HU226243B1

HU226243B1 - Thrombin inhibitors, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU226243B1
Application number: HU9500038A
Authority: HU
Inventors: Johannes Dr Dodt; Juergen Dr Hemberger; Roy Dr Sawyer; Sabine Dr Wolf
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-05-03
Publication date: 2008-07-28
Also published as: NO318017B1; JP3537437B2; WO1994026777A1; SK895A3; ZA943171B; RU95105983A; CZ287794B6; ATE208793T1; DE69429062D1; HU9500038D0; DE69429062T2; JPH07508765A; ES2167364T3; NO950075D0; RU2138275C1; KR100335536B1; EP0652900A1; CZ4295A3; UA43831C2; SK282860B6

Description

A találmány új trombininhibitorokra, közelebbről Theromyzon tessulatum fajba tartozó piócák nyálmirigyéből izolált trombininhibitorokra vonatkozik.

A trombin katalizálja a fibrinrögök képződését, és ezért gátolja a vér koagulálását. Emellett, a trombin számos más bioregulátor szereppel is rendelkezik, így közvetlenül aktiválja a vérlemezke-aggregációt, és a vérlemezke-aktiváló faktor (az angol „piatelet activating factor” név alapján rövidítve PAF) endotéliás sejtek által történő előállításának stimulálásával aktiválja a gyulladásos választ. Ez azt jelenti, hogy a trombin központi szerepet játszik a trombózissal rokon betegségekben, például a kardiovaszkuláris betegségekben.

Ennek következtében folyamatosan szükség van új vagy javított hatású trombininhibitorok és antikoagulánsok kidolgozására.

A közismert trombininhibitorokra példaként említhető a heparin és a hirudin.

A heparin elősegíti az antitrombin III antikoaguláns hatékonyságát. Széles körben használják olyan körülmények között, így vénás tromboembólia esetén, ahol a trombin aktivitása felelős a trombusz kialakulásáért vagy terjedéséért. Nem hatásos azonban olyan esetekben, ahol az antitrombin III hatása lecsökken, így például nefrózissal társult trombózis vagy disszeminált intravaszkuláris koagulációs szindróma (DIQ) esetén. Emellett, a heparin számos nemkívánatos mellékhatást okoz, ilyen például a vérzés és a csökkent trombocitaszám.

A hirudin egy jól ismert és általánosan jellemzett polipeptid, amely trombinra specifikus, és a Hirudo medicinalis fajba tartozó piócák nyálmirigyéből és más szöveteiből származó extraktumból izolálható. A hirudin és származékai előállíthatók rekombinánstechnikával is. A polipeptid móltömege viszonylag nagy, 7000 D és 65 aminosavat tartalmaz. A hirudin aminosavszekvenciáját Dodt és munkatársai határozták meg [FEBS Letters, 165, 180-184 (1984)]. A Hirudo medicinalis orvosi piócában a hirudin három fő változata (HV1, HV2 és HV3) található, amelyek az összaminosav-pozícióban csupán mintegy 10%-os eltérést mutatnak. A legjelentősebb eltérés a molekula N-terminális végén található első két pozíció: a hirudin 1 változatánál (HV1) Val-Val, és a hirudin 2 változatánál (HV2) lleThr. Ezek csekély eltérések, és nem befolyásolják a hirudin-trombin kölcsönhatás funkcióját és specifikusságát. A hirudin a koaguláció természetes eredetű potenciális inhibitora. Igazoltan hatásos a vénás trombózis, a vaszkuláris összeköttetés elzáródása és a trombinnal indukált DIC megelőzésében azonban hosszabb vérzést eredményez.

Rendszertanilag a Hirudo medicinalis orvosi pióca a Hirudinidae piócacsalád Hirudininae alcsaládjába tartozik [R. T. Sawyer: Leech Biology and Behaviour, Oxford University Press, 2, 688 (1986)]. Evolúciós szempontból kedvezőbb piócafaj a Hirudinaria manillensis, amely a Hirudinidae család Hlrudinaríinae alcsaládjába tartozik. Meglepő módon, a hirudinnak egy rokon, de jobban eltérő izoform változata található a Hirudinaria manillensisben (WO 90/05143 számú irat). Ez az izoform változat az aminosavpozíciókban közel 40%-os eltérést mutat a Hirudo medicinalisból származó hirudinhez viszonyítva. Az említett két faj, vagyis a Hirudo medicinalis és Hirudinaria manillensis az Arhynchobdellida rendbe (állkapcsos piócák) tartoznak. Az Arhynchobdellida rend mellett a piócák másik fő rendje a Rhynchobdellida rend (orrmányos piócák) [R. T. Sawyer: Leech Biology and Behaviour, Oxford University Press, 2, 651 (1986)]. A Rhynchobdellida rend nyálfehérjék szempontjából legközelebbről tanulmányozott tagja az amazon pióca, Haementeria ghilianii. Kimutatták, hogy ez a faj meglepő módon nem tartalmaz antitrombint [Budzynski és munkatársai: Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 768, 259-265 (1981)]. Ehelyett, a Haementeria ghilianii egy fibrinogenolitikus enzimet tartalmaz, amelynek neve Hementin (US 4 390 630 számú irat), valamint egy inhibitort tartalmaz, amely az Xa vérkoagulációs faktort gátolja [C. Condra és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 437-441 (1986)].

A fenti felfedezés és az ezt követő munka hatására általánosan elfogadottá vált, hogy az antitrombinszerű hatás az Arhynchobdellida rendbe tartozó piócákra korlátozódik, és a Rhynchobdellida rendnél hiányzik.

A fenti eredmények ellenére továbbra is szükség van a heparin és hirudin mellett olyan antikoaguláns és antitrombin kifejlesztésére, amely hatékonyabban gátolja a rögképződést, a trombinnal indukált vérlemezkeaktiválást vagy az endotéliás sejtek aktiválását, és amely kereskedelmi mennyiségben előállítható.

Meglepő módon azt találtuk, hogy antitrombinszerű hatással rendelkező vegyületek izolálhatok a Rhynchobdellida rendbe, és a Theromyzon tessulatum fajba tartozó piócák szöveteiből és váladékából. Ezeket a piócákat madárpiócáknak nevezik, és kivételesen specializált életmóddal rendelkeznek, amennyiben vízimadarak orrlyukából szívnak vért.

A találmány egyik tárgya ezért a Theromyzon tessulatum fajba tartozó piócák nyálmirigyéből izolált és trombingátló hatással rendelkező polipeptid, melynek móltömege 9 kD, és N-terminális aminosavszekvenciája:

H-Glu-Asp-Asp-Asn-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Ala-Cys-ProGly-Glu-OH, vagy melynek móltömege 14 kD, és N-terminális aminosavszekvenciája:

H-Ser-Glu-Leu-Gly-GIn-Ser-Cys-Ser-Lys-Glu-Asn-ProCys-Pro-Ser-Asn-Met-Lys-Cys-Asn-Arg-Glu-Thr-PheLys-OH.

A találmány tárgya továbbá eljárás a találmány szerinti polipeptid izolálására oly módon, hogy Theromyzon tessulatum fajba tartozó fagyasztott és liofilizált piócák nyálmirigyét vagy első harmadát víz/aceton eleggyel homogenizáljuk, az extraktumot centrifugáljuk, a vízben oldható felülúszót trombinspecifikus affinitáskromatográfiás oszlopra visszük és a trombinra aktív frakciókat legalább egy gélszűréses kromatográfiás oszlopra és legalább egy reverz fázisú HPLC-oszlopra visszük.

A találmány szerinti trombininhibitor előnyösen valamely aktív polipeptidfragmens, amelynek móltömege rendre mintegy 9 kD és mintegy 14 kD. Ezek az aktív

HU 226 243 Β1 polipeptidek egy eredeti vagy prekurzor trombininhibitor bomlástermékeinek is tekinthetők. A találmány szerinti eljárással izolálható még egy mintegy 3 kD polipeptidfragmens, amely szintén trombininhibitor, de amit közelebbről nem jellemeztünk.

A találmány szerinti trombininhibitor új, mivel különbözik az ismert antitrombinoktól, elsősorban a hirudintól a móltömegben, az izoelektromos pontban és az N-terminális aminosavszekvenciában, ami csak korlátozott (40% alatti) homológiát mutat más trombininhibitorokkal.

Előnyös az olyan trombininhibitor, melynek móltömege mintegy 9 kD és N-terminális aminosavszekvenciája: H-Glu-Asp-Asp-Asn-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-AlaCys-Pro-Gly-Glu-OH.

Előnyös továbbá az olyan trombininhibitor, melynek móltömege mintegy 14 kD és N-terminális aminosavszekvenciája: H-Ser-Glu-Leu-Gly-GIn-Ser-Cys-SerLys-Glu-Asn-Pro-Cys-Pro-Ser-Asn-Met-Lys-Cys-AsnArg-Glu-Thr-Phe-Lys-OH.

A találmány értelmében a „mintegy 9 (14) kD” azt jelenti, hogy a móltömeg legfeljebb ±1 kD, előnyösen 0,5 kD mértékben tér el a megadott értéktől. Emellett, az oltalmi körhöz tartoznak a megadott szekvenciák olyan változatai, ahol az aminosavak cseréje nem befolyásolja a lényeges biológiai tulajdonságokat. Ez kiterjed az egyes változatokra, fragmensekre, alegységekre, természetes eredetű mutációkra, és véletlenszerűen generált mesterséges mutációkra. Ugyanígy kiterjed a hibridfehérjékre, így az eredeti peptidekből származó fúziós fehérjékre.

A találmány szerinti trombininhibitor antikoaguláns és antitrombotikus hatással rendelkezik. Felhasználható ezért olyan klinikai állapotoknál, ahol a koagulációs rendszer játszik szerepet. Ezekre példaként említhető a trombózis, gutaütés, miokardiális infarktus, mélyvénás trombózis, a végtagartériák elzáródása, tüdőtrombózis, retinális artériatrombózis, vagy bármely más trombózis. A trombininhibitorok felhasználhatók továbbá artériás-vénás összekötéssel rendelkező vagy koronáriás „by-pass” műtétnek alávetett betegeknél. A találmány szerinti polipeptidek antikoagulánsként alkalmazhatók trombózis vagy artériás újraelzáródás megelőzésére, a vér vagy vértermékek konzerválására, és a vér vagy plazma testen kívüli keringtetéséhez.

A találmány szerinti trombingátló polipeptidek lényegében a hirudinhoz hasonlítható biológiai hatással rendelkeznek. A trombinhoz történő kötődési affinitás (inhibiciós konstanst) valamivel nagyobb, mint a hirudiné, amely a legerősebb eddig ismert trombininhibitor.

A találmány szerinti polipeptidek ezért gyógyszerként alkalmazhatók, elsősorban trombózissal összefüggő betegségek in vivő kezelésére, valamint a vérlemezke-aggregáció és vérrögösödés gátlására a testen kívüli vérben.

A találmány további tárgya ezért gyógyszerkészítmény, amely fenti trombininhibitort vagy polipeptidet tartalmaz gyógyszerészeti hordozóanyag, segédanyag vagy hígítóanyag mellett, és trombózissal rokon betegségek kezelésére alkalmas.

A találmány közelebbi bemutatására szolgáló ábrák részletes ismertetése megtalálható az 1-10. példákban. Összefoglalva, az 1. ábra az antitrombin elúciós profilját mutatja affinitásoszlopon (3. példa): +=antitrombinhatás, OD=280 nm, 10 ml/h, 1=NaOAc, pH=4,0;

a 2. ábra a T. tessulatumból származó antitrombin Biogel P4-en felvett gélszűrési analízisét (4. példa) mutatja; +=antitrombinhatás, OD=280 nm, 4 ml/h, 1=üres térfogat;

a 3. ábra a pozitív frakciók analitikai RP-HPLCanalízisét mutatja affinitív oszlopon (5. példa);

a 4. ábra a pozitív frakciók preparatív RP-HPLCanalízisét mutatja affinitásoszlopon (5. példa);

az 5. ábra a hirudin és a találmány szerinti inhibitor összehasonlítása HPLC-analízissel (6. példa); 1 =hirudin, 2=új trombininhibitor;

a 6. ábra az RP-HPLC aktív második csúcsának ismételt kromatográfiás analízise (7. példa);

a 7. ábra az RP-HPLC aktív második csúcsának tömegspektroszkópiai vizsgálata (7. példa);

a 8. ábra az RP-HPLC aktív második csúcsának IEF nyomelemvizsgálata (7. példa);

a 9. ábra az RP-HPLC aktív negyedik csúcsának ismételt kromatográfiás vizsgálata (9. példa);

a 10. ábra az RP-HPLC aktív negyedik csúcsának tömegspektroszkópiai vizsgálata (9. példa).

Mint fent említettük, a találmány szerinti trombininhibitorok a Rhynchobdellida rendbe, és a Theromyzon tessulatum fajba tartozó piócák szöveteiből vagy váladékából izolálhatok és tisztíthatok.

Kiindulási anyagként előnyösen a piócák nyálmirigyét használjuk. Mivel a nyálmirigyek kipreparálása külön lépést igényel, és jelentős anyagveszteséggel jár, kiindulási anyagként alkalmazható a piócák feje vagy első harmada.

Az eljárás első lépése általában a piócaszövetek fagyasztása és/vagy fagyasztva szárítása a homogenizálás előtt, amit általában aceton/víz elegyben végzünk. A vízben nem oldható komponensek eltávolításához más poláros, szerves oldószer is felhasználható. Az első lépésben kapott extraktumot előnyösen centrifugáljuk az affinitív kromatográfia előtt a nemkívánatos sejttörmelékek eltávolítása érdekében. Az affinitáskromatográfiát előnyösen trombin-aktív helyeket tartalmazó oszlopon végezzük. A trombin-aktív hely azt jelenti, hogy az oszlopon olyan trombinhelyek találhatók, amelyhez a trombininhibitor kötődik. A trombin-aktív helyekre példaként említhető az immobilizált natív vagy dezaktivált trombin, valamint trombinból származó pepiid, peptidomimetika, vagy más trombinszármazék. A találmány értelmében a trombint vagy más trombin3

HU 226 243 Β1 származékot aktív gélmátrixon immobilizáljuk, előnyösen úgy, hogy a szokásos módon a gélmátrixon lévő azalaktoncsoporttal reagáltatjuk. Egyéb szempontból az affinitáskromatográfiát a standardtechnikákkal végezzük.

A gélszűrést előnyösen az affinitáskromatográfiával együtt végezzük. A találmány értelmében a gélmátrix kizárási határa mintegy 5 kD, ezért a frakcionálást mintegy 1-5 kD intervallumban teszi lehetővé.

Az izolált antitrombin-extraktumon előnyösen reverz fázisú HPLC-analízist végzünk a további tisztításhoz. A fenti polipeptidfragmensek előállíthatók, ha az izolált extraktumot RP-HPLC-lépésben tisztítjuk. Reverz fázisú anyagként alkalmazható például 2-18 szénatomos alifás szubsztituensekkel módosított szilikagél. A találmány szerinti polipeptidek azonban bármely ismert kromatográfiás módszerrel tisztíthatok. A HPLC-tisztítás részleteit a példákban ismertetjük.

A trombininhibitorok aktivitása az extraktumokban és a tisztítási lépések egyes frakcióiban mérhető például az in vitro nyújtott alvadási idővel [F. Markwardt: Meth. Enz. 19, 924-932 (1970)] vagy egy trombinspecifikus kromogén szubsztrátum, így a tozil-glicil-prolilarginin-4-nitro-anilid-acetát (Chromozym TH, Boehringer Mannheim) hasításának csökkenésével [H. U. Bergmeyer: Meth. Enz. Anal. 3. kiadás, 5, 365-394 (1988)].

Mint fent említettük, a találmány szerinti polipeptidek gyógyszerhatóanyagként alkalmazhatók gyógyszerkészítményekben és kombinációkban.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmény adott esetben további hatóanyagot tartalmazhat, amelyre példaként említhetők az antíkoagulánsok, így hirudin vagy heparin, trombolitikus szerek, így plazminogén aktivátor vagy hementin.

A találmány szerinti új polipeptidek és trombininhibitorok farmakológiailag alkalmazható sóvá alakíthatók bármely, nem toxikus, szerves vagy szervetlen savval. Szervetlen savként alkalmazható például a hidrogénklorid, hidrogén-bromid, kénsav vagy foszforsav, valamint savas fémsók, így nátrium-monohidrogén-ortofoszfát és kálium-hidrogén-szulfát. Szerves savként alkalmazhatók mono-, di- és trikarbonsavak, így ecetsav, glikolsav, tejsav, piruvinsav, malonsav, szukcinsav, glutársav, fumársav, malonsav, borkősav, citromsav, aszkorbinsav, maleinsav, hidroxi-maleinsav, benzoesav, hidroxi-benzoesav, fenil-ecetsav, fahéjsav, szalicilsav, valamint szulfonsavak, így metánszulfonsav. A karboxiterminális aminosav sóira példaként említhetők a szervetlen és szerves bázisokkal képzett nem toxikus karbonsavsók. Az ilyen sókra példaként említhetők az alkálifémek, így nátrium és kálium, alkáliföldfémek, így kalcium és magnézium, a lll/A csoportba tartozó könnyűfémek, így alumínium, valamint szerves, primer, szekunder és tercier aminok, így trialkil-aminok, például trietil-amin, prokain, dibenzil-amin, 1-eténamin, Ν,Ν’-dibenzil-etilén-diamin, dihidro-abietil-amin és N-alkil-piperidin.

A gyógyszerkészítményben hordozóanyagként bármely inért, nem toxikus, szilárd vagy folyékony töltőanyag, hígítóanyag vagy kapszulázóanyag alkalmazható, amely káros módon nem befolyásolja a hatóanyagot vagy a beteget. Folyékony hordozóanyagként alkalmazható például steril víz, sóoldat, vizes dextrózoldat, cukoroldat, etanol, glikol és olaj, például petróleum, állati, növényi vagy szintetikus olaj, így mogyoróolaj, szójababolaj vagy ásványi olaj.

A találmány szerinti készítmények a szokásos nem toxikus farmakológiai hordozóanyagokat, hígítóanyagokat, segédanyagokat és egyéb adalék anyagokat tartalmazó dózisegység formájában adagolhatok, előnyösen parenterális módon.

A parenterális adagolás lehet szubkután, intravénás, intraartikuláris és intratracheális injekció vagy infúzió. A további adagolási módokra példaként említhető az orális adagolás és helyi adagolás. A parenterális készítmény előnyösen adagolható intravénásán, egyszeri injekció vagy folyamatos fúzió formájában. Az orális adagolásra alkalmas tabletta és kapszula a szokásos adalék anyagokat tartalmazza, amelyekre példaként említhetők a kötőanyagok, töltőanyagok, hígítóanyagok, tablettázóanyagok, kenőanyagok, szétesést elősegítő anyagok és nedvesítőszerek. A tabletta a szokásos módon előállított bevonattal látható el. Az orális, folyékony készítmények lehetnek vizes vagy olajos szuszpenziók, oldatok, emulziók, szirupok vagy elixírek, vagy alkalmazás előtt vízzel vagy más hordozóanyaggal hígított száraz készítmények. Az ilyen folyékony készítményben alkalmazható szokásos adalék anyagokra példaként említhetők a szuszpendálószerek, emulgeálószerek, nemvizes hordozóanyagok és tartósítószerek.

A helyi adagoláshoz alkalmazható vizes vagy olajos szuszpenzió, oldat, emulzió, gél, előnyösen emulziós kenőcs.

A dózisegység a találmány szerinti polipeptidet a napi szükséges mennyiségben vagy ennek törtrészében tartalmazza. Az optimális, terápiás adagolás és dózis egy adott betegnél, amely lehet humán vagy állat, különböző faktoroktól függ, így az alkalmazott hatóanyag hatékonyságától, a kezelt beteg korától, testtömegétől, általános egészségügyi állapotától, nemétől, táplálkozásától, valamint az adagolás időpontjától és módjától. Függ továbbá a kezelt trombotikus betegség típusától, valamint attól a ténytől, hogy terápiás vagy profilaktikus kezelést alkalmazunk-e.

Ennek megfelelően, a készítmény antikoaguláns hatáshoz szükséges napi dózisa mintegy 0,01-100 mg/kg, előnyösen 0,1-10 mg/kg-testtömeg. Az adagolás formájától függően a dózisegység általában 0,5-10 mg hatóanyagot tartalmaz a testen kívüli vérben antikoaguláns hatás kiváltásához. A farmakológiailag hatékony mennyiség a peptidek vonatkozásában 0,2-150 mg/l, előnyösen 1-20 mg/l a testen kívüli vér mennyiségére vonatkoztatva.

A találmány szerinti polipeptid felhasználható továbbá olyan implantátum vagy testen kívüli gyógyászati eszköz formájában, amely testfolyadékokkal érintkezik, ahol az eszköz felülete lényegében tromborezisztens, és találmány szerinti immobilizált polipeptiddel

HU 226 243 Β1 van bevonva. A találmány szerinti polipeptidet úgy immobilizáljuk a gyógyászati eszközön, hogy annak felülete biokompatibilis és tromborezisztens legyen. Az ilyen eszköz gyakran nedvesíthető felülettel rendelkezik, amely általában indukálja a vérlemezkék aggregációját, és ezért az eszköz implantátumként vagy testen kívüli eszközként a vérrel és más testfolyadékkal érintkezve nem használható. Az ilyen eszközökre példaként említhetők az általában műanyagból és szintetikus rostokból készített protézisek, műszervek, sebészeti varratok, mesterséges érszegmensek, katéterek, dializálók, valamint vér tárolására alkalmas csövek és edények.

A találmányt közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.

1. példa

Antitrombin kimutatása T. tessulatumban

Tíz Theromyzon tessulatum fejet izotóniás sóoldatban homogenizálunk. A homogenizátumot röviden centrifugálva eltávolítjuk a szemcsés anyagot, és a felülúszót antitrombinvizsgálatnak és más haematológiás teszteknek vetjük alá.

Az antitrombinaktivitás meghatározásához 20 μΙ fenti extraktumot 10 μΙ (1 egység) trombinnal keverünk, és a keverékhez 100 μΙ 0,5 mg/ml fibrinogén oldatot adunk, elkeverjük, és 1 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

A vizsgálat részleteit R. T. Sawyer és munkatársai: Comp. Haematol. Int. 1, 35-41 (1991) ismerteti. A Theromyzon tessulatum nyers extraktumának in vitro gátolt alvadási paramétereit az 1. táblázatban foglaltuk össze.

1. táblázat

Antitrombin hatékonyság igazolása T. tessulatumban

	Normál kontroll	Nyers extraktum
(másodperc)
Protrombin idő (külső)	15	42
Aktivált PTT (belső)	40	220
Trombin idő (antitrombin)	45	>600
Reptiláz idő	20	20

A táblázat adataiból látható, hogy a Theromyzon tessulatum fejrésze olyan vízben oldható faktort vagy faktorokat tartalmaz, amelyek lényegesen meghosszabbítják a trombin rögösödési idejét.

2. példa

Kromogén vizsgálat a trombin és az Xa faktor gátlására

a) Trombin gátlása μΙ trombinoldatot (ml-enként 5 NIH egység trombin 0,05 tömeg% PEG 6000-rel kiegészített 250 mmol/l foszfátpufferben, pH=6,5) egy fotométer küvettában

880 μΙ trombinvizsgáló pufferrel (100 mmol/l trisz-HCI, 200 mmol/l NaCI, 0,05 tömeg% PEG, pH=8,3) 5 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubálunk. A reakció megindításához 100 μΙ szubsztrátoldatot (4 mg Chromozym TH, Boehringer, Mannheim, DE, 5 ml vízben oldva) adunk hozzá, és az abszorpciót 405 nm hullámhosszon és 25 °C hőmérsékleten 5 percen keresztül 30 másodperces intervallumokban mérjük.

A gátló hatékonyság méréséhez 10-200 μΙ mintát vagy standardként hirudin 20 μΙ trombinoldattal keverünk, és vizsgálati pufferrel 900 μΙ térfogatra töltjük. A keveréket 5 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd a reakciót 100 μΙ szubsztrátoldat hozzáadásával megindítjuk.

b) Xa faktor gátlása μΙ Xa faktor oldatot (10 egység/0,5 ml oldatban, vízzel 2,0 ml-re töltve) 880 μΙ Xa faktor vizsgálati pufferrel (10 mmol/l Trisz-HCI, 200 mmol/l NaCI, 0,05 tömeg% PEG, pH=8,3) fotométer küvettában 5 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubálunk. A reakció megindításához 100 μΙ szubsztrátoldatot (3,5 mg Chromozym X, Boehringer, Mannheim, DE, 5 ml vízben oldva) adagolunk, és az abszorpciót 205 nm hullámhosszon és 25 °C hőmérsékleten 5 percen keresztül 30 másodperces intervallumokban mérjük.

A gátló hatékonyság vizsgálatához 10-200 μΙ mintát 20 μΙ Xa faktor oldattal keverünk, és vizsgálati pufferrel 900 μΙ térfogatra töltjük. A keveréket 5 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, és a reakciót 100 μΙ szubsztrátoldat hozzáadásával indítjuk.

3. példa

Trombininhibitor kinyerése és tisztítása

Theromyzon tessulatumból

1. lépés

1000 kétszer etetett Theromyzon tessulatum első harmadát -70 °C hőmérsékletre fagyasztjuk, és liofilizáljuk. Az anyaghoz 35 ml 40% acetont adunk, és a szuszpenziót ultratorax készüléken háromszor 10 másodpercen keresztül homogenizáljuk. 2 percen keresztül ultrahanggal kezeljük, majd 30 másodpercen keresztül tovább homogenizáljuk. A homogenizátumot 15 percen keresztül 6000 fordulat/perc fordulatszámon centrifugáljuk. Ennek során egy első csapadékot és egy első felülúszót (S1) kapunk, ez utóbbit eltesszük.

Az első csapadékhoz további 35 ml 40% acetont adunk, és második homogenizálást végzünk (egyszer 10 másodperc, 2 perc ultrahangos besugárzás és egyszer 30 másodperc). A homogenizátumot ismét 15 percen keresztül 6000 fordulat/perc fordulatszámon centrifugáljuk, melynek során egy második csapadékot és egy második felülúszót kapunk. A második felülúszót az első felülúszóhoz adjuk. Ezek elegyéhez 80 térfogat% acetont adunk.

Ecetsavval pH=4,0 értékre állítjuk, és a szuszpenziót 20 percen keresztül 6000 fordulat/perc fordulatszámon centrifugáljuk, melynek során egy harmadik csapadékot és egy harmadik felülúszót kapunk. A harmadik csapadékot eldobjuk. A harmadik felülúszót forgó vákuumbepárlóban negyedrész térfogatra bepároljuk.

HU 226 243 Β1

Az acetonmentes extraktum az 1. példa szerinti véralvadás-vizsgálattal és a 2. példa szerinti kromogén vizsgálattal ellenőrizve pozitív antitrombinhatással rendelkezik.

2. lépés

Az acetonmentes extraktumot PD-10 oszlopra (Pharmacia) visszük puffercsere miatt. Az oszlopot affinitáspufferrel (20 mmol/l Trisz-HCI, 50 mmol/l NaCI, pH=7,4) egyensúlyozzuk ki, és 2,5 ml 1. lépés szerinti extraktumot viszünk fel az oszlopra. Az eluátumot antitrombinhatásra vizsgáljuk.

A trombin-affinitásoszlop előállítása:

400 mg száraz azlakton tentakle fraktogél mátrixot (E. Merck, Darmstadt, DE) 7 ml kapcsolópufferben (50 mmol/l foszfát, 150 mmol/l NaCI, pH=7,5) 2 órán keresztül szobahőmérsékleten szuszpendálunk. A szuszpenziót centrifugálással és kapcsolópufferben történő újrafelvétellel kétszer mossuk. 5000 NIH egység borjútrombint (Sigma) 1 ml vízben oldunk, és pH=7,5 értékre állítjuk. Ezt a trombinoldatot a kapcsolópufferrel egyensúlyozzuk ki PD-10 gélszűréssel. A kiegyensúlyozott trombinoldathoz 1 mol/l végső koncentrációig nátrium-szulfátot adagolunk. A trombinfehérjét közvetlenül az aktivált gélmátrixra pipettázzuk, és enyhe keveréssel 4 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül kapcsoljuk. Ezután háromszor 5 térfogatrész kapcsolópufferrel mossuk, 1,5 ml etanol-aminnal dezaktiváljuk, és egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten óvatosan rázzuk. A mátrixot kétszer 5 térfogatrész acetátpufferrel (100 mmol/l nátrium-acetát, 500 mmol/l nátrium-klorid, pH=4,0) mossuk, majd kétszer 5 térfo10 gatrész affinitáspufferrel mossuk.

A PD-10 oszlop aktív eluátumát az affinitásoszlopra visszük egy perisztaltikus pumpával (10 ml/óra), a nem kötött frakciót összegyűjtjük, és az oszlopot 12 ml affinitáspufferrel mossuk (első mosás). Az eluálást 6 ml ace15 tátpufferrel (pH=4,0) végezzük, és 0,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az elúciós profilt az 1. ábra mutatja.

Az első eluálást egy második lépés követi, amelyben 6 ml acetátpuffert (pH=3,0) alkalmazunk, és 1,5 ml frakciót gyűjtünk. Az oszlopot 25 ml affinitáspufferrel egyensúlyozzuk ki.

Az extrakciós és affinitív lépés eredményeit a 2. táblázatban foglaljuk össze.

2. táblázat

Frakció	Térfogat (ml)	Alvadási idő (másodperc)	Trombingátlás (egység)	Xa faktor gátlás (egység)
Üres	-	20,5	0	0
Aceton	34	59,4	33	-
Extraktum; nem kötött affinitás	34	24,3	1,8	1,1
1. mosás	24	20,2	1,6	1,0
1. affinitáseluátum	4	>600	25	0,2
2. affinitáseluátum	4	22,1	0	0

4. példa

Theromyzon tessulatumból származó aktív trombininhibltor gélszűrése Az aktív anyagot 25 ml térfogatú Biogel P4 gélszűrö oszlopra (Biorad) visszük. Az eluálást 20 mmol/l TriszHCI és 50 mmol/l NaCI eleggyel (pH=7,4) végezzük 4 ml/óra áramlási sebességgel. Az 1 ml térfogatú frakciókban vizsgáljuk az antitrombin-hatékonyságot.

A P4 gélmátrix kizárási határa 5000 D és a frakció- 45 nálást 1000-5000 D móltömeg intervallumban végzi. Meglepő módon azt találtuk, hogy az antitrombin-hatékonyság a megadott frakciótérfogatban eluálódik, vagyis a látszólagos móltömeg kisebb, mint 5000 D (2. ábra). Ez a viselkedés ellentétes a hirudinnal (móltömeg 7000 D), amely a fenti körülmények között a kizárt térfogatban jelenik meg. A P4 oszlop kalibrálása alapján mintegy 3000 D móltömeget számolunk a Theromyzon tessulatumból származó antitrombinaktivitáshoz.

5. példa

Theromyzon tessulatumból származó tisztított trombininhibitor reverz fázisú HPLC tisztítása A 3. példa szerinti affinitáskromatográfia aktív eluátumát RP-HPLC eljárással tovább tisztítjuk. 20 μΙ min- 60 tát HPLC-oszlopra (LiChrospher 3 000 RP-18, 5 pm; E. Merck, Darmstadt, DE) viszünk, és a következő acetonitril gradienssel eluáljuk 1,0 ml/perc áramlási sebesség mellett:

A puffer: 0,1% trifluor-ecetsav vízben

B puffer: 0,08% trifluor-ecetsav acetonitrilben

Gradiens: 0-2 perc 10% B

2- 3 perc injektálás

3- 28 perc 60% B.

A 3. ábra egy tipikus analitikai kromatogramgörbét mutat 220 nm-nél felvéve. A trombin elleni hatás a 2 és 4 csúcsban található. Az analitikai HPLC-vizsgálat eredményeit alkalmazzuk az azonos körülmények kö50 zött végzett preparatív szétválasztáshoz.

A preparatív tisztítást az affinitív kromatográfiából származó 500 μΙ mintával végezzük (4. ábra). Az egyedi csúcsokat összegyűjtjük, és forgó vákuumbepárlóban bepároljuk. A szárított frakciókat vízben fel55 vesszük, és az antitrombinhatást véralvadás-vizsgálattal, és a 2. példa szerinti kromogén vizsgálattal ellenőrizzük.

A két vizsgálati rendszerben a fő aktivitás a 2 és csúcsban mérhető, és némi aktivitás mutatható ki az csúcsban, ami feltehetően arra utal, hogy a 4 csúcs

HU 226 243 Β1 szennyezi az 5 csúcsban található anyagot. A kromatogram többi csúcsa trombin elleni hatást nem mutat. A 2 és 4 csúcs aktivitásának összege megközelíti az összaktivitás 93%-át.

6. példa

A találmány szerinti trombininhibitor és a hirudin

HPLC analízisének összehasonlítása

Annak igazolására, hogy a találmány szerinti inhibitor alapvetően más molekula, mint a hirudin, a következő vizsgálatot végezzük. Az 5. példa szerinti HPLC vizsgálat aktív 2 csúcsához azonos fehérje koncentrációban tisztított hirudint adunk, és az elegyet RP-HPLC vizsgálatnak vetjük alá aceonitril gradienssel (40-70%). Két csúcs található, amely antitrombinhatást mutat (5. ábra). Az egyedi inhibitorokkal végzett összehasonlító vizsgálat alapján azonosíthatók az 5. ábrán található csúcsok.

Az 5. ábráról látható, hogy a találmány szerinti antitrombin a hirudintól eltérő pozícióban eluálódik. Ugyanez igazolható az 5. példa szerinti HPLC szétválasztás aktív 4 csúcsára.

7. példa

A 2 csúcs antitrombin hatékonyságának további jellemzése

Tisztítás

Az RP-HPLC szétválasztás aktív 2 csúcsát a 3. ábrával azonos körülmények között újrakromatografáljuk. A 6. ábráról látható, hogy kis mennyiségű szennyező anyag még elválasztható a fő aktív csúcstól, ami homogén preparátumot ad a második RP-HPLC szétválasztásban (lásd 8. ábra, amely a frakció kapilláris elektroforézisét mutatja).

Trombingátlás

Az HP-HPLC szétválasztás 2 csúcsa aktivitást mutat a véralvadás-vizsgálatban (trombinidő nagyobb, mint 600 másodperc/5 μΙ), valamint a 2. példa szerinti kromogén antitrombin vizsgálatban. Ez utóbbi vizsgálat aktivitása 3,2 egység/250 μΙ. Xa faktor gátló hatás nem mutatható ki a 2 csúcsban a 2. példa szerinti vizsgálattal, ami arra utal, hogy az anti-FXa hatás kisebb, mint az antitrombinhatás 1%-a. A szóban forgó inhibitor tehát a trombinra nézve igen specifikus.

Aktívhely-titrálás

A trombinnal szembeni inhibitor konstans megállapításához spektrofluorometriás titrálást végzünk standardizált trombinoldaton a találmány szerinti inhibitorral. A vizsgálat részleteit G. W. Jameson és munkatársai: Biochem. J. 131, 107-117 (1973) ismerteti.

Röviden, a Tos-Gly-Pro-Arg-AMC fluorogén szubsztrátumot 50 pmol/l koncentrációban alkalmazzuk. A vizsgálatot 100 mmol/l Trisz-HCI, 200 mmol/l NaCal és 0,05 tömeg% PEG 6000 elegyben (pH=7,8) végezzük 25 °C hőmérsékleten. 20 pmol/l aktív helyre titrált humán alfa-trombint inkubálunk az inhibitorral 0,2-5xEo értéknél 10 percen keresztül, és a szubsztrátum hozzáadása után egyenletes sebesség mérhető. A kinetikus állandót nem lineáris regressziós analízissel grafit-programmal [R. J. Leatherbarrow: Erithacus

Software, Staines, GB (1980)] számoljuk. A Kj-értéke 178 femtomolar.

Móltömeg

Az aktív 2 csúcs móltömegét lézerdeszorpciós tömegspektrometriával mérjük a MALDI-TOF módszerrel (Kratos). 0,5 μΙ mintát néhány μΙ acetonban felvett dihidroxi-benzoésawal keverünk, amely mátrixként szolgál. A keveréket hideg levegőn szárítjuk egy ezüst mintatartóban, majd a készülékbe helyezzük. A kapott tömegspektrumot ismert móltömegű standard fehérjével kalibráljuk. A móltömegnek megfelelő csúcsértéke mintegy 9000 D (7. ábra).

Izoelektromos fokuszálás

Az inhibitor izoelektromos pontját IEF módszer szerinti kapilláris elektroforézissel (Applied Biosystems) mérjük. A 8. ábrán látható, hogy az inhibitorcsúcs a standard proteinhez viszonyítva 4,9 pl értéknél jelentkezik.

8. példa

Az antitrombinhatással rendelkező 2 csúcs szekvenciaadatai

Az 5. példa szerinti RP-HPLC szétválasztás 2 csúcsán standard edman degradációs kémiával Beckman peptidszekvenálóban meghatározott N-terminális szekvencia a következő: H-Glu-Asp-Asp-Asn-Pro-Gly-ProPro-Arg-Ala-Cys-Pro-Gly-Glu-OH.

9. példa

Az antitrombinhatással rendelkező 4 csúcs további jellemzése

Tisztítás

Az RP-HPLC szétválasztás aktív 4 csúcsát azonos körülmények között újrakromatografáljuk. A 9. ábrán látható, hogy kevés szennyező anyag még mindig elválasztható a főcsúcstól, amelynek hatására a második RP-HPLC szétválasztásnál homogén készítményt kapunk.

Trombingátlás

Az RP-HPLC szétválasztás 4 csúcsa aktív a véralvadás-vizsgálatban (trombinidő nagyobb, mint 600 másodperc/5 μΙ), valamint a 2. példa szerinti kromogén antitrombintesztben. Ez utóbbi hatékonyság 1,3 egység/250 μΙ. Xa faktor gátló hatás nem mutatható ki a 2. példa szerint, ami arra utal, hogy az anti-FXa hatás kisebb, mint 1% az antitrombinhatásra vonatkoztatva. Ebből az következik, hogy a szóban forgó inhibitor a trombinra nézve igen specifikus.

Aktívhely-titrálás

A trombinnal szembeni inhibitor állandó meghatározásához spektrofluorometriás titrálást végzünk standardizált trombinoldaton a találmány szerinti inhibitorral. A részleteket a 7. példa ismerteti. A mért K_rérték 240 femtomolar.

Móltömeg

Az aktív 4 csúcs móltömegét lézerdeszorpciós tömegspektrometriával határozzuk meg MALDI-TOF módszerrel (Kratos) a 7. példában leírt módon. A kapott tömegspektrumot ismert móltömegű standard fehérjékkel kalibráljuk. A kapott csúcs móltömege mintegy 14 kD (10. ábra).

HU 226 243 Β1

10. példa

Az antitrombinhatású 4 csúcs szekvenálása

A HPLC szétválasztás (5. példa) 4 csúcsában kapott anyag N-terminális szekvenciája a Beckman peptidszekvenálóban végzett standard edman lebontás szerint a következő:

11. példa

Az 1-5. példákban leírt módon antitrombinhatással rendelkező polipeptidek izolálható a következő Theromyzon fajokból: T. binannulatum, T. cooperi, T. gajaewi, T. maculosum és T. sexoculatum.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Theromyzon tessulatum fajba tartozó piócák nyálmirigyéből izolált és trombingátló hatással rendelkező polipeptid, melynek móltömege 9 kD, és N-terminális aminosavszekvenciája:

H-Glu-Asp-Asp-Asn-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Ala-Cys-ProGly-Glu-OH, vagy melynek móltömege 14 kD, és N-terminális aminosavszekvenciája:

H-Ser-Glu-Leu-Gly-GIn-Ser-Cys-Ser-Lys-Glu-Asn-ProCys-Pro-Ser-Asn-Met-Lys-Cys-Asn-Arg-Glu-Thr-PheLys-OH.
2. Eljárás az 1. igénypont szerinti polipeptid izolálására, azzal jellemezve, hogy Theromyzon tessulatum fajba tartozó fagyasztott és liofilizált piócák nyálmirigyét vagy első harmadát víz/aceton eleggyel homogenizáljuk, az extraktumot centrifugáljuk, a vízben oldható felülúszót trombinspecifikus affinitáskromatográfiás oszlopra visszük és a trombinra aktív frakciókat legalább egy gélszűréses kromatográfiás oszlopra és legalább egy reverz fázisú HPLC-oszlopra visszük.
3. Az 1. igénypont szerinti polipeptid trombingátló gyógyszerként történő alkalmazásra.
4. Gyógyszerkészítmény, amely 3. igénypont szerinti polipeptidet tartalmaz gyógyszerészeti hordozóanyag, segédanyag vagy hígítóanyag mellett.
5. Az 1. igénypont szerinti polipeptid alkalmazása a trombózissal rokon betegségek in vivő kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.
6. Az 1. igénypont szerinti polipeptid alkalmazása a testen kívüli vérben bekövetkező vériemezke-aggregáció gátlására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.
7. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 2. igénypont szerint előállított polipeptidet gyógyszerészeti hordozóanyaggal, segédanyaggal vagy hígítóanyaggal keverünk, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.