PL179215B1

PL179215B1 - sposób wytwarzania wyciagu i srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL179215B1
Application number: PL94307088A
Authority: PL
Inventors: Juergen Hemberger; Roy Sawyer; Sabine Wolf; Johannes Dodt
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-05-03
Publication date: 2000-08-31
Also published as: HU9500038D0; US5583111A; HU226243B1; SK282860B6; RU95105983A; PT652900E; DE69429062T2; PL307088A1; DE69429062D1; UA43831C2; NO318017B1; AU682368B2; DK0652900T3; CZ4295A3; KR100335536B1; EP0652900B1; RU2138275C1; WO1994026777A1; GB9309509D0; ZA943171B

Abstract

1. Oczyszczony polipeptyd posiadajacy aktywnosc hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzedu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posia- dajacy ciezar czasteczkowy okolo 9000 i N-koncowa sekwencje aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu. 2. Oczyszczony polipeptyd posiadajacy aktywnosc hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzedu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posia- dajacy ciezar czasteczkowy okolo 14000 i N-koncowa sekwencje aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys. 3. Sposób wytwarzania oczyszczonego polipeptydu posiadajacego aktywnosc hamowania trombi- ny oraz posiadajacego ciezar czasteczkowy okolo 9000 kD i N-koncowa sekwencje aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, i polipeptydu posiadajacego ciezar czasteczkowy okolo 14000 i N-koncowa sekwencje aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys, znamienny tym, ze homogenizuje sie tkanki lub wydzieliny pijawek rzedu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, przygotowuje sie frakcje zawierajaca rozpuszczalne w wodzie skladniki oraz oczyszcza sie ta frakcje za pomocachroma- tografii powinowactwa specyficznej w stosunku do trombiny, a po niej co najmniej jednego etapu chroma- tografii zelowej i co najmniej jednego etapu HPLC z odwróconymi fazami. P L 179215 PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony polipeptyd, sposób wytwarzania oczyszczonego polipeptydu, sposób wytwarzania wyciągu i środek farmaceutyczny. Oczyszczony polipeptyd zgodnie z wynalazkiem jest inhibitorem trombiny z tkanki oraz wydzielin pijawek.

Trombina katalizuj e tworzenie skrzepów fibrynowych, a przez to hamuj e krzepnięcie krwi.

Ponadto trombina odgrywa kilka innych ról bioregulacyjnych, takich jak bezpośrednie aktywowanie agregacji płytek i aktywacja odpowiedzi zapalnej przez stymulowanie syntezy czynnika aktywującego płytki krwi (PAF) w komórkach śródbłonka. Oznacza to, że trombina odgrywa

179 215 kluczową rolę w schorzeniach związanych z zakrzepicą, takich jak na przykład choroba sercowo-naczyniowa.

W konsekwencji istnieje znaczne zainteresowanie ciągłymi poszukiwaniami nowych lub ulepszonych odpowiednio inhibitorów trombiny i antykoagulantów.

Przykładami dobrze znanych inhibitorów trombiny są heparyna i hirudyna.

Heparyna wzmaga czynność przeciwzakrzepowąantytrombiny III. Jest ona szeroko stosowana do leczenia schorzeń, w których za powstawanie lub ekspansję skrzepu takich jak zakrzepowy zator żylny, odpowiedzialna jest aktywność trombiny. Heparyna jest nieskuteczna w leczeniu przypadków, w których aktywność trombiny III jest zmniejszona, na przykład w przypadkach zakrzepicy towarzyszącej nerczycy lub zespołowi rozsianej krzepliwości wewnątrznaczyniowej (DIC). Ponadto heparyna daje wiele niepożądanych działań ubocznych, w tym krwotoki i małopłytkowość.

Hirudyna jest dobrze poznanym i scharakteryzowanym, polipeptydem o znanej specyficzności w stosunku do trombiny, który można wyizolować z wyciągów z gruczołu ślinowego i innych tkanek pijawek gatunku Hirudo mecicinalis. Hirudyna i jej pochodne mogą być także otrzymane za pomocą technik rekombinacyjnych. Polipeptyd ma stosunkowo niski ciężar cząsteczkowy równy 7000 i składa się z 65 aminokwasów. Sekwencja aminokwasów hirudyny została po raz pierwszy oznaczona przez Dodt’a i współpracowników (FEBS Letters, 165, 180-18-4,1984). W pijawce lekarskiej Hirudo medicinalis wykryto trzy główne odmiany hirudyny (HV1, HV2, HV3), różniące się tylko w około 10% wszystkich pozycji aminokwasów Najbardziej istotną różnicą jest różnica w pierwszych dwóch pozycjach N-terminalnego końca cząsteczki: Val-Val w odmianie hirudyny 1 (HV1) i Ile-Thr w odmianie hirudyny 2 (HV2). Znaczenie tych różnic jest niewielkie i nie wpływają one ani na funkcję ani na specyficzność interakcji hirudyna-trombina. Hirudyna jest silnym, naturalnym inhibitorem krzepnięcia. Okazała się skuteczną w zapobieganiu zakrzepicy żylnej, okluzji zespolenia żylnego i indukowanego przez trombinę Rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego, ale powoduje jednakże wydłużenie czasu krwawienia.

Filogenetycznie pijawka lekarska Hirudo medicinalis należy do podrodziny Hirudininae rodziny pijawek Hirudinidae (R. T. Sawyer: „Leech Biology and Behaviour”, Oxford University Press, Vol. 2, strona 688, 1986). Bardziej zaawansowanym ewolucyjnie gatunkiem pijawki jest Hirudinaria manillensis, która należy do podrodziny Hirudinarimae tej samej rodziny Hirudinidae. Nieoczekiwanie pokrewna, ale wyraźnie zupełnie różna izoforma hirudyny została ostatnio odkryta w Hirudinaria manillensis, jak ujawniono w publikacji zgłoszenia PCT WO 90/05143. Izoforma ta w porównaniu z hirudynrąz Hirudo medicinalis różni się w prawie 40% pozycji aminokwasów. Wymienione powyżej dwa gatunki, mianowicie Hirudo medicinalis i Hirudinaria manillensis, należą do rzędu pijawek Arhynchobdellida („pijawki szczękowe”). Oprócz rzędu Arhynchobdellida jest jeszcze jeden ważny rząd pijawek, to jest Rhynchobdellida („pijawki trąbkowe”) (R. T. Sawyer: „Leech Biology and Behaviour”, Oxford University Press, Vol. 2, strona 651, 1986). Najszerzej badanym przedstawicielem rzędu Rhynchobdellida, w odniesieniu do białek śliny, jest „pijawka amazońska”, Haementeria ghilianii. Wykazano jednakże, że nieoczekiwanie gatunek ten nie zawiera antytrombiny (Budzyński i współpr., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 168, 259-265, 1981). Zamiast tego Haementeria ghilianii zawiera enzym fibrynogenolityczny o nazwie hementin (patent USA nr 4390630), jak również inhibitor czynnika koagulacji łowi Xa (C. Condra i współpr.: Thromb. Haemost., 61, 437-441, 1986).

Na podstawie tego odkrycia i późniejszych prac zostało ogólnie zaakceptowane, że czynność antytrombino-podobna jest ograniczona do pijawek rzędu Arhynchobdellida, natomiast rząd Rhynchobdellida jest obecnie uważany za nie posiadający czynności antytrombino-podobnej.

Mimo omowionych powyżej osiągnięć istnieje nadal zapotrzebowanie na dostarczenie oprócz heparyny i hirudyny innych antykoagulantów i antytrombin, mających zwiększoną skuteczność w hamowaniu tworzenia skrzepu, indukowanej przez trombinę aktywacji płytek lub aktywacji płytek śródblonkowych, które mogłyby być wytwarzane w ilościach handlowych.

179 215

Nieoczekiwanie stwierdzono, że związki o czynności antytrombino-podobnej można wyizolować z tkanek i wydzielin pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie rodziny Theromyzon, zwanej niekiedy „pijawkąptasią”, ponieważ gatunek ten ma wyjątkowo wyspecjalizowany sposób życia, polegający na wysysaniu krwi z nozdrzy ptaków wodnych. .

Zatem celem wynalazku jest wykorzystanie pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, do wytwarzania związków hamujących trombinę.

Stwierdzono, że w wyciągach, zawierających rozpuszczalne w wodzie składniki tych pijawek, może być zmierzona aktywność hamowania trombiny. Zatem celem wynalazkujest wytworzenie posiadającego czynność hamowania trombiny wyciągu z tkanek lub wydzielin pijawek rzędu Rhynchobdellida lub rodziny Theromyzon lub gatunku Theromyzon tessulatum, zawierającego ich składniki rozpuszczalne.

Ze wspomnianych wyciągów może być wyizolowany aktywny inhibitor trombiny. Zatem celem wynalazkujest dostarczenie polipeptydu o aktywności inhibitora trombiny o wysokim stopniu oczyszczenia, który może być zidentyfikowany jako polipeptydy posiadające aktywność hamowania trombiny, uzyskiwalne z wyciągu zdefiniowanego powyżej oraz w zastrzeżeniach, przez oczyszczanie wyciągu otrzymanego przez homogenizację w' wodzie/acetonie przedniej przyssawki mrożonych i liofilizowanych pijawek, za pomocą chromatografii powinowactwa specyficznej dla trombiny, po której następuje etap chromatografii żelowej i co najmniej jeden etap HPLC z odwróconymi fazami.

Inhibitor trombiny korzystnie zawiera czynne fragmenty polipeptydowe o ciężarach cząsteczkowych odpowiednio około 3000, około 9000 i około 14000. Te czynne polipeptydy mogą być uznane za produkty degradacji macierzystego lub prekursorowego inhibitora trombiny.

Inhibitor trombiny według wynalazku jest nowy, ponieważ różni się od znanych antytrombin, w szczególności od hirudyny, ciężarem cząsteczkowym jak również punktem izoelektrycznym i N-terminalnymi sekwencjami aminokwasów, które wykazują ograniczoną homologię (poniżej 40%) z innymi inhibitorami trombiny.

Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posiadający ciężar cząsteczkowy około 90001 N-końcową sekwencję aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu.

Przedmiotem wynalazku jest także oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posiadający ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcową sekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania oczyszczonego polipeptydu posiadającego aktywność hamowania trombiny oraz posiadającego ciężar cząsteczkowy około 9000 kD i N-końcową sekwencję aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, i polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcowąsekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys, polegający na tym, że homogenizuje się tkanki lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, przygotowuje się frakcję zawierającą rozpuszczalne w wodzie składniki oraz oczyszcza się tą frakcję za pomocą chromatografii powinowactwa specyficznej w stosunku do trombiny, a po niej co najmniej jednego etapu chromatografii żelowej i co najmniej jednego etapu HPLC z odwróconymi fazami. Korzystnie przednie przyssawki zamrożonych lub liofilizowanych pijawek homogenizuje się wodą/acetonem.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wyciągu posiadającego aktywność hamowania trombiny, polegający na tym, że homogenizuje się tkankę lub wydzieliny pijawekrzędy

Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, w obecności wody/acetonu i sporządza frakcję zawierającą składniki rozpuszczalne w wodzie.

179 215

Następnym przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny zawierający polipeptyd i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że jako polipeptyd zawiera oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, przy czym polipeptyd ten został wybrany spośród polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 9000 i N-końcową sekwencję aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, albo polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcową sekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.

Zgodnie z wynalazkiem określenia ciężaru cząsteczkowego „około 3000 (9000, 14000)” obejmują maksymalne odchylenie plus/minus ciężar cząsteczkowy 1000, korzystnie 500.

Ponadto wynalazek obejmuje także wymienione powyższe i poniższe sekwencje, w których nastąpiła wymiana aminokwasów przy zachowaniu zasadniczych właściwości biologicznych. Obejmuje to także odmiany, fragmenty, podjednostki, naturalnie występujące mutacje i przypadkowo wytworzone mutanty sztuczne. Obejmuje to również białka hybrydowe, takie jak białka fuzyjne pochodzące od ujawnionych peptydów'.

Polipeptyd według wynalazku posiada właściwości przeciwzakrzepowe i antytrombotyczne. Może on być zatem stosowany we wszelkich stanach klinicznych, w których zaburzone jest działanie układu krzepliwości. Do zastosowań tych należą leczenia zakrzepicy, udaru, zawału serca, zakrzepicy żyły głębokiej, niedrożności tętnic kończyn, zakrzepicy płucnej, zakrzepicy tętnic siatkówki oraz wszelkich innych zaburzeń trombotycznych. Ponadto inhibitor(y) trombiny mogą być stosowane u pacjentów ze sztucznymi przetokami tętniczo-żylnymi lub pacjentów poddawanych operacji omijającego przepływu wieńcowego. Polipeptydy według wynalazku mogą być również stosowane jako leki przeciwzakrzepowe w profilaktyce zakrzepicy lub reokluzji tętniz, do konserwacji krwi lub produktów krwiopochodnych oraz w pozaustrojowym krążeniu krwi lub osocza.

Oczyszczone polipeptydy według wynalazku czyli inhibitory trombiny wykazują czynność biologiczną porównywalną w zasadzie z hirudyną. Powinowactwo wiązania z trombiną (stała hamowania) jest nawet nieco zwiększone w porównaniu z hirudyną, która jest znana jako najsilniejszy dotychczas inhibitor trombiny.

Wynalazek dostarcza zatem polipeptydów zdefiniowanych powyżej do stosowania jako leku, zwłaszcza do leczenia in vivo schorzeń związanych z zakrzepicąoraz do hamowania agregacji płytek i tworzenia skrzepów krwi poza ustrojem.

Środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera inhibitor trombiny lub polipeptyd, taki jak zdefiniowano powyżej, oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik do leczenia schorzeń związanych z zakrzepicą wymienionych powyżej.

Szczegóły figur są objaśnione w przykładach 1 do 10.

Figura 1 przedstawia profil elucji antytrombiny z kolumny powinowacta (przykład 3). Fig. 2 analizę antytrombiny otrzymanej z T. tessulatum na żelu filtracyjnym Biogel P4 (przykład 4). Fig. 3 analityczną RP-HPLC frakcji pozytywnych z etapu powinowactwa (przykład 5). Fig. 4 - preparatywnąRP-HPLC frakcji pozytywnych z etapu powinowactwa (przykład 5). Fig. 5 - porównanie hirudyny i inhibitora według wynalazku na HPLC (przykład 6). Fig. 6 - powtórną chromatografię aktywnego piku 2 z RP-HPLC (przykład 7). Fig. 7 - widmo masowe aktywnego piku 2 z RP-HPLC (przykład 7). Fig. 8 - ślad IEF aktywnego piku 2 z RP-HPLC (przykład 7). Fig. 9 - powtórną chromatografię aktywnego piku 4 z RP-HPLC (przykład 9). Fig. 10 - widmo masowe aktywnego piku 4 z RP-HPLC (przykład 9).

Oczyszczone polipeptydy według wynalazku mogąbyć wyizolowane i oczyszczone z tkanek lub wydzielin pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie rodziny Theromyzon. Z pijawek rodziny Theromyzon otrzymywane są inhibitory trombiny o podobnej czynności i tylko niewielu różnicach. Przykładami odpowiednich gatunków rodziny Theromyzon są T. binannulatum, T. cooperi, T. garjaewi, T. maculosum, T. mollissimum, T. pallens, T. propinquum, T. rude, T. sexoculatum, a zwłaszcza T. tessulatum.

179 215

Korzystnie jako źródło zgodnie z wynalazkiem stosuje się gruczoły ślinowe pijawek. Jednakże ponieważ wypreparowanie gruczołów ślinowych wymaga wiele wysiłku, a także nie można uniknąć przy tym znacznych strat materiału, możliwe jest stosowanie jako źródła głów lub przednich przyssawek pijawek.

Typowo pierwszy etap sposobu polega korzystnie na tym, że tkanki pijawek zamrażą się i/lub liofilizuje, po czym poddaje się homogenizacji, którą typowo prowadzi się w acetonie lub mieszaninach aceton/woda. Jednakże do usunięcia składników nierozpuszczalnych w wodzie można stosować inne polarne rozpuszczalniki organiczne. Ponadto korzystnie wyciąg otrzymany w etapie pierwszym poddaje się odwirowaniu, a następnie chromatografii powinowactwa w celu usunięcia zbędnych resztek komórek. Korzystnie w chromatografii powinowactwa stosuje się kolumnę z „trombinowymi miejscami aktywnymi”. Określenie „trombinowe miejsca aktywne” oznacza tu obecność na kolumnie miejsc trombinowych, z którymi inhibitor trombiny może się wiązać. Przykładami trombinowych miejsc aktywnych są^m^mobilizowana natywna lub dezaktywowana trombina, również pokrewne trombinie peptydy, peptydomimetyki lub inne pochodne trombiny. Zgodnie z wynalazkiem trombinę lub wymienione pochodne trombiny immobilizuje się na matrycy aktywnego żelu, korzystnie przez reakcję znanymi metodami z grupąazlaktonową wspomnianej matrycy żelu. Następnie chromatografię powinowactwa przeprowadza się za pomocą standardowych technik.

Korzystnie chromatografię powinowactwa stosuje się razem z chromatografią żelową.

Matryca żelowa ma zgodnie z wynalazkiem granicę ekskluzji około 5000, pozwala zatem na frakcjonowanie w zakresie około 1000 i 5000.

Korzystnie wyizolowane wyciągi antytrombinowe poddaje się następnie dalszemu oczyszczaniu za pomocąHPLC z odwróconymi fazami. Opisane powyżej fragmenty polipeptydów są uzyskiwalne przez oczyszczanie wyizolowanych wyciągów za pomocąRP-HPLc. Przykładami odpowiednich materiałów do fazy odwróconej sążele krzemionkowe modyfikowane podstawnikami alifatycznymi C2-C18. Jednakże polipeptydy według wynalazku mogąbyć oczyszczane za pomocą innych dobrze znanych procedur chromatograficznych. Szczegóły oczyszczania za pomocą HPLC są podane w przykładach.

Aktywność inhibitorów trombiny w wyciągach oraz w poszczególnych frakcjach z etapu oczyszczania może być zmierzona in vitro przy zastosowaniu pomiaru przedłużenia czasu krzepnięcia (F. Markwardt: Meth. Enz., 19,924-932,1970) lub zmniejszenia rozszczepiania specyficznego dla trombiny substratu chromogenicznego, takiego jak octan tosyloghcylo-piOlllo-arginino-4-nitroanilidu (Chromozym TH, Boehringer Mannheim), jak opisano (H. U. Bergmeyer: Meth. Enz. Anal., 3 wydanie, wol. 5, 365-394,1988).

Jak wskazano powyżej, polipeptydy według wynalazku są odpowiednie jako związki skuteczne farmaceutycznie w kompozycjach i kombinacjach farmaceutycznych.

Preparaty farmaceutyczne według wynalazku mogą ewentualnie zawierać dodatkowe składniki czynne, jak czynniki przeciwzakrzepowe takie jak hirudyna lub heparyna lub czynniki trombolityczne, takie jak aktywator plazminogenu lub hementyna.

Nowe polipeptydy i inhibitory trombiny według wynalazku mogą tworzyć dopuszczalne farmaceutycznie sole z dowolnym nietoksycznym kwasem organicznym lub nieorganicznym. Kwasami nieorganicznymi są na przykład kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, siarkowy lub fosforowy oraz kwasowe sole metali, takie jak wodoroortofosforan sodowy i wodorosiarczan potasowy. Przykładami kwasów organicznych są kwasy mono-, di-1 trika^loc^l^.ss/l<^lwe, takie jak kwas octowy, glikolowy, mlekowy, pirogronowy, malonowy, bursztynowy, glutarowy, fumarowy, jabłkowy, winowy, cytrynowy, askorbinowy, maleinowy, hydroksymaleinowy, benzoesowy, hydroksybenzoesowy, fenylooctowy, cynamonowy, salicylowy i kwasy sulfonowe, takie jak kwas metanosulfonowy. Sole ugrupowania karboksylowego końcowego aminokwasu obejmują nietoksyczne sole kwasu karboksylowego, utworzone z dowolnymi zasadami nieorganicznymi lub organicznymi. Sole te obejmująna przykład sole metali alkalicznych, takich jak sód i potas, metali ziem alkalicznych, takich jak wapń i magnez, metali lekkich grupy IIIA, w tym glinu, oraz pierwszorzędowych, drugorzędowych i trzeciorzędowych amin organicznych, takich jak trialki179 215 loaminy, w tym trietyloamina, prokaina, dibenzyloamina, 1-etenoamina, N,N'-dibenzyloetylenodiamina, dihydroabietyloamina i N-alkilopiperydyna.

Stosowane tu określenie „dopuszczalny farmaceutycznie nośnik” oznacza obojętny, nietoksyczny stały lub ciekły wypełniacz, rozcieńczalnik lub materiał kapsułkujący, nie oddziaływujący w sposób niepożądany na związek czynny lub pacjenta. Odpowiednie, korzystne nośniki ciekłe są dobrze znane ze stanu techniki, takie jak jałowa woda, solanka, wodny roztwór dekstrozy, roztwory cukrów, etanol, glikole i oleje, w tym pochodzenia naftowego, roślinnego, zwierzęcego lub syntetycznego, na przykład olej arachidowy, olej sojowy i olej mineralny.

Środki według wynalazku mogąbyć podawane w dawkachjednostkowych, zawierających zwykłe, nietoksyczne, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki, rozcieńczalniki, adiuwanty i podłoża, typowe dla podawania pozajelitowego.

Określenie „pozajelitowy” oznacza tu techniki iniekcji i infuzji podskórnych, dożylnych, dostawowych i dotchawiczych. Odpowiednie są także inne drogi podawania, takie jak podawanie doustne i miejscowe. Kompozycje i kombinacje pozajelitowe najkorzystniej podaje się dożylnie albo w postaci wlewu lub w postaci ciągłej infuzji zgodnie ze znanymi procedurami.

Tabletki i kapsułki do podawania doustnego zawierają zwykłe środki pomocniczne, takie jak środki wiążące, wypełniacze, rozcieńczalniki, środki tabletkujące, środki smarujące, środki rozsadzające i zwilżające. Tabletki mogąbyć powlekane sposobami dobrze znanymi ze stanu techniki.

Płynne preparaty doustne mogą mieć postać zawiesin, roztworów, emulsji, syropów lub eliksirów wodnych łub oleistych, lub mogą mieć postać suchego produktu do roztwarzania przed użyciem wodą lub innym odpowiednim wehikulum. Takie płynne preparaty mogą zawierać typowe dodatki, jak środki utrzymujące w zawiesinie, środki emulgujące, podłoża niewodne i konserwanty.

Preparaty miejscowe mogą mieć postać wodnych lub olejowych zawiesin, roztworów, emulsji, galaretek lub korzystnie maści emulsyjnych.

Dawki jednostkowe według wynalazku mogą zawierać wymagane dzienne ilości białka według wynalazku lub ich podwielokrotności tworzące żądaną dawkę. Optymalna dopuszczalna terapeutycznie dawka i sposób dawkowania danemu pacjentowi (ssaki, w tym ludzie) zależy od różnych czynników, takich jak aktywność szczególnego zastosowanego materiału, wiek, ciężar ciała, zdrowie ogólne, płeć, dieta, czas i droga podawania, szybkość usuwania, cel terapii, to jest leczenie lub profilaktyka oraz rodzaj leczonej choroby zakrzepowej, czynności przeciwpłytkowej lub przeciwzakrzepowej.

Zatem w kompozycjach i kombinacjach użytecznych jako środki przeciwzakrzepowe u leczonego pacjenta (in vivo) efektywna farmaceutycznie dawka dzienna peptydów według wynalazku jest równa między około 0,01 a 100 mg/kg wagi ciała, korzystnie między 0,1 a 10 mg/kg wagi ciała. Zależnie od postaci podawania jedna pojedyncza dawka może zawierać między 0,5 a 10 mg inhibitora trombiny. Efektywna farmaceutycznie dawka dla uzyskania efektu przeciwzakrzepowego w krwi poza ustrojem jest równa między 0,2 a 150 mg/l, korzystnie między 1 mg a 200 mg/l krwi poza ustrojem.

W oparciu o oczyszczony polipeptyd według wynalazku można skonstruować implantowalne lub pozaustrojowe urządzenie medyczne do stosowania w kontakcie z płynami ustrojowymi, którego powierzchnia jest powleczona immobilizowanym polipeptydem zdefiniowanym powyżej oraz w zastrzeżeniach, w celu nadania powierzchni tego urządzenia znacznej odporności na krzepnięcie. Polipeptyd według wynalazkujest immobilizowany na urządzeniu medycznym tak, aby nadać powierzchni biokompatybilność i odporność na krzepnięcie. Takie urządzenia niekiedy mają zwilżalne powierzchnie, które zwykle indukująagregację płytek, co jest niekorzystne w ich zamierzonych zastosowaniach w urządzeniach implantowalnych i pozaustrojowych w kontakcie z krwią lub innymi płynami ustrojowymi. Przykładami takich urządzeń, które są zwykle wykonane z materiałów plastikowych i włókien syntetycznych są protezy, sztuczne narządy, bandaże, sztuczne segmenty naczyń, katetery, dializatory, rurki i naczynia do przenoszenia krwi.

Wynalazek zostanie dalej zilustrowany w odniesieniu do poniższych przykładów, które służą do zilustrowania wynalazku i nie ograniczają jego zakresu.

179 215

Przykład I

Wykazanie obecności antytrombiny w T. tessulatum

Dziesięć główek Theromyzon tessulatum zhomogenizowano w izotonicznej solance. Homogenizat krótko wirowano w celu usunięcia zawieszonych cząstek, a supernatant zachowano w celu przeprowadzenia poniższego testu antytrombinowego oraz innych wskazanych testów hematologicznych.

W celu oszacowania aktywności antytrombinowej 20 gl powyższego wyciągu zmieszano z 10 gl trombiny (1 j.). Do tej mieszaniny dodano 100 gl roztworu fibrynogenu o stężeniu 0,5 mg/ml, następnie wymieszano i inkubowano przez 1 minutę w 37°C. Dalsze szczegóły tego testu opisali R. T. Sawyer i współpr. (Comp. Haematol. Int., 1,35-41,1991). W poniższej tabeli zestawiono hamowanie in vitro parametrów krzepnięcia przez surowe wyciągi z Theromyzon tessulatum:

Tabela 1

Wykazanie obecności aktywności antytrombiny w T. Tessulatum

	Normalne kontrole [sekundy]	Surowy wyciąg [sekundy]
Czas protrombiny (zewnętrzny)	15	42
Aktywowany PTT (wewnętrzny)	40	220
Czas trombiny (antytrombina)	45	>600
Czas reptilazy	20	20

Z powyższych danych widoczne jest, że region głowy 'Theromyzon tessulatum zawiera rozpuszczalny w wodzie czynnik lub czynniki, które znacznie przedłużajączas krzepnięcia trombiny.

Przykład II

Chromogeniczny test hamowania trombiny i czynnika Xa

a) Hamowanie trombiny gl roztworu trombiny (5 NIH-U trombiny/ml 250 mM buforu fosforanowego zawierającego 0,05% PEG 6000, pH 6,5) preinkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej z 880 gl buforu do oznaczania trombiny (100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,05% PEG, pH 8,3) w kuwecie fotometrycznej. Reakcję rozpoczęto przez dodanie 100 gl roztworu substratu (4 mg Chromozymu TH z Boehringer Mannheim, Niemcy, rozpuszczone w 5 ml H₂O) i odczytywano przez 5 minut absorpcję w 25°C przy 405 nm z trwającymi 30 sekund interwałami.

W celu zmierzenia aktywności hamowania próbkę 10-200 gł lub hirudynę jako wzorzec zmieszano z 20 gl roztworu trombiny i dopełniono do łącznej objętości 900 gl buforem do oznaczeń. Mieszaninę tę preinkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej i rozpoczęto reakcję przez dodanie 100 gl roztworu substratu.

b) Hamowanie czynności czynnika Xa gl roztworu czynnika Xa (10 j/0,5 ml rozcieńczone do 2,0 ml H2O) preinkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej z 880 gl buforu do oznaczeń czynnika Xa (100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,05% PEG, pH 8,3) w kuwecie fotometrycznej. Reakcję zapoczątkowano przez dodanie 100 gl roztworu substratu (3,5 mg Chromozymu X, Boehringer Mannheim, rozpuszczono w 5 ml H2O) i odczytywano przez 5 minut w odstępach 3 0-sekundowych absorpcję przy 405 nm w temperaturze pokojowej.

W celu zmierzenia czynności hamującej próbkę 10-200 gl zmieszano z 20 gl roztworu czynnika Xa i dopełniono buforem do oznaczeń do objętości całkowitej 900 gl. Mieszaninę tę preinkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zapoczątkowano reakcję przez dodanie 100 gl roztworu substratu.

179 215

Przykład III

Oczyszczanie inhibitora trombiny z Theromyzon tessulatum

Etap 1

Przednie przyssawki Theromyzon tessulatum karmionych przez 1000 sekund natychmiast zamrożono w -70°C i liofilizowano. Do materiału tego dodano 35 ml 40% acetonu i homogenizowano zawiesinę w ultra-toraksie 3 razy za każdym razem po po 10 sekund. Poddano obróbce w somkatorze przez 2 minuty, po czym przeprwadzono dodatkowy etap homogenizacji (30 sekund). Homogenizat wirowano przez 15 minut przy 6000 rpm, a utworzony supematant zachowano (S1).

Do peletki 1 dodano następne 35 ml 40% acetonu i przeprowadzono drugą homogenizację (1x10 sekund; 2 minuty sonikacji, 1 x 30 sekund). Homogenizat ponownie wirowano przez 15 minut przy 6000 rpm. Supematant 2 dodano do zachowanego supematanta 1, a do połączonych supernatantów dodano 80% aceton (v/v).

pH ustawiono na 4,0 za pomocą kwasu octowego, a uzyskaną zawiesinę wirowano przez 20 minut przy 6000 rpm. Peletkę 3 odrzucono. Supematant 3 zatężono 4-krotnie za pomocą wyparki próżniowej (Speed Vac).

Obecność aktywności antytrombinowej w wyciągu bezacetonowym wykazano za pomocą testu krzepnięcia według przykładu I oraz testu chromogenicznego według przykładu U.

Etap 2

Wyciąg bezacetonowy naniesiono na kolumnę PD-10 (Pharmacia) do wymiany buforowej . Kolumnę zrównoważono buforem powinowactwa (20 mM Tris-HC'l, 50 mM NaCl. pH 7,4) i naniesiono na nią2,5 ml wyciągu z etapu 1. Eluat testowano na obecność aktywności antytrombinowej.

Kolumnę powinowactwa z trombinąprzygotowano w następujący sposób.

400 mg suchej matrycy Azlacton Tentacle Fractogel (E. Merck, Darmstadtd, Niemcy) zawieszono na 2 godziny w temperaturze pokojowej w 7 ml buforu do sprzęgania (50 mM fosforan, 150 mM NaCl, pH 7,5). Zawiesinę przemyto dwukrotnie przez wirowanie i ponowne zawieszenie w buforze do sprzęgania. 500 NIH-U trombiny bydlęcej (Sigma) rozpuszczono w 1 ml H₂O i ustawiono pH na 7,5. Ten roztwór trombiny zrównoważono z buforem do sprzęgania za pomocą żelu filtracyjnego PD-10. Do zrównoważonego roztworu trombiny dodano siarczan sodu do osiągnięcia końcowego stężenia 1M. Na zaktywowany żel matrycy naniesiono natychmiast pipetką białko trombiny i umożliwiono sprzęganie przez 3 godziny w 4°C przy lekkim mieszaniu. Przemyto trzykrotnie 5 objętościami buforu do sprzęgania za każdym razem. W celu dezaktywacji matrycy dodano 1,5 ml etanoloaminy i pozostawiono na noc w 4 °C przy lekkim wstrząsaniu. Matrycę przemyto dwukrotnie 5 objętościami buforu octanowego (100 mM octanu sodu, 500 mM NaCl, pH 4,0). Końcowe zrównoważenie przeprowadzono przez dwukrotne przemycie 5 objętościami buforu powinowactwa.

Aktywne eluaty z kolumny PD-10 naniesiono na kolumnę powinowactwa za pomocą pompy perystaltycznej (przepływ 10 ml/h). Zebrano niezwiązanąfrakcję i przemyto kolumnę 12 ml bufom powinowactwa (przemywka 1). Eluowano 6 ml bufom octanowego o pH 4,0 i zbierano frakcje o objętości 0,5 ml. Profil elucji z tej kolumny przedstawiono na fig. 1.

Po pierwszej elucji przeprowadzono drugi etap elucji, stosując 6 ml bufom octanowego o pH 3,0. Zbierano frakcje po 1,5 ml. Kolumnę ponownie zrównoważono 25 ml bufom powinowactwa.

Wyniki ekstrakcji i etapu chromatografii powinowactwa zestawiono poniżej w tabeli 2.

179 215

Tabela 2

Wyniki oczyszczania inhibitora trombiny z Theromyzon tessulatum za pomocą chromatografii powinowactwa

Frakcja	Objętość [ml]	Czas krzepnięcia [sek]	Inhibitor trombiny [j. m.]	Inhibitor czynnika Xa [j. m.]
Ślepa	-	20,5	0	0
aceton	34	59,4	33	nie ozn.
wyciąg niezwiązany w chr. pow.	34	24;3	1,8	1,1
przemywka 1	24	20,2	1,6	1,0
eluat 1 z chr. pow.	4	>600	25	0,2
eluat 2 z chr. pow.	4	22,1	0	0

chr. pow. = chromatografia powinowactwa

Przykład IV

Analiza aktywnego inhibitora trombiny z Theromyzon tessulatum za pomocą chromatografii żelowej

Aktywny materiał naniesiono na kolumnę do chromatografii żelowej Biogel P4 (Biorad) o objętości 25 ml. Elucję prowadzono za pomocą20 mM Tris-HCl, 40 mM NaCl, pH 7,4, przy prędkości przepływu 4 ml/godz. Frakcje o objętości 1 ml testowano na obecność aktywności antytrombinowej.

Matryca żelowa P4 posiada granicę ekskluzji 5000 D i pozwala na frakcjonowanie w zakresie ciężaru cząsteczkowego 1000 do 5000 D. Nieoczekiwanie stwierdzono, że aktywność antytrombinowa eluuje w objętości frakcjonowania, to jest ma pozorny ciężar cząsteczkowy poniżej 5000 D (fig. 2). Zachowanie to stoi w kontraście z zachowaniem hirudyny (ciężar cząsteczkowy 7000 D), która w tych samych warunkach pojawia się w objętości pustej. Na podstawie kalibracji kolumny P4 wyliczono, że ciężar cząsteczkowy aktywności antytrombinowej z Theromyzon tessulatum wynosi około 3000 D.

Przykład V

HPLC z odwróconymi fazami oczyszczonego inhibitora trombiny z Theromyzon tessulatum

Po etapie chromatografii powinowactwa według przykładu III aktywne eluaty analizowano dalej za pomocą RP-HPLC. Próbkę o objętości 20 pl wstrzykiwano na kolumnę HPLC (LiChrospher 300 RP-18, 5 pm; E. Merck. Darmstadt, Niemcy) i eluowano poniższym gradientem acetonitrylu z szybkością 1,0 ml/min:

Bufor A: 0,1% kwas trifuorooctowy w H2O

Bufor B: 0,08% kwas trifluorooctowy w acetonitrylu

Gradient: 0-2 minuty 10% B

2- 3 minuty wstrzyknięcie

3- 28 minut 60% B

Figura 3 obrazuje typowy chromatogram analityczny zarejestrowany przy 220 nm. Aktywność hamowania trombiny wykryto w pikach oznaczonych jako pik 2 i pik 4. Informacja z analitycznej HPLC została następnie wykorzystana do przeprowadzenia w tych samych warunkach rozdziałów preparatywnych.

Oczyszczanie preparatywne prowadzono na próbkach z chromatografii powinowactwa o objętości 500 pl (fig. 4). Poszczególne piki zbierano, łączono i zatężano przez odparowanie próżniowe w Speed Vac. Wysuszone frakcje roztwarzano w H2O i oznaczano w nich aktywność antytrombinową, stosując test czasu krzepnięcia, jak również test chromogeniczny, opisane w przykładzie II.

W obu układach testowych aktywności wykrywano głównie w pikach 2 i 4, znajdując pewną aktywność również w piku 5, co najprawdopodobniej jest odzwierciedleniem zanieczyszczenia materiału piku 5 pikiem 4. Wszystkie pozostałe piki z chromatogramu nie wykazywały

179 215 wcale aktywności antytrombinowej. Suma aktywności pików 2 i 4 stanowiła około 93% aktywności całkowitej.

Przykład VI

Porównanie inhibitora trombiny według wynalazku z hirudyną za pomocą HPLC

W celu dalszego wykazania, że inhibitor według wynalazku jest cząsteczką różniącą się fundamentalnie od hirudyny, przeprowadzono poniższy eksperyment. Do aktywnego piku 2 po HPLC zgodnie z przykładem V dodano oczyszczoną hirudynę o podobnym stężeniu białka i mieszaninę poddano RP-HPLC w gradiencie acetonitrylu (40-70%). Otrzymano dwa piki, zawierające aktywność antytrombinową (fig. 5). Na podstawie eksperymentów porównawczych, w których wstrzykiwano pojedyncze inhibitory, można dokonać przypisania pików takjak wskazano na fig. 5.

Z figury 6 wynika wyraźnie, że antytrombina według wynalazku eluuje w pozycji bardzo różnej od pozycji hirudyny. To samo można wykazać dla aktywnego piku 4 po rozdziale HPLC zgodnie z przykładem 5.

Przykład VH:

Dalsze scharakteryzowanie piku 2 posiadającego aktywność antytrombiny

Czystość

Połączony aktywny pik z RP-HPLC poddano ponownej chromatografii w tych samych warunkach jak chromatografia na fig. 3. Jak pokazano na fig. 6, z głównego piku aktywnego można jeszcze po drugiej RP-HPLC wydzielić niewielką ilość materiału zanieczyszczającego, uzyskując preparat homogenny (patrz również fig. 8, która przedstawia elektroforezę kapilarną tej frakcji).

Hamowanie trombiny

Pik 2 z RP-HPLC okazał się aktywny w teście krzepnięcia (czas trombiny > 600 sek./5 pl), jak również w chromogenicznym teście antytrombinowym według przykładu II. Aktywność w teście chromogenicznym wynosiła 3,2 j. m./250 pl. Stosuj ąc test opisany w przykładzie II nie można było wykryć aktywności hamowania czynnika Xa w piku 2, który wykazywał maksymalną aktywność anty-Xa<<1% aktywności antytrombiny. Wyciągnięto zatem wniosek, że ujawniony tu inhibitor jest wysoce specyficzny w stosunku do trombiny.

Miareczkowanie miejsc aktywnych

Stałą hamowania trombiny oznaczono przez spektrofluorometryczne miareczkowanie inhibitorem według wynalazku standaryzowanego roztworu trombiny. Szczegóły metody opisane są przez G. W. Jamesona i współpr. (Biochem. J., 131, 107-117, 1973).

Skrótowo, w eksperymentach miareczkowania użyto fluorogenicznego substratu TosGly-Pro-Arg-AMC w stężeniu 50 μΜ. Testy prowadzono w buforze 100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,05% PEG 600, pH 7,8, w 25°C. Ludzkąa-trombinę z oznaczonymi miejscami aktywnymi w stężeniu 20 pM inkubowano przez 10 minut z inhibitorem przy 0,2-5 x Eo i po dodaniu substratu mierzono prędkości ustalone. Stałe kinetyczne oznaczano stosując program analizy regresji nieliniowej GraFit (R. J. Leatherbarrow, Erithacus Software, Staines, Wielka Brytania, 1980). Wyliczono, że Kj jest równa 178 fentomoli.

Ciężar cząsteczkowy

Ciężar cząsteczkowy aktywnego piku 2 oznaczono za pomocą spektrometrii masowej z desorpcją laserową, stosując metodąMALDI-TOF (Kratos). 0,5 μ! próbki zmieszano z kilkoma μ] kwasu dihydroksybenzoesowego w acetonitrylu, który służył jako matryca. Mieszaninę wysuszono pod zimnym powietrzem na srebrnym uchwycie do próbek i umieszczono w aparacie. Uzyskane widmo masowe kalibrowano białkami wzorcowymi o znanym ciężarze cząsteczkowym. Pik odpowiadał masie cząsteczkowej około 9000D (fig. 7).

Ogniskowanie izoelektryczne

Punkt izoelektryczny inhibitora mierzono za pomocąelektroforezy kapilarnej w trybie IEF (Applied Biosystems). Jak widać z fig. 8, pik inhibitora wystąpił przy pl 4,9 w porównaniu z białkami wzorcowymi.

179 215

Przykład VIII

Sekwencja piku 2 posiadającego aktywność antytrombiny

Dla piku 2 z RP-HPLC (przykład V) otrzymano za pomocą standardowej chemii degradacji edmana na sekwencjonerze peptydowym Beckmanna następującą sekwencję N-końcową:

Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu

Przykład IX

Dalsze charakteryzowanie piku 4 posiadającego aktywność antytrombiny

Czystość

Połączony aktywny pik 4 z RP-HPLC poddano ponownej chromatografu w tych samych warunkach. Jak pokazano na fig. 9, z głównego piku aktywnego można nadal wydzielić pewną ilość materiału zanieczyszczającego, otrzymując po drugiej HPLC preparat homogenny.

Hamowanie trombiny

Pik 4 z RP-HPLC był aktywny w teście krzepnięcia (czas trombiny > 600 sek./5 pl), jak również w chromogenicznym teście antytrombinowym według przykładu II. Aktywność w teście chromogenicznym wynosiła 1,3 j. m./250 pl. W piku 2 przy użyciu testu opisanego w przykładzie II nie można było wykryć aktywności hamowania czynnika Xa, co odzwierciedla maksymalna aktywność anty-Xa«1°% aktywności antytrombinowej. Wyciągnięto zatem wniosek, że ujawniony tu inhibitor jest wysoce specyficzny w stosunku do trombiny.

Miareczkowanie miejsc aktywnych

Stała hamowania trombiny została oznaczona za pomocą miareczkowania spektrofluorometrycznego standaryzowanego roztworu trombiny inhibitorem według wynalazku. Szczegóły metody podano w przykładzie VII. Zmierzona wartość K1 była równa 240 fentomoli.

Ciężar cząsteczkowy

Ciężar cząsteczkowy aktywnego piku 4 oznaczono za pomocą spektrometrii masowej z desorpcją laserem, stosując metodę MALDI-TOF (Kratos), opisaną w przykładzie VII. Uzyskane widmo masowe kalibrowano za pomocąwzorcowych białek o znanym ciężarze cząsteczkowym. Pik odpowiadał masie cząsteczkowej około 14 kD (fig. 10).

Przykład X

Sekwencja piku 4, posiadającego aktywność antytrombinową

Dla piku 4 z HPLC (przykład V) otrzymano za pomocą standardowej chemii degradacji edmana na sekwencjonerze peptydowym Beckmanna następującą sekwencję N-końcową:

Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys

Przykład XI

Stosując taką samą procedurę jak procedura opisana w przykładach I-V można wyizolować polipeptydy posiadające aktywność antytrombiny z następujących gatunków Theromyzon:

T. binannulatum

T. cooperi

T. garjaewi

T. maculosum

T. sexoculatum

179 215

WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA (i) ZGŁASZAJĄCY (A) NAZWA: Merck Patent GmbH (B) ULICA: Frankfurter Str. 250 (C) MIASTA; Darmstadt (E) KRAJ: Republika Federalna Niemiec (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 64271 (G) TELEFON: 06151-727022 (H) TELEFAX: 06151-727191 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Inhibitory trombiny (iii) LICZBA SEKWENCJI: 2 (IV) FORMA CZYTANA PRZEZ KOMPUTER (A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) STRUKTURA NICIOWA: jednoniciowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (IV) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(B) SZCZEP: Theromyzon tessulatum

179 215 (F) TYP TKANKI: gruczoł ślinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1:

Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu

10 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) STRUKTURA NICIOWA: jednoniciowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) PRZYPUSZCZALNY: Numer (iii) ANT^TSENSOWNY: Nnmer (v) TYP FRAGMENTU: N-terminalny (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(B) SZCZEP: theromyzon tessulatum (F) TYP YKANKI:: grugzoł sl inovn (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) ROZMIESZCZENIE: 1..24 (D) INNE INFORMACJE: /znak= N-terminalny fragment polipeptydu o mmsse cząsttezkowej 14KD/ (xi) OPIS SEKWENCJI: SErwencjy o niwrze identyfikacyjnym: 2:

Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn 15 10 15

Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys 20 25

179 215

179 215 αο

Fig.3

179 215

Fig. 6

179 215

Fig.7

<im_et md

Fig. 8 pl - Wzorce

179 215

Fig. 9

Fig. 10

Ciężar cząsteczkowy [D]

179 215 +++

Fig.1 π ΓΊ + = aktywność antytrombiny

OD=280 nm ml /godzina

NaOAc pH4 0

Fig. 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posiadający ciężar cząsteczkowy około 9000 i N-końcową sekwencję aminokwasów·': Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu.
2. Oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posiadający ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcową sekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.
3. Sposób wytwarzania oczyszczonego polipeptydu posiadającego aktywność hamowania trombiny oraz posiadającego ciężar cząsteczkowy około 9000 kD i N-końcową sekwencję aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, i polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcową sekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys, znamienny tym, że homogenizuje się tkanki lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, przygotowuje się frakcję zawierającą rozpuszczalne w wodzie składniki oraz oczyszcza się tą frakcję za pomocą chromatografii powinowactwa specyficznej w stosunku do trombiny, a po niej co najmniej jednego etapu chromatografii żelowej i co najmniej jednego etapu HPLC z odwróconymi fazami.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że homogenizuje się przednie przyssawki zamrożonych lub liofilizowanych pijawek wodą/acetonem.
5. Sposób wytwarzania wyciągu posiadającego aktywność hamowania trombiny, znamienny tym, że homogenizuje się tkankę lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, za pomocą woda/aceton i sporządza frakcję zawierającą składniki rozpuszczalne w wodzie.
6. Środek farmaceutyczny zawierający polipeptyd i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako polipeptyd zawiera oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, przy czym polipeptyd ten został wybrany spośród polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 9000 i N-końeowąsekwencję aminokwasów···: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, albo polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcowąsekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.