CZ287794B6 - Purified polypeptide, process of its preparation and use, extract and pharmaceutical preparation in which it is comprised - Google Patents

Description

Purifikovaný polypeptid, způsob jeho výroby a použití, extrakt a farmaceutický přípravek

Oblast techniky

Vynález se týká purifikovaného polypeptidu, způsob jeho výroby a použití, extraktu, jako meziproduktu pro výrobu tohoto peptidů a farmaceutického přípravku na bázi tohoto peptidů. Vynález se zejména týká inhibitorů trombinu získaných z tkáně a sekretů pijavic.

Dosavadní stav techniky

Trombin katalyzuje tvorbu fibrinových sraženin, a proto indukuje koagulaci krve. Kromě toho má trombin několik dalších bioregulačních rolí, jako je přímá aktivace agregace destiček a aktivace inflamatomí odpovědi prostřednictvím stimulace syntézy aktivačního faktoru destiček (PAF) buňkami endothelu. To znamená, že trombin má ústřední úlohu při poruchách spojených s trombózou, jako jsou například kardiovaskulární choroby.

Existuje proto velký zájem na stálém hledání nových a zlepšených inhibitorů trombinu a antikoagulačních činidel.

Jako příklad dobře známých inhibitorů trombinu je možno uvést heparin a hirudin.

Heparin urychluje antikoagulační aktivitu antitrombinu III. Používá se ho ve velkém rozsahu pro léčbu chorob jako je cévní tromboembolismus, při nichž je účinnost trombinu zodpovědná za vývoj nebo narůstání trombů. Není účinný při léčbě případů, při nichž je snížena hladina antitrombinu III, jako například případů, kdy je trombóza doprovázena nefrosou nebo disseminovaným intravaskulámím koagulačním syndromem (DIC). Kromě toho má heparin řadu nežádoucích vedlejších účinků, jako je hemorrhagie a trombocytopenie.

Hirudin je dobře známý a dobře charakterizovaný polypeptid, o němž je známo, že je specifický pro trombin. Tento polypeptid je možno izolovat z extraktů slinné žlázy a jiných tkání pijavic druhu Hirudo medicinalis. Hirudin a jeho deriváty je také možno získat rekombinantními technikami. Tento polypeptid má poměrně nízkou molekulovou hmotnost 7000 D a skládá se ze 65 aminokyselin. Sekvenci aminokyselin hirudinu poprvé stanovili Dodt et al. (FEBS Letters, 165, 180 až 184, 1984). V pijavici lékařské Hirudo medicinalis byly nalezeny tři hlavní varianty hirudinu (HV1, HV2 a HV3), které se liší pouze celkem asi v 10% poloh aminokyselin. Nejnápadnější rozdíl je v prvních dvou polohách N-terminálního konce molekuly: ve variantě hirudinu HV1 jsou zde obsaženy zbytky Val-Val a ve variantě hirudinu HV2 jsou zde zbytky Ile-Thr. Tyto rozdíly nejsou příliš velké a neovlivňují funkci ani specifičnost interakce hirudinu a trombinu. Hirudin je silným přírodním inhibitorem koagulace. Ukázal se jako účinný při prevenci cévní trombózy, okluzi umělých cév a trombinem indukované disseminované intravaskulámí koagulace, ale způsobuje zvýšenou krvácivost.

Fylogeneticky je pijavice lékařská Hirudo medicinalis členem předčeledi Hirudiniae, čeledi pijavic Hirudinidae (R. T. Sawyer: „Leech Biology and Behaviour“, Oxford University Press, sv. 2, str. 688, 1986). vývojově pokročilejším druhem pijavic je druh Hirudinaria manillensis, který náleží do podčeledi Hirudinarlinae stejné čeledi Hirudinidae. Neočekávaně byla nedávno zjištěna příbuzná, ale zcela odlišná isoforma hirudinu v pijavici Hirudinaria manillensis (viz patentovou přihlášku PCT WO 90/05143). Tato isoforma se liší téměř ve 40% poloh aminokyselin ve srovnání s hirudinem z Hirudo medicinalis. Dva výše uvedené druhy, totiž Hirudo medicinalis a Hirudinaria manillensis patří do řádu pijavic Arhynchobdellida. Kromě řádu Arhynchobdellida existuje ještě jeden velký řád pijavic, tj. Rhynchobdellida (R. T. Sawyer: „Leech Biology and Behaviour“, Oxford University Press, sv. 2, str. 651, 1986). Nejlépe prostudovaným členem řádu Rhynchobdellida, pokud se týče slinných proteinů, je tzv. amazonská pijavice (Haementeria

- 1 CZ 287794 B6 ghilianii). Bylo ukázáno, že tento druh s překvapením neobsahuje žádný antitrombin (Budzynski et al.: Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 168, 259 až 265, 1981). Místo toho obsahuje Haementeria ghilianii fibrinogenolytický enzym hementin(US patent č. 4 390 630), jakož i inhibitor krevního koagulačního faktoru Xa (C. Condra et al.: Tromb. Haemost., 61,437 až 441, 1986).

Na základě tohoto objevu a dalších prací se obecně akceptuje, že aktivita antitrombinového typu je omezena na pijavice řádu Arhynchobdellida, přičemž se předpokládá, že tato aktivita u řádu Rhynchobdellida chybí.

Přes výše uvedený vývoj pokračuje nadále potřeba vyvinout další antikoagulanty a antitrombiny kromě heparinu a hirudinu, které by vykazovaly zvýšenou aktivitu při inhibici tvorby sraženin, trombinem indukované aktivace destiček nebo aktivace buněk endothelu. Požadavkem též je, aby bylo možno tyto látky vyrábět v průmyslově zajímavých množstvích.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je purifikovaný polypeptid s inhibiční aktivitou na trombin, izolovaný z tkáně nebo sekretů pijavic řádu Rhynchobdellida zvolený z polypeptidu o relativní molekulové hmotnosti 9000 ± 1000, který má následující N-terminální sekvenci aminokyselin

Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu.

nebo polypeptidu o relativní molekulové hmotnosti 14 000 ± 1000, který má následující Nterminální sekvenci aminokyselin

Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.

Dále je předmětem vynálezu také způsob výroby purifíkovaného polypeptidu definovaného výše, jehož podstata spočívá v tom, že se homogenizuje tkáň nebo sekrety pijavic řádu Rhynchobdellida, z homogenátu se vyrobí frakce obsahující jeho vodorozpustné složky a tato frakce se purifíkuje trombin-specifickou afinitní chromatografií, po níž následuje alespoň jeden další stupeň gelové filtrace a alespoň jeden další stupeň HPLC s reverzními fázemi. Při způsobu podle vynálezu se přednostně postupuje tak, že se přední třetina zmrazených a lyofilizovaných pijavic homogenizuje se směsí vody a acetonu.

Předmětem vynálezu je rovněž extrakt, jako meziprodukt pro výrobu polypeptidu definovaného výše, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje vodorozpustné složky homogenizované tkáně nebo sekretů pijavic řádu Rhynchobdellida.

Dále je předmětem vynálezu také farmaceutický přípravek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje polypeptid definovaný výše a farmaceuticky vhodný nosič.

Konečně je předmětem vynálezu také použití polypeptidu definovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení chorob spojených s trombózou nebo pro inhibici agregace krevních destiček v mimotělní krvi.

Vynález se opírá o překvapující zjištění, že je možno sloučeniny vykazující aktivitu antitrombinu izolovat z tkání a sekretů pijavic řádu Rhynchobdellida, přednostně čeledi Theromyzon a nejvýhodněji druhu Theromyzon tessulatum, které bývají někdy označovány názvem „ptačí pijavice“, poněvadž tento druh má výjimečně specializovaný způsob života v tom, že saje krev z nosních dírek vodních ptáků.

-2CZ 287794 B6

Zjistilo se, že aktivitu inhibující trombin je možno naměřit v extraktech obsahujících vodorozpustné složky těchto pijavic. Z těchto extraktů je možno izolovat aktivní inhibitor trombinu.

Inhibitor trombinu přednostně zahrnuje aktivní fragmenty polypeptidu s relativními molekulovými hmotnostmi asi 9000 a asi 14 000. Tyto aktivní polypeptidy je možno popřípadě považovat za degradační produkty rodičovského (prekurzorového) inhibitoru trombinu.

Inhibitor trombinu podle tohoto vynálezu je nový, poněvadž se liší od známých antitrombinů, zejména hirudinu, svou molekulovou hmotností, isoelektrickým bodem a N-terminální sekvencí aminokyselin, která vykazuje omezenou homologii (nižší než 40 %) s jinými inhibitory trombinu.

Označení „± 1000“, kterého se používá v souvislosti s relativní molekulovou hmotností polypeptidů charakterizuje maximální odchylku molekulové hmotnosti. Přednostně je tato maximální odchylka ± 500. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají též výše a dále uvedené sekvence, v nichž jsou některé aminokyseliny vyměněny, za předpokladu, že jsou zachovány základní biologické vlastnosti. Do rozsahu vynálezu tedy spadají i sekvence zahrnující určité variace, fragmenty, podjednotky, přirozené mutace a náhodně vytvořené umělé mutanty. Také sem spadají hybridní proteiny, jako jsou fúzované proteiny získané z výše uvedených peptidů.

Inhibitor trombinu podle vynálezu vykazuje antikoagulační a antitrombotické vlastnosti. Může se ho proto používat při všech klinických stavech, při nichž je ovlivněn koagulační systém. Jedná se o léčbu trombózy, mrtvice, infarktu myokardu, trombózy hlubokých cév, obstrukce arterií v končetinách, pulmonámí trombózy, trombózy retinální arterie nebo jakýchkoliv jiných trombotických jevů. Dále lze inhibitoru nebo inhibitorů trombinu používat u pacientů s umělými arteriovenosními náhradami nebo u pacientů, kteří se podrobili koronární operaci by pass. Polypeptidů podle vynálezu je také možno používat jako antikoagulantu při profylaxi trombózy nebo arteriálních reoklusí, pro konzervaci krve nebo krevních produktů a pro mimotělní oběh krve nebo plasmy.

Inhibitor trombinu (polypeptidy) podle tohoto vynálezu vykazují biologickou aktivitou, která je v podstatě srovnatelná s hirudinem. Jejich vazebná afinita k trombinu (inhibiční konstanta) je dokonce poněkud vyšší než v případě hirudinu, který je až dosud nejsilnějším známým inhibitorem trombinu.

Přehled obrázků na výkresech

Podrobnosti vztahující se k obrázkům jsou uvedeny v příkladech 1 až 10.

Na obr. 1 je znázorněn eluční profil antitrombinů z afinitního sloupce (příklad 3).

Na obr. 2 je uvedena gelová filtrační analýza antitrombinů získaného z T. tessulatum na náplni Biogel P4 (příklad 4).

Na obr. 3 uvádí analytickou HPLC s reverzními fázemi (RP-HPLC) pozitivních frakcí z afinitního stupně (příklad 5).

Obr. 4 uvádí preparativní RP-HPLC pozitivních frakcí z afinitního stupně (příklad 5).

Na obr. 5 je uvedeno srovnání hirudinu a inhibitoru podle vynálezu pomocí HPLC (příklad 6).

Na obr. 6 je uvedena rechromatografie aktivní píkové frakce 2 z RP-HPLC (příklad 7).

Na obr. 7 je uvedeno hmotnostní spektrum aktivní píkové frakce 2 z RP-HPLC (příklad 7).

-3CZ 287794 B6

Na obr. 8 ukazuje IEF stopu aktivní píkové frakce 2 z RP-HPLC (příklad 7).

Na obr. 9 je znázorněna rechromatografie aktivní píkové frakce 4 z RP-HPLC (příklad 9).

Na obr. 10 je uvedeno hmotnostní spektrum aktivní píkové frakce 4 z RP-HPLC (příklad 9).

Následuje podrobnější popis tohoto vynálezu.

Inhibitor nebo inhibitory trombinu podle vynálezu je možno izolovat a purifíkovat z tkání nebo sekretů pijavic řádu Rhynchobdellida, přednostně čeledi Theromyzon. Inhibitory trombinu připravitelné z pijavic čeledi Theromyzon vykazují podobnou aktivitu a pouze malé rozdíly. Jako příklady vhodných druhů z čeledi Theromyzon je možno uvést T. binannulatum, T. cooperi, T. garjaewi, T. maculosum, T. mollisimum, T. pallens, T. propinquum, T. rudé, T. sexoculatum a zejména T. tessulatum.

Jako zdroje se podle vynálezu přednostně používá slinných žláz pijavic. Jelikož je však preparace slinných žláz pracná a nelze při ní zabránit značné ztrátě materiálu, je také možno jako zdroje používat hlav nebo předních třetin pijavic.

První stupeň použitého postupu obvykle zahrnuje přednostně důkladné zmrazení a/nebo lyofílizaci tkáně pijavic před homogenizací, která se obvykle provádí v acetonu nebo směsi acetonu a vody. Může se však používat i jiných polárních organických rozpouštědel pro odstranění složek, které nejsou rozpustné ve vodě. Extrakt získaný ve stupni 1 se dále před prováděním afínitní chromatografíe přednostně centrifuguje, aby se odstranily nežádoucí úlomky buněk. Afínitní chromatografíe se přednostně provádí za použití sloupce s místy s trombinovou aktivitou. Pod označením „místa s trombinovou aktivitou“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumějí trombinová místa na sloupci, k nimž se může připojit inhibitor trombinu. Jako příklady míst s trombinovou aktivitou je možno uvést immobilizovaný nativní nebo deaktivovaný trombin, včetně peptidů odvozených od trombinu,peptidomimetik nebo jiných trombinových derivátů. Trombin nebo deriváty trombinu se podle vynálezu immobilizují na aktivní gelové matrici přednostně reakcí s azlaktonovou skupinou této gelové matrice, což se provádí známými metodami. Jinak se afínitní chromatografíe provádí standardními technikami.

Spolu s afínitní chromatografii se přednostně používá gelové filtrace. Gelová matrice, které se podle vynálezu používá, má vylučovací mez molekulové hmotnosti přibližně 5 kD a umožňuje frakcionaci přibližně v rozmezí od 1 do 5 kD.

Izolované antitrombinové extrakty se dále přednostně purifikují HPLC s reverzními fázemi. Polypeptidové fragmenty popsané výše je možno získat purifíkací izolovaných extraktů pomocí RP-HPLC. Jako příklady vhodných materiálů s reverzními fázemi je možno uvést silikagel modifikovaný alifatickými substituenty C2 až Cl8. Polypeptidy podle vynálezu je však možno purifíkovat i jinými dobře známými chromatografíckými postupy. Podrobnosti purifíkace pomocí HPLC jsou uvedeny v příkladech.

Účinnost (aktivitu) inhibitorů trombinu v extraktech a ve specifických frakcích získaných v purifíkačních stupních je možno měřit in vitro na základě prodloužení doby vzniku sraženin (F. Markwardt: Meth. Enz., 19, 924 až 932, 1970) nebo na základě snížení štěpení trombinspecifického chromogenního substrátu, jako je tosyl-glycyl-prolyl-arginin-4-nitroanilidacetát (Chromozym TH, Boehringer Mannheim, SRN), jak je to popsáno v publikaci H. U. Bermeyer: Meth. Enz, Anal., 3. vydání, sv. 5, 365 až 394, 1988.

Jak již bylo uvedeno výše, polypeptidy podle tohoto vynálezu jsou vhodné jako farmaceuticky účinné sloučeniny ve farmaceutických přípravcích a kombinacích.

-4CZ 287794 B6

Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou popřípadě obsahovat přídavné přísady, jako jsou antikoagulanty, jako je hirudin nebo heparin, nebo trombolytická činidla, jako je aktivátor plasminogenu nebo hementin.

Nové polypeptidy a inhibitory trombinu podle tohoto vynálezu mohou vytvářet farmaceuticky vhodné soli sjakýmikoliv netoxickými organickými nebo anorganickými kyselinami. Jako vhodné anorganické kyseliny je například možno uvést kyselinu chlorovodíkovou, kyselinu bromovodíkovou, kyselinu sírovou nebo kyselinu fosforečnou a soli kovů s kyselinami, jako je monohydrogenorthofosforečnan sodný a hydrogensíran draselný. Jako příklady organických kyselin je možno uvést monokarboxylové, dikarboxylové a trikarboxylové kyseliny, jako je kyselina octová, glykolová, mléčná, hroznová, malonová, jantarová, glutarová, fumarová, jablečná, vinná, citrónová, askorbová, maleinová, hydroxymaleinová, benzoová, hydroxybenzoová, fenyloctová, skořicová, salicylová, a sulfonové kyseliny, jako je kyselina methansulfonová. Jako soli na karboxyterminálním zbytku aminokyseliny je možno uvést netoxické soli karboxylové kyseliny vytvořené s jakoukoliv vhodnou anorganickou nebo organickou bází. Tyto soli zahrnují například soli alkalických kovů, jako jsou soli sodné a draselné, soli kovů alkalických zemin, jako soli vápenaté a hořečnaté, soli lehkých kovů ze skupiny lila, jako jsou soli hlinité a soli s organickými primárními, sekundárními nebo terciárními aminy, jako jsou soli trialkylaminů, včetně triethylaminu, prokainu, dibenzylaminu, 1-ethenaminu, N,N‘-dibenzylethylendiaminu, dihydroabiethylaminu a N-alkylpiperidinu.

Pod označením „farmaceuticky vhodný nosič“ se rozumí inertní netoxické pevné nebo kapalné plnivo, ředidlo nebo zapouzdřující materiál, které nevykazuje nepříznivou reakci s účinnou sloučeninou nebo s pacientem. Vhodné, přednostně kapalné, nosiče jsou v tomto oboru dobře známy. Jedná se například o sterilní vodu, roztok chloridu sodného, vodný roztok dextrosy, roztoky cukru, ethanol, glykoly a oleje, včetně olejů ropného, živočišného, rostlinného nebo syntetického původu, jako je například arašídový olej, sojový a minerální olej.

Přípravky podle vynálezu se mohou podávat ve formě jednotkových dávek obsahujících obvyklé netoxické farmaceuticky vhodné nosiče, ředidla, adjuvanty a vehikula, které jsou typické pro parenterální podávání.

Pod označením „parenterální podávání“ se zde rozumí podávání ve formě subkutánních, intravenosních, intraartikulámích a intratracheálních injekcí a infuzí. Také se může použít jiných druhů podávání, jako je orální podávání a topické podávání. Parenterální přípravky a kombinace se nejvýhodněji podávají intravenosně buď ve formě bolu, nebo ve formě konstantní fuze, což se provádí známými technikami. Tablety a kapsle pro orální podávání obsahují konvenční excipienty, jako jsou pojivá, plniva, ředidla, tabletovací činidla, mazadla, bubřidla a smáčedla. Tablety je možno známými způsoby potahovat. Orální kapalné přípravky mohou mít podobu vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, sirupů nebo elixírů nebo podobu suchého produktu určeného pro rekonstituci pomocí vody nebo jiného vhodného vehikula před použitím. Takové kapalné přípravky mohou obsahovat běžné přísady, jako jsou suspenzní činidla, emulgátory, nevodná vehikula a konzervační činidla. Jako typické přípravky je možno uvést vodné nebo olejové suspenze, roztoky, emulze, želé nebo přednostně emulsní masti.

Jednotkové dávky podle tohoto vynálezu mohou obsahovat požadované denní množství proteinu podle vynálezu nebo jeho zlomek. V posledním případě je výsledná denní dávka sestavena z několika poddávek. Optimální terapeuticky vhodná dávka nebo dávkovači režim pro daného pacienta (savce, včetně lidí) závisí na různých faktorech, jako je účinnost konkrétně použité účinné přísady, věk, tělesná hmotnost, všeobecný zdravotní stav, pohlaví, strava, doba a cesta podávání, iychlost vylučování, účel léčby (tj. terapie nebo profylaxe) a druh léčebné trombotické choroby, protidestičkové nebo antikoagulační aktivity.

Za použití přípravků nebo kombinací podle vynálezu, které jsou užitečné jako antikoagulanty pro léčbu pacientů in vivo, je proto farmaceuticky účinná denní dávka peptidů podle vynálezu

-5CZ 287794 B6 v rozmezí od asi 0,01 do asi 100 mg/kg tělesné hmotnosti, přednostně v rozmezí od asi 0,1 do asi 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Podle druhu aplikační formy může jednotková dávka obsahovat 0,5 až 10 mg inhibitoru trombinu. Vhodné farmaceuticky účinné množství peptidů podle vynálezu pro dosažení antikoagulačního účinku v mimotělní krvi leží v rozmezí od asi 0,2 do asi 150 mg/litr, přednostně od asi 1 do asi 20 mg/litr mimotělní krve.

Do rozsahu vynálezu spadá také aplikace immobilizovaného polypeptidu definovaného výše na implantovatelné nebo extrakorporální (mimotělní) lékařské zařízení, které přichází do styku s tělesnými tekutinami, za účelem dosažení tromborezistence povrchu tohoto zařízení. Polypeptid podle vynálezu se immobilizuje na takovém lékařském zařízení, aby byl jeho povrch biokompatibilní a tromborezistentní. Taková implantovatelná nebo extrakorporální zařízení mají často smáčitelné povrchy, které obvykle indukují agregaci krevních destiček, což je jejich nevýhodou, pokud mají být použity ve styku s krví nebo jinými tělními tekutinami. Jako příklady takových zařízení, která bývají obvykle zhotovena z plastů a syntetických vláken, je možno uvést protézy, umělé orgány, stehy, umělé vaskulámí segmenty, katétry, dialyzátory a zkumavky nebo nádoby pro krev.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter, ale rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Demonstrace přítomnosti antitrombinu v T. tessulatum hlaviček pijavice Theromyzon tessulatum se homogenizuje v isotonickém roztoku chloridu sodného. Homogenát se krátce odstředí, aby se odstranila částicová látka a supematant se uschová pro následující antitrombinové stanovení a hematologické zkoušky.

Za účelem odhadu aktivity antitrombinu se 20 μΐ výše uvedeného extraktu smíchá s 10 μΐ trombinu (1 U). Ke vzniklé směsi se přidá 100 μΐ roztoku fibrinogenu o koncentraci 0,5 mg/ml, směs se promíchá a jednu minutu inkubuje při 37 °C.

Další podrobnosti tohoto stanovení jsou popsány v práci R. T. Sawyer et al., Comp. Haematol. Int., 1, 35 až 41, 1991. V následující tabulce jsou souhrnně uvedeny hodnoty inhibice srážecích parametrů in vitro za použití surových extraktů z Theromyzon tessulatum:

Tabulka 1

Demonstrace přítomnosti antitrombinové aktivity v T. tessulatum

	Normální kontrola (s)	Surový extrakt (s)
Protrombinová doba (vnější)	15	42
Aktivovaná PTT (vnitřní)	40	220
Trombinová doba (antitrombin)	45	>600
Reptilasová doba	20	20

Z výše uvedených dat je zřejmé, že hlavová část pijavice Theromyzon tessulatum obsahuje vodorozpustný faktor nebo faktoiy, které podstatně prodlužují trombinovou srážecí dobu.

-6CZ 287794 B6

Příklad 2

Chromogenní zkouška inhibice trombinu a faktoru Xa

a) Inhibice trombinu μΐ roztoku trombinu (5 NIH-U trombinu/ml 250mM fosfátového pufru s obsahem 0,05 % PEG 6 000 o pH 6,5) se preinkubuje s 880 μΐ trombinového zkouškového pufru (lOOmM TrisHC1, 200mM NaCI, 0,05% PEG, pH 8,3) v kyvetě fotometru po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Reakce se zahájí přídavkem 100 μΐ substrátového roztoku (4 mg Chromozymu TH, výrobek firmy Boehringer Mannheim, SRN, ,rozpuštěné v 5 ml vody) a při 25 °C se odečítají hodnoty absorpce při 400 nm v průběhu 5 minut s intervalem 30 sekund.

Pro měření inhibice aktivity se 10 až 200μ1 vzorek hirudinu, jako standardu, smíchá s 20 μΐ roztoku trombinu a směs se zkouškovým pufrem doplní na celkový objem 900 μΐ. Vzniklá směs se 5 minut preinkubuje při teplotě místnosti a reakce se zahájí přídavkem 100 μΐ substrátového roztoku.

b) Inhibice aktivity faktoru Xa μΐ roztoku faktoru Xa (roztok o koncentraci 10 U/0,5 ml zředěný vodou do celkového objemu 2,0 ml) se preinkubuje s 880 μΐ zkouškového pufru pro faktor Xa (lOOmM Tris-HCl, 200mM NaCI, 0,05% PEG, pH 8,3) v kyvetě fotometru po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Reakce se zahájí přídavkem 100 μΐ substrátového roztoku (3,5 mg Chromozymu X, výrobek firmy Boehringer Mannheim, SRN, rozpuštěné v 5 ml vody) a při 25 °C se odečítají hodnoty absorpce při 405 nm v průběhu 5 minut s intervalem 30 sekund.

Pro měření inhibice aktivity se 10 až 200μ1 vzorek smíchá s 20 μΐ roztoku faktoru Xa a směs se zkouškovým pufrem doplní na celkový objem 900 μΐ. Vzniklá směs se 5 minut preinkubuje při teplotě místnosti a reakce se zahájí přídavkem 100 μΐ substrátového roztoku.

Příklad 3

Purifíkace inhibitoru trombinu z Theromyzon tessulatum

Stupeň 1

Přední třetina pijavice Theromyzon tessulatum krmené po dobu 1000 sekund se ihned zmrazí při teplotě -70 °C a lyofílizuje. Ke vzniklému materiálu se přidá 35 ml 40% acetonu a suspenze se homogenizuje v zařízení Ultratorax třikrát, vždy po dobu 10 sekund. Potom se suspenze 2 minuty zpracovává ultrazvukem, načež následuje přídavný homogenizační stupeň (30 sekund). Homogenát se 15 minut centrifuguje při frekvenci otáčení 6000 min’¹ a výsledný supematant (Sl) se uschová. K peletě 1 se přidá dalších 35 ml 40% acetonu a provede se druhá homogenizace (1 x 10 sekund; zpracování ultrazvukem - 2 minuty; a 1 x 30 sekund). Homogenát se znovu 15 minut centrifuguje při frekvenci otáčení 6000 min’¹. Získaný supematant 2 se přidá k uschovanému spematantu 1 a ke vzniklé směsi se přidá 80 % objemových acetonu.

Hodnota pH se kyselinou octovou nastaví na 4,0 a vzniklá suspenze se 20 minut centrifuguje při frekvenci otáčení 6000 min¹. Peleta 3 se zahodí. Supematant 3 se čtyřnásobně zkoncentruje v rotačním odpařováku (Speed Vac).

-7CZ 287794 B6

Extrakt prostý acetonu je pozitivní při zkoušce antitrombinové aktivity za použití srážecího stanovení podle příkladu 1 a chromogenního stanovení podle příkladu 2.

Stupeň 2

Extrakt prostý acetonu se nanese na sloupec PD-10 (Pharmacia) za účelem výměny pufru. Sloupec se ekvilibruje afinitním pufřem (20mM Tris-HCl, 50mM NaCl,pH 7,4) a na sloupec se nanese 2,5 ml extraktu ze stupně 1. Eluát se zkouší na antitrombinovou aktivitu.

Trombinový afinitní sloupec se připraví následujícím způsobem:

400 mg suché matrice Azlacton Tentacle Fractogel (E. Měrek, Darmstadt, SRN) se suspenduje v 7 ml kondenzačního pufru (50mM fosfát, 150mM NaCl, pH 7,5) a suspenze se nechá 2 hodiny 15 stát při teplotě místnosti. Potom se suspendovaná látka 2 x promyje centrifugací a resuspendováním v kondenzačním pufru. 5 000NIH-U hovězího trombinu (Sigma) se rozpustí v 1 ml vody a hodnota pH roztoku se nastaví na 7,5. Tento trombinový roztok se ekvilibruje s kondenzačním pufrem pomocí gelové filtrace na PD-10. K ekvilibrovanému trombinovému roztoku se přidá síran sodný až do výsledné koncentrace 1M. Trombinový protein se ihned nato pipetou přidá 20 k aktivované gelové matrici a nechá se probíhat kondenzace po dobu 3 hodin při 4 °C za mírného míchání. Produkt se 3 x promyje vždy 5 objemy kondenzačního pufru. Pro deaktivaci matrice se přidá 1,5 ml ethanolaminu a směs se mírně třepe přes noc při 4 °C. Matrice se 2 x promyje vždy 5 objemy octanového pufru (lOOmM octan sodný, 500mM chlorid sodný, pH 4,0). Konečná ekvilibrace se provede dvojnásobným promytím vždy 5 objemy afinitního pufru.

Aktivní eluáty ze sloupce DP-10 se pomocí peristaltického čerpadla (průtok 10 ml/h) nanese na afinitní sloupec. Zachytí se nenavázaná frakce a sloupec se promyje 12 ml afinitního pufru (promývací kapalina 1). Eluce se provádí 6 ml octanového pufru o pH 4,0 a sbírají se frakce o objemu 0,5 ml. Eluční profil z tohoto sloupce je znázorněn na obr. 1.

Po první eluci následuje druhý stupeň za použití 6 ml octanového pufru o pH 3,0. Sbírají se frakce o objemu 1,5 ml. Sloupec se reekvilibruje s 25 ml afinitního pufru.

Výsledky extrakčního a afinitního stupně jsou souhrnně uvedeny v následující tabulce 2.

Tabulka 2

Výsledky afinitní purifikace inhibitoru trombinu z Theromyzon tessulatum

Frakce	Objem (ml)	Srážecí doba (s)	Inhibice trombinu (IU)	Inhibice F Xa (IU)
prázdná	—	20,5	0	0
acetonový	34	59,4	33	nestán.
extrakt nanaváz.	34	24,3	1,8	1,1
frakce promýv. kapalina 1	24	20,2	1,6	1,0
afinit, eluát 1	4	>600	25	0,2
afinit, eluát 2	4	22,1	0	0

-8CZ 287794 B6

Příklad 4

Gelová filtrační analýza aktivního inhibitoru trombinu z Theromyzon tessulatum

Aktivní materiál se nanese na sloupec pro gelovou filtraci Biogel P4 (Biorad) o objemu 25 ml. Eluce se provádí 20mM Tris.HCl, 50mM NaCl o pH 7,4 při průtoku 4 ml/h. Sbírají se frakce o objemu 1 ml, které se potom zkoušejí na antitrombinovou aktivitu.

Použitá gelová matrice P4 má vylučovací mez molekulové hmotnosti 5000 D, a proto umožňuje frakcionaci v rozmezí molekulové hmotnosti 1000 až 5000 D. S překvapením se zjistilo, že antitrombinová aktivita se eluuje ve frakcionačním objemu, tj. ve frakci se zdánlivou molekulovou hmotnostní pod 5000 D (obr. 2). Toto chování kontrastuje s chováním hirudinu (molekulová hmotnost 7000 D), který je za stejných podmínek obsažen ve vyloučeném objemu. Na základě kalibrace sloupce P4 byla pro produkt vykazující antitrombinovou aktivitu z Theromyzon tessulatum stanovena molekulová hmotnost přibližně 3000 D.

Příklad 5

HPLC s reverzními fázemi purifíkovaného inhibitoru trombinu z Theromyzon tessulatum

Aktivní eluáty se po stupni afinitní chromatografie, prováděném podle příkladu 3, dále analyzují RP-HPLC. 20μ1 vzorek se nastříkne na sloupec pro HPLC (Li Chrospher 300 RP-18, 5μπι; E. Měrek, Darmstadt, SRN) a eluuje následujícím gradientem acetonitrilu při průtoku 1,0 ml/min.

Pufr A: 0,1 % kyselina trifluoroctová ve vodě

Pufr B: 0,08% kyselina trifluoroctová v acetonitrilu

Gradient: 0 až 2 minuty 10% B až 3 minuty nástřik až 28 minut 60% B

Na obr. 3 je znázorněna typická stopa zakreslená v zařízení pro analytickou chromatografíi při 220 nm. Inhibiční aktivita vzhledem k trombinu je zjištěna v pících označených jako pík 2 a pík

4. Informace z analytické HPLC se bezprostředně použije při provádění preparativních separací za stejných podmínek.

Preparativní purifikace se provádějí za použití 500μ1 alikvotních vzorků z afinitní chromatografie (obr. 4). Zachytí se jednotlivé píkové frakce, vhodné frakce se spojí a zkoncentrují v rotačním odpařováku Speed Vac. Vysušené frakce se rekonstituují vodou a podrobí zkoušení na antitrombinovou aktivitu pomocí zkoušky srážecí doby a chromogenního stanovení popsaného v příkladu

2.

Hlavní aktivity se v obou zkušebních systémech zjistí v píkových frakcích 2 a 4, přičemž určitá aktivita se také zjistí v píkové frakci 5, což je nejpravděpodobněji způsobeno kontaminací píkové frakce 5 píkovou frakcí 4. Všechny ostatní frakce, které odpovídají zbývajícím pikům v chromatogramu, nevykazují vůbec žádnou inhibiční aktivitu vzhledem k trombinu. Součet aktivity píkové frakce 2 a 4 představuje přibližně 93 % celkové aktivity.

-9CZ 287794 B6

Příklad 6

Porovnání inhibitoru trombinu podle vynálezu s hirudinem při HPLC

Aby se ještě více potvrdilo, že molekula inhibitoru podle tohoto vynálezu je zcela odlišná od molekuly hirudinu, provede se následující pokus. K aktivní píkové frakci 2 z HPLC podle příkladu 5 se přidá purifikovaný hirudin v podobné proteinové koncentraci a vzniklá směs se podrobí RP-HPLC za použití acetonitrilového gradientu (40 až 70 %). Zjistí se 2 píkové frakce vykazující antitrombinovou aktivitu (obr. 5). Ze srovnávacích pokusů, při nichž se nastřikují inhibitory jednotlivě, je možno identifikovat píky způsobem uvedeným na obr. 5.

Z obr. 5 je zřejmé, že antitrombin podle vynálezu se eluuje ve zcela odlišné poloze ve srovnání s hirudinem. Totéž lze potvrdit s aktivní píkovou frakcí 4 po separaci HPLC podle příkladu 5.

Příklad 7

Další charakterizace píkové frakce 2 s antitrombinovou aktivitou

Čistota

Spojená píková frakce 2 z RP-HPLC se rechromatografuje za stejných podmínek, jako jsou podmínky uvedené na obr. 3. Jak je zřejmé z obr. 6, je možno z hlavní aktivní píkové frakce ještě oddělit malé množství kontaminačního materiálu. Po druhé RP-HPLC se získá homogenní přípravek (viz též obr. 8, který ukazuje kapilární elektroforézu této frakce).

Inhibice trombinu

Píková frakce 2 z RP-HPLC je aktivní při srážecí zkoušce (trombinová doba > 600 s/5 μΐ) a při chromogenní antitrombinové zkoušce prováděné způsobem popsaným v příkladu 2. Při této poslední zkoušce je aktivita 3,2 IU/250 μΐ. Inhibiční aktivitu na faktor Xa není možno u píkové frakce 2 zjistit za použití zkoušky popsané v příkladu 2, což ukazuje, že maximální anti-FXa aktivita je « 1 % antitrombinové aktivity. Z toho lze učinit závěr, že tento inhibitor je vysoce specifický pro trombin.

Titrace aktivních míst

Inhibiční konstanta proti trombinu se stanoví spektrofluorometrickou titrací standardizovaného roztoku trombinu inhibitorem podle vynálezu. Podrobnosti této metody již byly popsány (G. W. Jameson et al., Biochem. J., 131, 107 až 117,1973).

Krátce lze tuto zkoušku popsat takto: Při titračních experimentech se použije fluorogenního substrátu Tos-Gly-Pro-Arg-AMC o koncentraci 50μΜ. Zkoušení se provádí ve lOOmM TrisHCI, 200mM NaCl, 0,05 % PEG 6000 o pH 7,8 při 25 °C. Koncentrace 25pM titrovaného humánního α-trombinu (aktivní místa) se inkubuje s inhibitorem při hodnotě 0,2 až 5 x E_o po dobu 10 minut a po přidání substrátu se měří ustálené rychlosti. Kinetické konstanty se stanoví za použití programu pro nelineární regresní analýzu GraFit (R. J. Leatherbarrow, Erithacus Software, Staines, Velká Británie, 1980). Naměřená hodnota Kj je 178 femtomolámí.

Molekulová hmotnost

Molekulová hmotnost aktivní píkové frakce 2 se stanovuje laserovou desorpční hmotnostní spektrometrií za použití metody MALDI-TOF (Kratos). 0,5μΐ vzorek smíchaný s několika μΐ

-10CZ 287794 B6 roztoku kyseliny dihydroxybenzoové v acetonitrilu slouží jako matrice. Směs se vysuší chladným vzduchem, v držáku vzorku ze stříbra a potom umístí do přístroje. Výsledné hmotnostní spektrum se kalibruje pomocí standardních proteinů o známé molekulové hmotnosti. Pík odpovídá molekulové hmotnosti přibližně 9000 D (obr. 7).

Isoelektrická fokusace

Isoelektrický bod inhibitoru se měří pomocí kapilární elektroforézy v režimu IEF (Applied Biosystems). Jak je zřejmé z obr. 8, inhibiční pík je umístěn při hodnotě pl 4,9 ve srovnání se standardními proteiny.

Příklad 8

Sekvenční data píkové frakce 2 s antitrombinovou aktivitou

Pomocí sekvenčního zařízení Beckman Peptide Sequencer, které pracuje za použití standardní degradační chemie (edman) se u píkové frakce 2 z RP-HPLC (příklad 5) zjistí následující Nterminální sekvence:

Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu.

Příklad 9

Další charakterizace píkové frakce 4 s antitrombinovou aktivitou

Čistota

Spojená píková frakce 4 z RP-HPLC se rechromatografuje za stejných podmínek. Jak je zřejmé z obr. 9, je možno z hlavní aktivní píkové frakce ještě oddělit malé množství kontaminačního materiálu. Po druhé RP-HPLC se získá homogenní přípravek.

Inhibice trombinu

Píková frakce 4 z RP-HPLC je aktivní při srážecí zkoušce (trombinová doba > 600 s/5 μΐ) a při chromogenní antitrombinové zkoušce prováděné způsobem popsaným v příkladu 2. Při této poslední zkoušce je aktivita 1,3 IU/250 μΐ. Inhibiční aktivitu na faktor Xa není možno u píkové frakce 4 zjistit za použití zkoušky popsané v příkladu 2, což ukazuje, že maximální anti-FXa aktivita je « 1 % antitrombinové aktivity. Z toho lze učinit závěr, že tento inhibitor je vysoce specifický pro trombin.

Titrace aktivních míst

Inhibiční konstanta proti trombinu se stanoví spektrofluorometrickou titrací standardizovaného roztoku trombinu inhibitorem podle vynálezu. Podrobnosti jsou uvedeny v příkladu 7. Naměřená hodnota Kj je 240 femtomolámí

Molekulová hmotnost

Molekulová hmotnost aktivní píkové frakce 4 se stanovuje laserovou desorpční hmotnostní spektrometrií za použití metody MALDI-TOF (Kratos), popsané v příkladu 7. Výsledné hmotnostní spektrum se kalibruje pomocí standardních proteinů o známé molekulové hmotnosti. Pík odpovídá relativní molekulové hmotnosti přibližně 14 000 (obr. 10).

-11CZ 287794 B6

Příklad 10

Sekvenční data píkové frakce 4 s antitrombinovou aktivitou

Pomocí sekvenčního zařízení Beckman Peptide Sequencer, které pracuje za použití standardní degradační chemie (Edman) se u píkové frakce 4 z RP-HPLC (příklad 5) zjistí následující Nterminální sekvence:

Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.

Příklad 11

Za použití stejného postupu, jaký je popsán v příkladech 1 až 5 je možno izolovat polypeptidy s antitrombinovou aktivitou z následujících druhů Theromyzon:

T. binannulatum,

T. cooperi,

T. garjaewi,

T. maculosum,

T. sexoculatum.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Purifíkovaný polypeptid s inhibiční aktivitou na trombin, izolovaný z tkáně nebo sekretů pijavic řádu Rhynchobdellida zvolený z polypeptidu o relativní molekulové hmotnosti 9000 ± 1000, který má následující N-terminální sekvenci aminokyselin

   Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu nebo polypeptidu o relativní molekulové hmotnosti 14 000 + 1000, který má následující Nterminální sekvenci aminokyselin

   Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.
2. 2. Způsob výroby purifíkovaného polypeptidu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se homogenizuje tkáň nebo sekrety pijavic řádu Rhynchobdellida, z homogenátu se vyrobí frakce obsahující jeho vodorozpustné složky a tato frakce se purifikuje trombin-specifíckou afinitní chromatografií, po níž následuje alespoň jeden další stupeň gelové filtrace a alespoň jeden další stupeň HPLC s reverzními fázemi.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se přední třetina zmrazených a lyofilizovaných pijavic homogenizuje se směsí vody a acetonu.
4. 4. Extrakt, obsahující vodorozpustné složky homogenizované tkáně nebo sekretů pijavic řádu Rhynchobdellida, jako meziprodukt pro výrobu polypeptidu podle nároku 1.

   -12CZ 287794 B6
5. 5. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 1 a farmaceuticky vhodný nosič.
6. 6. Použití polypeptidů podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení chorob spojených s trombó5 zou nebo pro inhibici agregace krevních destiček v mimotělní krvi.