KR100532190B1 - 선충에서추출된세린프로테아제억제제및항응고성단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항응고 및(또는) 세린 프로테아제 억제제로서의 활성을 갖고 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 특정 단백질은 인자 Xa 억제 활성을 갖고 다른 단백질은 인자 VIIa/TF 억제제로서의 활성을 갖는다. 이들 단백질은 선충과 같은 천연 공급원으로부터 단리되거나, 상이한 DNA 발현계를 사용한 재조합 방법에 의해 화학적으로 합성되거나 제조된다.

도 16

Description

선충에서 추출된 세린 프로테아제 억제제 및 항응고성 단백질

본 발명은, 1995년 10월 18일에 출원된 미국 출원 번호 제08/326,110호의 일부 계속 출원으로서 모두 1995년 6월 5일에 출원된 미국 출원 번호 제08/46l,965호, 동 제08/465,380호, 동 제08/486,397호 및 동 제08/486,399호의 일부 계속 출원이고 상기 모든 출원의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 특이 단백질 및 인간 혈장에서의 효능있는 항응고제를 포함하여 세린 프로테아제 억제제인 상기 단백질의 재조합 변이체에 관한 것이다. 이 단백질은 선충에서 추출된 특정 단백질을 포함한다. 다른 특징에서 본 발명은 시험관내 및 체내에서 혈액 응고 효소의 효능있는 특이 억제제로서 유용한, 상기 단백질로 이루어지는 조성물 및 혈액의 응고를 억제하기 위한 시험관내 진단제 및 체내 치료제로서 그의 사용 방법에 관한 것이다. 또다른 특징에서 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 mRNA 및 DNA를 포함하여 핵산 서열 및 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환시키기 위한 벡터에서의 그의 용도 및 다른 종 및 생물체에서 특정 관련 유전자를 단리하기 위한 프로브로서의 그의 용도에 관한 것이다.

발명의 배경 및 소개

정상적인 항상성은 혈병 형성 (혈액 응고) 및 혈병 분해 (섬유소 용해)의 반응간의 미세한 균형의 결과이다. 혈액 세포, 특이 혈장 단백질 및 혈관 표면 사이의 복합적인 상호 작용은 손상이 없으면 혈액의 유동성을 유지한다. 혈관벽의 내부를 감싸는 내피세포 장벽에 대한 손상은 하부 조직을 상기 혈액 성분에 노출시킨다. 이는 항상성 균형을 혈액 응고 쪽으로 변형시키는 일련의 생화학적 반응을 촉발하여 혈액의 손실을 저지하는 항상성 플러그의 바람직한 형성 또는 손상 기관으로의 혈액 흐름의 저하 또는 완전한 차단을 야기하는 혈관내 폐색성 혈전의 바람직하지 않은 형성을 야기할 수 있다.

혈액 응고 반응은 혈장 내의 세린 프로테아제의 복수개의 특이 효소원이 제한된 단백질 분해에 의해 활성화되는 일련의 증폭 반응의 정점이다. 이러한 일련의 반응은 피브린 및 1차 항상성 플러그 또는 혈전의 안정화에 필요한 세포 성분으로 구성된 불용성 매트릭스의 형성을 야기한다. 단백질 분해 활성화 반응의 개시 및 진행은 혈관 손상 부위에서 멤브레인 표면에 위치한 일련의 증폭 경로를 통하여 발생한다 (Mann, k.G., Nesheim, M.E., Church, W.R., Haley, P. and krishnaswamy, S. (1990) Blood 76: 1-16. and Lawson, J.H., kalafatis, M., Stram, S., and Mann, K.G. (1994) J. Biol. Chem. 269: 23357-23366).

혈관 손상에 대한 혈액 응고 반응은 세린 프로테아제 인자 VIIa및 비효소성 코팩터인 조직 인자 (TF)로 구성된 촉매 복합체의 형성 후에 개시된다 (Rappaport, S.I. and Rao, L.V.M. (1992) Arteriosclerosis and Thrombosis 12: 1112-1121). 이 반응은 혈관 통합성의 병소 붕괴 후에 내피하층 TF가 인자 VIIa 및 그의 효소원 인자 VII의 미순환농도에 노출되는 것에 의해 배타적으로 조절되는 것으로 보인다. 자기활성화는 세린 프로테아제 인자 Xa의 형성의 원인이 되는 인자 VIIa/TF 복합체의 수를 증가시킨다. 인자 VIIa/TF 복합체 외에 형성되는 소량의 인자 Xa는 인자 VIIa/TF 복합체에 의해 활성 세린 프로테아제 인자 IXa_베타로 전환되는 인자 IX_알파로 인자 IX를 단백질 분해에 의해 변형시켜 응고 반응을 촉진한다 (Mann, k.G., krishnaswamy, S. and Lawson, J.H. (1992) Sem. Hematology 29: 213-226). 혈액 응고 연쇄 반응의 제2 단계를 촉매하는 인자 Xa를 다량 생성시키는, 세린 프로테아제 트롬빈을 형성시키는 작용을 하는 것으로 보이는 것은 인자 IXa_베타와 활성 인자 VⅢa와의 복합체이다.

인자 Xa는 대부분의 경우 손상 부위에 부착하는 활성 혈소판의 표면상에 회합하는 인자 Xa, 비효소성 코팩터 Va와 기질 프로트롬빈 (인자 II)으로 구성된 프로트롬비나제 복합체의 회합 후에 트롬빈의 형성을 촉매한다 (Fuster, V., Badimon, L., Badimon, J.J. and Chesebro, J.H. (1992) New Engl. J. Med. 326: 310-318). 동맥 혈관계에서 프로트롬비나제에 의해 촉매되는 트롬빈 생성의 증폭 "분출 (burst)"은 피브린 형성 및 또다른 혈소판의 추가적인 보충 및 트랜스글루타미나제 효소원 인자 XⅢ의 활성화를 통한 혈병의 공유결합에 의한 안정화를 담당하는 상기 프로테아제의 농도를 국지적으로 증가시킨다. 또한, 응고 반응은 추가로 보다 많은 프로트롬비나제 형성 및 이에 따른 보다 많은 트롬빈 생성을 야기하는 비효소성 코팩터 V 및 VⅢ의 트롬빈-매개 단백질 분해성 피드백 활성화를 통하여 촉진된다(Hemker, H.C. and kessels, H. (1991) Haemostasis 21: 189-196).

혈액 응고의 과정을 방해하는 물질 (항응고제)은 혈전증의 치료 및 예방에서 중요한 치료제임이 입증되었다 (Kessler, C.M. (1991) Chest 99: 97S-112S and Cairns, J.A., Hirsh, J., Lewis, H.D., Resnekov, L., and Theroux, P. (1992) Chest 102: 456S-481S). 현재 인정되는 임상적 항응고제는 혈액 응고 연쇄 반응에 대한 그의 비교적 비특이적인 특성 때문에 많은 부작용을 야기한다 (Levine, M.N., Hirsh, J., Landefeld, S., and Raskob, G. (1992) Chest 102: 352S-365S). 이 때문에 항응고 요법의 복잡성을 완화시킴에 있어 혈액 응고 과정의 특정 반응을 선택적으로 방해함으로써 보다 효과적으로 응고 연쇄 반응의 활성을 조절할 수 있는 보다 효과적인 항응고제에 대한 연구가 요구되었다 (Weitz, J., and Hirsh, J. (1993) J. Lab. Clin. Med. 122: 364-373). 또다른 면에서, 상기 연구는 혈액 응고 연쇄 반응의 활성의 조절시에 내인성 항응고제로서 작용하는 정상 인간 단백질에 촛점을 맞추었다. 또한, 다양한 식혈 생물은 그의 숙주로부터 영양을 취하는 도중에 또는 그 후에 혈액을 효과적으로 항응고시킬 수 있어 이로부터 치료제로서 유용할 수 있는 효과적인 항응고제 전략을 개발할 수 있음을 시사하기 때문에 다양한 식혈 생물이 연구되어 왔다.

혈장 단백질인 조직 인자 경로 억제제 (TFPI)는 3개의 연속적인 쿠니쯔(kunitz) 도메인을 포함하고 인자 Xa의 효소 활성을 직접 억제하고 인자 Xa에 의존적인 방식으로 인자 VIIa-조직인자 복합체의 효소 활성을 억제하는 것으로 보고되었다 (Salvensen, G., and Pizzo, S.V., "Proteinase Inhibitors: α-Macroglobulins, Serpins, and kunis", "Hemostasis and Thrombosis, Third Edition, pp.251-253, j.B. Lippincott Company (Edit. R.W. Colman et al. 1994). TFPI를 코딩하는 cDNA 서열은 보고되었고, 클로닝된 단백질은 분자량이 31,950 달톤이고 276개의 아미노산을 포함하는 것으로 보고되었다 (Broze, G.J. and Girad, T.J., 미국 특허 제5,106,833호, 컬럼 1, (1992)). TFPI에서 유래한 상이한 재조합 단백질이 보고되었다 (Girad, T.J. and Broze, G.J. 유럽 특허 제439,442호 (1991); Rasmussen, J.S. and Nordfand, O.J., 국제공개 제WO 9l/02753호 (1991) 및 Broze, G.J. and Girad, T.J, 미국 특허 제 5,106,833호 컬럼 1 (1992)).

119개의 아미노산으로 구성되고 멕시코 거머리 해멘테리아 오피시날리스 (Haementeria officinalis)의 침선에서 발견된 단백질인 안티스타신은 인자 Xa의 효소 활성을 억제하는 것으로 보고되었다 (Tuszynski et al., J. Biol. Chem, 262:9718(1987); Nutt, et al., J. Biol. Chem, 263:10l62 (1988)). 안티스타신의 아미노 말단 아미노산 1 내지 58에 매우 높은 상동성을 갖는 58개의 아미노산을 포함하는 6,000 달톤 재조합 단백질은 인자 Xa의 효소 활성을 억제하는 것으로 보고되었다 (Tung, J. et al., 유럽 특허 제454,372호 (1991년 10월 30일); Tung, J. et al., 미국 특허 제 5,189,019호 (1993년 2월 23일)).

60개의 아미노산으로 구성되고 연질 참진드기인 오르니토도로스 모우바타(Ornithodoros moubata)로부터 단리된 참진드기 항응고성 펩티드 (TAP)는 인자 Xa의 효소 활성은 억제하지만 인자 VIIa의 활성은 억제하지 않는 것으로 보고되었다(Waxman, L. et al., Science, 248:593 (1990)). 재조합 방법에 의해 제조된 TAP는 보고되었다 (Vlausk, G.P. et al., 유럽 특허 제419,099호 (1991) 및 Vlausk, G.P. et al., 미국 특허 제5,239,058호 (1993)).

사람도 감염될 수 있는 개 십이지장충인 안실로스토마 카니눔 (Ancylostoma caninum)은 시험관 내에서 혈액의 응고를 억제하는 효능있는 항응고성 물질을 포함하는 것으로 보고되었다 (Loeb, L. and Smith, A.J., Proc. Pathol. Soc. Philadelphia, 7:173-187 (1904)). 에이. 카니눔 (A. caninum)의 추출물은 인간 혈장에서 프로트롬빈 시간 및 부분적인 트롬보플라스틴 시간을 연장하고 항응고 효과는 인자 Xa는 억제하지만 트롬빈은 억제하지 않기 때문인 것으로 보고되었다 (Spellman, Jr., J.J. and Nossel, H.L., Am. J. Physiol., 220:922-927 (1971)). 근래에는 에이. 카니눔의 가용성 단백질 추출물은 시험관 내에서 인간 혈장에서의 프로트롬빈 시간 및 부분적인 트롬보플라스틴 시간을 연장하는 것으로 보고되었다. 항응고 효과는 트롬빈이 아니라 인간 인자 Xa의 억제 (Cappello, M, et al., J. Infect. Diseases, 167:1474-1477 (1993) 및 인자 Xa 및 인자 VIIa의 억제 (국제 출원 공개 제 WO94/25000호; 미국 특허 제5,427,937호) 때문인 것으로 보고되었다

인간 십이지장충인 안실로스토마 세일라니쿰 (Ancylostoma ceylanicum)도 항응고제를 포함하는 것으로 보고되었다. 에이. 세일라니쿰의 추출물은 시험관 내에서 개 및 인간 혈장에서의 프로트롬빈 시간 및 부분적인 트롬보플라스틴 시간을 연장하는 것으로 보고되었다 (Carroll, S.M., et al., Thromb. Haemostas. (Stuttgart), 51:222-227 (1984)).

비흡혈성 기생충인 아스카르비스 숨 (Ascaris suum)의 가용성 추출물은 항응고 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 이들 추출물은 프로트롬빈 시간 시험이 아니라 카올린-활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 시험에서 전체 혈액의 응고 및 응고 시간을 연장시키는 것으로 보고되었다 (Crawford, G.P.M. et al., J. Parasitol., 68: 1044-1047 (1982)). 아스카리스 숨에서 단리된 키모트립신/엘라스타제 억제제-1 및 그의 주요 이소형인 트립신 억제제-1 및 키모트립신/엘라스타제 억제제-4는 세린 프로테아제 억제제이고 5개의 디술파이드 결합의 공통적인 패턴을 공유하는 것으로 보고되었다 (Bernard, V.D. and Peanasky, R.J., Arch. Biochem. Biophys., 303:367-376 (1993); Huang, K. et al., Structure, 2:679-689 (1994); 및 Graberger, B.L. et al., Structure, 2:669-678 (1994)). 보고된 세린 프로테아제 억제제가 항응고 활성을 갖는다는 것은 언급되지 않았다.

십이지장충 네카토르 아메리카누스 (Necator americanus)의 분비물은 인간 혈장 응고 시간을 연장시키고 형광 발생 기질을 사용한 인간 FXa의 아미드 분해 활성을 억제하고 다중 아고니스트-유도 혈소판 조밀 과립 방출을 억제하고 피브리노겐을 분해하는 것으로 보고되었다 (Pritchard, D.I. and B. Furmidge, Thromb. Haemost. 73: 546 (1995) (국제 출원 공개 제WO95/12651호).

발명의 요약

본 발명은 세린 프로테아제 억제 활성 및(또는) 항응고 활성을 갖고 적어도 하나의 NAP 도메인을 포함하는 단리된 단백질에 관한 것이다. 본 발명자들은 이들 단백질을 선충에서 추출한 항응고성 단백질 또는 "NAP"로 명명하였다. "NAP 도메인"은 본 명세서에서 후술되는 억제 활성을 갖는 것으로 생각되는 단리된 단백질 또는 NAP의 서열을 의미한다. 이들 단백질의 항응고 활성은 프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 분석에서 인간 혈장의 응고 시간을 증가시키는 활성 및 혈액 응고 효소 인자 Xa 또는 인자 VIIa/TF의 억제 능력에 의해 분석될 수 있다. NAP 도메인은 상기 단백질의 항응고 활성에 주로 작용하는 것으로 생각된다. 이들 중에서 특정 단백질은 10개의 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 약 120개 미만의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열인 NAP 도메인을 하나 이상 포함한다.

다른 특징에서, 본 발명은 항응고 활성을 보이고 NAP 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 cDNA 분자의 제조 및 단리 방법 및 이 방법에 의해 제조된 재조합 cDNA 분자에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 한 종류의 선충에서 cDNA 라이브러리를 제조하는 단계; (b) 상기 cDNA 라이브러리를 적합한 클로닝 벡터에 라이게이션시키는 단계; (c) 상기 cDNA 라이브러리를 포함하는 클로닝 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; (d) 상기 숙주 세포의 cDNA 분자를 AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG (여기서, R은 A 또는 G이고, Y는 T 또는 C이고, i는 이노신임) [서열 번호 94]로 이루어지는 핵산 서열을 갖는 혼성화 프로브를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; (e) 상기 프로브와 혼성화하는 재조합 cDNA 분자를 검출하는 단계; 및 (f) 상기 재조합 cDNA 분자를 단리하는 단계로 이루어진다.

또다른 면에서, 본 발명은 항응고 활성을 갖고 NAP 도메인을 포함하며 상기 cDNA에 의해 코딩되는 재조합 단백질을 제조하는 방법 및 이러한 방법에 의해 제조된 재조합 단백질에 관한 것이다. 이 방법은 (a) 한 종류의 선충에서 cDNA 라이브러리를 제조하는 단계; (b) 상기 cDNA 라이브러리를 적합한 클로닝 벡터에 라이게이션시키는 단계; (c) 상기 cDNA 라이브러리를 포함하는 클로닝 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; (d) 상기 숙주 세포의 cDNA 분자를 AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG (여기서, R은 A 또는 G이고, Y는 T 또는 C이고, i는 이노신임) [서열 번호 94]로 이루어지는 핵산 서열을 갖는 혼성화 프로브를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; (e) 상기 프로브와 혼성화하는 재조합 cDNA 분자를 검출하는 단계; (f) 상기 재조합 cDNA 분자를 단리하는 단계; (g) 상기 재조합 단백질을 코딩하는 상기 cDNA 분자의 핵산 서열을 적합한 발현 클로닝 벡터에 라이게이션시키는 단계; (h) 상기 재조합 단백질을 코딩하는 상기 cDNA 분자의 상기 핵산 서열을 포함하는 상기 발현 클로닝 벡터로 제2 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; (i) 형질전환된 제2 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (j) 상기 제2 숙주 세포에 의해 발현된 상기 재조합 단백질을 단리하는 단계로 이루어진다. 특정 발현계, 예를 들면 COS 세포에서의 재조합 단백질의 생성을 기술할 때 용어 "형질감염"은 통상적으로 "형질전환" 대신에 (및 때때로 상호 교환가능하게) 사용된다.

다른 면에서, 본 발명은 항응고 활성을 보이고 NAP 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 재조합 cDNA의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 한 종류의 선충에서 cDNA 라이브러리를 단리하는 단계; (b) 상기 cDNA 라이브러리를 클로닝 벡터에 라이게이션시키는 단계: (c) 상기 cDNA 라이브러리를 포함하는 클로닝 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; (d) 상기 숙주 세포의 cDNA 분자를 하기 핵산 서열을 갖는 제1 혼성화 프로브 [서열 번호 1] 및 제2 혼성화 프로브 [서열 번호 2]로 이루어지는 용액과 접촉시키는 단계; (e) 상기 프로브 혼합물과 혼성화하는 재조합 cDNA 분자를 검출하는 단계; 및 (f) 상기 재조합 cDNA 분자를 단리하는 단계로 이루어진다.

[서열 번호 1]

[서열 번호 2]

또다른 특징에서, 본 발명은 항응고 활성을 보이고 NAP 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 재조합 cDNA의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 한 종류의 선충에서 cDNA 라이브러리를 단리하는 단계; (b) 상기 cDNA 라이브러리를 적합한 파지미드 발현 클로닝 벡터에 라이게이션시키는 단계; (c) 상기 cDNA 라이브러리를 포함하는 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; (d) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; (e) 상기 숙주 세포를 헬퍼 파지로 감염시키는 단계; (f) 상기 cDNA 라이브러리를 포함하는 파지를 상기 숙주 세포로부터 분리하는 단계; (g) 상기 cDNA 라이브러리를 포함하는 상기 파지 용액을 비오틴화 인간 인자 Xa의 용액과 접촉시키는 단계; (h) 스트렙타비딘-코팅 고형상을 상기 cDNA 라이브러리를 포함하는 상기 파지 및 상기 비오틴화 인간 인자 Xa를 포함하는 상기 용액과 접촉시키는 단계; (i) 상기 스트렙타비딘-코팅 고형상에 결합한 파지를 단리하는 단계; 및 (j) 상기 스트렙타비딘-코팅 고형상에 결합한 파지로부터 재조합 cDNA 분자를 단리하는 단계로 이루어진다.

한 바람직한 면에서, 본 발명은 도 1, 도 3, 도 7A 내지 7F, 도 9, 도 13A 내지 13H 및 도 14에 도시한 핵산 서열로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는 재조합 cDNA에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 FXa의 촉매 활성을 억제하는 NAP, FVIIa/TF 복합체의 촉매 활성을 억제하는 NAP 및 세린 프로테아제의 촉매 활성을 억제하는 NAP 및 상기 NAP를 코딩하는 핵산 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

정의

용어 "아미노산"은 천연 L-아미노산을 의미하고, D-아미노산은 D-아미노산을 포함하는 단백질이 생물학적 활성을 보유하는 정도로 포함된다. 천연 L-아미노산에는 알라닌 (A1a), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 라이신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr) 및 발린 (Val)이 포함된다.

용어 "아미노산 잔기"는 1) L-프롤린을 제외하고 R이 L-아미노산의 알파-탄소 측쇄기인 -NH-CH(R)C(=O)-; 또는 2) L-프롤린의 경우에는

의 구조를 갖는 라디칼을 의미한다.

용어 "펩티드"는 아미노산의 알파-아미노기와 카르복실레이트기가 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 서열을 의미한다. 본 명세서에 나타낸 이러한 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 표시된다.

용어 "단백질"은 하나 이상의 펩티드로 구성된 분자를 의미한다.

용어 "cDNA"는 상보성 DNA를 의미한다.

용어 "핵산"은 염기 (예를 들면, 퓨린 또는 피리미딘)가 당 인산염 골격에 부착된 중합체를 의미한다. 핵산에는 DNA및 RNA가 포함된다.

용어 "핵산 서열"은 핵산으로 이루어진 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 본 명세서에 나타낸 이러한 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 5' 방향에서 3' 방향으로 표시된다.

용어 "재조합 DNA 분자"는 정상적으로는 인접하지 않은 DNA 단편을 서로 라이게이션시켜 제조된 DNA 분자를 의미한다.

용어 "mRNA"는 메신저 리보핵산을 의미한다.

용어 "상동성"은 DNA 또는 펩티드 서열의 유사도를 의미한다.

용어 "인자 Xa" 또는 "fXa" 또는 "FXa"는 동의어이고 통상적으로 효소 트롬빈을 형성하는 프로트롬비나제 복합체의 일부로서 기능하는 혈액 응고 연쇄 반응의 효소 중의 하나인 세린 프로테아제를 의미하는 것으로 알려져 있다.

구문 "인자 Xa 억제 활성"은 fXa의 그의 기질에 대한 촉매 활성을 억제하는 활성을 의미한다.

구문 "인자 Xa 선택적 억제 활성"은 다른 관련 효소, 예를 들면 다른 세린 프로테아제에 비해 인자 Xa에 대해 선택적인 억제 활성을 의미한다.

구문 "인자 Xa 억제제"는 인자 Xa 억제 활성을 갖는 화합물이다.

용어 "인자 VIIa/조직인자" 또는 "fVIIa/TF" 또는 "FVIIa/TF"는 동의어이고 통상적으로 정의된 조성물의 인지질 멤브레인의 표면에 회합하는, 세린 프로테아제 응고 인자 VIIa (fVIIa)와 비효소성 단백질 조직 인자 (TF)의 촉매 활성 복합체를 의미하는 것으로 알려져 있다.

구문 "fVIIa/TF 억제 활성"은 fXa 또는 촉매 불활성 fXa 유도체의 존재 하에 fVIIa/TF 복합체의 촉매 활성을 억제하는 활성을 의미한다.

구문 "fVIIa/TF 선택적 억제 활성"은 FVIIa 및 fXa를 포함하여 다른 세린 프로테아제와 같은 다른 관련 효소에 비해 fVaII/TF에 대하여 선택적인 fVIIa/TF 억제 활성을 의미한다.

구문 "fVIIa/TF 억제제"는 fXa 또는 촉매 불활성 fXa 유도체의 존재 하에 fVIIa/TF 복합체의 촉매 활성을 억제하는 화합물을 의미한다.

구문 "세린 프로테아제"는 통상적으로 아미노산 히스티딘, 아스파르트산 및 세린의 삼중체로 이루어지고 삼중체 내의 세린 잔기가 촉매 분해에서 공유결합 방식으로 관련되는, 아미드 결합을 촉매적으로 분해하는 효소를 의미하는 것으로 알려져 있다. 세린 프로테아제는 디이소프로필플루오로포스페이트 (DFP)에 의한 촉매 삼중체 내의 세린 잔기의 공유결합 변형에 의해 촉매 불활성화된다.

구문 "세린 프로테아제 억제 활성"은 세린 프로테아제의 촉매 활성을 억제하는 활성을 의미한다.

구문 "세린 프로테아제 선택적 억제 활성"은 다른 세린 프로테아제에 비해 특정 세린 프로테아제에 대하여 선택적인 억제 활성을 의미한다.

구문 "세린 프로테아제 억제제"는 세린 프로테아제 억제 활성을 갖는 화합물을 의미한다.

용어 "프로트롬비나제"는 통상적으로 정의된 조성물의 인지질 멤브레인의 표면에 회합하는, 세린 프로테아제 응고 인자 Xa (fXa)와 비효소성 단백질 인자 Va (fVa)의 촉매 활성 복합체를 의미하는 것으로 알려져 있다.

구문 "항응고 활성"은 혈장의 응고를 포함하여 혈액의 응고를 억제하는 활성을 의미한다.

용어 "선택적", "선택성" 및 그의 치환어는 특정 효소에 대한 NAP 활성을 언급할 때 NAP가 다른 관련 효소를 억제하는 것보다 10배 이상 효과적으로 특정 효소를 억제한는 것을 의미한다. 따라서, NAP 활성은 특정 효소에 대하여 선택적이다.

용어 "실질적으로 동일한"은 단백질, 아미노산 서열, cDNA, 뉴클레오티드 서열 등의 기술에 사용시에 다른 단백질, cDNA 또는 서열과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 단백질, cDNA또는 서열을 의미한다.

용어 "NAP" 또는 "NAP 단백질"은 하나 이상의 NAP 도메인을 포함하고 세린 프로테아제 억제 활성 및(또는) 항응고 활성을 갖는 단리된 단백질을 의미한다.

도 1은 AcaNAP5 cDNA의 뉴클레오티드 서열 [서열 번호 3]을 도시한 것이다. 번호는 cDNA의 제1 뉴클레오티드에서 시작한다. 번역은 제1 ATG 코돈 (위치 14)에서 시작하고 프레임 내의 제2 ATG는 위치 20에 존재한다.

도 2는 성숙 AcaNAP5의 아미노산 서열 [서열 번호 4]을 도시한 것이다.

도 3은 성숙 AcaNAP6의 뉴클레오티드 서열 [서열 번호 5]을 도시한 것이다. 번호는 cDNA의 제1 뉴클레오티드에서 시작한다. 번역은 제1 ATG 코돈 (위치 14)에서 시작하고 프레임 내의 제2 ATG는 위치 20에 존재한다.

도 4는 성숙 AcaNAP6의 아미노산 서열 [서열 번호 6]을 도시한 것이다. AcaNAP5와 상이한 아미노산 서열은 밑줄을 그었다. 이들 아미노산 치환 외에 AcaNAP6는 AcaNAP5와 비교시 2개의 아미노산 결실 (Pro-Pro)를 포함한다.

도 5는 프로-AcaNAP5의 아미노산 서열 [서열 번호 7]을 도시한 것이다.

도 6은 프로-AcaNAP6의 아미노산 서열 [서열 번호 8]을 도시한 것이다. AcaNAP5와 상이한 아미노산 서열은 밑줄을 그었다. 이들 아미노산 치환 외에 프로-AcaNAP6은 프로-AcaNAP5와 비교시 2개의 아미노산 결실 (Pro-Pro)를 포함한다.

도 7A 내지 7F는 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 듀오데날레(duodsnale) 및 헬리그모소모이데스 폴리기루스 (Heligmosomoides polygyrus)로부터 단리된 특정 NAP 단백질의 추정 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 7A는 안실로스토마 세일라니쿰으로부터 단리된 재조합 cDNA 분자, AceNAP4의 서열 [서열 번호 9]을 도시한 것이다. 도 7B는 안실로스토마 세일라니쿰으로부터 단리된 재조합 cDNA분자, AceNAP5의 서열 [서열 번호 10]을 도시한 것이다. 도 7C는 안실로스토마 세일라니쿰으로부터 단리된 재조합 cDNA 분자, AceNAP7의 서열 [서열 번호 11]을 도시한 것이다. 도 7D는 안실로스토마 듀오데날레로부터 단리된 재조합 cDNA분자, AduNAP4의 서열 [서열 번호 12]을 도시한 것이다. 도 7E는 안실로스토마 듀오데날레로부터 단리된 재조합 cDNA 분자, AduNAP7의 서열 [서열 번호 13]을 도시한 것이다. 도 7F는 헬리그모소모이데스 폴리기루스로부터 단리된 재조합 cDNA 분자, HpoNAP5의 서열 [서열 번호 14]을 도시한 것이다. 재조합 cDNA 분자의 5' 말단에 대응하는 EcoRI 부위는 모든 경우에 밑줄을 그어 표시하였다. 각 서열의 번호는 이 EcoRI 부위에서 시작한다. AceNAP4 및 AduNAP7은 각각 2개의 NAP 도메인을 갖는 단백질을 코딩하고 이 도면 내의 모든 다른 클론은 하나의 NAP 도메인을 갖는 단백질을 코딩한다. AduNAP4 cDNA 클론은 전체 길이가 아니다. 즉, 재조합 cDNA 분자는 다른 이소형과 비교하여 코딩 영역의 5' 말단부가 결여되어 있다.

도 8A 내지 8C는 벡터 pDONG61 (도 8A) [서열 번호 15], pDONG62 (도 8B) [서열 번호 16] 및 pDONG63 (도 8C) [서열 번호 17]의 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다. 나타낸 HindⅢ-BamHI 단편은 pUC119의 HindⅢ와 BamHI 사이에 위치한다. 벡터는 필라멘트상 파지 유전자 6의 하류의 3개의 상이한 리딩 프레임에 대한 SfiI-NotI 단편으로서의 cDNA의 클로닝을 허용한다. 모든 관련 제한 부위는 나타내었다. 위치 373-375에 존재하는 AAA의 Lys 코딩 삼중체는 유전자 6의 최종 코돈이다. 유전자 6에 의해 코딩되는 단백질 뒤에는 Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly [서열 번호 18] 링커 서열이 존재한다.

도 9는 재조합 cDNA 분자 AcaNAPc2 cDNA의 뉴클레오티드 서열 [서열 번호 19]을 도시한 것이다. 재조합 cDNA 분자의 5' 말단에 대응하는 EcoRI 부위는 모든 경우에 밑줄을 그어 표시하였다. 서열의 번호는 이 EcoRI 부위에서 시작한다. 추정 아미노산 서열도 나타내었다. 번역 리딩 프레임은 유전자 6 융합 파트너에 의해 정하였다. AcaNAPc2 cDNA는 코딩 영역의 5' 말단의 일부가 결여되었고, AcaNAP5 및 AcaNAP6과의 상동성은 처음 7개의 아미노산 잔기가 분비 신호에 속한다는 것을 예측하게 한다.

도 10A 및 10B는 정상 시트레이트화 인간 혈장의 프로트롬빈 시간 (PT) 측정 (도 10A) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) (도 10B)에 대한 특정 NAP 단백질의 효과의 비교를 도시한 것이다. 점 (·)은 프로-AcaNAP5을, 삼각형 (△)은 ACaNAP5를 (표 2의 AcaNAP5^a), 원 (O)은 천연 AcaNAP5를 나타낸다.

도 11은 다양한 선충에서 단리된 특정 NAP cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 배열을 나타낸 것이다. AcaNAP5 [서열 번호 20], AcaNAP6 [서열 번호 21] 및 AcaNAPc2 [서열 번호 128]은 안실로스토마 카니눔으로부터 단리되었다. AceNAP5 [서열 번호 22], AceNAP7 [서열 번호 23] 및 AceNAP4 (AceNAP4d1 [서열 번호 24] 및 AceNAP4d2 [서열 번호 25])는 안실로스토마 세일라니쿰으로부터 단리되었다. AduNAP4 [서열 번호 26] 및 AduNAP7 (AduNAP7d1 [서열 번호 27] 및 AduNAP7d2 [서열 번호 28])는 안실로스토마 듀오데날레로부터 단리되었다. HpoNAP5 [서열 번호 29]는 헬리그모소모이데스 폴리기루스로부터 단리되었다. 이 도면에 나타낸 아미노산 서열은 도 1, 3, 7A 내지 7F 및 9에 나타낸 것과 같다. 성숙 AcaNAP5 [서열 번호 4] 및 AcaNAP6 [서열 번호 6] (도 2 및 4 참조)의 서열은 10개의 시스테인 잔기 (1 내지 10으로 번호를 매기고 진하게 표시함)에 의해 부분적으로 특성화된다. 이 도면 내의 모든 아미노산 서열은 1개 이상의 NAP 도메인을 포함한다. AceNAP4 cDNA는 제1 (d1) 및 제2 (d2) NAP-도메인을 코딩하는 AceNAP4d1 [서열 번호 24] 및 AceNAP4d2 [서열 번호 25]로 명명된 2개의 인접 영역으로 구성되고, 이와 유사하게 AduNAP7 cDNA는 제1 (d1) 및 제2 (d2) NAP-도메인을 코딩하는 AduNAP7d1 [서열 번호 27] 및 AduNAP4d2 [서열 번호 28]의 2개의 인접 영역으로 구성된다. 모든 NAP-도메인의 아미노산 서열 배열은 시스테인에 의해 안내되고, 시스테인 배열을 유지하고 그 위치에 아미노산이 없음을 나타내기 위하여 대쉬(--)를 특정 위치에 사용하였다. cDNA에 의해 코딩되는 단백질의 카르복시 말단 잔기 뒤에는 "종결"이라는 용어를 사용하였다.

도 12 A 및 12B는 피. 파스토리스 (P. pastoris) pYAM7SP8 발현/분비 벡터 (도 12A)의 지도 및 벡터에 포함된 서열 (도 12B) [서열 번호 30]을 도시한 것이다. 도 12A에 도시한 바와 같이, 이 플라스미드는 메탄올 유도 AOX1 프로모터 (5'AOX 비번역 영역 내의 진한 화살표)와 AOX1 전사 종결 신호 (3'T) 사이에 삽입된 다음과 같은 성분을 포함한다; 산 포스파타제 분비 신호 (S)를 코딩하는 합성 DNA 단편, KEX2 프로테아제의 Lys-Arg 처리 부위로 종결되는 아미노산 19개의 합성 프로 서열 (P) 및 다중 클로닝 부위. GS115 형질전환에서의 선별 마커로서 작용하는 HIS4 유전자를 부위 지향 돌연변이에 의해 변형시켜 Stul 인식 서열을 제거하였다 (HIS4^*). Bla 유전자 및 이. 콜라이 (E. coli) 증식을 위한 복제 기점 (ori)를 포함하는 pBR322 서열을 단일 라인으로 나타내었다. 도 12B는 pYAM7SP8에 포함된 다음과 같은 인접 DNA 서열을 도시하였다: 산 포스파타제 (PH01) 분비 신호 서열, 프로 서열 및 다중 클로닝 부위 (MCS) 서열. PH01 분비 신호의 ATG 출발 코돈은 밑줄을 그었다.

도 13A 내지 13H는 안실로스토마 카니눔으로부터 단리된 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 특정 NAP 단백질의 추정 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 13A는 재조합 cDNA분자 AcaNAP23 [서열 번호 31]의 서열을 도시한 것이다. 도 13B는 재조합 cDNA 분자 AcaNAP24 [서열 번호 32]의 서열을 도시한 것이다. 도 13C는 재조합 cDNA 분자 AcaNAP25 [서열 번호 33]의 서열을 도시한 것이다. 도 13D는 모두 동일한 재조합 cDNA 분자 AcaNAP31, AcaNAP42 및 AcaNAP46의 서열 [서열 번호 34]을 도시한 것이다. 도 13E는 재조합 cDNA 분자 AcaNAP44 [서열 번호 35]의 서열을 도시한 것이다. 도 13F는 재조합 cDNA 분자 AcaNAP45 [서열 번호 36]의 서열을 도시한 것이다. 도 13G는 재조합 cDNA 분자 AcaNAP47 [서열 번호 37]의 서열을 도시한 것이다. 도 13H는 재조합 cDNA 분자 AcaNAP48 [서열 번호 38]의 서열을 도시한 것이다. 재조합 cDNA 분자의 5' 말단에 대응하는 EcoRI 부위는 모든 경우에 밑줄을 그어 표시하였다. 각 서열의 번호는 이 EcoRI 부위에서 시작한다. AcaNAP45 및 AcaNAP47은 각각 2개의 NAP 도메인을 갖는 단백질을 코딩하고 이 도면 내의 모든 다른 클론은 하나의 NAP 도메인을 갖는 단백질을 코딩한다.

도 14는 재조합 cDNA 분자 NamNAP [서열 번호 39]의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 15는 동맥 혈전증의 FeCl₃에서 평가된 AcaNAP5 및 저분자량 헤파린 (LMWH; Enoxaparin^TM)의 항혈전 활성을 나타낸 것이다. 활성 데이타는 경동맥에서 폐색성 혈전 형성의 발생 백분율로서 나타내었다 (원). 혈전 형성은 시험 제제의 피하 (s.c.) 투여 150분 후에 시작되었다. 동일한 방식으로 처리하되 FeCl₃를 첨가하지 않은 별개군의 동물에서 심한 상처의 출혈을 정량하였다 (사각형). 목의 심한 외과적 상처에서의 혈액 손실을 화합물의 피하 투여 후에 총 210분 동안에 걸쳐서 정량하였다.

도 16은 본 명세서에서 개시된 방법에 따라 단리된 성숙 NAP, 즉 AcaNAP5 [서열 번호 40], AcaNAP6 [서열 번호 41], AcaNAP48 [서열 번호 42], AcaNAP23 [서열 번호 43], AcaNAP24 [서열 번호 44], AcaNAP25 [서열 번호 45], AcaNAP44 [서열 번호 46], AcaNAP31, 42, 46 [서열 번호 47], AceNAP4d1 [서열 번호 48], AceNAP4d2 [서열 번호 49], AcaNAP45d1 [서열 번호 50], AcaNAP47d1 [서열 번호 51], AduNAP7d1 [서열 번호 52], AcaNAP45d2 [서열 번호 53], AcaNAP47d2 [서열 번호 54], AduNAP4 [서열 번호 55], AduNAP7d2 [서열 번호 56], AceNAP5 [서열 번호 57], AceNAP7 [서열 번호 58], AcaNAPc2 [서열 번호 59], HpoNAP5 [서열 번호 60] 및 NamNAP [서열 번호 61]에 대응하는 아미노산 서열의 배열을 나타낸 것이다. 각각의 NAP 도메인은 아미노산 서열을 배열하는데 사용되는 10개의 시스테인 잔기 및 시스테인 사이의 아미노산 서열을 포함한다. A1 내지 A10은 시스테인 잔기 및 사이의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 17은 2개의 도메인을 갖는 성숙 AceNAP4 [서열 번호 62]의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 18은 2개의 도메인을 갖는 성숙 AcaNAP45 [서열 번호 63]의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 19는 2개의 도메인을 갖는 성숙 AcaNAP47 [서열 번호 64]의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 20은 2개의 도메인을 갖는 성숙 AduNAP7 [서열 번호 65]의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

본 발명은 선충에서 추출된 항응고성 단백질 (NAP)로 집합적으로 언급되는 일군의 단백질을 제공한다. 이 단백질은 처음에 단리된 최초의 구성원이 선충인 개 십이지장충 안실로스토마 카니눔으로부터 추출되었기 때문에 그와같이 명명되었다. 그러나, NAP 또는 NAP 도메인으로 명명하였다고 하여 상기 또는 다른 천연 공급원에 의해 본 발명의 단백질을 제한하는 것으로 생각되어서는 안된다.

각각의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖고 세린 프로테아제 억제 및(또는) 항응고 활성을 갖는다는 특징을 갖는다. 이러한 항응고 활성은 본 명세서에서 기술되는 PT 및 aPTT 분석 모두에서 응고 시간의 증가, 인자 Xa 또는 인자 VIIa/TF 활성의 억제 또는 체내에서의 활성의 입증에 의해 평가할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 분석에 사용되는 혈액 또는 혈장은선충에 감염되는 것으로 알려진 종, 예를 들면 돼지, 인간, 영장동물 등에서 유래한 것이다. NAP 도메인은 아미노산 서열이다. NAP 도메인은 관찰된 억제 및(또는) 항응고 활성을 갖는 것으로 생각된다. 대표적인 특정 NAP 도메인은 도 11 및 16에 도시한 아미노산 서열, 특히 도면에 시스테인 1 및 시스테인 10으로 명명된 시스테인 사이의 서열 및 시스테인 10 이후의 서열을 포함한다. 이 단백질 군, 및 이 단백질을 코딩하는 mRNA 및 DNA 서열을 포함한 핵산 분자를 광범위하게 정의하는 특성이 제공된다. 이들 단백질의 제조 방법 및 이 단백질을 코딩하는 핵산의 제조 방법도 제공된다. 제시된 구체적인 실시예는 단지 예시적인 것으로서 NAP 단백질 군의 다른 구성원 및 이를 코딩하는 핵산 서열은 실시예에서 개괄되고 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 단백질은 항응고 활성을 갖고 하나 이상의 NAP 도메인을 포함하는 단백질로 이루어지는 단리된 NAP를 포함한다.

"항응고 활성"에 있어서, 본 발명의 정제 단백질은 항응고제로서 활성을 갖고 이와 같이 혈장의 응고를 포함하여 혈액의 응고를 억제한다는 특징을 갖는다. 한 특징에서 본 발명의 바람직한 단리된 단백질은 프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 분석 모두에서 측정된 인간 혈장의 응고 시간을 증가시키는 단백질을 포함한다.

PT 분석에서 응고는 고정량의 조직 인자-인지질 미셀 복합체 (트롬보플라스틴)를 인간 혈장에 첨가함으로써 개시된다. 항응고제는 이 복합체의 표면에서 특정의 상호 작용을 방해하여 항응고제가 없을 때 관찰된 응고에 비해 응고를 달성하는데 소요되는 시간을 증가시킨다. PT의 측정은 이 분석에서 응고를 야기하는데 필요한 일련의 특이 생화학적 사건이 흡혈을 촉진하기 위해 십이지장충이 현실적으로 극복해야 하는 사건과 유사하기 때문에 NAP 항응고 활성의 평가에 특히 관련된다. 따라서, 이 분석에서 억제제로서 작용하는 NAP의 능력은 현실적으로 그의 활성에 비견할 만하고 체내에서 항응고 활성의 지표가 된다. 양 분석 모두에서 및 체내에서 응고 반응은 세린 프로테아제 인자 VIIa (fVIIa)와 단백질 조직 인자 (TF) (fVlla/TF)의 이원 복합체가 형성되어 fXa가 생성됨으로써 개시된다. 그 다음에 fXa의 프로트롬비나제 복합체로의 회합은 트롬빈 형성 및 종국적인 혈병 형성의 중요한 사건이다.

aPTT 분석에서 응고는 특정한 고정량의 음하전 인지질 미셀 (활성인자)을 인간 혈장에 첨가함으로써 개시된다. 항응로제로서 작용하는 물질은 복합체의 표면에서 특정 상호 작용을 방해하여 항응고제가 없을 때 관찰되는 것에 비해 특정량의 응고를 달성하는데 소요되는 시간을 증가시킨다. 실시예 B는 이러한 PT 및 aPTT 분석을 기술한다. 이들 분석을 사용하여 본 발명의 단리된 NAP의 항응고 활성을 분석할 수 있다.

본 발명의 바람직한 단리된 NAP에는 약 1 내지 약 500 나노몰의 농도로 존재시에 PT 분석에서 인간 혈장의 응고 시간을 2배로 하는 NAP 및 약 1 내지 약 500 나노몰의 농도로 존재시에 aPTT 분석에서 인간 혈장의 응고 시간을 두배로 하는 NAP이 포함된다. 특히 바람직한 것은, 약 5 내지 약 100 나노몰의 농도로 존재시에 PT 분석에서 인간 혈장의 응고 시간을 2배로 하는 NAP 및 약 5 내지 약 200 나노몰의 농도로 존재시에 aPTT 분석에서 인간 혈장의 응고 시간을 두배로 하는 NAP이다. 보다 특히 바람직한 것은, 약 10 내지 약 50 나노몰의 농도로 존재시에 PT 분석에서 인간 혈장의 응고 시간을 2배로 하는 NAP 및 약 10 내지 약 100 나노몰의 농도로 존재시에 aPTT 분석에서 인간 혈장의 응고 시간을 두배로 하는 NAP이다.

또한, 본 발명의 항응고 또는 항혈전 활성은 실시예 F에 나타낸 체내 모델을 사용하여 평가할 수 있다. 실시예 F의 A에서 기술된 쥐 FeCl₃ 모델은 항혈전 화합물을 평가하는데 주로 사용되는 혈소판 의존성 동맥 혈전증의 모델이다. 이 모델은 쥐 경동맥의 부위에서 FeCl₃에 의해 유도되는 폐색성 혈전의 형성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 평가한다. 본 발명의 NAP는 정맥내 또는 피하 투여될 때 상기 모델에서의 효과적인 항응고제이다. 실시예 F의 B에서 기술되는 심한 상처 출혈 분석은 항응고 화합물 투여 후의 혈액 손실을 측정할 수 있게 한다. 항응고제의 바람직한 효과는 혈액 응고 또는 혈전 형성을 억제하는 것이지 응혈을 완전히 억제하여 출혈을 심화시킬 정도는 아니다. 따라서, 심한 부상 출혈 분석은 항응고제 투여 후 3.5시간에 걸쳐서 혈액 손실량을 측정한다. 도 15에 나타낸 데이타는 본 발명의 NAP가 과도한 출혈을 야기하지 않는 투여량에서 효과적인 항혈전성 화합물임을 보여준다. 이와 대조적으로, 저분자량 헤파린 (LMWH)의 0% 폐색에 관련된 투여량은 NAP의 효과적인 투여량보다 약 3배 더 출혈을 야기하였다.

일반적인 NAP 도메인 (화학식 Ⅰ)

"NAP 도메인"에 대하여 본 발명의 단리된 단백질 (또는 NAP)은 그의 아미노산 서열에 하나 이상의 NAP 도메인을 포함한다. 특정 NAP 도메인은 약 5.0 내지 10.0 킬로달톤, 바람직하게는 약 7.0 내지 10.0 킬로달톤의 분자량을 갖고 10개의 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 특정의 바람직한 단리된 NAP에는 각각 하기 화학식 Ⅰ의 아미노산 서열을 포함하는 특징을 추가로 갖는 NAP 도메인을 하나 이상 포함하는 것이 포함된다.

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Crs

상기 식에서,

(a) A1은 7 내지 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이고; (b) A2는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이고; (c) A3은 3개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이고; (d) A4는 6 내지 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이고; (e) A5는 3 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이고; (f) A6은 3 내지 5개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이고; (g) A7은 아미노산 잔기이고; (h) A8은 10 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이고; (i) A9는 5 내지 6개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다. 경미하게 상이한 NAP 도메인을 갖는 다른 NAP (화학식 II 내지 V 참조)은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

특히 바람직한 NAP 도메인에는 A2가 4 내지 5개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이고; A4는 6 내지 16개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열인 것이 포함된다. 보다 바람직한 것은, (a) A1은 그의 제4 아미노산 잔기로서 Glu를 갖고; (b) A2는 그의 제1 아미노산 잔기로서 Gly를 갖고; (c) A8은 그의 제3 아미노산 잔기로서 Gly를, 제6 아미노산 잔기로서 Arg를 갖고; (d) A9는 그의 제1 아미노산 잔기로서 Val을 갖는 NAP 도메인이다. 보다 바람직하게는, A3은 그의 제1 아미노산 잔기로서 Asp 또는 Glu를, 제3 아미노산 잔기로서 Lys 또는 Arg을 갖고 A7은 Val 또는 Gln이다. 또한, 보다 바람직하게는 A8은 그의 제4 아미노산 잔기로서 Leu 또는 Phe을, 제5 아미노산 잔기로서 Lys 또는 Tyr을 갖는다. 또한, 바람직한 NAP 도메인은 A8이 11 또는 12개의 아미노산 잔기를 가질 때 Asp 또는 Gly가 그의 마지막 2번째의 아미노산 잔기이고, A8이 10개의 아미노산을 가질 때 Gly가 그의 제10 아미노산 잔기인 것이다. 재조합 단백질의 특정 발현계에서의 발현을 위하여 재조합 NAP는 추가로 적합한 분비 신호의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정의 대표적인 NAP 도메인은 도 11 및 도 16에 도시한 서열, 특히 시스테인 1 및 시스테인 10으로 명명된 시스테인 사이의 (및 이를 포함하는) 서열 및 시스테인 10 이후의 서열을 포함한다.

바람직한 특징에 따라, 하기 아미노산 서열을 포함하는 화학식 Ⅰ의 NAP 도메인을 하나 이상 포함하는 NAP가 제공된다.

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10

상기 식에서,

(a) Cys-A1은 서열 번호 66 및 129에서 선택되고; (b) Cys-A2-Cys은 서열 번호 130 내지 133 중의 하나에서 선택되고: (c) A3-Cys-A4는 서열 번호 134 내지 145 중의 하나에서 선택되고; (d) Cys-A5는 서열 번호 146 및 147에서 선택되고; (e) Cys-A6은 서열 번호 148 내지 150 중의 하나에서 선택되고; (f) Cys-A7-Cys-A8은 서열 번호 151 내지 153 중의 하나에서 선택되고; (g) Cys-A9-Cys은 서열 번호 154 및 155에서 선택된다. 또한, Cys-A2-Cys은 서열 번호 130 및 131에서 선택되고; A3-Cys-A4는 서열 번호 135 내지 145 중의 하나에서 선택되는 단백질이 바람직하다. 서열 번호 66 및 129가 위치 5에서 Glu를 갖고; 서열 번호 130 및 131이 위치 2에서 Gly을 갖고; 서열 번호 151 내지 153이 위치 6에서 Gly을 갖고 위치 9에서 Arg를 갖고; 서열 번호 154 및 155가 위치 2에서 Val을 갖는 단백질이 보다 바람직하다. 보다 바람직하게는, 서열 번호 151 내지 153이 위치 2에서 Val 또는 Glu를, 위치 7에서 Leu 또는 Phe를, 및(또는) 위치 8에서 Lys 또는 Tyr을 갖는다. 추가로 바람직하게는, 서열 번호 151은 위치 14에서 Asp 또는 Gly를 갖고, 서열 번호 152는 위치 13에서 Asp 또는 Gly를 갖고, 서열 번호 153은 위치 13에서 Gly를 갖는다.

본 발명의 특정 NAP는 응고 연쇄 반응에서의 특정 성분, 예를 들면 fXa 또는 fVIIa/TF 복합체의 억제에 대한 특이성을 보인다. 응고 연쇄 반응의 성분에 대한 NAP의 억제 활성의 특이성은 실시예 D에서의 프로토콜을 사용하여 평가할 수 있다. 이 실시예에서 응고에 관련된 상이한 세린 프로테아제의 활성을 억제하는 NAP의 능력이 측정되고 비교된다. 또한, fVIIa/TF 복합체를 억제하는 NAP의 능력은 억제 또는 비억제 방식으로 fXa에 결합하는 NAP의 능력 및 TF와 복합체를 형성할 때 FVIIa를 억제하는 NAP의 능력을 측정하는 실시예 E에서의 프로토콜을 사용하여 평가할 수 있다. AcaNAP5 및 AcaNAP6은 fXa를 특이적으로 억제하는 NAP 도메인을 갖는 단백질의 예이다. AcaNAPc2는 fXa 또는 그의 촉매 활성 또는 불활성 유도체의 존재시 fVIIa/TF 복합체에 대한 선택적인 억제를 보이는 fVIIa/TF 복합체를 갖는 단백질이다.

인자 Xa 억제 활성을 갖는 NAP를 포함하여 항응고 활성을 갖는 NAP (화학식 II)

따라서, 한 특징에서 본 발명의 NAP는 인자 Xa 억제 활성을 갖고 각각 하기 서열을 포함하는 NAP 도메인을 하나 이상 갖는 단리된 단백질을 포함하여 항응고 활성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다.

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10-Cys

상기 식에서,

(a) A1은 7 내지 8개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(b) A2는 아미노산 서열이고;

(c) A3은 3개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(d) A4는 아미노산 서열이고;

(e) A5는 3 내지 4개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(f) A6은 아미노산 서열이고;

(g) A7은 아미노산이고;

(h) A8은 11 내지 12개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(i) A9는 5 내지 7개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(j) A10은 아미노산 서열이고;

A2, A4, A6 및 A10은 각각 독립적으로 선택되는 수의 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기를 갖고 각 서열은 각각의 NAP 도메인이 총 약 120개 미만의 아미노산 잔기를 갖도록 선택된다.

상기 특징에서 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 특징에 따라 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고 억제 방법도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 상기 특징 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. NAP 단백질 AcaNAP5 [서열 번호 4 및 40] 및 AcaNAP6 [서열 번호 6 및 41] 은 하나의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 특징에 따라 바람직한 NAP이다.

본 발명의 상기 특징의 한 실시태양에 따른 바람직한 NAP 단백질은 A2가 3 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A4가 6 내지 19개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A6이 3 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A10이 5 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열인 것이다.

따라서, 한 바람직한 특징에서 인자 Xa 억제제로서의 활성을 갖고 하기 서열을 포함하는 화학식 II의 NAP 도메인을 하나 이상 갖는 단리된 단백질을 포함하여 항응고 활성을 갖는 단백질이 제공된다:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10

상기 식에서,

(a) Cys-A1은 서열 번호 67 및 156으로부터 선택되고;

(b) Cys-A2-Cys는 서열 번호 157 내지 159 중의 하나로부터 선택되고;

(c) A3-Cys-A4는 서열 번호 160 내지 173 중의 하나로부터 선택되고;

(d) Cys-A5는 서열 번호 174 및 175로부터 선택되고;

(e) Cys-A6은 서열 번호 176 내지 178 중의 하나로부터 선택되고;

(f) Cys-A7-Cys-A8은 서열 번호 179 및 180으로부터 선택되고;

(g) Cys-A9는 서열 번호 181 내지 183 중의 하나로부터 선택되고;

(h) Cys-A10은 서열 번호 184 내지 204 중의 하나로부터 선택된다.

본 발명의 상기 특징의 또다른 바람직한 실시태양에서 A3은 A3_a 및 A3_b가 독립적으로 선택된 아미노산 잔기인 서열 Glu-A3_a-A3_b를 갖는다. 보다 바람직하게는, A3_a는 A1a, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu 및 Thr으로 이루어지는 군 중에서 선택되고 A3_b는 Lys, Thr 및 Arg으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 특히 바람직한 A3 서열은 Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys 및 Glu-Thr-Lys으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

본 발명의 상기 특징의 또다른 바람직한 실시태양에서 A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산이다.

본 발명의 상기 특징에 따라 바람직한 A7 아미노산 잔기는 Val 또는 Ile이다.

본 발명의 상기 특징의 또다른 바람직한 실시태양은 A8이 하기 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

A8_a-A8_b-A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g [서열 번호 68]

상기 식에서,

(a) A8_a는 A8의 제1 아미노산 잔기이고,

(b) A8_a 및 A8_b 중의 적어도 하나는 Glu 또는 Asp로 이루어지는 군 중에서 선택되고,

(c) A8_c 내지 A8_g는 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기이다.

바람직하게는, A8_c는 Gly이고, A8_d는 Phe, Tyr 및 Leu으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, A8_e는 Tyr이고, A8_f는 Arg이고, A8_g는 Asp 및 Asn 중에서 선택된다. 특히 바람직한 A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g 서열은 Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 72] 및 Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 73]으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

또다른 바람직한 실시태양은 A10이 Glu-Ile-Ile-His-Val [서열 번호 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [서열 번호 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [서열 번호 76] 및 Met-Glu-Ile-Ile-Thr [서열 번호 77]로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

NAP 단백질 AcaNAP5 및 AcaNAP6은 A10에 아미노산 서열 Glu-Ile-Ile-His-Val [서열 번호 74]를 포함하고 본 발명의 상기 실시태양에 따라 바람직한 NAP이다.

본 발명의 상기 특징의 한 실시태양에서, 바람직한 NAP 분자는

(a) A3은 A3_a 및 A3_b가 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기인 서열 Glu-A3_a-A3_b이고,

(b) A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산 서열이고,

(c) A7은 Val 및 Ile으로 이루어지는 군 중에서 선택되고,

(d) A8은 Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 72] 및 Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 73]으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고,

(e) A10은 Glu-Ile-Ile-His-Val [서열 번호 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [서열 번호 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [서열 번호 76] 및 Met-Glu-Ile-Ile-Thr [서열 번호 77]로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고의 억제 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 상기 실시태양 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. 하나 또는 두개의 NAP 도메인을 갖는 NAP가 바람직하다. NAP 단백질 AcaNAP5 및 AcaNAP6은 하나의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 실시태양에 따른 바람직한 NAP이다.

또다른 바람직한 실시태양에서, NAP 분자는

(a) A3은 Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys 및 Glu-Thr-Lys으로 이루어지는 군 중에서 선택되고,

(b) A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산 서열이고,

(c) A7은 Val 또는 Ile이고,

(d) A8은 A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 78], A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 79], A8_a-A8_b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 80], A8_a-A8_b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 81] 및 A8_a-A8_b-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 82] (여기서, A8_a 및 A8_b 중의 적어도 하나는 Glu또는 Asp임)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고,

(e) A9는 5개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고,

(f) A10은 Glu-Ile-Ile-His-Val [서열 번호 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [서열 번호 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [서열 번호 76] 및 Met-Glu-Ile-Ile-Thr [서열 번호 77]로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고의 억제 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 상기 실시태양 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. 하나 또는 두개의 NAP 도메인을 갖는 NAP가 바람직하다. AcaNAP5 [서열 번호 40] 또는 AcaNAP6 [서열 번호 41]과 실질적으로 동일한 NAP 도메인을 하나 이상 갖는 단백질이 바람직하다. NAP 단백질 AcaNAP5 [서열 번호 4 및 40] 및 AcaNAP6 [서열 번호 6 및 41]은 하나의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 실시태양에 따른 특히 바람직한 NAP이다.

인자 Xa 억제 활성을 갖는 것을 포함하여 본 발명의 상기 특징에 대해 상기 언급한 모든 실시태양에 따른 항응고 활성을 갖는 바람직한 NAP 단백질은 선충 종에서 유래할 수 있다. 바람직한 선충 종은 안실로스토마 카니눔, 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 듀오데날레, 네카토르 아메리카누스 및 헬리고모소모이데스 폴리기루스로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 안실로스토마 카니눔에서 유래한 NAP 단백질 AcaNAP5 및 AcaNAP6이 특히 바람직하다.

또한, 본 발명의 상기 특징은 항응고 및(또는) 인자 Xa 억제 활성을 갖는 단리된 NAP 단백질에 대해 상기 언급한 각각의 실시태양에 따라 정의된, 항응고 및 (또는) 인자 Xa 억제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 단리된 재조합 cDNA 분자를 포함한다. 본 발명의 상기 특징에 따른 바람직한 cDNA는 AcaNAP5 및 AcaNAP6을 코딩한다.

본 발명의 상기 특징 내의 NAP의 인자 Xa 억제 활성은 본 명세서에서 기술한 프로토콜을 사용하여 측정할 수 있다. 실시예 A는 이러한 하나의 방법을 기술한다. 간단히 설명하면, NAP를 일정 기간 동안 인자 Xa와 함께 배양한 후 인자 Xa의 기질을 첨가한다. 기질의 가수분해 속도를 측정한 결과, NAP의 부재하의 속도보다 더 느린 속도로 분해하여 인자 Xa에 대한 NAP의 억제를 나타내었다. 실시예 C는 프로트롬비나제 복합체로의 회합시에 인자 Xa에 대한 NAP의 억제 활성을 검출하고 보다 정확하게 fXa의 정상적인 체내 생리적 기능을 반영하는 다른 방법을 제공한다. 이 실시예에서 기술하는 바와 같이, 프로트롬비나제 복합체에 회합된 인자 Xa를 NAP와 함께 배양하고 기질을 첨가한다. 프로트롬비나제 복합체에 의한 인자 Xa-매개 트롬빈 생성은 상기 혼합물로부터의 트롬빈의 생성 속도에 의해 측정된다.

인자 VIIa/TF 억제 활성을 갖는 NAP를 포함하여 항응고 활성을 갖는 NAP (화학식 Ⅲ)

또다른 특징에서, 본 발명의 NAP는 또한 인자 VIIa/TF 억제 활성을 갖고 각각 하기 화학식 Ⅲ의 서열을 포함하는 NAP 도메인을 하나 이상 갖는 단리된 단백질을 포함하여 항응고 활성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다.

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10

상기 식에서,

(a) A1은 7 내지 8개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(b) A2는 아미노산 서열이고;

(c) A3은 3개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(d) A4는 아미노산 서열이고;

(e) A5는 3 내지 4개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(f) A6은 아미노산 서열이고;

(g) A7은 아미노산이고;

(h) A8은 11 내지 12개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(i) A9는 5 내지 7개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(j) A10은 아미노산 서열이고;

A2, A4, A6 및 A10은 각각 독립적으로 선택되는 수의 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기를 갖고 각 서열은 각각의 NAP 도메인이 총 약 120개 미만의 아미노산 잔기를 갖도록 선택된다.

상기 특징에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 특징에 따라 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고 억제 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 상기 특징 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. 하나 또는 두개의 NAP 도메인을 갖는 NAP가 바람직하다. AcaNAPc2 [서열 번호 59]와 실질적으로 동일한 NAP 도메인을 하나 이상 갖는 단백질이 바람직하다. NAP 단백질 AcaNAPc2 [서열 번호 59]는 하나의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 특징에 따른 특히 바람직한 NAP이다.

본 발명의 상기 특징의 한 실시태양에 따른 바람직한 NAP 단백질은 A2가 3 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A4가 6 내지 19개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A6이 3 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A10이 5 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열인 것이다.

따라서, 한 바람직한 특징에서, 인자 VIIa/TF 억제 활성을 포함하여 항응고 활성을 갖고 하기 아미노산 서열을 포함하는 화학식 Ⅲ의 NAP 도메인을 하나 이상 갖는 단백질이 제공된다:

<화학식 Ⅲ>

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10

상기 식에서,

(a) Cys-A1은 서열 번호 83 및 205로부터 선택되고;

(b) Cys-A2-Cys는 서열 번호 206 내지 208 중의 하나로부터 선택되고;

(c) A3-Cys-A4는 서열 번호 209 내지 222 중의 하나로부터 선택되고;

(d) Cys-A5는 서열 번호 223 및 224로부터 선택되고;

(e) Cys-A6은 서열 번호 225 내지 227 중의 하나로부터 선택되고;

(f) Cys-A7-Cys-A8은 서열 번호 228 및 229로부터 선택되고;

(g) Cys-A9는 서열 번호 230 내지 232로부터 선택되고;

(h) Cys-A10은 서열 번호 233 내지 253중의 하나로부터 선택된다.

본 발명의 상기 특징의 또다른 바람직한 실시태양에서 A3은 A3_a 및 A3_b가 독립적으로 선택된 아미노산 잔기인 서열 Asp-A3_a-A3_b를 갖는다. 보다 바람직하게는, A3은 Asp-Lys-Lys이다.

또다른 바람직한 실시태양에서 A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산이다.

본 발명의 상기 특징의 또다른 바람직한 실시태양에서 A5는 A5_a 내지 A5_d가 독립적으로 선택된 아미노산 잔기인 서열 A5_a-A5_b-A5_c-A5_d [서열 번호 84]를 갖는다. 바람직하게는, A5_a는 Leu이고 A5_c는 Arg이다.

발명의 상기 특징에 따라 바람직한 A7 아미노산 잔기는 Val 또는 Ile, 보다 바람직하게는 Val이다.

본 발명의 상기 특징의 또다른 바람직한 실시태양은 A8이 하기 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

A8_a-A8_b-A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g [서열 번호 68]

상기 식에서,

(a) A8_a는 A8의 제1 아미노산 잔기이고,

(b) A8_a 및 A8_b 중의 적어도 하나는 Glu 또는 Asp로 이루어지는 군 중에서 선택되고,

(c) A8_c 내지 A8_g는 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기이다.

바람직하게는, A8_c는 Gly이고, A8_d는 Phe, Tyr 및 Leu으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, A8_e는 Tyr이고, A8_f는 Arg이고, A8_g는 Asp 및 Asn 중에서 선택된다. 특히 바람직한 A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g 서열은 Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 70]이다.

한 실시태양에서, 바람직한 NAP 분자는

(a) A3은 A3_a 및 A3_b가 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기인 서열 Asp-A3_a-A3_b이고,

(b) A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산 서열이고,

(c) A5는 A5_a 내지 A5_d가 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기인 서열 A5_a-A5_b-A5_c-A5_d를 갖고,

(d) A7은 Val 및 Ile으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것이다.

상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고의 억제 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 상기 실시태양 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. 하나 또는 두개의 NAP 도메인을 갖는 NAP가 바람직하다. NAP 단백질 AcaNAPc2는 하나의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 실시태양에 따른 바람직한 NAP이다.

또다른 바람직한 실시태양에서, NAP분자는

(a) A3은 Asp-Lys-Lys이고,

(b) A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산 서열이고,

(c) A5는 A5_a 내지 A5_d가 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기인 서열 A5_a-A5_b-A5_c-A5_d [서열 번호 85]를 갖고,

(d) A7은 Val이고,

(e) A8은 A8_a 및 A8_b 중의 적어도 하나가 Glu 또는 Asp인 아미노산 서열 A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 79]을 포함한다. 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고의 억제 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 상기 실시태양 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. 하나 또는 두개의 NAP 도메인을 갖는 NAP가 바람직하다. NAP 단백질 AcaNAPc2 [서열 번호 59]는 하나의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 실시태양에 따른 바람직한 NAP이다.

인자 VIIa/TF 억제 활성을 갖는 것을 포함하여 본 발명의 상기 특징에 대해 상기 언급한 모든 실시태양에 따른 항응고 활성을 갖는 바람직한 NAP 단백질은 선충 종에서 유래할 수 있다. 바람직한 선충 종은 안실로스토마 카니눔, 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 듀오데날레, 네카토르 아메리카누스 및 헬리고모소모이데스 폴리기루스로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 안실로스토마 카니눔에서 유래한 NAP 단백질 AcaNAPc2가 특히 바람직하다. 본 발명의 상기 특징은 항응고 및 (또는) 인자 VIIa/TF 억제 활성을 갖는 단리된 NAP 단백질에 대해 상기 언급한 각각의 실시태양에 따라 정의된, 항응고 및(또는) 인자 VIIa/TF 억제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 단리된 재조합 cDNA 분자를 포함한다. 본 발명의 상기 특징에 따른 바람직한 cDNA는 뉴클레오티드 서열 [서열 번호 19]을 갖고 AcaNAPc2 [서열 번호 59]를 코딩한다.

본 발명의 상기 특징 내의 NAP의 fVIIa/TF 억제 활성은 본 명세서에서 기술한 프로토콜을 사용하여 측정할 수 있다. 실시예 E는 fVIIa/TF 분석법을 기술한다. 이 실시예에서, 방사표지된 인간 인자 IX (³H-FIX)로부터의 3중수소화 활성화 펩티드의 fVIIa/TF-매개 분해 및 방출 또는 색소원성 펩티딜 기질의 아미드 분해를 측정한다. 흥미롭게도, 본 발명의 NAP fVIIa/TF 억제제가 활성 fVIIa/TF 억제제가 되기 위해서는 fXa의 존재를 필요로 한다. 그러나, NAP fVIIa/TF 억제제는 활성부위가 펩티딜 클로로메틸 케톤 H-Glu-Gly-Arg-CMK (EGR)에 의해 비가역적으로 결합되어 촉매적으로 불활성 (EGR-fXa)으로 된 fXa의 존재하에서도 동일하게 효과적이다. 어떠한 설명으로 지지되기를 바라는 것은 아니지만, fVIIa/TF 억제 활성을 갖는 NAP는 fXa의 촉매 중심 내의 1차 인식 부위인 P4-P1과 상이한 이 효소 상의 특이 인식 부위에 결합함으로써 fXa와 이원 복합체를 형성하는 것으로 보인다. 이어서, fVIIa/TF 복합체와의 4원 억제 복합체를 형성한다. 이 가설은 EGR-fXa가 트리펩티딜-클로로메틸 케톤 (EGR-CMK)에 의해 fxa의 촉매 부위 내의 1차 인식 부위 (P4-P1)가 공유결합에 의해 점유되어도 fVIIa/TF를 억제하는 NAP에 의한 fVIIa/TF의 억제를 충분히 지지한다는 것과 일치한다.

또한, NAP의 fVIIa/TF 억제 효과는 실시예 D의 프로토콜 및 실시예 A 및 C에 기술한 fXa분석을 사용하여 측정할 수 있다. 이 측정에서 상이한 효소의 촉매 활성을 억제하는 NAP의 능력을 측정하여 fVIIa/TF 복합체에 대한 그의 억제 활성과 비교한다. NAP에 의한 fVIIa/TF의 특이적인 억제는 특정의 용도를 위한 바람직한 특성이다.

본 발명의 다른 특징은 fXa 또는 촉매상 불활성인 fXa 유도체의 존재 하에 fVIIa/TF 복합체의 촉매 활성을 특이적으로 억제하지만 TF의 부재시에는 FVIIa의 활성을 특이적으로 억제하지 못하고 프로트롬빈을 특이적으로 억제하지 못하며 항응고 활성을 갖는 단리된 단백질 및 이 단백질 코딩하는 cDNA를 포함한다. 본 발명의 상기 특징에 따른 바람직한 단백질은 인자 VIIa/TF 억제 활성을 갖고 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는 단리된 단백질에 대해 상기 기술한 특징을 갖는다. 본 발명의 상기 특징에 따라 바람직한 단백질은 AcaNAPc2이다.

본 발명의 상기 특징 내의 NAP는 fXa 또는 촉매 활성을 갖거나 갖지 않는 fXa 유도체의 존재 하에 그의 fVIIa/TF 억제 활성에 의해 동정된다. 실시예 B, C 및 F에 기술된 프로토콜은 상기 NAP의 항응고 활성의 측정에 유용하다. 실시예 A의 프로토콜은 유리 fXa 또는 프로트롬비나제에 대한 NAP의 불활성을 검출할 수 있다. 실시예 E의 프로토콜을 사용하여 얻은 데이타는 fVIIa/TF 복합체를 억제하기 위해 촉매 활성 또는 불활성 fXa를 필요로 하는 NAP를 동정할 것이다.

세린 프로테아제 억제 활성을 갖는 NAP (화학식 IV)

또다른 특징에서, 본 발명의 NAP는 또한 세린 프로테아제 억제 활성을 갖고 각각 하기 화학식 IV의 서열을 포함하는 NAP 도메인을 하나 이상 갖는 단리된 단백질을 포함한다.

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10

상기 식에서,

(a) A1은 7 내지 8개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(b) A2는 아미노산 서열이고;

(c) A3은 3개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(d) A4는 아미노산 서열이고;

(e) A5는 3 내지 4개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(f) A6은 아미노산 서열이고;

(g) A7은 아미노산이고;

(h) A8은 10 내지 12개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(i) A9는 5 내지 7개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(j) A10은 아미노산 서열이고;

A2, A4, A6 및 A10은 각각 독립적으로 선택되는 수의 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기를 갖고 각 서열은 각각의 NAP 도메인이 총 약 120개 미만의 아미노산 잔기를 갖도록 선택된다. 상기 특징에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 특징에 따라 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고 억제 방법도 본 발명에 의해 고려된다. 본 발명의 상기 특징 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. 하나 또는 두개의 NAP 도메인을 갖는 NAP가 바람직하다. HpoNAP5 [서열 번호 60] 또는 NamNAP [서열 번호 61]와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 NAP 도메인이 바람직하다. NAP 단백질 HpoNAP5 [서열 번호 60] 및 NamNAP [서열 번호 61]는 하나의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 특징에 따른 특히 바람직한 NAP이다.

본 발명의 상기 특징의 한 실시태양에 따른 바람직한 NAP 단백질은 A2가 3 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A4가 6 내지 19개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A6이 3 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A10이 1 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열인 것이다.

따라서, 한 바람직한 특징에서, 세린 프로테아제 억제 활성을 보이는 NAP는 하기 아미노산 서열을 포함하는 화학식 IV의 NAP 도메인을 하나 이상 갖는다:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10

상기 식에서,

(a) Cys-A1은 서열 번호 86 및 254로부터 선택되고;

(b) Cys-A2-Cys는 서열 번호 255 내지 257 중의 하나로부터 선택되고;

(c) A3-Cys-A4는 서열 번호 258 내지 271 중의 하나로부터 선택되고;

(d) Cys-A5는 서열 번호 272 및 273으로부터 선택되고;

(e) Cys-A6은 서열 번호 274 내지 276 중의 하나로부터 선택되고;

(f) Cys-A7-Cys-A8은 서열 번호 277 및 279로부터 선택되고;

(g) Cys-A9는 서열 번호 280 내지 282로부터 선택되고;

(h) Cys-A10은 서열 번호 283 내지 307 중의 하나로부터 선택된다.

또다른 바람직한 실시태양에서 A3은 A3_a 및 A3_b가 독립적으로 선택된 아미노산 잔기인 서열 Glu-A3_a-A3_b를 갖는다. 보다 바람직하게는, A3은 Glu-Pro-Lys 이다.

또다른 바람직한 실시태양에서 A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산이다.

또다른 바람직한 실시태양에서 A5는 A5_a 내지 A5_c가 독립적으로 선택된 아미노산 잔기인 서열 A5_a-A5_b-A5_c를 갖는다. 바람직하게는, A5_a는 Thr이고 A5_c는 Asn이다. 특히 바람직한 A5 서열은 Thr-Leu-Asn 또는 Thr-Met-Asn을 포함한다.

발명의 상기 특징에 따라 바람직한 A7 아미노산 잔기는 Gln이다.

본 발명의 상기 특징의 한 실시태양에서, 바람직한 NAP 분자는

(a) A3은 A3_a 및 A3_b가 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기인 서열 Glu-A3_a-A3_b이고,

(b) A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산 서열이고,

(c) A5는 A5_a 내지 A5_c가 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기인 서열 A5_a-A5_b-A5_c를 갖고,

(d) A7은 Gln인 것이다.

상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고의 억제 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 상기 실시태양 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. 하나 또는 두개의 NAP 도메인을 갖는 NAP가 바람직하다. NAP 단백질 HpoNAP5 [서열 번호 60] 및 NamNAP [서열 번호 61]는 하나의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 실시태양에 따른 바람직한 NAP이다.

또다른 바람직한 실시태양에서, NAP 분자는

(a) A3은 Glu-Pro-Lys이고,

(b) A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산 서열이고,

(c) A5는 Thr-Leu-Asn 및 Thr-Met-Asn 중에서 선택되고,

(d) A7은 Gln인 것이다

상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고의 억제 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 상기 실시태양 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. 하나 또는 두개의 NAP 도메인을 갖는 NAP가 바람직하다. NAP 단백질 HpoNAP5 [서열 번호 60] 및 NamNAP [서열 번호 61]는 하나의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 실시태양에 따른 바람직한 NAP이다.

본 발명의 상기 특징에 대해 상기 언급한 모든 실시태양에 따라 세린 프로테아제 억제 활성을 갖는 바람직한 NAP 단백질은 선충 종에서 유래할 수 있다. 바람직한 선충 종은 안실로스토마 카니눔, 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 듀오데날레, 네카토르 아메리카누스 및 헬리고모소모이데스 폴리기루스로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 각각 헬리고모소모이데스 폴리기루스 및 네카토르 아메리카누스에서 유래한 NAP 단백질 HpoNAP5 및 NamNAP가 특히 바람직하다.

본 발명의 상기 특징은 세린 프로테아제 억제 활성을 갖는 단리된 NAP 단백질에 대해 상기 언급한 각각의 실시태양에 따라 정의된, 세린 프로테아제 억제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 단리된 재조합 cDNA 분자를 포함한다. 본 발명의 상기 특징에 따른 바람직한 cDNA는 뉴클레오티드 서열 [서열 번호 14] (HpoNAP5) 및 [서열 번호 39] (NamNAP)를 갖고 HpoNAP5 [서열 번호 60] 및 NamNAP [서열 번호 61]을 코딩한다.

세린 프로테아제 억제 활성은 실시예 A 내지 F에서 기술되는 분석법 중의 어느 하나 또는 세린 프로테아제 활성의 억제를 측정하기 위하여 통상적으로 사용되는 효소 분석법을 사용하여 측정할 수 있다. 다중 효소 분석 방법은 문헌 [Methods of Enzymology] 또는 유사한 참고 문헌에서 찾아볼 수 있다. 바람직한 NAP는 혈액 응고 연쇄 반응의 효소 또는 트립신/엘라스타제에 대한 세린 프로테아제 활성을 갖는다.

항응고 활성을 갖는 NAP (화학식 V)

또다른 특징에서, 본 발명의 NAP는 또한 항응고 활성을 갖고 각각 하기 화학식 V의 서열을 포함하는 NAP 도메인을 하나 이상 갖는 단리된 단백질을 포함한다.

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10

상기 식에서,

(a) A1은 7 내지 8개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(b) A2는 아미노산 서열이고;

(c) A3은 3개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(d) A4는 아미노산 서열이고;

(e) A5는 3 내지 4개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(f) A6은 아미노산 서열이고;

(g) A7은 아미노산이고;

(h) A8은 11 내지 12개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(i) A9는 5 내지 7개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고;

(j) A10은 아미노산 서열이고;

A2, A4, A6 및 A10은 각각 독립적으로 선택되는 수의 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기를 갖고 각 서열은 각각의 NAP 도메인이 총 약 120개 미만의 아미노산 잔기를 갖도록 선택된다. 상기 특징에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 특징에 따라 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고 억제 방법도 본 발명에 의해 포함된다. 본 발명의 상기 특징 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. 하나 또는 두개의 NAP 도메인을 갖는 NAP가 바람직하다. 바람직한 NAP는 [서열 번호 40 내지 58] 중의 어느 하나와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 NAP 도메인을 하나 이상 갖는 것을 포함한다. NAP 단백질 AcaNAP5 [서열 번호 40], AcaNAP6 [서열 번호 41], AcaNAP8 [서열 번호 42], AcaNAP23 [서열 번호 43], AcaNAP24 [서열 번호 44], AcaNAP25 [서열 번호 45], AcaNAP44 [서열 번호 46], AcaNAP31 [서열 번호 47], AduNAP4 [서열 번호 55], AceNAP5 [서열 번호 57] 및 AceNAP7 [서열 번호 58]은 하나의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 특징에 따른 특히 바람직한 NAP이다. NAP 단백질 AceNAP4 [서열 번호 62], AcaNAP45 [서열 번호 63], AcaNAP47 [서열 번호 64] 및 AduNAP7 [서열 번호 65]는 2개의 NAP 도메인을 갖고 본 발명의 상기 특징에 따라 바람직한 NAP이다.

본 발명의 상기 특징의 한 실시태양에 따른 바람직한 NAP 단백질은 A2가 3 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A4가 6 내지 19개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A6이 3 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고, A10이 5 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열인 것이다.

상기 특징에 따라 본 발명의 바람직한 NAP는 항응고 활성을 갖고 하기 서열을 포함하는 화학식 V의 NAP 도메인을 하나 이상 갖는 단리된 단백질을 포함한다:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10

상기 식에서,

(a) Cys-A1은 서열 번호 87 및 308로부터 선택되고;

(b) Cys-A2-Cys는 서열 번호 309 내지 311 중의 하나로부터 선택되고;

(s) A3-Cys-A4는 서열 번호 312 내지 325 중의 하나로부터 선택되고;

(d) Cys-A5는 서열 번호 326 및 327로부터 선택되고;

(e) Cys-A6은 서열 번호 328 내지 330 중의 하나로부터 선택되고;

(f) Cys-A7-Cys-A8은 서열 번호 331 및 332로부터 선택되고;

(g) Cys-A9는 서열 번호 333 내지 335로부터 선택되고;

(h) Cys-A10은 서열 번호 336 내지 356 중의 하나로부터 선택된다.

또다른 바람직한 실시태양에서 A3은 A3_a 및 A3_b가 독립적으로 선택된 아미노산 잔기인 서열 Glu-A3_a-A3_b를 갖는다. 보다 바람직하게는, A3_a는 Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu 및 Thr으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, A3_b는 Lys, Thr 및 Arg으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 특히 바람직한 A3 서열은 Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys및 Glu-Thr-Lys으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

또다른 바람직한 실시태양에서 A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산이다. 발명의 상기 특징에 따라 바람직한 A7 아미노산 잔기는 Val 또는 Ile이다.

본 발명의 상기 특징의 또다른 실시태양은 A8이 하기 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

A8_a-A8_b-A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g [서열 번호 68]

상기 식에서,

(a) A8_a는 A8의 제1 아미노산 잔기이고,

(b) A8_a 및 A8_b 중의 적어도 하나는 Glu 또는 Asp로 이루어지는 군 중에서 선택되고,

(c) A8_c 내지 A8_g는 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기이다.

바람직하게는, A8_c는 Gly이고, A8_d는 Phe, Tyr 및 Leu으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, A8_e는 Tyr이고, A8_f는 Arg이고, A8_g는 Asp 및 Asn 중에서 선택된다. 바람직한 A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g 서열은 Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 72] 및 Gly-Leu-Tyr-Arg-AsP [서열 번호 73]으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

또다른 바람직한 실시태양은 A10이 Glu-Ile-Ile-His-Val [서열 번호 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [서열 번호 75], Phs-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [서열 번호 76] 및 Met-Glu-Ile-Ile-Thr [서열 번호 77]로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. NAP 단백질 AcaNAP5 [서열 번호 4 및 40] 및 AcaNAP6 [서열 번호 6 및 41]은 A10에 아미노산 서열 Glu-Ile-Ile-His-Val [서열 번호 74]를 포함하고 본 발명의 상기 실시태양에 따른 바람직한 NAP이다. NAP 단백질 AcaNAP48 [서열 번호 42]는 A10에 아미노산 서열 Asp-Ile-Ile-Met-Val [서열 번호 75]를 포함하고 본 발명의 상기 실시태양에 따른 바람직한 NAP이다. NAP 단백질 AcaNAP23 [서열 번호 43], AcaNAP24 [서열 번호 44], AcaNAP25 [서열 번호 45], AcaNAP44 [서열 번호 46], AcaNAP31 [서열 번호 47] 및 AceNAP4 [서열 번호 48, 49 및 62]는 아미노산 서열 Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [서열 번호 76]을 포함하고 본 발명의 상기 실시태양에 따른 바람직한 NAP이다. NAP 단백질 AcaNAP45 [서열 번호 50, 53 및 63], AcaNAP47 [서열 번호 51, 54 및 64], AduNAP7 [서열 번호 52, 56 및 65], AduNAP4 [서열 번호 55], AceNAP5 [서열 번호 57] 및 AceNAP7 [서열 번호 58]은 아미노산 서열 Met-Glu-Ile-Ile-Thr [서열 번호 77]을 포함하고 본 발명의 상기 실시태양에 따라 바람직한 NAP이다.

한 실시태양에서, 바람직한 NAP 분자는

(a) A3은 A3_a 및 A3_b가 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기인 서열 Glu-A3_a-A3_b이고,

(b) A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산 서열이고,

(c) A7은 Val 및 Ile으로 이루어지는 군 중에서 선택되고,

(d) A8은 Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn[서열 번호 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 72] 및 Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 73]으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고,

(e) A10은 Glu-Ile-Ile-His-Val [서열 번호 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [서열 번호 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [서열 번호 76] 및 Met-Glu-Ile-Ile-Thr [서열 번호 77]로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고의 억제 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 상기 실시태양 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. 하나 또는 두개의 NAP 도메인을 갖는 NAP가 바람직하다. NAP 단백질 AcaNAP5 [서열 번호 4 및 40], AcaNAP6 [서열 번호 6 및 41], AcaNAP48 [서열 번호 42], AcaNAP23 [서열 번호 43], AcaNAP24 [서열 번호 44], AcaNAP25 [서열 번호 45], AcaNAP44 [서열 번호 46], AcaNAP31 [서열 번호 47], AduNAP4 [서열 번호 55], AceNAP5 [서열 번호 57] 및 AceNAP7 [서열 번호 58]은 하나의 NAP 도메인을 포함하고 상기 실시태양에 따라 바람직한 NAP이다. NAP 단백질 AceNAP4 [서열 번호 62], AcaNAP45 [서열 번호 63], AcaNAP47 [서열 번호 64] 및 AduNAP7 [서열 번호 65]는 2개의 NAP 도메인을 갖고 상기 실시태양에 따라 바람직한 NAP이다.

또다른 바람직한 실시태양에서, NAP분자는

(a) A3은 Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys 및 Glu-Thr-Lys으로 이루어지는 군 중에서 선택되고,

(b) A4는 순 음이온 전하를 갖는 아미노산 서열이고,

(c) A7은 Val 또는 Ile이고,

(d) A8은 A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 78], A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 79], A8_a-A8_b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 80], A8_a-A8_b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [서열 번호 81] 및 A8_a-A8_b-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [서열 번호 82] (여기서, A8_a 및 A8_b 중의 적어도 하나는 Glu 또는 Asp임)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고,

(e) A9는 5개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이고,

(f) A10은 Glu-Ile-Ile-His-Val [서열 번호 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [서열 번호 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [서열 번호 76] 및 Met-Glu-Ile-Ile-Thr [서열 번호 77]로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 실시태양에 따른 NAP 단백질을 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 응고의 억제 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 상기 실시태양 내의 NAP 단백질은 하나 이상의 NAP 도메인을 갖는다. NAP 단백질 AcaNAP5 [서열 번호 4 및 40], AcaNAP6 [서열 번호 6 및 41], AcaNAP48 [서열 번호 42], AcaNAP23 [서열 번호 43], AcaNAP24 [서열 번호 44], AcaNAP25 [서열 번호 45], AcaNAP44 [서열 번호 46], AcaNAP31 [서열 번호 47], AduNAP4 [서열 번호 55], AceNAP5 [서열 번호 57] 및 AceNAP7 [서열 번호 58]은 하나의 NAP 도메인을 포함하고 상기 실시태양에 따라 바람직한 NAP이다. NAP 단백질 AceNAP4 [서열 번호 62], AcaNAP45 [서열 번호 63], AcaNAP47 [서열 번호 64] 및 AduNAP7 [서열 번호 65]는 2개의 NAP 도메인을 갖고 상기 실시태양에 따라 바람직한 NAP이다.

본 발명의 상기 특징에 대해 상기 언급한 모든 실시태양에 따라 세린 프로테아제 억제 활성을 갖는 바람직한 NAP 단백질은 선충 종에서 유래할 수 있다. 바람직한 선충 종은 안실로스토마 카니눔, 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 듀오데날레, 네카토르 아메리카누스 및 헬리고모소모이데스 폴리기루스로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 안실로스토마 카니눔에서 유래한 NAP 단백질 AcaNAP5 [서열 번호 4 및 40], AcaNAP6 [서열 번호 6 및 41], AcaNAP48 [서열 번호 42], AcaNAP23 [서열 번호 43], AcaNAP24 [서열 번호 44], AcaNAP25 [서열 번호 45], AcaNAP44 [서열 번호 46], AcaNAP45 [서열 번호 63], AcaNAP47 [서열 번호 64] 및 AcaNAP31 [서열 번호 47]; 안실로스토마 세일라니쿰에서 유래한 AceNAP4 [서열 번호 62], AceNAP5 [서열 번호 57] 및 AceNAP7 [서열 번호 58]; 및 안실로스토마 듀오데날레에서 유래한 AduNAP7 [서열 번호 65] 및 AduNAP4 [서열 번호 55] 가 특히 바람직하다.

본 발명의 상기 특징은 항응고 활성을 갖는 단리된 NAP 단백질에 대해 상기 언급한 각각의 실시태양에 따라 정의된, 항응고 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 단리된 재조합 cDNA 분자를 포함한다. 본 발명의 상기 특징에 따른 바람직한 cDNA는 AcaNAP5 [서열 번호 3], AcaNAP6 [서열 번호 5], AcaNAP48 [서열 번호 38], AcaNAP23 [서열 번호 31], AcaNAP24 [서열 번호 32], AcaNAP25 [서열 번호 33], AcaNAP44 [서열 번호 35], AcaNAP31 [서열 번호 34], AduNAP4 [서열 번호 12], AceNAP5 [서열 번호 10], AceNAP7 [서열 번호 11], AceNAP4 [서열 번호 9], AcaNAP45 [서열 번호 36], AcaNAP47 [서열 번호 37] 및 AduNAP7 [서열 번호 13]을 포함한다.

본 발명의 상기 특징 내의 항응고 활성은 본 명세서에서 기술되는 프로토콜을 사용하여 측정할 수 있다. 실시예 B 및 F는 NAP의 항응고 활성을 평가하는 특히 유용한 방법을 제공한다. fXa 억제 활성 (실시예 A, C) 및 fVIIa/TF 억제 활성 (실시예 E)을 갖는 NAP를 검출하기 위해 기술되는 방법은 또한 NAP의 항응고 활성의 평가에 유용하다.

올리고뉴클레오티드

본 발명의 또다른 면은 하기 서열로부터 선택되는 서열로 이루어지는 올리고 뉴클레오티드이다:

YG109: TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [서열 번호 88]

YG103: AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [서열 번호 89]

NAP-1: AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY [서열 번호 90] 및

NAP-4. RC: TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA [서열 번호 91]

이들 올리고뉴클레오티드 서열은 NAP 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 혼성화한다.

본 발명의 단리된 NAP는 단편을 포함하여 개시된 아미노산 서열 또는 서열들에서의 변이, 자연 발생 돌연변이, 대립유전자 변이, 랜덤 발생 인위적 돌연변이 및 의도적인 서열 변이를 갖고 항응고 활성을 갖는 것을 포함한다. 용어 "단편"은 완전한 단백질보다 적은 아미노산을 포함하는 서열의 임의의 부분, 예를 들면 완전한 단백질의 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 아미노 말단과 카르복시 말단 사이의 부분을 제외한 부분 서열을 의미한다.

또한, 본 발명의 단리된 NAP는 NAP 도메인 아미노산 서열 또는 서열들의 항응고 활성이 보존된 재조합 아미노산 서열 또는 서열들을 갖는 단백질을 포함한다. 따라서,본 명세서에서 사용하는 바와 같이, 구문 "NAP 단백질" 또는 용어 "단백질"은 NAP 도메인을 포함하는 단백질을 나타낼 때 천연 NAP 단백질 및 재조합 수단에 의해 제조된 NAP 단백질을 차별 없이 의미한다. 이들 재조합 단백질은 하이브리드 단백질, 예를 들면 융합 단백질, 발현 벡터 내의 다중 유전자의 발현으로 생성된 단백질, 숙주 세포의 염색체 내의 다중 유전자의 발현으로 생성된 단백질을 포함하고 펩티드 결합에 의해 제2 폴리펩티드에 결합된 개시된 단백질의 항응고 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 또한 보존적 아미노산 치환에 의해서만 상이한 본 발명의 NAP 도메인 아미노산 서열 또는 서열들의 변이체를 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 문헌 [Taylor, W.R., J. Mol. Biol., 188:233 (1986)]의 표 1에 "세트 (sets)"로서 정의된다. 또한, 재조합 단백질은 아미노산이 치환되거나 결실되고 단리된 NAP 도메인 서열 또는 서열들의 항응고 활성이 보존된 본 발명의 단리된 NAP 도메인 아미노산 서열 또는 서열들의 변이체를 포함한다.

본 발명의 한 바람직한 실시태양은 실시예 1에서 기술되는 바와 같이 선충인 안실로스토마 카니눔으로부터 생화학적 방법에 의해 단리된 단백질이다. 이 단백질은 PT 및 aPTT 분석에서 인간 혈장의 응고 시간을 증가시키고 하나의 NAP 도메인을 포함하고 N 말단의 아미노산 서열이 Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [서열 번호 92]이고 질량 분광계에 의해 측정한 분자량이 약 8.7 킬로달톤 내지 약 8.8 킬로달톤이라는 특징을 갖는다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시태양은 선충 안실로스토마 카니눔으로부터 단리된 cDNA 라이브러리로부터 재조합 방법에 의해 제조된 항응고 활성을 갖는 단백질, 예를 들면 AcaNAP5 [서열 번호 4 및 40], AcaNAP6 [서열 번호 6 및 41], Pro-AcaNAP5 [서열 번호 7], Pro-AcaNAP6 [서열 번호 8], AcaNAP48 [서열 번호 42], AcaNAP23 [서열 번호 43], AcaNAP24 [서열 번호 44], AcaNAP25 [서열 번호 45], AcaNAP44 [서열 번호 46], AcaNAP31 [서열 번호 47], AcaNAP45 [서열 번호 63], AcaNAP47 [서열 번호 64] 및 AcaNAPc2 [서열 번호 59]; 안실로스토마 세일라니쿰으로부터 단리된 cDNA 라이브러리로부터 재조합 방법에 의해 제조된 항응고 활성을 갖는 단백질, 예를 들면 AceNAP4 [서열 번호 62], AceNAP5 [서열 번호 57] 및 AceNAP7 [서열 번호 58]; 안실로스토마 듀오데날레로부터 단리된 cDNA 라이브러리로부터 재조합 방법에 의해 제조된 항응고 활성을 갖는 단백질, 예를 들면 AduNAP7 [서열 번호 65] 및 AduNAP4 [서열 번호 55]; 헬리고모소모이데스 폴리기루스로부터 단리된 cDNA 라이브러리로부터 재조합 방법에 의해 제조된 항응고 활성을 갖는 단백질, 예를 들면 HpoNAP5 [서열 번호 60]; 및 네카토르 아메리카누스로부터 단리된 cDNA 라이브러리로부터 재조합 방법에 의해 제조된 항응고 활성을 갖는 단백질, 예를 들면 NamNAP [서열 번호 61]을 포함한다. 이들 단백질의 아미노산 서열은 도 11 및 16에 도시하였다. 이러한 각각의 바람직한 실시태양은 PT 및 aPTT 분석에서 인간 혈장의 응고 시간을 증가시키고 하나 이상의 NAP 도메인을 포함한다.

"단리된 단백질"에 있어서, 본 발명의 단백질은 당업계에 공지도거나 하기되는 당백질 정제 방법에 의해 단리된 것이다. 이들 단백질은 천연 공급원, 고형상 또는 용액 중에서 화학적 합성 후, 예를 들면 고형상 자동화 펩티드 합성 후의 화합물 혼합물 또는 재조합 방법에 의해 생성된 후의 세포 배양물로부터 단리될 수 있다.

또한, 하기되는 바와 같이, 본 발명은 NAP를 포함하는 제액 조성물 및 혈액응고 및 관련 혈전증의 반응을 억제하기 위한 NAP의 사용 방법을 포함한다. 또한, 시료 중의 NAP 핵산의 동정에 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브도 보다 충분하게 후술되는 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있다.

1. 천연 공급원으로부터 단리된 NAP

본 발명의 바람직한 단리된 단백질 (NAP)은 천연 공급원으로부터 단리하여 정제할수 있다. 천연 공급원으로서는 선충이 바람직하다. 적합한 선충에는 장내 선충류, 예를 들면 안실로스토마 카니눔, 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 듀오데날레, 네카토르 아메리카누스 및 헬리그모소모이데스 폴리기루스가 포함된다. 특히 바람직한 천연 공급원은 식혈 선충인 십이지장충 안실로스토마 카니눔이다.

본 발명의 바람직한 단리된 단백질은 생화학적 기술에 의해 천연 공급원으로부터 단리하여 정제할 수 있다. 상기 방법에는 가용성 추출물을 제조하고 상이한 고형 지지체 매트릭스 상에서의 크로마토그래피 방법을 사용하여 추출물을 농축하는 것을 포함한다. 바람직한 정제 방법은 상이한 프로테아제 억제제를 포함하는 0.02 M Tris-HCl, pH 7.4 완충액 중에 선충의 가용성 추출물을 제조한 후 콘카나발린-A 세파로스 매트릭스, 포로스20 HQ 양이온 교환 매트릭스, 수퍼덱스30 겔 여과 매트릭스 및 C18 역상 매트릭스를 포함하는 컬럼을 통과시키는 추출물의 크로마토그래피를 포함한다. PT 또는 aPTT 분석에 의해 측정시에 인간 혈장의 응고 시간을 증가시키는 능력 또는 정제 효소를 사용한 아미드 분해 비색 분석 또는 실시예 A 내지 F에 개시된 다른 방법으로 측정시에 인자 Xa 아미드 분해 활성을 억제하는 능력에 의해 상기 크로마토그래피 컬럼으로부터 수거된 분획을 선별하였다. 본 발명의 단리된 단백질의 바람직한 정제 방법의 예는 실시예 1에 개시된 방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 단백질은, 상기한 안실로스토마 카니눔과 같은 천연 공급원으로부터 정제하는 경우, [서열 번호 92]의 아미노산 서열 Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp을 포함하는 단백질을 포함한다. 그의 아미노 말단에 도 2 (AcaNAP5 [서열 번호 4]) 또는 도 4 (AcaNAP6 [서열 번호 6])에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 정제된 단백질이 특히 바람직하다. 본 발명의 한 바람직한 단백질은 그의 아미노 말단에 아미노산 서열 Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [서열 번호 92]를 갖고 질량 분광계에 의해 측정한 분자량이 약 8.7 킬로달톤 내지 약 8.8 킬로달톤인 것으로 입증되었다.

2. 화학 합성에 의해 제조된 NAP

본 발명의 바람직한 단리된 NAP는 화학 분야에 공지된 표준 방법에 의해 합성될 수 있다.

본 발명의 단리된 단백질은 고형상 합성, 예를 들면 문헌 [Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85:2149 (1964)]에 기재된 방법 또는 화학 분야에 공지된 다른 방법, 예를 들면 문헌 [Houghten in Proc. Natl. Acad. Sci., 82:5132 (1985)]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

고형상 합성법은 적합한 불용성 수지에 보호된 아미노산 또는 펩티드를 커플링시킴으로써 펩티드의 C 말단으로부터 시작한다. 적합한 수지에는 아미노산이 직접 커플링될 수 있는 클로로메틸, 브로모메틸, 히드록시메틸, 아미노메틸, 벤즈히드릴 및 t-알킬옥시카르보닐히드라지드기를 포함하는 수지가 포함된다.

이러한 고형상 합성법에서, 그의 알파 아미노기 및 필요한 경우 적합하게 보호된 그의 반응성 측쇄기를 갖는 카르복시 말단 아미노산이 불용성 수지에 먼저 커플링된다. 적합한 용매 중에서 예를 들면 트리플루오로아세트산으로 처리함으로써 알파 아미노 보호기를 제거한 후에, 그 역시 알파 아미노기 및 필요한 경우 적합하게 보호된 그의 반응성 측쇄기 또는 기들을 갖는 다음의 아미노산 또는 펩티드를 수지에 커플링된 아미노산의 유리 알파 아미노기에 커플링시킨다. 추가의 적합하게 보호된 아미노산 또는 펩티드를 동일한 방식으로 성장하는 펩트드쇄에 커플링시켜 목적하는 아미노산 서열을 얻는다. 이러한 합성은 자동 펩티드 합성기들 또는 이들을 조합 사용하여 수동 실시할 수 있다.

적합하게 보호된 아미노산 또는 펩티드의 수지에 부착된 아미노산의 유리 알파 아미노기에 대한 커플링은 통상의 커플링 방법, 예를 들면 아지드법, 혼합 무수물법, DCC (디시클로헥실카르보디이미드)법, 활성 에스테르법 (p-니트로페닐 에스테르 또는 N-히드록시숙신이미드 에스테르), BOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트)법 또는 우드워드(Woodward) 시약 K법에 의해 실시할 수 있다.

펩티드 합성에 있어서, 불용성 수지에 부착된 성장하는 펩티드쇄에 커플링되는 아미노산 또는 펩티드의 알파 아미노기에 대한 보호기는 측쇄 보호기를 제거하지 않는 조건 하에서 제거되는 것이 일반적이다. 합성 종결 후에 불용성 수지로부터 펩티드를 제거하고 제거 중 또는 후에 측쇄 보호기를 제거하는 것이 일반적이다.

모든 아미노산의 알파 아미노기 및 라이신의 오메가 아미노기에 대한 적합한 보호기에는 벤질옥시카르보닐, 이소니코티닐옥시카르보닐, o-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로페닐옥시카르보닐, p-메톡시페닐옥시카르보닐, t-부톡시카르보닐, t-아밀옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 2-(4-비페닐)-2-프로필옥시카르보닐, 9-플루오르에닐메톡시카르보닐, 메틸술포닐에톡실카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프탈릴, 포르밀, 2-니트로페닐술페닐, 디페닐포스피노티오일, 디메틸포스피노티오닐 등이 포함된다.

아스파르트산 및 글루탐산의 카르복시기에 대한 적합한 보호기에는 벤질 에스테르, 시클로헥실 에스테르, 4-니트로벤질 에스테르, t-부틸 에스테르, 4-피리딜메틸 에스테르 등이 포함된다.

아르기닌의 구아니디노기에 대한 적합한 보호기에는 니트로, p-톨루엔술포닐, 벤질옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, p-메톡시벤젠술포닐, 4-메톡시-2,6-디메틸벤젠술포닐, 1,3,5-트리메틸-페닐술포닐 등이 포함된다.

시스테인의 티올기에 대한 적합한 보호기에는 p-메톡시벤질, 트리페닐메틸, 아세틸아미노메틸, 에틸카르바모일, 4-메틸벤질, 2,4,6-트리메틸벤질 등이 포함된다.

세린의 히드록시기에 대한 적합한 보호기예는 벤질, t-부틸, 아세틸, 테트라히드로피라닐 등이 포함된다.

감온에서 티오 함유 스카벤저를 하나 이상 포함하는 액체 히드로플루오르산으로 처리하여 수지로부터 완전해진 펩티드를 분해할 수 있다. 이러한 처리에 의한 수지로부터 펩티드의 분해는 또한 펩티드로부터 모든 측쇄 보호기를 제거할 것이다.

분해된 펩티드는 묽은 아세트산 중에 용해시켜 여과한 후 재폴딩시키고 0.1 M 아세트산 용액 중의 약 0.5 내지 약 2 mM의 펩티드 농도로 희석하여 적절한 디술파이드 결합이 형성되도록 하였다. 이 용액의 pH는 수산화암모늄을 사용하여 약 8.0으로 조정하고 약 24 내지 약 72시간 동안 공기에 노출시킨 상태로 교반하였다.

재폴딩 펩티드를 크로마토그래피, 바람직하게는 물 중의 아세토니트릴 (0.1% 트리플루오로아세트산도 포함함)의 구배, 바람직하게는 물 중의 0 내지 약 80% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 역상 컬럼 상에서 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수 펩티드를 포함하는 분획을 수거하여 분획을 한데 모아서 고형상 펩티드로 동결건조시켰다.

3. 재조합 방법에 의해 제조된 NAP

별법으로, 본 발명의 바람직한 단리된 NAP는 본 명세서에 교시되고 생물학 분야에 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다 (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, volumes 1 to 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

재조합 DNA 방법을 사용하여 DNA가 얻어지는 생물체의 외부에서 상이한 생물체의 유전 정보 세그먼트인 DNA를 함께 결합시키고 이에 의해 생성되는 하이브리드 DNA를 본래의 DNA가 코딩하는 단백질을 생성시킬 수 있는 세포에 도입할 수 있다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 유전 정보는 당업계에 공지된 방법에 의해 생물체의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 얻을 수 있다. 이러한 유전 정보를 얻는 바람직한 방법은 생물체로부터 mRNA를 단리하는 단계, 이를 그의 상보성 DNA (cDNA)로 전환시키는 단계, cDNA를 적합한 클로닝 벡터에 도입하는 단계 및 단백질의 알려진 서열로부터 제조된 적합한 올리고뉴클레오티드 프로브로 혼성화시켜 목적 단백질을 코딩하는 재조합 cDNA를 포함하는 클론을 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 재조합 cDNA 내의 유전 정보는 발현 벡터에 라이게이션시키고 이 벡터를 숙주 세포에 도입하고 유전 정보가 코딩하는 단백질로서 유전 정보를 발현시킬 수 있다.

(A) cDNA 라이브러리의 제조

cDNA 라이브러리의 제조를 위한 mRNA의 바람직한 천연 공급원은 장내 선충을 포함하는 선충, 예를 들면 안실로스토마 카니눔, 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 듀오데날레, 네카토르 아메리카누스 및 헬리그모소모이데스 폴리기루스이다. 특히 바람직한 mRNA의 공급원은 십이지장충 선충인 안실로스토마 카니눔이다.

생물체로부터 다른 mRNA와 함께 본 발명의 단백질을 코딩하는 mRNA의 바람직한 단리 방법은 폴리 U 또는 폴리 T 친화도 겔 상에서의 크로마토그래피를 포함한다. 선충으로부터 mRNA의 특히 바람직한 단리 방법은 QuickPrep mRNA 정제 키트 (Pharmacia사)에서제공되는 방법 및 물질을 포함한다.

이중 가닥 cDNA를 단리된 mRNA로부터 얻는 바람직한 방법은 역전사효소를 사용하여 mRNA 주형 상에 단일 가닥 cDNA를 합성하는 단계, 리보뉴클레아제 (RNase)를 사용하여 cDNA 가닥에 혼성화된 RNA를 분해하는 단계 및 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보성 DNA 가닥을 합성하여 이중가닥 cDNA를 생성시키는 단계를 포함한다. 특히 바람직한 방법은 선충에서 단리된 mRNA 약 3 mg을 조류 골수성 백혈병 바이러스 역전사효소, RNase H, 및 이. 콜라이 (E. coli) DNA 폴리머라제 I 및 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 이중가닥 cDNA로 전환시키는 것을 포함한다.

이어서, 상기와 같이 제조된 라이브러리에서 다른 cDNA와 함께 본 발명의 단백질을 코딩하는 cDNA를 클로닝 벡터에 라이게이션시킨다. 클로닝 벡터는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA를 적합하게 하는 DNA 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리를 포함하는 벡터는 안정한 방식으로 존재할 수 있고 클로닝 벡터가 복제되는 환경을 제공하는 숙주 세포에 도입된다. 적합한 클로닝 벡터에는 플라스미드, 박테리오파지, 바이러스 및 코스미드가 포함된다. 바람직한 클로닝 벡터는 박테리오파지이다. 특히 바람직한 클로닝 벡터는 박테리오파지인 람다 gt11 Sfi-Not 벡터이다.

cDNA 라이브러리 및 조절 서열을 포함하는 적합한 클로닝 벡터의 제조는 당업계에 공지된 표준 라이게이션 및 제한 기술을 사용한다. 단리된 플라스미드, DNA 서열 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 분해하여 적합한 말단 서열을 부착시켜 목적하는 형태로 재라이게이션시킨다.

제한 기술에 있어서, cDNA의 부위 특이 분해는 일반적으로 당업계에 이해되는 조건 및 시판되는 제한 효소의 제조자가 규정한 기타 사항 하에 안정한 제한 효소로 처리하여 수행한다. 예를 들면, 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs), 프로메가 (Promega) 및 스트라타진 클로닝 시스템스 (Stratagene Cloning SyStems)사의 제품 카탈로그 참조.

일반적으로, cDNA 약 1 mg을 완충액 용액 약 20 μl 중의 제한 효소 1단위로 처리하여 분해한다. 전형적으로, 과량의 제한 효소를 사용하여 cDNA의 완전한 분해를 확실하게 한다. 예외가 알려졌지만, 약 37℃에서 약 1 내지 약 2시간 동안 배양한다. 각각의 분해 반응 후에 페놀/클로로포름으로 추출한 후 임의로 겔 여과 컬럼, 예를 들면 세파덱스

G50 상에서의 크로마토그래피에 의해 단백질을 분리한다. 별법으로, cDNA 분해 단편은 폴리아크릴아미드 또는 아가로스 겔에서의 전기 영동에 의해 그의 크기에 의해 분리하여 표준 기술을 사용하여 단리할 수 있다. 크기 분리에 대한 일반적인 기술은 문헌 [Methods of Enzymology, 65:499-560 (1980)] 에서 볼 수 있다.

이어서, 제한 효소에 의해 분해된 cDNA 단편은 클로닝 벡터에 라이게이션된다.

라이게이션 기술에 있어서, 블런트 (blunt) 말단 라이게이션은 일반적으로 약 1 mM ATP 및 약 14℃에서 T4 리가제 약 0.3 내지 0.6 (Weiss) 단위를 포함하는 pH 7.5 완충액 약 15 내지 약 30 μl 중에서 실시된다. 분자간 "스티키 (sticky) 말단" 라이게이션은 일반적으로 약 5 내지 100 나노몰의 총 말단 DNA 농도에서 실시된다. 분자간 블런트 말단 라이게이션 (일반적으로 약 10 내지 30배 몰과량의 링커를 사용함)은 약 1 마이크로몰의 총 말단 DNA 농도에서 실시된다.

(B) NAP를 코딩하는 cDNA의 제조

개시된 바와 같이 제조된 cDNA 라이브러리를 포함하는 클로닝 벡터를 숙주 세포에 도입하고 숙주 세포를 배양하여 플레이팅한 후 혼성화 프로브로 프로빙하여 본 발명의 단백질을 코딩하는 재조합 cDNA를 포함하는 클론을 확인한다. 바람직한 숙주 세포에는 파지 클로닝 벡터를 사용할 경우의 세균이 포함된다. 특히 바람직한 숙주 세포에는 이. 콜라이 균주, 예를 들면 균주 Y1090이 포함된다.

별법으로, 본 발명의 단백질을 코딩하는 재조합 cDNA는 필라멘트상 파지의 외부 표면 상에서 상기 단백질을 발현시킨 후 이를 혈액 응고에 관련된 표적 단백질에 결합시켜 상기 파지를 단리함으로써 얻을 수 있다.

유전 암호의 중요하고 공지된 특징은 그의 리던던시 (redundancy), 즉 한 아미노산을 2개 이상의 트리플렛 뉴클레오티드 서열이 코딩한다는 것이다. 따라서, 다수의 상이한 뉴클레오티드 서열이 본 발명의 NAP를 위한 특정 아미노산 서열을 코딩하는 재조합 cDNA 분자일 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 이들이 모든 생물체에서 동일한 아미노산 서열을 생성시킬 수 있기 때문에 기능적으로 균등한 것으로 생각된다. 때때로, 퓨린 또는 피리미딘의 메틸화 변이체가 제공된 뉴클레오티드 서열에 도입될 수 있다. 그러나, 이러한 메틸화는 어떠한 방식으로도 코딩 관계에 영향을 끼치지 않는다.

(1) 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용

혼성화 프로브 및 프라이머는 목적하는 재조합 cDNA 분자의 전부 또는 일부에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열이다. 이들은 적합한 방법, 예를 들면 각각 문헌 [Narang, S.A. et al., Methods in Enzymology, 68:90 (1979) 및 Brown, E.L. et al., Methods in Enzymology, 68:109 (1979)]에 기재된 포스포트리에스테르 및 포스포디에스테르 방법 또는 이들의 자동화 실시 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 한 실시 방법에서, 디에틸포스포르아미다이트는 출발 물질로서 사용되고 문헌 [Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22:1859-1862 (1981)]에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다. 변형 고형 지지체 상에서의 올리고뉴클레오티드의 한 합성 방법은 미국 특허 제4,458,066호에 기재되어 있다. 프로브는 검출을 촉진하기 위해 효소, 예를 들면 양고추냉이 퍼록시다제 또는 방사성 원자, 예를 들면 ³²P로 표지된다는 점에서 프라이머와 상이하다. 합성 프로브는 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 Ⅰ을 사용한 닉 트랜스레이션 (nick translation) 또는 알칼린 포스파타제 및 T4 박테리오파지 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 방사선 표지된다.

바람직한 혼성화 프로브로는 선충, 예를 들면 십이지장충 안실로스토마 카니눔에서 정제된 NAP의 아미노산 서열의 일부를 코딩하는 단일 가닥 cDNA의 스트레치에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열을 들 수 있다. 예를 들면, 도 2 (AcaNAP5) [서열 번호 4] 또는 도 4 (AcaNAP6) [서열 번호 6]에 나타낸 아미노산 서열의 일부를 사용할 수 있다. 특히 바람직한 혼성화 프로브로는 그의 올리고뉴클레오티드가 아미노산 서열 Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp [서열 번호 93]을 코딩하는 단일 가닥 cDNA의 스트레치에 상보성인 것을 들 수 있다. 이러한 혼성화 프로브에는 올리고뉴클레오티드 서열 AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [서열 번호 94] (여기서, R은 A 또는 G이고, Y는 T 또는 C이고 i는 이오신임)을 갖는 변성 프로브가 포함된다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 바람직한 재조합 cDNA 분자는 이 프로브에 혼성화하는 그의 능력에 의해 확인된다.

또한, 바람직한 혼성화 프로브에는 쌍 NAP-1 [서열 번호 90] 및 NAP-4.RC [서열 번호 91], 및 쌍 YG109 [서열 번호 88] 및 YG103 [서열 번호 89]가 포함되고, 이 둘은 각각 실시예 13 및 12에서 기술된다.

목적 cDNA를 포함하는 클론의 확인 후에 본 발명의 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합 cDNA 분자의 형태로 다량 생성하기 위해 증폭시킨다.

바람직한 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)의 사용을 포함한다 (예를 들면, PCR Technology, W.H. Freeman and Company, New York (Edit. Erlich, H.A. 1992). PCR은 특정 DNA 서열의 합성을 위한 시험관내 증폭 방법이다. PCR에서 대향 가닥에 혼성화하고 클론의 cDNA 내의 관심 영역에 인접한 2개의 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용한다. cDNA의 단일가닥으로의 변성, 단일가닥 cDNA에 프라이머의 어닐링 (annealing) 및 DNA 폴리머라제에 의한 어닐링된 프라이머의 신장을 포함하는 일련의 반복 싸이클을 통하여 그 말단이 프라이머의 5' 말단에 의해 규정되는 cDNA의 카피 수가 매 싸이클마다 약 2배로 된다 (상기 문헌 1 페이지). PCR 증폭을 통하여 단리되는 재조합 cDNA 분자의 코딩 도메인 및 임의의 추가의 프라이머에 의해 코딩되는 정보, 예를 들면 제한 부위 또는 번역 신호 (신호 서열, 개시 코돈 및(또는) 정지 코돈)를 얻게 된다.

바람직한 cDNA 증폭 조건은 Taq 폴리머라제의 사용 및 95℃에서 1분, 50℃ 에서 1분, 72℃에서 1.5분의 온도 싸이클 30회를 포함하는 것을 들 수 있다. 바람직한 프라이머로는 프로메가사 (Promega Corp)의 올리고(dT)-NotⅠ 프라이머 AATTCGCGGC CGC(T)₁₅ [서열 번호 95]와 (i) 올리고뉴클레오티드 서열 AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [서열 번호 94] (여기서, R 은 A 또는 G이고, Y는 T 또는 C이고 i는 이오신임)을 갖는 변성 프라이머 또는 (ii) 뉴 잉글랜드 바이오랩스사의 람다 gt11 프라이머 ＃1218, GGTGGCGACGACTCCTGGAG CCCG [서열 번호 96] 중의 하나와 조합한 것을 들 수 있다.

개시된 바와 같이 제조된 재조합 cDNA 분자의 핵산 서열은 문헌 [Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463 (1977) 및 Messing, et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)]의 디데옥시 방법을 기초로 한 방법에 의해 결정할 수 있다.

개시된 바와 같이 제조된 바람직한 재조합 cDNA 분자는 도 1, 3, 7, 9, 13 및 14의 핵산 서열을 갖는 것을 포함한다.

(2) 프로브로서 NAP cDNA의 사용

또한, 혼성화 프로브로서 특히 바람직한 것은 선충인 십이지장충 안실로스토마 카니눔으로부터 정제된 NAP의 아미노산 서열을 실질적으로 모두 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열이다. 특히 바람직한 프로브에는 하기 핵산 서열 (AcaNAP5 유전자)

[서열 번호 1] 또는 도 3 (AcaNAP6 유전자)의 서열

[서열 번호 2]을 갖고 AcaNAP5 및 AcaNAP6 유전자로부터 유래한 것이 포함된다.

또한, 바람직한 혼성화 프로브로는 NAP의 아미노산 서열의 실질적인 부분을 코딩하는 서열, 예를 들면 실시예 13에서 기술되는 바와 같은 프라이머 쌍 NAP-1 [서열 번호 90] 및 NAP-4.RC [서열 번호 91]에 의해 생성된 PCR 단편을 들 수 있다.

(3) 파지 디스플레이의 사용

필라멘트상 파지 디스플레이 기술을 사용하여 전체 cDNA 라이브러리로부터 본 발명의 단백질을 코딩하는 cDNA를 선별하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 필라멘트상 파지를 사용하는 현재의 디스플레이 기술은 목적 코딩 영역을 각각 파지의 부착 단백질 및 주요 코트 단백질을 코딩하는 유전자 3 또는 유전자 8에 인-프레임 (in-frame)으로 삽입하는 것에 의존한다. 당업계의 숙련가는 서열을 모르는 매우 다량의 cDNA의 혼합물을 사용하여 상기 방법을 수행할 때 다양한 난점이 발생하고 cDNA 생성물의 기능성 디스플레이를 얻는 가장 실제적인 방법은 cDNA를 그의 5' 말단을 통하여 융합시키는 것으로 구성된다는 것을 인식할 것이다. 충분한 크기의 cDNA 라이브러리는, 동일한 mRNA에서 유래하지만 상이한 지점에서 5' 말단이 절두되어 (truncated) 그 일부가 융합 생성물로서 발현될 수 있는 복수개의 cDNA를 포함한다. 이에 따라 류신 지퍼스 준 앤드 포스 (leucine zippers Jun and Fos)의 이종이량체를 형성하는 능력에 의존하는 전략이 최근에 문헌 [Crameri, R. and Suter, M., Gene, 137:69-75 (1993)]에 개시되었다.

본 발명자들은 cDNA 유전자 생성물을 파지 표면에 공유결합시키는 신규의 직접적인 방법을 발견하였다. 이 발견은 파지 코드 단백질 6의 C-말단에 융합된 단백질이 기능을 보일 수 있다는 관찰에 기초한 것이다. 이러한 관찰을 통하여 기능을 보이는 cDNA 생성물을 발현시키고 기능을 보이는 cDNA 생성물의 생성에 필요한 cDNA를 포함하는 파지 입자의 친화도-선별을 허용하는, 본 명세서에서 개시된 파지미드계를 개발하였다. 이러한 계는 본 발명의 단백질을 코딩하는 cDNA의 단리를 위한 기초를 제공한다. 단리된 후에 이러한 cDNA를 포함하는 재조합 cDNA 분자는 다른 발현계에서 본 발명의 단백질의 발현을 위해 사용할 수 있다. 이러한 방식으로 제조된 재조합 cDNA 분자는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 생각된다.

본 발명의 재조합 cDNA 분자는 천연 공급원 (예를 들면, 십이지장충과 같은 선충)으로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고 이 cDNA 라이브러리를 적합한 파지미드 벡터에 라이게이션시키고 cDNA를 포함하는 이 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키고 숙주 세포를 배양하고 적합한 헬퍼 파지를 사용하여 형질전환된 세포를 감여시키고 숙주 세포 배양물로부터 파지를 분리하고 그 표면에 본 발명의 단백질을 발현하는 파지를 분리 및 단리하고 이 파지로부터 재조합 cDNA 분자를 단리함으로써 단리할 수 있다.

파지미드 벡터는 문헌 [Vierira, J. and Messing, J., Methods in Enzymology, 153:3-11 (1987)]에 기재된 pUC119 발현 벡터를 사용하여 제조된다. 파지의 표면 단백질을 코딩하는 필라멘트상 파지 유전자 6은 3개의 전향(forward) 프라이머 및 1개의 후향 (backward) 프라이머 사용 PCR을 사용하여 각각 HindⅢ 및 SfiⅠ 제한 부위를 첨가함으로써 그의 5' 및 3' 말단 상에서 변형된다. 그 결과, 그의 3' 말단에 PCR에 의한 NotⅠ 및 BamHI 제한 부위가 첨가되어 추가로 변형된 3개의 DNA 단편이 생성된다. 3개의 DNA 단편을 HindⅢ 및 BamHI으로 별개로 분해한 후 3개의 DNA 단편을 pUC119에 라이게이션시켜 pDONG61, pDONG62 및 pDONG63 발현 벡터를 생성시킨다. 이들 벡터는 그 내부에 SfiⅠ-NotⅠ 단편으로서의 cDNA의 삽입을 가능하게 한다.

cDNA 라이브러리는 실시예 2, 9 및 13에서 기술되는 바와 같이 천연 공급원, 예를 들면 선충으로부터 제조된다. 상기 cDNA 라이브러리를 제조하는 바람직한 선충으로는 장내 선충, 예를 들면 안실로스토마 카니눔, 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 듀오데날레, 네카토르 아메리카누스 및 헬리그모소모이데스 폴리시루스를 들 수 있다.

SfiⅠ-NotⅠ 단편으로서의 cDNA 라이브러리는 파지미드 벡터 pDONG61, pDONG62 및 pDONG63에 직접 지향적으로 라이게이션된다. 별법으로, 실시예 2에 기술되는 바와 같이 람다 gt11 파지 벡터에 라이게이션되는 cDNA 라이브러리는 PCR에 의해 수거하여 전기영동으로 단리한 후 상기 벡터에 직접 라이게이션된다. 이 후자의 방법에서, PCR에 바람직한 조건은 Taq 폴리머라제; 프라이머로서 서열 GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [서열 번호 96] (미국 매사츄세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스사)을 갖는 람다 gt11 프라이머 ＃1218 및 AATTCGCGGC CGC(T)₁₅ [서열 번호 95] (프로메가사)을 갖는 올리고(dT)-NotⅠ 프라이머; 및 95℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 3분의 온도 싸이클 20회 후 65℃에서 10분을 사용한다.

숙주 세포는 cDNA 라이브러리를 포함하는 pDONG 발현 벡터로 형질전환된다. 바람직한 숙주 세포로는 이. 콜라이 균주, 특히 바람직하게는 균주 TG1을 들 수 있다. 이. 콜라이 숙주 세포를 형질전환시키는 바람직한 방법은 일렉트로포레이션 (electroporation)이다.

형질전환된 세포는 600 nm에서의 흡광도가 0.5에 도달할 때까지 1% 글루코스 및 카르베니실린 100 ㎍/ml로 보충된 LB 배지 중에서 37℃에서 배양한 후 감염 다중도 (moi) 20으로 감염시킨다.

파지는 원심분리하여 배양물로부터 분리한 후 폴리에틸렌 글리콜/염화나트륨으로 침전시켜 정제한다.

그의 표면에서 본 발명의 NAP를 과량 발현시키는 파지는 NAP가 혈액 응고에 관련되는 단백질, 예를 들면 Xa에 결합하는 능력을 이용하여 단리한다.

이러한 파지를 단리하는 바람직한 방법은

(1) 비오틴으로 표지된 인자 Xa의 용액을 상기 파지 용액과 혼합하는 단계;

(2) 상기 혼합물을 배양하는 단계;

(3) 스트렙타비딘으로 표지된 고형상을 상기 혼합물과 접촉시키는 단계;

(4) 혼합물을 가진 고형상을 배양하는 단계;

(5) 혼합물로부터 고형상을 제거하여 고형상을 완충액과 접촉시켜 결합하지 않은 파지를 제거하는 단계;

(6) 고형상을 제2 완충액과 접촉시켜 결합된 파지를 고형상으로부터 제거하는 단계;

(7) 상기 파지를 단리하는 단계;

(8) 상기 파지를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;

(9) 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계

(10) 형질전환된 숙주 세포를 VCSM13 헬퍼 파지로 감염시키는 단계;

(11) 숙주 세포 배양물로부터 파지를 단리하는 단계; 및

(12) 단계 (1) 내지 (11)을 4회 이상 반복하는 단계로 이루어진다.

상기 파지를 단리하는 특히 바람직한 방법은 실시예 10에서 상술되는 방법을 포함한다.

단일가닥 DNA는 단리된 파지 및 그의 서열분석되는 필라멘트상 파지 유전자 6의 3'에 삽입된 삽입체로부터 제조된다.

도 9는 파지 디스플레이 방법에 의해 단리된 재조합 cDNA 분자 AcaNAPc2를 도시한 것이다. AcaNAPc2에 의해 코딩되는 본 발명의 단백질의 추정 아미노산 서열도 상기 도면에 나타내었다.

(C) 재조합 NAP의 제조

개시된 바와 같이 단리한 본 발명의 재조합 cDNA 분자를 사용하여 본 발명의 NAP의 발현체를 얻었다. 일반적으로, 본 발명의 재조합 cDNA 분자는 발현 벡터에 도입되고 이 발현 벡터를 적합한 숙주 세포에 도입한 후 숙주 세포를 배양하여 발현된 단백질을 단리한다.

발현 벡터는 클로닝된 유전자 카피의 적합한 숙주 내에서의 전사 및 그의 mRNA의 번역을 위해 필요한 DNA 서열이다. 이들 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 유전자를 다양한 세포, 예를 들면 세균, 효모, 포유동물, 식물 및 곤충 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 또한, 단백질은 다수의 바이러스계 중에서 발현될 수도 있다.

적합하게 제조된 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 자동 복제를 위한 복제 기점을 포함하거나 또는 숙주 세포 염색체에 도입될 수 있다. 이러한 벡터는 또한 선별 마커, 제한된 수의 유용한 제한 효소 부위, 높은 카피수 및 강력한 프로모터를 포함할 것이다. 프로모터는 RNA 폴리머라제가 DNA에 결합하여 RNA 합성을 개시하도록 지시하는 DNA 서열이고, 강력한 프로모터는 이러한 개시를 높은 빈도로 발생시킨다. 본 발명의 바람직한 발현 벡터는 본 발명의 재조합 cDNA 분자에 조작 연결된다. 즉, 벡터는 부착된 재조합 cDNA 분자의 복제 및 재조합 cDNA 분자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 모두 지시할 수 있다. 발현 벡터에는 클로닝 벡터, 변형 클로닝 벡터 및 특정하게 고안된 플라스미드 또는 바이러스가 포함되고 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 세균, 효모, 포유동물, 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 각각의 세포 종류 및 그 내부 종에 따라 하기되는 바와 같이 특정 발현 벡터가 적합하다.

원핵생물은 본 발명의 단백질의 발현에 사용될 수 있다. 적합한 세균 숙주 세포에는 이. 콜라이, 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 및 다양한 종의 슈도모나스 (Pseudomonas)의 다양한 균주가 포함된다. 이들 계에서 숙주와 혼화성인 종에서 유래한 복제 부위 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 사용된다. 이. 콜라이에 적합한 벡터는 이. 롤라이 종에서 유래한 플라스미드인 pBR322의 유도체이다 [Bolivar et al., Gene, 2:95 (1997)]. 본 명세서에서 리보좀 결합 부위 서열과 함께 임의로 오퍼레이터를 갖는 전사 개시용 프로모터를 포함하는 것으로 규정되는 일반적인 원핵생물 조절 서열에는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터계 (Chang et al., Nature, 198:1056 (1977)), 트립토판 프로모터계 (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)) 및 람다 유래 P_L 프로모터 및 N-유전자 리보좀 결합 부위 (Shimatake et al., Nature, 292:128 (1981))이 포함된다. 그러나, 원핵생물과 혼화성인 모든 가용한 프로모터계를 사용할 수 있다. 바람직한 원핵생물 발현계에는 이. 콜라이 및 그의 발현 벡터가 포함된다.

진핵생물은 본 발명의 단백질의 발현에 사용할 수 있다. 대표적인 진핵생물은 일반적으로 효모 및 포유동물 세포이다. 적합한 효모 숙주 세포에는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)를 포함한다. 적합한 포유동물 숙주 세포에는 COS 및 CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포가 포함된다.

진핵생물용 발현 벡터는 적합한 진핵세포 유전자로부터 유래한 프로모터로 구성된다. 효모 세포 발현 벡터에 적합한 프로모터로는 사카로마이세스 세레비지애의 3-포스포글리세레이트 키나제 유전자용 프로모터 (Hitzman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980) 및 피치아 파스토리스의 알콜 옥시다제와 같은 메탄올 대사용 프로모터 (Stroman et al., 미국 특허 제4,808,537호 및 동 제4,855,231호)를 포함하여 당분해 효소의 합성용 프로모터를 들 수 있다. 다른 적합한 프로모터에는 YEp13에서 얻은 에놀라제 유전자 (Holland, M.J. et al., J. Biol. Chem., 256:1385 (1981)) 또는 Leu2 유전자 (Broach, J. et al., Gene, 8:121 (1978))에서 유래한 프로모터가 포함된다.

바람직한 효모 발현계는 피치아 파스토리스 및 그의 발현 벡터를 포함한다. 피치아 파스토리스에서 발현되는 NAP 코딩 cDNA는 임의로 C 말단에 프롤린 잔기를 포함한 NAP 단백질을 코딩하도록 변이될 수 있다. 어떤 경우에 NAP 단백질은 보다 높은 수준으로 발현되고 원치않는 단백질 분해에 보다 내성을 가질 수 있다. 이러한 cDNA 및 그의 피치아 파스토리스에서의 발현은 실시예 17에서 기술된다.

포유동물 세포 발현 벡터에 적합한 프로모터는 SV40에서 유래한 초기 및 후기 프로모터 또는 예를 들면 폴리오마, 아데노바이러스 II, 소 유두종 바이러스 또는 조류 육종 바이러스와 같은 다른 바이러스계 프로모터를 포함한다. 적합한 바이러스 및 포유동물계 인핸서도 상기 발현 벡터에 도입될 수 있다.

식물 세포 발현 벡터에 적합한 프로모터로는 문헌 [Depicker, A. et al., Mol. Appl. Gen., 1:561 (1978)]에 기재된 노팔린 합성 프로모터를 들 수 있다.

곤충 세포 발현 벡터에 적합한 프로모터로는 스미스 (Smith) 등의 미국 특허 제4,745,051호에 기재된 계의 변형판을 들 수 있다. 이 발현 벡터는 단백질을 코딩하는 cDNA 분자가 위치할 수 있는, 바큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터로 이루어진다.

숙주 세포는 그 내부에 본 발명의 발현 벡터를 도입함으로써 형질전환된다. 형질전환은 각각의 종류의 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 실시된다. 문헌 [Cohen, S.N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972)]에 기재된 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리 또는 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p. 254, Cold Spring Harbor Press (1982)]에 기재된 RbC1 방법은 실질적인 세포벽 장애를 포함하는 원핵생물 또는 다른 세포에 사용된다. 효모의 형질전환은 문헌 [Van Solingen, P. et al., J. Bacter., 130:946 (1997) 및 Hsiao, C.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)]에 기재된 바와 같이 실시된다. 많은 세포벽이 없는 포유동물 세포는 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:546 (1978)]의 인산칼슘법을 사용하여 형질전환시킨다. 식물 세포는 문헌 [Shaw, C. et al., Gene, 23:315 (1983)]에 기재된 바와 같이 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염에 의해 형질전환된다. 발현 벡터를 사용한 이. 콜라이 및 피치아 파스토리스의 바람직한 형질전환 방법으로는 일렉트로포레이션을 들 수 있다.

형질전환된 세포는 생물학 분야에 공지된 배지의 종류, 온도, 산소 함량, 유체 유동성 등의 조건 하에 배양된다.

본 발명의 재조합 단백질은 크로마토그래피 방법의 사용을 포함하여 생화학 분야에 공지된 표준 방법에 의해 숙주 세포 또는 배지로부터 단리된다. 바람직한 정제 방법은 포로스20 HQ 음이온 교환 매트릭스 또는 포로스20 HS 양이온 교환 매트릭스, 수퍼덱스30 겔 여과 매트릭스 및 C18 역상 매트릭스를 포함하는 컬럼을 통한 순차 크로마토그래피를 포함한다. 이러한 크로마토그래피 컬럼 후에 수거된 분획은 PT 또는 aPTT 분석에 의해 측정된 인간 혈장의 응고 시간을 증가시키는 그의 능력 또는 비색계 분석에 의해 측정된 인자 Xa 아미드 분해 활성 또는 본 명세서에 개시된 임의의 다른 분석법에서의 활성의 입증에 의해 선별될 수 있다. 본 발명의 재조합 단백질의 바람직한 정제 방법의 예는 실시예 3, 4, 6, 8, 14 및 15에 개시되어 있다.

4. NAP의 사용 방법

한 특징에서, 본 발명은 혈액 수거 튜브에 포유동물 혈액이 도입될 때 혈병의 형성을 억제하기에 충분한 양의 본 발명의 단백질을 첨가한 후 포유동물 혈액을 상기 튜브에 첨가하고 적혈구 세포를 포유동물 혈장으로부터 분리하고 포유동물 혈장을 수거하는 것으로 이루어지는, 포유동물 혈장의 응고가 억제되는 포유동물 혈장의 수거 방법을 포함한다.

혈액 수거 튜브는 정맥천자에 의해 얻은 혈액을 튜브에 넣는 수단으로서 그 내부가 진공인 마개가 달린 시험관을 포함한다. 바람직한 시험관으로는 보로실리케이트 유리로 제조되고 예를 들면 10.25 x 47 mm, 10.25 x 50 mm, 10.25 x 64 mm, 10.25 x 82 mm, 13 x 75 mm, 13 x 100 mm, 16 x 75 mm, 16 x 100 mm 또는 16 x 125 mm의 차원을 갖는 것을 들 수 있다. 바람직한 스토퍼로는 혈액 수거 바늘에 의해 용이하게 천자될 수 있고 시험관 상에 위치시킬 때 튜브에 공기의 침입을 억제하기에 충분한 밀봉상태를 제공하는 것을 들 수 있다.

본 발명의 단백질은 당업계에 공지된 다양한 형태, 예를 들면 그의 액체 조성물, 그의 고형 조성물 또는 튜브 내에 동결건조된 액체 조성물로서 혈액 수거 튜브에 첨가된다. 상기 튜브에 첨가되는 양은 포유동물 혈액이 튜브 내에 첨가될 때 혈병의 형성을 억제하기에 충분한 양이다. 본 발명의 단백질은 포유동물 혈액 2 내지 10 ml과 혼합될 때 상기 단백질의 농도가 혈병 형성의 억제에 충분하도록 혈액 수거 튜브에 첨가된다. 일반적으로, 효과적인 농도는 약 1 내지 10,000 nM, 바람직하게는 10 내지 1000 nM이다. 별법으로, cDNA은 다른 응혈 억제 첨가제, 예를 들면 헤파린염, EDTA염, 시트레이트 또는 옥살레이트염과 혼합되어 상기 튜브에 첨가될 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 다른 응혈 억제 첨가제와 혼합된 본 발명의 단백질을 포함하는 혈액 수거 튜브에 포유동물 혈액을 첨가할 때 적혈구 세포는 원심분리에 의해 포유동물 혈장으로부터 분리된다. 원심분리는 의학 분야에 공지된 g력, 온도 및 시간에서 실시된다. 적혈구 세포로부터 혈장을 분리하는 일반적인 조건으로는 약 100 x g 내지 1500 x g의 원심분리력, 약 5 내지 약 25℃의 온도에서 약 10 내지 약 60분 동안 실시하는 원심분리를 들 수 있다.

포유동물 혈장은 그 혈장을 피펫 또는 의학 분야의 숙련가에게 공지된 다른 방법에 의해 별도의 용기에 부어서 수거할 수 있다.

또다른 특징에서, 본 발명은 포유동물에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 단백질 또는 제약 조성물을 투여하는 것으로 이루어지는, 포유동물의 혈전증 (혈병 형성) 또는 혈액 응고의 예방 또는 억제 방법을 포함한다.

본 발명의 단백질 또는 제약 조성물은 체내에 포유동물, 바람직하게는 인간에 통상적으로 투여된다. 이들을 체내에 사용할 때, 단백질 또는 제약 조성물은 다양한 투여 형태로 다양한 방법, 예를 들면 경구, 비경구, 정맥내, 피하, 근내, 결장내, 직장내, 비내 또는 복강내 투여될 수 있다. 투여는 1일 투여를 기초로 하여 바람직하게는 비경구, 예를 들면 정맥내 투여된다. 별법으로, 투여는 1일 투여를 기초로 하여 바람직하게는 경구 투여, 예를 들면 정제, 캡슐제 또는 엑릭시르제로 투여된다.

본 발명의 방법을 실시함에 있어서, 본 발명의 단백질 또는 제약 조성물은 단독으로 또는 서로 함께 또는 다른 치료제 또는 체내 진단제와 투여된다.

의학분야의 숙련가에게 분명한 바와 같이 본 발명의 단백질 또는 제약 조성물의 치료 유효량은 치료 대상의 나이, 중량 및 포유동물의 종, 사용되는 특정 단백질, 특정 투여 방식 및 목적 효과 및 치료 처방에 따라 상이할 것이다. 이들 인자와 상기 투여량 결정과의 관계는 의학 분야에 공지되었기 때문에 치료 유효 투여 수준의 결정, 혈전증 예방의 목적 결과를 달성하는데 필요한 양은 의학 분야의 숙련가의 지식 범위 내에 있다.

일반적으로, 본 발명의 단백질 또는 제약 조성물은 저투여 수준으로 투여하기 시작하여 치료 유효량을 규정하는 체내 혈전증 예방이라는 목적 효과가 얻어질 때까지 증가시킨다. 본 발명의 단백질의 경우에 조성물 단독 또는 일부로서 상기 투여량은 약 0.01 내지 100 mg/kg (체중), 바람직하게는 약 0.01 내지 10 mg/kg (체중)이다.

5. 유용성

개시된 바와 같이 제조되고 선별된 본 발명의 단백질은 시험관내 또는 체내에서 혈액 응고의 효능있는 억제제이다. 이와 같이, 이들 단백질은 혈액 응고의 예방을 위한 시험관내 진단 시약으로서 유용하고 포유동물의 혈전증 또는 혈액 응고의 예방 또는 억제를 위한 체내 제약 제제로서도 유용하다.

본 발명의 단백질은 혈액 도입 튜브에서 응고를 억제하기 위한 시험관내 진단 시약으로서 유용하다. 정맥천자에 의해 얻어지는 혈액을 튜브에 도입하는 수단으로서 그 내부가 진공인 마개달린 시험관의 용도는 의학 분야에 공지되어 있다 [kasten, B.L., "Specimen Collection", Laboratory Test Handbook, 2nd Edition, Lexi-Comp Inc., Cleveland pp. 16-17 (Edits. Jacobs, D.S. et al. 1990)]. 이러한 진공 튜브는 응고 억제 첨가제가 존재하지 않을 수 있고, 이 경우에 이 튜브는 혈액으로부터 포유동물 혈청의 단리에 유용하다. 이 튜브는 응고 억제 첨가제 (예를 들면, 헤파린염, EDTA염, 시트레이트염 또는 옥살레이트염)을 포함할 수 있고, 이 경우 이 튜브는 혈액으로부터 포유동물 혈장의 단리에 유용하다. 본 발명의 단백질은 혈액 응고의 효능있는 억제제이고, 이와 같이 그 단백질에 도입된 포유동물 혈액의 응고를 억제하기 위해 혈액 수거 튜브에 도입될 수 있다.

본 발명의 단백질은 단독으로, 본 발명의 다른 단백질과 함께, 또는 공지된 혈액 응고 억제제, 예를 들면 헤파린염, EDTA염, 시트레이트염 또는 옥살레이트염과 함께 혈액 수거 튜브에 사용된다.

상기 튜브에 첨가되는 양 또는 효과적인 양은 포유동물 혈액이 튜브에 도입될 때 혈액 혈병의 형성을 억제하는데 충분한 양이다. 본 발명의 단백질은 포유동물 혈액 2 내지 10 ml과 혼합될 때 상기 단백질의 농도가 혈액 응고의 형성을 억제하는데 충분한 양으로 혈액 수거 튜브에 첨가된다. 일반적으로, 상기 유효량은 혈액 중의 최종 농도가 약 1 내지 10,000 nM, 바람직하게는 10 내지 1000 nM이 되도록하기에 필요한 양이다.

또한, 본 발명의 단백질은 진단용 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 한 실시 태양에서, 진단용 조성물은 본 발명의 단백질을 인산염 완충 염수 (0.01 M 인산나트륨 + 0.15 M 염화나트륨, pH 7.2 또는 트리스 완충 염수 (0.05 M 트리스-HCl + 0.15 M 염화나트륨, pH 8.0)을 포함하는 진단학상 허용되는 담체에 용해시켜 제조된다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 단백질은 당업계에 공지된 방법으로 다른 진단학상 허용되는 고형 담체와 블렌딩될 수 있다. 이들 담체로는 완충액 염을 들 수 있다.

본 발명의 단백질은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 본 발명의 액상 진단용 조성물, 고형 진단용 조성물 또는 혈액 수거 튜브 내에 동결건조된 액상 진단용 조성물을 첨가하는 방법에 의해 혈액 수거 튜브에 첨가할 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물을 포함하는 혈액 수거 튜브의 사용은 상기 진단용 조성물의 유효량을 튜브에 도입된 포유동물 혈액과 접촉시키는 것으로 이루어진다. 일반적으로, 포유동물 혈액 시료 2 내지 10 ml을 혈액 수거 튜브에 도입하고 튜브 내부의 상기 진단용 조성물과 접촉시킬 때, 사용되는 유효량은 혈액 시료에서 혈병의 형성을 억제하기에 충분한, 진단용 조성물로서 제형되는 단백질의 농도를 포함할 것이다. 바람직한 유효 농도는 약 1 내지 10,000 nM, 특히 바람직하게는 10 내지 1000 nM이다.

본 발명의 다른 특징에 따르면, 본 발명의 단백질은 또한 포유동물의 혈전증 혈액 응고의 예방 또는 억제용 제약 제제로서도 유용하다. 이러한 혈전증 또는 혈액 응고의 예방 또는 억제는 비정상적인 혈전증의 예방 또는 억제를 포함한다.

비정상적 혈전증의 특징적인 질환은 의학 분야에 공지되어 있고 포유동물의 동맥 및 정맥 혈관계에 관계되는 것을 포함한다. 관상동맥 혈관계에 있어서, 비정상적인 혈전증 (혈전 형성)은 급성 심근경색 및 불안정한 협심증의 주요 원인인 확립된 아테롬성 동맥경화증 플라크의 파열이라는 특징을 갖고 혈전 분해 요법 또는 경피 경관 관상동맥 형성술 (PTCA)에 기인하는 폐색성 관상동맥 혈전 형성이라는 특징을 갖는다. 정맥 혈관계에 있어서, 비정상적인 혈전증은 이환된 사지에 혈류를 저하시키고 폐 색전증을 야기하는 정맥 혈관계에서의 혈전 형성으로 고통받는, 하부 사지 또는 복부 부분에 큰 수술을 받은 환자에서 발견되는 질병이라는 특징을 갖는다. 또한, 비정상적 혈전증은 패혈 쇼크, 특정 바이러스 감염 및 암, 응고 인자가 급속하게 소비되는 질환 및 미세혈관계 전반에 발생하는 생명을 위협하는 혈전의 형성을 야기하여 기관 부전을 확산시키는 전신계 응고 동안에 혈관계 내에서 주로 발생하는 산발적인 혈관내 응혈 이상이라는 특징을 갖는다.

본 발명의 NAP 단백질은 또한 그에 대해 항체가 발생하는 유용한 면역원이다. NAP를 지향하는 단클론 및 다클론 항체는 모두 진단 목적 및 다양한 생물학적 유체 내의 NAP 농도의 확인에 유용하다. 이들 항체를 사용하는 면역 분석은 예를 들면 포유동물 숙주의 기생충의 감염 또는 포유동물 숙주의 조직에서 기생충으로부터 NAP를 검출하기 위한 진단 시험으로서 유용하다. 또한, 상기 면역 분석은 조직 균등액, 클로닝된 세포 등으로부터 NAP의 검출 및 단리에 사용될 수 있다.

NAP는 포유동물에서 기생충 감염에 대한 백신으로서 적합한 보조제와 함께 사용될 수 있다. NAP 백신을 사용한 면역화는 기생충 감염의 예방 및 치료 모두에 사용할 수 있다. 기생충에 의해 발생하는 질병은 상기 기생충에 감염된 동물에게 항NAP 항체를 투여함으로써 치료될 수 있다.

또한, 세린 프로테아제 억제 활성을 갖는 본 발명의 NAP 단백질은 세린 프로테아제의 억제가 요구되는 질병 또는 분석에 유용하다. 예를 들면, 세린 프로테아제 트립신 또는 엘라스타제를 억제하는 NAP 단백질은 백혈구에 의해 매개되는 급성 췌장염 또는 급성 염증성 반응의 치료에 각각 유용하다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 재조합 cDNA 분자는 한 특징에서 본 발명의 단백질을 또한 코딩하는 다른 재조합 cDNA 분자를 단리함에 있어 유용하다. 또다른 특징에서, 상기 분자는 숙주 세포에서 본 발명의 단백질의 발현에 유용하다.

본 발명의 뉴클레오티드 프로브는 선충 또는 다른 생물체에서 NAP를 코딩하는 핵산을 동정하고 단리함에 유용하다. 또한, 본 발명의 뉴클레오티드 프로브는 시료, 예를 들면 선충에 감염된 것으로 의심되는 포유동물의 체액 또는 조직에서 선충-코딩 핵산의 존재를 검출하기 위한 유용한 진단시약이다. 상기 프로브는 선충 핵산의 존재를 검출하기 위하여 검출에 적합하게 표지되어 직접 사용될 수 있거나, 또는 검출하기 위한 시료에 존재할 수 있는 선충 핵산을 증폭하기 위해 예를 들면 PCR 형태의 반응에서 보다 간접적인 방식으로 사용될 수도 있다. 이러한 방법 및 진단 분석의조건은 당업계에서 용이하게 입수할 수 있다.

이해를 돕기 위해서 본 발명은 추가로 하기 실시예에 의해 예시된다. 본 발명에 관련되는 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 제한하고자 하는 것으로 간주해서는 안되고 당업계의 숙련가의 영역 내에서 이제 알려지거나 후에 개발되는 본 발명의 변형은 본 명세서에서 기술되고 특허 청구되는 바와 같이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주되어야 한다.

실시예 1

안실로스토마 카니눔으로 부터의 신규 항응고 단백질(NAP)의 분리

(A) 안실로스토마 카니눔 용해물의 제조

냉동핀 개의 십이지장충인 안실로스토마 카니눔을 항체 시스템(Bedford, TX) 으로 부터 얻었다. 십이지장충을 균질화물에 사용될때까지 -80 ℃에서 저장하였다.

십이지장충을 액체 질소중에서 냉동시키고, 모르타르중에서 분쇄한 다음 테플론 피스톤을 갖는 균질화기(B. Braun Melsungen AG, Germany)를 사용하여 균질화 완충액 중에서 얼음상에서 균질화시켰다. 균질화 완충액은 다음을 함유하였다: 0.02 M 트리스-HCl, pH 7.4, 0.05 M NaCl., 0.001 M MgCl₂, 0.001 M CaCl2, 1.0 X 10^-5 M E- 64 프로테아제 억제제(Boehringer Mannheim, Germany), 1.0 x 10^-5 M 펩스타틴 A(이소발레릴-Val-Val-4-아미노-3-히드록시-6-메틸-헵타노일-Ala-4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵타노산, ICN Biomedicals, CA), 1.0 X 10^-5 M 키모스타틴(Boehringer), 1.0 X 10^-5 M 루펩틴(ICN), 5 x 10^-5 M AEBSF (4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐 플루오라이드, ICN), 및 5 % (v/v) 글리세롤. 냉동 기생충(약 500마리) 각 g을 균질화시키는데 약 4 ml의 균질화 완충액을 사용하였다. 불용성 성분을 2개의 일련의 원심분리 단계로 펠릿화하였다: 19,000 x g_max 4 ℃, 30분 이어서 110,000 x g_max, 4 ℃ 40분, 상등액을 0.45 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터(Corning, NY)내로 통과시켜 청징화하여 안실로스토마 카니눔 용해물을 얻었다.

(B) 콘카나발린 A 세파로오스 크로마토그래피

안실로스토마 카니눔 용해물(100 ml)을 1.6 x 11 cm 겔 칼럼에 유속 3 ml/분 (90 cm/시)으로 부하하여 콘카나발린 A 완충액 (0.02 M 트리스-HCl, pH 7.4, 1M NaCl, 0.02MCaCl2)로 미리 평형시킨 22 ml의 콘카나발린 A 세파로오스(Pharmacia, Sweden)상에 흡착시켰다. 용해물 저장기를 전 과정을 통해 빙욕 온도로 유지하면서 칼럼을 주위 온도로 유지시켰다. 칼럼을 칼럼 2배 부피의 콘카나발린 A 완충액으로 세척하였다. 칼럼 유출액과 세척액을 모아서(대략 150 ml) 그다음 처리시까지 -80 ℃에서 보관하였다.

(C) 음이온 교환 크로마토그래피

콘카나발린 A 세파로오스 칼럼의 유출액 및 세척액에 고상 아세트산 나트륨을 최종 농도 12.5 mM 까지 가하여 완충시켰다. 밀리Q 수로 희석하여 전도도를 감소시키고, HCl을 사용하여 pH 5.3으로 조정하였다. pH 조정중에 생긴 침전을 15,000 x g_max, 4 ℃에서 15분간 원심 분리하여 펠릿화하였다. 상등액을 0.2 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터(Corning, NY)를 통과시켜 청징화하였다

청징화된 용액(총 부피 약 500 ml)을 유속 10 ml/분(80 cm/시)에서 음이온 완충액(0.05 M Na 아세테이트, pH 5.3, 0.1M NaCl)으로 미리 평형시킨 Poros 20 HQ(Perseptive Biosystems, MA)에 걸었다. 칼럼과 가해진 용액을 정제 전 과정을 통하여 주위 온도로 하였다. 칼럼을 칼럼 10배 부피의 음이온 완충액으로 세척하였다.

하기 과정에 따라 인자 Xa 아미노분해 검정에서 검출되는 억제 활성을 갖는 물질을 유속 5 ml/분(400 cm/시)에서 0.55 M NaCl을 함유하는 양이온 완충액으로 용출시켰다. 용액 샘플을 인자 Xa 아미도 분해 검정법으로 다음과 같이 시험하였다. 반응 혼합물(150 ㎕)을 검정 완충액(100 mM, 트리스-HCl, pH9.4, 140 mM NaCl, 0.1 % BSA) 중 인자 Xa과 각종 희석도의 샘플을 함유하는 96-웰 플레이트 중에 제조하였다. 사람 인자 X를 구입하고[Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN, USA] 및 문헌[Bock, P. E., Craig, P. A., Olson, S. T., and Singh P., Arch. Biochem. Biophys., 273: 375-388(1989)]의 방법을 이용하여 러셀(Russell)의 살무사 독으로 활성화시켰다. 주위 온도에서 30분간 인큐베이팅시킨 후, 물 중 1 mM 기질 용액(N-α-벤질옥시카르보닐-D-아르기닐-L-글리실-L-아르기닌 p-니트로아닐리드-디히드로-클로라이드; S-2765; Chromogenir, Molndal, Sweden) 50 ㎕를 가하여 효소 반응을 개시시켜 최종 농도 0.2 nM 인자 Xa 및 0.25 mM S-2765를 생성시켰다. V_max 키네틱 플레이트 판독기(Molecular Devices, Menlo Park, EA, USA)를 사용하여 405 nm에서의 흡광도를 연속 측정하여 기질 가수 분해를 모니터링하였다.

(D) 열 처리

음이온 교환 크로마토그래피로 부터의 0.55 M NaCl 용출 풀(3 ml)의 반을 1 M 트리스-HCl, pH 7.5를 최종 농도 50 mM 까지 가하여 중화시키고, 유리 튜브중 90 ℃에서 5분간 인큐베이팅시키고, 이어서 얼음상에서 급속히 냉각시켰다. 19,000 x g_max, 4 ℃에서 20분간 원심 분리하여 불용성 물질을 펠릿화하였다. 상등액은 인자 Xa 아미도분해 검정법에서 인자 Xa를 억제하는 물질을 함유하였다. 약 89 %의 인자 Xa 억제 활성이 희석 후 이와 같은 열처리후에 상등액 중에서 회복되었다.

(E) 슈퍼덱스 30을 사용한 분자체 크로마토그래피 (열처리 단계 대용법)

음이온 교환 크로마토그래피로 부터의 0.55 M NaCl 용출 풀(3 ml)의 절반을, 이어서 인산 나트륨, pH 7.4, 0.15M NaCl로 24 ℃에서 예비 평형시킨 슈퍼덱스 30 PG(Pharmacia, Sweden) 1.6 x 66 cm 칼럼에 걸었다. 인자 Xa 억제 활성(인자 Xa 아미도 분해 검정법으로 결정)은 56 내지 64 ml의 런(kav=0.207)으로 용출되었다. 이 용출 부피는 14,000 달톤의 분자량을 갖는 구형 단백질로 예상되었다.

(F) 역상 크로마토그래피

콘카나발린 A 세파로오스, 음이온 교환 및 슈퍼덱스 30(또는 대용으로서의 열처리 단계)상에서 크로마토그래피에 의해 분획화된 십이지장충 용해물을 0.46 x 25 cm C18 칼럼(218TP54 Vydac, Hesperia, CA)에 걸고, 0.1 %(v/v) 트리플루오로아세트산중 10-35% 아세토니트릴의 선형 구배로 유속 1 ml/분에서 아세토니트릴/분의 변화 속도를 0.625 %로 하여 전개시켰다. 인자 Xa 억제 활성(인자 Xa 아미도 검정법에서 결정)은 대략 30 % 아세토니트릴에서 용출되었다. HPLC런을 215 nm로 설정된 폴리크롬 9600 검출기(Varian, CA)에 연결된 Vista 5500상에서 수행하였다. 검출기 시그널을 동일회사의 4290 인테그레이터 상에서 적분하였다. 인자 Xa 억제 활성 함유 분획을 진공 건조시키고 PBS(0.01 M 인산 나트륨, pH 7.4, 0.15 M NaCl)중에 재용해시켰다

이들 분획을 모으고, 0.46 x 25 cm C18 칼럼(218TP54 Vydac; Hesperia, (A)에 건 다음, 0.1 % 트리플루오로아세트산중 10-35 % 아세토니트릴 선형 구배로 유속 1 ml/분에서 아세토니트릴/분 변화 속도가 다소 느린 0.4%에서 전개시켰다. 인자 Xa 검정 활성 함유 분획을 모으고, 진공 건조시켰다.

(G) 안실로스토마 카니눔으로부터의 NAP의 분자량 결정

이 실시예에서 기술된 바와 같이 분리된 NAP의 추정 분자량을 일렉트로스프레이 이온화 질량 스펙트럼 분석법으로 결정하였다.

진공 건조된 NAP 펠릿은 50 %(v/v) 아세토니트릴, 1 %(v/v) 포름산에 용해시켰다. VG Bio-Q(Fisons Instruments, Manchester UK)를 사용하여 질량 분석을 수행하였다.

NAP 셈플을 모세관을 통해 펌핑하고, 그의 꼭대기에 고전압 4 KV를 걸었다. 고 전기랑 효과하에 샘플을 단백질 분자를 함유하는 방울로 분사시켰다. 60 ℃에서 중성 가스(N₂) 건조 효과에 보조하여 방울 크기는 모든 용매가 증발되고 단백질 종만이 가스상 형태로 자존할 때까지 감소된다. 하나의 전하에 있어서 서로 상이한 단백질 종 집단이 생겼다. 콰드러플 분석기를 사용하여 상이한 Da/e(질량/하전량) 값을 검출하였다. 기기의 캘리브레이션은 말 심장 미오글로빈(Sigma, Missouri)을 사용하여 수행하였다.

본 실시예의 섹션 A, B, C, D 및 F에서 분리된 NAP의 예상 분자량은 8734.60 달톤이다. 섹션 A, B, C, E 및 F에서 기재된 바와 같이 분리된 천연 NAP의 예상 분자량은 8735.67 달톤이다.

(H) 안실로스토마 가니눔으로부터의 NAP의 아미노산 서열화

분석기와 분석 시스템을 갖춘 476-A 단백질/펩티드 서열화기[476-A protein/Peptide Sequencer with On Board Microgradient PTH Analyzer and Model 610A Data Analysis System, Applied Biosystems, CA]상에서 아미노산 서열을 결정하였다. 잔기의 정량화는 시스템 컴퓨터(Applied Biosystems, CA) 상의 온-라인 분석에 의해 수행되었다; 잔기 결정은 HPLC 크로마토그램의 시각 분석으로 수행하였다. 천연 NAP 아미노 말단의 최초 20개 아미노산은 다음과 같았다:

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly Thr Gln Lys Pro [서열 번호 97].

시스테인 잔기는 이 분석에서 직접적으로 검출되지 않았는데 샘플을 환원시키고 알칼화하지 않았기 때문이다. 특정 아미노산으로 나타내지 않은 위치를 시스테인으로 하였다.

실시예 2

안실로스토마 카니눔으로부터의 NAP의 클로닝 및 서열화

(A) 혼성화 프로브의 제조

NAP를 코딩하는 전 길이 cDNA 클론을 선충류인 안실로스토마 카니눔으로부터 분리된 mRNA로 부터 제조된 cDNA 라이브러리를 하기와 같은 안실로스토마 카니눔의 NAP의 아미노 말단 최초 11개 아미노산에 기초한 방사성 표지된 축퇴 올리고뉴클레오티드로 스크리닝하여 단리하였다:

Lys ala Tyr Pro Gu Cys Gly Glu Asn Glu Trp [서열 번호 93]

YG99로 지칭되는 33-머 올- 혼성화 프로브는 다음 서열을 갖는다:

AAR GCI TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [서열 번호 94].

상기식에서, R은 A 또는 G를, Y는 T 또는 C를, 그리고 i는 이노산을 나타낸다. YG99는 감마- ³²P-ATP(비활성>7000 Ci/mmole; ICN, Costa mesa, CA, USA)를 사용하여 효소적 말단 포스포릴화(5'-말단 라벨링 키트; Amersham, Buckingham shire, England)하여 방사성 표지화하고, 이어서 NAP^TM10 칼럼(Pharmacia, Uppsala, Sweden)으로 통과시켰다.

(B) cDNA 라이브러리의 제조

문헌[Promaga Protocols and Applications Guide 2nd Ed.; Promega Corp., Madison, Wi, USA]의 과정을 이용하여 cDNA 라이브러리를 작제하였다.

성충 십이지장충 안실로스토마 카니눔을 안티바디 시스템(Bedford, TX)으로부터 구입하였다. QuickPrep mRNA 정제 키트(Pharmacia)를 사용하여 폴리(A⁺)RNA를 제조하였다. 약 3 ㎍의 mRNA를 올리(dT)-NotⅠ 프라이머/어댑터 AATTCGCGGCCGC(T)₁₅ [서열 번호 95], (Promega Corp.) 및 AMV(Avian Myeloblastosi Virus) 역전사 효소(Bohringer, Mannheim, Germany)를 사용하여 역전사시켰다. 이중 가닥 cDNA의 합성에 사용된 효소는 다음과 같다: 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 Ⅰ 및 RNase H (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) 및 T4 DNA 폴리머라제(Pharmacia).

EcoRI 링커(pCGGAATTCCG) [서열 번호 98]를 EcoRI 메틸라제(RiboClone EcoRI Linker Ligation System Promega)로 처리한 후 얻어진 cDNA에 연결시켰다.

cDNA를 Not Ⅰ 및 EcoRⅠ로 소화시키고, 1.5 % 아가로오스 겔(포획될 수 있는 모든 물질을 진클린 프로토콜, BI0101 Inc., La Jolla, CA을 사용하여 용출시켰다) 상에 통과시키고, 람다 gt11 Sfi-NotⅠ 벡터(Promega)의 EcoRI-NotⅠ 암 내로 일방향으로 연결시켰다. 시험관 내 패키징(GigapackII-Gold, Stratagene, La Jolla, CA)한 후에 재조합 파아지를 균주 Y1090(Promega)를 감염시켜 얻었다.

cDNA 라이브러리의 유용성은 PCR 분석에 의해 입증되었다. (Taq 폴리머라제, Boehringer; 30 온도 사이클; 95 ℃ 1분, 50 ℃ 1분, 72 ℃ 3분) 상기 올리고(dT)-NotⅠ 프라이머/어댑터와 함께 서열 GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG(New England Biolabs, Beverly, MA, USA) [서열 번호 96]; cDNA 삽입물의 상류에 위치한 표적 서열)의 람다 gt 11 프라이머 ＃1218을 사용하여 랜덤하게 선택된 다수의 클론을 분석한 결과, 클론의 대부분이 다양한 크기의 cDNA 삽입물을 함유하는 것으로 밝혀졌다.

(C) 클론의 확인

1 x 10⁶ cDNA 클론 (Hybond^TM-N, Amersham을 사용하여 이중 플라크-리프트 필터를 제조하였다)을 방사성 표지화된 YG99 올리고뉴클레오티드로 하기 예비 혼성화 및 혼성화 조건을 사용하여 스크리닝하였다; 5 x SSC(SSC: 150 mM NaCl, 15 mM 트리나트륨 시트레이트), 5 x 덴하르트 용액, 0.5 % SDS, 100 ng/ml 초음파 처리 어류 정자 DNA (Boehringer) 42 ℃, 철야 인큐베이팅. 필터를 37 ℃에서 2 x SSC, 0.1 % SDS 중에서 4회 세척하였다. X-선 필름에 노출 (약 72시간) 시킨 후, 총 350 내지 500 혼성화 스폿을 찾아냈다.

NAP 1 내지 NAP 24로 지칭되는 24개 양성 클론을 보다 낮은 플라크 밀도에서 제 2 혼성화 처리하였다. NAP 24를 제외하고는, 람다 파아지 균질 집단을 함유하는 단일 플라크가 나타났다. 보유된 클론을 (i) YG 99 또는 (ii) 람다 gt11프라이머 ＃1218과 함께 올리고(dT)-NotⅠ 프라이머 (AATTCGCGGC CGC(T)15) [서열 번호 95]를 사용하여 PCR 증폭 (Boehringer 의 Taq 폴리머라제; 30 온도 사이클; 95 ℃ 1분, 50 ℃ 1분, 72 ℃ 1.5분)에 의해 분석하였다. 클론의 대부분 (23개중 20)이 올리고(dT)-NotⅠ/＃1218 프라이머 커플을 사용할 때 약 520 bp 단편을 사용하였다. 19개의 그러한 가능한 전길이 클론을 더욱 특성화하였다.

5개 클론의 cDNA 삽입물을 pGEM-5zf(-) 및 pGEM-9zf(-) (Promega)상에 SfiⅠ-NotⅠ 단편으로서 서브클로닝하였다. 람다 gt11 및 pGEM-5zf(-)의 Sfi Ⅰ 위치가 서로 상존적이지 않으므로, 이러한 벡터의 클로닝을 하기 2개의 5'-말단 포스포릴화 올리고뉴클레오티드를 어닐링한 후 얻어지는 작은 어댑터 단편의 사용을 요구하였다 (pTGGCCTAGCG TCAGGAGT [서열 번호 99] 및 pCCTGACGCTAGGCCATGG [서열 번호 10]. 단일 가닥 DNA를 제조한 후, 이러한 cDNA 서열을 서열 AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA (New England Biolabs) [서열 번호 101]을 갖는 프라이머 ＃1233을 사용하여 디데옥사슬 종결법으로 결정하였다. 모든 5개 클론을 완전한 분비 시그널을 포함하는 전길이인 것으로 밝혀졌다. 클론 NAP5, NAP7 및 NAP22는 동일한 코딩 영역을 갖는 것으로 밝혀졌다. 클론 NAP6과 NAP11 또한 동일하나 NAP5 코딩 영역 타입과는 다르다. 도1은 NAP5 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 도2는 코딩된 단백질 AcaNAP의 아미노산 서열을 나타낸다. 마찬가지로, 도3은 NAP6 유전자의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 5)를 나타내고, 도 4는 코딩된 단백질 AcaNAP6의아미노산 서열 (서열 번호 6)을 나타낸다.

14개의 다른 가능한 전길이 클론을 제한 분석하였다. YG99/올리고(dT)-NotⅠ 프라이머 커플로 얻어진 상기 400 bp PCR 생성물을 클론의 NAP5 및 NAP6-형을 분간할 수 있는 4개의 상이한 효소로 소화시켰다. Sau96Ⅰ, Sau3AⅠ, DdeⅠ, and HpaII. 결과는 14클론중 10개의 클론이 NAP-5-형인 것으로 나타났으며 (NAP4, NAP8, NAP9, NAP15, NAP16, NAP17, NAP18, NAP20, NAP21, 및 N2P23), 나머지 4개는 NAP6-형이었다( NAP10, NAP12, NAP14 및 NAP19).

이들 클론을 안실로스토마 카니눔 유래를 반영하도록 NAP바로 앞에 Aca를 붙여 다시 명명하였다. 예를 들어, NAP 5는 AcaNAP5, NAP6은 AcaNAP6 등으로 명명하였다.

실시예 3

피치아 파스토리스중 재조합 AcaNAP5의 생산 및 정제

(A) 발현 벡터 작제

이. 콜라이/피. 파스토리스 셔틀 벡터 pHILD2를 포함하는 피치아 파스토리스 효모 발현 시스템이 다수의 미국 특허에 기재되어 있다: 미국 특허 5,330,901; 5,268,273; 5,204,261; 5,166,329; 5,135,868; 5,122,465; 5,032,516; 5,004,688: 5,002,876; 4,895,800; 4,885,242; 4,882,279; 4,879,231; 4,857,467; 4,855,231, 4,837,148; 4,818,700; 4,812,405; 4.808,537; 4,777,242 및 4,683,293.

피치아 파스토리스 중 재조합 AcaNAP5의 발현 분비를 유도하는데 사용된 pYAM7SP8 벡터는 동일한 일반 구조를 갖는 HILD2 폴리펩티드 유도체였다 [Despreaus, C.W. and Manning, R.F., Gene 131: 35-41 (1993)]. 피치아 파스토리스 중 발현 및 염색체 통합에 요구되는 pHILD2의 전사 및 재조합 요소 외에[D.W. et al., 미국 특허 4,855,231], 이 벡터는 알콜 옥시다제 (AOXI) 프로모터 하류에 삽입된 키메릭 프리프로 리더 서열을 함유한다. 프리프로 리더는 합성 19-아미노산 프로서열에 융합된 피치아 파스토리스 산 포스파타제 (PH01)분비 시그날로 구성되었다. 이러한 프로 서열은 사카로마이세스 세레비지에 알파 인자 리더 서열에 기초하여 문헌[Clements et al., Gene 106: 267-272 (1991)]에서 설계된 2개의 19-aa 프로서열 중의 하나이다. 프리프로 리더 서열 바로 하류에 오도록 조작된 것은 효소 StuⅠ, SacII, EcoRⅠ,BglII, NotⅠ, XhoⅠ, SpeⅠ and BamHI에 대한 인식 서열을 갖는 합성 멀티 클로닝 위치로서 이는 외래 유전자의 클로닝을 촉진시킨다. 피치아 파스토리스 중 pYAM7SPS로부터 발현된 NAP는 우선 프리프로 생성물로 번역되며, 이어서 숙주 세포에 의해 처리되어 프로 및 프로 서열이 제거되게 되었다.

이 벡터의 구조는 도12에 나타나있다. 시그널 서열(S)는 다음과 같은 핵산 서열을 갖는다: ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA ATT ATT TTA GCT TTG GCT ACT TTG CAA TCT GTC TTC GCT [서열 번호 102]. 프로 서열 (P)는 다음과 같은 핵산 서열을 갖는다: CAG CCA GGT ATC TCC ACT ACC GTT GGT TCC GCT GCC GAG GGT TCT TTG GAC AAG AGG [서열 번호 103]. 멀티플 클로닝 위치 (MCA)는 다음과 같은 핵산 서열을 갖는다: CCT ATC CGC GGA ATT CAG ATC TGA ATG CGG CCG CTC GAG ACT AGT GGA TCC [서열 번호 104].

AcaNAP5 cDNA를 함유하는 pGEM-92zf(-) 벡터 (Promega)는 증폭 (PCR 레스큐)에 의해 성숙 AcaNAP5 단백질을 코딩하는 영역을 분리하는데 사용되었다. (New England Biolabs, Beverly, MA의 벤트 폴리머라제, 20 온도 사이클: 94 ℃ 1분, 50 ℃ 1분, 72 ℃ 1.5분) 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다.

YG101: GCTCGCTCTA-GAAGCTTTCAG-ACATGTATAA-TCTCATGTTG-G [서열 번호 105]

YG103: AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [서열 번호 89)]

YG101 프라이머 (C-말단 서열 표적)는 XbaⅠ 및 HindⅢ 제한 위치 (밑줄)를 포함하는 비어닐링 연장부를 함유하였다.

XbaⅠ 효소 절단한 후, 예상되는 크기의 증폭 생성물을 겔로부터 분리하고 이어서 효소적으로 포스포릴화 하였다(New England Biolabs, Beverly, MA의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제). 키나제를 열 불화성화 (70 ℃, 10분) 시킨 후에 평활 말단 XbaⅠ 단편을 벡터 pYAM7SP8내로 발현의 목적으로 직접 클로닝하였다. pYAM7SP8로부터의 수용 벡터 단편을 StuⅠ-SpeⅠ 제한에 의헤 제조하고 아가로오스겔로부터 정제하였다. 이. 콜라이 균주 [Zell, WK6 R. and Fritz, H.-J., EMBO J., 6: 1809-1815 (1987)]을 연결 혼합물로 형질전환 시키고 암피실린 내성 클론을 선택하였다.

제한 분석에 기초하여, 예상 크기의 삽입물을 함유하는 폴리펩티드 클론 pYAM7SP-NAP5를 추가 특성화를 위해 보유하였다. 클론 pYAM7SP-NAP5의 서열 결정은 성숙 AcaNAP5 코딩 영역이 작제 스킴에서 예상된 대로 프리프로 리더 서열과 융합되어 정확히 삽입되어 있으며 원치 않는 코딩 영역 변이가 없음을 확인시켰다.

(B) 피치아 파스토리스중 재조합 AcaNAP5의 발현

피치아 파스토리스 균주 GTS115(his 4)는 문헌에 기재되어 있다[Stroman, D.W. et al., 미국 특허 4,855,231]. 모든 피치아 파스토리스 조작은 문헌 [Stroman, D.W. et al., 미국 특허 4,855,231]에 기재된 바에 따라 수행하였다.

약 1 ㎍의 pYAM7SP-NAP5 플라스미드 DNA를 균주 GTS115 내로 표준 프로토콜로 일렉트로포레이션시켰다. 플라스미드를 미리 SalⅠ 소화에 의해 선형화 시켰으며, 이는 이론적으로는 플라스미드의 his4 염색체 좌위로의 표적화 및 통합을 촉진시켰다.

AcaNAP5 고발현 균주의 선택은 본질적으로 하기와 같이 수행되었다. His⁺ 형질전환체를 MD 플레이트 (아미노산이 없는 효모 질소 염기 (DIFCO), 13,4 g/l; 비오틴 400 ㎍/l; D-글루코오스 20 g/l, 아가 15 g/l). 일렉트로포레이션으로 부터의 단일 콜로니 (n=60)를 96-웰 플레이트의 웰중 FM22-글리세롤-PTM1 배지 100 μl 내로 접종하고 30 ℃에서 24시간 플레이트 교반지 상에서 성숙시켰다. 11의 FM22-글리세롤-PTH1 배지는 42.87 g KH₂PO₄, 5 g (NH₄)₂SO₄, 1 g CaSO₄·2H₂O, 14.28 g K₂SO₄, 11.7 g MgSO₄·7H₂O 50 g 글리세롤 (멸균, 100 ml 용액), 1 ml PTM1 미량 무기질 믹스 (필터 멸균)를 함유하였다. 배지의 FM 22 부분을 pH 4.9 (KOH 사용 조정) 멸균 여과 용액 900 ml로서 제조 되었다. 1 l의 PTM1 믹스는 6g CuSO₄·H₂O, 0.2 g NaMoO4·2H₂O, 0.02 g H₃BO₃, 0.5 g CoCl₂·6H₂O, 20 g ZnCl₂, 5 ml H₂SO₄, 65 g FeSO·7H₂O, 0.2 g 비오틴을 함유하였다.

세포를 펠릿화하고 신선한 FM22-메탄올-PTM1 배지 (상기와 동일 조성이되, 50 g의 글리세롤을 0.5 % (v/v) 메탄올로 대체하여 AOX1 프로모터 발현 유도) 중에 재현탁시켰다. 30 ℃에서 24시간 동안 추가로 인큐베이션시킨 후에, 미니 컬춰의 상등액을 분비된 AcaNAP5에 대하여 시험하였다. 배양 배지중 높은 인자 Xa 억제 활성에 의해 나타나는 바와 같이 (실시예 1에 기재된 인자 Xa 아미도분해 검정법에 의해 측정), 고 수준의 AcaNAP5 합성 및 분비를 유도하는 2개의 클론을 선택하였다. 제2 스크리닝 후에 동일한 과정을 사용하되 진탕 플라스크 레벨에서 하나의 숙주 세포를 선택 단리하여 피치아 파스토리스 GTS115/7SP-NAP5라 명명하였다.

숙주 세포 GTS115/7SP-NAP5는 야생형 메탄올 이용 표현형 (Mut⁺)을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 GST115 염색체 내로의 발현 카세트의 통합이 게놈 AOX1 유전자의 기능을 발현시키지 않았음을 입증한다.

재조합 AcaNAP5 물질의 생산은 진탕 플라스크 배양으로 수행되었다. [Stroman, D.W. et al., 미국 특허 4,855,231]. 재조합 생성물을 피치아 파스토리스 세포 상등액으로부터 다음과 같이 정제하였다.

(C) 재조합 AcaNAP5의 정제

(1) 양이온 교환 크로마토그래피

발현 후 GTS115/75SP-NAP5 (100 ml)로 부터의 배양 상등액을 16000 rpm (약 30,000 x g)에서 20분간 원심 분리하고 1N HCl을 사용하여 pH3으로 조정하였다. 상등액의 전도도를 MilliQ수를 가하여 10 mS/cm 미만으로 감소시켰다. 희석된 상등액을 0.22 μm 셀룰로오스 아세테이트 필터 (Corning Inc. Corning, NY. USA)를 통하여 청징화하였다.

상등액 총 부피를 (약 500 ml)를 Poros 20 HS (Persepfive Biosystems, MA) 1 x 2 cm 칼럼(0.05 M시트르산 나트륨 pH3.1 양이온 완충액으로 예비 평형화시킴) 상에 유속 5 ml/분 (400 cm/시)으로 걸었다. 칼럼과 샘플을 이 정제 단계를 통해 주위 온도로 유지시켰다. 칼럼을 50 칼럼 부피의 양이온 완충액으로 세척하였다. 인자 Xa 아미도분해 검정법에서 억제 활성을 나타낸 물질을 유속 2 ml/분으로 1M Nacl을 함유하는 양이온 완충액으로 용출시켰다.

(2) 슈퍼덱스 30을 사용한 분자체 크로마토그래피

양이온 교환 칼럼으로 부터의 억제 물질을 함유하는 1M NaCl 용리 풀을 0.01 M 인산나트륨, pH 7.4, 0.15 M NaCl로 예비 평형시킨 슈퍼덱스 30 PG(Pharmacia) 1.6 x 66 cm 칼럼상에 부과하였다. 크로마토그래피는 유속 2 ml/분의 유속에서 수행하였다. 인자 Xa 억제 활성은 런(kav 0.207)내로 56 내지 64 ml 용출되었다. 이는 천연 분자에 대해 결정된 것과 같은 용출 부피이다 (실시예 1, 파트 E)

(3) 역상 크로마토그래피

겔 여과 크로마토그래피로부터의 합한 분획 1 ml를 0.46 x 25 cm C18 칼럼(218 TP 54 Vydac; Hesperia, CA)상에 걸고, 1 ml/분의 속도로 0.1 % (v/v) 트리플 루오로아세트산중 10 내지 35 % 아세토니트릴 선형 구배로 아세토니트릴/분의 0.4 % 변화율로 전개시켰다. 인자 Xa 억제 활성 (실시예 1과 같이 검정)은 30 - 35 % 아세토니트릴 부근에서 용출되었으며 수개의 분획에 존재하였다. HPLC 런은 실시예 1에 기재된 것과 같은 시스템상에서 수행되었다. 이 칼럼상 수 회의 런으로 부터의 인자 Xa 억제 활성 함유 분획을 합하며 진공하에 건조시켰다.

(4) 재조합 AcaNAP5의 분자량 결정

본 실시예 섹션 (1) 내지 (3)에서와 같이 분리된 주 성분에 대한 예상 분자량은 실시예 1과 동일한 일렉트로스프레이 이온화 질량 스펙트럼 분석 시스템을 이용하여 결정하였다.

제조합 AcaNAP5의 예상 분자량은 8735.69 달톤이었다.

(5) 재조합 AcaNAP5의 아미노산 서열화

이 실시예의 섹션 (1) 내지 (3)에 의한 정제 후에, 피치아 파스토리스로 부터의 재조합 AcaNAP5를 실시예 1에서와 같이 아미노산 서열 분석하였다. AcaNAP5 아미노 말단의 최초 5개 아미노산은 다음과 같이 결정되었다.

Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu [서열 번호 106].

서열은 천연 NAP 단백질과 동일하였다. (실시예 1, 파트 E)

실시예 4

피치아 파스토리스 중 재조합 AcaNAP6의 생산 및 정제

(A) 발현 벡터 작제

발현 벡터 pYAM7SP-NAP6을 실시예 3에서 pYAM7SP-NAP5를 제조한 것과 같이 제조하였다.

(B) 피치아 파스토리스 중 재조합 AcaNAP6의 발현

벡터 pYAM7SP-NAP6을 실시예 3에서와 같이 피치아 균주 GTS115(his4)를 형질전환시키는데 사용하였다.

(C) AcaNAP6의 정제

발현 벡터 pYM7SP-NAP6으로 형질전환된 피치아 균주 GTS115 (his 4)로부터 발현된 재조합 AcaNAP6을 실시예 3에서 재조합 AcaNAP5에 대해 기술한 바와 같이 정제하였다.

재조합 AcaNAP6의 예상 분자량은 실시예 3에서와 같이 했을 때 8393.84달톤이었다.

AcaNAP 6 제제의 대부분을 하기 아미노산 서열을 가졌다:

Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu [서열 번호 106]

실시예 5

COS 세포중 재조합 Pro-AcaNAP5의 발현

(A) 발현 벡터 작제

AcaNAP5 cDNA가 서브클로닝된 pGEM-9zf(-)벡터 (Promega Corporation, Madison, WI, USA)는 천연 분비 시그널을 포함하여 전체 AcaNAP5 코딩 영역의 PCR-레스큐에 대한 표적으로 기능하였다. (벤트 폴리머라제, New England Biolabs, Beverly, MA, USA; 20 온도 사이클; 95 ℃ 1분, 50 ℃ 1분, 72 ℃ 1.5분) 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같다:

(1) YG101, NAP 코딩 유전자의 3'-말단을 표적으로 하며, 서열은 GCTCGCTCTA GAAGCTTCAG ACATGTATAA TCTCATGTTG G [서열 번호 105],

(2) YG102, NAP 코딩 유전자의 5'-말단을 표적으로 하며 서열은 GACCAGTCTA GACAATGAAG ATGCTTTACG CTATCG [서열 번호 107]

이러한 프라이머는 XbaⅠ 제한 위치 (밑줄)를 포함하는 비어닐링 연장부를 함유한다.

XbaⅠ 효소로 소화시킨 후에, 예상 크기의 증폭 생성물을 아가로오스 겔로부터 분리하고, 발현 목적으로 pEF-BOS 벡터 (Mizushima, S. and Nagata, S., Nud, Acid, Res. 18: 5322(1990)]의 450 bp XbaⅠ 스터퍼 단편으로 대체하였다. 수용 벡터-단편은 XbaⅠ 소화로 제조하여 아가로오스 겔로부터 정제하였다.

이. 콜라이 균주 WK 6[Zell, R. and Fritz, H.-J., EMBO J., 6: 1809-1815 (1987)]을 연결 혼합물로 형질전환시켰다. 30개 랜덤하게 선택된 암피실린 내성 형질전환체를 PCR분석 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, USA) 하였다: 30 사이클 증폭: 95 ℃에서 1분, 50 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분). 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같다: (1) 서열 AAGGCATACC CGGAGTGTGG TG [서열 번호 89]의 YG103, 성숙 NAP 코딩 아미노 말단과 일치, (2) 서열 GTGGGAGACC TGATACTCTC AG [서열 번호 108]의 YG 60, PEG-BOS 발현 카세트의 3'-비번역 영역중 삽입 위치의 하류 벡터 서열을 표적으로 한다. 삽입물을 목적하는 방향으로 함유하는 클론만이 예상 길이의 PCR 단편(약 250 염기쌍)을 생산할 수 있다. 그러한 2개의 클론을 서열 결정에 의해 더욱 특성화하였으며, 목적하는 Xba Ⅰ 삽입물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. pEF-BOS-NAP5로 지칭되는 클론 중의 하나를 COS 세포를 형질감염시키는데 사용하였다.

(B) COS 세포의 형질 감염

COS-7 세포(ATCC CRL 1651)를 pEF-BOS-NAP5(비관련 삽입물을 함유하는 pEF-BOS) 또는 DEAE-덱스트란을 사용하여 DNA를 생략하여(목 형질감염) 형질감염시켰다. 하기 배지 및 스톡 용액을 DEAE-덱스트란 방법에 사용하였다:

(1) COS-배지: DMEM: 10 % FBS(56 ℃에서 30분 인큐베이팅: 0.03 % L-글루타민; 페니실린 50 IU/ml 및 스트렙토마이신 50 ㎍/ml(모두 Life Technology로부터 입수).

(2) MEM-HEPES: MEM 배지(Life Technologies Inc.) 제조자의 지시에 따라 재생. 25 mM 최종 농도의 HPES 함유. 여과(0.22 μm)전 pH 7.1로 조정.

(3) DNA용액: 3 mml MEM-HEPES 당 6 ㎍.

(4) DEAE-덱스트란 용액: 30 ul DEAE-덱스트란 스톡(Pharmacia, Uppsala, Sweden; 100 mg/ml H₂O)/3 ml MEM-HEPES.

(5) 형질감염 혼합물: 3 ml의 DEAE-덱스트란 용액을 3 ml의 DNAE-덱스트란 용액을 3 ml의 DNA 용액에 가하고, 혼합물을 주위 온도에서 30분간 방치한다.

(6) 클로로퀸 용액: COS 배지중 1:100 희석 클로로퀸 스톡(Sigma, St. Louis, MO, USA; 10 mM 물중, 0.22 ㎛ 멤브레인 여과).

COS 세포의 일시 형질 감염을 다음과 같이 수행하였다. 175 cm² Nunc TC-플라스크(Life Technologies Inc.) 중에 배양된 COS 세포(약 3.5 x 10⁶)를 MEM-HEPES로 일회 세척하였다. 6 ml의 형질감염 혼합물을 세척된 세포상으로 피펫팅하였다. 주위 온도에서 30분간 인큐베이팅한 후, 48 ml의 클로로퀸 용액을 가하고 세포를 37 ℃에서 다시 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 신선한 COS-배지로 1회 세척하고 최종적으로 50 ml의 동일 배지 중 37 ℃에서 인큐베이션시켰다.

(C) 형질 감염된 COS 세포의 배양

형질 감염된지 3, 4 및 5일 후에 배양 상등액 샘플을 실시예 1에 따라 인자 Xa 아미노분해 검정법으로 시험하였다. 결과는 인자 Xa 활성이 pEF-BOS-NAP5로 형질 감염된 세포의 배양 상등액 중에 누적됨을 여실히 증명하였다.

COS 배양 상등액을 형질 감염 후 5일에 수확하고, NAP 단백질을 실시예 6에서와 같이 정제하였다.

실시예 6

재조합 Pro-AcaNAP5의 정제

(A) 음이온 교환 크로마토그래피

Pro-AcaNAP5를 함유하는 COS 배양 상등액을 1500 rpm(약 500 x g)에서 10분 동안 원심분리하고 고상 아세트산 나트륨을 최종 농도 50 mM로 가하였다. 하기 프로테아제 억제제(모두 ICN Biomedicals Inc. Costa Mesa,CA, USA)를 가하였다: 1.0 x 10^-5 M 펩스타틴 A(이소발레릴-Val-Val-4-아미노-3-히드록시-6-메틸-헵타노일-Ala-4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵타노산), 1.0 x 10^-5 M AEBSF(4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐 플루오라이드). HCl로 pH 5.3으로 조정하였다. 상등액을 0.2 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터(Corning Inc., Corning, NY, USA)를 통해 청징화하였다.

청징화 상등액(총 부피 약 300 ml)를 유속 10 ml/분(800 cm/시)로 음이온 완충액(0.05 M 아세트산 나트륨, pH 5.3, 0.1 M NaCl)으로 예비 평형된 Poros 20 HQ(Perseptive Biosystems, MA) 1 x 2 cm 칼럼 상에 걸었다. 칼럼과 샘플을 정제 전 과정을 통하여 주위 온도로 유지시켰다. 칼럼을 10 칼럼 부피의 음이온 완충액으로 세척하였다. 인자 Xa 아미노분해 검정법에서 억제 활성을 갖는 물질을 유속 5 ml/분(400 cm/시)로 0.55 M NaCl을 함유하는 음이온 완충액으로 용출시키고 수거하였다.

(B) 슈퍼덱스 30을 사용한 분자체 크로마토그래피

음이온 교환 크로마토그래피로 부터의 0.55 M NaCl 용출 풀(3 ml)을 0.01 M 인산나트륨, pH 7.4, 0.15 M NaCl로 219 ℃에서 예비 평형시킨 슈퍼덱스 30 PG(Pharmacia, Sweden) 1.6 x 66 cm 칼럼상에 걸었다. 크로마토그래피를 유속 2 ml/분에서 수행하였다. 인자 Xa 아미노분해 검정법에서 억제 활성을 갖는 물질이 런(Kav 0.207) 내로 56 내지 64 ml 용출되었다. 이는 천연 분자에 대한 것과 동일한 용출 부피였다.

(C) 열 처리

인자 Xa 억제 활성을 갖는 분획의 총 풀을 90 ℃에서 5분간 유리 튜브 중에서 인큐베이션시키고, 이어서 얼음 위에서 급속 냉각시켰다. 불용성 물질을 19,000 x g max에서 4 ℃에서 20분간 원심분리하여 펠릿화하였다. 상등액은 모든 인자 Xa 억제 활성을 함유하였다.

(D) 역상 HPLC 크로마토그래피

열처리된 샘플의 상등액을 0.46 x 26 cm C18 칼럼(218 TP54 Vydac; Hesperia, CA) 상에 걸고, 1 ml/분의 속도에서 0.1 %(v/v) 트리플루오로아세트산 중 10-35 % 아세토니트릴의 선형 구배로 아세토니트릴/분 변화율 0.4 % 속도로 전개하였다. 인자 Xa 억제 활성은 약 30 % 아세토니트릴에서 용출되었다. HPLC런을 실시예 1과 동일한 시스템 상에서 수행하였다. 인자 Xa 억제 활성 함유 분획을 진공 건조시켰다.

(E) 분자량 결정

이 실시예의 섹션 A 내지 D에서와 같이 분리된 재조합 프로-AcaNAP5의 예상 분자량을 실시예 1과 동일한 일렉트로스프레이 이온화 질량 스펙트럼 시스템을 사용하여 결정하였다.

재조합 프로-AcaNAP5의 예상 분자량은 9248.4 달톤이었다.

(F) 아미노산 서열화

정제 후, COS 세포로부터의 재조합 프로-AcaNAP5를 아미노산 서열 분석하여 실시예 1에서와 같이 아미노 말단 서열을 결정하였다. 프로-AcaNAP5의 아미노 말단의 최초 8개 아미노산은 다음과 같이 결정되었다: Arg Thr Val Arg Lys Ala Tyr Pro Glu [서열 번호 109] 천연 AcaNAP5 단백질과 비교하여(실시예 1 참조), Pro-AcaNAP5는 그의 N-말단에 4개의 아미노산을 더 가졌다. 프로-AcaNAP5의 아미노산 서열을 도 5에 있다.

실시예 7

COS 세포 중 재조합 Pro-AcaNAP6의 발현

실시예 5에서 프로-AcaNAP5에 대해 기재한 것과 같이, COS 세포 중에서 프로-AcaNAP6을 일시적으로 생산하였다. 분비 시그널을 포함한 AcaNAP6 코딩 영역을 동일한 두 개의 AcaNAP5에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머로 PCR-레스큐하였다: (1) 유전자의 3'-말단을 표적으로 하고 서열 GCTCGCTCTA GAAGCTTCAG ACATGTATAA TCTCATGTTG G [서열 번호 105]을 갖는 VG101, 및 (2) 유전자의 5'-말단을 표적으로 하고 서열 GACCAGTCTA GACAATGAAG ATGCTTTACG CTATCG [서열 번호 107]을 갖는 YC102. VG10-1 프라이머는 표적으로서 AcaNAP6(밑줄친 T-잔기, 도 1 및 도 3과 비교)을 사용할 때 비- 대칭 뉴클레오티드를 함유한다. 이러한 미스매치는 ATT Ile-코돈을 ATA Ile-코돈으로 대체되게 한다. 미스매치는 증폭 효율에 현저한 영향을 끼치지는 않는다.

실시예 5에 다음과 같이 변화를 주었다: COS 세포를 형질 감염(실시예 5, 섹션 B) 시킨 지 24시간 후에 10 % FBS를 함유하는 COS 세포를 DMEM과 뉴트리언트 믹스쳐 햄스(Ham's) F12(Life Technology)의 1:1 혼합물로 구성된 배지 50 ml로 대체하였다. 세포를 37 ℃에서 인큐베이션시킨 후 인자 Xa 억제 활성을 실시예 5에서와 같이 검출하였다.

실시예 8

재조합 프로-AcaNAP6의 정제

(A) 음이온 교환 크로마토그래피

Pro-AcaNAP6을 함유하는 COS 배양 상등액을 1500 rpm(약 500 x g)에서 10분 동안 원심분리하고 고상 아세트산 나트륨을 최종 농도 50 mM로 가하였다. 하기 프로테아제 억제제(모두 ICN Biomedicals Inc. Costa Mesa, CA, USA)를 가하였다: 1.0 x 10^-5 M 펩스타틴 A(이소발레릴-Val-Val-4-아미노-3-히드록시-6-메틸-헵타노일-Ala-4-아미노-3-히드록시-6-메틸-헵타노일-Ala-4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵타노산), 1.0 x 10^-5 M 루펩틴, 5 × 10^-5 M AEBSF(4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐 플루오로라이드). HCl로 pH 5.3으로 조정하였다. 상등액을 0.2 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터(Corning Inc. Corning, NY, USA)를 통해 청징화하였다.

청징화 상등액(총 부피 약 300 ml)를 유속 10 ml/분(800 cm/시)로 음이온 완충액(0.05 M 아세트산 나트륨, pH 5.3, 0.1 M NaCl)으로 예비 평형된 Poros 20 HQ(Perseptive Biosystems, MA) 1 x 2 cm 칼럼 상에 걸었다. 칼럼과 샘플을 정제 전 과정을 통하여 주위 온도로 유지시켰다. 칼럼을 10 칼럼 부피의 음이온 완충액으로 세척하였다. 인자 Xa 아미노분해 검정법에서 억제 활성을 갖는 물질을 유속 5 ml/분(400 cm/시)로 0.55 M NaCl을 함유하는 음이온 완충액으로 용출시키고 수거하였다.

(C) 역상 HPLC 크로마토그래피

열처리된 샘플의 상등액을 0.46 x 26 cm C18 칼럼(218 TP54 Vydac; Hesperia, CA) 상에 걸고, 1 ml/분의 속도에서 0.1 %(v/v) 트리플루오로아세트산 중 10-35 % 아세토니트릴의 선형 구배로 아세토니트릴/분 변화율 0.4 % 속도로 전개하였다. 인자 Xa 억제 활성은 약 30 % 아세토니트릴에서 용출되었다. HPLC런을 실시예 1과 동일한 시스템 상에서 수행하였다. 인자 Xa 억제 활성 함유 분획을 진공 건조시켰다.

(D) 분자량 결정

이 실시예의 섹션 A 내지 C에서와 같이 분리된 재조합 프로-AcaNAP5의 예상 분자량을 실시예 1과 동일한 일렉트로스프레이 이온화 질량 스펙트럼 시스템을 사용하여 결정하였다.

재조합 프로-AcaNAP6의 예상 분자량은 8906.9 달톤이었다.

(E) 아미노산 서열화

정제 후, COS 세포로부터의 재조합 프로-AcaNAP6를 아미노산 서열 분석하여 실시예 1에서와 같이 아미노 말단 서열을 결정하였다. 프로-AcaNAP5의 아미노 말단의 최초 8개 아미노산은 다음과 같이 결정되었다: Arg Thr Val Arg Lys [서열 번호 110]. 천연 AcaNAP5 단백질과 비교하여(실시예 1 참조), Pro-AcaNAP6은 그의 N-말단에 4개의 아미노산을 더 가졌다. 프로-AcaNAP5의 아미노산 서열을 도 5에 있다(서열 번호 8).

실시예 9

기타 NAP 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 NAP DNA 서열의 용도

AcaNAP5 및 AcaNAP6 cDNA 서열(실시예 2)를 사용하여 기타 기생 종으로부터 교차 혼성화를 통하여 관련 분자를 단리하였다.

AcaNAP5 및 AcaNAP6 cDNA를 함유하는 pGEM-9zf(-) 벡터(프로메가)를 사용하여 성숙 NAP 단백질을 코딩하는 영역을 PCR-레스큐하였다(Taq 폴리머라제, Life Technolagies; 20분 사이클: 95 ℃ 1분, 50 ℃ 1분, 72 ℃, 1.5분). 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같았다:

(1) NAP 코딩 cDNA의 C 말단을 표적으로하며 서열 TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [서열 번호 88]를 갖는 YG109, (2) 서열 AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [서열 번호 89]를 갖는 YG103. YG109 프라이머는 표적으로서 AcaNAP6과 함께 사용될 때 단일 뉴클레오티드 미스매치(밑출친 T-잔기: 도 1 및 3의 서열 비교)를 함유한다. 이는 증폭 효율에는 현저한 영향을 미치지 않았다. 정확한 크기의 PCR 생성물(약 230 bp)를 1.5 % 아가로오스 겔로부터 얻었다. 등몰량의 혼합물을 랜덤 프라이머 연장부(T7 Quick Prime 키트: Pharmacia)에 의해 방사성 표지하고, 바이오-스핀 30 칼럼(Bio-Rad, Richmond, CA, USA) 상으로 통과시켰다.

안실로스토마 세일라니쿰(Ace), 안실로스토마 듀오데날레(Adu) 및 헬리그모소 모이데스 폴리기루스(Hpo) cDNA 라이브러리를 실시예 2의 안실로스토마 카니눔의 경우와 같이 제조하였다.

안실로스토마 세일라니쿰 및 헬리그모소모이데스 폴리기루스를 구입하였다 [Dr. D. I. Pritchard, Department of Life Science, University of Nottingham, Nottingham, UK.]. 안실로스토마 듀오데날레를 구입하였다[Dr. G. A. Schad, The School of Veterinary Medicine, Department of Pathobiology University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA.].

각 경우에, cDNA를 람다 gt11 중 EcoRⅠ-NotⅠ 단편으로서 직접 클로닝하였다. 각 라이브러리로부터의 약 2 x 10⁵ cDNA 클론(Hybond-N, Amersham을 사용하여 듀플리케이트 플라크-리프트 필터 제조)을 하기 예비혼성화 및 혼성화 조건을 이용하여 표지된 AcaNAP5 및 AcaNAP6 단편으로 스크리닝하였다: 5 x SSC(SSC: 150 mM NaCl, 1.5 mM 트리나트륨 시트레이트), 5 x 덴하르트 용액, 0.5 % SDS, 20 % 포름아미드, 100 ㎍/ml 음파처리 어류 정자 DNA(Boehringer), 42 ℃ 철야. 필터를 2 x SSC, 0.1 % SDS로 37 ℃에서 30분간 4회 세척하였다. X-선 필름에 약 60시간 노출시킨 후, 총 약 100 내지 200 혼성화 스포트를 Ace 및 Adu의 경우에 확인하였다. 소수의 매우 미세한 스포트가 Hpo cDNA 라이브러리의 경우에 볼 수 있었다. 각 라이브러리에 대하여, 8개의 양성 클론을 보다 낮은 플라크 밀도에서 제2 혼성화 처리하여 단일 플라크를 단리하였다.

보유된 클론을 서열 GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [서열 번호 96](New England Biolabs; 프라이머 ＃1218은 cDNA 삽입 위치의 상류의 람다 서열을 표적으로 한다)을 갖는 람다 gt11 프라이머 ＃1218과 함께 올리고(dT)-NotⅠ 프라이머(Promega; 실시예 2의 제1 가닥 cDNA의 제조에 사용된 것과 동일함)를 사용하여 cDNA-삽입물을 PCR 증폭에 의하여 더욱 특성화하였다. PCR 증폭은 다음과 같이 수행하였다. 30 온도 사이클: 95 ℃에서 1분, 50 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1.5분.

PCR 생성물의 겔 전기 영동은 AcaNAP5 cDNA(예를 들어, 400 내지 500 pb)와 대략 동일 크기의 cDNA가 각 종에서 얻어졌음을 입증하였다. 이러한 AcaNAP5 크기의 cDNA외에, 몇몇 Ace 및 Adu cDNA는 약 700 bp 길이인 것으로 밝혀졌다.

500bp 또는 800bp 삽입물을 함유하는 다수의 클론을 서열 결정을 위해 선택하였다. 그러한 목적으로, cDNA 삽입물을 SfiⅠ-NotⅠ 단편으로서 pEG-형 파지미드(Promega, 실시예 2)에 서브클로닝하였으며, 이는 단일 가닥 DNA의 제조를 가능케 하였다. 서열화는 6개의 상이한 신규 NAP 유사 단백질을 나타냈다: AceNAP4, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AduNAP7 및 HopNAP5. cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 코팅된 단백질의 추론된 아미노산 서열은 도 7A에 나타나 있다: AceNAP4 [서열 번호 9], 도 7B (AceNAP5) [서열 번호 10], 도 7C (AceNAP7) [서열 번호 11], 도 7D (AduNAP4) [서열 번호 12], 도 7E (AduNAP7) [서열 번호 13], 및 도 7F (HpoNAP5) [서열 번호 14].

AceNAP4 (서열 번호 9) 및 AduNAP7(서열 번호 13) cDNA는 각각 약 700bp 길이로서 각각 2개의 NAP 도메인을 함유하는단배질을 코딩하며, 다른 분리된 cDNA는 단일 NAP 도메인을 함유하는 단백질을 코딩한다. AduNAP4 cDNA 클론(서열 번호 12)은 전길이가 아니며, 즉, 클론은 코딩 영역의 5' 말단부가 결여되어 있으며, 정확한 리딩 프레임은 관련 분자의 NAP 계열과의 아미노산 상동성이 기초하여 확정될 수 있다.

밝혀진 cDNA 서열을 실시예 3 내지 7에 기재되어 있는 바와 같이, 동일하거나 다른 적절한 발현 시스템을 사용하여 코딩 단백질을 생산하는데 사용할 수 있다. 조절된 배지 또는 세포 용해물을 사용된 시스템에 따라 그 자체로 또는 프로테아제 억제 및 항응고 활성에 대하여 분획화(그러한 방법은 실시예 3, 4, 6 및 8 참조)하여 시험할 수 있다. AcaNAP5 유전자(도 1, 서열 번호 3) 및(또는) AcaNAP6 유전자(도 3, 서열 번호 5)의 단편으로부터 유도된 프로브에 혼성화되며 세린 프로테아제 억제 및/또는 항응고 특성을 갖는 cDNA에 의해 코딩되는 단백질은 관련 분자의 NAP 계열에 속하는 것으로 여겨진다.

실시예 10

cDNA 코딩 단백질의 기능적 표시에 의한 NAP의 확인

(A) 벡터의 pDONG 시리즈

pDONG 벡터의 뉴클레오티드 서열을 도 8A 내지 8C에 각각 나타내었다: pDONG61 [서열 번호 15], pDONG62 [서열 번호 16] and PDONG63 [서열 번호 17], pUC119 유도체 [Vieira, J. and Messing, J., Methods in Enzymology, 153:3-11 (1987)].

이들 세 개의 벡터를 제조하기 위하여 Hind Ⅲ 및 Sfi Ⅰ 제한 위치를 필라멘트 파아지 유전자 6의 5' 및 3' 말단에 M13K07 단일 가닥 DNA의 PCR 증폭 [Vieira, J. and Messing, J.]에 백워드 프라이머로서 G6BACKHIND를, 포워드 프라이머로서 G6FORSFI61, G6FORSFI62 또는 G6FORSFI63를 사용하여 가하였다. 제 2PCR에서 얻어진 3개의 단편을 포워드 프라이머로서 G6BACKHIND 및 G6FORNOTBAMH를 사용하여 단편의 3' 말단에 NotⅠ-BamHI 위치를 부착시켰다. 상기 PCR-프라이머의 서열은 다음과 같다(제한 서열 밑줄)

최종적으로, PCR 생성물을 최종적으로 겔 정제하고, Hind Ⅲ 및 Bam HI로 개개 소화하고 pUC119 중 상응하는 위치에 삽입하였다. 서열 결정 결과 pDONG61, 62 및 63이 모두 목적하는 삽입물을 갖는 것으로 나타났다.

벡터의 pDONG 시리즈는 cDNA를 Sfi I-Not I 단편으로서 클로닝하는 것을 가능하게 한다. 이러한 클로닝은 각각 3개의 리딩(번역) 프레임중의 cDNA를 파지 외피 단백질의 하나를 코딩하는 필라멘트 파지 유전자 6의 3' 말단에 융합시킨다. pDONG 유도체를 함유하는 웅성-특이적 이. 콜라이 균주의 VCSM13 헬퍼 파아지(Stratagene, La Jolla, CA)로의 감염은 pDONG 유도체의 하나의 특이적 단일 가닥을 캡슐화할 수 있고 그의 외피안에 재조합 단백질 6(p6) 융합 단백질을 포함할 수 있는 슈도비리온을 레스큐잉하게 된다. 코딩된 단백질이 재조합 P6 융합 단백질로서 파지 표면상에 기능적으로 표시되는 cDNA는 하기 패닝 실험 수단에 의해 나타날 수 있다.

(B) 람다 gt11로부터의 안실로스토마 카니눔 cDNA 라이브러리의 pDONG 시리즈 벡터로의 전환

합한 안실로스토마 카니눔 cDNA 클론(약 1x10⁶ 플라크, 실시예 2)의 파지 람다 제제를 cDNA 삽입물을 PCR-레스큐하는데 사용하였다(Taq 폴리머라제, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA; 20 온도 사이클: 95 ℃ 1분, 50 ℃ 1분, 및 72 ℃ 3분, 65 ℃ 10분). 이때 제1 가닥 cDNA 합성에 사용된 올리고(dT)-Not Ⅰ 프라이머/어댑터(Promega)와 함께 서열 GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [서열 번호 96] (New England Biolabs, Beverly, MA, USA; cDNA 삽입물의 상부에 위치한 서열을 표적으로 함)을 갖는 람다 gt11 프라이머 ＃1218을 사용하였다. 제한 효소 SfiⅠ 및 NotⅠ로 소화시킨 후, 증폭 생성물의 전체 크기 범위를 아가로오스 겔로부터 회수하였다.

모든 단편을 pDONG61, pDONG62 및 pDONG63 벡터로 직접 클로닝하였다. 수용 벡터 단편을 ScCl 정제된 벡터를 SfiⅠ 및 NotⅠ로 소화하고 정제 시스템["Wizard^TM PCR Preps DNA Purification System" (promega Corp, Madison, WI, USA)]을 사용하여 정제하여 제조하였다.

이. 콜라이 균주 TG1[Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, volumes 1 to 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]을 pDONG/cDNA 연결 혼합물로 일렉트로포레이션에 의해 형질전환시켰다. 전기 형질전환된 세포를 SOC 배지 중 37 ℃에서 1시간 배양시키고, 카르베니실린(245 x 245 x 25 mm 플레이트; Nunc)을 함유하는 LB 아가 상에 플레이팅하였다. 2.2 x 10⁶, 1.6 x 10⁶ 및 1.4 x 10⁶ 카르베니실린 내성 형질 전환체를 pDONG61, pDONG62 및 pDONG63으로부터 얻었다. 각 라이브러리로부터 20L, 21L 및 22L로 지칭되는 다수의 랜덤하게 선택된 형질전환체를 PCR 분석(Taq 폴리머라제, 30 싸이클 증폭 온도 프로그램: 95 ℃ 1분, 50 ℃ 1분, 72℃ 1 내지 3분)하고, 이때 pUC119의 멀티플 클로닝 위치를 플랭킹하는 서열 [프라이머 ＃1224 CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC [서열 번호 116] 및 ＃1233 서열 AGCGGATAAC AATTTCACACAGGA [서열 번호 101] (New England Biolabs)을 사용하였다. 결과는 대다수의 클론이 각종 크기의 cDNA-삽입물을 함유하는 것을 나타났다.

(C) 인자 Xa에 기초한 NAP 단백질을 코딩하는 cDNA 클론의 친화도 선택

20L, 21L 및 22L로부터의 파지 입자로부터 다음과 같이 레스큐하였다: 각 라이브러리를 플레이트로부터 스크레이핑하고, 1% 글루코오스 및 100 ㎍/ml 카르베니실린으로 보충된 100 ml LB 배지중 37 ℃에서 60 nm에서의 흡광도가 0.5에 달할 때까지 배양시켰다. 감염 중복도(moi) 20으로 VCSM13 헬퍼 파지(Stratagene)을 추가로 가능한 후에, 배양물을 37 ℃에서 30분간 방치한 다음 다시 30분간 서서히 진탕하였다. 세포를 원심 분리에 의해 펠릿화하고 100 ㎍/ml 카르베니실린 및 50 ㎍/ml 가나마이신으로 보충된 250 ml의 1B 배지에 현탁시켰다. 이 배양물을 격렬히 교반하며 30 ℃에서 밤새 생육하였다. 생성된 파지 입자를 폴리에틸렌 글리콜/NaCl로 2회 연속 침강시켜 정제하고 1 x 10¹³ 비리온/ml로 트리스-완충된 생리식염수(0.05 M 트리스, 0.15 M 염화나트륨, pH 7.4) 중에 재현탁시켰다. 20L, 21L 및 22L로부터의 등량의 파지 입자를 함께 합하였다.

사람 인자 Xa(실시예 1)를 제조자(Pierce)의 지시에 따라 비오틴-xx-NHS로 비오티닐화시켰다. 프로테아제의 아미도 분해 활성은 발색성 기질 S-2765 (Chromogenix; 실시예 1)을 사용한 효소 검정법에 의해 나타난 바와 같이 이러한 변형에 의해 영향받지 않았다. 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드(Dynal; 1 mg/패닝 라운드)를 TBS로 2회 세척하였다.

패닝의 제1 라운드에서, 합한 라이브러리 중의 1 x 10¹³ 파지를 250 nM 비오티닐화 인자 Xa, 5 mM CaCl₂ 및 2% 탈지유로 보충된 TBS 완충액 200 μl 중 4 ℃에서 75분 동안 배양시켰다. 이 시간 후에, 5 mM CaCl₂ 및 2% 탈지유를 함유하는 TBS 200 μl 중에 재현탁된 1 mg의 차단된 스트렙타비딘-코팅 자성 비드를 파지 용액에 가하고 4 ℃에서 온화하게 교반하면서 1시간 동안 배양하였다. 자석(Dynal)으로 자성 비드를 0.1% 트윈-20을 함유하는 500 μl의 TBS로 10회 세정하였다. 결합된 파지를 500 μl의 0.1 M 글리신-HCl 완충액(pH 2.0)과 함께 10분 동안 인큐베이션시켜 자성 비드로부터 용출시켰다. 상등액을 150 μl의 1M 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 중화시켰다.

파지 증식을 위하여, 이. 콜라이 균주 TG1[Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Moleuclar Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Volumes 1 to 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]을 600 nm에서의 흡광도가 0.5에 달할 때까지 10 ml LB 배지 중 37 ℃에서 생육시켰다. 배양물을 자성 비드로부터 용출된 650 μl의 파지로 배양물을 감염시키고 진탕하지 않으면서 37 ℃에서 잠시 인큐베이션시켰다. 원심 분리 후, 감염된 세포를 2 ml LB 배지에 재현탁시키고, 1% 글루코오스 및 100 ㎍/ml 카르베니실린을 함유하는 LB-아가로 충전된 245 x 245 x 25 mm 플레이트상에 깔았다. 37 ℃에서 밤새 배양시킨 후, 세포를 플레이트로부터 스크레이핑하고, 1% 글루코오스 및 100 ㎍/ml 카르베니실린으로 보충된 40 ml LB 배지에 재현탁시켰다. 60 nm에서 15 광학 밀도에 상응하는 세포 분취량을 사용하여 1% 글루코오스 및 100 ㎍/ml 카르베니실린을 함유하는 100 ml LB 배지를 접종하였다. 다음 패닝 라운드를 위한 파지 레스큐는 위와 같이 수행하였다.

제2 패닝 라운드를 위하여, 6 x 10¹² 파지를 2.5 mM Ca²⁺ 및 2% 탈지유를 함유하는 TBS 200 μl 중 1 mg의 차단된 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드와 함께 90분간 인큐베이팅시켰다. 제거 후, 라운드 1과 동일한 프로토콜을 수행하였다. 라운드 3, 4 및 5를 라운드 2에서와 같이 수행하되, 파지 인풋을 2 x 10¹² 파지로 낮추었다.

비오티닐화 인자 Xa에 대한 5 라운드의 패닝 후 분리된 24개의 개개 카르베니실린 내성 클론을 ELOSA에 의해 분석하였다. 스트렙타비딘-코팅된 96-웰 플레이트(Pierce)를 웰 당 2% 탈지유를 함유하는 200 μl의 TBS로 1시간 동안 차단시킨 다음, 웰당 TBS 중 20 nM 비오티닐화 인자 Xa의 100 μl로 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 각 클론에 대하여, 2% 탈지유 및 0.1% 트윈-20을 함유하는 100 ml TBS 중 희석된 약 10¹⁰ 파지를 웰에 가하였다. 2시간 인큐베이션한 후에, 웰을 0.1 % 트윈-20을 함유하는 200 μl TBS로 4회 세정하였다. 결합된 파지를 토끼 항-M13 항 혈청(실시예 11), 알칼라인 포스파타제 결합 항 토끼 혈청(Sigma), 및 p-니트로페닐 포스페이트를 기질(Sigma)과 함께 연속적으로 인큐베이션시켜 시각화하였다. 20분 후, 흡광도를 405 nm에서 측정하였다. 24 클론 중 5개의 클론이 인자 Xa에 강하게 결합하였다. 이러한 파지에 있어서 비오티닐화 인자 Xa를 생략하여 동일한 ELISA로 시험할 때 유의적인 비특이적 결합이 나타나지 않았다.

단일 가닥 DNA를 5개의 양성 클론으로부터 제조하고, 유전자 6에 3'인 삽입물을 프라이머 ＃1224 CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC [서열 번호 116] (New England Biolabs)를 사용하여 자동 DNA 서열화하였다. 다섯 개의 클론 모두는 pDONG63 중 유전자 6의 프레임 내에 융합된 동일한 470 bp 5'-절단 cDNA를 함유하는 것으로 나타났다. 이 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 도 9에 나타내었다(서열 번호 19). AcaNAPc2로 표시된 cDNA는 NAP 이소형 C2로 지칭되는 단백질을 코딩하며, 이는 관련 단백질의 NAP 계열에 속한다.

실시예 11

M13 파지에 대한 항혈청의 제조

M13 파지에 대한 항혈청을 500 μl의 PBS (0.01 M 인산나트륨, pH 7.4 + 0.15M 염화나트륨) 중 약 10¹³ M13K07 파지와 동 부피의 보조제를 피하 주사하여 토끼 중에서 제조하였다. M13K07 파지를 CsCl-정제하였다 [Glaser-Wuttke, G., Keppner, J., and Rasched, I., Biochim. Biophys. Acta, 985: 239-247 (1989)]. 초기 주사는 제0일에 완전 프로인트 보조제를 그리고, 제7, 14 및 35일에 불완전 프로인트 보조제를 사용하여 수행하였다. 항혈청을 42일에 수확하였다.

항혈청의 IgG 분획을 당 분야 공지된 조건을 사용하여 단백질 A-세파로오스 칼럼상을 통과시켜 집적하였다.

실시예 12

안실로스토마 카니눔으로부터 추가의 NAP-코딩 서열을 단리하기 위한 AcaNAP5 및 AcaNAP6 DNA 서열의 용도

AcaNAP5 및 AcaNAP6 cDNA 서열(실시예 2)를 사용하여 교차 혼성화에 의해 동일 기생 종으로부터 관련 분자를 분리하였다.

AcaNAP5 및 AcaNAP6 cDNA를 함유하는 pGEM-9ZF(-) 벡터(Promega, Madison, WI)를 사용하여 성숙 NAP 단백질을 코딩하는 영역을 PCR-레스큐하였다 (Taq 폴리머라제, Life Technologies, Gaithersburg, MD, 20 온도 사이클: 95 ℃ 1분, 50 ℃ 1분, 72 ℃ 1.5분) 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같다: (1) AcaNAP5 및 AcaNAP6을 코딩하는 cDNA C-말단 코딩 서열을 표적으로 하는 서열 TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [서열 번호 88]의 YG109, (2) 성숙 AcaNAP5 및 AcaNAP6의 N-말단 코딩 서열을 표적으로 하는 서열 AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [서열 번호 89]의 YG103. YG109 프라이머는 표적으로서 AcaNAP6과 함께 사용할 때 단일 뉴클레오티드 미스매치를 함유한다(밑줄 T-잔기, 도 3의 서열 번호 5와 비교). 이러한 미스매치는 증폭 효율에 현저한 영향을 미치지 않았다. AcaNAP5 및 AcaNAP6을 위한 정확한 크기의 PCR 생성물(약 230 bp)을 1.5% 아가로오스 겔로부터 분리하였다. 등몰량의 혼합물을 랜덤 프라이머 연장부로 방사성 표지화시키고(T7 QuickPrime 키트; Pharmacia Sweden), Bio-Spin 30 칼럼(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)으로 통과시켰다.

대략 750,000 안실로스토마 카니눔 (Aca)cDNA 클론(실시예 2(B), 듀플리케이트 플라크-리프트 필터는 Hybond^TM-N. Amersham을 사용하여 제조)을 방사성 표지 AcaNAP5 및 AcaNAP6 cDNA 단편으로 스크리닝하고, 이때 다음과 같은 예비 혼성화 및 혼성화 조건을 사용하였다: 5 x SSC (SSC: 150 mM NaCl, 15 mM 트리나트륨 시트레이트), 5 x 덴하르트 용액, 0.5 % SDS, 20 % 포름아미드, 100 ㎍/ml 초음파 처리 어류 정자 DNA(Boehringer). 42 ℃ 철야. 필터를 2 x SSC, 0.1 % SDS 37 ℃에서 30분간 4회 세척하였다. x-선 필름에 노출시킨 후, 총 약 300개의 양성 클론을 찾아냈다.

300개 양성 클론 중 48개를 PCR 증폭(Taq 폴리머라제, 30 온도 사이클: 95 ℃ 1분, 50 ℃ 1분, 72 ℃ 1.5분)시키고, 이때 AcaNAP5 및 AcaNAP6 cDNA의 C-말단 코딩 서열에 특이적인 YG109 프라이머, cDNA 삽입물 위치의 상류에 위치한 람다-gt11 서열을 표적으로 하는 프라이머 ＃1218 (New England Biolabs, Beverly, MA; GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [서열 번호 96]). 48개의 양성 클론 중 31개가 AcaNAP5/6-형 cDNA에 예상했던 것과 유사한 PCR 생성물을 생산했다.

나머지 17개 양성 클론을 프라이머 ＃1218 및 AcaNAPc2 특이적 프라이머(예를 들어, AcaNAPc2 C-말단을 표적으로 하며 서열 GTTTCGAGTT CCGGGATATA TAAAGTCC [서열 번호 117]을 갖는 프라이머, 실시예 10 및 도 9)로 증폭시키기 위한 주형으로 사용하였다. 클론 중 어느 것도 PCR 생성물을 생산하지 않았다. 17개 양성 클론 모두를 보다 낮은 플라크 밀도에서 제2 혼성화시켜 모든 경우 단일 분리 클론들을 얻었다. 17개의 분리된 cDNA 클론을 프라이머 커플 ＃1212/YG109 및 ＃1218/LJ189를 사용할 PCR에 의해 재분석하였다. 17개 중 3개의 클론이 ＃1218/YG109 프라이머로 증폭 생성물을 생산하였다.

나머지 14개의 클론을 프라이머 ＃1218 및 올리고(dT)-NotⅠ (Promega, Madison, WⅠ; 제1 가닥 cDNA를 제조하는데 사용된 프라이머, 실시예 2)로 증폭시키기 위한 주형으로 사용하였다. 모든 14개의 클론이 PCR 생성물을 생산하였다. PCR 생성물을 겔 전기영동 분석한 결과 몇몇 cDNA가 AcaNAP5 cDNA 삽입물보다 상당히 긴 것을 발견하였다.

가장 큰 cDNA 삽입물을 갖는 것을 포함한 10개의 클론을 서열 결정에 선택하였다. 그러한 목적으로 실시예 2에서와 같이 cDNA 삽입물을 pGEM-형 파지미드 (Promega, Madison, WⅠ)상에 SfiⅠ-NotⅠ 단편으로 서브클로닝하였다. 서열화는 다음과 같은 8개의 추가 NAP 단백질 서열을 확인시켰다. AcaNAP23, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP31, AcaNAP44, AcaNAP45, AcaNAP47, 및 AcaNAP48. 두 개의 추가 cDNA 클론, AcaNAP42 및 AcaNAP46은 AcaNAP31 (서열 번호 34)에 의해 코딩되는 것과 동일하였다.

cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 코딩되는 단백질의 추론된 아미노산 서열을 다음과 같이 나타냈다: 도 13A (AcaNAP23 [서열 번호 311]), 도 13B (AcaNAP24 [서열 번호 32]), 도 13C (AcaNAP25 [서열 번호 33]), 도 13D (AcaNAP31 [서열 번호 34]), 도 13 E (AcaNAP44 [서열 번호 35]), 도 13F (AcaNAP45 [서열 번호 36]), 도 13G (AcaNAP47 [서열 번호 37]0, 및 도 13H (AcaNAP48 [서열 번호 38].

모든 클론은 전 길이였으며, 완전한 분비 시그널을 포함하였다. 각각 2개의 NAP 도메인을 포함하는 단백질을 AcaNAP45 (서열 번호 36) 및 AcaNAP47 (서열 번호 37) cDNA가 코텅하였으며, 다른 cDNA는 단일 NAP 도메인을 갖는 단백질을 코딩하였다.

실시예 13

네카토르 아메리카누스로부터의 NAP 단백질을 코딩하는 서열을 분리하기 위한 NAP DNA 서열의 용도

서열, AcaNAP25 [서열 번호 3], AcaNAP6 [서열 번호 5], AcaNAP2 [서열 번호 19], AcaNAP23 [서열 번호 31], AcaNAP24 [서열 번호 32], AcaNAP25 [서열 번호 33], AcaNAP31 [서열 번호 34], AcaNAP44 [서열 번호 35], AcaNAP45 [서열 번호 36], AcaNAP47 [서열 번호 37], AcaNAP48 [서열 번호 38], AcaNAP4 [서열 번호 9], AcaNAP5 [서열 번호 10], AcaNAP7 [서열 번호 11], AcaNAP4 [서열 번호 12], AcaNAP7 [서열 번호 13], AcaNAP5 [서열 번호 14], (도 1, 3, 7, 및 13)를 사용하여 흡혈 기생충 네카토르 아메리카누스로부터 PCR 클로닝에 의해 관련 분자를 분리하였다.

공통 아미노산 서열을 NAP 단백질 중 상동 영역으로부터 산출해 내었다. 이러한 공통 서열을 사용하여 다음과 같은 축퇴성 PCR 프라이머를 설계하였다. 아미노산 서열 NH₂-Lye-Pro-Cys-Glu-(Arg/Pro/Lys)Lys-Cys (서열 번호 118)에 상응하는 NAP-1, 5'-AAR-CCN-TGY-GAR-MGG AAR-TGY-3' [서열 번호 90], 서열 NH₂-Cys-(Val/Ille/Gln)-Cys-(Lys/Asp/Glu/Gln)-(Asp/Glu)-Gly-(Phe/Tyr)-Tyr [서열 번호 119]에 상응하는 이들 프라이머를 쌍으로 사용하여 주형으로 네카토르 아메리카누스 cDNA를 사용한 PCR에 의해 NAP-특이적 프로브를 생산하였다.

성충 엔실로스토마 카니늄를 구입하였다 [ Dr. David Pritchard, University of Nottingham]. Quick Prep mRNA 정제 키트를 사용하여 폴리 (A⁺) RNA를 제조하였다. 1㎍의 mRNA를 AMV 역전사 효소 및 랜덤 헥사머 프라이머(Amersham, Arlington Hills) 반응 생성물중의 15분의 1을 각 NAP-1 및 NAP-4 RC 400 pmole 이하에 대하여 PCR GeneAmp (Perkin Elmer) 시약을 사용하여 퍼킨엘머 DNA 열 사이클러상에 사용하였다. PCR 조건은 사이클 1-3, 96 ℃ 2분간 변성, 37 ℃ 1분간 어닐링, 72 ℃ 3분간 신장 (37 ℃와 72 ℃ 사이의 램프 시간은 2분), 사이클 4-5, 94 ℃ 1분간 변성, 37 ℃ 1분간 어니일링, 및 72 ℃ 2분간 신장 (37 ℃ 및 72 ℃ 사이의 램프 시간은 2분), 사이클 6-45, 94 ℃에서 1분간 변성, 37 ℃에서 1분간 어니일링, 및 72 ℃에서 2분간 신장 신장 시간은 사이클 6-45에 대해 3초/사이클로 증가시켰다.

네카토르 아메리카누스 cDNA의 NAP-1 및 NAP-4 RC 로의 PCR 증폭은 약 100 bP 증폭 생성물을 생산시켰다. PCS 생성물을 랜덤 프라이머 라벨링(Stratageme, La Jolla, CA)을 사용하여 [a-32p]-dCTP (Amersham)으로 표지화하고, 표지된 DNA를 포함되지 않은 뉴클레오티드로부터 크로마스핀-10 칼럼(Clonetech, Palo Alto, CA)을 사용하여 분리하였다.

다음 과정으로 cDNA 라이브러리를 작제하였다. 이중가닥 cDNA를 AMV 역전사효소 및 랜덤 헥사머 프라이머 (Amersham, Arlington Hills, IL)를 사용하여 1 ㎍의 네카토르 아메리카누스 폴리 (A+) RNA로부터 합성하였다. 대략 300bp를 넘는 cDNA 단편을 6% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제하고, 표준 방법으로 EcoRI 링커 (Stratagene, San Diego, CA)에 연결시켰다. 연결된 cDNA를 EcoRI-절단 및 탈포스포릴화 람다 gt-10 (Stratagene)으로 연결시키고, Gigapack Gold II 팩키징 키트 (Stratagene)를 사용하여 패키징하였다.

예비혼성화 및 혼성화 조건은 6 x SSC (SSC:" 150 mM Nacl, 15 ml의 트리나트륨 시트레이트, pH 7.0), 0.02M 인산 나트룸, pH 6.5, 5x 덴하르트 용액, 100 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA, 0.23% 덱스트란 술페이트였다. 예비 혼성화 및 혼성화는 42 ℃에서 수행하고, 필터를 2xSSc로 20분간 예비세척 2회한 후, 2 x SSC로 20분간 예비세척하였다. 필터를 2개의 강화스크린을 갖는 X-선 필름에 -70 ℃에서 밤새 노출시켰다.

랜덤하게 프라이밍된 네카토르 아메리카누스 라이브러리의 대략 400,000개 제조합 파지 (비증폭)를 NAP-1/NAR-4 RC PCR 단편으로 스크리닝하였다. 약 11개의 재조합 파지가 이 프로브에 혼성화되었으며, 그를 4개를 뉴클레오티드 서열 분석을 위해 단리하였다. 히중 가닥 서열화는 이들 파지 단리물중 EcoRⅠ cDNA 단편을 pBluscript II KS+ 벡터 (Stratageme)내로 서브클로닝하여 수행하였다. 시쿼나제 버전 2.0 키트 (Amersham, Arlington Hills, IL)를 사용하고 M13 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 DNA를 서열화하였다.

안실로스토마 카니눔 아롱 및 에이치. 폴리지루스로 부터의 NAP 서열과 유사한 단일 79개 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 4개의 람다 단리물이 함유하였다. 네카토르 아메리카누스로부터의 폴리펩티드는 계산된 분자량 8859.6 달톤을 갖는다. 뉴클레오티드 및 추론된 아미노산 서열은 도 14에 있다.

실시예 14

COS 세포중 제조합 AcaNAP4의 발현

A. 발현

AcaNAP 4를 COS 세포중에서 실시예 5의 프로-AcaNAP5 및 실시예 7의 ProAcaNAP6 에 대하여 기술한 것과 같이 일시적으로 생산하였다.

AcaNAP4 cDNA(실시예 9)를 함유하는 pGEM-형 파지미드는 분비 시그널을 포함한 전체 AcaNAP4 코딩 영역의 PCR-레스큐를 위한 표적으로 기능하였다. 사용된 2개의 XbaI-어펜딩 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같다: (1) 유전자의 5' 말단을 표적으로하여 서열 GACCAGTCTA GACCACCATG GCGGTGCTT ATTCAGTAGC AATA, 서열 번호 120을 갖는 SHPCR4, 및 (2) 유전자의 3' 말단을 표적으로하여 서열 GCTCGCTCTA GATTATCGTG AGGTTTCTGG TGCAAAAGTG [서열 번호 121] 을 갖는 SHPCR 5. 프라이머 중 포함된 XbaⅠ 제한 위치는 밑줄쳐져 있다. 프라이머는 실시예 5에 기술된 조건에 따라 AcaNP4를 증폭하는데 사용되었다.

XbaⅠ 효소로 절단한 후, 예상 크기의 증폭 생성물을 아가로오스 겔로부터 단리하고, pEF-BOS 벡터의 450 bp XbaⅠ 스터퍼 단편으로 대체하였다[Mizushima, S. and Nagata, S., Mucl. Acids Res., 18: 5322 (1990)].

실시예 5의 프로토콜을 이용하여 클론 pEF-BOS-AcaNAP4를 생산하였으며, 이는 프라이머 SHPCR 4 및 YG 60을 사용한 PCR에 의해 목적하는 배향으로된 XbaⅠ삽입물을 함유하는 것으로 나타났으며 서열 결정에 의해 확인되었다. 이 클론을 실시예 5의 방법에 따라 COS 세포를 형질 감염시키는데 사용하였다.

COS 세포 감염 24시간 후에 (실시예 5, 섹션 B), 10 % FBS 함유 COS 배지를 1:1 DMEM: 뉴트리언트 믹스쳐 햄스 F12 (Life Technololgies) 혼합물로 구성된 배지 50 ml로 대체하였다. 세포를 37 ℃에서 더욱 인큐베이션시키고, EGR-인자 Xa 의존성 TF/인자 VIIa 억제 활성의 생성을 실시예 E 에서와 같이 검출하였다.

B. AcaNAP4의 정제

1. 음이온 교환 크로마토그래피

AcaNAP4 발현 세포로 부터의 COS배양 상등액을 1500 rpm (약 500 x g)에서 10분간 원심분리한 후 다음 프로테아제 억제제를 가하였다: 1.0 x 10^-5M 펩스타틴 A(이소발레릴-Val-Val-4-아미노-3-히드록시-6-메틸-헵타노일-Ala-4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵타노산), 1.0 x 10 ^-5M AEBSF (4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐 플루오라이드) 고상 아세트산 나트륨을 최종 농도 50 mM로 가하고, 1NHCl로 pH 5.3으로 조정하였다. 상등액을 0.22 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터를 (Corming Inc.)를 통해 청징화하였다.

청징화된 상등액 (총 부피 약 450 ml)을 음이온 완충액 (0.05 M 아세트산 나트륨 0.1 M NaCl, pH 5.3)으로 예비 평형시킨 Poros 20 HQ(Perseptive Biosystems, MA) 1 x 2 cm 칼럼상에 유속 5 ml/분으로 걸었다. 칼럼과 샘플을 정제 단계를 통해 주위 온도에서 유지하였다. 칼럼을 10 칼럼 부피의 음이온 완충액 및 10칼럼 부피의 50 mM 아세트산 나트룸, 0.37 M NaCl, pH 5.3 으로 세척하였다.

EGR-FXa 의존성 fVIIa/TF. 아미도 분해 억제 활성을 갖는 물질 (실시예 E)을 50 mM 아세트산 나트륨, 1M NaCl, pH5.3 으로 유속 2ml/분으로 용출시켰다.

2. 역상 크로마토그래피

음이온 크로마토그래피 이후 모아진 분획 풀의 분휘량을 0.46 x 25 cm C18 칼럼 (218TP54 Vydac, Hesperi, CA) 상으로 걸고, 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산 중 10-35 % 아세토니트릴 선형 구베로 유속 1ml/분, 아세토니트릴/분 변화율 0.4 %에서 전개하였다. EGR-FXa 의존성 TF/FVIIa 아미도분해 억제 활성 (실시예 E)을 모니터링하고, 활성을 갖는 분획을 분리하여 진공 건조시켰다.

3. 재조합 AcaNAP4의 특성화

AcaNAP4 화합물은 4-20% 겔상에서 SDS-PAGE 이동도를 나타냈으며, 이는 cDNA 서열로부터 예상된 크기와도 일치하였다. (RP-크로마토그래피 gn 쿠마시는 겔을 염색시켰다).

실시예 15

피치아 파스토리스 중 재조합 AcaNAPc2의 생산 및 정제

A. 발현 벡터 작제

피치아 파스토리스 중 AcaNAPc2 유전자의 발현은 실시예 3에서 AcaNAP 5에 대하여 이용한 프로토콜을 사용하되 다음과 같이 변형시켜 사용하였다.

실시예 10의 AcaNAPc2 cDNA 함유 pDONG 63 벡터를 사용하여 성숙 AcaNAPc2 단백질을 코딩하는 영역을 증폭 (PCR-레스큐)에 의해 단리하였다. (벤트 폴리머라제, 20 온도 사이클: 94 ℃ 1분, 50 ℃ 1분, 72 ℃ 1.5분) 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다:

LJ190: AAAGCAACGA-TGCAGTGTGG-TGAG [서열 번호 122]

LJ191: GCTCGCTCTA-GAAGCTTCAG-TTTCGAGTTC-CGGATATAT-AAAGTCC[서열 번호 123]

C-말단 서열을 표적으로하는 LJ191 프라이머는 XbaⅠ 및 HindⅢ 제한 위치(밑줄)를 포함하는 비-어닐링 연장부를 함유하였다.

XbaL 효소 소화한 후, 예상 크기의 증폭 생성물을 겔로부터 분리하고, 효소적으로 포스포릴화시켰다 (T4 폴리뉴클레오티드 키나제, New England Biolabs, Benerly, MA). 키나제를 열 불활성화시킨 후 (70 ℃, 10분), 평활 말단/Xba 단편을 을 발현의 목적으로 벡터 PYAM7SP8 내로 방향에 따라 클로닝하였다. PYAM7SPS로 부터의 수용 벡터-단편을 StuⅠ-SPeⅠ 제한으로부터 제조하고 아가로오스 겔로부터 정제하였다. 이. 콜라이 균주 WK6[R. and Fritz, H.-J., EMBO j., 6: 1809-1815 (1987)]을 연결 혼합물로 형질전환시키고, 암피실린 내성 클론을 선택하였다. 제한 분석에 기초하여 예상 크기의 삽입물을 함유하는 플라스미드 클론 PYAM7SP-NAPC2를 다음의 특성화를 위해 함유하였다. 클론 PYAM7SP NAPC2의 서열 결정은 성숙 AcaNAPc2 코딩영역이 프리프로 리더 시그날과 융합하여 정확히 삽입되고 (작제 스킴에 의해 예상되었던 바이다), 코딩 영역에서의 원하지 않는 돌연변이도 없었다.

B. 피치아 파스토리스 중 재조합 AcaNAPc2의 발현

피치아 파스토리스 균주 GTS115 (his4)는 문헌 [Stroman, D.W. et al., 미국 특허 4,855,231] 에 기재되어 있다. 피치아 파스토리스의 모든 조작을 상기 문헌에 따라 수행하였다.

약 1㎍의 PYAM7SP-NAPC2 플라스미드 DNA를 표준 프로토콜로 GTS115 내로 일렉트로포레이션시켰다. 플라스미드를 미리 Sal Ⅰ 소화로 선형화시켜, 이론상 his 4 염색체 죄위로 중합되도록 하였다.

AcaNAPc2 고발현 균주에 대한 선택은 미니 컬춰 스크리닝을 사용한 NAP 이소형 5 (AcaNAP5)에 대한 실시예3의 방법에 따라 수행하였다. 미니 컬춰를 fVIIa/TF-EGR-fXa 검정법 (실시예 E)을 사용하여 분비된 AcaNAPc2의 존재에 대하여 시험하여 2개의 블론을 선택하였다. 제2 스크리닝 후, 동일 방법을 사용하되 진탕 플라스크 수준에서 하나의 단리된 숙주 세포를 선택하고 피치아 파스토리스 GTS115/ 7SP-NAPc2로 명명하였다.

숙주 세포 GTS115/7SP-NAPc2는 야생형 메탄올 이용성 표현형 (Mut⁺)을 갖는 것으로 나타났으며, 발현 카세트의 염색체 GTS115로의 통합이 게놈 AOX1 유전자의 기능성을 변화시키지 않는 것으로 나타났다.

재조합 AcaNAPc2 물질의 생산은 진탕 플라스크 배양에서도 수행되었다.

재조합 생성물을 하기와 같이 피치아 파스토리스 생성물을 하기와 같이 피치아 파스토리스 세포 상등액으로부터 정제하였다.

C. 재조합 AcaNAPc2의 정제

1. 양이온 교환 크로마토그래피

배양 상등액 (100ml)을 16,000 rpm (약 30,000 x g)에서 20분간 원심분리하고, 1N HCl을 사용하여 pH 3.0으로 조정하였다. 상등액의 전도도를 MilliQ 수를 가하여 10mS/cm 미만으로 감소시켰다. 희석된 상등액을 0.22 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터 (Corming Inc.)를 사용하여 청징화하였다.

상등액 총 부피 (약 500 ml)를 양이온 완충액 (50 mM 시트르산 나트룸, pH 3)으로 예비 평형시킨 Poros 20 HS (Perseptive Viosystems, MA) 1 x 2 cm 칼럼상으로 유속 5 ml/분으로 걸었다. 칼럼과 희석 발효 상등액은 이 정제 전 과정을 통해 실온으로 유지되었다. 칼럼을 50 칼럼 부피의 양이온 완충액 및 10칼럼 부피의 0.1 M NaCl 함유 양이온 완충액으로 세척하였다. 프로트롬비나제 검정에서 억제 활성을 갖는 물질은 2 ml/분의 속도로 1M NaCl 함유 양이온 완충액으로 용출시켰다.

2. 슈퍼덱스 30을 사용한 분자체 크로마토그래피

양이온 교환 칼럼으로부터의 EGR-fXa-fVIIA/TF 억제 물질 (3 ml, 실시예 c)을 함유하는 1M NaCl 용출물을 0.1 M 인산나륨 pH 7.4, 0.15 M NaCl로 예비 평형시킨 슈퍼덱스 30 PG (Pharma Cia, Sureden) 1.6 x 60 cm 칼럼상에서 주위 온도에서 크로마토그래피 하였다. 유속은 2 ml/분으로 하였다. 프로트롬비나제 억제 활성 (실시예 C)은 56-64 ml로 런으로 용출되었으며 합하여졌다.

3. 역상 크로마토그래피

겔 여과 크로마토그래피로 부터의 합한 분획 1 ml를 0.46 x 25 cm C18 칼럼 (218TP54 Vydac, Hesperia, CA) 상에 걸고, 0.1 % (v/v) 트리플루오로아세트산중 10-30% 아세토니트릴 선형 구베로 아세토니트/분 변화율 0.5 %에서 전개하였다. 주된 피크는 20-25 % 아세토니트릴에서 용출되었으며, 이를 수작업으로 합하였으며, 프로트롬비나제 억제 활성을 보였다.

4. 분자량 결정

(1) 내지 (3)에서 분리된 주 성분에 대한 예상 분자량을 일렉트로스프레이 이온화 질량 스펙트럼분석에 의해 결정하였다. 재조합 AcaNAPc2의 예상 분자량은 9640 달톤이었다. 이는 cDNA 서열로부터 유도된 이 분자의 계산된 분자량과 완전히 일치하였다.

실시예 16

피치아 파스토리스 중 AcaNAP42의 발현

AcaNAP4 2 cDNA(실시예 12)를 함유하는 pGEM-9zf(-)벡터(Promega)를 사용하여 PCR 증폭에 의하여 성숙 AcaNAP42 단백질을 코딩하는 영역을 분리하였다. (Taq 폴리머라제, 25 온도 사이클 ; 94℃ 1분 및 72℃ 1분)

다음 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다.

올리고 3: 5'GAG ACTT TTT AAA TCA CTG TGG GAT CAG AAG^3' [서열 번호 124]

올리고 2; 5'TTG AGG ACT AGT TCA TGG TGC GAA AGT AAT AAA^3' [서열 번호 125]

N-말단 서열을 표적으로 하는 올리고 3 프라이머는 Dra Ⅰ제한 위치(밑줄)을 포함하는 비어닐링 연장부를 함유하였다. C-말단 서열을 표적으로 하는 올리고 2 프라이머는 Spe Ⅰ제한 위치를 함유하였다.

대략 예상 크기가 250 bp인 NAP증폭 생성물을 Dra Ⅰ 및 Spe Ⅰ효소로 절단하고, 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜(25:24:1, v/v)로 추출정제하고, 에탄을 중에서 침전시켰다. pYAM75P8(실시예 3)로 부터의 수용 벡터-단편을 StuⅠ-SpeⅠ 제한에 의해 제조하고 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜(25:24:1 v/v)로 추출 정제하고, 에탄을 중 침전시켰다. 이 콜라이 균주 XL1-Blue [Bullock, W,O., Fernande, J.M., and Short, J.M. Biotechniques 5: 376-379 (1980)]를 상기 DNA 단편을 함유하는 연결 혼합물로 형질 전환시키고, 암피실린 내성 클론을 선택하였다.

제한 분석에 기초하여 예상 크기 삽입물을 함유하는 폴리스미드 클론 PSAM 75P8-NAP42를 추가의 특성화를 위해 보유하였다. 클론의 서열 결정은 성숙 코딩 영역이 PH01/α-인자 프리프로 리더 시그널과 융합하여 정확히 삽입되었을 뿐 아니라 코딩 역역 중 원치 않는 돌연 변이도 없음을 확인시켜 주었다.

약 10 ㎍의 pYSM 7SP-NAP42 플라스미드를 실시예 3에서와 같이 피치아 파스토리스 균주GTS115(his 4)내로 일렉트로포레이션시켰다. 플라스미드를 Not Ⅰ 효소로 미리 소화시켜 AOX1 염색체 좌위에 통합되도록 하였다.

His⁺ 형질 전환체를 실시예 3에서와 같이 선택하였다. 일렉트로포레이션으로부터의 단일 콜로니(n=90)를 100 ul의 글리세롤 최소 배지를 함유하는 96-웰 플레이트의 월 중에서 플레이트 진탕기 상 실온에서 24시간 동안 생육시켰다. 1 l의 글리세롤 최소 배지는 13.4 g의 효모 질소 염기 (아미노산 없음. DIFCO), 400 ㎍의 비오틴, 10 ml 글리세롤, 및 10 mM 인산 칼륨 (pH 6.0)을 함유하였다.

세포를 펠릿화하고 신선한 메탄올-최소 배치 (10 ml이 글리세롤이 5 ml 메탄올로 대체된 것을 제외하고 상기와 같은 조성)에 재현탁시켜 AOX1 프로모터를 유도하였다. 실온에서 교반하면서 추가로 24시간 교반한 후에 10 ul의 배양 상등액을 포로트롬빈 시간 검정법 (실시예 B)에 의해 시험하였다. 분비된 AcaNAP42의 존재를 사람 혈청의 응고 시간의 연장에 의해 검출하였다.

실시예 17

피치아 파스토리스 AcaNAPc2/프로린의 변화

AcaNAPc2의 안정성 및 발현 수준을 증가시키기 위해 단백질의 C-말단에 추가의 프롤린 잔기를 코딩하는 돌연 변이 cDNA를 작제하였다. (AcaNAPc2/프롤린 또는 AcaNAPc2P). 발현 벡터 pYAM7SP8-NAPc2/프롤린은 실시예 16과 같은 방법으로 작제되었다. 올리고 8 프라이머는 DraⅠ 제한 위치를 갖는 N-말단 프라이머이고, 올리고 9 프라이머는 C 말단에 하나의 프롤린을 더하는 TGG를 갖는 C-말단 프라이머이다.

올리고 8 : 5'GCG TTT AAA GCA ACG ATG CAG TGT GGT G^3' [서열 번호 126]

올리고 9 : 5'G GCT CTA GAA GCT TCA TGG GTT TCG AGT TCC GGG ATA TAT AAA GTC^3' [서열 번호 127]

증폭 생성물 (약 270 bp)을 Dra Ⅰ및 Xba Ⅰ으로 소화시키고, 정제한 다음 Stu Ⅰ-Spe Ⅰ제한에 의해 제조한 pYAM 7SPS로 부터의 벡터 단편과 연결시켰다. AcaNAP2/프롤린 삽입물을 함유하는 플라스미드 클론을 DNA 서열화에 의해 확인하고 pYAM 7SP8-NAPc2/프롤린으로 명명하였다.

벡터 pYAM 7SP8-NAPc2/프롤린을 사용하여 실시예 16에서와 같이 균쥬 GTS115를 형질전환시켰다. 형질 전환체를 선택하고 실시예 16에서와 같이 생육시켰다. 분비된 AcaNPAc2/프롤린의 생육 배지중의 존재를 사람 혈청 응고시간의 연장으로 검출하였다 (실시예 B).

실시예 18

AcaNAP5, AcANAPc2 및 AcANAPc 2P 정제의 대체법

(A) AcaNAp5

AcaNAP5를 발효 배지로 부터 정제하는 다른 방법은 다음과 같다. 세포를 AcaNAP5를 발현하는 피치아 파스토리스 균쥬 발효액으로부터 제거하고 배지를 동결시켰다. 동결 배지를 4℃에서 밤새 해동시킴으로서 정제 프로토콜을 개시흑, 이를 대략 4부의 MilliQ수로 희석하여 전도도를 8 mS미만으로 감소시켰다. pH를 3.5를 조정하고, 배지를 0.22 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터 (Corning Inc.) 로 여과하였다.

NAP-함유 물질의 활성을 정제 단계 초기 및 각 단계에서 프로트롬빈 시간 응집 검정법을 실시예 B의 프로토콜로 측정하였다.

여과된 배지를 파마시아 SP-패스트 플로우 칼럼에 주위 온도에서 유속 50 ml/분으로 걸고, 칼럼을 10 칼럼 부피의 50 mM시트레이트/포스페이트, pH3.5로 세척하였다. 100 mM NaCl, 250 mM NaCl, 및 1000 mM NaCl (모두 50 mM 시트레이트/포스페이트 pH3.5)로 단계 용출을 수행하였다. PT 활성을 250 mM NaCl 용출물 중에서 검출하였다. 총 용출물을 전도도가 8 mS 미만으로 될 때까지 투석하였다. 아세트산을 사용하여 물질의 pH를 4.5로 조정하고 주위 온도에서 술포에틸 아스파르트아미드 칼럼에 걸었다. 약 10 칼럼 부피의 50 mM 암모늄 아세테이트 pH4.5/40% 아세토니트릴을 사용하여 칼럼을 세척하였다. 칼럼을 50 mM암모늄 아세테이트, pH4.5/40% 아세토니트릴/200 mM NaCl로 용출시키고, 용출물을 이전과 같이 투석 또는 투석 여과 하였다.

용출물을 0.1% TFA로 조정하고 , 주위 온도에서 Vydax C18단백질/펩티드 역상 칼럼에 걸고, 0.1%/TFA/l9% 아세토니트릴, 이어서 0.1% TFA/25% 아세토니트릴로 유속 7 ml/분에서 용출시켰다. NAP를 검출하고, 0.1% TFA/25% 아세토니트릴 용출물로 부터 회수하였다.

(B) AcaNAPc 2 및 AcaNAPc 2P

AcaNAPc2 또는 AcaNAPc2P를 상기한 바와 같이 다음의 변형을 가하여 정제할 수 있다. 배지를 해동하고 희석하여 전도도 8mS미만으로 한 다음, AcaNAPc2 함유 배지의 pH를 NaOH로 pH 5.0으로 조정하였다. 여과된 배지를 주위 온도, 유속 50 ml/분에서 파마시아 Q 패스트 플로우 칼럼에 걸었다. 칼럼을 10 칼럼 부피의 50 mM 아세트산, pH 5.0으로 세척하였다. 100 mM NaCl, 250 mM NaCl 및 1000 mM NaCl (모두 50 mM아세트산 중, pH 5.0)을 사용하여 단계 용출을 수행하였다. 총 용출물을 전도도 8 mS미만으로 될 때까지 투석하고, 상기 개략한 프로토콜을 술포에틸 아스파르타미드 및 RP-HPLC 크로마토 그래피를 이용하여 수행하였다.

실시예 A

인자 Xa 아미도분해 검정법

인자 Xa 촉매 활성의 억제제로서 작용하는 본 발명의 NAP의 활성을 사람 효소에 의해 촉매화되는 아미도 분해 활성의 NAP-유도 억제 (Ki* 값)를 측정하여 평가하였다.

모든 검정법에 사용되는 완충액은 HBSA (10 mM HEPES, pH7.5, 150 mM 염화나트륨, 0.1% 소혈청 알부민)이었다. 모든 시약은 달리 언급이 없는 한 제조원 [Sigma Chemical Co. (St. Louis MO)]으로 부터 구입하였다.

검정은 코닝 마이크로타이터 플레이트 중 적절한 웰에서 50 ul HBSA, 50 ul의 시험 NAP화합물 (HBSA 중 0.0025 - 25 mM 희석, 또는 비억제 속도 측정을 위해 HBSA 단독), 50 ul의 인자 Xa 효소 (HBSA 중 희석, 문헌 Bock, P.E. et al., Archives of Biochem, Biophys. 273: 375 (1989)의 방법에 따라 Enzyme Research Laboratories로 부터 얻은 정제된 사람 인자 X로 부터 제조)를 합하여 수행하였다.

검정전 효소를 최종 농도 0.5 mM이 되도록 HBSA 중에서 희석하였다. 주위 온도에서 30분간 인큐베이션 시킨 후, 50 ul의 기질 S2765(N-α-벤질옥시카르보닐-D-아르기닐-L-글리실-L-아르기닌-P-니트로아닐리드 디히드로클로라이드, Kabi Diagnostica 또는 Kabi Pharmacia Hepar Inc.)를 탈이온수에 용해시켜 HBSA중 희석한 후 월에 가하여 최종 부피 200 ul, 최종 농도 250 μM (Km의 약 5배)로 하였다. 발색성 기질 가수 분해의 초기 속도를 405 nm에서의 흡광도 변화를 부분에 걸쳐 측정하였으며, 이 때 가해진 지질의 5% 미만이 이용되었다 [Thermo Max

Kinetic Microplate Reader (Molecular Devices, Palo alto, CA)].

NAP를 함유하는 억제된 예비평형 정상 상태 속도 (Vi) 대 유리 fXa단독 존재시의 비억제 속도 (Vo)의 배율을 상응하는 NAP 농도에 대하여 플롯팅하였다. 이들 데이타를 밀착 결합 억제제를 위한 방정식에 직접 대입시켜, 겉보기 평형 분리 억제 상수 Ki^*를 계산하였다[Morrison, J.F., and Walsh, C.T., Adv. Enzymol. 61:201-300(1988)].

표 1은 각각 실시예 3,4 및 15에서 제조된 시험 화합물 AcaNAP5 [서열 번호 4]. AcANAP6 [서열 번호 6], 및 AcaNAPc2 [서열 번호 59]의 Ki^*값을 제시한다. 데이타는 AcaNAP5 및 AcANAP6의 사람 FXa의 시험관 내 강력한 억제제로서의 용도를 보여준다. 대조적으로 AcaNAPc2는 FXa 아미도 분해 활성을 효과적으로 억제하지 못하였으며 이는 유리 fXa의 촉매 활성에 영향 주지 않음을 시사한다.

^aNⅠ=억제없음 ; 최대 15% 억제가 1 μM까지 관찰되었다.

실시예 13

프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화된 부분 트롬플라스틴 시간 (aPTT)검정

본 발명의 NAP의 사람 혈청내 생체외 항응고 효과를 각 억제제의 광범위한 농도 범위에서 걸쳐 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)및 프로트롬빈 시간 (PT)의 연장을 측정하여 평가하였다. 신선한 냉동 취합된 정상 시트르산 처리 사람 혈청을 구입하였다 (George King Biomedical, Overland Park, KS). 각각의 aPTT 및 PT 측정은 Coag-A-Mate RA4 자동환 응고 측정기 (Generl Diagnostic, Organon Technica, Okaahoma City, OK)를 사용하고, 제조자의 지시에 따라 응고 개시제로서 각각 시약 (Automated aPTT Platelin? L 시약 (Orgnon Technica, Durham, NC) 및 Simplastic

Excel (Organon Technica, Durham, NC)를 사용하였다.

빠르게 해동된 혈청중에 각 시험 NAP의 희석 계열을 만들고 200 μl 또는 100 μl의 상기 시약을 aPTT 및 PT측정을 위해 검정 캐로우젤의 웰에 가하였다. 다른 방법으로는 NAP를 HBSA로 연속적으로 희석하고, 10 μl의 각 희석액을 Coag-A-Mate 검정 캐로우젤의 웰 중 정상 사람 혈청 100 μl에 가한 다음 시약을 가하였다.

NAP의 농도를 응고 시간에 대하여 플롯팅하고 시간 배가 농도를 계산, 즉, PT 또는 aPTT의 대조 응고 시간의 두배가 되는 특정 NAP농도를 계산하였다. PT 및 aPTT의 대조 응고 시간의 두배가 되는 특정 NAP농도를 계산하였다. PT 및 aPTT 중 대조 응고 시간 (NAP부재)는 각각 12.1초 및 28.5초였다.

표 2는 PT 및 aPTT응고 검정법에서 NAP가 존재하지 않는 대조 검정에 비교하여 사람 정상 혈청의 대조 응고 시간을 배가시키는 농도를 나타낸, AcaNAP5 [서열 번호 4], AcaNAP6 [서열 번호 6], AcaNAPc2 [서열 번호 59] 및 AcaNAP4 [서열 번호 62] 및 Pro-AcaNAP5 [서열 번호 7]의 생체외 항응고 효과를 나타낸다. 데이타는 이들 화합물이 사람 혈청 응고의 강력한 항응고제로서의 이용성을 시사한다. 데이타는 또한 천연 NAP와 재조합 NAP가 대등함을 보여준다.

^a 피치아 파스토리스 중 제조

^b 천연 단백질

^c 피치아 파스토리스 중 ((a) 와는 다른 재조합 배치)

^d COS 세포중 제조

표 10A 및 10B는 또한 PT(도 10A) 및 aPTT (도 10B)의 용량 의존 방식의 NAP-유도된 연장을 보여준다.

실시예 C

프로트롬비나제 억제 활성 검정

생리학적 프로트롬비나제 컴플렉스로 통합된 인자 Xa에 의한 프로트롬빈 활성화 억제제로 작용하는 본 발명 NAP의 능력을 각각의 억제 상수 Ki^*를 측정하여 평가하였다.

미리 형성된 사람 fXa, 사람 인자 Va(FVa) 및 포스포리피드 소낭의 컴플렉스가 먼저 사람 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는, 커플링된 아미도 분해 검정을 이용하여 프로트롬비나제 활성을 측정하였다. 생성된 트롬빈의 아미도 분해 활성을 발색성 기질을 사용하여 동시에 측정하였다. 정제된 사람 FVa를 구입하였다 [Haematologic Technologies, Inc. (Essx Junction, VT)]. 정제된 사람 프로트롬빈을 구입하였다 [Celsus Laboratories, Inc. (Cincinnati, OH)]. 발색성 기질 Pefachrome t-PA(CH₃SO₂-D-헥사히드로티로신-글리실-L-아르기닌-p-니트로아닐리드)를 구입하였다 [Centerchem, Inc. (Tarrytown, NY)]. 기질을 탈이온수 중에 사용전 재생시켰다.

포스파티딜 콜린 (67%, w/w), 포스파티딜 글리세롤 (16%, w/v), 포스파티딜 에탄올아민 (10 %, w/v), 및 포스포리피드 소낭을 세척제 존재하에 제조하였다 [D.J., Rehemtulla, A., and Edgington, T.S. Methods in Ensymology 222: 209-224 (1993)]. 포스포리피드를 구입하였다 [Avanti Polar Lipids, (Alabaster, Alabama)].

3mN CaCl₂를 함유하는 HBSA 중 FVa, FXa 및 포스포리피드 소낭 (PLV)를 10분간 합하여 폴리프로필렌 테스트 튜브 중 프로트롬비나제 컴플렉스를 형성시켰다. 마이크로타이터 플레이트의 적절한 웰 중에, 50 μl의 컴플렉스를 HGSA에 NAP 50 μl 또는 HBSA 단독 (Vo> 비억제 속도 측정)과 함께 두었다. 30분간 실온에서 인큐베이션시킨 후, 사람 프로트롬빈, 트롬빈용 발색성 기질 PefachrometPA를 함유하는 기질 용액에 가하여 삼중 반응을 개시하였다. 총 150 μl의 HBSA중 반응물의 최종 농도는 다음과 같았다: (NAP.025-25 nM), FXa (250 fM), PLV (5 μM), 프로트롬빈 (250 nM), Pefachrome tPA (250 μM, 5X Km), 및 CaCl₂ (3 mM).

fXa의 프로트롬비나제 활성을 실시예 A에서와 같이 정상 상태 조건하에 10분에 걸쳐 405 nm에서의 흡광도 증가 (속도)로서 측정하였다. 흡광도 증가는 시간 경과에 따라 S 자형으로 나타났으며, 이는 Fxa-함유 프로트롬비나제 컴플렉스에 의한 프로트롬빈 활성화 및, 생성된 트롬빈에 의한 Pefachrome tPA의 가수 분해의 커플링된 반응을 나타낸다. 삼중 반응의 각 웰로부터의 데이타를 합하고, 시간의 제곱에 대한 흡광도의 함수로서 선형 최소 스퀘어 분석에 대입하여 프로트롬빈 활성의 초기 속도 (Vi)를 구하였다 [Carsibm S.D. Comput. Prog. Biomed. 19: 151-157 (1985)]. NAP를 함유하는 억제된 정상 상태 초기 속도(Vi)대 프로트롬비나제 fXa 단독의 비억제 속도 (Vo)를 NAP의 상응하는 농도에 대하여 플롯팅하였다. 이들 데이타를 밀착 결합 억제제에 대한 방정식에 대입하여 (실시예 A), 겉보기 평형 분리 억제 상수 Ki*를 계산하였다.

표 3은 프로트롬비나제 컴플렉스내로 혼입된 사람 fXa에 의한 프로트롬빈의 활성에 대한 재조합 AcaNAP5 [서열 번호 4], AcaNAP6 [서열 번호 6], 및 AcaNAPc2 [서열 번호 59] (모두 피치아 파스토리스에서 제조)의 분리 억제 상수(Ki^*)를 나타내고 있다. 이들 데이타는 이들 화합물이 프로트롬비나제 컴플렉스내로 혼입된 사랑 FXa의 억제제로서 이용 가능함을 나타낸다.

실시예 A, B 및 C에 제시된 데이타는 AcaNAP5 및 AcaNAP6이 펩티딜 및 매크로 분자 기질 (프로트롬빈)이 효소의 촉매 중심에 접근하는 것을 직접 제한하는 방식과 유사하게 FXa와 상호 반응할 수 있음을 암시한다. 이와는 대조적으로, AcaNAPc2는 이 효소가 기질 및(또는) 조인자 Va와 매크로분자 상호작용하는 것만을 방해할 뿐 펩티드 기질의 촉매 전환을 직접 억제하지 않는 방식으로 FXa와 상호 작용하는 것으로 나타난다(표 1).

실시예 D

활성 특이성 결정을 위한 시험관내 효소 검정법

본 발명의 NAP가 FXa 촉매 활성 또는 TF/VIIa 활성의 선택적 억제제로서 작용하는 능력을 시험 NAP가 하기 관련된 세린 프로테아제의 농도보다 100배 큰 농도에서 수행되는 검정에서 기타 효소를 억제하는지를 측정하여 평가하였다: 트롬빈, 인자 Xa, 인자 XⅠa, 인자 XIIa, 칼리크레인, 활성화 단백질 C, 플라스민, 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제(rt-PA), 유로키나제, 키모트립신, 및 트립신, 이들 검정법을 사용하여 세린 프로테아제 억제 활성을 갖는 NAP의 특이성을 결정하였다.

(1) 효소 억제 검정을 위한 일반적인 프로토콜

모든 검정법에 사용된 완충액은 HBSA(실시예 A)였다. 모든 기질을 탈이온수 중에서 재생시키고, 검정전 HBSA내로 희석시켰다. 세린 프로테아제 억제의 특이성을 측정하기 위한 아미노분해 검정법을 코닝 마이크로타이터 플레이트의 적절한 웰 중에서, 50 μl의 HBSA, 50 μl의 NAP(HBSA 중에 특정 농도로 희석) 또는 HBSA 단독(비억제 대조속도 Vo), 및 50 μl의 특정 효소(하기 참조)를 조합하여 시험하였다. 주위 온도에서 30분간 인큐베이션시킨 후, 50 μl의 기질을 삼중 웰에 가하였다. 총 부피 HBSA 200 μl 중의 반응물의 최종 농도는 다음과 같았다: NAP(75nM), 효소(750 pM), 및 발색성 기질(하기함). 발색성 기질 가수 분해의 초기 속도는 5분에 걸친 405 nm에서의 흡광도 변화로서 측정하였으며, 가해진 기질 5 % 미만이 가수분해되었다. NAP를 함유하는 시험 샘플의 속도(Vi)를 하기식에 따라 각 효소에 대하여 비억제 대조 속도(Vo)의 퍼센트로서 표현하였다: Vi/Vo x 100.

(2) 특이적 효소 검정

(a) 트롬빈 검정

발색성 기질 Pefachrome t-PA(CH₃SO₂-D-헥사히드로티로신-글리실-L-아르기닌-p-니트로아닐린, Pentapharm Ltd., Basel. Switzerland)를 사용하여 트롬빈 촉매 활성을 측정하였다. Pefachrome PA의 최종 농도는 250 μM(Km의 약 5배)였다. 정제된 사람 α-트롬빈을 구입하였다 [Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN].

(b) 인자 Xa 검정법

발색성 기질 S-2765(N-벤질옥시카르보닐-D-아르기닐-L-글리신-L-아르기닌-p-니트로아닐린, Kabi Pharmacia Hepar, Inc.)를 사용하여 인자 Xa 촉매 활성을 결정하였다. 모든 기질을 사용전 탈이온수에서 재생시켰다. S-2765의 최종 농도는 250 μM(약 Km의 5배)였다. 정제된 사람 인자 X를 구입하고 [Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN)], 이를 활성화하고 인자 X로부터 제조하였다 [Bock, P.E., Craig, P.A., Olson, S.T., and Singh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273:375-388 (1989)].

(c) 인자 XIa 검정

인자 FXIa 촉매 활성을 발색성 기질 S-2366(L-피로글루타밀-L-프로릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린, Kabi Pharmacia Hepar,Framklin, OH)을 사용하여 측정하였다. S-2366의 최종 농도는 750 μM였다. 정제된 사람 FXIa를 구입하였다 [Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN)].

(d) 인자 XIIa 검정법

발색성 기질 Spectrozyme FXIIa(H-D-CHT-L-글리실-L-아르기닐-P-니트로아릴린, American Diagnostica, Greenwich, CT)을 사용하여 인자 FXIIa 촉매 활성을 측정하였다. 스펙트로짐 FXIIa의 최종 농도는 100 μM였다. 정제된 사람 FXIIa를 구입하였다 [Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN)].

(e) 칼리크레인 검정법

발색성 기질 S-2302(H-D-프롤릴-L-페닐알라닐-L-아르기닌-p-니트로아닐린, Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH)를 사용하여 칼리크레인 촉매 활성을 측정하였다. S-2302의 최종 농도는 400 μM였다. 정제된 사람 칼리크레인을 구입하였다[Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN)].

(f) 활성화된 단백질C (aPC)

발색성 기질 SPectrozyme PCa(H-D-라이실-(-Cbo)-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린, American Diagnostica Inc. Greenwich, CT)를 사용하여 활성화된 단백질 C 촉매 활성을 측정하였다. 최종 농도는 400 μM(Km의 약 4배)였다. 정제된 사람 aPC를 구입하였다 [Hematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT)].

(g) 플라스민 검정법

발색성 기질 S-2366(L-피로글루타밀-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린, Kabi Pharmacia Hepar, Franklim, OH)을 사용하여 플라스민 촉매 활성을 결정하였다. S-2366의 최종 농도는 300 μM(Km의 약 4배)였다. 정제된 사람 플라스민을 구입하였다 [Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bendm, IN)].

(h) 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제(rt-PA)

기질 Pefachrome t-PA(CH₂SO₂-D-헥사히드로티로신-글리실-L-아르기닌-p-니트로아닐린, Pentapharm Ltd., Basel, Switzerland)를 사용하여 rt-PA 촉매 활성을 측정하였다. 최종 농도는 500 μM(Km의 약 3배)였다. 사람 rt-PA(Activase)를 구입하였다 [Genentech, Inc. (So. San Fransisco., CA)].

(i) 유로키나제

기질 S-2444 (L-피로글루타밀-L-글리실-L-아르기닌-p-니트로아닐린, Kabi Pharmacia Hepar, OH)을 사용하여 유로키나제 촉매 활성을 결정하였다. S-2444의 최종 농도는 150 μM(Km의 약 7배)이었다. 배양된 사람 신장 세포로 부터 정제된 사람 유로키나제 (Abbokinase)를 구입하였다 [Abbott Laboratories (North Chicago, IL)].

(j) 키모트립신

발색성 기질 S-2586 (메톡시-숙시닐-L-아르기닐-L-프롤릴-L-티로신-p-니트로 아닐린, Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH)를 사용하여 키모트립신 촉매 활성을 결정하였다. S-2586의 최종 농도는 100 μM(Km의 약 8 배)였다. 정제된 (3X-결정화된, CD Ⅰ)소 췌장 키모트립신을 구입하였다 [Worthington Biochemical Corp. (Freehold, NJ)].

(k) 트립신

발색성 기질 S-2222 (N-벤조일-L-이소로이실-L-글루타민[메틸 에스테르]-L-아르기닌-P-니트로아닐린, kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH)를 사용하여 트립신 촉매 활성을 결정하였다. 정제된 사람 췌장 트립신을 구입하였다 [Scripps Laboratories (San Diego, DA)].

표 4는 FXa및 10개의 추가 세린 프로테아제의 재조합 AcaNAP-5 [서열 번호 4] 또는 재조합 AcaNAP-6 [서열 번호 6](둘다 피치아 파스토리스에서 발현)의 아미도 분해 활성 억제를 대조 속도의 %로서 나타낸 것이다. 이들 NAP는 기타 관련된 세린 프로테아제와 비교하여 FXa에 억제에 대한 높은 정도의 특이성을 입중한다.

표 5는 11개의 선택된 세린 프로테아제의 아미도 분해 활성에 대하 재조합

AcaNAPe2 [서열 번호 59] 및 재조합 AcaNAP4 [서열 번호 NO. 62](둘다 피치아 파스토리스에서 발현)의 억제 효과를 기재하고 있다. 이들 데이타는 이들 NAP가 세린 프로테아제에 대한 높은 특이성을 가짐을 나타내다.

실시예 E

fⅦ/IF 컴플렉스의 NAP에 의한 억제 측정 검정법

(1) fⅦ/IF fIX 활성화 검정

이 실시예는 본 발명의 NAP가 생체의 프로트롬빈 시간 검정 (실시예 B)에서 응고 반응의 개시에 주된 역할을 하는 fVII/IF 촉매 컴플렉스의 억제제로서의 능력을 측정한다. rF fVIIa/rTF/PLV 컴플렉스에 의한 삼중 수소화 인자 IX의 활성화는 각각의 고유 억제 상수 Ki^*를 측정하여 평가하였다.

동결 건조, 정제된 재조합 사람 인자 VIIa를 구입하고[BiosPacific, Inc. (Emeruville, CA)], 사용전 HBS(10 mM HEPES, pH7.5, 150 mM 염화나트륨)중에 재생시켰다. 정제된 사람 인자 X를 구입하고 (Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend), 인자 Xa (유리 FXa)를 활성화 시키고 인자 X로부터 제조하였다 (Bock, P.E., Cratug, P.A., OISON, S.T., and Singh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273:375-388 (1989)).

L-글루타밀-L-글리실-L-아르기닐-클로로메틸케톤으로 비가역적 불활성화시킨 활성-위치 차단 사람 인자 Xa를 구입하였다[Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT)]. 재조합시킨 조직 인자 (rTF)를 배큘로 바이러스 발현 시스템으로부터 생산하고, 모노클로날항체 친화도 크로마토그래피로 균질해질 때까지 정제하였다(Corvas International, Inc., San Diego, CA).

정제된 rTF 아포단백질을 세척제 존재하에 포스포티딜 콜린 (75% w/v) 및 포스포티딜 세린 (25 % w/v)로 구성된 포스포리피드 소낭 (rTF/PLV)내로 혼입시켰다[Ruf, W., Miles, D.J., Rehemtulla, A., and Edgington, T.S. Methods in Enzymology 222: 209-224 (1993)]. 인지질을 구입하였다(Avanti Polar Lipids, (Alabaster, Alabama). 모든 검정에 사용된 완충액은 HNSA, 즉 소 혈청 알부민을 0.1% (w/v)함유하는 HBS였다. 모든 시약을 달리 언급이 없는 한 제조원 (Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO))으로 부터 구입하였다.

rFVIIa/rTF 컴플렉스에 의한 사람 3H-인자 IX(FIX)의 활성화를 방사성 표지화 활성화 펩티드의 방출을 측정하여 모니터링하였다. 정제된 사람 fIX를 구입하고 {Essex Junction, VT, Haematologic Technologies, Inc.], 환원적 삼중수소화에 의해 방사성 표지하였다 (Van Lenten ＆ Ashwell, 1971, JBC 246, 1889-1894).

생성된 FIX의 삼중수소화 제제는 면역 고갈 FIX결핍 혈청 (orth O)중에서 측정했을 때 194 응고 단위/mg을 가졌으며 97 %의 활성을 보유하였다. 방사특이적 활성은 2.7 × 10⁸ dpm/mg이었다. rFVIIa/rTF/PLV 에 의한 3H-FIX활성화에 대한 Km은 25nM이었으며, 이는 비처리된 (비표지)FIX에 대해 얻어진 Km과 대등하였다.

Ki*결정에 대한 검정은 다음과 같이 수행되었다 : rFVIIa/IPLV를 폴리프로필렌 시험 튜브 중에서 합하고, 5 mM CaCl₂ 함유 HBSA 중에서 10분간 방치하여 컴플렉스를 형성하도록 하였다. rFVIIa/rTF/PLV 컴플렉스의 분취량을 적절한 폴리프로필렌 마이크로 원심분리 튜브에서 포함되는 경우 EGR-FXa 또는 유리 FXa 및 각종 농도의 NAP 시험 화합물(HBSA에 희석한 후) 또는 HBSA 단독(Vo. 비억제 대조 속도)과 함께 두었다. 주위 온도에서 60분 배양시킨 후, 반응을 ³H-FIX를 가하여 개시시켰다. 420 μl HBSA 중 반응물 최종 농도는 다음과 같았다: rFVIIa [50 pM], rTF [2.7 nM], PLV [6.4 마이크로몰], 또는 EGR-FXa 또는 유리 FXa [300 pM], 재조합 NAP [5-1,500 pM], ³H-FIX [200 nM], 및 CaCl₂ [5 mM]. 또한, rFVIIa를 제외한 상기 반응물 모두를 포함하는 백그라운드 대조 반응을 수행하였다.

특정 시간 (8, 16, 24, 32 및 40분)에서, 80 μl의 반응 혼합물을 반응을 종결시키기 위하여, HBS 중 0.5% BSA와 함께 동 부피의 50 mM EDTA를 함유하는 에펜도르프 튜브에 가하였다. 여기에 160 μl의 6%(w/v) 트리클로로아세트산을 가하였다. 단백질을 침전시키고, 4 ℃ 16,000 x g에서 6분간 원심분리시켜 상등액으부터 분리하였다. 생성된 상등액에 함유된 방사 활성을 scinfiverse BD(Fisher Scientific, Fairlawn, NJ)에 가해진 삼중수소화 분취량을 제거하고 측정하고, 액체 신틸레이션 카운팅으로 정량하였다. 활성화의 대조 속도를 정상 상태 조건하에 시간 경화에 따라 방출되는 가용성 카운트를 선형 회귀 분석하여 결정하였으며, 삼중 수소화 FIX의 5 % 미만이 소비되었다. 백그라운트 콘트롤 (<대조 속도의 0.1%)을 모든 샘플로부터 삭감하였다. NAP 존재하에 rFVIIa/TF 단독의 비억제 대조 속도(Vo)에 대한 억제된 정상 상태 속도(Vi) 의 비를 상응하는 NAP 농도에 대하여 플롯팅하였다. 이들 데이터를 밀착 결합 억제제에 대한 방정식에 직접 대입시키고 이로부터 겉보기 평형 분리 억제 상수 Ki*를 계산하였다 [Morrison, J.F., and Walsh, C.T., Adv. Enzymol. 61:201-300 (1988)].

재조합 AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAPc2, 및 AceNAP4에 대한 데이타를 하기 표 6에 나타내었다.

(2) 인자 VIIa/조직 인자 아미도분해 검정

본 발명의 NAP가 fVIIa/TF 컴플렉스의 아미도 분해 활성의 억제제로서 작용하는 능력을 활성 위치-차단된 사람 인자 Xa(EGR-fXa)의 존재 또는 부재하에 각각의 억제 상수 Ki^*를 결정하여 평가하였다.

rFVIIa/rTF 아미도 분해 활성을 발색성 기질 S-2288(H-D-이소로이실-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린, Kabi Pharmacia Hepar, Inc. Franklin, OH)을 사용하여 측정하였다. 기질은 사용전 탈이온수 중에서 rFVIIa와 rTF/PLV를 폴리프로필렌 시험 튜브에서 합하여 3 mM CaCl₂를 함유하는 HBSA 중 10분간 컴플렉스를 형성하도록 방치하였다. Ki^* 결정을 위한 검정을 코닝 마이크로타이터 플레이트의 적절한 중에서 50 μ1의 rFVIIa/rTF/PLV 컴플렉스, 50 μl의 EGR-FXa, 및 50 μl의 각 농도의 NAP 시험 화합물(HBSA 희석) 또는 HBSA 단독(V. 비억제 속도 측정)을 합하여 수행하였다. 주위 온도에서 30분 인큐베이션시킨 후, 삼중 반응을 05 μl의 S-2288을 가하여 개시하였다. 총 200 μ1의 HBSA 중 반응물의 최종 농도는 다음과 같았다: 재조합 NAP(0.025-25 nM), rFVIIa(750 pM), rTF(3.0 nM), PLV(6.4 μM), EGR-FXa(2.5 nM) 및 S-2288 (3.0 mM, 3 x Km)

rFVIIa/rTF/PLV의 아미도 분해 활성을 10분에 걸쳐 405 nm에서의 선형 흡광도 증가(속도)로서, 정상 상태 조건하에 판독기[Thermo Max

Kinetic Microplate Reader )Molecular Devices, Palo Alto, CA]를 사용하여 측정하였으며, 기질의 5% 미만이 소비되었다. 유리 fXa 단독(Vo) 존재하의 비억제 속도에 대한 NAP 존재하의 억제된 예비 평형 정상 상태 속도(Vi)의 비율을 상응하는 NAP 농도에 대하여 플롯팅하였다. 이들 데이터를 실시예 E.1에서 사용된 밀착 결합 억제제에 대하 방정식에 직접 대입하여, 겉보기 평형 해리 억제 상수 Ki^*를 계산하였다.

표 6은 rFVIIa/rTF 활성의 억제 검정법 중 재조합 AcaNAPc2 [서열 번호 59], AceNAP4 [서열 번호 62], AcaNAP5 [서열 번호 4], 및 AcaNAP6 [서열 번호 6](피치아 파스토리스 중에서 제조)의 Ki^* 값을 나타낸다. 데이타는 유리 FXa 또는 활성 위치-차단 FXa의 부재 또는 존재하에 사람 rFVIIa/rTF/PLV 컴플렉스의 강력한 억제제로서의 AcaNAPc2 및 AcaNAP4의 용도를 나타낸다. AcaNAPc2P(실시예 17)의 시험관내 활성은 AcaNAPc2와 실질적으로 동일하다.

NI = 억제 없음

ND = 측정하지 않음

실시예 F

NAP 활성의 생체내 모델

(1) FeCl₃-유도된 혈소판-의존성 동맥 혈전증의 래트 모델에 있어서 항혈전 활성의 평가

NAP의 항혈전(혈전 형성의 방지) 특성을 급성 혈관 혈전증의 확립된 실험 래트 모델을 사용하여 평가하였다.

래트 FeCl₃ 모델은 혈소판 의존성 동맥 혈전증의 잘 특성화된 모델로서 효능 있는 항혈전 화합물을 평가하는데 사용되어 왔다 [kurz, k. D., Main, B. W., and Sandusky, G. E., Thromb. Res., 60: 269-280 (1990)]. 이 모델에서, 혈소판이 풍부한 폐색성 혈전이 필터 종이 조각에 흡착된 신선한 FeCl₃ 용액으로 국소적으로 처리된 래트 경동맥의 절편중에 형성된다. FeCl₃ 는 처리된 동맥 절편으로 확산되어 혈관 표면의 탈내피화를 초래하는 것으로 알려졌다. 이는 혈액을 다시 내피 하층 구조에 노출시켜 혈소판 흡착, 트롬빈 형성 및 혈소판 응집을 일으킨다. 결과는 폐색성 혈전의 형성이다. FeCl₃적용후의 폐쇄성 혈전 형성에 미치는 시험화합물의 효과를 초음파 유동측정 모니터링하고, 1차 종말점으로 사용한다. 경동맥 혈류 측정을 위한 유동 측정의 사용은 응집적 형성의 열 검출이 사용된 원래 과정의 변형이다 [kurz, K. D., Main, B. W., and Sandusky, G. E., Thromb. Res., 60: 269-280 (1990)].

(a) 정맥내 투여

수컷 할란 스프라그 돌리 래트 (420-450 g)을 사용 적어도 72시간 전에 순응시키고, 외과 처리 전 12시간 동안 물은 자유로이 먹게 하되 공복시켰다. 동물을 준비하여 넴부탈로 마취시킨 다음 혈압 모니터링, 약물 및 진통제 전달을 위하여 카테테르를 삽입하였다. 좌측 경동맥을 중앙 경부 절개에 의해 분리하다. 블런트 절개 및 스프레딩 (spereading) 기술에 의해 경동백 쉬스로부터 혈관의 2cm 절편을 분리하였다. 분리된 혈관의 중앙 및 말초 말단 아래에 실크 봉합사를 삽입하여 혈관의 중앙 말달 부근에 초음파 플로우 프로브 (Trasonic)의 위치를 명확히 하였다. 프로브를 스테이셔너리 암 (stationary arm)으로 고정시켰다.

외과 처리 후 동물을 랜덤하게 대조 (생리식염수) 또는 처리 (재조합 AcaNAP5)군으로 나누었다. 시험 화합물 (피치아 파스토리스에서 실시예 3에 따라 제조)를 플로우 프로브를 넣은 후 혈전 형성 자극전에 표 7에 나타낸 용량으로 단일 정맥내 거환으로서 투여하였다. t=0 시간에서, 10 ㎕의 35 % 신선한 FeCl₃ 용액 (물에서 만들어짐)으로 침지시킨 3 mn 직경 여과지 조각 (Whatm an ＃3)을 플로우 프로브에서 먼 분리된 경동맥 절편에 가하였다. 혈압, 혈류, 심박율, 및 호흡을 60분 동안 모니터링하였다. 폐색의 발생 (혈류가 0을 기록함)을 1차 종말점으로 기록하였다.

이러한 생체내 모델에서 혈전 형성을 방해하는 항혈전제로서의 AcaNAP5 (서열 번호 4)의 효능은, 표 7에 나타낸 바와 같이, 혈전 폐색 발생에 있어서의 용량 의존성 감소에 의해 입증되었다.

*-p≤0.05, 피셔(Fisher) 시험에 의해 생리식염수 대조로부터

이 모델에서 혈전 폐색을 50% 방지하는 효과 용량 (ED₅₀)을 폐색 발생 대 투여 용량을 플롯팅하여 상기 데이타로부터 결정할 수 있다. 이는 AcaNAP5의 항혈전 효능을 상기한 바와 같이 이 모델로서 이미 평가한 다른 항혈전제와 직접적으로 비교할 수 있도록 해 준다. 표 8은 이 모델에서 AcaNAP5에 비교한 몇몇 잘 공지된 항응고제의 ED₅₀ 값을 기재하고 있다.

a: ED₅₀은 시험된 동물 50 %에서 완전한 혈전 폐색 발생을 방지하는 용량으로 정의됨

b: 재조합 Tick 항응고 펩티드 [Vlasuk et al. Thromb. Haemostas. 70: 212-216 (1993)]

(b) 피하 투여

피하 투여 후 저분자량 헤파린 (Enoxaparin; Lovenox, Rhone-Poulenc Rorer)에 비한 AcaNAP5의 항혈전 효과를 FeCl₃ 모델을 사용하여 래트에서 평가하였다. 모델을 상기한 바와 같이 처리하되, 화합물을 피하로 투여하고 효능을 2가지 다른 시간, 즉, 투여한지 30분 및 150분에서 측정하였다. 이를 수행하기 위하여, 양 경동맥을 연속적으로 사용하였다. 이 실험의 결과는 AcaNAP5 (서열 번호 4)가 피하 투여 후 생체내 효과적인 항혈전제임을 나타낸다. 결과는 표 9에 나타나있다:

a: ED₅₀은 시험된 동물 50 %에서 완전한 혈전 폐색 발생을 방지하는 용량으로 정의됨.

(2) 깊은 상처 출혈 측정

깊은 상처 출혈 모델을 사용하여 출혈에 대한 NAP의 효과를 측정하고, 효과를 저분자량 헤파린의 효과와 비교하였다.

수컷 래트를 마취시키고 FeCl₃ 모델과 같은 방식으로 기구로 처리하였다. 그러나, FeCl₃를 경동맥에 가하지는 않았다. 경동맥을 노출시키는 깊은 외과적 상처를 목에 내고, 이를 시간에 따른 혈액 손실을 정량화하는데 사용하였다. AcaNAP5 또는 LMWH를 피하 투여한 후 3.5 시간에 걸쳐 혈액 손실을 측정하였다. 상처를 외과용 스폰지로 싸고 매 30분마다 제거하였다. 스폰지를 적혈구 세포를 용해시키고, 헤모글로빈과 발색 반응하는 드랩킨 (Drabkin)의 시약 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 중에 침지시켰다. 발색된 샘플을 550 nM에서의 흡광도를 측정하여 정량함으로써 스폰지중 혈액의 양을 결정하였다.

양 시험 화합물에 대한 용량 반응 특성이 양 시험 화합물에 대한 효능 데이타와 함께 도 5에 나타나 있다. AcaNAP 5(서열 번호 4)는 이 모델에 있어서 저분자량 헤파린 보다 페색성 동맥 혈정 생성을 예방하는데 훨씬 효능적이었다. 더우기 NAP로 처리한 동물은 저분자량 헤파린으로 처리한 것보다 출혈이 덜했다.

표 7 및 9 및 표 15에 나타낸 데이타는 이 실험 모델에서 폐색성 혈전 형성을 예방하는 NAP의 효과를 확실히 입증한다. 이러한 데이타와 사람 혈전증 방지와의 관련성은 표 8에 제시된 다른 항응고제와 비교할 때도 명확하다. 이러한 제제는 동일한 실험 모델을 사용하여, NAP에 대하여 기재한 것과 동일한 방법으로 평가되었으며, 임상적으로 혈전 형성을 방지하는 항혈전 효능을 입증한 것이었다 [Heparin-Hirsh, J. N. Engl. J. Med 324:165-1574 1992, Cairns, J.A. et al. Chest 102; 456S-481S(1992); Argatroban-Gold, H.K. et al. J. Am. coll. Cardiol. 21: 1039-1047(1993); and Hirulog^TM-Sharma, G.V.R.K. et al. Am. J. Cardiol. 72: 1357-1360(1993) and Lidon, R.M. et al.. Circulation 88: 1495-1501(1993)].

실시예 G

급성 관성 동맥 혈전증의 돼지 모델

이러한 연구에 사용된 프로토콜은 이전에 보고된 혈전증 모델의 변형이다 (Lucchesi, B.R., et al., (1994), Brit. J. Pharmacol. 113;1333-1343).

동물을 마취시키고 동맥 및 정맥 카테테르(좌측 통상의 경동맥 및 외부 경정맥)를 삽입하였다. 4번째 늑간에서 흉부 절개하여 심장을 노출시켰다. 좌측 전방 하강(LAD) 관상 동맥을 그위의 연결 조직으로 부터 분리하고 도플러(Doppler) 플로의 프로브와 17게이지 스테노시스를 설치하였다. 혈관안에 양극성 전극을 설치하였다.

베이스라인을 측정하고, 시험될 NAP 또는 위약을 외부 결정맥을 통하여 투여하였다. 투여한 지 5분 후, 직류(300 μA, DC)를 자극 전극에 가하여 관상 동맥 내피에 동맥내막 손상을 개시하고 혈전 형성을 개시시켰다. 전류를 3시간 동안 계속시켰다. 동물을 전류를 끊은 지 1시간 후 또는 동물이 죽을 때 까지 중 빠른 것까지 계속 관찰하였다.

표 10은 3가지 증가되는 NAP 용량에서 AcaNAP 5 또는 AcaNAPc2P를 투여한 동물에서 페색의 발생을 입증하는 데이타를 제공한다. 위약을 투여 받은 동물에서 폐색 발생은 8/8(100%)였다. 위약 처리 동물에서 폐색으로 까지의 시간은 66.6±7.5분(평균±표준 오차)이었다. AcaNAP 처리된 돼지에서 관찰 4시간 동안 폐색을 일으키지 않은 혈관에 폐색 240분 까지의 임의의 시간을 배당하여 통계학적 비교를 간편화하였다.

데이타는 AcaNAP5와 AcaNAPc2P가 이러한 세팅에서 유사하게 효과적임을 나타내며, 두 경우 모두 관상 동맥 폐색 까지의 시간을 용량 의존성 방식으로 연장시킴을 알 수 이었다. 더우기, 두 분자 모두 용량 0.03 mg/kg(정맥내)에서 관상 동맥 페색까지의 시간을 상당히 증가시켰으며 출혈에 있어서의 증가를 나타내지 않았다. 이러한 데이타 및 기타 데이타는 AcaNAP5 및 AcaNAPc2P가 유리한 치료 용도를 가짐을 시사한다.

^* P<0.05, 생릭식염수(8/8), 피셔의 추출물(Fisher's Exact); ^*p<0.05, 생리식염수, 던네트(Dunnett)의 다중비교 시험.

Claims (18)

1. AcaNAP5 [서열 번호 40] 및 AcaNAP6 [서열 번호 41]로 구성된 군으로부터 선택되는, 항응고 활성을 갖는 단리된 단백질.
2. 제1항의 단백질을 포함하는 혈액 응고 방지용 제약 조성물.
3. 제1항의 단백질 중 임의의 것을 암호화하는 cDNA 분자.
4. AcaNAPc2 [서열 번호 59]인, 항응고 활성을 가지는 단리된 단백질.
5. 제4항의 단백질을 포함하는 혈액 응고 방지용 제약 조성물.
6. 제4항의 단백질을 암호화하는 cDNA 분자.
7. AcaNAP5 [서열 번호 40], AcaNAP6 [서열 번호 41], AcaNAP48 [서열 번호 42], AcaNAP23 [서열 번호 43], AcaNAP24 [서열 번호 44], AcaNAP25 [서열 번호 45], AcaNAP44 [서열 번호 46], AcaNAP31 [서열 번호 47], AcaNAP45 [서열 변호 63] 및 AcaNAP47 [서열 번호 64]로 구성된 군으로부터 선택된 항응고 활성을 갖는 단리된 단백질.
8. 제7항의 단백질 중 임의의 것을 포함하는 혈액 응고 방지용 제약 조성물.
9. 제7항의 단백질 중 임의의 것을 암호화하는 cDNA 분자.
10. HpoNAP5 [서열 번호 60] 및 NamNAP [서열 번호 61]로 구성된 군으로부터 선택된 항응고 활성을 갖는 단리된 단백질.
11. 제10항의 단백질 중 임의의 것을 포함하는 혈액 응고 방지용 제약 조성물.
12. 제10항의 단백질 중 임의의 것을 암호화하는 cDNA 분자.
13. AceNAP4 [서열 번호 62], AduNAP7 [서열 번호 65], AduNAP4 [서열 번호 55], AceNAP5 [서열 번호 57] 및 AceNAP7 [서열 번호 58]로 구성된 군으로부터 선택되는, 항응고 활성을 갖는 단리된 단백질.
14. 제13항의 단백질 중 임의의 것을 포함하는 혈액 응고 방지용 제약 조성물.
15. 제13항의 단백질 중 임의의 것을 암호화하는 cDNA 분자.
16. AcaNAPc2 [서열 번호 59]의 카르복시 말단에 프롤린이 부가된 아미노산 서열을 갖는, AcaNAPc2/프롤린인 항응고 활성을 갖는 단리된 단백질.
17. 제16항의 단백질을 포함하는 혈액 응고 방지용 제약 조성물.
18. 제16항의 단백질을 암호화하는 cDNA분자.

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