KR100335536B1 - 트롬빈억제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 린코브델리다 목, 특히 쎄로마이존 테슐라튬 종 거머리의 조직 또는 분비물의 추출물로부터 수득할 수 있는 항트롬빈 활성을 갖는 신규한 폴리펩티드에 관한 것이다. 이 폴리펩티드는 약 14kD, 9kD 및 3kD의 분자량을 가지며 혈전증 관련 질환 및 관련 증상의 치료를 위한 약학 조성물에 사용할 수 있다.

Description

트롬빈 억제제
발명의 배경
본 발명은 신규한 트롬빈 억제제, 특히 거머리 조직 및 거머리 분비물로부터 유래된 트롬빈 억제제에 관한 것이다.
트롬빈은 피브린 응괴 형성을 촉매하고, 따라서 혈액 응고를 억제한다. 더욱이, 트롬빈은 다수의 다른 생물학적조절 역할, 예를 들어 내피 세포에 의해 혈소판 활성 인자(PAF) 합성을 자극함으로써 혈소판 응집의 직접적인 활성화 및 염증 반응의 활성화를 조절하는 역할을 한다. 이는 트롬빈이 예를 들어 심혈관 질환과 같은 혈전증 관련 질환에 중추적인 역할을 함을 의미한다. 따라서, 신규하거나 개선된 트롬빈 억제제 및 응고방지제 각각에 대한 계속적인 연구가 큰 관심이 되고 있다.
잘 알려진 트롬빈 억제제의 예로 헤파린 및 히루딘이 있다.
헤파린은 항트롬빈 III의 응고방지 활성을 촉진시킨다. 이러한 헤파린은, 트롬빈 활성이 혈전의 발달 또는 확장에 관련되어 있는 정맥성 혈전색전증과 같은 질환의 치료에 널리 사용되어 왔다. 그러나, 항트롬빈 III가 감소되는 경우, 예를 들어 혈전증이 신장염 또는 전이된 혈관내 응고 증후군(DIC)과 관련된 경우의 치료에는 효과적이지 않다. 더구나, 헤파린은 출혈 및 혈소판감소를 비롯한 다수의 바람직하지 못한 부작용을 일으킨다.
히루딘은 잘 알려지고 잘 특성화된 폴리펩티드로, 트롬빈에 대해 특이적인 것으로 공지되어 있으며, 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)종 거머리의 침샘 및 다른 조직들의 추출물로부터 단리시킬 수 있다. 히루딘 및 그의 유도체를 또한 재조합 기법에 의해 수득할 수도 있다. 상기 폴리펩티드는 7000D의 비교적 저분자량을 가지며 65개의 아미노산으로 이루어진다. 히루딘의 아미노산 서열은 도트(Dodt) 등에 의해 제일 먼저 결정되었다(FEBS Letters,165, 180-184(1984)). 히루딘의 3개의 주 변종(HV1, HV2, HV3)이 의료용 거머리 히루도 메디시날리스에서 발견되었고, 이들은 단지 전체 아미노산 위치중 약 10%만이 상이하다. 가장 현저한 상이성은 상기 분자의 N-말단의 처음 2개 위치, 즉 히루딘 변종 1(HV1)의 Val-Val 과 히루딘 변종 2(HV2)의 Ile-Thr이다. 이러한 차이는 부가적인 성질이며 히루딘-트롬빈 상호작용의 기능 또는 특이성에 영향을 미치지 않는다. 히루딘은 강력한 천연 응고 억제제이다. 이는 정맥 혈전증, 혈관 문합 폐색 및 트롬빈-유발된 전이된 혈관내 응고를 방지하는데에 그 효능이 입증되었으나, 출혈 시간이 지연된다.
계통 발생학적으로, 의료용 거머리 히루도 메디시날리스는 히루디니다에(Hirudinidae) 거머리과의 히루디니나에(Hirudininae)아과의 일원이다(알티 소여(R. T. Sawyer)의 문헌["Leech Biology and Behaviour", Oxford University Press, Vol. 2, p.688, 1986]), 혁신적으로 보다 진보된 거머리 종은 히루디나리아 마닐렌시스(Hirudinaria manillensis)로, 이는 같은 히루디니다에 과의 히루디나리이나에(Hirudinariinae)아과에 속한다. 의외로, 히루딘과 관련되기는 하지만 명백하게 매우 다른 동형 히루딘이 최근에 국제 특허 공개공보 제 WO90/05143 호에 기술된 바와 같이 히루디나리아 마닐렌시스에서 발견되었다. 상기 동형 히루딘은 히루도 메디시날리스의 히루딘과 비교시 거의 40%의 아미노산 위치가 다르다. 상기 언급한 2개의 종, 즉 히루도 메디시날리스와 히루디나리아 마닐렌시스는 아르힌코브델리다(Arhynchobdellida) 거머리 목("턱뼈가 있는 거머리")에 속한다. 아르힌코브델리다 목 이외에, 하나의 다른 주 거머리 목으로, 린코브델리다(Rhynchobdellida)("코 거머리")가 있다(알티 소여 (R.T. Sawyer)의 문헌["Leech Biology and Behaviour", Oxford University Press, Vol. 2, p.651, 1986]). 침 단백질에 대해서 가장 잘 연구된 린코브델리다 목의 일원은 "아마존 거머리"인 하에멘테리아 길리아니(Haementeria ghilianii)이다. 이 종은 의외로 항트롬빈을 함유하지 않음이 입증되었다(부드진스키 (Budzynski) 등의 문헌[Proc. Soc. Exp. Biol. Med,168, 259-265, 1981]). 대신에, 하에멘테리아 길리아니는 헤멘틴이라 지칭되는 피브리노겐분해 효소(미국 특허 제 4,390,630호) 뿐만 아니라 혈액응고 인자 Xa 의 억제제를 함유한다(씨콘드라(C. Condra) 등의 문헌 [Thromb. Haemost.,61, 437-441, 1986)].
상기 발견 및 후속의 연구를 기본으로, 항트롬빈과 갈은 활성이 아르힌코브델리다 목의 거머리로 제한되는 반면, 상기 활성은 현재 린코브델리다 목에는 부족한 것으로 생각됨이 일반적으로 받아들여지고 있다.
상기 논의된 개선에도 불구하고, 헤파린과 히루딘 외에, 응괴 형성의 억제, 트롬빈-유발된 혈소판 활성 또는 내피 세포 활성에 증가된 효능을 가져 상업적으로 적당한 양으로 생산될 수 있는 추가의 응고방지제 및 항트롬빈 각각에 대한 요구가계속되고 있다.
발명의 요약
놀랍게도, 항트롬빈과 같은 활성을 갖는 화합물을 린코브델리다 목, 바람직하게는 쎄로마이존(Theromyzon)과, 가장 바람직하게는 쎄로마이존 테슐라튬(Theromyzon tessulatum) 종 거머리 (때때로 "새 거머리"로 지칭됨)의 조직 및 분비물로부터 단리시킬수 있음이 밝혀졌는데, 그 이유는 상기 종이 물새의 비공으로부터 혈액을 빠는 이례적으로 분화된 생활사를 갖기 때문이다.
따라서, 본 발명의 목적은 트롬빈 억제 화합물의 제조를 위해서 린코브델리다 목, 바람직하게는 쎄로마이존 테슐라튬 종의 거머리를 사용하는 것이다. 트롬빈 억제 활성은 상기 거머리의 수용성 성분들을 포함하는 추출물에서 측정될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 목적은 수용성 성분들을 함유하는 린코브델리다 목 또는 쎄로마이존과 또는 쎄로마이존 테슐라튬 종 거머리의 조직 또는 분비물로부터 트롬빈 억제 활성을 갖는 추출물을 제조하는 것이다.
활성 트롬빈 억제제를 상기 추출물로부터 단리시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 동결 및 동결건조된 거머리의 앞부분 1/3을 물/아세톤으로 균질화시켜 수득한 추출물을 트롬빈-특이적 친화성 크로마토그래피에 이어서 하나 이상의 겔 여과 단계 및 하나 이상의 역상 HPLC 단계에 의해 정제시킴으로써, 상기 및 특허 청구범위에 정의된 추출물로부터 수득할 수 있는 트롬빈 억제 활성을 갖는 폴리펩티드로서 동정할 수 있는 본질적으로 정제된 트롬빈 억제제를 제공하는 것이다.
트롬빈 억제제는 바람직하게는 각각 분자량 약 3kD, 대략 9kD 및 대략 14kD를 갖는 환성 폴리펩티드 단편들을 포함한다. 이들 활성 폴리펩티드는 결국 모 트롬빈 억제제 또는 트롬빈 억제제 전구체의 분해 산물로서 간주될 수 있다.
본 발명에 따른 트롬빈 억제제는 공지된 항트롬빈, 특히 히루딘과 분자량 뿐만 아니라, 등전점 및 N-말단 아미노산 서열이 상이하므로(이것은 다른 트롬빈 억제제와 제한된 상동성(40% 이하)을 보인다) 신규한 것이다.
따라서, 본 발명의 추가의 목적은 상기 추출물로부터 트롬빈 억제 활성 및 약 3kD의 분자량을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 트롬빈 억제제를 단리하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 트롬빈 억제 활성을 갖고 분자량이 약 9kD이고 N-말단 아미노산 서열이 Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu인 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 트롬빈 억제제를 제공하는 것이다.
추가로, 본 발명의 목적은 트롬빈 억제 활성을 갖고 분자량이 약 14kD이고 N-말단 아미노산 서 열이 Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys인 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 트롬빈 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, "약 3(9, 14)kD"란 용어는 ±1kD, 바람직하게는 0.5kD의 최대 편차를 포함한다. 또한, 본 발명의 목적은 상기 및 하기의 서열, 및 주요 생물학적 특성을 보존하는 아미노산이 변화된 아미노산 서열들을 포함하는 것이다. 이것은 또한 변종, 단편, 서브유닛, 천연 변이 및 무작위적으로 발생된 인공 변이를포함한다. 개시된 펩티드로부터 유도된 융합 단백질과 같은 하이브리드 단백질도 또한 포함된다.
본 발명은 또한 린코브델리다 목, 바람직하게는 쎄로마이존 테슐라튬 종 거머리의 조직 또는 분비물을 균질화시키고 이들의 수용성 성분들을 포함하는 분획을 제조함으로써 상기 및 특허청구범위에 정의된 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 추출물을 트롬빈 특이적 친화성 크로마토그래피 및 하나 이상의 추가의 표준 크로마토그래피 단계에 의해서 정제시킴으로써 특허청구범위에 정의된 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 트롬빈 억제제는 응고방지 및 항트롬빈 성질을 갖는다. 따라서, 상기 억제제는 응고 시스템이 영향받는 모든 임상적 상태에 사용될 수 있다. 이러한 용도로는 혈전증, 발작, 심근 경색증, 심정맥 혈전증, 사지 동맥의 폐색, 폐 혈전증, 망막 동맥 혈전증 또는 임의의 다른 혈전형성증의 치료가 있다. 또한, 트롬빈 억제제(들)를 동맥정맥 문합 환자, 또는 관상동맥 우회 수술을 받은 환자에게 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 또한 혈액 또는 혈액 제품의 보존 및 생체외용 혈액 또는 혈장 순환을 위해, 혈전증 또는 동백 재폐색의 예방에 있어 응고방지제로서도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 트롬빈 억제제(폴리펩티드)는 주로 히루딘에 필적할만한 생물학적 활성을 나타낸다. 트롬빈에 대한 결합 친화성(억제 상수)조차도 현재까지 가장 강력한 트롬빈 억제제로서 알려진 히루딘과 비교하여 약간 증가된다.
따라서, 본 발명의 추가의 목적은 약제, 특히 혈전증 관련 질환의 생체내 치료, 및 생체외용 혈액중의 혈소판 응집 및 혈병의 억제를 위한 약제로서 사용하기 위해, 상기 및 특허청구범위에 정의된 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
최종적으로, 각각 상기 정의한 바와 같은 트롬빈 억제제 또는 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 상기 언급한 혈전중 관련 질환을 치료하기 위한 약학 조성물이 본 발명에 의해 추가로 제공된다.
제 1 도는 친화성 컬럼으로부터의 항트롬빈의 용출 프로파일을 도시 한다(실시예 3).
제 2 도는 바이오겔 P4에서의 쎄로마이존 테슐라튬으로부터 유래된 항트롬빈의 겔 여과 분석을 도시한다(실시예 4).
제 3 도는 친화성 단계로부터의 양성 분획들의 분석 RP-HPLC를 도시한다(실시예 5).
제 4 도는 친화성 단계로부터의 양성 분획들의 예비 RP-HPLC를 도시한다(실시예 5).
제 5 도는 HPLC상에서의 본 발명에 따른 억제제와 히루딘의 비교를 도시한다(실시예 6).
제 6 도는 RP-HPLC로부터의 활성 피크 2의 재크로마토그래피를 도시한다(실시예 7).
제 7 도는 RP-HPLC로부터의 활성 피크 2의 질량 스펙트럼을 도시한다(실시예 7).
제 8 도는 RP-HPLC로부터의 활성 피크 2의 IEF 자취를 도시한다(실시예 7).
제 9 도는 RP-HPLC로부터의 활성 피크 4의 재크로마토그래피를 도시한다(실시예 9).
제 10 도는 RP-HPLC로부터의 활성 피크 4의 질량 스펙트럼을 도시한다(실시예 9).
도면의 상세한 설명은 실시예 1 내지 10에서 설명한다.
린코브델리다 목, 바람직하게는 쎄로마이존 과 거머리의 조직 또는 분비물로부터 본 발명에 따른 트롬빈 억제제(들)를 단리하거나 정제할 수 있다. 쎄로마이존 과의 거머리로부터, 유사한 활성을 갖되 단지 부수적 차이만 있는 트롬빈 억제제를 수득할 수 있다. 쎄로마이존과의 적합한 종들의 예로 쎄로마이존 비난뉼라튬(binannulatum), 쎄로마이존 코오페리 (cooperi), 쎄로마이존 가르자에위(garjaewi), 쎄로마이존 마큘로슘(maculosum), 쎄로마이존 몰리씨뮴(mollissimum), 쎄로마이존 팔렌스(pallens), 쎄로마이존 프로핀큠(propinquum), 쎄로마이존 루데(rude), 쎄로마이존 섹소큘라튬(sexoculatum), 및 특히 쎄로마이존 테슐라튬이 있다.
바람직하게는, 상기 거머리들의 침샘을 본 발명에 따른 공급원으로서 사용한다. 그러나, 침샘을 준비하는 것은 힘이 들고 물질의 상당한 손실을 수반하므로, 또한 공급원으로서 상기 거머리들의 두부 또는 앞부분 1/3을 사용할 수 있다.
전형적으로, 상기 방법의 첫번째 단계는 전형적으로 아세톤 또는 아세톤/물혼합물중에서 수행되는 균질화에 앞서 거머리 조직을 실질적으로 동결시키고/시키거나 동결 건조시킴을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 다른 극성 유기 용매를 비-수용성 성분들의 제거를 위해서 사용할 수 있다. 1 단계에 의해 수득된 추출물을 친화성 크로마토그래피를 수행하기 전에 불필요한 세포 찌꺼기를 제거하기 위해서는 원심단리하는 것이 또한 바람직하다. 상기 친화성 크로마토그래피는 "트롬빈 활성 부위"가 제공된 컬럼을 사용하는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 "트롬빈 활성 부위"란 용어는 트롬빈 억제제가 부착할 수 있는 컬럼에서 트롬빈 부위가 존재함을 의미한다. 트롬빈 활성 부위의 예로는 고정화된 천연 또는 비활성화된 트롬빈을 비롯하여 또한 트롬빈-유도된 펩티드, 펩티드유사체 또는 다른 트롬빈 유도체가 있다. 본 발명에 따라, 트롬빈 또는 트롬빈 유도체를 공지된 방법에 따라 바람직하게는 활성 겔 매트릭스의 아즐락톤 그룹과 반응시켜 활성 겔 매트릭스에 고정화시킨다. 그렇지 않으면, 친화성 크로마토그래피를 표준 기법에 따라 수행한다.
겔 여과 방법을 친화성 크로마토그래피와 함께 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 겔 매트릭스는 약 5kD의 배제 한계를 가지며, 따라서 약 1kD 내지 5kD 범위에서 분별시킨다.
단리된 항트롬빈 추출물을 추가의 정제를 위해서 추가로 역상(RP) HPLC하는 것이 바람직하다. 상술한 바와 같은 폴리펩티드 단편들은 상기 단리된 추출물을 RP-HPLC에 의해 정제함으로써 수득할 수 있다. 적합한 역상 물질의 예로는 C2-C18지방족 치환체로 변형시킨 실리카겔이 있다. 그러나, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 다른 공지된 크로마토그래피 과정에 의해 정제시킬 수 있다. HPLC 정제에 대한 상세한 설명은 실시예에 나타나 있다.
정제 단계의 특정 분획 및 추출물중의 트롬빈 억제제 활성은 응고 시간의 연장(에프 마르크바르트(F. Markwardt)의 문헌[Meth. Enz.,19, 924-932, 1970]) 또는 하우 베르크마이어 (H.U Bergmeyer)의 문헌[Meth. Enz. Anal., 3rd Ed., Vol. 5, 365-394, 1988]에 기재된 바와 같이 토실-글리실-프롤릴-아르기닌-4-니트로아닐리드 아세테이트(크로모자임 TH, 베링거 만하임)와 같은 트롬빈 특이적 발색 기질의 절단의 감소에 의해 생체외에서 측정될 수 있다.
상기 지적한 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 약학 조성물 및 조합물에서 약학적으로 효과적인 화합물로서 적합하다.
본 발명에 따른 약학 배합물은 선택적으로 응고방지제, 예를 들어 히루딘 또는 헤파린, 또는 혈전분해제, 예를 들어 플라스미노겐 활성제 또는 헤멘틴과 같은 추가의 활성 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 폴리펩티드 및 트롬빈 억제제는 각각 임의의 무독성 유기산 또는 무기산과 함께 약학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 무기산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산 또는 인산, 및 나트륨 모노하이드로겐 오르토포스페이트 및 황산 수소 칼륨과 같은 산 금속염이 있다. 유기산의 예로는 모노, 디 및 트리 카복실산, 예를 들어, 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 및 메탄 설폰산과 같은 설폰산이 있다. 카복시 말단 아미노산 잔기 염으로는 임의의 적합한 무기 또는 유기 염기와 함께 형성된 무독성 카복실산 염이 포함된다. 이들 염의 예로는 나트륨 및 칼륨과 같은 알칼리 금속, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속, 알루미늄을 비롯한 IIIA족 경금속과 유기 1급, 2급 및 3급 아민, 예를 들어 트리에틸아민을 비롯한 트리알킬아민, 프로카인, 디벤질아민, 1-에텐아민, N,N'-디벤질에틸렌-디아민, 디하이드로아비에틸아민 및 N-알킬피페리딘의 염이 포함된다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"란 용어는 활성 화합물 또는 환자에게 불리하게 반응하지 않는 불활성, 무독성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 적합하고 바람직한 액체 담체, 예를 들어 멸균수, 염수, 수성 덱스트로즈, 당용액, 에탄올, 글리콜 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유 및 광유를 비롯한 오일이 당해분야에 잘 공지되어 있다.
본 발명에 따른 배합물을 비경구 투여에 전형적인 통상의 약학적으로 허용가능한 무독성 담체, 희석제, 보조제 및 비히클을 함유하는 단위 투여량으로 투여할 수 있다.
본원의 "비경구"란 용어는 피하, 정맥내, 관절내 및 기관내 주입 및 주사 기법을 포함한다. 또한, 경구 투여 및 국소 적용과 같은 다른 투여도 적합하다. 비경구 조성물 및 조합물은 공지된 과정에 따라 환괴 형태 또는 일정한 주입으로서 정맥내 투여하는 것이 가장 바람직하다. 경구 투여용 정제 및 캡슐은 통상적인 부형제, 예를 들어 결합제, 충전제, 희석제, 타정제, 윤활제, 붕해제 및 습윤제를 함유한다. 정제는 당해분야에 잘 공지된 방법에 따라 피복시킬 수 있다. 경구 액체 제제는 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 유화액, 시럽 또는 엘릭서의 형태이거나, 또는 사용전에 물 또는 또다른 적합한 비히클로 재조성하는 건조물로서 존재할 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제, 유화제, 비-수성 비히클 및 방부제와 같은 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다. 국소적용제는 추성 또는 유성 현탁액, 용액, 유화액, 젤리 또는 바람직하게는 유화 연고의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 단위 투여량은 본 발명에 따른 1일 단백질 필요량, 또는 필요 투여량을 구성하기 위한 상기량의 수회 이하의 분할용량을 함유할 수 있다. 치료할 환자(인간을 비롯한 포유동물)에 대한 최적의 치료학적으로 허용가능한 투여량 및 투여속도는 다양한 인자들, 예를 들어 사용되는 특정 활성 물질의 활성, 치료 대상자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성, 식이, 투여 시간 및 경로, 세척 속도, 치료 목적, 즉 치료 또는 예방, 및 치료할 혈전성 질환의 성질, 항혈소판 또는 응고방지 활성에 따라 변한다.
따라서, 치료 환자(생체내)에서 응고방지제로서 유용한 조성물 및 조합물에서 본 발명의 펩티드의 약학적으로 유효한 1일 투여량은 약 0.01 내지 100mg/체중kg, 바람직하게는 0.1 내지 10mg/체중kg이다. 적용 형태에 따라 1회 투여량은 0.5내지 10mg의 트롬빈 억제제를 함유할 수 있다. 생체외용 혈액에서 응고 방지 효과를 얻기 위한 본 발명의 펩티드의 약학적 유효량은 생체외용 혈액 ℓ 당 0.2 내지 150mg, 바람직하게는 1 내지 20mg이다.
이식성 또는 생체외용 의료 장치의 표면을 상기 및 특허청구범위에 정의된바와 같이 고정화된 폴리펩티드로 피복시켜 실질적으로 트롬빈내성으로 만들기 위해서 체액과 접촉하여 사용하기 위한 상기 의료 장치를 제공하는 것이 또한 본 발명의 목적이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 표면을 생체상용성 및 트롬빈내성으로 만들기 위해서 의료 장치에 고정화된다. 상기와 같은 장치는 때때로 전형적으로 혈소판 응집을 유발하는 습윤성 표면을 갖는데, 이는 혈액 또는 다른 체액과 접촉하는 이식성 및 생체외용 장치에 사용하는데 단점이 된다. 통상적으로 플라스틱 물질 및 합성 섬유로부터 제조된 상기와 같은 장치의 예로는 프로테스, 인공 기관, 봉합용실, 인공 혈관 분절, 카테터, 투석기, 혈액운반 튜브 및 용기가 있다.
이제 본 발명은 또한 하기 실시예를 참고로 예시될 것이며, 이들 실시예는 예시를 목적으로 하며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
쎄로마이존 테슐라튬에서의 항트롬빈 존재의 입증
10마리의 쎄로마이존 테슐라튬의 두부를 등장성 염수에서 균질화시켰다. 상기 균질물을 간단하게 원심단리시켜 미립 물질을 제거하고 상등액을 지시된 다른 혈액시험과 함께 하기의 항트롬빈 분석을 수행하기 위해서 보존한다.
항트롬빈 활성을 평가하기 위해서 상기 언급한 추출물 20㎕를 트롬빈 10㎕(1U)와 혼합하였다. 이 혼합물에 0.5mg/㎖의 피브리노겐 용액 100㎕를 가하고, 추가로 혼합하고 37℃에서 1분간 배양하였다.
상기 분석에 관한 보다 상세한 설명이 알티 소여(R.T Sawyer) 등의 문헌[Comp. Haematol Int.,1, 35-41, 1991)에 기술되어 있다. 하기의 표는 쎄로마이존 테슐라튬의 조 추출물을 사용한 응고 변수들의 생체외 억제를 요약한다.
쎄로마이존 테슐라튬의 두부 영역에 트롬빈 응고 시간을 현저하게 연장시키는 수용성 인자 또는 인자들이 함유되어 있음을 상기 자료로부터 알 수 있다.
실시예 2
트롬빈-억제 및 Xa 인자-억제에 대한 발색 분석
a) 트롬빈-억제
트롬빈 용액(0.05% PEG 6000 함유 250mM 인산염 완충액 (pH 6.5)㎖당 5 NIH-U 트롬빈) 20㎕를 실온에서 5분간 광도계 큐벳에서 트롬빈 분석 완충액 (100mM 트리스-HCl, 100mM NaCl, 0.05% PEG, pH 8.3) 880㎕와 함께 예비배양시켰다. 기질 용액[H2O 5㎖중에 용해된 크로모자임 TH(베링거 만하임, 독일) 4mg] 100㎕를 가하여 반응을 개시시키고 25℃에서 30초 간격으로 5분간 405nm에서 흡광도를 판독하였다.
억제 활성을 측정하기 위해서 샘플 또는 표준으로서 히루딘 10 내지 200㎕를 트롬빈 용액 20㎕와 혼합하고 분석 완충액으로 전체 부피를 900㎕로 만들었다. 이 혼합물을 실온에서 5분간 예비배양시키고 기질 용액 100㎕를 가하여 반응을 개시시켰다.
b) Xa 인자 활성의 억제
Xa 인자 용액(H2O로 2.0㎖로 희석시킨 10U/0.5㎖) 20㎕를 실온에서 5분간 광도계 큐벳에서 Xa 인자 분석 완충액(100mM 트리스-HCl, 200mM NaCl, 0.05% PEG, pH 8.3) 880㎕와 함께 예비배양시켰다. 기질 용액[H2O 5㎖중에 용해된 크로모자임 X(베링거 만하임, 독일)3.5mg]) 100㎕를 가하여 반응을 개시시키고 25℃에서 30초 간격으로 5분간 405nm에서 흡광도를 판독하였다.
억제 활성을 측정하기 위해서 10 내지 200㎕의 샘플을 Xa 인자 용액 20㎕와 혼합하고 분석 완충액으로 전체 부피를 900㎕로 만들었다. 상기 혼합물을 실온에서 5분간 예비배양시키고 기질 용액 100㎕를 가하여 반응을 개시시켰다.
실시예 3
쎄로마이존 테슐라튬으로부터의 트롬빈 억제제의 정제
단계 1
1000초간 비육된 쎄로마이존 테슐라튬의 앞부분 1/3을 -70℃에서 즉시 동결시키고 동결건조시켰다. 이 물질에 40% 아세톤 35㎖을 가하고, 현탁액을 각각 10초간 울트라-토락스에서 3회 균질화시켰다. 초음파기에서 2분간 처리한 다음 추가의 균질화 한계(30초)를 거쳤다. 이 균질물을 6000rpm에서 15분간 원심단리시키고 생성된 상등액을 얻었다(S1).
펠렛 1에 또다른 40% 아세톤 35㎖을 가하고 두번째 균질화를수행하였다(1×10초; 2분 초음파처리 ; 1×30초). 균질물을 다시 6000rpm에서 15분간 원심단리시켰다. 상등액 2를 상기 수득한 상등액 1에 가하고, 상기 혼합된 상등액에 80% 아세톤(부피/부피 )을 가하였다.
pH를 아세트산으로 4.0으로 조정하고 생성된 현탁액을 6000rpm에서 20분간 원심단리시켰다. 펠렛 3을 버렸다. 상등액 3을 회전 증발기(스피드 백(Vac))에 의해서 4배 농축시켰다.
무-아세톤 추출물을 실시예 1에 따른 응고 분석 및 실시예 2에 따른 발색 분석에서 항트롬빈 활성에 대해 양성여부를 시험하였다.
단계 2
상기 무-아세톤 추출물을 완충액 교환을 위해서 PD-10 컬럼(파마시아(Pharmacia))에 걸었다. 상기 컬럼을 친화성 완충액(20mM 트리스-HCl, 50mM NaCl, pH 7.4)으로 평형화시키고 단계 1의 추출물 2.5㎖를 상기 컬럼에 걸었다. 용출물을 항트롬빈 활성에 대해서 시험하였다.
트롬빈 친화성 컬럼을 하기 방식으로 제조하였다:
건조 아즐락톤 텐태클 프랙토겔 매트릭스(dry Azlacton Tentacle Fractogel matrix(이. 메르크(E. Merck, 독일 다름스타트 소재)) 400mg을 실온에서 2 시간동안 커플링 완충액(50mM 포스페이트, 150mM NaCl, pH 7.5) 7㎖에 현탁시켰다. 이 현탁액을 원심단리시키고 커플링 완충액중에서 재현탁시킴으로써 2회 세척하였다. 5000 NIH-U 소 트롬빈(시그마(Sigma))을 H2O 1㎖에 용해시키고 pH를 7.5로 조정하였다. 상기 트롬빈 용액을 PD-10 겔 여과에 의해 커플링 완충액으로 평형화시켰다.이렇게 평형화된 트롬빈 용액이 황산 나트륨을 가하여 최종 농도 1M을 얻었다. 트롬빈 단백질을 상기 활성화된 겔 매트릭스에 즉시 피펫팅하고 서서히 혼합하면서 4℃에서 3시간동안 커플링시켰다. 각각 커플링 완충액의 5배 부피 분량으로 3회 세척하였다. 상기 매트릭스의 탈활성화를 위해서 에탄올아민 1.5㎖을 가하고 서서히 진탕시키면서 4℃에서 밤새 정치시켰다. 상기 매트릭스를 5 배 부피 분량의 아세테이트 완충액(100mM Na-아세테이트, 500mM NaCl, pH 4.0)으로 2회 세척하였다. 5배 부피 분량의 친화성 완충액으로 2회 세척하여 최종적으로 평형화 시켰다.
PD-10 컬럼으로부터의 활성 용출물을 지속성 펌프(유속 10㎖/시간)로 친화성 컬럼에 걸었다. 미-결합된 분획들을 모으고, 컬럼을 친화성 완충액 12㎖로 세척하였다(세척물 1). 아세테이트 완충액(pH 4.0) 6㎖로 용출시키고 0.5㎖ 부피의 분획들을 수거하였다. 상기 컬럼의 용출 프로파일을 제 1 도에 도시한다.
첫번째 용출 후에 아세테이트 완충액(pH 3.0) 6㎖로 두번째 단계를 수행하였다. 1.5㎖의 분획을 수거하였다. 컬럼을 친화성 완충액 25㎖로 재평형화시켰다.
추출 및 친화 단계의 결과를 하기 표 2에 요약하였다.
실시예 4
쎄로마이존 테슐라튬으로부터의 활성 트롬빈 억제제의 겔 여과 분석
활성 물질을 25㎖ 부피의 바이오겔 P4겔 여과 컬림(바이오라드(Biorad))에 걸었다. 20mM 트리스-HCl, 50mM NaCl(pH 7.4)을 사용하여 4㎖/시간의 유속으로 용출시켰다. 1㎖의 분획을 항트롬빈 활성에 대해서 시험하였다.
상기 P4 겔 매트릭스는 5000D의 배제 한계를 가지며 1000 내지 5000D 분자량 범위로 분별시킨다. 놀랍게도, 분별 부피, 즉 5000D 미만의 겉보기 분자량을 갖는 부피에서 항트롬빈 활성이 나타나는 것으로 밝혀졌다(제 2 도). 이러한 양상은 동일한 조건하에서 배제 부피를 보이는 히루딘(분자량 7000D)과 대조적이다. 쎄로마이존 테슐라튬으로 부터의 항트롬빈 활성에 대해서 P4 컬럼의 눈금으로부터 약3000D의 분자량을 산정하였다.
실시예 5
쎄로마이존 테슐라튬으로부터의 정제된 트롬빈 억제제의 역상 HPLC
실시예 3에 따른 친화성 크로마토그래피 단계 후의 활성 용출물을 RP-HPLC에 의해 추가로 분석하였다. 샘플 20㎕를 HPLC 컬럼(리크로스퍼 (LiChrospher) 300 RP-18, 5㎛; 이. 메르크(독일 다름스타트 소재)상에 주입하고 하기 아세토니트릴 구배로 1.0㎖/분으로 용출시켰다:
완충액 A : H2O 중의 0.1% 트리플루오르아세트산
완충액 B : 아세토니트릴중의 0.08% 트리플루오르아세트산
구배 : 0 내지 2분 10% B
2 내지 3분 주입
3 내지 28분 60% B
제 3 도는 220nm에서 기록된 전형적인 분석 크로마토그래피 자취를 도시한다. 트롬빈 억제 활성은 피이크 2 및 피이크 4로서 표지된 피이크에서 발견되었다. 분석 HPLC 실시로부터 얻은 정보를 이어서 사용하여 동일한 조건하에서 예비 분리를 수행하였다.
친화성 크로마토그래피로부터의 500㎕ 샘플의 분취액으로 예비 정제를 수행하였다(제 4 도). 개별적인 피이크를 수거하여 모으고 스피드 백상에서 회전 증발에 의해 농축시켰다. 건조된 분획들을 H2O로 재조성하고 응고 시간 시험 및 실시예2에 기술한 발색 분석에서의 항트롬빈 활성을 분석하였다.
상기 두 시험 시스템에서 주요 활성은 피이크 2 및 4에서 발견되었으며, 피이크 5에서도 약간의 활성이 나타났는데, 이는 추측상 피이크 5 물질중의 피이크 4의 오염을 반영한다. 상기 크로마토그램의 다른 모든 피이크들은 트롬빈 억제 활성을 전혀 나타내지 않았다. 피이크 2및 4활성의 합은 전체 활성의 대략 93%로 간주된다.
실시예 6
HPLC에서의 본 발명에 따른 트롬빈 억제제와 히루딘의 비교
본 발명에 따른 억제제가 히루딘과 근본적으로 상이한 분자임을 추가로 입증하기 위해서, 하기 실험을 수행하였다. 실시예 5에 따른 HPLC후의 활성 피이크 2에 유사한 단백질 농도의 정제된 히루딘을 가하고 혼합물을 아세토니트릴 구배(40 내지 70%)로 RP-HPLC를 수행하였다. 항트롬빈 활성을 함유하는 2개의 피이크가 관찰되었다(제 5 도).
단일의 억제제가 주입된 비교 실험으로부터 제 3도에 도시된 바와 같이 피이크를 분할시킬 수 있다.
제 5 도로부터, 본 발명에 따른 항트롬빈이 히루딘과 매우 상이한 위치에서 용출됨이 분명하다. 실시예 5에 따른 HPLC 분리후의 활성 피이크 4에 대해서도 동일한 결과를 입증할 수 있다.
실시예 7
항트롬빈 활성을 갖는 피이크 2의 추가의 특성화
정제
RP-HPLC로부터 모은 활성 피이크 2를 제 3 도와 동일한 조건하에서 재크로마토그래피시켰다. 제 6 도에 도시된 바와 같이, 소량의 오염 물질을 주요 활성 피이크로부터 계속 분리시켜 두번째 RP-HPLC시킨 후에 균질한 제제를 수득할 수 있다(상기 분획의 모세관 전기영동을 나타내는 제 8 도를 또한 참조한다).
트롬빈 억제
RP-HPLC로부터의 피이크 2는 실시예 2에 따른 발색성 항트롬빈 시험에서 뿐만 아니라 응고 분석(트롬빈 시간 〉600초/5㎕)에서도 활성이었다. 상기 발색성 시험에서의 활성은 3.2 IU/250㎕이었다. Xa인자 억제 활성은 실시예 2에 기술된 분석을 사용하여 피이크 2에서 검출될 수 없었는데, 이는 최대 항-Xa 인자 활성이 항트롬빈 활성의 〈〈1%임을 반영한다. 따라서, 본원에 개시한 억제제는 트롬빈에 대해 매우 특이적인 것으로 결론지을 수 있다.
활성 부위 적정
트롬빈에 대한 억제제 상수를 본 발명에 따른 억제제로 표준화된 트롬빈 용액의 분광형광 적정에 의해 측정하였다. 이 방법의 상세한 설명은 지 더블유 제임슨(G.W. Jameson) 등의 문헌[Biochem, J.,131, 107-117, 1973]에 개시되어 있다.
간단하게 형광원성 기질 Tos-Gly-Pro-Arg-AMC를 적정 실험에 50μM의 농도로 사용하였다. 분석을 25℃에서 100mM 트리스-HCl, 200mM NaCl, 0.05% PEG 6000, pH 7.8에서 수행하였다. 인간 α -트롬빈을 적정한 20pM 농도의 활성 부위를 10분간 0.2 내지 5 × E0에서 억제제와 함께 배양하고 기질을 가한 후에 정상 속도를 측정하였다. 비선형 회귀 분석 프로그램 GraFit(R.J. Leatherbarrow, Erithacus Software, Staines, UK, 1980)을 사용하여 동역학 상수를 측정하였다. Ki는 178펨토몰인 것으로 밝혀졌다.
분자량
활성 피이크 2의 분자량을 MALDI-TOF 법(크라토스(Kratos))을 사용하여 레이저 탈착 질량 분광측정법으로 측정하였다. 샘플 0.5㎕를 매트릭스로서 작용하는 아세토니트릴중의 수 ㎕의 디하이드록시벤조산과 혼합하였다. 상기 혼합물을 은 샘플 홀더상에서 냉기하에 건조시키고 상기 장치에 넣었다. 생성된 질량 스펙트럼을 분자량이 공지된 표준 단백질로 검정하였다. 피이크는 약 9000D의 분자량에 상응하였다(제 7 도).
등전점
상기 억제제의 등전점을 IEF 모드(어플라이드 바이오시스템스(Applied biosystems))의 모세관 전기 영동에 의해 측정하였다. 제 8 도로부터 알 수 있는 바와 같이, 표준 단백질에 비해 억제제 피이크는 4.9의 pl에서 나타났다.
실시예 8
항트롬빈 활성을 갖는 피이크 2의 서열 자료
하기 N-말단 서열을 벡크만(Beckman) 펩티드 서열분석기에서 표준 에드만 분해 화학에 의해 RP-HPLC로부터 피이크 2(실시예 5)를 사용하여 수득하였다:
Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu
실시예 9
항트롬빈 활성을 갖는 피이크 4의 추가의 특성화
정제
RP-HPLC로부터 모은 활성 피이크 4를 동일한 조건하에서 재크로마토그래피 시켰다. 제 9 도에 도시된 바와 같이, 약간의 오염 물질을 주요 활성 피이크로부터 분리시켜 두번째 RP-HPLC시킨 후에 균질한 제제를 수득할 수 있었다.
트롬빈 억제
RP-HPLC로부터의 피이크 4는 실시예 2에 따른 발색성 항트롬빈 시험에서 뿐만 아니라 응고 분석(트롬빈 시간＞600초5㎕)에서도 활성이었다. 상기 발색성 시험에서의 활성은 1.3 IU/250㎕이었다. Xa인자 억제 활성은 실시예 2에 기술된 분석을 사용하여 피이크 2에서 검출될 수 없었는데, 이는 최대 항-Xa 인자 활성이 항트롬빈 활성의 ＜＜1%임을 반영한다. 따라서, 본원에 개시한 억제제는 트롬빈에 대해 매우 특이적인 것으로 결론지을 수 있다.
활성 부위 적정
트롬빈에 대한 억제제 상수를 본 발명에 따른 억제제로 표준화된 트롬빈 용액의 분광형광 적정에 의해 측정하였다. 상세한 설명은 실시예 7을 참조한다. Ki는 240펨토몰인 것으로 밝혀졌다.
분자량
활성 피이크 4의 분자량을 실시예 7에 기술한 바와 같이 MALDI-TOF 법(크라토스)을 사용하여 레이저 탈착 질량 분광측정법으로 측정하였다. 생성된 질량 스펙트럼을 분자량이 공지된 표준 단백질로 검정하였다. 피이크는 약 14kD의 분자량에상응하였다(제 10 도).
실시예 10
항트롬빈 활성을 갖는 피이크 4의 서열 자료
하기 N-말단 서열을 벡크만 펩티드 서열분석기에서 표준 에드만 분해 화학에 의해 RP-HPLC로부터 피이크 4(실시예 5)를 사용하여 수득하였다 :
Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys
Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys
실시예 11
실시예 1 내지 5에 기술된 바와 동일한 과정을 사용하여, 또한 항트롬빈 활성을 갖는 폴리펩티드를 하기의 쎄로마이존 종들로부터 단리시킬 수 있었다:
쎄로마이존 비난뉼라튬,
쎄로마이존 코오페리,
쎄로마이존 가르자에위,
쎄로마이존 마큘로슘, 및
쎄로마이존 섹소큘라튬.

Claims (9)

  1. 수용성 성분을 함유하는 린코브델리다(Rhynchobdellida) 목 쎄로마이존(Theromyzon)과 거머리의 조직 또는 분비물로부터의 트롬빈 억제 활성을 갖는 추출물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    쎄로마이존 테슐라튬(Theromyzon tessulatum) 종 거머리의 추출물.
  3. 동결 및 동결건조된 거머리의 앞부분 1/3을 물/아세톤으로 균질화시켜 수득한 추출물을 트롬빈 특이적 친화성 크로마토그래피에 이어서 하나 이상의 겔 여과 단계 및 하나 이상의 역상 HPLC 단계에 의해 정제시킴으로써 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 추출물로부터 수득할 수 있는 트롬빈 억제 활성을 가지며, 분자량이 약 3kD인 본질적으로 정제된 폴리펩티드.
  4. 동결 및 동결건조된 거머리의 앞부분 1/3을 물/아세톤으로 균질화시켜 수득한 추출물을 트롬빈 특이적 친화성 크로마토그래피에 있어서 하나 이상의 겔 여과 단계 및 하나 이상의 역상 HPLC 단계에 의해 정제시킴으로써 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 추출물로부터 수득할 수 있는 트롬빈 억제 활성을 가지며, 분자량이 약 9kD이고, N-말단 아미노산 서열: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala CysPro Gly Glu를 갖는 본질적으로 정제된 폴리펩티드.
  5. 동결 및 동결건조된 거머리의 앞부분 1/3을 물/아세톤으로 균질화시켜 수득한 추출물을 트롬빈 특이적 친화성 크로마토그래피에 이어서 하나 이상의 겔 여과 단계 및 하나 이상의 역상 HPLC 단계에 의해 정제시킴으로써 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 추출물로부터 수득할 수 있는 트롬빈 억제 활성을 가지며, 분자량이 약 14kD이고, N-말단 아미노산 서열: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys를 갖는 본질적으로 정제된 폴리펩티드.
  6. 린코브델리다 목, 바람직하게는 쎄로마이존 테슐라튬 종 거머리의 조직 또는 분비물을 균질화시키고 그 조직 또는 분비물의 수용성 성분을 포함하는 분획을 제조함으로써 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 추출물을 제조하는 방법.
  7. 트롬빈 특이적 친화성 크로마토그래피 및 하나 이상의 추가의 표준 크로마토그래피 단계에 의해 제 6 항에 따른 추출물을 정제시킴으로써 제 3 항, 제 4 항 및 제 5 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  8. 제 3 항, 제 4 항 및 제 5 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 생체외용 혈액의 혈소판 응집 억제를 위한 약학조성물.
  9. 제 3 항, 제 4 항 및 제 5 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 혈전증 관련 질환의 생체내 치료를 위한 약학 조성물.
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