PT788546E - Inibidores de serina-proteases e proteínas anti-coagulantes extraídos de nemátodos - Google Patents

Description

ΡΕ0788546 1 DESCRIÇÃO "INIBIDORES DE SERINA—PROTEASES E PROTEÍNAS ΑΝΤΙ— COAGULANTES EXTRAÍDOS DE NEMÁTODOS"

Campo do Invento 0 presente invento está relacionado com proteínas específicas, assim como com versões recombinantes destas proteínas que são inibidoras de serina-proteases, incluindo anticoagulantes potentes de plasma humano. Estas proteínas incluem determinadas proteínas extraídas de nemátodos. Num outro aspecto, o presente invento está relacionado com composições compreendendo estas proteínas, as quais são úteis como inibidores potentes e específicos das enzimas de coagulação do sangue in vitro e in vivo, e métodos para a sua utilização como agentes de diagnóstico in vitro, como agentes terapêuticos in vivo, para prevenir a coagulação de sangue. Num outro aspecto, o invento está relacionado com sequências de ácido nucleico, incluindo mRNA e DNA, codificadoras das proteínas e sua utilização em vectores para transfectar ou transformar células hospedeiras e como sondas para isolar determinados genes relacionados noutras espécies e organismos.

Fundamento e Introdução ao Invento A hemostasia normal é o resultado de um equilí- 2 ΡΕ0788546 brio delicado entre os processos de formação de coágulos (coagulação do sangue) e dissolução de coágulos (fibrinó-lise). As interacções complexas entre as células do sangue, proteínas específicas do plasma e a superfície vascular, mantêm a fluidez do sangue a menos que ocorram lesões. A destruição da barreira endotelial que forra a parede vascular expõe o tecido subjacente a estes componentes do sangue. Isto por sua vez desencadeia uma série de reacções bioquímicas alterando o equilíbrio hemostático em favor da coagulação do sangue, podendo resultar na formação pretendida de uma rolha hemostática estancando a perda de sangue ou na formação indesejável de um trombo intravascular oclusivo resultando na ausência reduzida ou completa do fluxo sanguíneo ao órgão afectado. A resposta de coagulação sanguínea é o culminar de uma série de reacções amplificadas em que vários zimog-énios específicos de serina-proteases no plasma são activados por proteólise limitada. Esta série de reacções resulta na formação de uma matriz insolúvel, composta por fibrina e componentes celulares, que é necessária para a estabilização da rolha ou trombo hemostático primário. A iniciação e propagação das reacções de activação proteolítica ocorrem através de uma série de vias de amplificação localizadas nas superfícies membranares no local da lesão vascular (Mann, K.G., Nesheim, M.E., Church, W.R., Haley, P. e Krishnaswamy, S. (1990) Blood 76_:1-16 e Lawsnon, J.H., Kalafatis, M., Stram, S., e Mann, K.G. (1994) J. Biol. Chem. 269:23357-23366). 3 ΡΕ0788546 A iniciação da resposta de coagulação sanguínea à lesão vascular segue a formação de um complexo catalítico composto pela serina-protease factor Vila e pelo co-factor não enzimático, factor tecidular (TF) (Rappaport, S.I. e Rao, L.V.M. (1992) Arterosclerosis and Thrombosis 1_2: 1112-1121). Esta resposta parece ser exclusivamente regulada pela exposição de TF subendotelial a níveis vestigiais circulantes do factor Vila e do seu factor zimogénio VII, após uma quebra focal na integridade vascular. A auto-activação resulta num aumento no número de complexos factor VIIa/TF que são responsáveis pela formação da serina-protease factor Xa. Crê-se que, para além do complexo factor VIIa/TF, a pequena quantidade do factor Xa que se forma inicia a resposta de coagulação através da modificação protelítica do factor IX para factor IXaifa que, por sua vez, é convertido na serina-protease activa factor IXabeta pelo complexo factor VIIa/TF (Mann, K.G., Krishnaswamy, S. e Lawson, J.H. (1992) Sem Hematology 2_9:213-226) . É o factor IXabeta, complexado com o factor VlIIa activado, que parece ser responsável pela produção de quantidades significativas do factor Xa que, subsequentemente, catalisa o penúltimo passo na cascata de coagulação do sangue; a formação da serina-protease trombina. 0 factor Xa catalisa a formação de trombina após montagem do complexo protrombinase que é composto pelo factor Xa, o cofactor não enzimático Va e o substrato protrombina (factor II) formado, na maior parte dos casos, 4 ΡΕ0788546 na superfície das plaquetas activadas aderentes ao local da lesão (Fuster, V., Badimon, L., Badimon, J.J. e Chesebro, J.H. (1992) New Engl. J. Med. 326:310-318). Na vasculatura arterial, a "explosão" amplificada resultante da geração de trombina catalisada por protrombinase causa localmente um nível elevado desta protease que é responsável pela formação de fibrina e pelo recrutamento adicional de plaquetas, assim como a estabilização covalente do coágulo através da activação da transglutaminase zimogénio factor XIII. Ainda, a resposta de coagulação é posteriormente propagada através da retro-activação proteolítica, mediada por trombina, dos cofactores não enzimáticos V e VIII resultando em mais formação de protrombinase e subsequente geração de trombina (Hemker, H.C. e Kessels, H. (1991) Haemostasis 21:189-196).

Demonstrou-se que as substâncias que interferem no processo de coagulação sanguínea (anticoagulantes) são agentes terapêuticos importantes no tratamento e prevenção de alterações trombóticas (Kessler, CM. (1991) Chest 9_9:97S-112S e Cairns, J.A, Hirsch, J., Lewis, H.D., Resnekov, L., e Theroux, P. (1992) Chest 102:456S-481S) . Os anticoagulantes clínicos actualmente aprovados têm sido associados a uma série de efeitos adversos devido à natureza relativamente não específica dos seus efeitos na cascata de coagulação sanguínea (Levine, M.N., Hirsch, J., Landefeld, S., e Raskob, G. (1992) Chest 102:325S-363S). Isto estimulou a pesquisa de agentes anticoagulantes mais eficazes que possam eficazmente controlar a actividade da 5 ΡΕ0788546 cascata de coagulação, ao interferir selectivamente com reacções especificas neste processo, podendo ter um efeito positivo na redução de complicações da terapia anticoagulante (Weitz, J., e Hirsh, J. (1993) J. Lab. Clin. Med. 122:364-3 73) . Num outro aspecto, esta pesquisa focou-se em proteínas humanas normais que servem como anticoa-gulantes endógenos no controlo da actividade de cascata da coagulação sanguínea. Ainda, vários organismos hematófagos foram investigados devido à sua capacidade para eficazmente anticoagularem a refeição sanguínea após alimentação nos seus hospedeiros, sugerindo que evoluíram estratégias anticoagulantes eficazes que podem ser úteis como agentes terapêuticos.

Uma proteína do plasma, Inibidor da Via do Factor Tecidular (TFPI), possui três domínios de Kunitz consecutivos e foi descrita como inibindo a actividade enzimática do factor Xa directamente e, numa forma dependente do factor Xa, inibe a actividade enzimática do complexo factor Vlla-factor tecidular. Salvensen, G., e Pizzo, S.V., "Proteinase Inhibitors: a-Macroglobulins, serpins, and Kunis", "Hemostasis and Thrombosis, Terceira Edição, pp. 251-253, J.B. Lippincott Company (Edit. R.W. Colman et al. 1994). Uma sequência de cDNA codificadora de TFPI foi descrita e a proteína clonada foi referida como tendo um peso molecular de 31950 daltons e contendo 276 aminoácidos. Broze, G.J. e Girard, T.J., Patente U.S. N° 5106833, col. 1, (1992). Foram descritas várias proteínas recombinantes derivadas de TFPI. Girard, T.J. e Broze, 6 ΡΕ0788546 G.J., ΕΡ 439442 (1991); Rasmussen, J.S. e Norfand, O.J., WO 91/02753 (1991); e Broze, G.J. e Girard, T.J., Patente U.S. N° 5106833, col. 1, (1992) . A antistasina, uma proteína constituída por 119 aminoácidos e encontrada na glândula salivar da sanguessuga Mexicana, Haementeria officinalis, foi descrita como inibindo a actividade enzimática do factor Xa. Tuszynski et ai., J. Biol. Chem., 262:9718 (1987); Nutt, et ai., J. Biol. Chem., 263:10162 (1988). Uma proteína recombinante de 6000 daltons contendo 58 aminoácidos, com um elevado grau de homologia com os aminoácidos do extremo amina de antistasina 1 a 58, foi descrita como inibindo a actividade enzimática do factor Xa. Tung, J. et ai., EP 454372 (30 de Outubro, 1991); Tung, J. et ai., Patente U.S. N° 5189019 (23 de Fevereiro, 1993). O peptídeo anticoagulante de carraça (TAP), uma proteína constituída por 60 aminoácidos e isolada a partir da carraça mole, Ornithodoros moubata, foi descrito como inibindo a actividade enzimática do factor Xa mas não o factor Vila. Waxman, L. et al., Science, 248:593 (1990). Têm sido descritas TAP preparadas por métodos recombinantes. Vlausk, G.P. et al., EP 419099 (1991) e Vlausk, G.P. et al., Patente U.S. N° 5239058 (1993). O ancilóstomo canino, Ancylostoma caninum, que pode também infectar humanos, tem sido descrito como possuindo uma potente substância anticoagulante que inibe a 7 ΡΕ0788546 coagulação do sangue in vitro. Loeb, L. e Smith, A.J., Proc. Pathol. Soc. Philadelphia, (1904). Os extractos de A. caninum foram descritos como prolongando o tempo de protrombina e o tempo de tromboplasmina parcial em plasma humana, com o efeito anticoagulante sendo descrito como atribuído à inibição do factor Xa mas não da trombina. Spellman, Jr., J.J. e Nossel, H.L., Am. J. Physiol., 220:922-927 (1971). Mais recentemente, os extractos de proteína solúvel de A. caninum foram descritos como prolongando o tempo de protrombina e o tempo de tromboplasmina parcial em plasma humano in vitro. O efeito anticoagulante foi descrito como sendo atribuído à inibição de factor Xa humano mas não da trombina, Cappello, M. et ai., J. Infect. Diseasesa, 167:1474-1477 (1993) e à inibição do factor Xa e do factor Vila (W094/25000; Patente U.S. N° 5427937). O ancilóstomo humano, Ancylostoma ceylanicum, foi também descrito como contendo um anticoagulante. Os extractos de A. ceylanicum foram descritos como prolongando o tempo de protrombina e o tempo de tromboplastina parcial no plasma canino e humano in vitro. Carroll, S.M., et al., Thromb. Haemostas. (Stuttgart) , _51:222-227 (1984).

Extractos solúveis do parasita não hematófago, Ascaris suum, foram descritos como possuindo um anticoagulante. Estes extractos foram descritos como prolongando a coagulação do sangue total, assim como o tempo de coagulação no teste do tempo de tromboplastina ΡΕ0788546 parcial activada por caulino mas não no teste do tempo de protrombina. Crawford, G.P.M. et al., J. Parasitol., 6_8:1044-1047 (1982). O inibidor-1 de quimiotripsina/elas-tase e as suas principais isoformas, inibidor-1 da tripsina e inibidor-4 de quimiotripsina/elastase, isolados a partir de Ascaris suum, foram descritos como sendo inibidores de serina-protease e partilham um padrão comum de cinco pontes dissulfureto. Bernard, V.D. e Peanasky, R.J., Arch. Biochem. Biophys., 303:367-376 (1993); Huang, K. et al., Structure, _2:679 — 689 (1994); e Grasberger, B.L. et al. , Structure 2:669-678 (1994). Não houve indicação de que os inibidores de serina-protease descritos tivessem actividade anticoagulante.

As secreções do ancilóstomo Necator americanus foram descritas como prolongadores os tempos de coagulação de plasma humano, inibidores da actividade amidolitica de Fxa humano usando um substrato fluorogénico, inibidores da libertação de grânulos densos de plaquetas induzidos por múltiplos agonistas e degradador do fibrinogénio. Pri-tchard, D.I. e B. Furmidge, Thromb. Haemost. 13_:5 46 (1995) (W095/12615).

Sumário do Invento O presente invento é dirigido a proteínas isoladas tendo actividade inibidora de serina-protease e/ou actividade anticoagulante e incluindo pelo menos um domínio NAP. Referimo-nos a estas proteínas como Proteínas Anti- 9 ΡΕ0788546 coagulantes extraídas de Nemátodos ou "NAPs". 0 "domínio NAP" refere-se a uma sequência da proteína isolada, ou NAP, que se pensa possuir actividade inibidora, como melhor definido mais abaixo. A actividade anticoagulante destas proteínas pode ser avaliada pelas suas actividades no aumento do tempo de coagulação de plasma humano nos ensaios do tempo de protrombina (PT) e do tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) , assim como pela sua capacidade para inibir as enzimas de coagulação do sangue factor Xa ou factor VIIa/TF. Pensa-se que o domínio NAP seja responsável pela actividade anticoagulante observada destas proteínas. Algumas destas proteínas possuem pelo menos um domínio NAP que é uma sequência de aminoácidos contendo menos de aproximadamente 120 resíduos de aminoácidos e incluindo 10 resíduos do aminoácido cisteína.

Num outro aspecto, o presente invento é dirigido a um método de preparação e isolamento de uma molécula de cDNA codificadora de uma proteína apresentando actividade anticoagulante e tendo um domínio NAP e a uma molécula de cDNA recombinante preparada por este método. Este método compreende os passos de: (a) construção de uma biblioteca de cDNA a partir de uma espécie de nemátodo; (b) ligação da referida biblioteca de cDNA a um vector de clonagem adequado; (c) introdução do referido vector de clonagem da referida biblioteca de cDNA numa célula hospedeira adequada; (d) contacto das moléculas de cDNA da referida célula hospedeira com uma solução contendo uma sonda de hibridação, tendo uma sequência de ácido nucleico 10 ΡΕ0788546 compreendendo AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [SEQ. ID. NO. 94] em que R é A ou G, Y é T ou C, e i é inosina; (e) detecção de uma molécula de cDNA recombinante que hibrida com a referida sonda; e (f) isolamento da referida molécula de cDNA recombinante.

Num outro aspecto, o presente invento é dirigido a um método de preparação de uma proteína recombinante codificada pelo referido cDNA, a qual tem actividade anticoagulante, e que inclui um domínio NAP e a proteínas recombinantes preparadas por este método. Este método compreende os passos de: (a) construção de uma biblioteca de cDNA a partir de uma espécie de nemátodo; (b) ligação da referida biblioteca de cDNA a um vector de clonagem; (c) introdução do referido vector de clonagem contendo a referida biblioteca de cDNA numa célula hospedeira adequada; (d) contacto das moléculas de cDNA da referida célula hospedeira com uma solução contendo uma sonda de hibridação tendo uma sequência de ácido nucleico compreendendo AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG, em que R é A ou G,Y é T ou C e i é inosina [SEQ. ID. NO. 94]; (e) detecção de uma molécula de cDNA recombinante que hibrida com a referida sonda; (f) isolamento da referida molécula de cDNA recombinante; (g) ligação da sequência de ácido nucleico da referida molécula de cDA que codifica a referida proteína recombinante a um vector de clonagem de expressão adequado; (h) transformação de uma segunda célula hospedeira com o referido vector de clonagem de expressão, contendo a referida sequência de ácido nucleico da referida 11 ΡΕ0788546 molécula de cDNA que codifica a referida proteína recombinante; (i) cultura da segunda célula hospedeira transformada; e (j) isolamento da referida proteína recombinante expressa pela referida segunda célula hospedeira. Note-se que quando da descrição da produção de proteínas recombinantes em determinados sistemas de expressão tais como células COS, o termo "transfecção" é convencionalmente usado em lugar de (e por vezes de forma permutável com) "transformação".

Num outro aspecto, o presente invento é dirigido a um método de preparação de um cDNA recombinante, codificador de uma proteína recombinante tendo actividade anticoagualante e tendo um domínio NAP, compreendendo os passo de: (a) isolamento de uma biblioteca de cDNA a partir de um nemátodo; (b) ligação da referida biblioteca de cDNA num vector de clonagem; (c) introdução do referido vector de clonagem contendo a referida biblioteca de cDNA numa célula hospedeira; (d) contacto das moléculas de cDNA das referidas células hospedeiras com uma solução compreendendo a primeira e segunda sondas de hibridação, em que a referida primeira sonda de hibridação tem a sequência de ácido nucleico compreendendo AAG GCA TAC CCG GAG TGT GT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GAC TGT GGA ACT CAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AAT GAG GAA CCC CCT GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGC TCA CGT GGT TGT TTA TTA CCT CCT GCT TGC GTA TGC AAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AGG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEQ. ID. NO. 1], e a referida segunda sonda de hibridação tem a sequência de 12 ΡΕ0788546 ácido nucleico compreendendo AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GTC TGT GGA ACT AAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AGT GAG GAA GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGA TCA TTT TCT TGT CCG GGT CCC GCT GCT TGC GTA TGC GAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AAG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEQ. ID. NO. 2]; (e) detecção de uma molécula de cDNA recombinante que híbrida com a referida mistura de sondas; e (f) isolamento da referida molécula de cDNA recombinante.

Ainda num outro aspecto, o presente invento é dirigido a um método de preparação de um cDNA recombinante, codificador de uma proteína tendo actividade anticoagulante e de um domínio NAP, compreendendo os passos de: (a) isolamento de uma biblioteca de cDNA a partir de um nemátodo; (b) ligação da referida biblioteca de cDNA a um vector de clonagem de expressão fagemídio adequado; (c) transformação de células hospedeiras com o referido vector contendo a referida biblioteca de cDNA; (d) cultura das referidas células hospedeiras; (e) infecção das referidas células hospedeiras com um fago auxiliar; (f) separação dos fagos contendo a referida biblioteca de cDNA a partir das referidas células hospedeiras; (g) combinação de uma solução do referido fago contendo a referida biblioteca de cDNA com uma solução de factor Xa humano biotinilado; (h) contacto de uma fase sólida revestida com estreptavidina com a referida solução contendo os referidos fagos contendo a referida biblioteca de cDNA e o referido factor Xa humano 13 ΡΕ0788546 biotinilado; (i) isolamento de fagos que se ligam à referida fase sólida revestida com estreptavidina; e (j) isolamento da molécula de cDNA recombinante a partir de fagos que se ligam à referida fase sólida revestida com estreptavidina.

Num aspecto preferido, o presente invento é dirigido a um cDNA recombinante tendo uma sequência de ácido nucleico seleccionada das sequências de ácido nucleico descritas na Figura 1, Figura 3, Figuras 7A a 7F, Figura 9, Figuras 13A a 13H e Figura 14. 0 presente invento também é dirigido a NAPs que inibem a actividade catalítica de FXa, a NAPs que inibem a actividade catalítica do complexo FVIIa/TF, e a NAPs que inibem a actividade catalítica de uma serina-protease, assim como ácidos nucleicos codificadores de tais NAPs e seus métodos de utilização.

Definições 0 termo "aminoácido" refere-se aos L-aminoácidos naturais; D-aminoácidos estão incluídos desde que uma proteína incluindo tais D-aminoácidos retenham actividade biológica. Os L-minoácidos naturais incluem alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gin), ácido glutâmico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), 14 ΡΕ0788546 prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e valina (Vai). 0 termo "resíduo de aminoácido" refere-se a radicais tendo a estrutura: (1) -NH-CH(R)C(=0)em que R é o grupo da cadeia lateral do carbono alfa de um L- H ! aminoácido, excepto para a L-prolina; ou (2) para L-prolina. 0 termo "peptídeo" refere-se a uma sequência de aminoácidos ligados uns aos outros através dos seus grupos alfa-amina e carboxilato por ligações peptídicas. Tais sequências como aqui mostrado estão apresentadas na direcção amina para carboxilo, da esquerda para a direita. 0 termo "proteína" refere-se a uma molécula constituída por um ou mais peptídeos. 0 termo "cDNA" refere-se a DNA complementar. 0 termo "ácido nucleico" refere-se a polímeros em que bases (e.g., purinas ou pirimidinas) estão ligadas a um esqueleto de fosfato de açúcar. Os ácidos nucleicos incluem DNA e RNA. 0 termo "sequência de ácido nucleico" refere-se à sequência de nucleósidos constituindo um ácido nucleico. 15 ΡΕ0788546

Tais sequências como aqui se mostra são apresentadas na direcção 5' para 3', da esquerda para a direita. 0 termo "molécula de DNA recombinante" refere-se a uma molécula de DNA criada pela ligação de fragmentos de DNA que não são normalmente contíguos. 0 termo "mRNA" refere-se a ácido ribonucleico mensageiro. 0 termo "homologia" refere-se ao grau de semelhança de sequências de DNA ou peptídicas.

Os termos "Factor Xa" ou "fXa" ou "FXa" são sinónimos e são normalmente conhecidos como significando uma serina-protease, dentro da cascata de enzimas da coagulação sanguínea, que funciona como parte do complexo protrombinase para formar a enzima trombina. A frase "Actividade inibidora do Factor Xa" significa uma actividade que inibe a actividade catalítica de fXa relativamente ao seu substrato. A frase "Actividade inibidora selectiva do Factor Xa" significa actividade inibidora que é selectiva para o Factor Xa comparativamente com outras enzimas relacionadas, tais como outras serina-proteases. A frase "Inibidor do Factor Xa" é um composto tendo actividade inibidora do Factor Xa. 16 ΡΕ0788546

Os termos "Factor VIIa/Factor Tecidular" ou "fVIIa/TF" ou "FVIIa/TF" são sinónimos e são normalmente conhecidos como significando um complexo cataliticamente activo da serina-protease factor de coagulação Vila (fVIIa) e da proteína não enzimática Factor Tecidular (TF) , em que o complexo é montado na superfície de uma membrana fosfolipídica de composição definida. A frase "actividade inibidora de fVIIa/TF" significa uma actividade que inibe a actividade catalítica do complexo fVIIa/TF na presença de fXa ou derivado de fXa cataliticamente inactivo. A frase "actividade inibidora selectiva de fVIIa/TF" significa actividade inibidora de fVIIa/TF que é selectiva para fVIIa/TF comparativamente com outras enzimas relacionadas, tais como outras serina-proteases, incluindo FVIIa e fXa. A frase um "inibidor de fVIIa/TF" é um composto tendo actividade inibidora de fVIIa/TF na presença de fXa ou derivados fXa cataliticamente inactivos. A frase "serina-protease" é normalmente conhecida como significando uma enzima, compreendendo uma tríade dos aminoácidos histidina, ácido aspártico e serina, que cataliticamente cliva uma ligação amida, em que o resíduo serina dentro da tríade está envolvido de forma covalente 17 ΡΕ0788546 na clivagem catalítica. As serina-proteases são tornadas cataliticamente inactivas por modificação covalente do resíduo serina dentro da tríade catalítica por di-isopropilfluorofosfato (DFP). A frase "actividade inibidora de serina-protease" significa uma actividade que inibe a actividade catalítica de uma serina-protease. A frase "actividade inibidora selectiva" significa actividade inibidora que é selectiva para uma serina-protease comparativamente com outras serina-proteases. A frase "inibidor de serina-proteases" é um composto tendo actividade inibidora de serina-proteases. 0 termo "protrombinase" é normalmente conhecido como significando um complexo cataliticamente activo da serina-protease factor de coagulação Xa (fXa) e da proteína não enzimática Factor Va (fVa), em que o complexo é montado na superfície de uma membrana fosfolipídica de composição definida. A frase "actividade anticoagulante" significa uma actividade que inibe a coagulação do sangue, que inclui a coagulação de plasma. 0 termo "selectivo", "selectividade" e suas permutações, quando se referem a actividade NAP contra uma 18 ΡΕ0788546 determinada enzima, significa que NAP inibe a enzima especificada com pelo menos 10 vezes maior potência do que inibe outras enzimas relacionadas. Assim, a actividade NAP é selectiva contra a enzima especificada. 0 termo "substancialmente o mesmo" quando usado para se referir a proteínas, sequências de aminoácidos, cDNAs, sequências nucleotídicas e similares refere-se a proteínas, cDNAs ou sequências tendo pelo menos cerca de 90% de homologia com a outra proteína, cDNA ou sequência. O termo "NAP" ou "proteína NAP" significa uma proteína isolada que inclui pelo menos um domínio NAP e tendo actividade inibidora de serina-protease e/ou actividade anticoagulante.

Breve descrição dos desenhos

Figura descreve a sequência nucleotídica do cDNA AcaNAP5 [SEQ. ID. NO.3]. A numeração começa no primeiro nucleótido do cDNA. A tradução começa no primeiro codão ATG (posição 14) ; um segundo codão ATG em grelha de leitura está presente na posição 20.

Figura 2 descreve a sequência de aminoácidos de AcaNAP5 madura [SEQ. ID. NO.49].

Figura 3 descreve a sequência de nucleótidos do cDNA AcaNAPô [SEQ. ID. NO.5]. A numeração começa no 19 ΡΕ0788546 primeiro nucleótido do cDNA. A tradução começa no primeiro codão ATG (posição 14); um segundo ATG em grelha está presente na posição 20.

Figura 4 descreve a sequência de aminoácidos de AcaNAPô maduro [SEQ. ID. NO. 6]. Os aminoácidos que diferem de AcaNAP5 estão sublinhados. Para além destas substituições de aminoácidos, AcaNAPô contem uma deleção de dois aminoácidos (Pro-Pro) quando comparado com AcaNAPõ.

Figura 5 descreve a sequência de aminoácidos de

Pro-AcaNAP5 [SEQ. ID. NO.7].

Figura 6 descreve a sequência de aminoácidos de Pro-AcaNAP6 [SEQ. ID. NO.8] . Os aminoácidos que diferem de Pro-AcaNAP5 estão sublinhados. Para além destas substituições de aminoácidos, AcaNAP6 contem uma deleção de dois aminoácidos (Pro-Pro) quando comparado com AcaNAPõ.

Figuras 7A a 7F descrevem as sequências nucleo-tidicas dos cDNAs e as sequências de aminoácidos deduzidas de determinadas proteínas NAP isoladas a partir de Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale e Heligmo-soides polygyrus. A Figura 4A descreve sequências da molécula de cDNA recombinante, AceNAP4, isolada a partir de Ancylostoma ceylanicum [SEQ. ID. NO. 9]. Figura 7B descreve a sequência da molécula de cDNA recombinante, AceNAPõ, isolada a partir de Ancylostoma ceylancum [SEQ. ID. NO. 10] . Figura 7C descreve a sequência da molécula de cDNA 20 ΡΕ0788546 recombinante, AceNAP7, isolada a partir de Ancylostoma ceylanicum [SEQ. ID. NO. 11] . Figura 7D descreve a sequência da molécula de cDNA recombinante, AduNAP 4, isolada a partir de Ancylostoma duodenale [SEQ. ID. NO. 12]. Figura 7E descreve a sequência da molécula de cDNA recombinante, AduNAP 7, isolada a partir de Ancylostoma duodenale [SEQ. ID. NO. 13]. Figura 7F descreve sequências da molécula de cDNA recombinante, HpoNAP5, isolada a partir de He ligmo somo Ides polygyrus [SEQ. ID. NO. 14]. O local EcoRI, correspondendo ao extremo 5' da molécula de cDNA recombinante, está indicado em todos os casos (sublinhado). A numeração de cada uma das sequências começa neste local EcoRI. AceNAP4 e AduNAP7, cada uma delas codifica uma proteina que tem dois domínios NAP; todos os outros clones nesta Figura codificam uma proteína que tem um domínio NAP simples. O clone de cDNA AduNAP4 não tem tamanho completo, i.e., a molécula de cDNA recombinante não possui a parte 5' terminal da região codificadora baseado na comparação com outras isoformas.

Figuras 8A a 8C descrevem a sequência nucleotídica dos vectores, pDONGôl (Figura 8A) [SEQ. ID. NO.15], pDONG62 (Figura 8B) [SEQ. ID. NO.16] e pDONG63 (Figura 8C) [SEQ. ID. NO.17]. O fragmento HindiII-BamHI que está apresentado está situada entre os locais HindiII e BamHI de pUC119. Os vectores permitem a clonagem de cDNAs, como fragmentos Sfil-NotI, nas três grelhas de leitura diferentes a jusante dos gene 6 do fago filamentoso. Estão indicados todos os locais de restrição relevantes. O 21 ΡΕ0788546 tripleto codificador de Lys, AAA, na posição 373-375 é o último codão do gene 6. A proteína codificada pelo gene 6 é seguida de uma sequência de ligação Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly [SEQ. ID. No. 18].

Figura 9 descreve a sequência nucleotídica da molécula de cDNA recombinante, cDNA AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO.19]. 0 local EcoRI, correspondendo ao extremo 5' do cDNA, está indicado (sublinhado). A numeração começa neste local EcoRI. A sequência de aminoácidos deduzida está também apresentada; a grelha de leitura de tradução foi determinada pelo parceiro de fusão do gene 6. 0 cDNA AcaNAPc2 não possui uma porção da parte 5' terminal da região codificadora; a homologia com AcaNAP5 e AcaNAPó prevê que os primeiros sete resíduos de aminoácidos pertencem ao sinal de secreção.

Figuras 10A e 10B descrevem os efeitos comparativos de determinadas proteínas NAP na medição do tempo de protrombina (PT) (Figura 10A) e no tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) (Figura 10B) de plasma humano normal citratado. Os círculos a cheio (·) , representam Pro-AcaNAP5; triângulos abertos, (Δ) , representam AcaNAP5 (AcaNAP5a na tabela 2); e círculos abertos, (0), representam AcaNAP5 nativo.

Figura 11 descreve o alinhamento das sequências de aminoácidos codificadas por certos cDNAs NAP isolados a partir de vários nemátodos. AcaNAP5 [SEQ. ID. NO.20], 22 ΡΕ0788546

AcaNAPô [SEQ. ID. NO.21] e AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO.128] foram isoladas a partir de Ancylostoma caninum. AceNAP5 [SEQ. ID. NO.22], AceNAP7 [SEQ. ID. NO.23] e AceNAP4 (AceNAP4dl [SEQ. ID. NO.24] e AceNAP4d2 [SEQ. ID. NO.25] foram isolados a partir de Ancylostoma ceylanicum. AduNAP4 [SEQ. ID. No. 26] e AduNAP 7 (AduNAP7dl [SEQ. ID. NO. 27] e AduNAP7d2 [SEQ. ID. NO. 28]) foram isolados a partir de Ancylostoma duodenale. HpoNAP5 [SEQ. ID. NO. 29] foi isolado a partir de Haligmosomoides polygyrus. As sequências de aminoácidos apresentadas nesta figura são como nas Figuras 1, 3, 7A a 7F e 9. As sequências de AcaNAP5 maduro [SEQ. ID. NO. 4] e AcaNAPô [SEQ. ID. NO. 6] (ver Figuras 2 e 4) são caracterizadas, em parte, por dez resíduos de cisteína (numerados e um a dez e apresentados a cheio) . Todas as sequências de aminoácidos nesta figura contêm pelo menos um domínio NAP. 0 cDNA AceNAP4 consiste em duas regiões adjacentes, designadas AceNAP4dl [SEQ. ID. NO. 24] e AceNAP4d2 [SEQ. ID. NO. 25], que codificam um primeiro e um segundo domínio NAP (d2); de forma semelhante, o cDNA AduNAP7 contem duas regiões adjacentes, AduNAP7dl [SEQ. ID. NO. 27] e AduNAP7d2 [SEQ. ID. NO. 28], codificadoras de um primeiro (dl) e de um segundo (d2) domínio NAP. 0 alinhamento das sequências de aminoácidos de todos os domínios NAP é guiado elas cisteínas; os traços (---) foram introduzidos em determinadas posições para manter o alinhamento das cisteínas e indicam a ausência de um aminoácido naquela posição. 0 resíduo carboxi-terminal de uma proteína codificada por cDNA é seguido pela palavra fim" . 23 ΡΕ0788546

Figuras 12A e 12B descrevem um mapa do vector de expressão/secreção pYAM7SP8 de P. pastoris (Figura 12A) e as sequências incluídas no vector (Figura 12B) [SEQ. ID. NO. 30]. Como descrito na Figura 12A, este plasmídeo contem os seguintes elementos inseridos entre o promotor AOXl induzido por metanol (seta escura na região não traduzida 5ΆΟΧ) e sinal de terminação da transcrição AOXl (3'T): um fragmento de DNA sintético codificador do sinal de secreção da fosfatase ácida (S), uma pro-sequência de 19 aminoácidos sintética (P) terminando com um local de processamento Lys-Arg para a protease KEX2 e um local de clonagem múltipla. O gene HIS4 que serve como marca de selecção na transformação com GS115 foi modificado por mutagénese dirigida para eliminar a sequência de reconhecimento StuI (HIS4*) . As sequências pBR322, incluindo o gene Bla e a origem (ori) para propagação em E. coli estão representadas por uma linha simples. Figura 12B descreve as seguintes sequências de DNA contíguas que são incorporadas em pYAM7SP8: a sequência sinal de secreção da fosfatase ácida (PH01), a pro-sequência e sequência de múltiplos locais de clonagem (MCS) . O codão de iniciação ATG do sinal de secreção PHOl está sublinhado.

Figuras 13A a 13H descrevem as sequências nucleotídicas dos cDNAs e as sequências de aminoácidos deduzidas de determinadas proteínas NAP isoladas a partir de Ancylostoma caninum. Figura 13A descreve a sequência para a molécula de cDNA recombinante AcaNAP23 [SEQ. ID. NO. - 24 - ΡΕ0788546 31] . A Figura 13B descreve a sequência para a molécula de cDNA recombinante AcaNAP24 [SEQ. ID. NO. 32]. A Figura 13C descreve a sequência para a molécula de cDNA recombinante AcaNAP25 [SEQ. ID. NO. 33] . A Figura 13D descreve as sequências para as moléculas de cDNA recombinante AcaNAP31, AcaNAP42 e AcaNAP46, todas elas são idênticas [SEQ. ID. NO. 34] . A Figura 13E descreve a sequência para a molécula de cDNA recombinante AcaNAP44 [SEQ. ID. NO. 35]. A Figura 13F descreve a sequência para a molécula de cDNA recombinante AcaNAP45 [SEQ. ID. NO. 36]. A Figura 13G descreve a sequência da molécula de cDNA recombinante AcaNAP47 [SEQ. ID. NO. 37] . A Figura 13H descreve a sequência para a molécula de cDNA recombinante AcaNAP48 [SEQ. ID. NO. 38]. O local EcoRI, correspondendo ao extremo 5' da molécula de cDNA recombinante, está indicada em todos os casos (sublinhado). A numeração de cada uma das sequências começa neste local EcoRI. AcaNAP45 e AcaNAP47, cada uma delas codifica uma proteína que tem dois domínios NAP; todos os outros clones nesta Figura codificam uma proteína tendo um único domínio NAP. A Figura 14 descreve a sequência de nucleótidos e de aminoácidos deduzida da molécula de cDNA recombinante NamNAP [SEQ. ID. NO. 39]. A Figura 15 apresenta a actividade antitrombótica de AcaNAP5 e a Heparina de Baixo Peso Molecular (LMWH; Enoxaparin™) avaliada no modelo FeCl3 de trombose arterial. Os dados de actividade estão representados como a 25 ΡΕ0788546 percentagem de incidência de formação de trombos oclusivos na artéria carótida (circulos). A formação de trombos começou 150 minutos após administração subcutânea (s.c.) do agente a testar. A hemorragia de feridas profunda foi quantificada num grupo separado de animais que foram tratados de forma idêntica mas sem adição de FeCl3 (quadrados). A perda de sangue numa ferida cirúrgica profunda no pescoço foi quantificada ao longo de um total de 210 minutos após administração subcutânea do composto. A Figura 16 representa o alinhamento de sequências de aminoácidos correspondendo a NAPs maduras isoladas de acordo com os procedimentos descritos aqui: nomeadamente AcaNAP5 [SEQ. ID. NO. 40], AcaNAPô [SEQ. ID. NO. 41], AcaNAP48 [SEQ. ID. NO. 42], AcaNAP23 [SEQ. ID. NO 43], AcaNAP2 4 [SEQ. ID. NO. 44], AcaNAP25 [SEQ. ID. NO. 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. NO. 46], AcaNAP31, 42, 46 [SEQ. ID. NO. 47], AceNAP4dl [SEQ. ID. NO. 48], AceNAP4d2 [SEQ. ID. NO. 49], AcaNAP45dl [SEQ. ID. NO. 48], AceNAP4d2 [SEQ. ID. NO. 49], AcaNAP45dl [SEQ. ID. NO. 50], AcaNAP47dl [SEQ. ID. NO. 51], AduNAP7dl [SEQ. ID. NO. 52], AcaNAP45d2 [SEQ. ID. NO. 53], AcaNAP4 7d2 [SEQ. ID. NO. 54], AduNAP 4 [SEQ. ID. N055] , AduNAP7d2 [SEQ. ID. NO. 56], AceNAP5 [SEQ. ID. NO. 57], AceNAP7 [SEQ. ID. NO. 58], AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 59], HpoNAP5 [SEQ. ID. NO. 60] e NamNAP [SEQ. ID. NO. 61]. Cada um dos dominios NAP compreende dez residuos cisteina, os quais são usados para alinhar as sequências e as sequências de aminoácidos entre as cisteinas. AI a A10 representam as sequências de aminoácidos entre os residuos de cisteina. 26 ΡΕ0788546

Figura 17 descreve a sequência de aminoácidos de AceNAP4 madura [SEQ. ID. NO. 62] tendo dois dominios NAP.

Figura 18 descreve a sequência de aminoácidos de AcaNAP45 madura [SEQ. ID. NO. 63] tendo dois dominios NAP.

Figura 19 descreve a sequência de aminoácidos de AcaNAP47 madura [SEQ. ID. NO. 64] tendo dois dominios NAP.

Figura 20 descreve a sequência de aminoácidos de AduNAP7 madura [SEQ. ID. NO. 65] tendo dois dominios NAP.

Descrição detalhada do invento

Este invento proporciona uma familia de proteínas, colectivamente referidas como Proteínas Anticoagu-lantes extraídas de Nemátodos (NAPs). Estas proteínas são assim designadas devido ao primeiro membro originalmente isolado ter sido extraído a partir de um nemátodo, o ancilóstomo canino, Ancylostoma caninum. No entanto, a designação NAP ou domínio NAP não deverá ser considerada limitante das proteínas do presente invento a esta ou outra fonte natural.

As proteínas individuais NAP são caracterizadas por terem pelo menos um domínio NAP e por terem actividade inibidora de serina-proteases e/ou anticoagulante. Tal actividade anticoagulante pode ser avaliada por aumentos no 27 ΡΕ0788546 tempo de coagulação nos ensaios de PT e aPTT aqui descritos, através da inibição da actividade do factor Xa ou do factor VIIa/TF ou através da demonstração de actividade in vivo. Preferência, o sangue ou plasma usado em tais ensaios deriva das espécies que se sabe ser infectada por nemátodos, tais como porcos, humanos, primatas e similares. 0 dominio NAP é uma sequência de aminoácidos. Pensa-se que o domínio NAP seja responsável pela actividade inibidora e/ou anticoagulante observada. Determinados domínios representativos de NAP incluem sequências de aminoácidos descritas nas Figuras 11 e 16, particularmente as sequências entre as cisteínas designadas como Cisteína e Cisteína 10 nas Figuras e a sequência a seguir à Cisteína 10. São descritas as características que definem de um modo geral esta família de proteínas, assim como as moléculas de ácido nucleico, incluindo sequências de mRNAs e sequências de DNA que codificam tais proteínas. Métodos para a preparação destas proteínas, assim como métodos para a preparação de moléculas de ácido nucleico codificadoras de tais proteínas, são igualmente proporcionados. Os exemplos específicos apresentados são apenas exemplos e outros membros da família de proteínas NAP, assim como sequências de ácido nucleico codificadoras das mesmas, podem ser obtidos seguindo os procedimentos descritos nestes exemplos e aqui apresentados.

As proteínas do presente invento incluem NAPs isoladas que compreendem proteínas tendo actividade anticoagulante e incluindo pelo menos um domínio NAP. 28 ΡΕ0788546

Relativamente à "actividade anticoagulante", as proteínas purificadas do presente invento são activas como anticoagulantes e, como tal, são caracterizadas por inibirem a coagulação de sangue que inclui a coagulação de plasma. Num aspecto, as proteínas isoladas preferidas do presente invento incluem as que aumentam o tempo de coagulação de plasma humano conforme medido tanto no ensaio de tempo de protrombina (PT) como no do tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT).

No ensaio PT, a coagulação é iniciada pela adição de uma quantidade fixa de complexo factor tecidular-micelas de fosfolípidos (tromboplastina) a plasma humano. Os anticoagulantes interferem com determinadas interacções na superfície deste complexo e aumentam o tempo necessário para se conseguir coagulação relativamente à coagulação observada na ausência do anticoagulante. A medição de PT é particularmente importante para avaliar a actividade anticoagulante de NAP devido à série de acontecimentos bioquímicos específicos necessários para causar coagulação neste ensaio ser semelhante aos que devem ser ultrapassados pelo ancilóstomo na natureza para facilitar a alimentação. Assim, a capacidade de NAP para actuar como um inibidor neste ensaio pode ser paralela à sua actividade na natureza e é preditiva de actividade anticoagulante in vivo. Tanto no ensaio como na natureza, a resposta de coagulação é iniciada pela formação de um complexo binário da serina-protease factor Vila (fVIIa) e da proteína factor tecidular 29 ΡΕ0788546 (TF) (fVIIa/TF), resultando na geração de fXa. A montagem subsequente de fXa no complexo protrombinase é o acontecimento chave responsável pela formação de trombina e eventual formação de coágulo.

No ensaio aPTT, a coagulação é iniciada pela adição de uma determinada quantidade fixa de micelas de fosfolipidos carregados negativamente (activador) a plasma humano. As substâncias que actuam como anticoagulantes interferirão com determinadas interacções na superfície do complexo e novamente aumentam o tempo necessário para se atingir uma determinada quantidade de coagulação relativamente ao observado na ausência do anticoagulante. 0 Exemplo B descreve tais ensaios PT e aPTT. Estes ensaios podem ser usados para avaliar a actividade anticoagulante de NAPs isoladas do presente invento.

As NAPs isoladas preferidas do presente invento incluem as que incluem duplicação do tempo de coagulação de plasma humano no ensaio PT, quando presentes numa concentração de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 nanomolar, e que também duplicam o tempo de coagulação de plasma humano no ensaio aPTT quando presentes numa concentração de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 nanomolar. São especialmente preferidas as proteínas que duplicam o tempo de coagulação de plasma humano no ensaio PT, quando presente numa concentração entre cerca de 5 e cerca de 100 nanomolar, e que também duplicam o tempo de coagulação de plasma humano no ensaio aPTT, quando 30 ΡΕ0788546 presentes numa concentração entre cerca de 5 e cerca de 200 nanomolar. Mais especialmente preferidas são as proteínas que duplicam o tempo de coagulação de plasma humano no ensaio PT quando presente numa concentração entre cerca de 10 e cerca de 50 nanomolar e que também duplicam o tempo de coagulação de plasma humano num ensaio aPTT, quando presentes numa concentração entre cerca de 10 e cerca de 100 nanomolar. A actividade anticoagulante ou antitrombótica de NAPs do presente invento pode também ser avaliada usando os modelos in vivo apresentados no Exemplo F. O modelo FeCl3 de rato descrito na parte A daquele Exemplo é um modelo de trombose arterial dependente de plaquetas que é normalmente usado para avaliar compostos antitrombóticos. O modelo avalia a capacidade de um composto a testar para prevenir a formação de um trombo oclusivo induzido por FeCl3 num segmento da artéria carótida de rato. NAPS do presente invento são anticoagulantes eficazes neste modelo quando administrados intravenosamente ou subcutaneamente. O ensaio de hemorragia de ferida profunda, na parte B do Exemplo F, permite a medição da perda de sangue após administração de um composto anticoagulante. Um efeito pretendido de um anticoagulante é que ele iniba a coagulação sanguínea ou formação de trombo, mas não tanto que iniba totalmente a coagulação e estimule assim as hemorragias. Assim, o ensaio de hemorragia de ferida profunda mede a quantidade de sangue ao longo de um período de 3,5 horas após administração de anticoagulantes. Os dados apresentados na 31 ΡΕ0788546

Figura 15 mostram NAP do presente invento como sendo um composto antitrombótico eficaz numa dose que não causa excessiva hemorragia. Pelo contrário, a dose de heparina de baixo peso molecular (LMWH) que está correlacionada com 0,8% de oclusão causou cerca de três vezes mais hemorragia do que a dose de NAP eficaz.

Dominio NAP geral [Fórmula I]

Relativamente ao "dominio NAP", as proteinas isoladas (ou NAPs) do presente invento incluem pelo menos um dominio NAP na sua sequência de aminoácidos. Determinados domínios NAP possuem uma sequência de aminoácidos tendo um peso molecular de cerca de 5,0 a 10,0 quilodaltons, de preferência entre cerca de 7,0 a 10,0 quilodaltons e contendo 10 resíduos do aminoácido cisteína.

Determinados NAPs do presente invento demonstram especificidade relativamente à inibição de um componente particular na cascata de coagulação, como seja o complexo fXa ou fVIIa/TF. A especificidade de uma actividade inibidora NAP relativamente a um componente na cascata de coagulação pode ser avaliado usando o protocolo do Exemplo D. Neste caso, a capacidade de um NAP para inibir a actividade de uma variedade de serina-proteases na coagulação é medida e comparada. A capacidade de um NAP para inibir o complexo fVIIa/TF pode ser avaliada usando os protocolos no Exemplo E, que mede a capacidade de um NAP para se ligar a fXa de forma inibidora ou não inibidora e 32 ΡΕ0788546 para inibir FVIIa quando complexado com TF. AcaNAP5 e AcaNAP6 são exemplos de proteínas tendo domínios NAP que especificamente inibem fXa. AcaNAPc2 é uma proteína tendo um domínio NAP que demonstra inibição selectiva do complexo fVIIa/TF quando fXa, ou um seu derivado cataliticamente activo ou inactivo, está presente. NAPs tendo actividade anticoagulante, incluindo NAPs tendo actividade inibidora do Factor Xa (Fórmula II)

Assim, num aspecto NAPs do presente invento também incluem uma proteína isolada tendo actividade anticoagulante, incluindo uma proteína isolada tendo actividade inibidora do Factor Xa, e tendo um ou mais domínios NAP, em que cada um dos domínios NAP inclui a sequência:

Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-Al0 (Fórmula II), em que resíduos resíduos resíduos resíduos resíduos (a) AI é uma sequência de aminoácidos de 7 a 8 de aminoácidos; (b) A2 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 de aminoácidos; (c) A3 é uma sequência de aminoácidos de 3 de aminoácidos; (d) A4 é uma sequência de aminoácidos de 6 a 19 de aminoácidos; (e) A5 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 4 de aminoácidos; 33 ΡΕ0788546 resíduos resíduos resíduos resíduos (f) A6 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 de aminoácidos; (g) A7 é um aminoácido; (h) A8 é uma sequência de aminoácidos de 11 a 12 de aminoácidos; (i) A9 é uma sequência de aminoácidos de 5 a 7 de aminoácidos; e (j) AIO é uma sequência de aminoácidos de 5 a 25 de aminoácidos. São igualmente contempladas composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com este aspecto e métodos de inibição da coagulação sanguínea compreendendo administração de proteínas NAP de acordo com este aspecto.

As proteínas NAP dentro deste aspecto do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidas NAPs tendo um ou mais domínios NAP. As proteínas NAP AcaNAP5 [SEQ. ID. NOS. 4 e 40] e AcaNAPô [SEQ. ID. NOS. 6 e 41] possuem um domínio NAP e são preferidas de acordo com este aspecto do invento.

Assim de acordo com um aspecto preferido, são proporcionadas proteínas tendo actividade anticoagulante, incluindo proteínas isoladas tendo actividade como inbidores de Factor Xa, tendo pelo menos um domínio NAP da fórmula II que inclui a seguinte sequência: 34 ΡΕ0788546

Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 em que (a) Cys-Al é seleccionado de SEQ. ID. NOs. 67 e 156; (b) Cys-A2-Cys é seleccionado de uma de SEQ. ID. NOS. 157 a 159; (c) A3-Cys-A4 é seleccionado de uma sequência de SEQ. ID. NOS. 174 e 175; (d) Cys-A5 é seleccionado de SEQ. ID. NOS. 174 e 175; (e) Cys-A6 é seleccionada de uma de SEQ. ID. NOS. 176 a 178; (f) Cys-A7-

Cys-A8 é seleccionado de SEQ. ID. NO. 179 e 180; (g) Cys-A9 é seleccionado de uma SEQ. ID. NOS. 181 a 183; e (h) Cys-A10 é seleccionado de uma SEQ. ID. NOS. 184 a 204.

Numa outra realização preferida deste aspecto do invento, A3 tem a sequência Glu-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos independentemente seleccio-nados. Mais preferencialmente, A3a é seleccionado do grupo consistindo em Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu e Thr e A3b é seleccionado do grupo consistindo em Lys, Thr e Arg. Sequências A3 especialmente preferidas são seleccionadas do grupo consistindo em Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys e Glu-Thr-Lys.

Numa outra realização preferida deste aspecto do invento, A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica.

De acordo com este aspecto do invento, um resíduo de aminoácido A7 preferido é Vai ou Ile. 35 ΡΕ0788546

Uma outra realizaçao preferida deste aspecto do invento é um em que A8 inclua a sequência de aminoácidos A8a-A8b-A8c-A8d-A8e-A8f-A8g [SEQ. ID. NO. 68], em que (a) A8a é o primeiro resíduo de aminoácido em A8, (b) pelo menos de um de A8a e A8b é seleccionado do grupo consistindo em Glu ou Asp e (c) A8C a A8g são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados.

De preferência, A8C é Gly, A8d é seleccionado do grupo consistindo em Phe, Tyr e Leu, A8e é Tyr, A8f é Arg e A8g é seleccionado entre Asp e Asn. Uma sequência especialmente preferida A8c-A8d-A8e-A8f-A8g é seleccionada do grupo consistindo em Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 72] e Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 73].

Uma realização preferida adicional é uma em que AIO inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] e Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77] .

As proteínas NAP AcaNAP5 e AcaNAP6 incluem a 36 ΡΕ0788546 sequência de aminoácidos Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74] em AIO e são NAPs preferidas de acordo com esta realização do invento.

Numa realização deste aspecto do invento, uma molécula NAP preferida é uma em que (a) A3 tem a sequência Glu-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos seleccionados independentemente; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A7 é seleccionado do grupo consistindo em Vai e Ile; (d) A8 inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 72] e Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 73]; e (e) AIO inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] e Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77]. 37 ΡΕ0788546

Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com esta realização e métodos de inibição da coagulação sanguínea compreendendo administração de proteínas NAP de acordo com esta realização também estão contempladas por este invento. As proteínas NAP dentro desta realização do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidas NAPs tendo um ou mais domínios NAP. As proteínas NAP AcaNAP5 e AcaNAPô possuem um domínio NAP e são NAPs preferidas de acordo com esta realização do invento.

Numa outra realizaçao preferida, uma molécula NAP é uma em que (a) A3 é seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys e Glu-Thr-Lys; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A7 é Vai ou Ile; (d) A8 inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em A8a-A8b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 78], A8a-A8b-Gly-

Phe- -Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 79] , A8a-A8b-Gly-Tyr-Tyr-Arg- Asp [SEQ. ID. NO. 80] , A8a- -A8b- -Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 81] e A8a-A8b-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 82], em que pelo menos um de A8a e A8b é Glu ou Asp; 38 ΡΕ0788546 (e) A9 é uma sequência de aminoácidos de cinco resíduos de aminoácidos; e (f) AIO inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75],

Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] e Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77]. Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com esta realização e métodos de inibição de coagulação sanguínea compreendendo a administração de proteínas NAP de acordo com esta realização são igualmente considerados por este invento. Proteínas NAP dentro desta realização do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidos NAPs tendo um ou mais domínios NAP. São preferidas proteínas tendo pelo menos um domínio NAP que é substancialmente o mesmo de AcaNAP5 [ SEQ. ID. NO. 40] ou AcaNAPô [SEQ. ID . NO. 41] . Proteínas NAP AcaNAP5 [SEQ . ID. NOS. 4 e 40] e AcaNAPô [SEQ. ID, . NOS. 6 e 41] possuem um domínio NAP e são especialmente preferidas NAPs de acordo com esta realização do invento.

Proteínas NAP preferidas tendo actividade anticoagulante, incluindo as possuidoras de actividade inibidora de Factor Xa, de acordo com todas as realizações referidas atrás para este aspecto do invento, podem ser derivadas de uma espécie de nemátodo. Uma espécie de nemátodo preferida é seleccionada do grupo consistindo em 39 ΡΕ0788546

Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus e Heligomosomoides polygyrus.

São particularmente preferidas as proteínas NAP

AcaNAP5 e AcaNAPô derivadas de Ancylostoma caninum.

Este aspecto do invento também contempla moléculas de cDNA recombinante isoladas, codificadoras de uma proteína tendo actividade anticoagulante e/ou actividade inibidora do Factor Xa, em que a proteína é definida de acordo com cada uma das realizações atrás referidas para proteína NAP isolada tendo actividade anticoagulante e/ou actividade inibidora de Factor Xa. Os cDNAs preferidos de acordo com este aspecto do invento codificam AcaNAPõ e AcaNAP6. A actividade inibidora do Factor Xa de NAPs dentro deste aspecto do invento pode ser determinada usando protocolos aqui descritos. 0 Exemplo A descreve um desses métodos. Resumidamente, uma NAP é incubada com o factor Xa durante um período de tempo, após o que um substrato do factor Xa é adicionado. A velocidade de hidrólise do substrato é medida, sendo uma velocidade mais lenta comparativamente com a velocidade na ausência de NAP indicativa de inibição com NAP do factor Xa. 0 Exemplo C proporciona um outro método de detecção de uma actividade inibidora NAP relativamente ao factor Xa quando se associa num complexo protrombinase, o qual mais precisamente reflecte a função fisiológica normal de fXa in vivo. Como 40 ΡΕ0788546 aqui descrito, o factor Xa associado ao complexo de protrombinase é incubado com NAP, seguido da adição do substrato. A geração de trombina mediada por Factor Xa no complexo protrombinase é medida pela velocidade de geração de trombina nesta mistura. NAPs tendo actividade anticoagulante, incluindo NAPs tendo actividade inibidora do Factor VIIa/TF (Fórmula III)

Num outro aspecto, NAPs do presente invento também incluem uma proteína isolada tendo actividade anticoagulante, incluindo uma proteína isolada tendo actividade inibidora do Factor VIa/TF e tendo um ou mais domínios NAP, em que cada um dos domínios NAP inclui a sequência: Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-Al0 (Fórmula III"), em que (a) AI é uma sequência de aminoácidos de 7 a 8 resíduos de aminoácidos; (b) A2 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 resíduos de aminoácidos; (c) A3 é uma sequência de aminoácidos de 3 resíduos de aminoácidos; (d) A4 é uma sequência de aminoácidos de 6 a 19 resíduos de aminoácidos; 41 ΡΕ0788546 (e) A5 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 4 resíduos de aminoácidos; (f) A6 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 resíduos de aminoácidos; (g) A7 é um aminoácido; (h) A8 é uma sequência de aminoácidos de 11 a 12 resíduos de aminoácidos; (i) A9 é uma sequência de aminoácidos de 5 a 7 resíduos de aminoácidos; e (j) AIO é uma sequência de aminoácidos de 5 a 25 resíduos de aminoácidos.

Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com este aspecto e métodos de inibição da coagulação sanguínea compreendendo a administração de proteínas NAP de acordo com este aspecto são também contempladas por este invento. As proteínas NAP dentro deste aspecto do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidas NAPs tendo um ou mais domínios NAP. São preferidas proteínas tendo pelo menos um domínio NAP substancialmente igual ao de AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 59] . A proteína NAP AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 59] tem um domínio NAP e é um NAP especialmente preferido de acordo com este aspecto do invento. 42 ΡΕ0788546

Assim, num aspecto preferido, são proporcionadas NAPs tendo actividade anticoagulante, incluindo actividade inibidora do factor VIIa/TF e tendo pelo menos um dominio NAP da fórmula III em que o dominio NAP inclui a sequência de aminoácidos:

Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 em que (a) Cys-Al é seleccionada de SEQ. ID. NOS. 83 e 205; (b) Cys-A2-Cys é seleccionada de uma de SEQ. ID. NOS. 206 a 208; (c) A3-Cys-A4 é seleccionada de uma sequência de SEQ. ID. NOS. 209 e 222; (d) Cys-A5 é seleccionada de SEQ. ID. NOS. 223 e 224; (e) Cys-A6 é seleccionada de uma de SEQ. ID. NOS. 225 a 227; (f) Cys-A7-

Cys-A8 é seleccionada de SEQ. ID. NO. 228 e 229; (g) Cys-A9 é seleccionada de uma SEQ. ID. NOS. 230 a 232; e (h) Cys-A10 é seleccionada de uma SEQ. ID. NOS. 233 a 253.

Numa outra realização preferida de acordo com este aspecto do invento, A3 tem a sequência Asp-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados. Mais de preferência, A3 é Asp-Lys-Lys.

Numa realização preferida, A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica.

Numa outra realização preferida deste aspecto do invento, A5 tem a sequência A5a-A5b-A5c-A5d [SEQ. ID. NO. 84], em que A5a a A5d são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados. De preferência A5a é Leu e A5C é Arg. 43 ΡΕ0788546

De acordo com este aspecto do invento, um resíduo de aminoácido A7 preferido é Vai ou Ile, mais de preferência Vai.

Uma realização ainda preferida deste aspecto do invento é uma em que A8 inclui a sequência de aminoácidos A8a-A8b-A8c-A8d-A8e-A8f-A8g [SEQ. ID. NO. 68], em que (a) A8a é o primeiro resíduo de aminoácido em A8; (b) pelo menos um de A8a e A8b é seleccionado do grupo consistindo em Glu ou Asp; e (c) A8C a A8g são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados.

De preferência A8C é Gly, A8d é seleccionado do grupo consistindo em Phe, Tyr e Leu, A8f é Arg e A8g é seleccionado entre Asp e Asn. Uma sequência A8c-A8d-A8e-A8f-A8gpreferida é Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 70].

Numa realização, uma molécula NAP preferida é uma em que: (a) A3 tem a sequência Asp-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; 44 ΡΕ0788546 (c) A5 tem a sequência A5a-A5b-A5c-A5d, em que A5a a A5d são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados; e (d) A7 é seleccionado do grupo consistindo em Vai e Ile. Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com esta realização, e métodos de inibição da coagulação sanguínea compreendendo a administração de proteínas NAP de acordo com esta realização são igualmente contemplados por este invento. As proteínas NAP dentro desta realização do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidas NAPs tendo um ou mais domínios NAP. A proteína NAP AcaNAPc3 tem um domínio NAP e é uma NAP preferida de acordo com esta realização do invento.

Numa outra realização preferida, uma molécula NAP é uma em que (a) A3 é Asp-Lys-Lys; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A5 tem a sequência A5a-A5b-A5c-A5d [SEQ. ID. NO. 85], em que A5a a A5d são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados; (d) A7 é Vai; e 45 ΡΕ0788546 (e) A8 inclui uma sequência de aminoácidos A8a-A8b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn[SEQ. ID. NO. 79],em que pelo menos um de A8a e A8b é Glu ou Asp. Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com esta realização e métodos de inibição da coagulação sanguínea compreendendo a administração de proteínas NAP de acordo com esta realização são igualmente contemplados por este invento. Proteínas NAP dentro desta realização do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidos NAPs tendo um ou mais domínios NAP. A proteína NAP AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 59] tem um domínio NAP e é uma NAP preferida de acordo com esta realização do invento.

Proteínas NAP preferidas tendo actividade anticoagulante, incluindo as possuidoras de actividade inibidora de Factor VIIa/TF, de acordo com todas as realizações descritas atrás para este aspecto do invento, podem derivar de uma espécie de nemátodo. Uma espécie de nemátodo preferida é seleccionada do grupo consistindo em Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus e Heligomosomoides polygyrus. É particularmente preferida a proteína NAP AcaNAPc2 derivada de Ancylostoma caninum.

Este aspecto do invento contempla igualmente moléculas de cDNA recombinante isoladas codificadoras de uma proteína tendo actividade anticoagulante e/ou inibidora de Factor VIIa/TF, em que a proteína é definida de acordo com cada uma das realizações atrás referidas para proteína 46 ΡΕ0788546 NAP isolada tendo actividade anticoagulante e/ou inibidora de Factor VIIa/TF. Um cDNA preferido de acordo com este aspecto tem uma sequência nucleotidica [SEQ. ID. NO. 19] e codifica AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 59]. A actividade inibidora de fVIIa/TF de NAPs dentro deste aspecto do invento pode ser determinada usando os protocolos aqui descritos. 0 exemplo E descreve ensaios fVIIa/TF. Ai são medidas a clivagem mediada por fVIIa/TF e a libertação do peptídeo de activação triciado do factor IX humano marcado radioactivamente (3H-FIX) ou a hidrólise amidolitica de um substrato peptidilo cromogénico. É interessante que os inibidores NAP de fVIIa/TF do presente invento requerem a presença de fXa de forma a activarem os inibidores de fVIIa/TF. No entanto, os inibidores NAP de fVIIa/TF foram igualmente eficazes na presença de fXa em que o local activo tinha sido irreversivelmente ocupado com a peptidil clorometil cetona H-Glu-Gly-Arg-CMK (EGR) e assim tornados cataliticamente inactivos (EGR-fXa). Ainda que não pretendendo ficar limitado a qualquer explicação, parece que uma NAP tendo actividade inibidora de fVIIa/TF forma um complexo binário com fXa através da ligação a um local de reconhecimento específico na enzima, o qual é distinto dos locais de reconhecimento primários P4-P1, dentro do centro catalítico da enzima. Isto é seguido da formação de um complexo inibidor quaternário com o complexo fVIIa/TF. Consistente com esta hipótese, está o facto de EGR-fXa poder suportar totalmente a inibição de fVIIa/TF por NAPs inibidoras de fVIIa/TF, apesar da ocupação ΡΕ0788546 - 47 - covalente dos locais de reconhecimento primários (P4-P1) dentro do local catalítico de fXa pela tripeptidil-clorometil cetona (EGR-CMK). A actividade inibidora de fVIIa/TF de NAPs também pode ser determinada usando os protocolos do Exemplo D, assim como os ensaios fXa descritos nos Exemplos A e C. Ai, é medida a capacidade de uma NAP inibir a actividade catalítica de uma variedade de enzimas relativamente ao complexo fVIIa/TF. A inibição específica de fVII/TF por uma NAP é uma característica desejável para determinadas aplicações.

Um outro aspecto do invento inclui uma proteína isolada tendo actividade anticoagulante e cDNAs codificadores da proteína, em que a referida proteína inibe especificamente a actividade catalítica do complexo fVIIa/TF na presença de fXa ou de um derivado de fXa cataliticamente inactivo, mas não inibe especificamente a actividade de FVIIa na ausência de TF e não inibe especificamente protrombinase. Proteínas preferidas de acordo com este aspecto do invento possuem as caracte-rísticas descritas atrás para uma proteína isolada tendo actividade inibidora do Factor VIIa/TF e tendo um ou mais domínios NAP. Uma proteína preferida de acordo com este aspecto do invento é AcaNAPc2. NAPs dentro do aspecto do invento são identificadas pela sua actividade inibidora de fVIIa/TF na 48 ΡΕ0788546 presença de fXa ou de um derivado de fXa, quer o derivado seja cataliticamente activo ou não. Os protocolos descritos nos Exemplos B, C e F são úteis na determinação de actividade anticoagulante de tais NAPs. 0 protocolo no Exemplo A pode detectar uma inactividade de NAP relativamente a fXa livre ou protrombinase. Os dados gerados usando os protocolos no Exemplo E identificarão NAPs que necessitam de fXa cataliticamente activo ou inactivo para inibir o complexo fVIIa/TF. NAPs tendo actividade inibidora de serina-protease (Fórmula IV)

Num aspecto adicional, NAPs do presente invento também incluem uma proteína isolada tendo actividade inibidora de serina-protease e tendo um ou mais domínios NAP, em que cada domínio NAP inclui a sequência: Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-AlO ("Fórmula IV"), em que (a) AI é uma sequência de aminoácidos de 7 a 8 resíduos de aminoácidos; (b) A2 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 resíduos de aminoácidos; (c) A3 é uma sequência de aminoácidos de 3 resíduos de aminoácidos; 49 ΡΕ0788546 (d) A4 é uma sequência de aminoácidos de 6 a 19 resíduos de aminoácidos; (e) A5 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 4 resíduos de aminoácidos; (f) A6 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 resíduos de aminoácidos; (q) A7 é um aminoácido; (h) A8 é uma sequência de aminoácidos de 10 a 12 resíduos de aminoácidos; (i) A9 é uma sequência de aminoácidos de 5 a 7 resíduos de aminoácidos; e (j) AIO é uma sequência de aminoácidos de 1 a 25 resíduos de aminoácidos.

Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com este aspecto e métodos de inibição da coagulação sanguínea compreendendo a administração de proteínas NAP de acordo com este aspecto são igualmente contempladas por este invento. Proteínas NAP dentro deste aspecto do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidas NAPs tendo um ou mais domínios NAP. São preferidos os domínios NAP tendo as sequências de aminoácidos que são substancialmente as mesmas dos domínios 50 ΡΕ0788546 NAP de ΗροΝΑΡ5 [SEQ. ID. NO. 60] ou NamNAP [SEQ. ID. NO. 61]. Proteínas NAP HpoNAP5 [SEQ. ID. NO. 60] e NamNAP [SEQ. ID. NO. 61] possuem um domínio NAP e são NAPs preferidas de acordo com este aspecto do invento.

Assim, num aspecto preferido, NAPs apresentando actividade de serina-protease possuem pelo menos um domínio NAP da fórmula IV, que inclui a sequência de aminoácidos: Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 em que (a) Cys-Al é seleccionado de SEQ. ID. NOs. 86 e 254; (b) Cys-A2-Cys é seleccionado de uma de SEQ. ID. NOS. 255 a 257; (c) A3-Cys-A4 é seleccionado de uma sequência de SEQ. ID. NOS. 258 a 271; (d) Cys-A5 é seleccionado de SEQ. ID. NOS. 272 e 273; (e) Cys-A6 é seleccionada de uma de SEQ. ID. NOS. 274 a 276; (f) Cys-A7-

Cys-A8 é seleccionado de SEQ. ID. NO. 277 e 279; (g) Cys-A9 é seleccionado de uma SEQ. ID. NOS. 280 a 282; e (h) Cys-A10 é seleccionado de uma SEQ. ID. NOS. 283 a 307.

Numa outra realização preferida deste aspecto do invento, A3 tem a sequência Glu-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos independentemente seleccio-nados. Mais preferencialmente, A3 é Glu-Pro-Lys.

Numa outra realização preferida, A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica.

Numa outra sequência A5a-A5b-A5c, realização preferida, A5 tem a c são resíduos de em que A5a a A5 51 ΡΕ0788546 aminoácidos independentemente seleccionados. De preferência A5 a é Thr e A5C é Asn. Uma sequência A5 especialmente seleccionada inclui Thr-Leu-Asn ou Thr-Met-Asn.

De acordo com este aspecto do invento, um resíduo de aminoácido A7 preferido é Gin.

Numa realização deste aspecto do invento, uma molécula NAP preferida é aquela em que (a) A3 tem a sequência Glu-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos seleccionados independentemente; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A5 tem a sequência A5a-A5b-A5c, em que A5a a A5C são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados e (d) A7 é Gin. Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com esta realização são igualmente contemplados por este invento. Proteínas NAP dentro desta realização do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidos NAPs tendo um ou dois domínios NAP. As proteínas NAP HpoNAPõ [SEQ. ID. NO. 60] e NamNAP [SEQ. ID. NO. 61] possuem um domínio NAP e são NAPs preferidas de acordo com esta realização do invento. 52 ΡΕ0788546

Numa outra realização preferida,uma molécula NAP é aquela em que (a) A3 é Glu-Pro-Lys; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A5 é seleccionado entre Thr-Leu-Asn e Thr-

Met-Asn; e (d) A7 é Gin. Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com esta realização e métodos de inibição da coagulação sanguínea compreendendo administração de proteínas NAP de acordo com esta realização são igualmente contemplados por este invento. Proteínas NAP dentro desta realização do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidas NAPs tendo um ou dois domínios NAP. As proteínas NAP HpoNAP5 [SEQ. ID. NO. 60] e NamNAP [SEQ. ID. NO. 61] possuem um domínio NAP e são NAPs preferidas de acordo com esta realização do invento.

Proteínas NAP preferidas tendo actividade inibidora de serina-protease, de acordo com todas as realizações descritas atrás para este aspecto do invento, podem derivar de uma espécie de nemátodo. Uma espécie de nemátodo preferida é seleccionada do grupo consistindo em Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus e Heligomosomoides polygyrus. São particularmente preferidas as proteínas NAP HpoNAP5 e 53 ΡΕ0788546

NamNAP derivadas de Heligosomoides polygyrus e Necator americanus, respectivamente.

Este aspecto do invento também contempla moléculas de cDNA recombinantes isoladas, codificadoras de uma proteína tendo actividade inibidora de serina-protease, em que a proteína é definida de acordo com cada uma das realizações referidas atrás para proteína NAP isolada tendo actividade inibidora de serina-protease. cDNAs preferidos de acordo com este aspecto possuem sequências nucleotídicas [SEQ. ID. NO. 14] (HpoNAP5) e [SEQ. ID. NO. 39] (NamNAP) e codificam HpoNAP5 [SEQ. ID. NO. 60] e NamNAP [SEQ. ID. NO. 61] . A actividade de serina-protease pode ser determinada usando qualquer um dos ensaios descritos nos Exemplos A a F, ou qualquer ensaio enzimático normalmente usado para medir inibição de actividade de serina-protease. Os procedimentos para uma série de ensaios enzimáticos pode ser encontrado nos volumes de Methods of Enzymology ou materiais de referência semelhantes. NAPs preferidos possuem actividade inibidora de serina-protease tendo como alvo enzimas da cascata de coagulação sanguínea ou a tripsina/elastase. NAPs tendo actividade anticoagulante (Fórmula V)

Num outro aspecto do invento, NAPs do presente isolada tendo invento também incluem uma proteína 54 ΡΕ0788546 actividade anticoagulante e tendo um ou mais domínios NAP, em que cada um dos domínios NAP inclui a sequência: Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-AlO ("Fórmula V"), em que (a) AI é uma sequência de aminoácidos de 7 a 8 resíduos de aminoácidos; (b) A2 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 resíduos de aminoácidos; (c) A3 é uma sequência de aminoácidos de 3 resíduos de aminoácidos; (d) A4 é uma sequência de aminoácidos de 6 a 19 resíduos de aminoácidos; (e) A5 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 4 resíduos de aminoácidos; (f) A6 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 resíduos de aminoácidos; (g) A7 é um aminoácido; (h) A8 é uma sequência de aminoácidos de 11 a 12 resíduos de aminoácidos; 55 ΡΕ0788546 (i) A9 é uma sequência de aminoácidos de 5 a 7 resíduos de aminoácidos; e (j) AIO é uma sequência de aminoácidos de 5 a 25 resíduos de aminoácidos.

Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com este aspecto e métodos de inibição da coagulação sanguínea compreendendo a administração de proteínas NAP de acordo com este aspecto são igualmente contempladas por este invento. Proteínas NAP dentro deste aspecto do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidas NAPs tendo um ou mais domínios NAP. São preferidas as NAPs tendo um ou dois domínios NAP possuindo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente a mesma de qualquer uma de [SEQ. ID. NOS. 40 a 58]. As proteínas NAP AcaNAP5 [SEQ. ID. NO. 40], NAP AcaNAPô [SEQ. ID. NO. 41], NAP AcaNAP48 [SEQ. ID. NO. 42], NAP AcaNAP23 [SEQ. ID. NO. 43], NAP AcaNAP24 [SEQ. ID. NO. 44], NAP AcaNAP25 [SEQ. ID. NO. 45], NAP AcaNAP44 [SEQ. ID. NO. 46], NAP AcaNAP31 [SEQ. ID. NO. 47], AduNAP4 [SEQ. ID. NO. 55], AceNAP5 [SEQ. ID. NO.57] e AceNAP7 [SEQ. ID. NO. 58 ] possuem um domínio NAP e sao NAPs preferidas de acordo com este aspecto do invento. As proteínas NAP AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 62], AcaNAP45 [SEQ . ID. NO. 63] , AcaNAP4 7 [SEQ. ID. NO. 64] e AduNAP 7 [SEQ. ID. NO. 65] possuem dois domínios NAP e são NAPs preferidas de acordo com este aspecto do invento. NAPs preferidas do presente invento de acordo com 56 ΡΕ0788546 este aspecto incluem proteínas isoladas tendo actividade anticoagulante e tendo pelo menos um domínio NAP da fórmula V que inclui a seguinte sequência: Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 em que (a) Cys-Al é seleccionado de SEQ. ID. NOs. 87 e 308; (b) Cys-A2-Cys é seleccionado de uma de SEQ. ID. NOS. 309 a 311; (c) A3-Cys-A4 é seleccionado de uma sequência de SEQ. ID. NOS. 312 a 325; (d) Cys-A5 é seleccionado de SEQ. ID. NOS. 326 e 327; (e) Cys-A6 é seleccionada de uma de SEQ. NOS . 328 a 330; (f) Cys-A7-Cys-A8 é seleccionado de ID. NO. 331 e 332; (g) Cys-A9 é seleccionado de uma ID. NOS . 333 a 335; e (h) Cys-Al0 é seleccionado de uma SEQ. ID. NOS. 336 a 356.

Numa outra realização preferida, A3 tem a sequência Glu-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados. Mais preferencialmente, A3a é seleccionado do grupo consistindo em Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu e Thr e A3b é seleccionado do grupo consistindo em Lys, Thr e Arg. Sequências A3 especialmente preferidas são seleccionadas do grupo consistindo em Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys e Glu-Thr-Lys.

Numa outra realização preferida deste aspecto do invento, A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica. 57 ΡΕ0788546

De acordo com este aspecto do invento, um resíduo de aminoácido A7 preferido é Vai ou lie.

Uma outra realização preferida deste aspecto do invento é um em que A8 inclua a sequência de aminoácidos A8a-A8b-A8c-A8d-A8e-A8f-A8g [SEQ. ID. NO. 68], em que (a) A8a é o primeiro resíduo de aminoácido em A8; (b) pelo menos de um de A8a e A8b é seleccionado do grupo consistindo em Glu ou Asp; e (c) A8C a A8g são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados.

De preferência, A8C é Gly, A8d é seleccionado do grupo consistindo em Phe, Tyr e Leu, A8e é Tyr, A8f é Arg e A8g é seleccionado entre Asp e Asn. Uma sequência especialmente preferida A8c-A8d-A8e-A8f-A8g é seleccionada do grupo consistindo em Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 72] e Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 73].

Uma outra realização preferida é uma em que AIO inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] e Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77]. 58 ΡΕ0788546

As proteínas NAP AcaNAP5 [SEQ. ID. NOS. 4 e 40] e AcaNAP6 [SEQ. ID. NOS. 6 e 41] incluem a sequência de aminoácidos Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74] em AIO e são preferidas NAPs de acordo com esta realização do invento. A proteína NAP AcaNAP48 [SEQ. ID. NO. 42] inclui a sequência de aminoácidos Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75] em AIO e é uma NAP preferida de acordo com esta realização do invento. As proteínas NAP AcaNAP23 AcaNAP23 [SEQ. ID. NO 43], AcaNAP2 4 [SEQ. ID. NO. 44], AcaNAP25 [SEQ. ID. NO. 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. NO. 46], AcaNAP31 [SEQ. ID. NO. 47] e AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 48, 49 e 62] incluem a sequência de aminoácidos Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] e são NAPs preferidas de acordo com esta realização do invento. AS proteínas NAP AcaNAP45 [SEQ. ID. NOS. 50, 53 e 63],

AcaNAP4 7 [SEQ. ID. NO. 51, 54 e 64], AduNAP 7 [SEQ. ID. NO. 52, 56 e 65], AduNAP4 [SEQ. ID. NO. 55], AceNAPP5 [SEQ. ID. NO. 57] e AceNAP7 [SEQ. ID. NO. 58] incluem a sequência de aminoácidos Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77] e são NAPs preferidas de acordo com esta realização do invento.

Numa realização, uma molécula NAP preferida é aquela em que (a) A3 tem a sequência Glu-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos seleccionados independentemente; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; ΡΕ0788546 59 (c) A 7 é seleccionada do grupo consistindo em Vai e Ile; (d) A8 inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 72] e Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 73]; e (e) AIO inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] e Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77]. Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com esta realização, e métodos de inibição da coagulação sanguínea compreendendo administração de proteínas NAP de acordo com esta realização também estão contempladas por este invento. As proteínas NAP dentro desta realização do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidas NAPs tendo um ou mais domínios NAP. As proteínas NAP AcaNAP5 [SEQ. ID. NOS. 4 e 40], AcaNAP6 [SEQ. ID. NOS. 6 e 41], AcaNAP48 [SEQ. ID. NO. 42], AcaNAP23 [SEQ. ID. NO. 43], AcaNAP24 [SEQ. ID. NO. 44], AcaNAP25 [SEQ . ID. NO . 45], AcaNAP4 4 [SEQ. ID. NO. 46], AcaNAP31 [SEQ. ID. NO. 47], AduNAP4 [SEQ . ID. NO. 55] , AceNAP5 [SEQ. ID. NO. 57] e AceNAP7 [SEQ. ID. NO. 58] possuem um domínio NAP e sao NAPs preferidas de acordo com 60 ΡΕ0788546 esta realização. As proteínas NAP AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 62] , AcaNAP45 [SEQ. ID. NOO. 63] , AcaNAP4 7 [SEQ. ID. NO. 64] e AduNAP7 [SEQ. ID. NO. 65] possuem dois domínios NAP e são NAPs preferidas de acordo com esta realização.

Numa outra realização preferida, uma molécula NAP é aquela em que (a) A3 é seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys e Glu-Thr-Lys; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A7 é Vai ou Ile; (d) A8 inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em A8a-A8b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 78], A8a-A8b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 79], A8a-A8b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 80], A8a-A8b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 81] e A8a-A8b-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 82], em que pelo menos um de A8a e A8b é Glu ou Asp; (e) A9 é uma sequência de aminoácidos de cinco resíduos de aminoácidos; e (f) AIO inclui uma sequência de aminoácidos 61 ΡΕ0788546 seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] e Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77] . Composições farmacêuticas compreendendo proteínas NAP de acordo com esta realização, e métodos de inibição da coagulação sanguínea compreendendo administração de proteínas NAP de acordo com esta realização também estão contempladas por este invento. As proteínas NAP dentro desta realização do invento possuem pelo menos um domínio NAP. São preferidas NAPs tendo um ou mais domínios NAP. As proteínas NAP AcaNAP5 [SEQ. ID. NOS. 4 e 40], AcaNAP6 [SEQ. ID. NOS. 6 e 41], AcaNAP48 [SEQ. ID. NO. 42], AcaNAP23 [SEQ. ID. NO . 43], AcaNAP2 4 [SEQ . ID. NO. 44], AcaNAP25 [SEQ . ID. NO • 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. NO. 46], AcaNAP31 [SEQ. ID. NO. 47 ], AduNAP 4 [SEQ . ID. NO. 55] , AceNAP5 [SEQ. ID. NO. 57] e AceNAP7 [SEQ. ID. NO. 58] possuem um domínio NAP e são NAPs preferidas de acordo com esta realização. As proteínas NAP AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 62], AcaNAP45 [SEQ. ID. NO. 63], AcaNAP47 [SEQ. ID. NO. 64] e AduNAP7 [SEQ. ID. NO. 65] possuem dois domínios NAP e são NAPs preferidas de acordo com esta realização.

Proteínas NAP preferidas tendo actividade anticoagulante, de acordo com todas as realizações descritas atrás para este aspecto do invento, podem derivar de uma espécie de nemátodo. Uma espécie de nemátodo preferida é seleccionada do grupo consistindo em Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus e Heligomosomoides polygyrus. 62 ΡΕ0788546

Sao partiularmente preferidas as proteínas NAP AcaNAP5 [SEQ. ID. NOS . 4 e 40] , AcaNAP6 [SEQ. ID. NOS. 6 e 41] , AcaNAP48 [SEQ. ID. NO. 42] , AcaNAP23 [SEQ. ID. NO. 43] , AcaNAP24 [SEQ. ID. NO. 44] , AcaNAP25 [SEQ. ID. NO. 45] , AcaNAP4 4 [SEQ. ID. NO. 46] , AcaNAP45 [SEQ. ID. NO. 63] , AcaNAP4 7 [SEQ. ID. NO. 64] e AcaNAP31 [SEQ . ID . NO. 47] derivadas de Ancylostoma caninum; AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 62], AceNAP5 [SEQ. ID. NO. 57] e AceNAP7 [SEQ. ID. NO. 58] derivadas de Ancylostoma ceylanicum; e AduNAP7 [SEQ. ID. NO. 65] e AduNAP4 [SEQ. ID. NO. 55] derivada de Ancylostoma duodenale.

Este aspecto do invento também contempla moléculas de cDNA recombinante isoladas codificadoras de uma proteína tendo actividade anticoagulante, em que a proteína é definida de acordo com cada uma das realizações referidas atrás para proteína NAP isolada tendo actividade anticoagulante. cDNAs preferidos de acordo com este aspecto incluem . AcaNAP5 [SEQ. ID . NO. 3], AcaNAP6 [SEQ. ID. NO. 5], AcaNAP4 8 [SEQ. ID. NO. 38] , AcaNAP23 [SEQ . ID . N. 31] , AcaNAP24 [SEQ. ID. NO. 44] , AcaNAP25 [SEQ. ID. NO. 45] , AcaNAP4 4 [SEQ. ID. NO. 32] , AcaNAP31 [SEQ. ID. NO. 34] , AduNAP4 [SEQ. ID. NO. 12] , AceNAP5 [SEQ. ID. NO. 10] , AceNAP7 [SEQ. ID. NO. 11] , AceNAP4 [SEQ. ID. NO . 9] , AcaNAP45 [SEQ. ID. NO. 36] , AcaNAP4 7 [SEQ. ID. NO. 37] e

AduNAP 7 [SEQ. ID. NO. 13] . A actividade anticoagulante de NAPs dentro deste aspecto do invento pode ser determinada usando protocolos 63 ΡΕ0788546 aqui descritos. Os exemplos B e F apresentam métodos particularmente úteis para avaliar uma actividade de anticoagulação de NAP. Os procedimentos descritos para a detecção de NAPs tendo actividade inibidora de fXa (Exemplos A, C) e actividade inibidora de fVIIa/TF (Exemplo E) são também úteis na avaliação de uma actividade de anticoagulação de NAP. 01igonucleótidos

Um outro aspecto deste invento é um oligonu-cleótido compreendendo uma sequência seleccionada entre YG109: TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [SEQ. ID. NO. 88] , YG103: AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEQ. ID. NO. 89] , NAP-1: AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY [SEQ. ID. NO. 90] e NAP-4.RC: TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA [SEQ. ID. NO. 91].

Estas sequências oligonucleotídicas hibridam com sequências de ácido nucleico codificadoras de proteína NAP.

As NAPs isoladas do presente invento incluem as possuidoras de variações na sequência ou sequências de aminoácidos descritas, incluindo fragmentos, mutações naturais, variantes alélicas, mutantes artificiais gerados ao acaso e variações intencionais das sequências, todas 64 ΡΕ0788546 elas conservando a actividade anticoagulante. 0 termo "fragmentos" refere-se a qualquer parte da sequência que contem menos aminoácidos do que a proteína completa, como por exemplo, sequências parciais excluindo porções no extremo amina, extremo carboxilo ou entre o extremo amina e o extremo carboxilo da proteína completa.

As NAPs isoladas do presente invento também incluem proteínas tendo uma sequência ou sequências de aminoácidos recombinantes que conservam a actividade anticoagulante da sequência ou sequências de aminoácidos do domínio NAP. Assim, como aqui é usada, a frase "proteína NAP" ou o termo "proteína" quando se refere a uma proteína compreendendo um domínio NAP significa, sem discriminação, proteína NAP nativa e proteína NAP preparada por meios recombinantes. Estas proteínas recombinantes incluem proteínas híbridas, tais como proteínas de fusão, proteínas resultantes da expressão de múltiplos genes dentro do vector de expressão, proteínas resultantes da expressão de múltiplos genes dentro do cromossoma da célula hospedeira e podem incluir um polipeptídeo, tendo actividade anticoagulante de uma proteína descrita, ligado por ligações peptídicas a um segundo polipeptídeo. As proteínas recombinantes também incluem variantes da sequência ou sequências de aminoácidos do domínio NAP do presente invento que diferem apenas na substituição de aminoácidos conservadas. As substituições de aminoácidos conservadas são definidas como "séries" na Tabela 1 de Taylor, W.R., J. Mol. Biol., 188:233 (1986). As proteínas recombinantes 65 ΡΕ0788546 também incluem variantes da sequência ou sequências de aminoácidos do domínio NAP isolado descrito do presente invento, em que são feitas substituições ou deleções de aminoácidos que conservam a actividade anticoaqulante da sequência ou sequências do domínio NAP isolado.

Uma realização preferida do presente invento é uma proteína isolada por métodos bioquímicos a partir do nemátodo Ancylostoma caninum, como descrito no Exemplo 1. Esta proteína aumenta o tempo de coagulação de plasma humano nos ensaios PT e aPTT, possui um domínio NAP e caracteriza-se por um extremo N tendo a sequência de aminoácidos Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [SEQ. ID. NO. 92] e um peso molecular de aproxi-madamente 8,7 quilodaltons a cerca de 8,8 quilodaltons conforme determinado por espectrometria de massa.

Outras realizações preferidas do presente invento incluem as proteínas tendo actividade anticoaqulante preparadas pelos métodos recombinantes, a partir da biblioteca de cDNA do nemátodo Ancylostoma caninum, por exemplo AcaNAPõ [SEQ. ID. NO 4 ou 40], AcaNAP6 [SEQ. ID. NO. 6 ou 41], Pro-AcaNAP5 [SEQ. ID. NO. 7], Pro-AcaNAP6 [SEQ D NO. 8], AcaNAP48 [SEQ. ID. NO. 42], AcaNAP23 [SEQ. ID. NO. 43], AcaNAP2 4 [SEQ. ID. NO. 44], AcaNAP25 [SEQ. ID. NO. 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. NO. 46], ACaNAP31 [SEQ. ID. NO. 47], AcaNAP45 [SEQ. ID. NO. 63], AcaNAP47 [SEQ. ID. NO. 64] e AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 59]; isoladas a partir do nemátodo Ancylostoma ceylanicum, por exemplo AceNAP4 [SEQ. 66 ΡΕ0788546 ID. NO. 62], AceNAP5 [SEQ. ID. NO. 57] e AceNAP7 [SEQ. ID. NO. 58]; isoladas a partir do nemátodo Ancylostoma duodenale, por exemplo, AduNAP4 [SEQ. ID. NO. 55] e AduNAP7 [SEQ. ID. NO. 65]; isoladas a partir do nemátodo Heligmosmoides polygyrus, por exemplo, HpoNAP5 [SEQ. ID. NO. 60]; e do nemátodo Necator americanus, por exemplo, MamNAP [SEQ. ID. NO. 61]. As sequências de aminoácidos destas proteínas estão apresentadas nas Figuras 11 e 16 e noutros locais. Cada uma destas realizações preferidas aumenta o tempo de coagulação de plasma humano nos ensaios PT e aPTT e contem pelo menos um domínio NAP.

Relativamente às "proteínas isoladas", as proteínas do presente invento são isoladas por métodos de purificação de proteínas bem conhecidos na área ou como aqui descrito abaixo. Podem ser isoladas a partir de uma fonte natural, a partir de uma mistura química após síntese química em fase sólida ou em solução, como seja síntese automática de peptídeos em fase sólida ou a partir de uma cultura celular após produção por métodos recombinantes.

Como aqui descrito mais abaixo, o presente invento também contempla composições farmacêuticas compreendendo NAP e métodos de utilização de NAP para inibir o processo de coagulação sanguínea e trombose associada. As sondas oligonucleotídicas úteis na identificação de ácido nucleico NAP numa amostra também estão dentro do âmbito do presente invento, como descrito mais detalhadamente abaixo. 67 ΡΕ0788546 1. NAP Isolada a partir de fontes naturais

As proteínas isoladas preferidas (NAPs) do presente invento podem ser isoladas e purificadas a partir de fontes naturais. Os nemátodos são fontes naturais preferidas; os nemátodos adequados incluem nemátodos intestinais tais como Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus e Heligomosomoides polygyrus. É especialmente preferida como fonte natural o nemátodo hematófago, o ancilóstomo, Ancylostoma caninum.

As proteínas preferidas do presente invento são isoladas e purificadas a partir das suas fontes naturais por métodos conhecidos na área da bioquímica. Estes métodos incluem preparação de um extracto solúvel e enriquecimento do extracto usando métodos cromatográficos em diferentes matrizes de suporte sólido. Métodos preferidos de purificação incluirão preparação de um extracto solúvel de um nemátodo em tampão Tris-HCl 0,02M, pH 7,4 contendo vários inibidores de proteases, seguido de cromatografia sequenciada do extracto através de colunas contendo matriz de Concanavalina-A Sepharose, matriz de permuta iónica catiónica Poros20 HQ, matriz de filtração em gel Superdex30 e uma matriz de fase reversa C18. As fracções colhidas de tais colunas de cromatografia podem ser seleccionadas pela sua capacidade para aumentar o tempo de coagulação de plasma humano, conforme medido pelos ensaios PT e aPTT, ou pela sua capacidade para inibir a actividade amidolítica do ΡΕ0788546 factor Xa conforme medido num ensaio amidolitico colorimétrico usando enzima purificada ou por outros métodos descritos nos Exemplos A a F aqui descritos. Um exemplo de um método preferido de purificação de uma proteína isolada do presente invento incluirá o descrito no Exemplo 1.

As proteínas preferidas do presente invento, quando purificadas a partir de uma fonte natural, como seja Ancylostoma caninum, como descrito, incluem as que possuem a sequência de aminoácidos: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [SEQ. ID. NO. 92]. São especialmente preferidas as proteínas purificadas tendo esta sequência de aminoácidos no seu extremo amina, como se mostra na Figura 2 (AcaNAP5 [SEQ. ID. NO. 4]) ou Figura 4 (AcaNAP6 [SEQ. ID. NO.6]). Uma outra proteína preferida do presente invento demonstrou-se ter a sequência de aminoácidos Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [SEQ. ID. NO. 92] e um peso molecular de aproximadamente 8,7 quilodaltons a cerca de 8,8 quilodaltons conforme determinado por espectrometria de massa. 2. NAP preparada por síntese química

As NAPs isoladas preferidas do presente invento podem ser sintetizados por métodos convencionais conhecidos na área da química. 69 ΡΕ0788546

As proteínas isoladas do presente invento podem ser preparadas usando síntese em fase sólida, como seja a descrita por Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85:2149 (1964) ou outros métodos equivalentes conhecidos na área da química, como seja o método descrito por Houghten em Proc. Natl. Acad. Sei., 82:5132 (1985). A síntese em fase sólida inicia-se no extremo C do peptídeo, através do acoplamento de uma aminoácido ou peptídeo protegido a uma resina insolúvel adequada. Resinas adequadas incluem as que possuem grupos clorometilo, bromometilo, hidroximetilo, aminometilo, benzidrilo e t-alquiloxicarbonil-hidrazida aos quais o aminoácido pode ser directamente acoplado.

Nesta síntese em fase sólida, o aminoácido do extremo carboxilo, tendo o seu grupo alfa amina e, se necessário, o seu grupo da cadeia lateral reactivo adequadamente protegido, é primeiro acoplado à resina insolúvel. Após remoção do grupo protector alfa amina, como seja por tratamento com ácido trifluoroacético num solvente adequado, o aminoácido ou peptídeo seguinte, também tendo o seu grupo alfa amina e, se necessário, qualquer grupo ou grupos reactivos da cadeia lateral adequadamente protegidos, é acoplado ao grupo alfa amina do aminoácido acoplado à resina. Aminoácidos ou peptídeos adequadamente protegidos são acoplados da mesma forma à cadeia peptídica em crescimento, até ser atingida a sequência de aminoácidos pretendida. A síntese pode ser feita manualmente, usando 70 ΡΕ0788546 sintetizadores de peptídeos automáticos ou por uma combinação dos mesmos. O acoplamento do aminoácido ou peptídeo adequadamente protegido ao grupo alfa amina livre do aminoácido ligado à resina pode ser realizadoa de acordo com métodos de acoplamento convencionais, tais como o método de azida, método de anidridos mistos, método DCC (diciclo-hexil-carbodiimida), método do éster activado (éster p-nitrofe-nílico ou éster de N-hidroxi-succinimida), método BOP (hexafluorofosfato de benzotriazole-l-il-oxi-tris(diami-no)fosfónio) ou método do reagente K de Woodward. É normal na síntese de peptídeos que os grupos protectores do grupo alfa amina dos aminoácidos ou peptídeos acoplados à cadeia peptídica em crescimento ligada à resina insolúvel sejam removidos em condições que não removem os grupos protectores da cadeia lateral. Quando completada a síntese, é também comum que o peptídeo seja removido da resina insolúvel e durante ou após tal remoção, os grupos protectores das cadeias laterais são removidos. metil-

Grupos protectores adequados para o grupo alfa amina de todos os aminoácidos e do grupo ómega amina da lisina incluem benziloxicarbonilo, isonicotiniloxi-carbonilo, o-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrofeniloxicar-bonilo, p-metoxifeniloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo, t-amiloxicarbonilo, adaantiloxicarbonilo, 2-(4-bifenil)-2-propiloxicarbonilo, 9-fluorofenilmetoxicarbonilo, 71 ΡΕ0788546 sulfoniletoxilcarbonilo, trifluoroacetilo, ftalilo, formi-lo, 2-nitrofenilsulfenilo, difenilfosfinotioilo, dimetil-fosfinotioilo e similares.

Grupos protectores adequados para o grupo carbo-xilo de ácido aspártico e ácido glutâmico incluem éster benzilico, éster ciclo-hexílico, éster 4-nitrobenzílico, éster t-butilico, éster 4-piridilmetílico e similares.

Grupos protectores adequados para o grupo guanidino de arginina incluem nitro, p-toluenossulfonilo, benziloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, p-metoxibenze-nossulfonilo, 4-metoxi-2,6-dimetilbenzenossulfonilo, 1,3,5-trimetilfenilsulfonilo e similares.

Grupos protectores adequados para o grupo tiol de cisteina incluem p-metoxibenzilo, trifenilmetilo, acetil-aminometilo, etilcarbamoilo, 4-metilbenzilo, 2,4,6-trime-tilbenzilo e similares.

Grupos protectores adequados para o grupo hidroxilo de serina incluem benzilo, t-butilo, acetilo, tetra-hidropiranilo e similares. 0 peptídeo completo pode ser separado da resina por tratamento com ácido fluórico liquido, contendo um ou mais captores com tio a temperaturas reduzidas. A clivagem do peptídeo da resina por tal tratamento também removerá grupos protectores das cadeias laterais do peptídeo. 72 ΡΕ0788546 0 peptídeo clivado é dissolvido em ácido acético diluído seguido de filtração, depois é deixado a renaturar e estabelecer a formação de ligações dissulfureto adequadas por diluição para uma concentração peptídica de aproxi-madamente 0,5 mM a cerca de 2 mM numa solução de ácido acético 0,1M. 0 pH desta solução foi ajustado a cerca de 8,0 usando hidróxido de amónio e a solução foi agitada ao ar durante cerca de 24 a 72 horas. 0 peptídeo renaturado é purificado por croma-tografia, de preferência por cromatografia líquida de alta pressão numa coluna de fase reversa, eluindo com um gradiente de acetonitrilo em água (também contendo 0,1% de ácido trifluoroacético), com o gradiente preferido correndo de 0 a cerca de 80% de acetonitrilo em água. Quando da colheita das fracções contendo o peptídeo puro, as fracções foram reunidas e liofilizadas para se obter o peptídeo sólido. 3. NAP preparada por métodos recombinantes.

Como alternativa, NAPs isoladas preferidas do presente invento podem ser preparadas por métodos de DNA recombinante aqui descritos e bem conhecidos nas áreas da biologia. Sambrook, J., Fritsch,E.F. e Maniatis, T., Molecular Clonlng, Ά Laboratory Manual, Segunda Edição, volumes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). 73 ΡΕ0788546

Os métodos de DNA recombinante permitem que segmentos de informação genética, DNA, de diferentes organismos, sejam ligados fora dos organismos de onde o DNA foi obtido e permitem que este DNA híbrido seja incorporado numa célula, a qual permitirá a produção da proteína codificada pelo DNA original. A informação genética codificadora de uma proteína do presente invento pode ser obtida a partir de DNA genómico ou mRNA de um organismo por métodos conhecidos na área. Métodos preferidos de obtenção desta informação genética incluem isolamento de mRNA de um organismo, conversão do mesmo no seu DNA complementar (cDNA), incorporação de cDNA num vector de clonagem adequado e identificação do clone que contem o cDNA recombinante codificador da proteína pretendida por meio de hibridação com sondas oligonucleotídicas adequadas construídas a partir de sequências conhecidas da proteína. A informação genética no cDNA recombinante codificador de uma proteína do presente invento pode ser ligada a um vector de expressão, o vector introduzido nas células hospedeiras e a informação genética expressa como a proteína codificada. (A) Preparação de Bibliotecas de cDNA.

Os nemátodos são fontes naturais preferidas de mRNA a partir das quais se constrói uma biblioteca de cDNA, 74 ΡΕ0788546 os quais incluem nemátodos intestinais tais como Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus e Heligomosomoides polygyrus. É especialmente preferida como fonte natural de mRNA, o nemátodo ancilóstomo Ancylostoma caninum. Métodos preferidos de isolamento de mRNA codificador de uma proteína do presente invento, juntamente com outro mRNA derivado de um organismo, incluem cromatografia em géis de afinidade de poli U ou poli T. Métodos especialmente preferidos de isolamento do mRNA a partir de nemátodos incluem o procedimento e materiais proporcionados no kit de purificação de mRNA QuickPrep (Pharmacia). Métodos preferidos de obtenção de cDNA de cadeia dupla a partir de mRNA isolado incluem a síntese de um cDNA de cadeia simples sobre a matriz de mRNA usando uma transcriptase reversa, degradação do RNA hibridado com a cadeia de cDNA usando uma ribonuclease (RNase) e síntese de uma cadeia de DNA complementar usando uma DNA polimerase para dar um cDNA de cadeia dupla. Métodos especialmente preferidos incluem aqueles em que cerca de 3 microgramas de mRNA isolado a partir de um nemátodo é convertido em cDNA de cadeia dupla fazendo uso da transcriptase reversa do Vírus da Mieloblastose, RNase H e DNA polimerase I de E. coli e DNA polimerase de T4. cDNA codificador de uma proteína do presente invento, juntamente com outro cDNA na biblioteca construída 75 ΡΕ0788546 como descrito atrás, são então ligados a vectores de clonagem. Os vectores de clonagem incluem uma sequência de DNA que acomoda o cDNA da biblioteca de cDNA. Os vectores contendo a biblioteca de cDNA são introduzidos nas células hospedeiras que podem existir de forma estável e proporcionam um ambiente em que o vector de clonagem é replicado. Vectores de clonagem adequados incluem plasmideos, bacteriófagos, virus e cosmideos. Vectores de clonagem preferidos incluem os bacteriófagos. Os vectores de clonagem que são especialmente preferidos incluem o vector bacteriófago lambda gtll Sfi-Not. A construção de vectores de clonagem adequados contendo a biblioteca de cDNA e sequências de controlo empregam técnicas de ligação e restrição convencionais que são bem conhecidas na área. Plasmideos isolados, sequências de DNA ou oligonucleótidos sintetizados são clivados, cortados e religados na forma pretendida.

Relativamente às técnicas de restrição, a clivagem especifica de local do cDNA é realizada por tratamento com enzima de restrição adequadas em condições que são de um modo geral conhecidas na área e cujas especificações são descritas pelo fabricante destas enzimas de restrição comerciais. Por exemplo, ver os catálogos de produtos de New England Biolabs, Promega e Satatgene Cloning Systems.

De um modo geral, cerca de 1 micrograma do cDNA é clivado por tratamento com uma unidade de uma enzima de 76 ΡΕ0788546 restrição em cerca de 20 microlitros de solução tampão. Tipicamente, um excesso de enzima de restrição é usado para assegurar clivagem completa do cDNA. Tempos de incubação de aproximadamente 1 a 2 horas a cerca de 3 7°C são geralmente usados, apesar de serem conhecidas excepções. Após cada uma das reacções de clivagem, a proteína pode ser removida por extracção com fenol/clorofórmio, facultativamente seguido de cromatografia numa coluna de filtração em gel, como seja Sephadex® G50. Como alternativa, fragmentos de cDNA clivados podem ser separados pelos seus tamanhos, através de electroforese em géis de poliacrilamida ou agarose, e isolados usando técnicas convencionais. Uma descrição geral das separações de acordo com o tamanho é encontrada em Methods of Enzymology, 6_5:499-560 (1980).

Os fragmentos de cDNA clivados com enzimas de restrição são então ligados a um vector de clonagem.

Relativamente a técnicas de ligação, ligações de extremos cerses são geralmente realizadas em cerca de 15 a cerca de 30 microlitros de um tampão a pH 7,5 compreendendo ATP cerca de 1 mM e cerca de 0,3 a 0,6 unidades (Weiss) de DNA ligase de T4, a cerca de 14°C. Ligações intermo-leculares de "extremos coesivos" são geralmente realizadas com concentrações de extremos totais de DNA de cerca de 5 a 100 nanomolar. Ligações de extremos cerses intermoleculares (geralmente usando um excesso molar de cerca de 10 a cerca de 30 vezes de adaptadores) são realizados em concentrações de extremos totais de DNA de cerca de 1 micromolar. 77 ΡΕ0788546 (B) Preparação de cDNA codificador de NAP.

Vectores de clonagem contendo a biblioteca de cDNA preparada como descrito são introduzidas nas células hospedeiras, as células hospedeiras são cultivadas, semeadas e depois testadas com uma sonda de hibridação para identificar clones que contenham o cDNA recombinante codificador de uma proteína do presente invento. Células hospedeiras preferidas incluem bactérias quando são usados vectores de clonagem fágicos. Células hospedeiras especialmente preferidas incluem estirpes de E. coli tais como a estirpe Y1090.

Como alternativa, o cDNA recombinante codificador de uma proteína do presente invento pode ser obtido por expressão de tal proteína na superfície externa de um fago filamentoso e depois isolamento de tal fago através da sua ligação a uma proteína alvo envolvida na coagulação do sangue.

Uma característica importante e bem conhecida do código genético é a sua redundância - mais de uma sequência tripleto de nucleótidos codifica um mesmo aminoácido. Assim, uma série de sequências nucleotídicas diferentes são possíveis para moléculas de cDNA recombinantes que codificam uma sequência de aminoácidos particulares de uma NAP do presente invento. Tais sequências nucleotídicas são consideradas funcionalmente equivalentes, uma vez que podem 78 ΡΕ0788546 resultar na produção da mesma sequência de aminoácidos em todos os organismos. Ocasionalmente, uma variante metilada de uma purina ou pirimidina pode ser incorporada numa determinada sequência nucleotidica. No entanto, tais metila-ções não afectam de forma alguma a relação codificadora. (1) Utilização de sondas oligonucleotídicas.

As sondas de hibridação e sequências iniciadoras são sequências oligonucleotídicas complementares da totalidade ou parte da molécula de cDNA recombinante que se pretende. Elas podem ser preparadas usando qualquer método adequado, por exemplo, os métodos fosfotriéster e fosfodiéster, descritos respectivamente em Narang, S.A. et al., Methods in Enzymology, 6_8:90 (1979) e Brown, E.L. et al., Methods in Enzymology, 6_8:109 (1979) ou suas realizações automatizadas. Numa dessas realizações, dietil-fosforamidetos são usados como materiais de partida e podem ser sintetizados como descrito por Beaucage et al., Tetrahedron Letters, _22:1859-1862 (1981). Um método para a síntese de oligonucleótidos num suporte sólido modificado está descrito na Patente U.S. No. 4458066. As sondas diferem das sequências iniciadoras por serem marcadas com uma enzima, como seja peroxidase de rábano silvestre, ou átomo radioactivo, como seja 32P, para facilitar a sua detecção. Uma sonda sintetizada é marcada radioactivamente por translação de corte ("nick translation") usando DNA polimerase I de E. coli ou por marcação dos extremos usando fosfatase alcalina e cinase de polinucleótids do bacte-riófago T4. 79 ΡΕ0788546

As sondas de hibridação preferidas incluem sequências oligonucleotidicas complementares de um segmento do cDNA de cadeia simples codificador de uma porção da sequência de aminoácidos de uma NAP purificada a partir de um nemátodo, como seja ancilóstomo, Ancylostoma caninum. Por exemplo, pode ser usada uma porção da sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2 (AcaNAP5) [SEQ. ID. NO. 4] ou Figura 4 (AcaNAPô [SEQ. ID. NO. 6]) . Sondas de hibridação especialmente preferidas incluem aquelas em que a sua sequência oligonucleotidica é complementar do segmento de cDNA de cadeia simples codificador da sequência de aminoácidos: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp [SEQ. ID. NO. 93]. Tais sondas de hibridação incluem a sonda degenerada tendo a sequência oligonucleotidica: AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [SEQ. ID. NO. 94], em que RéAouG, YéTouCeié inosina. Uma molécula de cDNA recombinante preferida codificadora de uma proteína do presente invento é identificada pela sua capacidade para hibridar com esta sonda.

Sondas de hibridação preferidas também incluem o par NAP-1 [SEQ. ID. NO. 90] e NAP-4.RC [SEQ. ID. NO. 91] e o par YG109 [SEQ. ID. NO. 88] e YG103 [SEQ. ID. NO. 89], ambos sendo aqui descritos nos Exemplos 13 e 12, respectivamente.

Quando da identificação do clone contendo o cDNA 80 ΡΕ0788546 pretendido, a amplificação é usada para produzir grandes quantidades de um gene codificador de uma proteina do presente invento na forma de uma molécula de cDNA recombinante. Métodos preferidos de amplificação incluem a utilização da reacção em cadeia com polimerase (PCR). Ver, e.g., PCR Technology, W.H. Freeman and Company, New York (Edit. Erlich, H.A. 1992). 0 PCR é um método de amplificação in vitro para a síntese de sequências de DNA específicas. No PCR, são usadas duas sequências iniciadoras oligonucleotídicas que hibridam com cadeias opostas e flanqueiam a região de interesse no cDNA de clones. Uma série repetitiva de ciclos envolvendo desnaturação de cDNA em cadeias simples, emparelhamento de sequências iniciadoras com o cDNA de cadeia simples, e a extensão pela DNA polimerase das sequências iniciadoras emparelhadas resulta numa série de cópias de cDNA cujos extremos são definidos pelos extremos 5' das sequências iniciadoras, aproximadamente duplicando em cada um dos ciclos. Ibld., p. 1. Através da amplificação por PCR, são obtidos o domínio codificador e qualquer informação adicional codificada pela sequência iniciadora, como sejam locais de restrição ou sinais de tradução (sequências sinal, codões de iniciação e/ou codões de paragem) da molécula de cDNA recombinante a ser isolada.

Condições preferidas para amplificação de cDNA incluem as que usam polimerase Taq e envolvendo 30 ciclos 81 ΡΕ0788546 de temperatura de: 1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C; 1,5 minutos a 72°C. As sequências iniciadoras preferidas incluem a sequência iniciadora oligo(dT)-NotI, AATTCGCGGC CGC(T)i5 [SEQ. ID. NO. 95], adquirida à Promega Corp. em combinação com (i) a sequência iniciadora degenerada tendo a sequência oligonucleotidica: AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [SEQ. ID. NO. 94], em que R é A ou G, Y é T ou C e i é inosina ou (ii) a sequência iniciadora de lambda gtll #1218, GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEQ. ID. NO. 96], adquirida à New England Biolabs. A sequência de ácido nucleico de uma molécula de cDNA recombinante preparada como descrito foi determinada por métodos baseados no método didesoxi de Sanger, F. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7_4:5463 (1977) como descrito mais detalhadamente por Messing, et al., Nucleic Acids Res., _9 :309 (1981).

Moléculas de cDNA recombinante preferidas preparadas como descrito incluem as que possuem as sequências de ácido nucleico das Figuras 1, 3, 7, 9, 13 e 14. (2) Utilização de cDNAs NAP como sondas. São também especialmente preferidas como sondas de hibridação as sequências oligonucleotidicas codificadoras de essencialmente toda a sequência de aminoácidos de uma NAP purificada a partir de nemátodo, o ancilóstomo Ancylostoma caninum. Sondas especialmente 82 ΡΕ0788546 preferidas incluem as derivadas dos genes AcaNAP5 e AcaNAPô e tendo as seguintes sequências de ácido nucleico (gene AcaNAP5) : AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GAC TGT GGA ACT CAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AAT GAG GAA CCC CCT GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGC TCA CGT GGT TGT TTA TTA CCT CCT GCT TGC GTA TGC AAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AGG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEQ. ID. NO. 1], OU Figura 3 (gene AcaNAPô): AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GTC TGT GGA ACT AAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AGT GAG GAA GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGA TCA TTT TCT TGT CCG GGT CCC GCT GCT TGC GTA TGC GAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AAG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT T«GTC TGA [SEQ. ID. NO. 2].

Sondas de hibridação preferidas também incluem sequências codificadoras de uma parte substancial da sequência de aminoácidos de uma NAP, como seja o fragmento de PCR gerado com o par de sequências iniciadoras NAP-1 [SEQ. ID. NO. 90] e NAP-4.RC [SEQ. ID. NO. 91] como descrito no Exemplo 13. (3) Utilização da apresentação em fagos. É aqui descrito um método para seleccionar cDNAs codificadores das proteínas do presente invento a partir de bibliotecas de cDNA total utilizando tecnologia de apresentação em fagos filamentosos. A tecnologia existente de apresentação com fagos filamentosos baseia-se na 83 ΡΕ0788546 inserção em grelha de regiões codificadoras com interesse no gene 3 ou no gene 8, que codificam a proteina de ligação e a principal proteina de revestimento do fago, respecti-vamente. Os familiarizados com a matéria reconhecerão que várias dificuldades são inerentes à sua execução com uma vasta mistura de cDNAs de sequência desconhecida e que a via mais prática de obter apresentação funcional de produtos de cDNA consistirá na fusão de cDNAs através dos seus extremos 5'. De facto, as bibliotecas de cDNA de tamanho suficiente podem conter vários cDNAs que derivam do mesmo mRNA mas que estão truncados no extremo 5' em várias posições, de forma que alguns possam ser expressos como produtos de fusão. Uma estratégia desta linha, que se baseia na capacidade dos fechos de leucina Jun e Fos para formarem heterodimeros foi recentemente descrita. Ver, Crameri, R. E uter, M., Gene, 137:69-75 (1993).

Encontrámos uma nova forma alternativa e directa de ligar covalentemente produtos de cDNA de genes à superfície dos fagos; este resultado baseia-se na observação de que proteínas fundidas ao extremo C da proteína 6 da cápside fágica pode ser apresentada funcionalmente. Esta observação conduziu ao desenvolvimento de um sistema fagemídeo como aqui descrito que permite a expressão de produtos de cDNA funcionalmente apresentados, que por sua vez permite a selecção por afinidade de partículas fágicas possuidoras do cDNA necessário para a produção do produto de cDNA apresentado. Este sistema proporciona a base para o isolamento de cDNAs que codificam uma proteína do presente 84 ΡΕ0788546 invento. Uma vez isoladas, as moléculas de cDNA recombi-nantes contendo tal cDNA podem ser usadas para a expressão das proteinas do presente invento noutros sistemas de expressão. As moléculas de cDNA recombinantes assim preparadas são consideradas como estando dentro do âmbito do presente invento.

As moléculas de cDNA recombinante do presente invento são isoladas através da preparação de uma biblioteca de cDNA a partir de uma fonte natural (como por exemplo, um nemátodo como seja um ancilóstomo), ligação desta biblioteca de cDNA a vectores fagemídeos adequados, transformação das células hospedeiras com estes vectores contendo os cDNAs, cultura das células hospedeiras, infecção das células transformadas com um fago auxiliar adequado, separação do fago da cultura de células hospedeiras, separação dos fagos que expressam uma proteína do presente invento na sua superfície, isolamento destes fagos e isolamento de uma molécula de cDNA recombinante a partir de tais fagos.

Os vectores fagemídeos fram construídos usando o vector de expressão pUC119 descrito por Vieira, J. E Messing, J., Methods in Enzymology, 153 :3-11 (1987) . 0 gene 6 dos fagos filamentosos codificador de uma proteína de superfície do fago é modificado nos seus extremos 5' e 3' pela adição de locais de restrição Hindi11 e Sf il, respectivamente, através da utilização de três sequências iniciadoras directas e uma sequência iniciadora reversa 85 ΡΕ0788546 usando PCR. Isto resulta em três fragmentos de DNA que são ainda modificados pela adição ao seus extremos 3' de locais de restrição NotI e BamHI por PCR. Após digestão separada dos três fragmentos de DNA com HindiII e BamHI, os três fragmentos de DNA são ligados a pUC119 para dar os vectores de expressão pD0NG61, pDONG62 e pDONG63. Estes vectores permitem a inserção de cDNA como fragmentos Sfil-NotI.

As bibliotecas de cDNA são preparadas a partir de fontes naturais, tais como nemátodos, como descrito nos Exemplos 2, 9 e 13. Nemátodos preferidos a partir dos quais se preparam tais bibliotecas incluem nemátodos intestinais tais como Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus e Heligo-mosomoides polygyrus.

Uma biblioteca de cDNA como fragmentos Sfil-NotI pode ser directamente ligada de forma direccionada aos vectores fagemideos pD0NG61, pDONG62 e pDONG63. Como alternativa, uma biblioteca de cDNA que tenha sido ligada ao vector fágico lambda gtll como descrito no Exemplo 2 pode ser recuperada por PCR, seguido de isolamento por electroforese e depois ligada de forma direccionada nestes vectores. Na última abordagem, condições preferidas para PCR usam polimerase Taq; as sequências iniciadoras, sequência iniciadora de lambda gtll #1218 tendo a sequência GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) [SEQ. ID. NO. 96] e a sequência iniciadora oligo(dT)-Notl tendo a sequência AATTCGCGGC CGC(T)15, 86 ΡΕ0788546 (Promega Corp. ) [SEQ. ID. NO. 95]; e 20 ciclos de temperatura de 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 50°C e 3 minutos a 72°C, seguido 10 minutos a 65°C.

As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão pDONG contendo uma biblioteca de cDNA. Células hospedeiras preferidas incluem estirpes de E. coli, com a estirpe TG1 sendo especialmente preferida. Métodos preferidos para a transformação de células hospedeiras E. coli incluem electroporação.

As células transformadas foram cultivadas a 37°C em meio LB suplementado com 1% de glucose e 100 microgramas/ml de carbenicilina até a absorvância óptica a 600 nm atingir o valor de 0,5 e depois infectadas com o fago auxiliar VCSM13 (Stratagene) numa multiplicidade de infecção (moi) de 20.

Os fagos foram separados da cultura por centrifugação, depois foram purificados por precipitações com polietilenoglicol/cloreto de sódio.

Os fagos que expressam uma NAP do presente invento na sua superfície são isolados tirando partido da capacidade de NAP se ligar a uma proteína alvo envolvida na coagulação do sangue, por exemplo, Factor Xa. Métodos preferidos de isolamento de tais fagos incluem um método compreendendo os passos de: 87 ΡΕ0788546 (1) combinação de uma solução de factor Xa marcado com biotina com uma solução de tais fagos; (2) incubação desta mistura; (3) contacto de uma fase sólida marcada com estreptavidina com esta mistura: (4) incubação da fase sólida com a mistura; (5) remoção da fase sólida da mistura e contacto da fase sólida com tampão para remover os fagos não ligados; (6) contacto da fase sólida com um segundo tampão para remover os fagos ligados da fase sólida; (7) isolamento de tais fagos; (8) transformação das células hospedeiras com tais fagos; (9) cultura das células hospdeiras transformadas; (10) infecção das células hospedeiras transformadas com o fago auxiliar VCSM13; (11) isolamento dos fagos a partir da cultura das células hospedeiras; e ΡΕ0788546 (12) repetição dos passos (1) a (11) mais quatro vezes

Um método especialmente preferido de isolamento de tais fagos inclui o método detalhado no Exemplo 10.

Preparou-se DNA de cadeia simples a partir dos fagos isolados e sequenciaram-se as suas inserções 3' relativamente ao gene 6 do fago filamentoso.

Figura 9 descreve a molécula de cDNA recombi-nante, AcaNAP2, isolada pelo método de apresentação em fagos. A sequência de aminoácidos deduzida da proteína do presente invento codificada por AcaNAPc2 está também apresentado nesta figura. (C) Preparação de NAP recombinante.

As moléculas de cDNA recombinantes do presente invento quando isoladas como descrito são usadas para se obter expressão dos NAPs do presente invento. De um modo geral, uma molécula de cDNA recombinante do presente invento é incorporada num vector de expressão, este vector de expressão é introduzido numa célula hospedeira adequada, a célula hospedeira é cultivada e isolada a proteína expressa.

Os vectores de expressão sao sequências de DNA 89 ΡΕ0788546 necessárias para a transcrição de cópias clonadas de genes e tradução dos seus mRNAs num hospedeiro adequado. Estes vectores podem expressar genes procarióticos ou eucarió-ticos numa variedade de células tais como bactérias, leveduras, células de mamífero, vegetais e de insecto. As proteínas podem também ser expressas numa série de sistemas virais.

Vectores de expressão adequadamente construídos contêm uma origem de replicação para replicação autónoma em células hospedeiras ou são capazes de se integrar nos cromossomas das células hospedeiras. Tais vectores conterão também marcas de selecção, um número limitado de locais de enzimas de restrição úteis, um elevado número de cópias e promotores fortes. Os promotores são sequências de DNA que dirigem a RNA polimerase para se ligar ao DNA e inciar a síntese de RNA; promotores fortes causam tal iniciação com uma frequência elevada. Os vectores de expressão preferidos do presente invento são operacionalmente ligados a uma molécula de cDNA recombinante do presente invento, i.e., os vectores são capazes de dirigir a replicação da molécula de cDNA recombinante ligada e expressão da proteína codificada pela molécula de cDNA recombinante. Os vectores de expressão podem incluir, mas não estão limitados a vectores de clonagem, vectores de clonagem modificados e plasmídeos ou vírus especificamente projectados. Células hospedeiras adequadas para expressão das proteínas do presente invento incluem células de bactérias, 90 ΡΕ0788546 leveduras, mamífero, plantas e insectos. Para cada um dos tipos de células e espécies são adequados determinados vectores de expressão como será discutido abaixo.

Os procariotas podem ser usados para expressão das proteínas do presente invento. Células hospedeiras bacterianas adequadas incluem as várias estirpes de E. coli, Bacillus subtilis e várias espécies de Pseudomonas. Nestes sistemas, são usados vectores plasmídicos que contêm locais de replicação e sequências de controlo derivadas de espécies compatíveis com o o hospedeiro. Vectores adequados para E. coli são derivados de pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli por Bolívar et al., Gene, 2:95 (1977). Sequências de controlo procarióticas frequentemente usadas, que são aqui definidas para incluir promotores da transcrição, iniciação, facultativamente com um operador, juntamente com sequências de ligação a ribossomas, incluem os sistemas promotores de beta-lactamase e lactose (Chang et al., Nature, 198:1056 (1977)), o sistema promotor do triptofano (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., _8:4057 (1980)) e o promotor PL derivado de lambda e o local de ligação ao ribossoma do gene N (Shimtake et al., Nature, 292:128 (1981)). No entanto, pode ser usado qualquer sistema promotor disponível compatível com procariotas. Sistemas de expressão de procariotas preferidos incluem E. coli e seus vectores de expressão.

Os eucariotas podem ser usados para expressão das proteínas do presente invento. Os eucariotas geralmente 91 ΡΕ0788546 usados são células de levedura e células de mamífero. Células hospedeiras de levedura adequadas incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células COS e CHO (ovário de hamster chinês).

Vectores de expressão para eucariotas incluem os promotores derivados de genes eucarióticos adequados. Promotores adequados para vectores de expressão de células de levedura incluem promotores da síntese de enzimas glicolíticas, incluindo os do gene de 3-fosfoglicerato cinase em Saccharomyces cerevisiae (Hitzman et al., J. Biol. Chem., 255;2073 (1980)) e as do metabolismo de metanol como seja o gene de álcool oxidase em Pichia pastoris (Stroman et al., Patente U.S. Nos. 4808537 e 4855231) . Outros promotores adequados incluem os do gene da enolase (Holland, M.J. et al., J. Biol. Chem., 256:1385 (1981)) ou o gene Leu2 obtido a partir de Yepl3 (Broach, J. et al., Gene, 8_:121 (1978)).

Sistemas de expressão de levedura preferidos incluem Pichia pastoris e seus vectors de expressão. cDNAs codificadores de NAP expressos em Pichia pastoris podem, facultativamente, ser alterados para codificarem uma proteína NAP que possui um resíduo de prolina no extremo C. Nalguns casos, a proteína NAP é expressa num nível mais elevado e pode ser mais resistente a proteólise indesejável. Um desses cDNAs, e a sua expressão em Pichia pastoris, está descrito no Exemplo 17. 92 ΡΕ0788546

Promotores adequados para vectores de expressão em células de mamífero incluem os promotores precoce e tardio de SV40 (Fiers, et al., Nature, 273:113 (1978)) ou outros promotores virais tais como os derivados de polioma, adenovírus II, vírus do papiloma bovino ou vírus do sarcoma aviário. Estimuladores virais e de mamífero adequados podem também ser incorporados nestes vectores de expressão.

Promotores adequados para os vectores de expressão em células vegetais incluem o promotor da síntese de nopalina descrito em Depicker, A. et al., Mol. Appl. Gen . , _1: 561 (1978) .

Promotores adequados para os vectores de expressão em células de insecto incluem versões modificadas do sistema descrito por Smith et al., Patente U.S. N° 4745051. O vector de expressão compreende um promotor da poliedrina de baculovírus, sob o controlo do qual pode ser colocada uma molécula de cDNA codificadora de uma proteína. Células hospedeiras são transformadas através da introdução de vectores de expressão do presente invento. A transformação é feita usando técnicas convencionais adequadas a cada tipo de célula. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio descrito em Cohen, S.N., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69 :2110 (1972) ou o método RbCl descrito em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p. 254, Cold Spring Harbor Press (1982) 93 ΡΕ0788546 foi usado para procariotas ou outras células que contêm substanciais barreiras de parede celular. A transformação de leveduras é realizada como descrito em Van Solingen, P. et al., J. Bacter. , 130:946 (1977) e Hsiao, C.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7_6:3829 (1979) . As células de mamífero sem tal parede celular são transformadas usando o processo de fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, _52:546 (1978). Células vegetais transformadas pela infecção com Agrobacterium tumefaciens como descrito em Shaw, C. et al., Gene, 2_3:315 (1983). Métodos preferidos de transformação de E. coli e Pichia pastoris com vectores de expressão incluem electroporação. Células hospedeiras transformadas são cultivadas em condições, como seja tipo de meio, temperatura, teor de oxigénio, movimento de fluidos, etc., conhecidos das áreas da biologia.

As proteínas recombinantes do presente invento são isoladas a partir da célula hospedeira ou meio, por métodos convencionais bem conhecidos das áreas da bioquímica, que incluem a utilização de métodos de cromatografia. Métodos preferidos de purificação incluem cromatografia sequenciada de um extracto através de colunas contendo matriz de permuta aniónica-iónica Poros20 HQ ou matriz de permuta catiónica Poros20 HS, matriz de filtração em gel Superdex30 e uma matriz de fase reversa C18. As fraeções colhidas após uma dessas colunas de cromatografia podem ser seleccionadas pela sua capacidade para aumentar o 94 ΡΕ0788546 tempo de coagulação de plasma humano, conforme medido pelos ensaios PT e aPTT, ou pela sua capacidade para inibir a actividade amidolitica do factor Xa conforme medido num ensaio colorimétrico ou demonstração de actividade em qualquer um dos outros ensaios aqui descritos. Exemplos de métodos preferidos de purificação de uma proteína recombinante do presente invento estão descritos nos Exemplos 3, 4, 6, 8, 14 e 15.

4. Métodos de utilização de NAP

Num aspecto, o presente invento inclui métodos de colheita de plasma de mamífero, de tal forma que a coagulação do referido plasma é inibida, compreendendo a adição a um tubo de colheita de sangue de uma quantidade de uma proteína do presente invento suficiente para inibir a formação de um coágulo quando sangue de mamífero é colhido para o tubo, adição de sangue de mamífero ao referido tubo, separação dos eritrócitos do plasma de mamífero e colheita do plasma de mamífero.

Os tubos de colheita de sangue incluem tubos de ensaio rolhados tendo vácuo como meio de fazer entrar para dentros dos tubos o sangue obtido por venipunctura. Tubos de ensaio preferidos incluem aqueles que são feitos de vidro de boro-silicato e têm as dimensões de, por exemplo, 10,25 x 47 mm, 10,25 x 50 mm, 10,25 x 64 mm, 10,25 x 82 mm, 13 x 75 mm, 13 x 100 mm, 16 x 75 mm, 16 x 100 mm ou 16 x 125 mm. Rolhas preferidas incluem as que podem ser 95 ΡΕ0788546 facilmente furadas por uma agulha de colheita de sangue e que, quando colocadas no tubo de ensaio, proporcionam uma selagem suficiente para evitar a entrada de ar para o tubo.

As proteínas do presente invento são adicionadas aos tubos de colheita de sangue numa variedade de formas bem conhecidas na área, como seja uma sua composição líquida, uma sua composição sólida ou uma composição líquida que é liofilizada para se obter um sólido no tubo. A quantidade adicionada a tais tubos é a quantidade suficiente para inibir a formação de um coágulo quando o sangue de mamífero é introduzido no tubo. As proteínas do presente invento são adicionadas aos tubos de colheita de sangue em quantidades tais que, quando combinadas com 2 a 10 ml de sangue de mamífero, a concentração de tais proteínas será suficiente para inibir a formação de coágulos. Tipicamente, esta concentração eficaz será de cerca de 1 a 10000 nM, sendo preferido 10 a 1000 nM.

Como alternativa, as proteínas do presente invento podem ser adicionadas a tais tubos em combinação com outros aditivos de inibição de coágulo, tais como sais de heparina, sais de EDTA, sais de citrato ou sais de oxalato.

Após remoção do sangue de mamífero para um tubo de colheita de sangue contendo uma proteína do presente invento ou a mesma em combinação com outros aditivos inibidores de coágulo, os eritrócitos são separados do 96 ΡΕ0788546 plasma de mamífero por centrifugação. A centrifugação é realizada a forças g, temperaturas e tempos bem conhecidos das áreas médicas. Condições típicas para a separação de plasma de eritrócitos incluem centrifugação a uma força centrífuga entre cerca de lOOxg e cerca de 1500xg, a temperaturas entre cerca de 5 e cerca de 25°C, e durante um tempo entre cerca de 10 e cerca de 60 minutos. O plasma de mamífero pode ser colhido vertendo-o para um recipiente separado, retirando-o para uma pipieta ou por outro meio conhecido dos familiarizados com as áreas médicas.

Num outro aspecto, o presente invento inclui métodos para a prevenção ou inibição de trombose (formação de coágulo) ou coagulação de sangue num mamífero, compreendendo a administração ao referido mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína ou de uma composição farmacêutica do presente invento.

As proteínas ou composições farmacêuticas do presente invento são administradas in vivo, normalmente a um mamífero, de preferência um ser humano. Ao empregá-las in vivo, as proteínas ou composições farmacêuticas podem ser administradas a um mamífero numa variedade de formas, incluindo oralmente, parenteralmente, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, colonicamente, rectalmente, nasalmente ou intraperitonealmente, empregando uma variedade de formas de dosagem. A administração é, de 97 ΡΕ0788546 preferência, parentérica, como seja intravenosa, numa base diária. Como alternativa, a administração é, de preferência, oral, como seja através de comprimidos, cápsulas ou elixires tomados numa base diária

Na realização dos métodos do presente invento, as proteínas ou composições farmacêuticas do presente invento são administradas sozinhas ou em combinação de umas com as outras ou em combinação com outros agentes terapêuticos ou diagnósticos in vivo.

Como é aparente para os familiarizados com a área, uma quantidade terapeuticamente eficaz das proteínas ou composições farmacêuticas do presente invento variarão dependendo da idade, peso e espécie de mamífero tratado, das proteínas particulares empregues, do modo particular de administração e dos efeitos pretendidos, e da indicação terapêutica. Devido a estes factores e à sua relação na determinação desta quantidade serem bem conhecidos nas áreas médicas, a determinação de níveis de dosagem eficazes, a quantidade necessária para se conseguir o resultado pretendido de prevenção de trombose, estará dentro do âmbito dos familiarizados com a matéria.

Tipicamente, a administração das proteínas ou composições farmacêuticas do presente invento é iniciada em níveis de dosagem baixos, com os níveis de dosagem sendo aumentados até o efeito desejado de prevenção de trombose in vivo ser atingido, o que definirá uma dose terapeu- 98 ΡΕ0788546 ticamente eficaz. Para as proteínas do presente invento, sozinhas ou como parte de uma composição farmacêutica, tais doses estão entre cerca de 0,01 mg/Kg e 100 mg/Kg de peso de corpo, de preferência entre cerca de 0,01 e 10 mg/Kg de peso de corpo. 5. Utilidade

Proteínas do presente invento quando preparadas e seleccionadas como dscrito são úteis como inibidores potentes da coagulação do sangue in vitro e in vivo. Como tal, estas proteínas são úteis como reagentes de diagnóstico in vitro para prevenir a coagulação de sangue e são também úteis como agentes farmacêuticos in vivo para prevenir ou inibir a trombose ou coagulação do sangue em mamíferos.

As proteínas do presente invento são úteis como reagentes de diagnóstico in vitro para inibição da coagulação do sangue em tubos de colheita. A utilização de tubos de ensaio rolhados tendo vácuo como forma de colher sangue obtido por venipunctura para o tubo é do conhecimento da área médica. Kasten, B.L., "Specimen Collection", Laboratory Test Hanbook, 2nd Edition, Lxi-Comp Inc.,

Cleveland pp. 16 -17 (Edits . Jacobs, D.S. et al. 1990) . Tais tubos de vácuo podem não possuir aditivos inibidores de coágulos, neste caso, são úteis para o isolamento de soro de mamífero a partir de sangue. Como alternativa, eles podem conter aditivos inibidores de coágulos (tais como 99 ΡΕ0788546 sais de heparina, sais de EDTA, sais de citrato ou sais de oxalato), neste caso, são úteis para o isolamento de plasma de mamífero a partir de sangue. As proteínas do presente invento são fortes inibidores da coagulação do sangue e, como tal, podem ser incorporadas nos tubos de colheita de sangue para evitar a coagulação do sangue de mamífero neles colhido.

As proteínas do presente invento são usadas por si só, em combinação com outras proteínas do presente invento, ou em combinação com outros inibidores da coagulação, nos tubos de colheita, por exemplo, com sais de heparina, sais de EDTA, sais de citrato ou sais de oxalato. A quantidade a ser adicionada a tais tubos ou quantidade eficaz, é a quantidade suficiente para inibir a formação de um coágulo sanguíneo quando o sangue é colhido para o tubo. As proteínas do presente invento são adicionadas a tubos de colheita de sangue em quantidades tais que, quando combinadas com 2 a 10 ml de sangue de mamífero, a concentração de tais proteínas será suficiente para inibir a formação de coágulos sanguíneos. Tipicamente, esta quantidade eficaz é a necessária para dar uma concentração final no sangue de cerca de 1 a 10000 nM, sendo preferido 10 a 1000 nM.

As proteínas do presente invento podem também ser usadas para preparar composições de diagnóstico. Numa realização, as composições de diagnóstico são preparadas 100 ΡΕ0788546 pela dissolução das proteínas do presente invento em veículos diagnosticamente aceitáveis, veículos esses que incluem soro fisiológico tamponado com fosfatos (fosfato de sódio 0,01M + cloreto de sódio 0,15M, pH 7,2 ou soro fisiológico tamponado com Tris pH 7,2 (Tris-HCl 0,05M + cloreto de sódio 0,15M pH 8,0). Numa outra realização, as proteínas do presente invento podem ser misturadas com veículos sólidos diagnosticamente aceitáveis por métodos bem conhecidos na área para proporcionar composiçõs de diagnóstico sólidas. Estes veículos incluem sais de tampões. A adição das proteínas do presente invento aos tubos de colheita de sangue pode ser conseguida por métodos bem conhecidos na área, métodos esses que incluem a introdução de uma sua composição de diagnóstico líquida, uma sua composição de diagnóstico sólida ou uma composição de diagnóstico liquida que é liofilizada em tais tubos para se obter um sedimento de uma composição de diagnóstico sólida. A utilização dos tubos de colheita de sangue contendo as composições de diagnóstico do presente invento compreende o contacto de uma quantidade eficaz de tal composição de diagnóstico com sangue de mamífero colhido para o tubo. Tipicamente uma amostra de 2 a 10 ml de sangue de mamífero é colhida para um tubo de colheita de sangue e colocado em contacto com tal composição de diagnóstico aqui descrita; a quantidade eficaz a ser usada incluirá as 101 ΡΕ0788546 concentrações das proteínas formuladas como composição de diagnóstico que na amostra de sangue são suficientes para inibir a formação de coágulos sanguíneos. Concentrações eficazes preferidas serão entre cerca de 1 e cerca de 10000 nM, sendo especialmente preferido 10 a 1000 nM.

De acordo com um aspecto alternativo do nosso invento, as proteínas do presente invento são também úteis como agentes farmacêuticos para a prevenção ou inibição de trombose ou coagulação sanguínea num mamífero. Esta prevenção ou inibição da trombose ou coagulação do sangue previne ou inibe a trombose anormal.

Nas áreas médicas são bem conhecidas condições caracterizadas pela trombose anormal e incluem as que envolvem a vasculatura arterial e venosa de mamíferos. Relativamente à vasculatura arterial coronária, a trombose anormal (formação de trombos) caracteriza a ruptura de uma placa aterosclerótica estabelecida, que é a principal causa de enfarte agudo do miocárdio e angina instável, e também caracteriza a formação de trombos coronários oclusivos resultante de terapia trombolítica ou de angioplastia coronária transluminal percutânea (PTCA). Relativamente à vasculatura venosa, a trombose anormal caracteriza as condições observadas em doentes sujeitos a cirurgia nas extremidades inferiores ou na área abdominal que muitas vezes sofrem de formação de trombos na vasculatura venosa, resultante de fluxo sanguíneo reduzido na extremidade afectada e uma predisposição para o embolismo pulmonar. A 102 ΡΕ0788546 trombose anormal ainda caracteriza a coagulopatia intravascular disseminada que normalmente ocorre nos sistemas vasculares durante o choque séptico, determinadas infecções virais e cancro, uma condição em que existe consumo rápido de factores de coagulação e coagulação sistémica que resulta na formação de trombos de risco de vida ao longo da microvasculatura levando à falência alargada de órgãos.

As proteínas NAP do presente invento são também imunogénios úteis contra as quais são induzidos anticorpos. Os anticorpos, tanto monoclonais como policlonais, dirigidos contra uma NAP são úteis para fins de diagnóstico e para a identificação de níveis de concentração de NAP em vários fluidos biológicos. O imunoensaio que utiliza estes anticorpos pode ser usado como teste de diagnóstico, como seja para detectar a infecção de um hospedeiro mamífero por um verme parasita ou para detectar NAP a partir de um verme parasita num tecido do hospedeiro mamífero. Igualmente, tais imunoensaios podem ser usados na detecção e isolamento de NAP a partir de homogenatos de tecido, células clonadas e similares. NAP pode ser usada, com adjuvantes adequados, como uma vacina contra infecções por vermes parasitas em mamíferos. A imunização com a vacina NAP pode ser usada tanto na profilaxia como na terapia de infecções parasitárias. As condições de doença causadas por vermes parasitas podem ser tratadas através da administração de um 103 ΡΕ0788546 anticorpos anti-NAP a um animal infectado com estes parasitas.

As proteínas NAP deste invento tendo actividade inibidora de serina-protease são igualmente úteis em condições ou ensaios em que a inibição da serina-protease seja desejável. Por exemplo, proteínas NAP que inibem a serina-protease tripsina ou elastase são úteis para o tratamento de pancreatite aguda ou de resposta inflamatória aguda mediada por leucócitos, respectivamente.

As moléculas de cDNA recombinante codificadoras das proteínas do presente invento são úteis num aspecto para o isolamento de outras moléculas de cDNA recombinante que também codificam as proteínas do presente invento. Num outro aspecto, elas são úteis para a expressão das proteínas do presente invento em células hospedeiras.

As sondas nucleotídicas do presente invento são úteis para identificar e isolar ácido nucleico codificador de NAPs a partir de nemátodos ou outros organismos. Ainda, as sondas nucleotídicas são reagentes de diagnóstico úteis para detectar a presença de ácido nucleico codificador de nemátodo numa amostra, como seja um fluido ou tecido de um mamífero suspeito de estar infectado pelo nemátodo. As sondas podem ser usadas directamente, com marca adequada para a detecção, para detectar a presença de ácido nucleico de nemátodos ou podem ser usadas numa forma mais indirecta, como seja numa reacção tipo PCR, para amplificar ácido 104 ΡΕ0788546 nucleico de nemátodos que possam estar presentes na amostra para detecção. As condições de tais métodos e ensaios de diagnóstico estão facilmente disponíveis na área.

Para ajudar à sua compreensão, o presente invento será agora ilustrado pelos exemplos que se seguem.

Exemplos

Exemplo 1

Isolamento de nova proteína anticoagulante (NAP) a partir de Ancylostoma caninum. (A) Preparação do lisado de Ancylostoma caninum.

Ancilóstomos caninos congelados, Ancylostoma caninum, foram aquiridos à Antibody Systems (Bedford, TX). Os ancilóstomos foram guardados a -80°C até serem usados no homogenato.

Os ancilóstomos foram congelados em azoto líquido e triturados num almofariz, seguido de uma homogeneização em gelo em tampão de homogeneização usando o homogenizador PotterS com um pistão de teflon (B. Braun Melsungen AG, Germany). O tampão de homogeneização continha: Tris-HCl 0, 02M, pH 7,4, NaCl 0,05M, MgCl2 0,001M, CaCl2 0, 001M, inibidor de proteases E-64 1,0 x 10~5 M (Boehringer Mannheim, Germany), pepstatina A 1,0 x 10~5 M (ácido 105 ΡΕ0788546 isovaleril-Val-Val-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoil-Ala-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanóico, ICN Biomedicals, CA) , quimostatina (Boehringer) 1,0 x 10-5 M, leupeptina (ICN) 1,0 x 10”5 M, AEBSF (fluoreto de (4-(2-aminoetil)benze-nosulfonilo, ICN) 5 x 10~5 M e 5% (v/v) de glicerol. Apro-ximadamente 4 ml de tampão de homogeneização foi usado para homogeneizar cada grama de vermes congelados (aproximada-mente 500 vermes). O material insolúvel foi sedimentado através de dois passos de centrifugação sequenciados: 19 000 x gmax a 4°C durante 30 minutos seguido de 110 000 gmax a 4°C durante 40 minutos. A solução do sobrenadante foi clarificada por passagem através de um filtro de acetato de celulose de 0,45 micrómetros (Corning, NY) para dar o lisado de Ancylostoma caninum. (B) Cromatografia em Concanavalina A Sepharose. O lisado de Ancylostoma caninum (100 ml) foi adsorvido a 22 ml de Concanavalina A Sepharose (Pharmacia, Sweden), pré-equilibrada com tampão Com A (Tris-HCl, 0,02M, pH 7,4, NaCl 1M, CaCl2 0,002M), através da sua aplicação a uma coluna de 1,6 x 11 cm deste gel, num fluxo de 3 ml/minuto (90 cm/hora). A coluna estava à temperatura ambiente enquanto o reservatório do lisado foi mantido à temperatura de um banho de gelo ao longo do processo. A coluna foi subsequentemente lavada com 2 volumes de coluna de tampão ConA. O efluente da coluna e o liquido de lavagem foram colhidos (aproximadamente 150 ml) e guardados a -80°C até posterior processamento. 106 ΡΕ0788546 (C) Cromatoqrafia de permuta aniónica. O efluente e o líquido de lavagem da coluna de Concanavalina A Sepharose foram tamponados pela adição de actato de sódio sólido para uma concentração final de 12,5 mM. A condut ividade foi reduzida pela diluição com água milliQ e o pH ajustado com HC1 a pH 5,3. O precipitado formado durante o acerto do pH foi sedimentado por

centrifugação a 15 000 x gmax a 4°C durante 15 minutos. A solução do sobrenadante foi clarificada por passagem através de um filtro de acetato de celulose de 0,2 micrómetros (Corning, NY). Esta solução clarificada (volume total de aproximadamente 600 ml) foi aplicada numa coluna Poros20 HQ (Perseptive Biosystems; MA) de 1x2 cm pré- equilibrada com tampão aniónico (Na acetato 0,005M, pH 5,3, NaCl 0,1 M) num fluxo de 10 ml/minuto (800 cm/hora) . A coluna e a solução adicionadas estavam à temperatura ambiente ao longo este passo de purificação. A coluna foi subsequentemente lavada com 10 volumes de coluna de tampão aniónico. O material que tinha actividade inibidora, detec-tada seguindo o procedimento abaixo, no ensaio amidolítico do factor Xa foi eluído com tampão catiónico contendo NaCl 0,55M num fluxo de 5 ml/minuto (400 cm/hora).

Uma amostra da solução foi testada num ensaio amidolítico do factor Xa como se segue. As misturas de 107 ΡΕ0788546 reacção (150 microlitros) foram preparadas em placas de 96 alvéolos contendo o factor Xa e várias diluições da amostra no tampão de ensaio (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4; NaCl 140 mM; O, 1% BSA). O factor X humano foi adquirido à Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN, USA) e activado com veneno de víbora de Russell usando o procedimento de Bock, P. E., Craig, P.A., Olson, S.T., e Singh P., Arch. Biochem. Biophys., 273:375-388 (1989) . Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, as reacções enzimáticas foram iniciadas pela adição de 50 microlitros de uma solução de substrato 1 mM em água (N-alfa-benziloxicarbonil-D-arginil-L-glicil-L-arginina p-nitro-anilida-di-hidrocloreto; S-2765; Chromogenix, Mõlndal, Suécia) para dar uma concentração final de factor Xa 0,2 nM e S-2765 0,25 mM. A hidrólise do substrato foi controlada através da medição contínua da absorvância a 405 nm usando um leitor da cinética Vmax em placas (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA). (D) Tratamento pelo calor.

Metade do lote de eluição com NaCl 0,55 M (3 ml) da cromatografia de permuta aniónica foi neutralizada pela adição de Tris-HCl 1 M, pH 7,5, para uma concentração final de 50 mM, incubada durante 5 minutos a 90°C num tubo de vidro e subsequentemente arrefecida rapidamente em gelo. O material insolúvel foi sedimentado por centrifugação a 19 000 x gmax a 4°C durante 20 minutos. O sobrenadante continha material que inibiiu o factor Xa no ensaio amidolítico do 108 ΡΕ0788546 factor Xa. Cerca de 89% da actividade inibidora do factor Xa foi recuperada no sobrenadante, após este tratamento pelo calor tendo em conta a diluição. (E) Cromatografia de crivagem molecular usando Superdex30 (alternativa ao passo de tratamento pelo calor).

Metade do lote de eluição com NaCl 0,55 M (3 ml) da cromatografia de permuta aniónica foi aplicada numa coluna Superdex30 PG (Pharmacia, Sweden) 1,6 x 66 cm pré-equilibrada com fosfato de sódio 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15 M a 24°C. A cromatografia foi realizada a um fluxo de 2 ml/minuto. A actividade inibidora de factor Xa (determinada no ensaio amidolitico do factor Xa) eluiu a 56-64 ml da corrida (Kav de 0,207) . Este volume de eluição é esperado para uma proteína globular com uma massa molecular de 14 000 daltons. (F) Cromatografia de fase reversa. O lisado de ancilóstomo que foi fraccionado por cromatografia em Concanavalina A Sepharose, permuta aniónica e Superdex30 (ou com o passo alternativo de tratamento pelo calor) foi aplicado numa coluna C18 de 0, 46 x 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que foi então revelada com um gradiente linear de 10-35% de acetonitrilo em 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético, num fluxo de 1 ml/minuto, com uma velocidade de 0,625% de permuta de actonitrilo/minuto. A actividade inibidora de fXa (determinada no ensaio 109 ΡΕ0788546 amidolítico do factor Xa) eluiu a aproximadamente 30% de acetonitrilo. As corridas de HPLC foram realizadas numa Vista 5500 ligada a um detector Polychrom 9600 regulado para 215 nm (Varian, CA) . Os sinais do detector foram integrados num integrador 4290 adquirido à mesma companhia. As fracções contendo actividade inibidora do factor Xa foram secas sob vácuo e depois redissolvidas em PBS (fosfato de sódio 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15M).

Estas fracções foram reunidas e depois aplicadas numa coluna C18 de 0, 46 x 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que foi sujeita a um gradiente linear de 10-35% de acetonitrilo, em 0,1% de ácido trifluoroacético, num fluxo de 1 ml/minuto, com uma velocidade mais baixa de 0,4% de permuta de acetonitrilo/minuto. As fracções contendo actividade inibidora de factor Xa foram reunidas e subsequentemente secas sob vácuo. (G) Determinação da massa molecular de NAP derivada de Ancylostoma caninum. A massa estimada para NAP isolada como descrito neste exemplo foi determinada usando espectrometria de massa por ionisação de electrovaporização.

Um sedimento seco sob vácuo de NAP foi dissolvido em 50% (v/v) de acetonitrilo, 1% (v/v) de ácido fórmico. A análise da massa foi realizada usando VG Bio-Q (isons Instruments, Manchester UK). 110 ΡΕ0788546 A amostra de NAP foi bombeada através de um capilar e no seu extremo foi aplica uma alta voltagem de 4 KV. Sob a influência do campo eléctrico elevado, a amostra foi vaporizada em gotículas contendo as moléculas de proteína. Auxiliadas pelo efeito de secagem de um gás neutro (N2) a 60°C, as gotículas foram ainda reduzidas em tamanho até todo o solvente ter sido evaporado e apenas a spécie proteica permanecer na forma gasosa. Surgiu uma população de espécies proteicas que diferem de uma carga. Com um analisador quadripolo, foram detectados os diferentes valores Da/e (massa/carga). A calibração do instrumento foi conseguida usando Mioglobina de Coração de Cavalo (Sigma, Missouri). A massa estimada de NAP isolada como descrita nas secções A, B, C, D e F deste exemplo é de 8 734,60 daltons. A massa estimada de NAP nativa isolada como descrito nas secções A, B, C, E e F é de 8 735,67 daltons. (H) Seguenciação de aminoácidos de NAP derivada de Ancylostoma caninum. A determinação de aminoácidos foi realizada num sequenciador de Proteínas/Peptídeos com o Analisador On Board Microgradient PTH e o sistema de análise de dados Modelo 610A (Applied Biosystems, CA) . A quantificação dos resíduos foi realizada por análise em linha no computador do sistema (Applied Biosystems, CA); a atribuição dos resí- 111 ΡΕ0788546 duos foi realizada pela análise visual dos cromatogramas de HPLC. Os primeiros vinte aminoácidos do extremo amina da NAP nativa foram determinados como sendo:

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly Thr Gin Lys Pro [SEQ. ID. NO. 97].

Os residuos de cisterna não foram directamente detectados nesta análise porque a amostra não foi reduzida e subsequentemente alquilada. As cisteinas foram atribuidas às posições onde não foram identificados aminoácidos específicos.

Exemplo 2

Clonagem e sequenciaçao de NAP derivada de Ancylostoma caninum. (A) Preparaçao de sonda de hibridação.

Clones de cDNA de tamanho completo, codificadores de NAP, foram isolados por rastreio de uma biblioteca de cDNA, preparada a partir de mRNA isolado do nemátodo Ancylostoma caninum, com um oligonucleótido degenerado, marcado radioactivamente, cuja sequência foi baseada nos primeiros onze aminoácidos do extremo amina de NAP derivada de A. caninum:

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp [SEQ. ID. NO. 93] . 112 ΡΕ0788546 A sonda de hibridação oligonucleótido 33-meros, designada YG99, tinha a seguinte sequência: AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [SEQ. ID. NO. 94] em que "R" refere-se a A ou G, "Y" refere-se a T ou C, e "i" refere-se a inosina. YG99 foi marcada radioactivamente por fosforilação enzimática do extremo 5' (kit de marcação do extremo 5'; Amersham, Buckinghamshire, England) usando gama-32P-ATP (actividade especifica >7000 Ci/mmole; ICN, Costa Mesa, CA, USA) e subsequentemente passada numa coluna NAP™10 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). (B) Preparação de uma biblioteca de cDNA.

Construiu-se uma biblioteca de cDNA usando procedimentos já descritos (Promega Protocols ans Applications Guide 2nd Ed.; Promega Corp., Madison, WI, USA) .

Ancilóstomos adultos, Ancylostoma caninum, foram adquiridos à Antibody Systems (Bedford, TX) . RNA Poli(A+) foi preparado usando o kit de purificação de mRNA QuickPrep (Pharmacia). Cerca de 3 microgramas de mRNA foram sujeitos a transcrição reversa usando uma sequência iniciado-ra/adaptador oligo(dT)-Notl, AATTCGCGGCCGC(T) 15 [SEQ. ID. NO. 95], (Promega Corp.) e transcriptase reversa AMV (Avian Myeloblastosis Virus) (Boehringer, Mannheim,

Germany) . As enzimas usadas para a síntese de cDNA de 113 ΡΕ0788546 cadeia dupla foram as seguintes: DNA polimerase I de E. coli e RNase H da Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) e DNA polimerase de T4 da Pharmacia.

Adaptadores EcoRI (pCGGAATTCCG) [SEQ. ID. NO. 98] foram ligados ao cDNA obtido após tratamento com metilase de EcoRI (RiboClone EcoRI Ligation System; Promega).

Os cDNAs foram digeridos com NotI e EcoRI, passados num gel de 1,5% de agarose (todo o material mensurável foi eluido usando um protocolo Geneclean, BIO101 Inc., La Jolla, CA), e ligado unidireccionalmente aos braços EcoRI-NotI do vector Sfi-NotI de lambda gtll (Promega). Após encapsidação in vitro (Gigapackll-Gold, Stratagene, La Jolla, CA) os fagos recombinantes foram obtidos através da infecção da estirpe Y1090 (Promega). A utilidade da biblioteca de cDNA foi demonstrada por análise de PCR (polimerase Taq da Boehringer; 30 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C; 3 minutos a 72°C) de uma série de clones picados ao acaso usando a sequência iniciadora #1218 de lambda gtll, tendo a sequência, GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG (New England Biolas, Beverly, MA, USA) [SEQ. ID. NO. 96]; sequências de direccionamento localizadas a montante do inserto de cDNA) em combinação com a sequência iniciadora/adaptador olio(dT)-NotI atrás referida; encontrou-se que a maioria dos clones possuia os insertos de DNA de tamanho variável. 114 ΡΕ0788546 (C) Identificação de clones.

Aproximadamente lxlO6 clones de cDNA (filtros de cópias em duplicado das placas foram preparados usando Hybond™-N; Amersham) foram testados com o oligonucleótido YG99 marcado radioactivamente usando as seguintes condições de pré-hibridação e hibridação: 5X SSC (SSC: NaCl 150 mM, citrato tri-sódico 15 mM), solução de Denhardt 5x, 0,5% SDS, 100 microgramas/ml de DNA de esperma de peixe sonicado (Boehringer), durante a noite a 42°C. Os filtros foram lavados 4 vezes em SSC 2X, 0,1% SDS a 37°C. Após exposição (cerca de 72 horas) a filme de raios X, foi obtido um total entre 350 e 500 manchas de hibridação.

Dezanove

Vinte e quatro clones positivos, designados NAP1 a NAP24, foram sujeitos a um segundo ciclo de hibridação com uma densidade de placas mais baixa; excepto para NAP24, foram identificadas placas isoladas contendo uma população homogénea de fago lambda. Os clones separados foram analisados através de amplificações por PCR (polimerase Taq da Boehringer; 30 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C; 3 minutos a 72°C) usando a sequência iniciadora oligo (dT)-Notl (AATTCGCGGC CGC(T)15) [SEQ. ID. NO. 95] em combinação com (i) YG99 ou (ii) a sequência iniciadora #1218 de lambda gtll. A maioria dos clones (20 de 23) deu um fragmento com cerca de 400 pb quando a série de sequências iniciadoras oligo(dT)-NotI/YG99 foi usada e um fragmento de cerca de 520 pb quando o par de sequências iniciadoras oligo(dT)-NotI/#1218 foi usado. 115 ΡΕ0788546 possíveis clones de tamanho completo foram posteriormente caracterizados.

Os insertos de cDNA de cinco clones foram subclonados como fragmentos Sfil-NotI em pGEM-5Zf(-) e pGEM-9Zf(-) (Promega). Devido aos locais Sfil de lambda gtll e pGEM-5Zf(-) não serem compatíveis um com o outro, a clonagem neste vector necessitou da utilização de um pequeno fragmento adaptador, obtido após emparelhamento dos seguintes dois oligonucleótidos fosforilados no extremo 5': pTGGCCTAGCG TCAGGAGT [SEQ. ID. NO. 99] e pCCTGACGCTA GGCCATGG [SEQ. ID. NO. 100]. Após preparação de DNA de cadeia simples, as sequências destes cDNAs foram determinadas com o método de terminação de cadeias didesoxi usando a sequência iniciadora #1233 tendo a sequência, AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA (New England Biolabs) [SEQ. ID. NO. 101]. Encontrou-se que os cinco clones tinham tamanho completo incluindo um sinal de secreção completo. Encontrou-se que os clones NAP5, NAP7 e NAP22 possuem uma região codificadora idêntica. Os clones NAP6 e NAP11 são também idênticos mas diferem da região codificadora do tipo NAP5. A Figura 1 descreve a sequência nucleotídica do gene NAP5 e a Figura 2 descreve a sequência de aminoácidos da proteína codificada, AcaNAP5. Igualmente, a Figura 3 descreve a sequência nucleotídica do gene de NAP6 [SEQ. ID. NO. 5] e a Figura 4 descreve a sequência de aminoácidos da proteína codificada, AcaNAPô [SEQ. ID. NO.6].

Catorze outros clones possivelmente de tamanho 116 ΡΕ0788546 completo foram sujeitos a análise de restrição. 0 produto de PCR de 400 pb atrás referido obtido com o par de sequências YG99/oligo(dT)-Notl, foi digerido com quatro enzimas capazes de descriminar entre um clone do tipo NAP5 e do tipo NAP6: Sau96l, Sau3AI, Ddel e HpalI. Os resultados foram consistentes com 10 dos 14 clones sendo do tipo NAP5 (e.g. NAP4, NAP8, NAP9, NAP15, NAP16, NAPl7, NAP18, NAP20, NAP21 e NAP23) enquanto os restantes quatro eram tipo NAP6 (e.g. NAP10, NAP12, NAPl4 e NAP19).

Estes clones foram renomeados para reflectirem a origem do Ancylostoma caninum ao serem colocadas as letras Aca imediatamente antes da designação NAP. Por exemplo, NAP5 tornou-se AcaNAP5, NAP6 tornou-se AcaNAPô, etc.

Exemplo 3

Produção e purificação de AcaNAP5 recombinante em P. pastoris. (A) Construção do vector de expressão. O sistema de expressão da levedura Pichia pastoris, incluindo o vector vai-vem para E. coli/P. pastoris, pHILD2, foi descrito numa série de Patentes dos Estados Unidos. Ver, e.g., Patente U.S. Nos. 5330901; 5268273; 5204261; 5166329; 5135868; 5122465; 5032516; 5004688; 5002876; 4895800; 4885242; 4882279; 4879231; 4857467; 4855231; 4837148; 4818700; 4812405; 4808537; 4777242; e 4683293. 117 ΡΕ0788546 0 vector pYAM7SP8 usado para dirigir a expressão e secreção de AcaNAP5 recombinante em P. pastoris foi um derivado do plasmídeo pHILD2 (Despreaux, C.W. e Manning, R.F., Gene 131:35-41 (1993)), tendo a mesma estrutura geral. Para além dos elementos da transcrição e recombi-nação de pHILD2, necessários à expressão e integração cromossómica em P. pastoris (ver Stroman, D.W. et ai., Patente U.S. No. 4855231), este vector continha uma sequência líder prepro quimérica inserida a jusante do promotor da álcool oxidase (A0X1). 0 líder prepro consistiu no sinal de secreção da fosfatase ácida de P. pastoris (PH01) fundido com uma pro-sequência sintética de 19 aminoácidos. Esta pro-sequência era uma das duas pro-sequências de 19-aa designada por Clements et ai., Gene 106:267-272 (1991) com base na sequênca líder do factor alfa de Saccharomyces cerevisiae. Introduziu-se imediatamente a jusante da sequência líder prepro um local de clonagem múltipla sintético com sequências de reconhecimento para as enzimas StuI, SaciI, EcoRI, Bgll, NotI, Xhol, Spel e BamHI para facilitar a clonagem de genes estranhos. NAP conforme expresso a partir de pYAM7SP8 em Pichia pastoris foi primeiro traduzido como produto prepro e subsequentemente processado pela célula hospedeira para remover as sequências pre e pro.

A estrutura deste vector está apresentada na Figura 12. A sequência sinal (S) tem a sequência de ácido nucleico: ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA ATT ATT TTA 118 ΡΕ0788546

GCT TTG GCT ACT TTG CAA TCT GTC TTC GCT [SEQ. ID. NO. 102]. A sequência pro (P) tem a sequência de ácido nucleico: CAG

CCA GGT ATC TCC ACT ACC GTT GGT TCC GCT GCC GAG GGT TCT TTG

GAC AAG AGG [SEQ. ID. NO. 103] . O local de clonagem múltipla (MCS) tem a sequência de ácido nucleico: CCT ATC

CGC GGA ATT CAG ATC TGA ATG CGG CCG CTC GAG ACT AGT GGA TCC

[SEQ. ID. NO. 104]. O vector pGEM-9Zf(-) (Promega) contendo o cDNA AcaNAP5 foi usado para isolar por amplificação ("recuperação por PCR") a região codificadora da proteína AcaNAP5 madura (usando polimerase Vent da New England Biolabs, Beverly, MA; 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 50°C e 1,5 minutos a 72°C) . Foram usadas as sequências iniciadoras oligonucletídicas seguintes: YG101: GCTCGCTCTA-GAAGCTTCAG-ACATGTATAA-TCTCATGTTG-G [SEQ. ID. NO. 105] YG103: AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEQ. ID. NO. 89] A sequência iniciadora YG101, tendo como alvo sequências C-terminais, continha uma extensão que não emparelha, a qual inclui locais de restrição Xbal e HindiII (sublinhado).

Após digestão com a enzima Xbal, o produto de amplificaçao, tendo o tamanho esperado, foi isolado do gel e subsequentemente fosforilado enzimaticamente (polinu- 119 ΡΕ0788546 cleótido cinase de T4 da New England Biolabs, Beverly, MA). Após inactivação pelo calor (10 minutos a 70°C) da cinase, o fragmento extremo cerse/Xbal foi direccionadamente clonado no vector pYAM7SP8 para fins de expressão. O fragmento vector recipiente derivado de pYAM7SP8 foi preparado por restrição com Stul-Spel e purificado a partir de gel de agarose. A estirpe de E. coli WK6 [Zell, R. e Fritz, H.-J., EMBO J., 6_: 1809-1815 (1987)], foi transformada com a mistura de ligação e os clones resistentes à ampicilina foram seleccionados.

Com base na análise de restrição, um clone plasmídico contendo um inserto do tamanho esperado, designado pYAM7SP-NAP5, foi separado para posterior caracterização. A determinação da sequência do clone pYAM7SP-NAP5 confirmou a inserção precisa da região codificadora de AcaNAP5 madura fundida com o sinal lider prepro, conforme previsto pelo esquema de construção, assim como a ausência de mutações indesejáveis na região codificadora. (B) Expressão de AcaNAPõ recombinante em P. pastoris. A estirpe GTS115 (his4) de Pichia pastoris foi descrita em Stroman, D.W. et al., Patente U.S. No. 4855231. Todas as manipulações de P. pastoris foram realizadas essencialmente como descrito em Stroman, D.W. et al.,

Patente U.S. No. 4855231. 120 ΡΕ0788546

Cerca de 1 micrograma de DNA do plasmídeo pYAM7SP-NAP5 foi electroporado com a estirpe GTS115 usando um protocolo de electroporação convencional. O plasmídeo foi previamente linearizado por digestão com Sall, que teoricamente facilita o direccionamento e integração do pasmídeo no locus cromossómico his4. A selecção de uma esirpe de elevada expressão de AcaNAPã foi ralizada essencialmente como aqui descrito abaixo. Os transformantes His+ foram recuperados em placas MD (Base azotada de levedura sem aminoácidos (DIFCO), 13,4 g/1; biotina, 400 microgramas/1; D-glucose, 20 g/1; agar, 15 g/1). Colónias isoladas (n=60) obtidas por electroporação foram inoculadas em 100 microlitros de meio FM22-glicerol-PTMl em alvéolos de uma placa de 96 alvéolos e foram deixadas a crescer num agitador de placas, a 30°C, durante 24 horas. Um litro de meio FM22-glicerol-PTMl continha 42, 87 g de KH2P04, 5 g de (NH4)2S04, 1 g de

CaS04.2H20, 14,28 g K2S04, 11,7 g MgS04.7H20, 50g de glicerol esterilizado como uma solução de 100 ml e 1 ml de mistura de minerais pouco abundantes PTM1 esterilizada por filtração. A parte FM22 do meio foi preparada como uma solução de 900 ml ajustada a pH 4,9 com KOH e esterilizada por filtração. Um litro da mistura PTM1 continha 6 g de CuS04.5H20, 0,8 g de Kl, 3 g de MnS04.H20, 0,2 g de

NaMo04.2H20, 0, 02 g de H3B03, 0,5 g de CoC12.6H20, 20 g de

ZnCl2, 5 ml de H2S04, 65 g de FeS04.7H20, 0,2 g de biotina.

As células foram então sedimentadas e ressus- 121 ΡΕ0788546 pensas em meio fresco FM22-metanol-PTMl (a mesma composição descrita atrás, exceptuando 50 g de glicerol ser substituído por 0,5% (v/v) de metanol de forma a induzir expressão do promotor A0X1). Após um período de incubação adicional de 24 horas a 30 °C, os sobrebranadantes das mini-culturas foram testados quanto à presença de AcaNAP5 secretada. Foram seleccionados dois clones que dirigem um elevado nível de síntese e secreção de AcaNAP5, como se mostra pelo aparecimento de elevada actividade inibidora do factor Xa no meio de cultura (conforme medido pelo ensaio amidolítico do factor Xa descrito no Exemplo 1). Após um segundo ciclo de rastreio, usando o mesmo procedimento, mas desta vez ao nível de frascos de agitação, uma célula hospedeira isolada foi escolhida e designada P. pastoris GTS115/7 SP-NAP5.

Demonstrou-se que a célula hospedeira, GTS115/7SP-NAP5, possui um fenótipo selvagem de utilização de metanol (Mut + ) , demonstrando que a integração da cassete de expressão no cromossoma de GTS115 não alterou a funcionalidade do gene AOXl genómico. A produção subsequente de material AcaNAP5 recombinante foi realizada em culturas de frascos de agitação, como descrito em Stroman, D.W. et ai., Patente U.S. No. 4855231. O produto recombinante foi purificado a partir do sobrenadante das células de Pichia pastoris como descrito abaixo. 122 ΡΕ0788546 (C) Purificação de AcaNAP5 recombinante. (1) Cromatografia de permuta catiónica.

Após expressão, o sobrenadante de cultura derivado de GTS115/75SP-NAP5 (100 ml) foi centrifugado a 16 000 rpm (cerca de 30 000 xg) durante 20 minutos antes do pH ser ajustado com HC1 IN a pH 3. A condutividade do sobrenadante decresceu para menos de 10 mS/cm através da adição de água MilliQ. O sobrenadante diluído foi clarificado pela passagem através de um filtro de acetato de celulose de 0,22 micrómetros (Corning Inc., Corning, NY, USA). O volume total (aproximadamente 500 ml) de sobrenadante foi aplicado numa coluna Poros20 HS (Perseptive Biosystems, MA) de 1 x 2 cm, pré-equilibrada com tampão catiónico (citrato de sódio 0,05M, pH 3) num fluxo de 5 ml/minuto (400 cm/hora). A coluna e a amostra estiveram à temperatura ambiente ao longo deste passo de purificação. A coluna foi subsequentemente lavada com 50 volumes de coluna de tampão catiónico. O material que tinha actividade inibidora no ensaio amidolítico do factor Xa foi eluido com tampão catiónico contendo NaCl 1M, num fluxo de 2 ml/minuto. (2) Cromatografia de crivagem molecular usando Superdex3 0. O lote eluido com NaCl 1M contendo o material 123 ΡΕ0788546 inibidor (3 ml) da coluna de permuta catiónica foi aplicado numa coluna Superdex30 PG (Pharmacia, Sweden), 1,6 x 66 cm, pré-equilibrada com fosfato de sódio 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15 M à temperatura ambiente. A cromatografia foi realizada a um fluxo de 2 ml/minuto. A actividade inibidora de factor Xa (determinada no ensaio amidolitico do factor Xa) eluiu a 56-64 ml da corrida (Kav de 0,207) . Este é o mesmo volume de eluição determinado para a molécula nativa (Exemplo 1, parte E). (3) Cromatografia de fase reversa. 1 ml das fracções reunidas do gel de filtração foi aplicado numa coluna C18 de 0,46 x 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) , a qual foi então sujeita a um gradiente linear de 10-35% de acetonitrilo em 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético a lml/minuto, com uma taxa de permuta de 0,4% de acetonitrilo/minuto. A actividade inibidora do factor Xa, testada como no Exemplo 1, eluiu à volta de 30-35% de acetonitrilo e estava presente em várias fracções. As corridas de HPLC foram realizadas no mesmo sistema como descrito no Exemplo 1. As fracções de diferentes corridas nesta coluna contendo a actividade inibidora do factor Xa foram reunidas e secas sob vácuo. (4) Determinação da massa molecular de AcaNAP5 recombinante. A massa estimada para o principal constituinte 124 ΡΕ0788546 isolado como descrito nas secções (1) a (3) deste exemplo foi determinada usando o mesmo sistema de espectrometria de massa por ionisação com electrovaporização, como descrito no Exemplo 1. A massa estimada de AcaNAPõ recombinante foi de 8 735,69 Daltons. (5) Sequenciação de aminoácidos de AcaNAP5 recombinante.

Após a purificação de acordo com as secções (1) a (3) deste exemplo, AcaNAP5 recombinante derivada de Pichia pastoris foi sujeita a análise da sequência de aminoácidos como descrito no Exemplo 1. Os cinco primeiros aminoácidos do extremo amina de AcaNAP5 foram determinados como sendo: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu [SEQ. ID. NO. 106]. A sequência era idêntica à da proteína NAP nativa (ver Exemplo 1).

Exemplo 4

Produção e purificação de AcaNAP6 recombinante em P. pastoris. (A) Construção do vector de expressão. 0 vector de expressão, pYAM7SP-NAP6, foi preparado como descrito para pYAM7SP-NAP5 no Exemplo 3. 125 ΡΕ0788546 (B) Expressão de AcaNAP6 recombinante em P. pastoris. 0 vector, pYAM7SP-NAP6, foi usado para transformar a estirpe GTS115 (his4) de Pichia pastoris como descrito no Exemplo 3. (C) Purificação de AcaNAP6. A AcaNAP6 recombinante, expressa a partir da estirpe GTS115 (his4) de Pichia pastoris transformada com o vector de expressão, pYAM7SP-NAP6, foi purificada como descrito para AcaNAP5 recombinante descrita no Exemplo 3. A massa estimada de AcaNAPô recombinante foi determinada, como descrito no Exemplo 3, como sendo 8393,84 Daltons. A maioria da preparação de AcaNAPô tinha o seguinte extremo amina: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu [SEQ. ID. NO. 106] .

Exemplo 5

Expressão de Pro-AcaNAP5 recombinante em células cos (A) Construção do vector de expressão. O vector pGEM-9Zf(-)(Promega Corporation, Madi- 126 ΡΕ0788546 son, WI, USA) no qual foi clonado o cDNA de AcaNAP5, serviu como alvo para o resgate, por PCR, de toda a região codificadora de AcaNAP5, incluindo o sinal de secreção nativo (usando polimerase Vent da New England Biolabs, Beverly, MA, USA; 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C; 1,5 minutos a 72°C. As sequências oligonucleotídicas iniciadoras usadas foram: (1) YG101, tendo como alvo o extremo 3' do gene codificador de uma NAP e tendo a sequência GCTCGCTCTA GAAGCTTCAG ACATGTATAA TCTCATGTTG G [SEQ. ID. NO. 105], e (2) YG102, tendo como alvo o extremo 5' do gene codificador de uma NAP e tendo a sequência GACCAGTCTA GACAATGAAG ATGCTTTACG CTATCG [SEQ. ID. NO. 107]. Estas sequências iniciadoras possuem extensões que não emparelham, as quais incluem locais de restrição Xbal (sublinhado).

Após digestão com a enzima Xbal, o produto de amplificação tendo o tamanho esperado foi isolado num gel de agarose e subsequentemente usado para substituir o fragmento Xbal de cerca de 450 pares de bases irrelevantes do vector pEF-BOS [Mizushima, S. e Nagata, S., Nucl. Acids Res., 1_8:5322 (1990)] para fins de expressão. O fragmento vector recipiente foi preparado por digestão com Xbal e purificado a partir de um gel de agarose. E. coli stirpe WK6 [Zell, R. e Fritz, H.-J., EMBO J., 6: 1809-1815 (1987)] foi transformada com a mistura de ligação. Trinta transformantes picados ao acaso resistentes à ampicilina foram sujeitos a análise por PCR (polimerase 127 ΡΕ0788546

Taq da Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA: 30 ciclos de amplificação com o seguinte programa de temperaturas: 1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C; 1 minuto a 72°C. As sequências oligonucleotidicas iniciadoras usadas foram: (1) YG103 tendo a sequência, AAGGCATACC CGGAGTGTGG TG [SEQ. ID. NO. 89] e emparelhamento do extremo N da região codificadora de NAP madura e (i i) YG60 tendo a sequência GTGGGAGACC TGATACTCTC AAG [SEQ. ID. NO. 108] e as sequências de vector alvo a jusante do lugar de inserção, i. e., na região 3' não traduzida da cassete de expressão pEF-BOS. Apenas os clones portadores do inserto na orientação pretendida podem dar um fragmento de PCR com o comprimento previsto (cerca de 250 pares de bases). Dois desses clones foram ainda caracterizados por determinação da sequência e encontrou-se possuírem o inserto Xbal pretendido. Um dos clones, designado pEF-BOS-NAP5, foi usado para transfectar células COS. (B) Transfecção de células COS. Células COS-7 (ATCC CRL 1651) foram transfectadas com pEF-BOS-NAP5 ou pEF-BOS contendo um inserto irrelevante ou com omissão de DNA (transfecções simuladas) usando DEAE-dextrano. O meios e soluções stock que se seguem foram usados com o método de DEAE-dextrano: (1) Meio COS: DMEM; 10% FBS (incubado durante 30 minutos a 56°C); 0,03% L-glutamina; penicilina (50 U.I./ml) e estreptomicina (50 microgramas/ml) (todos os produtos da Life Technologies). 128 ΡΕ0788546 (2) MEM-HEPES: meio MEM da Life Technologies Inc., reconstituído de acordo com as especificações do fabricante; contendo uma concentração final de 25 mM de HEPES; ajustado a pH 7,1 antes da filtração (0,22 micrómetros).

(3) Solução de DNA: 6 microgramas de DNA por ml de MEM-HEPES (4) Solução de DEAE-dextrano: 30 microlitros de DEAE- dextrano stock (Pharmacia, Uppsala, Sweden; 100 mg/ml em H20) por 3 ml de MEM-HEPES. (5) Mistura de transfecção: 3 ml da solução de DEAE- dextrano foi adicionada a 3 ml da solução de DNA e a mistura foi deixada em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente. (6) Solução de cloroquina: uma diluição de 1:100 de cloroquina stock (Sigma, St. Louis, MO, USA; 10 mM em água; filtrada através de uma membrana de 0,22 micrómetros) em meio COS. A transfecção transitória das células COS foi realizada como se segue. Células COS (cerca de 3,5 x 106) , cultivadas num frasco TC Nunc de 175 cm2 (Life Technologies Inc.) foram lavadas uma vez com MEM-HEPES. Seis ml da mistura de transfecção foram pipetados para as células 129 ΡΕ0788546 lavadas. Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente, 48 ml da solução de cloroquina foram adicionados e as células foram incubadas durante mais 4 horas a 37°C. As células foram lavadas uma vez com meio COS fresco e finalmente incubadas em 50 ml do mesmo meio a 37°C. (C) Cultura de células COS transfectadas.

Três, quatro e cinco dias após a transfecçao uma amostra dos sobrenadantes de cultura foi testada num ensaio amidolítico do factor Xa de acordo com o procedimento no Exemplo 1. Os resultados demonstram claramente que a actividade inibidora do factor Xa se acumulou no sobrenadante de cultura das células transfectadas com pEF-BOS-NAP5. O sobrenadante da cultura COS foi colhido cinco dias após transfecção e a proteína NAP purificada como descrito no Exemplo 6.

Exemplo 6

Purificação de Pro-AcaNAP5 recombinante. (A) Cromatoqrafia de permuta aniónica. O sobrenadante de cultura COS contendo Pro-AcaNAP5 foi centrifugado a 1 500 rpm (cerca de 500 xg) , durante 10 minutos, antes da adição de acetato de sódio 130 ΡΕ0788546 sólido para uma concentração final de 50 mM. Os inibidores de protease que se seguem foram adicionados (todos os inibidores de proteases foram da ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA, USA) : pepstatina A (isovaleril-Val-Val-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoil-Ala-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanóico) 1,0 x 10-5 M, leupeptina 1,0 x 10-5 M, AEBSF (fluoreto de 4-(2-aminoetil)-benzenossulfonilo) 5,0 x 10-5 Μ. O pH foi ajustado com HC1 a pH 5,3. O sobrenadante foi clarificado pela passagem através de um filtro de acetato de celulose de 0,2 micrómetros (Corning Inc., Corning, NY, USA). O sobrenadante clarificado (volume total de aproximadamente 300 ml) foi aplicado numa coluna Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA) de 1 x 2 cm pré-equilibrada com tampão aniónico (acetato de sódio 0,05M, pH 5,3, NaCl 0,1 M) num fluxo de 10 ml/minuto (800 cm/hora) . A coluna e a solução adicionada estavam à temperatura ambiente ao longo deste passo de purificação. A coluna foi subsequentemente lavada com pelo menos 10 volumes de coluna de tampão aniónico. O material que tinha actividade inibidora no ensaio amidolitico do factor Xa foi eluído com tampão aniónico contendo NaCl 0,55 M num fluxo de 5 ml/minuto (400 cm/hora) e colhido. (B) Cromatografia de crivagem molecular usando Superdex3 0. O material da eluição com NaCl 0,55 M (3 ml) da 131 ΡΕ0788546 cromatografia de permuta aniónica foi aplicado numa coluna Superdex30 PG (Pharmacia, Sweden) 1,6 x 66 cm pré-equilibrada com fosfato de sódio 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M a 24°C. A cromatografia foi realizada a um fluxo de 2 ml/minuto. O material que tinha actividade inibidora de factor Xa no ensaio amidolitico do factor Xa eluiu a 56-64 ml da corrida (Kav de 0,207). Este foi exactamente o mesmo volume de eluição determinado para a molécula nativa. (C) Tratamento pelo calor. O conjunto total de fracções tendo actividade inibidora do factor Xa foi incubado durante 5 minutos a 90°C num tubo de vidro e subsequentemente arrefecido rapidamente em gelo. O material insolúvel foi sedimentado por centrifugação a 19000 x gmax, a 4°C, durante 20 minutos. O sobrenadante continha toda a actividade inibidora do factor Xa. (D) Cromatografia de fase reversa. O sobrenadante da amostra tratada pelo calor foi aplicado numa coluna C18 de 0,46 x 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que foi então sujeita a um gradiente linear de 10-35% de acetonitrilo em 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético, a lml/minuto, com uma taxa de permuta de 0,4% de acetonitrilo/minuto. A actividade inibidora do factor Xa eluiu à volta de 30-35% de acetonitrilo. As 132 ΡΕ0788546 corridas de HPLC foram realizadas no mesmo sistema descrito no Exemplo 1. As fracções contendo actividade inibidora do factor Xa foram secas sob vácuo. (E) Determinação de massa molecular. A massa estimada para Pro-AcaNAP5 recombinante, isolada como descrito nas secções A-D deste exemplo, foi determinada usando o mesmo sistema de espectrometria de massa por ionisação com electrovaporização descrito no Exemplo 1. A massa estimada para Pro-AcaNAP5 recombinante foi de 9 248,4 daltons. (F) Sequenciação de aminoácidos.

Após a purificação, Pro-AcaNAP5 recombinante derivada de células COS foi sujeita a análise da sequência de aminoácidos para determinar a sequência do extremo amina, como descrito no Exemplo 1. Os nove primeiros aminoácidos do extremo amina de Pro-AcaNAP5 foram determinados como sendo: Arg Thr Vai Arg Lys Ala Tyr Pro Glu [SEQ. ID. NO. 109]. Comparativamente com a proteína AcaNAP5 nativa (ver Exemplo 1), Pro-AcaNAP5 possui quatro aminoácidos adicionais no seu extremo N. A sequência de aminoácidos de Pro-AcaNAP5 está apresentada na Figura 5. ΡΕ0788546 133

Exemplo 7

Expressão de pro-AcaNAP6 recombinante em células

COS

Pro-AcaNAP6 foi transitoriamente produzida em células COS essencialmente como descrito para Pro-AcaNAP5 no Exemplo 5. A região codificadora de AcaNAPô, incluindo o sinal de secreção, foi recuperada por PCR com as mesmas duas sequências oligonucleotidicas iniciadoras usadas para AcaNAP5: (1) YG101, tendo como alvo o extremo 3' do gene, tendo a sequência GCTCGCTCTA GAAGCTTCAG ACATGTATAA TCTCATGTTG G [SEQ. ID. NO. 105], e (2) YG102, tendo como alvo o extremo 5' do gene e tendo a sequência GACCAGTCTA GACAATGAAG ATGCTTTACG CTATCG [SEQ. ID. NO. 107]. A sequência iniciadora YG101 possui um nucleótido que não emparelha quando usado com AcaNAP6 como alvo (o resíduo T sublinhado; comparado com a Figura 1 e a Figura 3) ; este desemparelhamento resulta na substituição de um codão ATT para Ile por um codão ATA para Ile. O desemparelhamento não influencia marcadamente a eficiência de amplificação.

Introduziu-se a seguinte modificação do Exemplo 5: vinte e quatro horas após transfecçao das células COS (que está descrito no Exemplo 5, secção B) , o meio COS contendo 10% FBS foi substituído com 50 ml de um meio consistindo numa mistura a 1:1 de DMEM e da mistura de 134 ΡΕ0788546 nutrientes Ham's F-12 (Life Technologies). As células foram ainda incubadas a 37°C e a produção de actividade inibidora do factor Xa detectada como descrito no Exemplo 5.

Exemplo 8

Purificação de Pro-AcaNAP6 recombinante. (A) Cromatografia de permuta aniónica. 0 sobrenadante de cultura COS contendo Pro-AcaNAPô foi centrifugado a 1 500 rpm durante 10 minutos antes da adição de acetato de sódio sólido para uma concentração final de 50 mM. Os inibidores de protease que se seguem foram adicionados (todos os inibidores de proteases foram da ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA, USA): pepstatina A (isovaleril-Val-Val-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoil-Ala-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanóico) 1,0 x 10”5 M, leupeptina 1,0 x 10”5 M, AEBSF (fluoreto de 4-(2-aminoetil)-benzenossulfonilo) 5,0 x 10“5 Μ. O pH foi ajustado com HC1 a pH 5,3. O sobrenadante foi clarificado pela passagem através de um filtro de acetato de celulose de 0,2 micrómetros (Corning Inc., Corning, NY, USA). O sobrenadante clarificado (volume total de aproximadamente 450 ml) foi aplicado numa coluna Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA) de 1 x 2 cm pré-equilibrada com tampão aniónico (Na acetato 0,05M, pH 5,3, NaCl 0,1 M) num fluxo de 10 ml/minuto (800 cm/hora) . A coluna e a solução 135 ΡΕ0788546 adicionadas estavam à temperatura ambiente ao longo deste passo de purificação. A coluna foi subsequentemente lavada com pelo menos 10 volumes de coluna de tampão aniónico. O material que tinha actividade inibidora no ensaio amidolitico do factor Xa foi eluido com tampão aniónico contendo NaCl 0,55 M num fluxo de 5 ml/minuto (400 cm/hora) e colhido. (B) Cromatografia de crivagem molecular usando

Superdex3 0. 0 material da eluição com NaCl 0,55 M (3 ml) da cromatografia de permuta aniónica foi aplicado numa coluna Superdex30 PG (Pharmacia, Sweden) 1,6 x 66 cm pré-equilibrada com fosfato de sódio 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M a 24°C. A cromatografia foi realizada a um fluxo de 2 ml/minuto. 0 material que tinha actividade inibidora de factor Xa no ensaio amidolitico do factor Xa eluiu a 56-64 ml da corrida (Kav de 0,207). Este foi exactamente o mesmo volume de eluição determinado para a NAP nativa. (C) Cromatografia de HPLC em fase reversa.

As fracções reunidas da filtração em gel foram aplicadas numa coluna C18 de 0,46 x 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que foi então sujeita a um gradiente linear de 10-35% de acetonitrilo em 0,1% (v/v) de ácido tri- fluoroacético a lml/minuto com uma taxa de permuta de 0,4% de acetonitrilo/minuto. A actividade inibidora do factor Xa 136 ΡΕ0788546 (testada de acordo com o Exemplo 1) eluiu à volta de 30% de acetonitrilo. As corridas de HPLC foram realizadas no mesmo sistema como descrito no Exemplo 1. As fracções contendo actividade inibidora do factor Xa foram secas sob vácuo. (E) Determinação da massa molecular. A massa estimada para Pro-AcaNAP6 recombinante, isolada como descrito nas secções A a C deste exemplo, foi determinada usando o mesmo sistema de espectrometria de massa por ionisação com electrovaporização como descrito no Exemplo 1. A massa estimada para Pro-AcaNAP5 recombinante foi de 8 906,9 daltons. (F) Sequenciação de aminoácidos.

Após a purificação, Pro-AcaNAP6 recombinante derivada de células COS foi sujeita a análise da sequência de aminoácidos para determinar a sequência do extremo amina, como descrito no Exemplo 1. Os cinco primeiros aminoácidos do extremo amina de Pro-AcaNAP6 foram determinados como sendo: Arg Thr Vai Arg Lys [SEQ. ID. NO. 110]. Comparativamente com a proteína AcaNAPõ nativa (ver Exemplo 1), Pro-AcaNAP6 possui quatro aminoácidos adicionais no seu extremo amina. A sequência de aminoácidos de Pro-AcaNAP6 está apresentada na Figura 6 [SEQ. ID. NO. 8]. ΡΕ0788546 137

Exemplo 9 A utilização de sequências de DNA de NAP para isolar genes codificadores de outras proteínas NAP.

As sequências de cDNA de AcaNAP5 e AcaNAPô (do Exemplo 2) foram usadas para isolar moléculas relacionadas de outras espécies de parasitas por hibridação cruzada.

Os vectores pGEM-9Zf(-) (Promega) contendo os cDNAs AcaNAP5 e AcaNAP6 foram usados para recuperar por PCR as regiões codificadoras de proteínas NAP maduras (polimerase Taq da Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA; 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C; 1,5 minuto a 72°C. As sequências oligonucleotídicas iniciadoras usadas foram: (1) YG109, tendo como alvo as sequências C-terminais de cDNA codificador de NAP e tendo a sequência TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [SEQ. ID. NO. 88] e (2) YG103 tendo a sequência, AAGGCATACC CGGAGTGTGG TG [SEQ. ID. NO. 89] . A sequência iniciadora YG109 possui um nucleótido que não emparelha (o resíduo T sublinhado; comparado com as sequências apresentadas na Figura 1 e na Figura 3) quando usado com AcaNAP6 como alvo. Isto não influenciou marcadamente a eficiência de amplificação. Os produtos de PCR de tamanho correcto (cerca de 230 pares de bases) foram ambos isolados a partir de um gel de 1,5% de agarose. Uma mistura equimolar foi marcada radioactivamente por extensão de sequências iniciadoras ao acaso (kit T7 QuickPrime; 138 ΡΕ0788546

Pharmacia) e subsequentemente passada numa coluna Bio-Spin 30 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

As bibliotecas de cDNA de Ancylostoma ceylanicum (Ace), Ancylostoma duodenale (Adu) e Heligmosomo ides polygyrus (Hpo) foram preparadas essencialmente como descrito para Ancylostoma caninum no Exemplo 2.

Ancylostoma ceylanicum e Heligmosomo ides polygyrus foram adquiridos ao Dr. D.I. Protchard, Department of Life Science, University of Nottingham, UK. Ancylostoma duodenale foi adquirido ao Dr. G.A. Schad, The School of Veterinary Medicine, Department of Pathobiology, University of Pensylvania, Philadelphia, PA, USA.

Em cada um dos casos, os cDNAs foram clonados direccionadamente como fragmentos EcoRI-NotI em lambda gtll. Aproximadamente 2xl05 clones de cDNA para cada uma das bibliotecas (filtros de cópias em duplicado das placas foram preparados usando Hybond™-N; Amersham) foram testados com os fragmentos de AcaNAP5 e AcaNAPô marcados radioactivamente usando as seguintes condições de pré-hibridação e hibridação: 5X SSC (SSC: NaCl 150 mM, citrato tri-sódico 15 mM) , solução de Denhardt 5x, 0,5% SDS, 100 microgramas/ml de DNA de esperma de peixe sonicado (Boehringer), durante a noite a 42°C. Os filtros foram lavados 4 vezes em SSC 2X, 0,1% SDS a 37°C. Após exposição (cerca de 60 horas) a filme de raios X, foi obtido um total entre 100 e 200 manchas de hibridação no caso de Ace e de 139 ΡΕ0788546

Adu. Um pequeno número de manchas muito fracas foram visíveis no caso da biblioteca de cDNA Hpo. Para cada uma das bibliotecas, oito positivos foram sujeitos a um segundo ciclo de hibridação com uma densidade de placas mais baixa de forma a obter placas isoladas.

Os clones separados foram ainda caracterizados através de amplificação por PCR dos insertos de cDNA usando a sequência iniciadora oligo(dT)-NotI (Promega; esta é a mesma sequência iniciadora usada para preparar a primeira cadeia de cDNA; ver Exemplo 2) [SEQ. ID. NO. 95] em combinação com a sequência iniciadora #1218 de lambda gtll tendo a sequência GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEQ. ID. NO. 96] ( New England Biolabs; a sequência iniciadora #1218 tem como alvo sequências de lambda situadas a montante do local da inserção de cDNA). As amplificações por PCR foram realizadas como se segue: polimerase Taq da Boehringer; 30 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C; 1,5 minutos a 72°C. A análise por electroforese em gel dos produtos de PCR demonstrou claramente que foram obtidos os cDNAs de aproximadamente o mesmo tamamho do cDNA de AcaNAP5 (e.g., 400 a 500 pb) para cada espécie. Para além destes cDNAs do tamanho de AcaNAP5, alguns cDNAs Ace e Adu foram estimados como tendo cerca de 700 pb de comprimento.

Uma série de clones, contendo um inserto de 500 pb ou de 800 pb, foram escolhidos para determinação da sequência. Com este objectivo, os insertos de cDNA foram subclonados como fragmentos Sfil-NotI, em fagemídeos do 140 ΡΕ0788546 tipo pGEM (Promega; ver Exemplo 2 para detalhes) que permitem a preparação de DNA de cadeia simples. Os resultados de sequenciação levaram à identificação de seis novas proteínas diferentes do tipo NAP, designadas como se segue: AceNAP4, AceMAP5, AceNAP7, AduNAP4, AduNAP7 e HpoNAP5. As sequências nucleotídicas dos cDNAs, assim como as sequências de aminoácidos deduzidas das proteínas codificadas estão apresentadas na Figura 7A (AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 9]), Figura 7B (AceNAP5) [SEQ. ID. NO. 10], Figura 7C (AceNAP7) [SEQ. ID. NO. 11], Figura 7D (AduNAP 4) [SEQ. ID. NO. 12], Figura 7E (AduNAP7) [SEQ. ID. NO. 13] e Figura 7F (HpoNAP5) [SEQ ID NO. 14]. Os cDNAs de AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 9] e AduNAP7 [SEQ. ID. NO. 13], cada um com cerca de 700 pb de comprimento, cada uma das proteínas codificadas que incluem dois domínios NAP; os outros cDNAs isolados codificaram uma proteína tendo um único domínio NAP. 0 clone de cDNA AduNAP4 [SEQ . ID. NO. 12] não tinha tamanho completo, i.e., o clone não possuía a parte 5'-terminal da região codificadora; a grelha de leitura correcta podia, no entanto, ser atribuída com base na homologia da sequência de aminoácidos com a família NAP de moléculas relacionadas.

As sequências de cDNA identificadas podem ser usadas para produzir as proteínas codificadas como descrito nos Exemplos 3, 4, 5 e 7 usando os mesmos sistemas de expressão ou sistemas alternativos adequados. O meio condicionado ou lisados celulares, dependendo do sistema usado, pode ser testado como tal ou após f raccionamento (usando metodologia como a descrita no Exemplo 3, 4, 6 e 8) 141 ΡΕ0788546 da actividade inibidora de protease e anticoagulante. As proteínas que são codificadas pelos cDNAs que hibridam com sondas derivadas de fragmentos do gene AcaNAP5 (Figura 1) [SEQ. ID. NO. 31] e/ou do gene AcaNAPô (Figura 3) [SEQ ID NO. 5] e que possui propriedades inibidoras de serina-proteases e/ou anticoagulantes são consideradas como pertencentes à família NAP de moléculas relacionadas.

Exemplo 10

Identificação de NAP por apresentação funcional de proteínas codificadas por cDNA. (A) A Série de vectores pDONG.

As sequências nucleotídicas dos vectores pDONG, pDONGôl [SEQ. ID. NO. 15], pDONG62 [SEQ. ID. NO. 16] e pDONG63 [SEQ. ID. NO. 17], derivados de pUC119 [Vieira, J. e Messing, J., Methods in Enzymology 153:3-11 (1987)] estão descritos nas Figuras 8A a 8C, respectivamente.

Para construir estes três vectores, locais de restrição HindiII e Sfil foram adicionados aos extremos 5' e 3' do gene 6 do fago filamentoso através de amplificação por PCR do DNA de cadeia simples M13K07 [Vieira, J. e Messing, J., Ibid] com a sequência iniciadora reversa G6BACKHIND e G6FORSFI61, G6FORSFI62 ou G6FORSFI63 como sequências iniciadoras directas. Num segundo PCR, os três fragmentos obtidos foram novamente amplificados com 142 ΡΕ0788546 G6BACKHIND e G6F0RN0TBAMH como sequência iniciadora directa para adicionar os locais Not I e BamHI no extremo 3' dos fragmentos. As sequências das sequências iniciadoras para PCR referidas são como se segue (os locais de restrição estão sublinhados): G6BACKHIND: ATCCGAAGCT TTGCTAACAT ACTGCGTAAT AAG [SEQ ID NO. 111]

G6FORSFI61: TATGGGATGG CCGACTTGGC CTCCGCCTGA GCCTCCACCT TTATCCCAAT CCAAATAAGA [SEQ. ID. NO. 112]

G6FORSFI62: ATGGGATGGC CGACTTGGCC CTCCGCCTGA GCCTCCACCT TTATCCCAAT CCAAATAAGA [SEQ. ID. NO. 113]

G6FORSFI63: TATGGGATGG CCGACTTGGC CGATCCGCCT GAGCCTCCAC CTTTATCCCA ATCCAAATAA [SEQ. ID. NO. 114] G6F0RN0TBAMH: AGGAGGGGAT CCGCGGCCGC GTGATATGGG ATGGCCGACT TGGCC [SEQ. ID. NO. 115]

Finalmente, os produtos de PCR foram purificados em gel, digeridos individualmente com HindiII e BamHI e inseridos entre os locais correspondents de pUC119. A determinação da sequência confirmou que pDONGôl , pDONG62 e pDONG63 possuem todos o inserto pretendido. A série de vectores pDONG permite a clonagem de cDNAs, como fragmentos Sfil-NotI. Esta clonagem funde os cDNAs em cada uma das três grelhas de leitura (tradução) ao extremo 3' do gene 6 dos fagos filamentosos que codifica uma das proteínas da cápsdie do fago. A infecção de uma estirpe de E. coli masculina portadora de um derivado de pDONG, com o fago auxiliar VCSM13 (Stratagene, La Jolla, 143 ΡΕ0788546 CA) resulta na recuperação de pseudoviriões que encapsidam uma cadeia simples especifica do derivado de pDONG e que pode também incorporar uma proteína de fusão com a proteína 6 recombinante (p6) na sua cápside. Os cDNAs que permitem que a proteína codificada seja funcionalmente apresentada na superfície do fago como uma proteína de fusão com p6 recombinante tornam-se identificáveis por meio de uma experiência de adsorção descrita abaixo. (B) Transferência da biblioteca de cDNA de Ancylostoma caninum de lambda gtll para os vectores da série pDONG.

Uma preparação do fago lambda dos clones de cDNA reunidos de A. caninum (cerca de 1 x 106 placas, ver Exemplo 2) foi usada para recuperar por PCR os insertos de cDNA (polimerase Taq da Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA: 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C; 3 minutos a 72°C seguido de 10 minutos a 65°C), com a sequência iniciadora #1218 de lambda gtll tendo a sequência GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEQ. ID. NO. 96] (New England Biolabs, Beverly, MA, USA; sequências alvo situadas a montante do inserto de cDNA) em combinação com a sequência iniciadora oligo(dT)-NotI/adaptador (Promega) usada para a síntese da primeira cadeia de cDNA. Após digestão com as enzimas de restrição Sfil e NotI, a totalidade da gama de produtos de amplificação foi recuperada do gel de agarose. 144 ΡΕ0788546

Todos os fragmentos foram direccionadamente clonados nos vectores pDONGôl, pDONG62 e pDONg63. Os fragmentos de vector recipiente foram preparados por digestão com os vectores purificados por CsCl com Sfil e Not I e purificação com o "Wizard™ PCR Preps DNA Purification System" (Promega Corp, Madison, WI, USA). E. coli estirpe TG1 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T., Molecular Cloning, Ά Laboratory Manual, Second Edition, volumes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] foi transformada por electroporação com as misturas de ligação pDONG/cDNA. As células electrotransformadas foram incubadas 1 hora, a 37°C, em meio SOC [Sambrook, J. et al., Ibid.] e semeadas em agar LB contendo 0,1% de glucose e 100 microgramas/ml de carbe-nicilina (placas de 245x245x25 mm; Nunc). 2,2 x 106, 1,6 x 106 e 1,4 x 106 transformantes resistentes a carbenicilina foram obtidos com pDONGôl, pDONG62 e pDONG63, respecti-vamente. A partir de cada uma das respectivas biblotecas designadas 20L, 21L e 22L, uma série de transf ormantes picados ao acaso foram sujeitos a análise de PCR (polimerase Taq da Life Technologies; 30 ciclos de amplificação com o seguinte programa de temperaturas: 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 50°C e 1 a 3 minutos a 72°C) usando duas sequências iniciadoras que são concordantes com as sequências que flanqueiam o local de clonagem múltipla de pUC119 (sequências iniciadoras #1224 tendo a sequência, CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC [SEQ. ID. NO. 116] e #1233 tendo a sequência AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA [SEQ . ID. NO. 101]; 145 ΡΕ0788546

New England Biolabs). Os resultados mostraram que a grande maioria dos clones continha um inserto de cDNA de tamanho variável. (C) Clones de cDNA codificadores de uma proteína NAP seleccionados por afinidade baseada no Factor Xa.

As partículas fágicas derivadas das bibliotecas 20L, 21L e 22L foram recuperadas como se segue: cada uma das bibliotecas foi raspada das placas e crescida a 37°C em 100 ml de meio LB, suplementado com 1% de glucose e 100 microgramas/ml de carbenicilina, até a absorvância óptica a 600 nm atingir o valor de 0,5. Após adição do fago auxiliar VCSM13 (Stratagene) a uma multiplicidade de infecção (moi) de 20, a cultura foi deixada em repouso durante 30 minutos a 37°C e depois lentamente agitada durante 30 minutos. As células foram sedimentadas por centrifugação e ressuspensas em 250 ml de meio LB suplementado com 100 microgramas/ml de carbenicilina e 50 microgramas/ml de canamicina. Estas culturas foram deixadas a crescer durante a noite a 30°C sob forte agitação. As partículas fágicas resultantes foram purificadas por duas precipitações consecutivas com poletilenoglicol/NaCl e ressuspensas a 1 x 1013 viriões por ml em soro fisiológico tamponado com Tris (Tris 0,05M, cloreto de sódio 0,15M, pH 7,4) (TBS) . Quantidades iguais de partículas fágicas derivadas de 20L, 21L e 22L foram então misturadas umas com as outras.

Factor Xa humano (ver Exemplo 1 para a prepa- 146 ΡΕ0788546 ração) foi botinilado com biotina-XX-NHS de acordo com as instruções do fabricante (Pierce). A actividade amidolitica da protease não foi afectada por esta modificação como se mostra num ensaio enzimático usando o substrato cromogénico S-2765 (Chromogenix; ver Exemplo 1). Esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (Dyna; 1 mg por ciclo de selecção) foram lavadas três vezes com TBS e bloqueadas em TBS suplementado com 2% de leite desnatado (Difco) à temperatura ambiente. Após uma hora, as esferas magnéticas foram lavadas duas vezes com TBS antes de usar.

Para o primeiro ciclo de selecção, 1 x 1013 fagos derivados do conjunto de bibliotecas foram incubados durante 75 minutos a 4°C em 200 microlitros de tampão TBS suplementado com factor Xa biotinilado 250 nM, CaCl2 5 mM e 2% de leite desnatado. Após este tempo, 1 mg de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina bloqueadas, ressuspensas em 200 microlitros de TBS contendo Ca2+ 5 mM e 2% de leite desnatado, foi adicionado à solução de fagos e incubado durante 1 hora a 4°C com agitação suave. Com um magnete (Dynal), as esferas magnéticas foram então lavadas dez vezes com 500 microlitros de TBS contendo 0,1% Tween-20. Os fagos ligados foram eluidos das esferas magnéticas através da incubação com 500 microlitros de tampão glicina-HC1 0,1 M (pH 2,0) durante 10 minutos. O sobrenadante foi neutralizado com 150 microlitros de tampão Tris-HCl 1 M (pH 8,0) .

Para a propagação de fagos, E. coli estirpe TG1 147 ΡΕ0788546 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T., Molecular Cloning, Ά Laboratory Manual, Second Edition, volumes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] foi crescida a 37°C em 10 ml de meio LB até a absorvância óptica a 600 nm atingir o valor de 0,5. A cultura foi infectada com 650 microlitros de fagos eluídos das esferas magnéticas e rapidamente incubada a 37°C sem agitação. Após centrifugação, as células infectadas foram ressuspensas em 2 ml de meio LB e semeadas em placas de 245x245x25 mm contendo agar LB com 1% de glucose e 100 microgramas/ml de carbenicilina. Após incubação durante a noite a 37°C, as células foram raspadas e ressuspensas em 40 ml de meio LB suplementado com 1% de glucose e 100 microgramas/ml de carbenicilina. Uma alíquota de células, correspondendo a 15 unidades de densidade óptica a 600 nm, foi então usada para inocular 100 ml de meio LB contendo 1% de glucose e 100 microgramas/ml de carbenicilina. A recuperação de fagos para a selecção seguinte foi feita como descrito abaixo.

Para o segundo ciclo de selecção, 6 x 1012 fagos foram incubados durante 90 minutos com 1 mg de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina bloqueadas, ressuspensas em 200 microlitros de TBS contendo Ca2+ 5 mM e 2% de leite desnatado (este passo foi introduzido no procedimento para evitar selecção de clones que se ligam à estreptavidina). Após remoção das esferas, foi seguido o mesmo protocolo do ciclo 1. Os ciclos de selecção 3, 4 e 5 foram conseguidos como no ciclo 2, excepto ter-se baixado para 2 x 1012 o número de fagos adicionados. 148 ΡΕ0788546

Vinte e quatro clones individuais resistentes à carbenicilina, que foram isolados após os cinco ciclos de selecção contra factor Xa biotinilado, foram então analisados por ELISA. Placas de 96 alvéolos revestidas com estreptavidina (Pierce) foram bloqueadas durante 1 hora com 200 microlitros de TBS contendo 2% de leite desnatado por alvéolo, depois foram incubadas durante 1 hora com 100 microlitros de factor Xa biotinilado 20 nM em TBS por alvéolo. Para cada um dos clones, cerca de 1010 fagos diluídos em 100 microlitros de TBS contendo 2% de leite desnatado e 0,1% de Tween-20 foram adicionados aos alvéolos. Após uma incubação de 2 horas, os alvéolos foram lavados quatro vezes com 200 microlitros de TBS contendo 0,1% Tween-20. Os fagos ligados foram visualizados através de incubação consecutiva com anti-soro anti-M13 de coelho (ver Exemplo 11), soro anti-coelho conjugado com fosfatase alcalina (Sigma) e p-nitrofenilfosfato como substrato (Sigma) . As absorvâncias foram lidas a 405 nm após 20 minutos. De entre os 24 clones, cinco ligaram-se fortemente ao factor Xa. Não foi observada ligação inespecífica significativa com estes fagos quando testados no mesmo ELISA com omissão do factor Xa biotinilado. DNA de cadeia simples foi então preparado a partir de cinco clones positivos e os insertos 3' relativamente ao gene 6 foram submetidos a sequenciação de DNA automática usando a sequência iniciadora #1224 tendo a sequência, CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC [SEQ. ID. NO. 116] 149 ΡΕ0788546 (New England Biolabs). Encontrou-se que os cinco clones possuem o mesmo cDNA truncado em 5', de 470 pb, na mesma grelha de leitura do gene 6 em pDONG63. A sequência nucleotidica deste cDNA assim como a sequência de aminoácidos deduzida estão descritas na Figura 9 [SEQ. ID. NO. 19]. O cDNA, designado AcaNAPc2, codifica uma proteína, designada NAP isoforma c2, que pertence à família NAP de proteínas relacionadas.

Exemplo 11

Preparaçao de anti-soro contra o fago M13. O anti-soro contra o fago M13 foi preparado em coelhos através de injecções subcutâneas de aproximadamente 1013 fagos M13K07 em 500 microlitros de PBS (fosfato de sódio 0,01 M, pH 7,4 + cloreto de sódio 0,15 M) combinado com um volume igual de adjuvante. O fago M13K07 foi purificado em CsCl essencialmente como descrito por Glaser-Wuttke, G., Keppner, J., e Rasched, I., Biochem. Biophys. Acta, 985:239-247 (1989). A injecção inicial foi feita com adjuvante completo de Freunds no dia 0, seguido de injecções subsequentes com adjuvante incompleto de Freund nos dias 7, 14 e 35. O anti-soro foi colhido no dia 42. A fracção de IgG do anti-soro foi enriquecido pela passagem através de uma coluna de Proteína A-Sepharose usando condições bem conhecidas na área. ΡΕ0788546 150

Exemplo 12 A utilização de sequências de DNA AcaNAP5 e AcaNAP6 para isolar sequências adicionais codificadoras de NAP derivadas de A. caninum.

As sequências de cDNA de AcaNAP5 e AcaNAPô (derivadas do Exemplo 2) foram usadas para isolar moléculas relacionadas a partir da mesma espécie de parasita através de hibridação cruzada.

Os vectores pGEM-9Zf(-) (Promega, Madison, WI) contendo cDNAs de AcaNAP5 e AcaNAPô foram usados para recuperar por PCR as regiões codificadoras das proteínas maduras (polimerase Taq da Life Technologies Inc., (Gaithersburg, MD); 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C; 1,5 minutos a 72°C). As sequências oligonucleotídicas iniciadoras usadas foram: (1) YG109, tendo como alvo as sequências codificadoras C-terminais do cDNA codificador de AcaNAP5 e AcaNAPô e tendo a sequência TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [SEQ . ID. NO. 88] e (2) YG103, tendo como alvo as sequências codificadoras N-terminais de AcaNAP5 e AcaNAPô maduras, tendo a sequência AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEQ. ID. NO. 89]. A sequência iniciadora YG109 possui um desemparelhamento de um único nucleótido quando usado com AcaNAPô como alvo (resíduo T sublinhado; comparar com a sequência apresentada na Figura 3 [SEQ. ID. NO. 5]). Este desemparelhamento não influencia marcadamente a eficiência de amplificação. Os produtos de 151 ΡΕ0788546 PCR com o tamanho correcto (cerca de 230 pares de bases) para AcaNAP5 e AcaNAPô foram ambos isolados a partir de um gel de 1,5% de agarose. Uma mistura equimolar foi marcada radioactivamente por extensão de sequências iniciadoras ao acaso (kit T7 QuickPrime; Pharmacia (Sweden) e subsequentemente passado através de uma coluna Bio-Spin 30 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Aproximadamente 750 000 clones de cDNA de Ancy-lostoma caninum (Aca) (ver Exemplo 2B) foram transferidos em duplicado para filtros usando Hybond™-N; Amersham (Buckinghamshire, England) foram testados com os fragmentos de cDNA de AcaNAP5 e AcaNAPô marcados radioactivamente usando as seguintes condições de pré-hibridação e hibri-dação: SSC 5X (SSC: NaCl 150 mM, citrato tri-sódico 15 mM), solução de Denhardt 5X, 0,5% SDS, 20% formamida, 100 micro-gramas/ml de DNA de esperma de peixe sonicado (Boehringer), durante a noite a 42°C. Os filtros foram lavados 4 vezes durante 30 minutos em SSC 20X, 0,1% SDS a 37°C. Após exposição a filme de raios X, foi identificado um total de 300 positivos. 48 dos 300 positivos foram sujeitos a amplificação por PCR (polimerase Taq da Boehringer Mannheim, Germany; 30 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C; 1,5 minutos a 72°C) usando a sequência iniciadora YG109 atrás referida, especifica para a sequência codificadora do extremo C dos cDNAs de AcaNAP5 e AcaNAP6 e a sequência iniciadora #1218 que tem como alvo 152 ΡΕ0788546 sequências de lambda-gtll situada a montante do local de inserção do cDNA (New England Biolabs, Beverly, MA; GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEQ. ID. NO. 96] . 31 dos 48 positivos deram um produto de PCR com um tamanho semelhante ao esperado para o cDNA tipo AcaNAP5/6.

Os restantes 17 positivos foram usados como matriz para a amplificação com a sequência iniciadora #1218 e uma sequência iniciadora especifica AcaNAPc2 (e.g., LJ189, tendo como alvo o extremo C de AcaNAPc2 e tendo a sequência GTTTCGAGTT CCGGGATATA TAAAGTCC [SEQ. ID. NO. 117]; refere-se ao Exemplo 10 e Figura 9). Nenhum dos clones deu um produto de PCR. Todos os 17 positivos foram então sujeitos a um segundo ciclo de hibridação, a uma densidade de placas mais baixa; clones isolados foram identificados em todos os casos. Os 17 clones de cDNA isolados foram re-analisados por PCR usando os pares de sequências iniciadoras #1218/YG109 e #1218/LJ189. Três dos 17 clones deram um produto de amplificação com as sequências iniciadoras #1218/YG109.

Os restantes 14 clones foram ainda analisados através de amplificação por PCR com as sequências iniciadoras #1218 e oligo(dT)-Not (Promega, Madison, WI; esta é a mesma sequência iniciadora usada para preparar a primeira cadeia de cDNA; ver Exemplo 2). Todos os 14 clones deram um produto de PCR. A análise por electroforese em gel dos produtos de PCR indicaram que alguns cDNAs eram 153 ΡΕ0788546 consideravelmente maiores do que o inserto de cDNA de AcaNAP5.

Dez clones, incluindo os possuidores dos maiores insertos de cDNA, foram escolhidos para determinação da sequência. Com este objectivo os insertos de cDNA foram subclonados como fragmentos Sfil-NotI nos fagemideos do tipo pGEM (Promega, Madison, WI) como descrito no Exemplo 2. A sequenciação identificou oito sequências adicionais de proteína NAP, designadas como se segue: AcaNAP23, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP31, AcaNAP44, AcaNAP45, AcaNAP47 e AcaNAP48. Dois clones adicionais de cDNA, designados AcaNAP42 e AcaNAP46 codificaram proteínas idênticas às codificadas por AcaNAP31 [SEQ. ID. NO. 34]. As sequências nucleotídicas dos cDNAs assim como as sequências de aminoácidos deduzidas das proteínas codificadas estão apresentadas na Figura 13A (AcaNAP23 [SEQ. ID NO. 31], Figura 13B (AcaNAP24 [SEQ. ID NO. 32]), Figura 13C (AcaNAP25 [SEQ. ID NO. 33], Figura 13D (AcaNAP31 [SEQ. ID NO. 34], Figura 13E (AcaNAP44 [SEQ. ID NO.35], Figura 13F (AcaNAP45 [SEQ. ID NO. 36], Figura 13G (AcaNAP47 [SEQ. ID NO. 37] e Figura 13H (AcaNAP48 [SEQ. ID NO. 38]). Todos os clones tinham tamanho completo e incluíam um sinal de secreção completo. Os cDNAs de AcaNAP45 [SEQ. ID NO. 36] e AcaNAP47 [SEQ. ID NO. 37], codificam proteínas que incorporam dois domínios NAP; os outros cDNAs codificam uma proteína tendo um único domínio NAP. ΡΕ0788546 154

Exemplo 13 A utilização de sequências de DNA de NAP para isolar sequências codificadoras de uma proteína NAP de Necator americanus.

As sequências de AcaNAP5 [SEQ. ID. NO . 3] , AcaNAP6 [SEQ. ID. NO. 5] , AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 19] , AcaNAP23 [SEQ . ID. NO. 31] , AcaNAP24 [SEQ. ID. NO. 32] , AcaNAP25 [SEQ . ID. NO. 33] , AcaNAP31 [SEQ. ID. NO. 34] , AcaNAP44 [SEQ . ID. NO. 35] , AcaNAP45 [SEQ. ID. NO. 36] , AcaNAP4 7 [SEQ . ID. NO. 37] , AcaNAP48 [SEQ. ID. NO. 38] , AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 9] , AceNAP5 [SEQ. ID. NO. 10] , AduNAP4 [SEQ. ID. NO. 12] , AduNAP7[SEQ. ID. NO. 13] e HpoNAP5 [SEQ. ID. NO. 14] (ver Figuras 1, 3, 7 e 13) foram usadas para isolar moléculas relacionadas derivadas do parasita hematófago Necator americanus através de clonagem do produto de PCR.

Sequências de aminoácidos de consenso foram geradas a partir de regiões de homologia entre as proteínas NAP. Estas sequências de consenso foram então usadas para projectar as seguintes sequências iniciadoras degeneradas: NAP-1, 5'-AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY-3' [SEQ ID NO. 90] correspondendo à sequência de aminoácidos NH2-Lys-Pro-Cys-Glu-(Arg/Pro/Lys)-Lys-Cys [SEQ. ID. NO. 118]; NAP-4.RC, 5'-TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA-3' [SEQ. ID. NO.91], correspondendo à sequência NH2-Cys-(Val/Ile/Gln)-Cys-(Lys/Asp/Glu/Gln)-(Asp/Glu)-Gly-(Phe/Tyr)-Tyr [SEQ. ID. NO. 155 ΡΕ0788546 119]. Estas sequências inicidoras foram usadas aos pares para gerar sondas específicas de NAP por PCR, usando cDNA de N. americanus como matriz.

Vermes adultos, N. americanus, foram adquiridos ao Dr. David Pritchard, University of Nottingham. Preparou-se RNA poli (A+) usando o kit de purificação de mRNA QuickPrep (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Um micrograma de mRNA foi sujeito a transcrição reversa usando transcriptase reversa de AMV e sequências iniciadoras de hexâmeros ao acaso (Amersham, Arlington Hills, IL) . Um quinto do produto de reacção de cDNA em cadeia simples foi usado como matriz para -400 pmoles de cada NAP-1 e NAP-4.RC, com reagentes de PCR GeneAmp (Perkin Elmer, Norwalk, CT), num termociclador de DNA Perkin-Elmer. As condições de PCR foram: ciclos 1-3, desnaturação a 96°C durante 2 minutos,, emparelhamento a 37°C durante 1 minuto e elonga-ção a 72°C durante 3 minutos (tempo de rampa entre 37°C e 72°C foi de 2 minutos); ciclos 4-5, desnaturação a 94°C durante 1 minuto, emparelhamento a 37°C durante um minuto e elongação a 72°C durante 2 minutos (o tempo de rampa entre 37°C e 72°C foi de 2 minutos); ciclos 6-45, desnaturação a 94°C durante 1 minuto, emparelhamento a 37°C durante 1 minuto e elongação a 72 °C durante 2 minutos. Os tempos de elongação foram incrementados em 3 segundos/ciclo para os ciclos 6-45. A amplificação por PCR de cDNA de N. americanus com NAP-1 e NAP-4.RC resultou num produto de amplificação 156 ΡΕ0788546 de aproximadamente 100 pb. O produto de PCR foi marcado com [a-32P]-dCTP (Amersham) usando marcação com sequências iniciadoras ao acaso (Stratagene, La Jolla, CA) e o DNA marcado foi separado dos nucleótidos não incorporados usando uma coluna de Chromaspin-10 (Clonetech, paio Alto, CA) .

Uma biblioteca de cDNA foi construída usando o procedimento que segue. CDNA de cadeia dupla foi sintetizado a partir de 1 μρ de RNA poli(A+) de N. americanus usando transcriptase reversa de AMV e sequências iniciadoras ao acaso (Amersham, Arlington Hills, IL) . Os fragmentos de cDNA superiores a aproximadamente 300 pb foram purificados num gel de 6% de poliacrilamida e ligados a sequências adaptadoras EcoRI (Stratagene, San Diego, CA) usando procedimentos convencionais. O cDNA com adaptadores foi ligado a lambda gtlO cortado com EcoRI e desfosforilado (Stratagene, San Diego, CA) e encapsidados usando um kit de encapsidação Gigapack Gold II (Stratagene, San Diego, CA).

As condições de pré-hibridação e hibridação foram SSC 6X (SSC: NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM, pH 7,0), fosfato de sódio 0,02M, pH 6,5, solução de Denhardt 5X, 100 μρ/ιηΐ de DNA de esperma de salmão desnaturado, 0,23% de dextrano sulfato. A pré-hibridação e a hibridação foram a 42°C e os filtros foram lavados durante 30 minutos a 45 °C com SSC 2X, após duas pré-lavagens com SSC 2X durante 20 minutos. Os filtros foram expostos durante a noite a filme de raios X com dois écrans intensificadores a 70 °C. 157 ΡΕ0788546

Aproximadamente 400 000 fagos recombinantes da biblioteca de N. americanus iniciada ao acaso (não amplificada) foram testados com o fragmento de PCR NAP-1/NAP-4.RC. Cerca de onze fagos recombinantes hibridaram com esta sonda, dos quais quatro foram isolados para análise da sequência de nucleótidos. A sequenciação em cadeia dupla foi efectuada através de subclonagem dos fragmentos de cDNA EcoRI inseridos nestes isolados fágicos no vector pBluescript II KS+ (Stratagene, San Diego, CA). O DNA foi sequenciado usando o kit Sequenase versão 2.0 (Amersham, Arlington Hills, IL)) e as sequências iniciadoras oligonucleotidicas de M13 (Stratagene, San Diego, CA).

Os quatro isolados de lambda continham DNA que codificava um único polipeptídeo NAP de 79 aminoácidos que se assemelha às sequências NAP derivadas de Ancylostoma spp. e H. polygyrus. O polipeptídeo NAP derivado de N. americanus tem uma massa molecular calculada de 8 859,6

Daltons. As sequências de nucleótids e de aminoácidos deduzida estão apresentadas na Figura 14.

Exemplo 14.

Expressão de AceNAP4 recombinante em células COS A. Expressão

AceNAP4 foi transitoriamente produzido em células 158 ΡΕ0788546 COS essencialmente como descrito para Pro-AcaNAP5 no Exemplo 5 e Pre-AcaNAP6 no Exemplo 7.

Um fagemídeo tipo pGEM que tem inserido o cDNA de AceNAP4 (do Exemplo 9), serviu como alvo para a recuperação por PCR da totalidade da região codificadora de AceNAP4, incluindo o sinal de secreção, usando as sequências iniciadoras oligonucleotidicas com Xbal apenso. As sequências iniciadoras usadas foram: (1) SHPCR4, tendo como alvo o extremo 5' do gene e tendo a sequência GACCAGTCTA GACCACCATG GCGGTGCTTT ATTCAGTAGC AATA [SEQ. ID. NO. 120] e (2) SHPCR5, tendo como alvo o extremo 3' do gene e tendo a sequência GCTCGCTCTA GATTATCGTG AGGTTTCTGG TGCAAAAGTG [SEQ. ID. NO. 121]. Os locais de restrição Xbal incluídos nas sequências iniciadoras estão sublinhados. As sequências iniciadoras foram usadas para amplificar a sequência AceNAP4 de acordo com as condições descritas no Exemplo 5.

Após digestão com a enzima Xbal, o produto de amplificação, tendo o tamanho esperado, foi isolado a partir de um gel de agarose e subsequentemente usado para substituir um fragmento Xbal de 450 pares de bases irrelevante do vector pEF-BOS [Mizushima, S. and Nagata, S., Nucl. Acids Res., _18_:5322 (1990)]. O protocolo descrito no Exemplo 5 foi seguido para dar o clone pEF-BOS-AceNAP4, que se verificou conter o inserto Xbal na orientação pretendida por PCR, usando as sequências iniciadoras SPHCR4 e YG60, e subsequentemente confirmado através da determi- 159 ΡΕ0788546 nação da sequência. Este clone foi usado para transfectar células COS de acordo com os métodos do Exemplo 5.

Vinte e quatro horas após transfecção das células COS (ver Exemplo 5, secção B) o meio de COS contendo 10% FBS foi substituído com 50 ml de um meio consistindo numa mistura de 1:1 de DMEM e Mistura Nutritiva de Ham F-12 (Life Technologies (Gaithersburg, MD) . As células foram ainda incubadas a 37°C e a produção da actividade inibidora de TF dependente de EGR-factor Xa/factor Vila detectada como descrito no Exemplo E. B. Purificação de AceNAP4 1. Cromatografia de permuta aniónica O sobrenadante da cultura COS derivado das células que expressam AceNAP4 foi centrifugado a 1500 rpm (cerca de 500xg) durante 10 minutos antes de serem adicionados os inibidores da protease que se seguem (ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA) (pepstatina A 1,0 x 10-5 M (ácido isovaleril-Val-Val-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoil-Ala-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanóico), AEBSF (fluoreto de (4-(2-aminoetil)benzenosulfonilo) 5 x 10~5 M.

Adicionou-se acetato de sódio sólido para uma concentração final de 50 mM antes do pH ser ajustado a pH 5,3. 0 sobrenadante foi clarificado por passagem através de um filtro de acetato de celulose 0,22 (Corning Inc. , Corning, NY, USA). 160 ΡΕ0788546 O sobrenadante clarificado (volume total de aproximadamente 450 ml) foi aplicado numa coluna Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA) de 1x2 cm pré-equilibrada com tampão aniónico (acetato de sódio 0,05M, NaCl 0,1M, pH 5,3) num fluxo de 5 ml/minuto. A coluna e a amostra permaneceram à temperatura ambiente ao longo deste passo de purificação. A coluna foi subsequentemente lavada com 10 volumes de coluna de tampão aniónico e 10 volumes de coluna de acetato de sódio 50 mM, NaCl 0,37M, pH 5,3. O material que tinha actividade inibidora amidolitica de fVIIl dependente de EGR-Fxa/TF (ver exemplo E) foi eluido com acetato de sódio 50 mM, NaCl 1M, pH 5,3 a um fluxo de 2 ml/minuto. 2. Cromatografia em fase reversa

Uma aliquota do conjunto de fracções colhidas após cromatografia de permuta aniónica foi aplicada numa coluna C18 de 0, 46 x 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que foi então sujeita a um gradiente linear de 10-35% de acetonitrilo em 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético num fluxo de 1 ml/minuto com uma velocidade de permuta de actonitrilo de 0,4% /minuto. A actividade inibidora amidolitica de TF/FVIIa dependente de EGR-FXa (ver Exemplo E) foi controlada e as fracções contendo esta actividade inibidora foram isoladas e secas sob vácuo. 161 ΡΕ0788546 3. Caracterizaçao de AceNAP4 recombinante 0 composto AceNAP4 demonstrou mobilidade em SDS-PAGE num gel de 4-20% consistente com o tamanho previsto a partir da sequência do cDNA (gel corado com Coomassie do material após cromatografia RP).

Exemplo 15

Produção e purificação de AcaNAP2 recombinante em P. pastoris. A. Construção do vector de expressão. A expressão do gene AcaNAP2 em P. pastoris foi conseguida usando o protocolo detalhado no Exemplo 3 para a expressão de AcaNAP5 com as modificações que se seguem. O vector pDONG63 contendo o cDNA de AcaNAPc2, descrito no Exemplo 10, foi usado para isolar por amplificação ("recuperação por PCR") a região codificadora da proteína AcaNAPc2 madura (usando polimerase Vent da New England Biolabs, Beverly, MA; 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 50°C e 1,5 minutos a 72°C). Foram usadas as sequências iniciadoras oligonucletídicas seguintes: LJ190: AAAGCAACGA-TGCAGTGTGG-TGAG [SEQ. ID. NO. 122] LJ191: GCTCGCTCTA-GAAGCTTCAG-TTTCGAGTTC-CGGGATATAT-AAAGTCC [SEQ. ID. NO. 123] 162 ΡΕ0788546 A sequência iniciadora LJ191, tendo como alvo sequências C-terminais, continha uma extensão não empare-lhante que inclui locais de restrição Xbal e HindiII (sublinhado).

Após digestão com a enzima Xbal, o produto de amplificação, tendo o tamanho esperado, foi isolado a partir de gel e subsequentemente fosforilado enzimaticamente (polinucleotódio cinase de T4 da New England Biolabs, Beverly, MA) . Após inactivação pelo calor (10 minutos a 70°C) da cinase, o fragmento extremo cerse/Xbal foi direccionadamente clonado no vector pYAM7SP8 para fins de expressão. O fragmento vector recipiente derivado de pYAM7 SP8 foi preparado por restrição com Stul-Spel e purificado a partir de gel de agarose. A estirpe de E. coli WK6 [Zell, R. e fritz, H.-J., EMBO J., 6 : 1809-1815 (1987)], foi transformada com a mistura de ligação e os clones resistentes à ampicilina foram seleccionados.

Com base na análise de restrição, um clone plas-midico contendo um inserto do tamanho esperado, designado pYAM7SP-NAPC2, foi separado para posterior caracterização. A determinação da sequência do clone pYAM7SP-NAPC2 confirmou a inserção precisa da região codificadora de AcaNAPc2 madura fundida com o sinal lider prepro, conforme previsto pelo esquema de construção, assim como a ausência de mutações indesejáveis na região codificadora. 163 ΡΕ0788546 (B) Expressão de AcaNAP5 recombinante em P. pastoris. A estirpe GTS115 (his4) de Pichia foi descrita em Stroman, D.W. et al., Patente U.S. No. 4855231. Todas as manipulações de P. pastoris foram realizadas essencialmente como descrito em Stroman, D.W. et al., Patente U.S. No. 4855231.

Cerca de 1 micrograma de DNA do plasmídeo pYAM7SP-NAPC2 foi electroporado com a estirpe GTS115 usando um protocolo de electroporação convencional. 0 plasmídeo foi previamente linearizado por digestão com Sall, que teoricamente facilita o direccionamento e integração do pasmídeo no locus cromossómico his4. A selecção de uma esirpe de elevada expressão de AcaNAPc2 foi realizada essencialmente como descrito no Exemplo 3 para a isoforma 5 de NAP (AcaNAP5) usando o rastreio de miniculturas. As miniculturas foram testadas quanto à presença de AcaNAPc2 secretada usando o ensaio fVIIa/TF-EGR-fXa (Exemplo E) resultando na selecção de dois clones. Após um segundo ciclo de rastreio, usando o mesmo procedimento, mas desta vez ao nível do frasco de agitação, uma célula hospedeira isolada foi escolhida e designada P. pastoris GTS115/7SP-NAPc2.

Demonstrou-se que a célula hospedeira, GTS115/ 7 SP-NAPc2, possui um fenótipo selvagem de utilização de 164 ΡΕ0788546 metanol (Mut + ) , demonstrando que a integração da cassete de expressão no cromossoma de GTS115 não alterou a funcionalidade do gene AOXl genómico. A produção subsequente de material AcaNAPc2 recombinante foi realizada em culturas de frascos de agitação, como descrito em Stroman, D.W. et al., Patente U.S. No. 4855231. 0 produto recombinante foi purificado a partir do sobrenadante das células de Pichia pastoris como descrito abaixo. C. Purificação de AcaNAPc2 recombinante 1. Cromatografia de permuta catiónica 0 sobrenadante de cultura (100 ml) foi centri-fugado a 16 000 rpm (cerca de 30 000 xg) durante 20 minutos antes do pH ser ajustado a pH 3 com HC1 IN. A condutividade do sobrenadante foi baixada para menos de 10 mS/cm através da adição de água MilliQ. O sobrenadante diluído foi clarificado pela passagem através de um filtro de acetato de celulose de 0,22 micrómetros (Corning Inc., Corning, NY, USA) . O volume total (aproximadamente 500 ml) de sobrenadante foi aplicado numa coluna Poros20 HS (Perseptive Biosystems, MA) de 1 x 2 cm pré-equilibrada com tampão catiónico (citrato de sódio 0,05M, pH 3) num fluxo de 5 ml/minuto (400 cm/hora). A coluna e a amostra estiveram à 165 ΡΕ0788546 temperatura ambiente ao longo deste passo de purificação. A coluna foi subsequentemente lavada com 50 volumes de coluna de tampão catiónico e 10 volumes de coluna de tampão catiónico contendo NaCl 0,1 Μ. O material que tinha actividade inibidora num ensaio de protrombinase foi eluido com tampão catiónico contendo NaCl 1M num fluxo de 2 ml/minuto. 2. Cromatografia de crivagem molecular usando

Superdex3 0 0 lote eluido com NaCl 1M contendo o material inibidor de EGR-f Xa-fVI Ia/TF (3 ml; ver Exemplo C) da coluna de permuta catiónica foi aplicado numa coluna

Superdex30 PG (Pharmacia, Sweden) de 1,6 x 66 cm, pré-equilibrada com fosfato de sódio 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15 M à temperatura ambiente. A cromatografia foi realizada a um fluxo de 2 ml/minuto. A actividade inibidora de protrombinase eluiu a 56-64 ml da corrida e foi reunida. 3. Cromatografia de fase reversa 1 ml das fracções reunidas do gel de filtração foi aplicado numa coluna C18 de 0, 46 x 25 cm (218TP54

Vydac; Hesperia, CA) , que foi então sujeita a um gradiente linear de 10-35% de acetonitrilo em 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético a lml/minuto com uma taxa de permuta de 0,4% de acetonitrilo/minuto. O pico principal, que eluiu à volta de 20-25% de acetonitrilo, foi colhido manualmente e apresentou actividade inibidora de protrombinase. 166 ΡΕ0788546 4. Determinação da massa molecular A massa estimada para o principal constituinte isolado como descrito nas secções (1) a (3) deste exemplo foi determinada usando espectrometria de massa por ionisação com electrovaporização. A massa estimada de AcaNAPc2 recombinante foi de 9 640 Daltons, totalmente de acordo com a massa moecular calculada para esta molécula a partir da sequência de cDNA.

Exemplo 16

Expressão de AcaNAP42 em P. pastoris. 0 vector pGEM-9Zf(-)(Promega) contendo o cDNA de AcaNAP42 (Exemplo 12), foi usado para isolar a região codificadora de AcaNAP42 através de amplificação por PCR, (usando polimerase Taq da Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey; 25 ciclos de temperatura: 1 minuto a 94°C; 1 minuto a 50°C; 1 minuto a 72°C). As sequências oligonucleotidicas iniciadoras usadas foram: oligo 3: 5 ' GAG ACT TTT AAA TCA CTG TGG GAT CAG AAG 3' [SEQ. ID. NO. 124] oligo 2: 5' TTC AGG ACT AGT TCA TGG TGC GAA AGT AAT [SEQ. ID. NO. 125] 167 ΡΕ0788546

A sequência iniciadora oligo 3, tendo como alvo a sequência N-terminal, continha uma extensão não empare-lhante qie inclui o local de restrição Dral (sublinhado). A sequência iniciadora oligo 2, tendo como alvo a sequência C-terminal, continha o local de restrição Spel. 0 produto de amplificação de NAP, tendo o tamanho esperado de aproximadamente 250 pb, foi digerido com as enzimas Dral e Spel, purificado por extracção com fenol:clorofórmio:álcool isoamilico (25:24:1, volume/vo-lume) e precipitado com álcool etílico. O fragmento vector recipiente derivado de pYAM7SP8 (Exemplo 3) foi preparado por restrição com Stul-Spel, purificado por extracção com fenol:clorofórmio:álcool isoamilico (25:24:1, volume/volu-me) e precipitado com álcool etílico. A estirpe de E. coli, XLl-Blue [Bullock, W.O., Fernande, J.M., e Short, J.M. Biotechniques _5:376-379 (1987)], foi transformada com a mistura de ligação que continha os fragmentos de DNA atrás referidos e os clones resistentes à ampicilina foram seleccionados.

Com base na análise de restrição, um clone plasmídico contendo um inserto com o tamanho esperado, designado pYAM7SP8-NAP42, foi separado para posterior caracterização. A determinação da sequência do clone confirmou a inserção correcta da região codificadora madura fundida com o sinal líder prepro de PHOl/factor alfa, 168 ΡΕ0788546 conforme previsto pelo esquema de construção, assim como a ausência de mutações indesejáveis na região codificadora.

Cerca de 10 microgramas do plasmídeo pYAM7SP-NAP42 foram electroporados para a estirpe GTS115 (his4) de Pichia descrita no Exemplo 3. O plasmídeo foi previamente digerido pela enzima Notl, tendo como alvo a integração no locus cromossómico AOXl.

Os transformantes His+ foram seleccionados como descrito no Exemplo 3. Colónias isoladas (n=9) derivadas da electroporação foram crescidas em alvéolos de uma placa de 96 alvéolos contendo 100 microlitros de meio mínimo com glicerol, durante 24 horas, num agitador de prato, à temperatura ambiente. Um litro de meio mínimo com glicerol continha 13,4g de Base Azotada de Leveduras sem aminoácidos (DIFCO); 400 microgramas de biotina; 10 ml de glicerol; e fosfato de potássio 10 mM (pH 6,0).

As células foram sedimentadas e ressuspensas em meio mínimo fresco com metanol (a mesma composição descrita atrás, excepto os 10 ml de glicerol serem substituídos por 5 ml de metanol) para induzir o promotor AOXl. Após um período de incubação adicional de 24 horas com agitação à temperatura ambiente, 10 microlitros dos sobrenadantes de cultura foram testados pelo ensaio do tempo de protrombina (Exemplo B) . A presença de AcaNAP42 secretada foi detectada pelo prolongamento do tempo de coagulação do plasma humano. ΡΕ0788546 169

Exemplo 17

Expressão de AcaNAPc2/Prolina em P. pastoris.

Para aumentar a estabilidade e o nível de expressão de AcaNAPc2, foi construído um cDNA mutante que codifica um resíduo de prolina adicional no extremo C da proteína (AcaNAPc2/Prolina ou "AcaNAPc2P")· 0 vector de expressão, pYAM7SP8-NAPc2/Prolina, foi preparado como descrito no Exemplo 16. A sequência iniciadora oligo 8 é a sequência iniciadora N-terminal com o local de restrição Dral e a sequência iniciadora oligo 9 é a sequência iniciadora C-terminal contendo o local Xbal e o codão de aminoácidos TGG, para adicionar um resíduo de prolina ao extremo C da forma natural de AcaNAPc2. oligo 8: 5 ' GCG TTT AAA GCA ACG ATG CAG TGT GGT G 3' [SEQ. ID. NO. 126] oligo 9: 5' C GCT CTA GAA GCT TCA TGG GTT TCG AGT TCC GGG ATA TAT AAA GTC 3' [SEQ. ID. NO. 127]

Após digestão do produto de amplificação (aproxi-madamente 2 70 pb) com Dral e Xbal, o produto de amplificação foi purificado e ligado ao fragmento de vector derivado de pYAM7SP8 preparado por restrição com Stul-Spel. Um clone plasmídico contendo o inserto AcaNAPc2/Prolina foi confirmado por sequenciação de DNA e designado pYAM7SP8-NAPc2/Prolina. 170 ΡΕ0788546 O vector, pYAM7SP8-NAPc2/Prolina, foi usado para transformar a estirpe GTS115 (his) como descrito no Exemplo 16. Os transformantes foram seleccionado e crescidos de acordo com o Exemplo 16. A presença de AcaNAPc2/Prolina secretada no meio de crescimento foi detectado através do prolongamento do tempo de coagulação de plasma humano (ver Exemplo B).

Exemplo 18

Métodos alternativos de purificação de AcaNAP5, AcaNAPc2 e AcaNAPc2P (A) AcaNAP5

Um método alternativo de purificação de AcaNAP5 a partir do meio de fermentação é como se segue. As células foram removidas de uma fermentação de uma estirpe de Pichia pastoris expressando AcaNAPã e o meio foi congelado. O protocolo de purificação foi iniciado através da descongelação do meio durante a noite, a 4°C, depois diluindo-o com aproximadamente quatro partes de água Milli Q para baixar a condutividade abaixo de 8 mS. O pH foi ajustado a 3,5 e o meio foi filtrado usando um filtro de acetato de celulose de 0,22 μιη (Corning Inc., Corning, NY) . A actividade do material contendo NAP foi determinada no ensaio de coagulação do tempo de protrombina 171 ΡΕ0788546 no começo do procedimento de purificação e em cada um dos passos no procedimento usando o protocolo no Exemplo B. 0 meio filtrado foi aplicado numa coluna Pharmacia SP-Fast Flow, a um fluxo de 60 ml/minuto à temperatura ambiente, e a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de citrato/fosfato 50 mM, pH 3,5. A eluição por passos foi realizada com NaCl 100 mM, NaCl 250 mM e depois NaCl 1000 mM, tudo em citrato/f osf ato 50 mM, pH 3,5. A actividade foi detectada no eluato de NaCl 250 mM. O eluato total foi dialisado até a condutividade descer abaixo de 8 mS. 0 pH do material foi ajustado a 4,5 com ácido acético, sendo depois aplicado numa coluna de sulfoetil aspartamida à temperatura ambiente. Aproximadamente 10 volumes da coluna de acetato de amónio 50 mM, pH 4,5/40% acetonitrilo foram usados para lavar a coluna. A coluna foi eluida com acetato de amónio 50 mM, pH 4,5/40% acetonitrilo/NaCl 200 mM e o eluato foi dialisado ou diafiltrado como anteriormente. O eluato foi ajustado a 0,1% TFA, aplicado numa coluna de fase reversa para proteinas/peptideos Vydac C18 à temperatura ambiente e esta eluida usando 0,1% TFA/19% acetonitrilo seguido de 0,1% TFA/25% acetonitrilo, a um fluxo de 7 ml/min. NAP foi detectada e recuperada da eluição com 0,1% TFA/25% de acetonitrilo. 172 ΡΕ0788546

(B) AcaNAPc2 e AcaNAPc2P

AcaNAPc2 ou AcaNAPc2P podem ser purificadas como descrito atrás com as seguintes modificações do protocolo. Após descongelação e diluição do meio para se conseguir uma condutividade abaixo de 8mS, o pH do meio contendo AcaNAPc2 foi ajustado a pH 5,0 usando NaOH. O meio filtrado foi aplicado a uma coluna Pharmacia Q Fast Flow, num fluxo de 60 ml/min à temperatura ambiente e a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de ácido acético 50 mM, pH 5,0. O passo de eluição foi realizado com NaCl 100 mM, NaCl 250 mM e depois NaCl 1000 mM, tudo em ácido acético 50 mM, pH 5,0. A actividade PT foi detectada no eluato de NaCl 250 mM. O eluato total foi dialisado até a condutividade descer abaixo de 8 mS e o protocolo descrito atrás foi seguido usando sulfoetilo aspartamida e cromatografia de RP-HPLC.

Exemplo A.

Ensaio amidolítico do factor Xa. A capacidade de NAPs do presente invento para actuarem como inibidores da actividade catalítica do factor Xa foi avaliada determinando a inibição induzida por NAP da actividade amidolítica catalisada pela enzima humana, conforme descrito pelos valores Ki*. O tampão usado em todos os ensaios foi HBSA (HEPES 10 mM, pH 7,5, cloreto de sódio 150 mM, 0,1% de 173 ΡΕ0788546 albumina sérica bovina) Todos os reagentes foram da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), a menos que de outra forma seja indicado. 0 ensaio foi conduzido combinando nos alvéolos adequados de uma placa de microtitulação Corning, 50 microlitros de HBSA, 50 microlitros do composto NAP a testar diluído (0,025-25 nM) em HBSA (ou HBSA sozinho medição da velocidade não inibida) e 50 microlitros da enzima Factor Xa (preparado a partir de factor X humano purificado da Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN) de acordo com o método descrito por Bock, P.E. et ai., Archives of Bicohem. Biophys. 273:375 (1989). A enzima foi diluída em HBSA antes do ensaio no qual a concentração final foi de 0,5 nM) . Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, 50 microlitros do substrato S26765 (di-hidrocloreto de N-alfa-benziloxicarbonil-D-arginil-L-glicil-L-arginina-p-nitroanilida, adquirido a Kabi Diagnostica (ou Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH) e preparado em água desionizada seguido de diluição em HBSA antes do ensaio) foram adicionados aos alvéolos dando um volume total final de 200 microlitros e uma concentração final de 250 micromolar (cerca de 5 vezes Km). A velocidade inicial de hidrólise do substrato cromogénico foi medida pela alteração na absorvância a 405 nm usando um leitor de microplacas cinético Thermo Max® (Molecular Devices, Paio Alto, CA) ao longo de um período de 5 minutoss em que menos de 5% do substrato adicionado foi utilizado. 174 ΡΕ0788546

As razões entre as velocidades do estado estacionário pré-equilibrio inibido com NAP (Vi) e a velocidade não inibida de fXa livre sozinho (V0) foram representadas em função das concentrações correspondentes de NAP. Estes dados foram então directamente ajustados a uma equação para inibidores de ligação forte [Morrison, J.F. e Walsh, C.T., Adv. Enzymol. 6_l:201-300 (1988)], a partir dos quais foi calculada a constante inibidora de dissociação aparente em equlibrio Kj_*. A Tabela 1 abaixo dá os valores Κ±* para os compostos a testar AcaNAPõ [SEQ. ID. NO. 4], AcaNAPô [SEQ. ID. NO. 6] e AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 59], preparados como descrito nos Exemplos 3, 4 e 15, respectivamente. Os dados mostram a utilidade de AcaNAP5 e AcaNAPô como inibidores potentes in vitro de Fxa humano. Pelo contrário, AcaNAPc2 não inibe efectivamente a actividade amidolítica de Fxa indicando que não afecta a actividade catalítica de fXa livre.

Tabela 1

Composto Ki* (pM) AcaNAP5 43 + 5 AcaNAPô 996 ± 65 AcaNAPc2 3 1—1 P> aNI = sem inibição; um máximo de 15% de inibição foi observado até 1 μΜ. 175 ΡΕ0788546

Exemplo B.

Ensaios de Tempo de Protrombina (PT) e Tempo de de Tromboplastina Parcial Activada (aPTT).

Os efeitos ant icoagulantes ex vivo de NAPs do presente invento em plasma humano foram avaliados através da medição do prolongamento do tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) e do tempo de protrombina (PT) para uma larga gama de concentrações de cada inibidor.

Um conjunto de amostras congeladas de plasma humano citratado normal foi adquirido a George King Biomedical, Overland Park, KS. As medições respectivas de aPTT e PT foram feitas usando o coagulómetro automático Coag-A-Mate RA4 (General Diagnostics, Organon Technica, Oklahoma City, OK) usando o reagente Automated aPTT Platelin® L (Organon Technica, Durham, NC) e Simplastin® Excel (Organon Technica, Durham, NC) respectivamente, como inibidores de coagulação de acordo com as instruções do fabricante.

Os ensaios foram realizados preparando-se uma série de diluições de cada NAP testado em plasma rapidamente descongelado, seguido da adição de 200 micro-litros ou 100 microlitros dos reagentes atrás referidos aos alvéolos do carrocei de ensaio para as medições de aPTT ou 176 ΡΕ0788546 PT, respectivamente. Como alternativa, as NAPs foram seriadamente diluídas em HBSA e 10 μΐ de cada uma das diluições foram adicionados a 100 μΐ de plasma humano normal nos alvéolos do carrocei do ensaio Coag-A-Mate, seguido da adição de reagente.

As concentrações de NAP foram representadas em função do tempo de coagulação e calculada uma concentração de duplicação do tempo, i.e., uma concentração específica de NAP que duplica o tempo de coagulação testemunha de PT ou de aPTT. Os tempos de coagulação testemunha (ausência de NAP) em PT e APTT foram de 12,1 segundos e 28,5 segundos, respectivamente. A Tabela 2 abaixo mostra os efeitos anticoagulantes ex vivo de AcaNAP5 [SEQ. ID. 4], AcaNAPô [SEQ. ID. NO. 69, AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 59] e AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 62] e Pro-AcaNAP5 [SEQ. ID. NO. 7] representados pela concentração de cada uma delas que duplica (concentração de duplicação) o tempo de coagulação do controlo do plasma humano normal, nos respectivos ensaios de coagulação PT e APTT, relativamente a um ensaio controlo em que não está presente tal NAP. Os dados mostram a utilidade destes compostos como anticoagulantes potentes da coagulação de plasma humana. Os dados também demonstram a equivalência de NAP nativa e de NAP recombinante. ΡΕ0788546 177

Tabela 2

Composto Concentração de duplicação (nM) no PT Concentração de duplicação (nM) no aPTT AcaNAP5a 43 + 8 87 + 4 AcaNAP6a 37 + 3 62 + 0 AcaNAPc2a 15 + 1 105 ± 11 AcaNAP4a 40 + 4 115 ± 12 AcaNAP5b 26, 9 76,2 AcaNAP5c 39,2 60,0 Pro-AcaNAP5d 21, 9 31, 0 a Preparada em Pichia pastoris b Proteína nativa c Preparada em Pichia pastoris (lote recombinante diferente de (a)). d Preparada em células COS.

As Figuras 10A e 10B também mostram o prolongamento induzido por NAP de PT (Figura 10A) e aPTT (Figura 10B) numa forma dependente de dose.

Exemplo C

Ensaio de inibição de protrombinase A capacidade de NAP do presente invento para actuar como um inibidor da activação de protrombina pelo Factor Xa, que tinha sido inserido num complexo de 178 ΡΕ0788546 protrombinase fisiológico, foi avaliada através da determinação da constante de inibição respectiva, Ki*. A actividade de protrombinase foi medida usando um ensaio amidolitico acoplado, pelo qual um complexo pré-formado de Fxa humano, Factor Va humano (Fva) e vesículas fosfolipídicas primeiro activa protrombina humana em trombina. A actividade amidolítica da trombina gerada foi medida simultaneamente usando um substrato cromogénico. Fva humana purificado foi obtido à Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT) . Protromina humana purificada foi adquirida a Celsus Laboratories, Inc. (Cincinati, OH). 0 substrato cromogénico Pefachrome t-PA (CH3S02-D-hexa-hidro-tirosina-glcil-L-arginina-p-nitroanilida) da Pentapharm Ltd (Basel, Switzerland) foi adquirido a Centerchem, Inc. (Tarrytown, NY) . 0 substrato foi reconstituído em água desionizada antes de ser usado. As vesículas fosfolipídicas foram preparadas, consistindo em fosfatidilcolina (67% p/v), fosfatidilglicerol (16%, p/v), fosfatidiletanolamina (10%, p/v) e f osf atidilserina (7%, p/v) na presença de detergente, como descrito por Ruf et al. [Ruf, W., Miles, D.J., Rehemtulla, A, e Edgington, T.S. Methods in Enzymology 222:209-224 (1993)]. Os fosfolípidos foram adquiridos à Avanti Polar Lipids, (Alabaster, Alabama). O complexo de protrombinase foi formado num tubo de ensaio de polipropileno combinando Fva, Fxa e vesículas fosfolipídicas (PVL) em HBSA contendo CaCl2 3 mM, durante 10 minutos. Em alvéolos adequados de uma placa de 179 ΡΕ0788546 microtitulaçao, 50 μΐ do complexo foram combinados com 50 μΐ de NAP diluído em HBSA ou HBSA sozinho (para medição de Vo (velocidade não inibida)). Após uma incubação de 30 min à temperatura ambiente, as reacções em triplicado foram iniciadas pela adição de uma solução de substrato, contendo protrombina humana e o substrato cromogénico para trombina, Pefachrome tPA. A concentração final de reagentes num volume total de 150 μΐ de HBSA foi de: NAP (0,25-25 nM) , Fxa (250 fM) , PVL (5 μΜ) , protrombina (250 nM) , Pefachrome tPA (250 μΜ, 5x Km) e CaCl2 (3 mM) . A actividade de protrombinase de fXa foi medida como um aumento na absorvância a 405 nm durante 10 minutos (velocidade); exactamente como descrito no Exemplo A, em codições de equilíbrio. O aumento da absorvância foi sigmoidal ao longo do tempo, reflectindo as reacções acopladas da activação de protrombina pelo complexo de protrombinase contendo Fxa e a subsequente hidrólise de Pefachrome tPA pela trombina gerada. Os dados de cada alvéolo de um triplicado foram combinados e ajustados através de análise reiterativa de regressão linear de mínimos quadrados, como função de absorvância versus tempo2, como descrito [Carson, S.D. Comput. Prog. Biomed. 1_9:151-157 (1985)] para determinar a velocidade inicial (Vi) de activação de protrombina. As razões entre velocidades iniciais em equilíbrio inibidas contendo NAP (Vi) e a velocidade não inibida de protrombinase fXa sozinha (V0) foram representadas em função das concentrações correspondentes de NAP. Estes dados foram directamente ajustados à equação dos inibidores de ligação 180 ΡΕ0788546 forte, como no Exemplo A atrás e a constante aparente inibidora da dissociação em emquilibrio Ki* foi calculada. A tabela 3 abaixo mostra a constante do inibidor de dissocição (Ki*) de AcaNAP5 recombinante [SEQ. ID. NO. 4], AcaNAPô [SEQ. ID. NO. 6] e AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 59] (todas preparadas em Pichia pastoris como descrito) contra a activação de protrombina por fXa humano incorporado num complexo de protrombinase. Estes dados mostram a utilidade destes compostos como inibidores de fXa humano incorporado no complexo protrombinase.

Tabela 3

Composto Ki* (PM) AcaNAP5 144 ± 15 AcaNAPô 207 ± 40 AcaNAPc2 2385 ± 283

Os dados apresentados nos Exemplos A, B e C sugerem que AcaNAP5 e AcaNAP6 podem interagir com fXa de forma semelhante, a qual envolve a restrição directa do acesso do substrato peptidilo e macromolecular (protrombina) ao centro catalítico da enzima. Pelo contrário, AcaNAPc2 parece estar a interagir com fXa numa forma que apenas perturba as interacções macromoleculares desta enzima com o substrato e/ou cofactor (Factor Va) , mas não inibindo directamente a renovação catalítica do substrato peptidilo (ver Tabela 1). ΡΕ0788546 181

Exemplo D

Ensaios de enzimas in vitro para determinação da especificidade da actividade A capacidade de NAP do presente invento para actuar como inibidor selectivo da actividade catalítica de fXa ou da actividade TF/VIIa foi avaliada determinando se a NAP a testar inibe outras enzimas num ensaio numa concentração que era 100 vezes superior à concentração das serina-proteases relacionadas que se seguem: trombina,

Factor Xa, Factor Xia, Factor Xlla, calicreína, proteína C activada, plasmina, activador do plasminogénio tecidular recombinante (rt-PA), urocinase, quimotripsina e tripsina. Estes ensaios também foram usados para determinar a especificidade de NAPs tendo actividade inibidora de serina-protease. (1) Protocolo geral para os ensaios de inibição enzimática

O tampão usado em todos os ensaios foi HBSA (Exemplo A) . Todos os substratos foram reconstituídos em água desionizada, seguido de diluição em HBSS antes do ensaio. O ensaio amidolítico para determinação da especificidade da inibição de serina-proteases foi conduzido combinando nos alvéolos adequados de uma placa de microtitulação Corning, 50 μΐ de HBSA, 50 μΐ de NAP numa 182 ΡΕ0788546 concentração específica diluída em HBSA ou HBSA sozinho (velocidade do controlo não inibido, V0 ), e 50 μΐ de uma enzima específica (ver enzimas específicas abaixo). Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, 50 μΐ de substrato foram adicionados a alvéolos em triplicado. A concentração final de reagentes num volume total de 200 μΐ de HBSA foi: NAP (75 nM) , enzima (750 pM) e substrato cromogénico (como indicado abaixo). A velocidade inicial de hidrólise do substrato cromogénico foi medida como uma alteração na absorvância a 405 nm ao longo de um período de 5 minutos em que menos de 5% do substrato adicionado foi hidrolisado. As velocidades das amostras a testar, contendo NAP (Vi) foram expressas como uma percentagem da velocidade do controlo não inibido (VQ) pela seguinte fórmula: Vi/V0 x 100, para cada um das enzimas. (2) Ensaios de enzimas específicas (a) Ensaio de trombina

A actividade catalítica de trombina foi determinada usando o substrato cromogénico Pefachrome t-PA (CH3S02-D-hexa-hidrotirosina-glicil-L-arginina-p-nitroani-lida) da Pentapharm Ltd (Basel, Switzerland). A concentração final de Pefachrome t-PA foi 250 μΜ (cerca de 5 vezes Km) . A alfa-trombina humana purificada foi adquirida à Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN). 183 ΡΕ0788546 (b) Ensaio do Factor Xa A actividade catalítica do Factor Xa foi determinada usando o substrato cromogénico S-2765 (N-alfa-benziloxicarbonil-D-arginina-L-glicina-L-arginina-p-nitro-anilida), adquirida à Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH) . Todos os substratos foram reconstituídos em água desionizada antes da utilização. A concentração final de S-2765 foi de 250 μΜ (cerca de 5 vezes Km). O Factor X humano purificado foi adquirido à Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN) e o Factor Xa (Fxa) foi activado e preparado a partir do factor X como descrito (Bock, P.E., Craig, P.A., Olson, S.T., and Singh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273:375-388 (1989]. (c) Ensaio do factor Xla A actividade catalítica do factor FXIa foi determinada usando o substrato cromogénico S-2366 (L-piro-glutamil-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina, adquirido à Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH) . A concentração final de S-2366 foi 750 μΜ. FXIa humano purificado foi adquirido à Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN). (d) Ensaio do Factor Xlla A actividade catalítica do factor Xlla foi determinada usando o substrato cromogénico Spectrozyme FXIIa (H-D-CTH-L-glicil-L-arginina-p-nitroanilina) , adquirido à 184 ΡΕ0788546

American Diagnostica, Greenwich, CT). A concentração final de Spectrozyme FXIIa foi de 100 μΜ. FXIIa humano purificado foi adquirido à Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN). (e) Ensaio de calicreína A actividade catalítica de calicreína foi determinada usando o substrato cromogénico S-2302 (H-D-prolil-L-fenilalanil-L-arginina-p-nitroanilina, adquirido à Kabi

Pharmacia Hepar, Franklin, OH). A concentração final de S-2302 foi de 400 μΜ. Calicreína humana purificada foi adquirida à Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN) . (f) Proteína C activada (aPC) A actividade catalítica da proteína C activada foi determinada usando o substrato cromgénico Spectrozyme Pca (H-D-lisil(-Cbo)-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina) adquirido à American Diagnostica Inc. (Greenwich, CT) . A concentração final foi de 400 μΜ (cerca de 4 vezes Km). aPC humana purificada foi adquirida a Hematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT). (g) Ensaio de plasmina A actividade catalítica da plasmina foi determinada usando o substrato cromogénico S-2366 (L-piro- 185 ΡΕ0788546 glutamil-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina, adquirido à Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH) . A concentração final de S-2366 foi de 300 μΜ (cerca de 4 vezes Km) . A plasmina humana purificada foi adquirida à Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN). (h) Activador do plasminogénio tecidular recom-binante (rt-PA) A actividade catalítica de rt-PA foi determinada usando o substrato cromogénico Pefachrome t-PA (CH3SO2-D-hexa-hidrotirosina-glicil-L-arginina-p-nitroanilida) da

Pentapharm Ltd (Basel, Switzerland). A concentração final foi de 500 μΜ (cerca de 3 vezes Km). rt-PA humano (Activase®) foi adquirido à Genentech,, Inc. (So. San Francisco, CA). (i) Urocinase A actividade catalítica da urocinase foi determinada usando o substrato S-2444 (L-piroglutamil-L-glicil-L-arginina-p-nitroanilina, adquirido à Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH) . A concentração final de S-2444 foi de 150 μΜ (cerca de 7 vezes Km) . Urocinase humana (Abbokinase®) , purificada a partir de células de rim humano em cultura, foi adquirida à Abbott Laboratories (North Chicago, IL). 186 ΡΕ0788546 (j) Quimotripsina A actividade catalítica de quimotripsina foi determinada usando o substrato cromogénico, S-2586 (Metoxi-succinil-L-arginil-L-prolil-L-tirosina.p-nitroanilina, que foi adquirido à Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH) . A concentração final de S-2586 foi de 100 μΜ (cerca de 8 vezes Km). Quimotripsina pancreática bovina purificada (3x-cristalizada; CDI) foi adquirida a Worthington Biochemical Corp. (Freehold, NJ). (k) Tripsina A actividade catalítica de tripsina foi determinada usando o substrato cromogénico S-2222 (N-benzoil-L-isoleucil-L-glutamil [éster metílico]-L-arginina-p-nitro-anilina, que foi adquirida à Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH). A concentração final de S-2222 foi de 300 μΜ (cerca de 5 vezes Km). A tripsina pancreática humana purificada foi adquirida a Scripps Laboratories (San Diego, CA) . A Tabela 4 apresenta a inibição da actividade amidolítica de Fxa e de 10 serina-proteases adicionais por AcaNAP-5 recombinante [SEQ. ID. NO. 4] ou AcaNAP-6 recom-binante [SEQ. ID. NO. 6] (ambos expressos em Pichia pastoris, como descrito), expresso como percentagem da velocidade do controlo. Estes NAPs demonstram um elevado grau de especificidade relativamente à inibição de Fxa, 187 ΡΕ0788546 comparativamente com as outras serina-proteases relacionadas .

Tabela 4

Enzima % velocidade do % velocidade do controlo controlo + AcaNAP5 + AcaNAPô Fxa 1 ± 1 14 + 1 Fila 104 ± 5 98+3 Fxa 34 ± 12 98+3 FXIIa 103 ± 6 100 ± 4 Calicreina 102 ± 4 101 ± 3 aPC 95 + 2 98 + 1 Plasmina 111 ± 6 113 ± 12 r-tPA 96 + 9 96 + 7 Urocinase 101 ± 14 96 + 2 Quimotripsina 105 ± 0 100 ± 11 Tripsina 98 + 6 93 + 4 A Tabela apresenta o efeito inibidor de uma AcaNAPc2 recombinante [SEQ. ID. NO. 59] e AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 62] (ambos expresso em Pichia pastoris, como descrito) sobre a actividade amidolítica de 11 serina-proteases seleccionadas. A inibição é expressa como percentagem da velocidade do controlo. Estes dados demonstram que estas NAPs possuem um elevado grau de especificidade para as serina-proteases na Tabela 5. ΡΕ0788546

Tabela 5

Enzima % velocidade do % velocidade do controlo controlo + AcaNAPc2 + AceNAP4 Fxa 84 + 5 76 + 3 Fila 99 + 5 93 + 3 Fxa 103 ± 4 96 + 1 FXIIa 97 + 1 102 ± 2 Calicreína 101 ± 1 32 + 1 aPC 97 + 3 103 ± 1 Plasmina 107 ± 9 100 ± 1 r-tPA 96 + 2 108 ± 3 Urocinase 97 + 1 103 ± 4 Quimotripsina 99 + 0 9 6 + 4 Tripsina 93 + 4 98 + 4

Exemplo E

Ensaios para medição da inibição do complexo fVIIa/TF por NAP

(1) Ensaio de activaçao de fVIIa/TF fIX

Este exemplo mede a capacidade de NAPs do presente invento para actuarem como um inibidor do complexo catalítico de fVIIa/TF, que tem um papel importante na ΡΕ0788546 iniciação da resposta de coagulação no ensaio do tempo de protrombina ex vivo (Exemplo B) . A activação do factor IX triciado pelo complexo rFVIIa/rTF/PVL foi avaliada pela determinação da respectiva constante de inibição intrínseca, Ki*. 0 factor Vila humano recombinante, purificado e liofilizado foi adquirido a BiosPacific, Inc. (Emeryville, CA) e reconstituído em HBS (HEPES 10 mM, pH 7,5, cloreto de sódio 150 mM) antes de ser usado. O factor X humano purificado foi adquirido a Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN) e Factor Xa (Fxa livre) foi activado e preparado a partir do Factor X como descrito (Bock, P.E., Craig, P.A., Olson, S.T. e Singh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273:375-388 (1989)). Factor Xa humano com o centro activo bloqueado (EGR-Fxa), que tinha sido irreversivelmente inactivado com L-glutamil-L-glicil-L-arginil clorometilcetona, foi adquirido a Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT) . O factor tecidular humano recombinante (rTF) foi produzido por um sistema de expressão de baculovírus e purificado até à homogeneidade por cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais (Corvas International, Inc., San Diego, CA). A apoproteína rTF purificada foi incorporada em vesículas de fosfolípidos (rTF/PVL), consistindo em fosfatidilcolina (75%, p/v) e fosfatidilserina (25%, p/v) na presença de detergente, como descrito por Ruf et al., (Ruf, W., Miles, D.J., Rehemtulla, A. and Edgington, T.S. 190 ΡΕ0788546

Methods in Enzymology 222:209-224 (1993)). Os fosfolípidos foram adquiridos a Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama). O tampão usado para todos os ensaios foi HBSA, HBS contendo 0,1% (p/v) de albumina sérica bovina. Todos os reagentes foram adquiridos à Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), a menos que de outra forma seja indicado. A activação de 3H-Factor IX (FIX) pelo complexo rFVIIa/rTF foi controlada medindo a libertação de peptideo de activação marcado radioactivamente. FIX humano purificado foi adquirido à Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT) e marcado radioactivamente por triciação redutora como descrito (Van Lenten & Ashwell, 1971, JBC 246, 1889-1894). A preparação triciada resultante de FIX tinha uma actividade específica de 194 unidades de coagulação/mg conforme medido em plasma deficiente em FIX por imuno-depleção (Ortho) e manteve 97% da sua actividade. A actividade específica radioactiva foi de 2,7 x 108 dpm/mg. O Km para a activação de 3H-FIX por rFVIIa/rTF/PVL foi 25 nM, que foi equivalente ao Km obtido para FIX não tratado (não marcado). O ensaio para a determinação de Ki* foi conduzido como se segue: rFVIIa e RTF/PVL foram combinados num tubo de ensaio de polipropileno e deixado a formar um complexo durante 10 min em HBSA, contendo CaCl2 5 mM. Alíquotas do complexo rFVIIa/rTF/PVL foram combinadas, nos tubos de microcentrífuga em polipropileno adequados, com EGR-Fxa ou Fxa livre, quando incluídos e o composto a testar NAP em várias concentrações, após diluição em HBSA ou HBSA sozinho 191 ΡΕ0788546 (como velocidade do controlo V0 (velocidade não inibida)) Após uma incubação de 60 minutos à temperatura ambiente, as reacções foram iniciadas pela adição de 3H-FIX. A concentração final dos reagentes em 420 μΐ de HBSA foi: rFVIIa [50 pM], rTF [2,7 nM], PLV [6,4 micromolar], EGR-Fxa ou Fxa livre [300 pM] , NAP recombinante [5-1500 pM] , 3H-FIX [200 nM] e CaCl2 [5 mM]. Ainda, uma reacção de controlo do fundo foi corrida, a qual incluia todos os reagentes referidos excepto rFVIIa.

Em pontos do tempo específicos (8, 16, 24, 32 e 40 min) , 80 μΐ da mistura de reacção foi adicionado a um tubo eppendorf que continha um volume igual de EDTA 50 mM em HBS com 0,5% de BSA para parar a reacção; esta foi seguida através da adição de 160 μΐ de 6% (p/v) de ácido tricloroacético. A proteína foi precipitada e separada do sobrenadante por centrifugação a 16 000 xg durante 6 minutos a 4°C. A radioactividade contida no sobrenadante resultante foi medida removendo alíquotas em triplicado que foram adicionadas a Scitiverse BD (Fisher Scientific, Fairlawn, NJ) e quantificada por contagem de cintilação líquida. A velocidade de activação do controlo foi determinada por análise de regressão linear das contagens solúveis libertadas ao longo do tempo em condições de estado estacionário, pelo que menos de 5% do FIX triciado foi consumido. O controlo do fundo (<1,0% da velocidade do controlo) foi subtraído a todas as amostras. As razões das velocidades do estado estacionário inibido (Vi), na presença de uma NAP, relativamente à velocidade do controlo não inibido de rFVIIa/TF sozinho (V0) foram representados 192 ΡΕ0788546 em função das concentrações correspondentes de NAP. Estes dados foram então directamente ajustados a uma equação para os inibidores de ligação forte [Morrison, J.F., e Walsh, C.T., Adv. Enzymol. 6_l:201-300 (1988)], a partir da qual foi calculada uma constante inibidora aparente da dissociação em equilíbrio Kj,*.

Os dados para AcaNAPõ, AcaNAPô, AcaNAPc2 e AceNAP4 recombinantes (preparados como descrito) estão apresentados na Tabela 6 Secção B, abaixo. (2) Ensaio amidolítico de Factor VIIa/Factor tecidular A capacidade de NAPs do presente invento para actuar como um inibidor da actividade amidolítica do complexo fVIIa/TF foi avaliada determinando a respectiva constante de inibição, K±*, na presença e ausência do Factor Xa humano com o centro activo bloqueado (EGR-fXa). A actividade amidolítica de rFVIIa/rTF foi determinada usando o substrato cromogénico S-2288 (H-D- isoleucil-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina) , adquirida a Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH). 0 substrato foi reconstituído em água desionizada antes de ser usado. RFVIIa e rTF/PVL foram combinados num tubo de ensaio de polipropileno e deixado a formar um complexo durante 10 min em HBSA, contendo CaCl2 3 mM. O ensaio para determinações de Ki* foi conduzido combinando em alvéolos adequados de uma placa de microtitulação Corning 50 μΐ do complexo 193 ΡΕ0788546 rFVIIa/rTF/PVL, 50 μΐ de EGR-Fxa e 50 μΐ do composto NAP a testar em várias concentrações, após diluição em HBSA ou HBSA sozinho (para medição de VQ (velocidade não inibida) ).Após uma incubação de 30 min à temperatura ambiente, as reacções em triplicado foram iniciadas pela adição de 50 μΐ de S-2288. A concentração final dos reagentes num volume total de 200 μΐ de HBSA foi: NAP recombinante (0, 025-25 nM), rFVIIa ( 750 pM) , rTF (3,0 nM), PLV (6,4 micromolar), EGR-Fxa (2,5 nM) e S-2288 (3,0 mM, 3X Km). A actividade amidolitica de rFVIIa/rTF/PLV foi medida como um aumento linear na absorvância a 405 nm durante 10 min (velocidade), usando um leitor de micro-placas cinético Thermo Max® (Molecular Devices, Paio Alto, CA), em condições de estado estacionário, enquanto menos de 5% do substrato foi consumido. As razões entre velocidades de estado estacionário em pré-equilíbrio (Vi) inibidas, na presença de NAP, e a velocidade não inibida na presença de fXa livre sozinha (VQ) foram representadas em função das concentrações correspondentes de NAP. Estes dados foram então directamente ajustados à mesma equação para inibidores fortes, usada no Exemplo E.I., a partir da qual foi calculada a constante aparente inibidora da dissociação em equilíbrio Ki*. A Tabela 6 abaixo dá os valores Ki* para AcaNAPc2 [SEQ. ID. NO. 59], AceNAP4 [SEQ. ID. NO. 62], AcaNAP5 [SEQ. ID. NO. 4] e AcaNAPô [SEQ. ID. NO. 6] (preparado em Pichia pastoris, como descrito) em ensaios inibidores de actividade de rFVIIa/rTF. Os dados mostram a utilidade de 194 ΡΕ0788546

AcaNAPc2 e AceNAP4 como inibidores fortes do complexo rFVIIa/rTF/PLV humano na ausência e presença de Fxa livre ou Fxa bloqueado no centro activo. A actividade in vitro de AcaNAPc2P (ver Exemplo 17) foi substancialmente o mesmo de AcaNAPc2.

Tabela 6

Ki* (pM) Ensaio amidolitico Activaçao de 3H-FIX Composto Sem adiçao Mais Sem adiçao +Fxa + EGR-Fxa NAP de Fxa EGR-Fxa de Fxa livre AcaNAPc2 NI 36 ± 20 NI 35 + 5 8,4 ± 1,5 AceNAP4 59230 ± 3600 378 ± 37 ND ND ND AcaNAP5 NI NI NI NI NI AcaNAPô NI NI NI NI NI NI = sem inibição ND = não determinado

Exemplo F

Modelos in vivo da actividade NAP (1) Avaliação da actividade antitrombótica de NAP no modelo de rato de trombose arterial dependente de plaquetas induzida por FeCl3

As propriedades antitrombóticas (prevenção da formação de trombos) de NAP foram avaliadas usando o modelo 195 ΡΕ0788546 experimental de rato estabelecido para trombose vascular aguda. 0 modelo FeC13 de rato é um modelo bem caracterizado de trombose arterial dependente de plaquetas que tem sido usado para avaliar os potenciais compostos antitrombóticos. Kurz, K.D., Main, B.W., e Sandusky, G.E., Thromb. Res., 6_0:269-280 (1990). Neste modelo um trombo oclusivo rico em plaquetas é formado num segmento da artéria carótida de rato tratada localmente com uma solução fresca de FeCl3 absorvido a um pedaço de papel de filtro. Pensa-se que FeCl3 se difunda no segmento tratado de artéria e cause desendotelialização da superfície do vaso afectado. Isto resulta na exposição de sangue a estruturas subendoteliais, que por sua vez causa aderência de plaquetas, formação de trombina e agregação de plaquetas. O resultado global é a formação de trombo oclusivo. O efeito de um composto a testar na incidência da formação de trombo oclusivo após aplicação de FeCl3 é controlado por fluxometria ultra-sónica e foi usado como ponto terminal primário. A utilização de fluxometria para medir o fluxo sanguíneo da artéria carótida é uma modificação do procedimento original em que a detecção térmica da formação de coágulo foi empregue. Kurz, K.D., Main, B.W. andSandy«usky, G.E., Thromb. Res.r 6_0 :269-280 (1990).

Administração intravenosa

Ratos macho Harlan Sprague Dawley (420-450 g) foram aclimatados pelo menos 72 horas antes de serem usados 196 ΡΕ0788546 e alimentados durante 12 horas antes da cirurgia, com acesso livre a água. Os animais foram preparados, anestesiados com Nembutal, seguido de inserção de catéteres para monitorização da pressão sanguínea, administração de fármaco e anestesia. A artéria carótida esquerda foi isolada fazendo uma incisão na linha média cervical, seguido de técnicas de dissecação e dispersão para separar um segmento de 2 cm do vaso relativamente à bainha da carótida. Uma sutura de seda foi inserida sob os extremos proximais e distais do vaso isolado para proporcionar desobstrução para a colocação de uma sonda de fluxo ultrassónica (Transonic) à volta do extremo proximal do vaso. A sonda foi então segura com um braço estacionário.

Após cirurgia, os animais foram distribuídos ao acaso por um grupo controlo (soro fisiológico) ou tratamento (AcaNAP5 recombinante). 0 composto a testar (preparado em P. pastoris de acordo com o Exemplo 3) foi administrado como um único bolus intravenoso nas doses descritas na Tabela 7 após colocação da sonda de fluxo e 5 min antes do estímulo trombogénico. Em t = 0, um pedaço de 3 mm de diâmetro de papel de filtro (Whatman #3) embebido em 10 μΐ de uma solução a 35% de FeCl3 fresco (preparado em água) foi aplicado ao segmento de artétia carótida isolada distai relativamente à sonda do fluxo. A pressão sanguínea, fluxo sanguíneo, batimento cardíaco e respiração foram controlados durante 60 minutos. A incidência de oclusão (definida como o atingir do zero de fluxo sanguíneo) foi registado como ponto terminal primário. 197 ΡΕ0788546 A eficácia de AcaNAP5 [SEQ. ID. NO.4] como agente antitrombótico na prevenção da formação de trombos neste modelo in vivo foi demonstrado pela redução dependente de dose na incidência de oclusão trombótica, como se mostra na Tabela 7 abaixo.

Tabela 7

Grupo de Dose (mg/Kg) N Incidência de tratamento oclusão Soro 8 8/8 fisiológico AcaNAP5 0, 001 8 7/8 AcaNAP5 0,003 8 5/8 AcaNAP5 0,01 8 3/8* AcaNAP5 0,03 8 1/8* AcaNAP5 1-1 o 8 0/8* AcaNAP5 0,3 4 0/4* AcaNAP5 1,0 2 0/2* *-p<0,05 do controlo de soro fisiológico pelo teste de

Fisher A dose eficaz que previne 50% de oclusões trom-boticas neste modelo (ED50) pode ser determinada a partir dos dados atrás referidos representando a incidência de oclusão em função da dose administrada. Isto permite uma comparação directa da eficácia antitrombótica de AcaNAP5 198 ΡΕ0788546 com outros agentes antitrombóticos que também foram avaliados neste modelo, como descrito abaixo. A Tabela 8 abaixo apresenta apresenta os valores de ED50 para vários agentes anticoagulantes bem conhecidos neste modelo comparativamente com AcaNAP5.

Tabela 8

Composto EDSOa Heparina padrão 300 U/Kg Argatroban 3,8 mg/Kg Hirulog™ 3,0 mg/Kg rTAPb 0,6 mg/Kg AcaNAP5 0,0055 mg/Kg aED50 é definida como a dose que previne a incidência de oclusão trombótica completa em 50% dos animais testados b-Peptídeo anticoagulante de carraças recombinante, Vlasuk et ai. Thromb. Haemostas. 7_0:212-216 (1993). (b) Administração subcutânea O efeito antitrombótico de AcaNAP5 comparado com a heparina de baixo peso molecular (Enoxaparin; Lovenox, Rhone-Poulenc Rorer) após administração subcutânea foi avaliado em ratos usando o modelo de FeCl3. O modelo foi realizado de forma idêntica ao descrito atrás, com excepção do composto ser administrado subcutaneamente e a eficácia ser determinada em dois tempos diferentes: 30 e 150 minutos após administração. Para se conseguir isto, foram empregues 199 ΡΕ0788546 ambas as artérias carótidas de forma sequenciada. Os resultados destas experiências indicam que AcaNAP5 [SEQ. ID. NO. 4] é um aqente antitrombótico in vivo após administração subcutânea. Os resultados estão apresentados abaixo na Tabela 9.

Tabela 9

Composto 30 ' ' EDsoa (mg/Kg) 150 ' ' ED50a (mg/Kg) Heparina de baixo peso molecular 30,0 15, 0 AcaNAP5 0,07 0, 015 aED50 é definido como a dose que previne a incidência de oclusão trombótica completa em 50% dos animais testados. (2) Medição da hemorragia de ferida profunda

Um modelo de hemorragia de ferida profunda foi usado para medir o efeito de NAP na hemorragia e comparar o efeito com o de Heparina de Baixo Peso Molecular.

Ratos macho foram anestesiados e e manipulados de forma idêntica ao modelo de FeCl3. No entanto, FeCl3 não foi aplicado na artéria carótida. A ferida cirúrgica profunda no pescoço, que expõe a artéria carótida, foi empregue para quantificar a perda óssea ao longo do tempo. A perda de sangue foi medida ao longo de um período de 3,5 horas após administração subcutânea de AcaNAP5 ou MWH. A 200 ΡΕ0788546 ferida foi preenchida com esponjas cirúrgicas que foram removidas de 30 em 30 minutos. As esponjas foram subsequentemente imersas em reagente de Drabkin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) que lisa os eritrócitos e reage com hemoglobina de forma colorimétrica. As amostras colori-métricas foram então quantificadas medindo a absorvância a 550 nm, o que proporciona uma determinação da quantidade de sangue na esponja.

As caracteristicas da dose-resposta para ambos os compostos a testar estão apresentadas na Figura 15 juntamente com os dados de eficácia para ambos os compostos. AcaNAP5 [SEQ. ID. NO. 4] foi muito mais potente do que a heparina de baixo peso molecular na prevenção da formação de trombos arteriais oclusivos neste modelo. Ainda, os animais tratados com NAP sangram menos do que os tratados com heparina de baixo peso molecular.

Os dados apresentados nas Tabelas 7 e 9 e na Figura 15 demonstram claramente a eficácia de NAP na prevenção da formação de trombos oclusivos neste modelo experimental. A relevância destes dados na prevenção de trombose humana é clara quando comparada com os outros agentes anticoagulantes, apresentados na Tabela 8. Estes agentes foram avaliados nos mesmos modelos experimentais, de forma idêntica ao descrito para NAPs neste modelo experimental e possuem eficácia antitrombótica na prevenção da formação de trombos clinicamente, como descrito nas 201 ΡΕ0788546 seguintes citações da literatura: Heparina - Hirsch, J. N. Engl. J. Med 324:1565-1574 1992, Cairns, J.A. et ai., Chest 102:456S-481S (1992); Argatroban-Gold, H.K. et al. J. Am.

Coll. Cardiol. ZL:1039-1047 (1993); e Hirulog™-Sharma, G.V.R.K. et al. Am. J. Cardiol. 72:1357-1360 (1993) e

Lidón, R.M. et al. Circulation 88_: 1495-1501 (1993).

Exemplo G

Modelo de trombose aguda das artérias coronárias em porco estudos é uma que foi descrito (1994), Brit. J. O protocolo usado nestes modificação de um modelo de trombose anteriormente (Lucchesi, B.R., et ai., Pharmacol. 113:1333-1343).

Os animais foram anestesiados e manipulados com catéteres arteriais e venosos (carótida comum esquerda e jugular externa, respectivamente). A toractomia foi feita no 4o espaço intercostal e o coração foi exposto. A artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) foi isolada do tecido conjuntivo sobrejacente e foi dotada de uma sonda de fluxo Doppler e de uma estenose de ligadura de 17 gauge. Um eléctrodo anódico foi também implantado dentro do vaso.

As medições da linha de base foram feitas a NAP ou placebo a ser testado foi administrado através da veia 202 ΡΕ0788546 jugular externa. Cinco minutos após administração, uma corrente directa (300 μΑ, DC) foi aplicada ao eléctrodo estimulador para iniciar a lesão intima do endotélio coronário e começar a formação do trombo. A corrente continuou durante um período de 3 horas. Os animais foram observados até 1 hora após a cessação da corrente ou morte do animal, o que quer que tenha ocorrido primeiro. A Tabela 10 apresenta dados que demonstram a incidência de oclusão em animais a quem foi administrado AcaNAP5 ou AcaNAPc2P (ver Exemplo 17) em três doses crescentes de NAP. A incidência de oclusão nos animais que receberam placebo foi de 8/8 (100%) . O tempo de oclusão nos animais tratados com placebo foi de 66,6 ± 7,5 minutos (média ± média do desvio padrão). Aos vasos dos porcos tratados com AcaNAP que falharam a oclusão durante o período de observação de 4 horas foi-lhes atribuído um tempo arbitrário de oclusão de 240 minutos de forma a facilitar as comparações estatísticas.

Os dados demonstram que AcaNAP5 e AcaNAPc2P foram eficazes de forma semelhante neste ensaio; ambos prolongaram o tempo de oclusão das artérias coronárias numa forma depedente da dose. Ainda, ambas as moléculas prolongaram significativamente o tempo de oclusão numa dose (0,03 mg/Kg i.v.) que não produziu aumentos significativos de hemorragia. Estes dados, e outros, sugerem que AcNAP5 e AcaNAPc2P possuem índices terapêuticos favoráveis. 203 ΡΕ0788546

Tabela 10. Comparação dos pontos limites entre AcaNAPc2P e AcaNAP5 após dosagem intravenosa no modelo de porco de trombose aguda das artérias coronárias.

Dose Incidência de Tempo de oclusão Perda de sangue (i.v.) oclusão (min) total (ml) (mg/Kg) AcaNAP5 AcaNAPc2P AcaNAP5 AcaNAPc2P AcaNAP5 AcaNAPc2 0, 01 6/6 6/6 107+13,0 10516,2 2,810,8 1,610,3 0, 03 5/6 4/6 150123,2 159127 5,611,4 4,911,4 0, 10 4/6 2/6f 187122,9* 215125* 43,5118* 17,617,9* * p<0,05 vs soro fisiológico (8/8), Exacto de Fisher; p<0,05 vs soro fisiológico, ANOVA, teste de comparaçao múltipla de Dunnett.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Corvas International , Inc.

Vlasuk, George Phillip Stanssens, Patrick Eric Hugo Messens, Joris Hila Lieven Lauwereys, Marc Josef Laroche, Yves Rene Jespers, Laurent Stephane Gansemans, Yannick Georges Jozef Moyle, Matthew Bergum, Peter W.

<120> INIBIDORES DE SERINA-PROTEASES E PROTEÍNAS ANTI-COAGULANTE S

EXTRAÍDOS DE NEMÁTODOS <130> 018813/0272487 <140> 09/498,556 <141> 2000-04-02 <150> 08/809,455 <151> 1997-04-17 204 ΡΕ0788546 <150> PCT/US95/13231 <151> 1995-10-17 <150> 08/486,399 <151> 1995-06-05 <150> 08/486,397 <151> 1995-06-05 <150> 08/465,380 <151> 1995-06-05 <150> 08/461,965 <151> 1995-06-05 <150> 08/326,110 <151> 1994-10-18 <160> 357 <17 0> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 234 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <4 0 0 > 1 aaggcatacc cggagtgtgg tgagaatgaa tggctcgacg actgtggaac tcagaagcca 60 tgcgaggcca agtgcaatga ggaaccccct gaggaggaag atccgatatg ccgctcacgt 120 ggttgtttat tacctcctgc ttgcgtatgc aaagacggat tctacagaga cacggtgatc 180 ggcgactgtg ttagggaaga agaatgcgac caacatgaga ttatacatgt ctga 234

<210> 2 <211> 228 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum 205 ΡΕ0788546 <4 0 0> 2 aaggcatacc cggagtgtgg tgagaatgaa tggctcgacg tctgtggaac taagaagcca 60 tgcgaggcca agtgcagtga ggaagaggag gaagatccga tatgccgatc attttcttgt 120 ccgggtcccg ctgcttgcgt atgcgaagac ggattctaca gagacacggt gatcggcgac 180 tgtgttaagg aagaagaatg cgaccaacat gagattatac atgtctga 228 <210> 3 <211> 461

<212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CDS <222> (22)..(321) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA de AcaNAPs <400> 3 gaattccgct actactcaac a atg aag atg ctt tac gct ate gct ata atg 51 Met Lys Met Leu Tyr Ala Ile Ala Ile Met 1 5 10 ttt ctc ctg gta tca tta tgc age gea aga aca gtg agg aag gea tac 99 Phe Leu Leu Vai Ser Leu Cys Ser Ala Arg Thr Vai Arg Lys Ala Tyr 15 20 25 ccg gag tgt ggt gag aat gaa tgg ctc gac gac tgt gga act cag aag 147 Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly Thr Gin Lys 30 35 40 cca tgc gag gcc aag tgc aat gag gaa ccc cct gag gag gaa gat ccg 195 Pro Cys Glu Ala Lys Cys Asn Glu Glu Pro Pro Glu Glu Glu Asp Pro 45 50 55 ata tgc cgc tca cgt ggt tgt tta tta cct cct gct tgc gta tgc aaa 243 Ile Cys Arg Ser Arg Gly Cys Leu Leu Pro Pro Ala Cys Vai Cys Lys 60 65 70 gac gga ttc tac aga gac acg gtg ate ggc gac tgt gtt agg gaa gaa 291 Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Vai Ile Gly Asp Cys Vai Arg Glu Glu 75 80 85 90 206 ΡΕ0788546 gaa tgc gac caa cat gag att ata cat gtc tgaacgagaaa gcaacaataacc 344 Glu Cys Asp Gin His Glu Ile Ile His Vai 95 100 aaaggttcca actctcgctc tgcaaaatcg ctagttggat gtctcttttg cgtccgaata 404 gttttagttg atgttaagta agaactcctg ctggagagaa taaagctttc caactcc 461 <210> 4 <211> 77

<212> PRT <213> Ascyclostoma caninum <400> 4

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp 1 5 10 Cys Gly Thr Gin Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys Asn Glu Glu 15 20 25 Pro Pro Glu Glu Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser Arg Gly Cys 30 35 40 Leu Leu Pro Pro Ala Cys Vai Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg 45 50 55 Asp Thr Vai Ile Gly Asp Cys Vai Arg Glu Glu Glu Cys Asp 60 65 70 Gin His Glu Ile Ile His Vai 75 <210> 5 <211> 455

<212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CDS <222> (22)..(315) <220>

<221> MOD_RES <223> sequência de cDNA de AcaNAP6 <400> 5 207 ΡΕ0788546 gaattccgct actactcaac a atg aag atg ctt tac gct ate gct ata atg 51 Met Lys Met Leu Tyr Ala Ile Ala Ile Met 1 5 10 ttt ctc ctg gtg tca tta tgc age aca aga aca gtg agg aag gea tac 99 Phe Leu Leu Vai Ser Leu Cys Ser Thr Arg Thr Vai Arg Lys Ala Tyr 15 20 25 ccg gag tgt ggt gag aat gaa tgg ctc gac gtc tgt gga act aag aag 147 Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Vai Cys Gly Thr Lys Lys 30 35 40 cca tgc gag gcc aag tgc agt gag gaa gag gag gaa gat ccg ata tgc 195 Pro Cys Glu Ala Lys Cys Ser Glu Glu Glu Glu Glu Asp Pro Ile Cys 45 50 55 cga tca ttt tct tgt ccg ggt ccc gct gct tgc gta tgc gaa gac gga 243 Arg Ser Phe Ser Cys Pro Gly Pro Ala Ala Cys Vai Cys Glu Asp Gly 60 65 70 ttc tac aga gac acg gtg ate ggc gac tgt gtt aag gaa gaa gaa tgc 291 Phe Tyr Arg Asp Thr Vai Ile Gly Asp Cys Vai Lys Glu Glu Glu Cys 75 80 85 90 gac caa cat gag att att cat gtc tgaacgagag i agcagtaata accaaaggttc 346 Asp Gin His Glu Ile Ile His Vai 95 caactttcgc tctacaaaat cgctagttgg atttctcctt tgcgtgcgaa tagttttagt 406 tgatattaag taaaacctcc tgttgaagag aataaagctt tccaacttc 455 <210> 6 <211> 75

<212> PRT <213> Ascyclostoma caninum <400> 6

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Vai Cys Gly 1 5 10 15 Thr Lys Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys Ser Glu Glu Glu Glu Glu Asp 20 25 30 Pro Ile Cys Arg Ser Phe Ser Cys Pro Gly Pro Ala Ala Cys Vai Cys 35 40 45 Glu Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Vai Ile Gly Asp Cys Vai Lys Glu 50 55 60 Glu Glu Cys Asp Gin His Glu Ile Ile His Vai 65 70 75 208 ΡΕ0788546 <210 > 7

<211> 81 <212> PRT <213> Ascyclostoma caninum <4 0 0> 7

Arg Thr Vai Arg Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu 1 5 10 15 Asp Asp Cys Gly Thr Gin Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys Asn Glu Glu 20 25 30 Pr ο Pro Glu Glu Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser Arg Gly Cys Leu Leu 35 40 45 Pr ο Pro Ala Cys Vai Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Vai Ile 50 55 60 Gly Asp Cys Vai Arg Glu Glu Glu Cys Asp Gin His Glu Ile Ile His 65 70 75 80 Vai <210> 8 <211> 79 <212> PRT <213> Ascyclostoma caninum <400> 8 Arg Thr Vai Arg Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu 1 5 10 15 Asp Vai Cys Gly Thr Lys Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys Ser Glu Glu 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser Phe Ser Cys Pro Gly Pro Ala 35 40 45 Ala Cys Vai Cys Glu Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Vai Ile Gly Asp 50 55 60 Cys Vai Lys Glu Glu Glu Cys Asp Gin His Glu Ile Ile His Vai 65 70 75 <210 > 9 <211> 711

<212> DNA <213> Ancyclostoma ceylanicum 209 ΡΕ0788546 <220> <221> CDS <222> (21)..(590) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA Recombinante de Molécula de AceNAP4 <400> 9 gaattcacta ttatccaaca atg gcg gtg ctt tat tca gta gca ata gcg 50

Met Ala Vai Leu Tyr Ser Vai Ala Ile Ala 15 10 tta cta ctg gta tca caa tgc agt ggg aaa ccg aac aat gtg atg act 98 Leu Leu Leu Vai Ser Gin Cys Ser Gly Lys Pro Asn Asn Vai Met Thr 15 20 25 aac gct tgt ggt ctt aat gaa tat ttc gct gag tgt ggc aat atg aag 146 Asn Ala Cys Gly Leu Asn Glu Tyr Phe Ala Glu Cys Gly Asn Met Lys 30 35 40 gaa tgc gag cac aga tgc aat gag gag gaa aat gag gaa agg gac gag 194 Glu Cys Glu His Arg Cys Asn Glu Glu Glu Asn Glu Glu Arg Asp Glu 45 50 55 gaa aga ata acg gca tgc ctc ate cgt gtg tgt ttc cgt cct ggt gct 242 Glu Arg Ile Thr Ala Cys Leu Ile Arg Vai Cys Phe Arg Pro Gly Ala 60 65 70 tgc gta tgc aaa gac gga ttc tat aga aac aga aca ggc age tgt gtg 290 Cys Vai Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg Asn Arg Thr Gly Ser Cys Vai 75 80 85 90 gaa gaa gat gac tgc gag tac gag aat atg gag ttc att act ttt gca 338 Glu Glu Asp Asp Cys Glu Tyr Glu Asn Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala 95 100 105 cca gaa gta ccg ata tgt ggt tcc aac gaa agg tac tcc gac tgc ggc 386 Pro Glu Vai Pro Ile Cys Gly Ser Asn Glu Arg Tyr Ser Asp Cys Gly 110 115 120 aat gac aaa caa tgc gag cgc aaa tgc aac gag gac gat tat gag aag 434 Asn Asp Lys Gin Cys Glu Arg Lys Cys Asn Glu Asp Asp Tyr Glu Lys 125 130 135 gga gat gag gca tgc cgc tca cat gtt tgt gaa cgt cct ggt gee tgt 482 Gly Asp Glu Ala Cys Arg Ser His Vai Cys Glu Arg Pro Gly Ala Cys 140 145 150 gta tgc gaa gac ggg ttc tac aga aac aaa aaa ggt age tgt gtg gaa 530 Vai Cys Glu Asp Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Ser Cys Vai Glu 155 160 165 170 210 ΡΕ0788546 age gat gac tgc gaa tac gat aat atg gat ttc ate act ttt gea cca 578

Ser Asp Asp Cys Glu Tyr Asp Asn Met Asp Phe Ile Thr Phe Ala Pro 175 180 185 gaa acc tea cga taaccaaaga tgctacctct cgtacgcaac tccgctgatt gaggtt 636 Glu Thr Ser Arg 190 gattcactcc cttgcatctc aacatttttt ttgtgatgct gtgcatctga gcttaacctg 696 ataaagccta tggtg 711 <210> 10 <211> 425

<212> DNA <213> Ancyclostoma ceylanicum <220> <221> CDS <222> (10) . . (291) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de eDNA Recombinante de Molécula de AceNAP5 <400> 10 gaattccgc atg cgg acg ctc tac ctc att tet ate tgg ttg ttc ctc ate 51

Met Arg Thr Leu Tyr Leu Ile Ser Ile Trp Leu Phe Leu Ile 15 10 teg caa tgt aat gga aaa gea ttc ccg aaa tgt gac gtc aat gaa aga 99 Ser Gin Cys Asn Gly Lys Ala Phe Pro Lys Cys Asp Vai Asn Glu Arg 15 20 25 30 ttc gag gtg tgt ggc aat ctg aag gag tgc gag ctc aag tgc gat gag 147 Phe Glu Vai Cys Gly Asn Leu Lys Glu Cys Glu Leu Lys Cys Asp Glu 35 40 45 gac cct aag ata tgc tet cgt gea tgt att cgt ccc cct gct tgc gta 195 Asp Pro Lys Ile Cys Ser Arg Ala Cys Ile Arg Pro Pro Ala Cys Vai 50 55 60 tgc gat gac gga ttc tac aga gac aaa tat ggc ttc tgt gtt gaa gaa 243 Cys Asp Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Lys Tyr Gly Phe Cys Vai Glu Glu 65 70 75 gac gaa tgt aac gat atg gag att att act ttt cca cca gaa acc aaa tg 293 Asp Glu Cys Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys 80 85 90 211 ΡΕ0788546 atgaccgaag cttccacctt tctatacata tcttcactgc ttgacaggct tctcgacaat 353 ttagaagttc tgcttgactt tgtctatttg aaattgttca cactaatggg ggaagtaaag 413 cattttcacg ac 425 <210> 11 <211> 471

<212> DNA <213> Ancyclostoma ceylanicum <220> <221> CDS <222> (23)..(237) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA Recombinante de Molécula de AceNAP7 <400> 11 gaattccgct acattttcaa ca atg tcg acg ctt tat gtt ate gea ata tgt 52

Met Ser Thr Leu Tyr Vai Ile Ala Ile Cys 15 10 ttg ctg ctt gtt tcg caa tgc aat gga aga acg gtg aag aag tgt ggc 100 Leu Leu Leu Vai Ser Gin Cys Asn Gly Arg Thr Vai Lys Lys Cys Gly 15 20 25 aag aat gaa aga tac gac gac tgt ggc aat gea aag gac tgc gag acc 148 Lys Asn Glu Arg Tyr Asp Asp Cys Gly Asn Ala Lys Asp Cys Glu Thr 30 35 40 aag tgc ggt gaa gag gaa aag gtg tgc cgt tcg cgt gag tgt act agt 196 Lys Cys Gly Glu Glu Glu Lys Vai Cys Arg Ser Arg Glu Cys Thr Ser 45 50 55 cct ggt gee tgc gta tgc gaa caa gga ttc tac aga gat ccg gct ggc 244 Pro Gly Ala Cys Vai Cys Glu Gin Gly Phe Tyr Arg Asp Pro Ala Gly 60 65 70 gac tgt gtc act gat gaa gaa tgt gat gaa tgg aac aat atg gag ate 292 Asp Cys Vai Thr Asp Glu Glu Cys Asp Glu Trp Asn Asn Met Glu Ile 75 80 85 90 att act atg cca aaa cag tagtgcgaag ttcccttctt tctccaaatc tgctccgtg 349 Ile Thr Met Pro Lys Gin 95 ctcaattatc acacacctcc actagttaag attgactgac tctcttgcat tgtagtattt 409 tcgcttgact ctgtgcattt aagcatgaga tactactagg gagaataaaa attactaact 469 ac 471 212 ΡΕ0788546 <210> 12 <211> 396

<212> DNA <213> Ancyclostoma duodenale <220> <221> CDS <222> (10)..(237) <2 2 0 >

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA Recombinante de Molécula de AduNAP4 <400> 12 gaattccgg aaa tgt cct acc gat gaa tgg ttc gat tgg tgt gga act tac 51

Lys Cys Pro Thr Asp Glu Trp Phe Asp Trp Cys Gly Thr Tyr 15 10 aag cat tgc gaa ctc aag tgc gat agg gag cta act gag aaa gaa gag 99 Lys 15 His Cys Glu Leu Lys Cys 20 Asp Arg Glu Leu 25 Thr Glu Lys Glu Glu 30 cag 147 gca tgt ctc tca cgt gtt tgt gag aag tcc gct tgc gta tgc aat Gin Ala Cys Leu Ser Arg Vai 35 Cys Glu Lys 40 Ser Ala Cys Vai Cys Asn 45 gac 195 gga tta tac aga gac aag ttt ggc aac tgt gtt gaa aaa gac gaa Asp Gly Leu Tyr Arg Asp Lys Phe Gly Asn Cys Vai Glu Lys Asp Glu 50 55 60 tgc aac gat atg gag att att act ttt gca cca gaa acc aaa taatggccta 247 Cys Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe tgagtaaacc 65 aggttccaaa 307 tttgcttgac 367 gacataataa ccttgctaca tctgtgtatt 70 caccgtcagt taagcattgt

Ala Pro Glu gctttactgt ctactaatgg

Thr Lys 75 ttcctctacg gcaaagtaaa tgttagtagt gcattgtaag ttctgattt 396 <210> 13 <211> 688 213 ΡΕ0788546

<212> DNA <213> Ancyclostoma ceylanicum <220> <221> CDS <222> (21)..(560) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA Recombinante de Molécula de AduNAP7 <400> 13 gaattccggg cggcagaaag atg cga atg ctc tac ctt gtt cct ate tgg 50

Met Arg Met Leu Tyr Leu Vai Pro Ile Trp 15 10 ttg ctg ctc att teg cta tgc agt gga aaa gct gcg aag aaa tgt ggt 98 Leu Leu Leu Ile Ser Leu Cys Ser Gly Lys Ala Ala Lys Lys Cys Gly 15 20 25 ctc aat gaa agg ctg gac tgt ggc aat ctg aag caa tgc gag ccc aag 146 Leu Asn Glu Arg Leu Asp Cys Gly Asn Leu Lys Gin Cys Glu Pro Lys 30 35 40 tgc age gac ttg gaa agt gag gag tat gag gag gaa gat gag teg aaa 194 Cys Ser Asp Leu Glu Ser Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Ser Lys 45 50 55 tgt cga tea cgt gaa tgt tet cgt cgt gtt tgt gta tgc gat gaa gga 242 Cys Arg Ser Arg Glu Cys Ser Arg Arg Vai Cys Vai Cys Asp Glu Gly 60 65 70 ttc tac aga aac aag aag ggc aag tgt gtt gea aaa gat gtt tgc gag 290 Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Lys Cys Vai Ala Lys Asp Vai Cys Glu 75 80 85 90 gac gac aat atg gag att ate act ttt cca cca gaa gac gaa tgt ggt 338 Asp Asp Asn Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Asp Glu Cys Gly 95 100 105 ccc gat gaa tgg ttc gac tac tgt gga aat tat aag aag tgc gaa ege 386 Pro Asp Glu Trp Phe Asp Tyr Cys Gly Asn Tyr Lys Lys Cys Glu Arg 110 115 120 aag tgc agt gag gag aca agt gag aaa aat gag gag gea tgc ctc tet 434 Lys Cys Ser Glu Glu Thr Ser Glu Lys Asn Glu Glu Ala Cys Leu Ser 125 130 135 cgt gct tgt act ggt cgt gct tgc gta tgc aaa gac gga ttg tac aga 482 Arg Ala Cys Thr Gly Arg Ala Cys Vai Cys Lys Asp Gly Leu Tyr Arg 140 145 150 214 ΡΕ0788546 gac gac ttt ggc aac tgt gtt cca cat gac gaa tgc aac gat atg gag 530

Asp Asp Phe Gly Asn Cys Vai Pro His Asp Glu Cys Asn Asp Met Glu 155 160 165 170 ate ate act ttt cca ccg gaa acc aaa cat tgaccagagg ctccaactct eget 584

Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys His 175 180 acacaacgtc agggctagaa tggcccctct gcgagttagt agttttgctt gactctgctt 644 atttgagcac tttctattga tggcgaaaat aaagcattta aaac 688 <210> 14 <211> 349

<212> DNA <213> Heligmosomoides polygyrus <220> <221> CDS <222> (49)..(276) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de eDNA Recombinante de Molécula de HpoNAP5 <400> 14 gaattccgcg cacctgagag gtgagctacg caagtcttcg ctggtaca atg ate cga 57

Met Ile Arg 1 aag etc gtt ctg ctg act gct ate gtc Lys Leu Vai Leu Leu Thr Ala Ile Vai 5 10 acc tgt gga cca aac gag gag tac act Thr Cys Gly Pro Asn Glu Glu Tyr Thr 20 25 ccg aag tgc aat gaa ccg atg cca gac Pro Lys Cys Asn Glu Pro Met Pro Asp 40 gtg aac gtg tgt cag tgc aaa ccc ggc Vai Asn Vai Cys Gin Cys Lys Pro Gly 55 60 tgc gtc gee ccc gga cca ggc tgt aaa Cys Vai Ala Pro Gly Pro Gly Cys Lys 70 75 acg gtg gtg cta agt gcg aag 105 Thr Vai Vai Leu Ser Ala Lys 15 gaa tgc ggg acg cca tgc gag 153 Glu Cys Gly Thr Pro Cys Glu 30 35 ate tgt act ctg aac tgc ate 201 Ile Cys Thr Leu Asn Cys Ile 45 50 ttc aag ege gga ccg aaa gga 249 Phe Lys Arg Gly Pro Lys Gly 65 tagttctcca cctgcccttt cgttggaa 304 349 caaatggctg tctttttaca ttctgaatca ataaagccga acggt 215 ΡΕ0788546 <210 > 15 <211> 432

<212> DNA <213> Heligmosomoides polygyrus <220> <221> CDS <222> (40)..(393) <220>

<221> MOD_RES <223> sequência de vector pDONG61 <400> 15 aagctttgct aacatactgc gtaataagga gtcttaatc atg Met ggt att Gly Ile ttc ggc Phe Gly att gct Ile Ala ctt gtg Leu Vai 55 gtt cag Vai Gin 70 tat gtt Tyr Vai caa aaa Gin Lys ccg tta Pro Leu tat ctg Tyr Leu 25 att tca Ile Ser 40 ggt tat Gly Tyr ggc gtt Gly Vai att ctc Ile Leu ate gtt Ile Vai 105 tta ttg Leu Leu 10 ctt act Leu Thr ttg ttt Leu Phe ctc tct Leu Ser cag tta Gin Leu 75 tct gta Ser Vai 90 tct tat Ser Tyr cgt ttc Arg Phe ttc ctt Phe Leu ctt gct Leu Ala 45 gat att Asp Ile 60 att ctc Ile Leu aag gct Lys Ala ttg gat Leu Asp ctc ggt Leu Gly 15 aaa aag Lys Lys 30 ctt att Leu Ile age gea Ser Ala ccg tct Pro Ser gct att Ala Ile 95 tgg gat Trp Asp 110 1 ttc ctt Phe Leu ggc ttc Gly Phe att ggg Ile Gly caa tta Gin Leu 65 aat gcg Asn Ala 80 ttc att Phe Ile aaa ggt Lys Gly cca gtt Pro Vai ctg gta Leu Vai ggt aag Gly Lys 35 ctt aac Leu Asn 50 ccc tct Pro Ser ctt ccc Leu Pro ttt gac Phe Asp gga ggc Gly Gly 115 ctt ttg Leu Leu 5 act ttg Thr Leu 20 ata gct Ile Ala tca att Ser Ile gat ttt Asp Phe tgt ttt Cys Phe 85 gtt aaa Vai Lys 100 tca ggc Ser Gly 54 102 150 198 246 294 342 390 gga ggccaagtcg gccatcccat atcacgcggc cgcggatcc Gly <210> 16 432 216 ΡΕ0788546 <211> 433 <212> DNA <213> Heligmosomoides polygyrus <220> <221> CDS <222> (40)..(393) <220> <221> MOD_RES <223> sequência de vector pDONG62 <400> 16 54 aagctttgct aacatactgc gtaataagga gtcttaatc atg cca gtt ctt ttg

Met Pro Vai Leu Leu 1 5 ggt att ccg tta tta ttg cgt ttc ctc ggt ttc ctt ctg gta act ttg Gly Ile Pro Leu Leu Leu Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Vai Thr Leu 10 15 20 ttc ggc tat ctg ctt act ttc ctt aaa aag ggc ttc ggt aag ata gct Phe Gly Tyr Leu Leu Thr Phe Leu Lys Lys Gly Phe Gly Lys Ile Ala 25 30 35 att gct att tea ttg ttt ctt gct ctt att att ggg ctt aac tea att Ile Ala Ile Ser Leu Phe Leu Ala Leu Ile Ile Gly Leu Asn Ser Ile 40 45 50 ctt gtg ggt tat ctc tet gat att age gea caa tta ccc tet gat ttt Leu Vai Gly Tyr Leu Ser Asp Ile Ser Ala Gin Leu Pro Ser Asp Phe 55 60 65 gtt cag ggc gtt cag tta att ctc ccg tet aat gcg ctt ccc tgt ttt Vai Gin Gly Vai Gin Leu Ile Leu Pro Ser Asn Ala Leu Pro Cys Phe 70 75 80 85 tat gtt att ctc tet gta aag gct gct att ttc att ttt gac gtt aaa Tyr Vai Ile Leu Ser Vai Lys Ala Ala Ile Phe Ile Phe Asp Vai Lys 90 95 100 caa aaa ate gtt tet tat ttg gat tgg gat aaa ggt gga ggc tea ggc Gin Lys Ile Vai Ser Tyr Leu Asp Trp Asp Lys Gly Gly Gly Ser Gly 105 110 115 102 150 198 246 294 342 390 gga gggccaagtc ggccatccca tatcacgcgg ccgcggatcc Gly <210> 17 <211> 434 433 217 ΡΕ0788546

<212> DNA <213> Heligmosomoides polygyrus <220>

<221> CDS <222> (140)..(291) <220>

<221> MOD_RES <223> sequência de vector pDONG63 <400> 17 aagctttgct aacatactgc gtaataagga gtcttaatc atg cca gtt ctt ttg 54

Met Pro Vai Leu Leu 1 5 ggt att ccg tta tta ttg cgt ttc ctc ggt ttc ctt ctg gta act ttg 102 Gly Ile Pro Leu Leu Leu Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Vai Thr Leu 10 15 20 ttc ggc tat ctg ctt act ttc ctt aaa aag ggc ttc ggt aag ata gct 150 Phe Gly Tyr Leu Leu Thr Phe Leu Lys Lys Gly Phe Gly Lys Ile Ala 25 30 35 att gct att tea ttg ttt ctt gct ctt att att ggg ctt aac tea att 198 Ile Ala Ile Ser Leu Phe Leu Ala Leu Ile Ile Gly Leu Asn Ser Ile 40 45 50 ctt gtg ggt tat ctc tet gat att age gea caa tta ccc tet gat ttt 246 Leu Vai Gly Tyr Leu Ser Asp Ile Ser Ala Gin Leu Pro Ser Asp Phe 55 60 65 gtt cag ggc gtt cag tta att ctc ccg tet aat gcg ctt ccc tgt ttt 294 Vai Gin Gly Vai Gin Leu Ile Leu Pro Ser Asn Ala Leu Pro Cys Phe 70 75 80 85 tat gtt att ctc tet gta aag gct gct att ttc att ttt gac gtt aaa 342 Tyr Vai Ile Leu Ser Vai Lys Ala Ala Ile Phe Ile Phe Asp Vai Lys 90 95 100 caa aaa ate gtt tet tat ttg gat tgg gat aaa ggt gga ggc tea ggc 390 Gin Lys Ile Vai Ser Tyr Leu Asp Trp Asp Lys Gly Gly Gly Ser Gly 105 110 115 gga tcggccaagt cggccatccc atatcacgcg gccgcggatc c 434

Gly

<210> 18 <211> 6 <212> PRT 218 ΡΕ0788546 <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc

<223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de ligação de vector pDONG <400> 18

Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 19 <211> 430

<212> DNA <213> Ancyclostoma ceylanicum <220>

<221> CDS <222> (10) . . (282) <220>

<221> MOD_RES <223> "w" representa a ou t <400> 19 gaattccgg ctg gtw tcc tac tgc agt gga aaa gca acg atg cag tgt ggt 51 Leu Vai Ser Tyr Cys Ser Gly Lys Ala Thr Met Gin Cys Gly 15 10 gag aat gaa aag tac gat tcg tgc ggt age aag gag tgc gat aag aag 99 Glu Asn Glu Lys Tyr Asp Ser Cys Gly Ser Lys Glu Cys Asp Lys Lys 15 20 25 30 tgc aaa tat gac gga gtt gag gag gaa gac gac gag gaa cct aat gtg 147 Cys Lys Tyr Asp Gly Vai Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro Asn Vai 35 40 45 cca tgc cta gta cgt gtg tgt cat caa gat tgc gta tgc gaa gaa gga 195 Pro Cys Leu Vai Arg Vai Cys His Gin Asp Cys Vai Cys Glu Glu Gly 50 55 60 ttc tat aga aac aaa gat gac aaa tgt gta tea gca gaa gag tgc gaa 243 Phe Tyr Arg Asn Lys Asp Asp Lys Cys Vai Ser Ala Glu Asp Cys Glu 65 70 75 219 ΡΕ0788546 ctt gac aat atg gac ttt ata tat ccc gga act cga aac tgaacgaaggctc 295 Leu Asp Asn Met Asp Phe Ile Tyr Pro Gly Thr Arg Asn 80 85 90 cattcttgct gcacaagatc gattgtctct cccctgcatc tcagtagttt tgctacattg 355 tatatggtag caaaaaatta gcttagggag aataaaatct ttacctatat ttaatcaatg 415 aagtattctc tttct 430

<210> 20 <211> 100 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 20

Met Lys Met Leu Tyr Ala Ile Ala Ile Met Phe Leu Leu Vai Ser Leu 1 5 10 15 Cys Ser Ala Arg Thr Vai Arg Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn 20 25 30 Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly Thr Gin Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys 35 40 45 Asn Glu Glu Pro Pro Glu Glu Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser Arg Gly 50 55 60 Cys Leu Leu Pro Pro Ala Cys Vai Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg Asp 65 70 75 80 Thr Vai Ile Gly Asp Cys Vai Arg Glu Glu Glu Cys Asp Gin His Glu 85 90 95 Ile Ile His Vai 100 <210> 21 <211> 98 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 21

Met 1 Lys Met Leu Tyr 5 Ala Ile Ala Ile Met 10 Phe Leu Leu Vai Ser 15 Leu Cys Ser Thr Arg 20 Thr Vai Arg Lys Ala 25 Tyr Pro Glu Cys Gly 30 Glu Asn ΡΕ0788546 - 220 -

Glu Trp Leu Asp Vai Cys Gly Thr Lys Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys 35 40 45 Ser Glu Glu Glu Glu Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser Phe Ser Cys Pro 50 55 60 Gly Pro Ala Ala Cys Vai Cys Glu Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Vai 65 70 75 80 Ile Gly Asp Cys Vai Lys Glu Glu Glu Cys Asp Gin His Glu Ile Ile 85 90 95 His Vai <210> 22 <211> 94 <212> PRT <213> Ancyclostoma ceylanicum <400> 22 Met Arg Thr Leu Tyr Leu Ile Ser Ile Trp Leu Phe Leu Ile Ser Gin 1 5 10 15 Cys Asn Gly Lys Ala Phe Pro Lys Cys Asp Vai Asn Glu Arg Phe Glu 20 25 30 Vai Cys Gly Asn Leu Lys Glu Cys Glu Leu Lys Cys Asp Glu Asp Pro 35 40 45 Lys Ile Cys Ser Arg Ala Cys Ile Arg Pro Pro Ala Cys Vai Cys Asp 50 55 60 Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Lys Tyr Gly Phe Cys Vai Glu Glu Asp Glu 65 70 75 80 Cys Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys 85 90 <210> 23 <211> 96 <212> PRT <213> Ancyclostoma ceylanicum <400> 23 Met Ser Thr Leu Tyr Vai Ile Ala Ile Cys Leu Leu Leu Vai Ser Gin 1 5 10 15 Cys Asn Gly Arg Thr Vai Lys Lys Cys Gly Lys Asn Glu Arg Tyr Asp 20 25 30 Asp Cys Gly Asn Ala Lys Asp Cys Glu Thr Lys Cys Gly Glu Glu Glu 35 40 45 221 ΡΕ0788546

Lys Vai Cys Arg Ser Arg Glu Cys Thr Ser Pro Gly Ala Cys Vai Cys 50 55 60 Glu Gin Gly Phe Tyr Arg Asp Pro Ala Gly Asp Cys Vai Thr Asp Glu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Glu Trp Asn Asn Met Glu Ile Ile Thr Met Pro Lys Gin 85 90 95 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Ancyclostoma ceylanicum <400> 24 Met Ala Vai Leu Tyr Ser Vai Ala Ile Ala Leu Leu Leu Vai Ser Gin 1 5 10 15 Cys Ser Gly Lys Pro Asn Asn Vai Met Thr Asn Ala Cys Gly Leu Asn 20 25 30 Glu Tyr Phe Ala Glu Cys Gly Asn Met Lys Glu Cys Glu His Arg Cys 35 40 45 Asn Glu Glu Glu Asn Glu Glu Arg Asp Glu Glu Arg Ile Thr Ala Cys 50 55 60 Leu Ile Arg Vai Cys Phe Arg Pro Gly Ala Cys Vai Cys Lys Asp Gly 65 70 75 80 Phe Tyr Arg Asn Arg Thr Gly Ser Cys Vai Glu Glu Asp Asp Cys Glu 85 90 95 Tyr Glu Asn Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro Glu 100 105 <210> 25 <211> 82 <212> PRT <213> Ancyclostoma ceylanicum <400> 25 Vai Pro Ile Cys Gly Ser Asn Glu Arg Tyr Ser Asp Cys Gly Asn Asp 1 5 10 15 Lys Gin Cys Glu Arg Lys Cys Asn Glu Asp Asp Tyr Glu Lys Gly Asp 20 25 30 Glu Ala Cys Arg Ser His Vai Cys Glu Arg Pro Gly Ala Cys Vai Cys 35 40 45 222 ΡΕ0788546

Glu Asp Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Ser Cys Vai Glu Ser Asp 50 55 60 Asp Cys Glu Tyr Asp Asn Met Asp Phe Ile Thr Phe Ala Pro Glu Thr 65 70 75 80 Ser Arg <210> 26 <211> 75 <212> PRT <213> Ancyclostoma duodenale <400> 26 Lys Cys Pro Thr Asp Glu Trp Phe Asp Trp Cys Gly Thr Tyr Lys His 1 5 10 15 Cys Glu Leu Lys Cys Asp Arg Glu Leu Thr Glu Glu Glu Gin Ala Cys 20 25 30 Leu Ser Arg Vai Cys Glu Lys Ser Ala Cys Vai Cys Asn Asp Gly Leu 35 40 45 Tyr Arg Asp Lys Phe Gly Asn Cys Vai Glu Lys Asp Glu Cys Asn Asp 50 55 60 Met Glu Ile Ile Thr Phe Ala Pro Glu Thr Lys 65 70 75 <210> 27 <211> 102 <212> PRT <213> Ancyclostoma duodenale <400> 27 Met Arg Met Leu Tyr Leu Vai Pro Ile Trp Leu Leu Leu Ile Ser Leu 1 5 10 15 Cys Ser Gly Lys Ala Ala Lys Lys Cys Gly Leu Asn Glu Arg Leu Asp 20 25 30 Cys Gly Asn Leu Lys Gin Cys Glu Pro Lys Cys Ser Asp Leu Glu Ser 35 40 45 Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Ser Lys Cys Arg Ser Arg Glu Cys 50 55 60 Ser Arg Arg Vai Cys Vai Cys Asp Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys 65 70 75 80 223 ΡΕ0788546

Gly Lys Cys Vai Ala Lys Asp Vai 85

Ile Thr Phe Pro Pro Glu 100

Cys Glu Asp Asp Asn Met Glu Ile 90 95 <210> 28 <211> 78

<212> PRT <213> Ancyclostoma duodenale <400> 28

Asp Glu Cys Gly Pro Asp Glu Trp 1 5 Lys Cys Glu Arg Lys Cys Ser Glu 20 Ala Cys Leu Ser Arg Ala Cys Thr 35 40 Gly Leu Tyr Arg Asp Asp Phe Gly 50 55 Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe 65 70

Phe Asp Tyr Cys Gly Asn Tyr Lys 10 15 Glu Thr Ser Glu Lys Asn Glu Glu 25 30 Gly Arg Ala Cys Vai Cys Lys Asp 45 Asn Cys Vai Pro His Asp Glu Cys 60 Pro Pro Glu Thr Lys His 75 <210> 29 <211> 76

<212> PRT <213> Helogmosomoides polygyru <4 0 0 > 29

Met Ile Arg Lys Leu Vai Leu Leu 1 5 Ser Ala Lys Thr Cys Gly Pro Asn 20 Pro Cys Glu Pro Lys Cys Asn Glu 35 40 Asn Cys Ile Vai Asn Vai Cys Gin 50 55 Pro Lys Gly Cys Vai Ala Pro Gly 65 70

Thr Ala Ile Vai Thr Vai Vai Leu 10 15 Glu Glu Tyr Thr Glu Cys Gly Thr 25 30 Pro Met Pro Asp Ile Cys Thr Leu 45 Cys Lys Pro Gly Phe Lys Arg Gly 60 Pro Gly Cys Lys 75 224 ΡΕ0788546 <210> 30 <211> 187 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 30 ttattcgaaa cgatgttctc tccaattttg tccttggaaa ttattttagc tactttgcaa 60 tctgtcttcg cccagccagt tatctccact accgttggtt ccgctgccga gggttctttg 120 gacaagaggc ctatccgcgg aattcagatc tgaatgcggc cgctcgagac tagtggatcc 180 ttagaca 187 <210> 31 <211> 495

<212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CDS <222> (36)..(356) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA recombinante de Molécula de AcaNAP23 <400> 31 gaattccgcg gaattccgct tgctactact caacg atg aag acg ctc tat att 53

Met Lys Thr Leu Tyr Ile 1 5 gtc gct ata tgc tcg ctc ctc att tcg ctg tgt act gga aaa cct tcg 101 Vai Ala Ile Cys Ser Leu Leu Ile Ser Leu Cys Thr Gly Lys Pro Ser 10 15 20 gag aaa gaa tgt ggt ccc cat gaa aga ctc gac tgt ggc aac aag aag 149 Glu Lys Glu Cys Gly Pro His Glu Arg Leu Asp Cys Gly Asn Lys Lys 25 30 35 cca tgc gag cgc aag tgc aaa ata gag aca agt gag gag gag gat gac 197 Pro Cys Glu Arg Lys Cys Lys Ile Glu Thr Ser Glu Glu Glu Asp Asp 40 45 50 225 ΡΕ0788546 tac gaa gag gga acc gaa cgt ttt cga tgc ctc tta cgt gtg tgt gat 245 Tyr Glu Glu Gly Thr Glu Arg Phe Arg Cys Leu Leu Arg Vai Cys Asp 55 60 65 70 cag cct tat gaa tgc ata tgc gat gat gga tac tac aga aac aag aaa 293 Gin Pro Tyr Glu Cys Ile Cys Asp Asp Gly Tyr Tyr Arg Asn Lys Lys 75 80 85 ggc gaa tgt gtg act gat gat gta tgc cag gaa gac ttt atg gag ttt 341 Gly Glu Cys Vai Thr Asp Asp Vai Cys Gin Glu Asp Phe Met Glu Phe 90 95 100 att act ttc gea cca taaacccaat . aatgaccaat gactcccatt : cttcgtgatcag 398 Ile Thr Phe Ala Pro 105 cgtcggtggt tgacagtctc ccctacatct tagtagtttt gcttgataat gtatacataa 458 actgtacttt ctgagataga ataaagctct caactac 495 <210> 32 <211> 478

<212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CDS <222> (24)..(341) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA recombinante de Molécula de AcaNAP24 <400> 32 gaattccgcg gaattccgca acg atg aag acg ctc tat att ate gct ata tgc 53

Met Lys Thr Leu Tyr Ile Ile Ala Ile Cys 15 10 teg ctc ctc att teg ttg tgt act gga aga ccg gaa aaa aag tgc ggt 101

Ser Leu Leu Ile Ser Leu Cys Thr Gly Arg Pro Glu Lys Lys Cys Gly 15 20 25 ccc ggt gaa aga ctc gee tgt ggc aat aag aag cca tgc gag ege aag

Pro Gly Glu Arg Leu Ala Cys Gly Asn Lys Lys Pro Cys Glu Arg Lys 30 35 40 149 226 ΡΕ0788546 tgc aaa ata gag aca agt gag gag gag gat gac tac cca gag gga acc Cys Lys Ile Glu Thr Ser Glu Glu Glu Asp Asp Tyr Pro Glu Gly Thr 45 50 55 gaa cgt ttt cga tgc ctc tta cgt gtg tgt gat cag cct tat gaa tgc Glu Arg Phe Arg Cys Leu Leu Arg Vai Cys Asp Gin Pro Tyr Glu Cys 60 65 70 ata tgc gat gat gga tac tac aga aac aag aaa ggc gaa tgt gtg act Ile Cys Asp Asp Gly Tyr Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Glu Cys Vai Thr 75 80 85 90 gat gat gta tgc cag gaa gac ttt atg gag ttt att act ttc gea cca Asp Asp Vai Cys Gin Glu Asp Phe Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro 95 100 105 taaacccaat aatgaccact ggctcccatt cttcgtgacc agcgtcggtg gttgacagtc 401 aaacagtact ttctgagata 461 478 tcccctgcat cttagtagtt ttgcttgata atgtatccat gaataaagct ctcaact <210> 33 <211> 472

<212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CDS <222> (21)..(335) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA recombinante de Molécula de AcaNAP25 <400> 33 gaattccgta ctactcaacg atg aag acg ctc tat att ate gct ata tgc Met Lys Thr Leu Tyr Ile Ile Ala Ile Cys 15 10 teg ctg ctc ttt tea ctg tgt act gga aga ccg gaa aaa aag tgc ggt Ser Leu Leu Phe Ser Leu Cys Thr Gly Arg Pro Glu Lys Lys Cys Gly 15 20 25 ccc ggt gaa aga ctc gac tgt gee aac aag aag cca tgc gag ccc aag Pro Gly Glu Arg Leu Asp Cys Ala Asn Lys Lys Pro Cys Glu Pro Lys 30 35 50 98 40 146 227 ΡΕ0788546 tgc aaa ata gag aca agt gag gag gag gat gac gac gta gag gat acc 194 Cys Lys Ile Glu Thr Ser Glu Glu Glu Asp Asp Asp Vai Glu Asp Thr 45 50 55 gat gtg aga tgc ctc gta cgt gtg tgt gaa cgt cct ctt aaa tgc ata 242 Asp Vai Arg Cys Leu Vai Arg Vai Cys Glu Arg Pro Leu Lys Cys Ile 60 65 70 tgc aag gat gga tac tac aga aac aag aaa ggc gaa tgt gtg act gat 290 Cys Lys Asp Gly Tyr Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Glu Cys Vai Thr Asp 75 80 85 90 gat gta tgc cag gaa gac ttt atg gag ttt att act ttc gea cca taaacc 341 Asp Vai Cys Gin Glu Asp Phe Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro 95 100 105 caataatgac cactggctcc cattcttcgt gatcagcgtc ggtggttgac agtctcccct 401 gcatcttagt tgctttgctt gataatctat acataaacag tactttctga gatagaataa 461 agctctcaac t 472 <210> 34 <211> 487

<212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CDS <222> (57)..(347) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA recombinante de Moléculas de AcaNAP31, AcaNAP42 and AcaNAP46 <400> 34 gaattccgga cttactagta ctcagcgaat caaatacgac ttactactac tcaacg atg 59

Met 1 aag acg ctc tct gct ate cct ata atg ctg ctc ctg gta teg caa tgc 107

Lys Thr Leu Ser Ala Ile Pro Ile Met Leu Leu Leu Vai Ser Gin Cys 5 10 15 agt gga aaa tea ctg tgg gat cag aag tgt ggt gag aat gaa agg ctc 155

Ser Gly Lys Ser Leu Trp Asp Gin Lys Cys Gly Glu Asn Glu Arg Leu 20 25 30 228 ΡΕ0788546 gac tgt ggc aat cag aag gac tgt gag ege aag tgc gat gat aaa aga 203 Asp Cys Gly Asn Gin Lys Asp Cys Glu Arg Lys Cys Asp Asp Lys Arg 35 40 45 agt gaa gaa gaa att atg cag gea tgt ctc aca cgt caa tgt ctt cct 251 Ser Glu Glu Glu Ile Met Gin Ala Cys Leu Thr Arg Gin Cys Leu Pro 50 55 60 65 cct gtt tgc gta tgt gaa gat gga ttc tac aga aat gac aac gac caa 299 Pro Vai Cys Vai Cys Glu Asp Gly Phe Tyr Arg Asn Asp Asn Asp Gin 70 75 80 tgt gtt gat gaa gaa gaa tgc aat atg gag ttt att act ttc ger cca tg 349 Cys Vai Asp Glu Glu Glu Cys Asn Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro 85 90 95 aagcaaatga cagccgatgg tttggactct cgctacagat cacagcttta ctgtttccct 409 tgcatcatag tagttttgct agatagtgta tatattagca tgattttctg atagggagaa 469 taaagctttc caattttc 487 <210> 35 <211> 477

<212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CDS <222> (24)..(338) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA recombinante de Molécula de AcaNAP44 <400> 35 gaattccgcg gaattccgca acg atg aag acg ctc tat att ate gct ata tgc 53

Met Lys Thr Leu Tyr Ile Ile Ala Ile Cys 15 10 teg ctc ctc att teg ctg tgt act gga aga ccg gaa aaa aag tgc ggt 101

Ser Leu Leu Ile Ser Leu Cys Thr Gly Arg Pro Glu Lys Lys Cys Gly 15 20 25 ccc ggt gaa aga ctc gac tgt gee aac aag aag cca tgc gag ccc aag

Pro Gly Glu Arg Leu Asp Cys Ala Asn Lys Lys Pro Cys Glu Pro Lys 30 35 40 149 229 ΡΕ0788546 tgc aaa ata gag aca agt gag gag gag gat gac gac gta gag gaa acc 197 Cys Lys Ile Glu Thr Ser Glu Glu Glu Asp Asp Asp Vai Glu Glu Thr 45 50 55 gat gtg aga tgc ctc gta cgt gtg tgt gaa cgg cct ctt aaa tgc ata 245 Asp Vai Arg Cys Leu Vai Arg Vai Cys Glu Arg Pro Leu Lys Cys Ile 60 65 70 tgc aag gat gga tac tac aga aac aag aaa ggc gaa tgt gtg act gat 293 Cys Lys Asp Gly Tyr Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Glu Cys Vai Thr Asp 75 80 85 90 gat gta tgc cag gaa gac ttt atg gag ttt att act ttc gea cca taaacc 344 Asp Vai Cys Gin Glu Asp Phe Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro 95 100 105 caataatgac cactggctcc cattcttcgt gatcagcgtc ggtggttgac agtctcccct 404 gcatcttagt tgctttgctt gataatctat acataaacag tactttctga gatagaataa 464 agctctcaac tac 477 <210> 36 <211> 685

<212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CDS <222> (14)..(556) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA recombinante de Molécula de AcaNAP45 <400> 36 aattccgga aaa atg ctg atg ctc tac ctt gtt cct ate tgg ttg cta 48

Met Leu Met Leu Tyr Leu Vai Pro Ile Trp Leu Leu 15 10 ctc att teg caa tgc agt gga aaa tcc gcg aag aaa tgt ggt ctc aat 96

Leu Ile Ser Gin Cys Ser Gly Lys Ser Ala Lys Lys Cys Gly Leu Asn 15 20 25 gaa aaa ttg gac tgt ggc aat ctg aag gea tgc gag aaa aag tgc age

Glu Lys Leu Asp Cys Gly Asn Leu Lys Ala Cys Glu Lys Lys Cys Ser 30 35 40 144 ΡΕ0788546 - 230 - gac ttg gac aat gag gag gat tat aag gag gaa gat gag teg aaa tgc 192 Asp Leu Asp Asn Glu Glu Asp Tyr Lys Glu Glu Asp Glu Ser Lys Cys 45 50 55 60 cga tea cgt gaa tgt agt cgt cgt gtt tgt gta tgc gat gaa gga ttc 240 Arg Ser Arg Glu Cys Ser Arg Arg Vai Cys Vai Cys Asp Glu Gly Phe 65 70 75 tac aga aac aag aag ggc caa tgt gtg aca aga gat gat tgc gag tat 288 Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Gin Cys Vai Thr Arg Asp Asp Cys Glu Tyr 80 85 90 gac aat atg gag att ate act ttt cca cca gaa gat aaa tgt ggt ccc 336 Asp Asn Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Asp Lys Cys Gly Pro 95 100 105 gat gaa tgg ttc gac tgg tgt gga act tac aag cag tgt gag ege aag 384 Asp Glu Trp Phe Asp Trp Cys Gly Thr Tyr Lys Gin Cys Glu Arg Lys 110 115 120 tgc aat aag gag cta agt gag aaa gat gaa gag gea tgc ctc tea cgt 432 Cys Asn Lys Glu Leu Ser Glu Lys Asp Glu Glu Ala Cys Leu Ser Arg 125 130 135 140 gct tgt act ggt cgt gct tgt gtt tgc aac gac gga ctg tac aga gac 480 Ala Cys Thr Gly Arg Ala Cys Vai Cys Asn Asp Gly Leu Tyr Arg Asp 145 150 155 gat ttt ggc aat tgt gtt gag aaa gac gaa tgt aac gat atg gag att 528 Asp Phe Gly Asn Cys Vai Glu Lys Asp Glu Cys Asn Asp Met Glu Ile 160 165 170 ate act ttt cca ccg gaa acc aaa cac tgaccaaagg ctctaactct cgctacat 583 Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys His 175 180 aacgtcagtg cttgaattgc ccctttacga gttagtaatt ttgactaact ctgtgtaatt 643 gagcattgtc tactgatggt gaaaatgaag tgttcaatgt ct 685 <210 > 37 <211> 707

<212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CDS <222> (34)..(576) <220>

MOD RES <221> 231 ΡΕ0788546 <223> Sequência de cDNA recombinante de Molécula de AcaNAP47 <400> 37 gaattccgcg gaattccggt tggcggcaga aaa atg ctg atg ctc tac ctt gtt 54

Met Leu Met Leu Tyr Leu Vai 1 5 cct ate tgg ttc ctg ctc att teg caa tgc agt gga aaa tcc gcg aag 102 Pro Ile Trp Phe Leu Leu Ile Ser Gin Cys Ser Gly Lys Ser Ala Lys 10 15 20 aaa tgt ggc ctc aat gaa aaa ttg gac tgt ggc aat ctg aag gca tgc 150 Lys Cys Gly Leu Asn Glu Lys Leu Asp Cys Gly Asn Leu Lys Ala Cys 25 30 35 gag aaa aag tgc age gac ttg gac aat gag gag gat tat ggg gag gaa 198 Glu Lys Lys Cys Ser Asp Leu Asp Asn Glu Glu Asp Tyr Gly Glu Glu 40 45 50 55 gat gag teg aaa tgc cga tea cgt gaa tgt att ggt cgt gtt tgc gta 246 Asp Glu Ser Lys Cys Arg Ser Arg Glu Cys Ile Gly Arg Vai Cys Vai 60 65 70 tgc gat gaa gga ttc tac aga aac aag aag ggc caa tgt gtg aca aga 294 Cys Asp Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Gin Cys Vai Thr Arg 75 80 85 gac gat tgc gag tat gac aat atg gag att ate act ttt cca cca gaa 342 Asp Asp Cys Glu Tyr Asp Asn Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu 90 95 100 gat aaa tgt ggt ccc gat gaa tgg ttc gac tgg tgt gga act tac aag 390 Asp Lys Cys Gly Pro Asp Glu Trp Phe Asp Trp Cys Gly Thr Tyr Lys 105 110 115 cag tgt gag ege aag tgc agt gag gag cta agt gag aaa aat gag gag 438 Gin Cys Glu Arg Lys Cys Ser Glu Glu Leu Ser Glu Lys Asn Glu Glu 120 125 130 135 gca tgc ctc tea cgt gct tgt act ggt cgt gct tgc gtt tgc aac gac 486 Ala Cys Leu Ser Arg Ala Cys Thr Gly Arg Ala Cys Vai Cys Asn Asp 140 145 150 gga ttg tat aga gac gat ttt ggc aat tgt gtt gag aaa gac gaa tgt 534 Gly Leu Tyr Arg Asp Asp Phe Gly Asn Cys Vai Glu Lys Asp Glu Cys 155 160 165 aac gat atg gag att ate act ttt cca ccg gaa acc aaa cac tgaccaaagg [ 586 Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys His 170 175 180 ctctagctct cgctacataa cgtcagtgct tgaattgtcc ctttacgtgt tagtaatttt 646 232 ΡΕ0788546 gactaactct gtgtatttga gcattgtcta ctaatggtga aaatgaagct tttcaatgac 706 t 707 <210> 38 <211> 529

<212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CDS <222> (31) . . (309) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA recombinante de Molécula de AcaNAP48 <400> 38 gaattccgta cgacctacta ctactcaacg atg aag gcg ctc tat gtt ate tet 54

Met Lys Ala Leu Tyr Vai Ile Ser 1 5 ata acg ttg ctc ctg gta tgg caa tgc agt gea aga aca gcg agg aaa 102 Ile Thr Leu Leu Leu Vai Trp Gin Cys Ser Ala Arg Thr Ala Arg Lys 10 15 20 ccc cca acg tgt ggt gaa aat gaa agg gtc gaa tgg tgt ggc aag cag 150 Pro Pro Thr Cys Gly Glu Asn Glu Arg Vai Glu Trp Cys Gly Lys Gin 25 30 35 40 tgc gag ate aca tgt gac gac cca gat aag ata tgc ege tea ctc gct 198 Cys Glu Ile Thr Cys Asp Asp Pro Asp Lys Ile Cys Arg Ser Leu Ala 45 50 55 tgt cct ggt cct cct gct tgc gta tgc gac gac gga tac tac aga gac 246 Cys Pro Gly Pro Pro Ala Cys Vai Cys Asp Asp Gly Tyr Tyr Arg Asp 60 65 70 acg aac gtt ggc ttg tgt gta caa tat gac gaa tgc aac gat atg gat 294 Thr Asn Vai Gly Leu Cys Vai Gin Tyr Asp Glu Cys Asn Asp Met Asp 75 80 85 att att atg gtt tea tagggttgac tgaagaatcg aacaaccggt gcacaacttc 349 Ile Ile Met Vai Ser 90 tatgcttgac tatetetett gcatcatgca agtttagcta gatagtgtat atattagcaa 409 233 ΡΕ0788546 gaccccttgg ggagaatgaa gcttcccaac tatattaaat caataacgtt ttcgcttcat 469 gtacacgtgc tcagcacatt catatccact cctcacactc catgaaagca gtgaaatgtt 529 <210> 39 <211> 361

<212> DNA <213> Necator americanus <220> <221> CDS <222> (16)..(252) <220>

<221> MOD_RES <223> Sequência de cDNA recombinante de Molécula de NamNAP <400> 39 gccaactctt cgaac atg att cga ggc ctc gtt ctt ctt tct ctc ctg ttt 51 Met Ile Arg Gly Leu Vai Leu Leu Ser Leu Leu Phe 15 10 tgc gtc act ttt gca gcg aag aga gat tgt cca gca aat gag gaa tgg 99 Cys Vai Thr Phe Ala Ala Lys Arg Asp Cys Pro Ala Asn Glu Glu Trp 15 20 25 agg gaa tgt ggc act cca tgt gaa cca aaa tgc aat caa ccg atg cca 147 Arg Glu Cys Gly Thr Pro Cys Glu Pro Lys Cys Asn Gin Pro Met Pro 30 35 40 gat ata tgt act atg aat tgt ate gtc gat gtg tgt caa tgc aag gag 195 Asp Ile Cys Thr Met Asn Cys Ile Vai Asp Vai Cys Gin Cys Lys Glu 45 50 55 60 gga tac aag cgt cat gaa acg aag gga tgc tta aag gaa gga tea gct 243 Gly Tyr Lys Arg His Glu Thr Lys Gly Cys Leu Lys Glu Gly Ser Ala 65 70 75 gat tgt aaa taagttatca gaacgctcgt tttgtcttac attagatggg tgagctgatg 302 Asp Cys Lys tatctgtcag ataaactctt tcttctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 361

40 77 PRT <210> <211> <212> 234 ΡΕ0788546 <213> Ancyclostoma caninum <400> 40

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly 1 5 10 15 Thr Gin Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys Asn Glu Glu Pro Pro Glu Glu 20 25 30 Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser Arg Gly Cys Leu Leu Pro Pro Ala Cys 35 40 45 Vai Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Vai Ile Gly Asp Cys Vai 50 55 60 Arg Glu Glu Glu Cys Asp Gin His Glu Ile Ile His Vai 65 70 75 <210> 41 <211> 75

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 41

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Vai Cys Gly 1 5 10 15 Thr Lys Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys Ser Glu Glu Glu Glu Glu Asp 20 25 30 Pro Ile Cys Arg Ser Phe Ser Cys Pro Gly Pro Ala Ala Cys Vai Cys 35 40 45 Glu Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Vai Ile Gly Asp Cys Vai Lys Glu 50 55 60 Glu Glu Cys Asp Gin His Glu Ile Ile His Vai 65 70 75 <210> 42 <211> 74

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 42

Arg Thr Ala Arg Lys 1 5

Pro Pro Thr Cys Gly Glu Asn Glu Arg Vai Glu 10 15 ΡΕ0788546 - 235 -

Trp Cys Gly Lys Gin Cys Glu Ile Thr Cys Asp Asp Pro Asp Lys Ile 20 25 30 Cys Arg Ser Leu Ala Cys Pro Gly Pro Pro Ala Cys Vai Cys Asp Asp 35 40 45 Gly Tyr Tyr Arg Asp Thr Asn Vai Gly Leu Cys Vai Gin Tyr Asp Glu 50 55 60 Cys Asn Asp Met Asp Ile Ile Met Vai Ser 65 70 <210> 43 <211> 88 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 43 Lys Pro Ser Glu Lys Glu Cys Gly Pro His Glu Arg Leu Asp Cys Gly 1 5 10 15 Asn Lys Lys Pro Cys Glu Arg Lys Cys Lys Ile Glu Thr Ser Glu Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Tyr Glu Glu Gly Thr Glu Arg Phe Arg Cys Leu Leu Arg 35 40 45 Vai Cys Asp Gin Pro Tyr Glu Cys Ile Cys Asp Asp Gly Tyr Tyr Arg 50 55 60 Asn Lys Lys Gly Glu Cys Vai Thr Asp Asp Vai Cys Gin Glu Asp Phe 65 70 75 80 Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro 85 <210> 44 <211> 87 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 44 Arg Pro Glu Lys Lys Cys Gly Pro Gly Glu Arg Leu Ala Cys Gly Asn 1 5 10 15 Lys Lys Pro Cys Glu Arg Lys Cys Lys Ile Glu Thr Ser Glu Glu Glu 20 25 30 Asp Asp Tyr Pro Glu Gly Thr Glu Arg Phe Arg Cys Leu Leu Arg Vai 35 40 45 236 ΡΕ0788546

Cys Asp Gin Pro Tyr Glu Cys Ile Cys Asp Asp Gly Tyr Tyr Arg Asn 50 55 60 Lys Lys Gly Glu Cys Vai Thr Asp Asp Vai Cys Gin Glu Asp Phe Met 65 70 75 80 Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro 85 <210> 45

<211> 86 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <40 0> 45

Arg Pro Glu Lys Lys Cys Gly Pro Gly Glu Arg Leu Asp Cys Ala Asn 1 5 10 15 Lys Lys Pro Cys Glu Pro Lys Cys Lys Ile Glu Thr Ser Glu Glu Glu 20 25 30 Asp Asp Asp Vai Glu Asp Thr Asp Vai Arg Cys Leu Vai Arg Vai Cys 35 40 45 Glu Arg Pro Leu Lys Cys Ile Cys Lys Asp Gly Tyr Tyr Arg Asn Lys 50 55 60 Lys Gly Glu Cys Vai Thr Asp Asp Vai Cys Gin Glu Asp Phe Met Glu 65 70 75 80 Phe Ile Thr Phe Ala Pro 85 <210> 46

<211> 86 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 46

Arg Pro Glu Lys Lys Cys Gly Pro Gly Glu Arg Leu Asp Cys Ala Asn 1 5 10 15 Lys Lys Pro Cys Glu Pro Lys Cys Lys Ile Glu Thr Ser Glu Glu Glu 20 25 30 Asp Asp Asp Vai Glu Glu Thr Asp Vai Arg Cys Leu Vai Arg Vai Cys 35 40 45 Glu Arg Pro Leu Lys Cys Ile Cys Lys Asp Gly Tyr Tyr Arg Asn Lys 50 55 60 237 ΡΕ0788546

Lys Gly Glu Cys Vai Thr Asp Asp Vai Cys Gin Glu Asp Phe Met Glu 65 70 75 80 Phe Ile Thr Phe Ala Pro 85 <210> 47 <21: L> 78 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 47 Lys Ser Leu Trp Asp Gin Lys Cys Gly Glu Asn Glu Arg Leu Asp Cys 1 5 10 15 Gly Asn Gin Lys Asp Cys Glu Arg Lys Cys Asp Asp Lys Arg Ser Glu 20 25 30 Glu Glu Ile Met Gin Ala Cys Leu Thr Arg Gin Cys Leu Pro Pro Vai 35 40 45 Cys Vai Cys Glu Asp Gly Phe Tyr Arg Asn Asp Asn Asp Gin Cys Vai 50 55 60 Asp Glu Glu Glu Cys Asn Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro 65 70 75 <210> 48 <211> 89 <212> PRT <213> Ancyclostoma ceylanicum <400> 48 Lys Pro Asn Asn Vai Met Thr Asn Ala Cys Gly Leu Asn Glu Tyr Phe 1 5 10 15 Ala Glu Cys Gly Asn Met Lys Glu Cys Glu His Arg Cys Asn Glu Glu 20 25 30 Glu Asn Glu Glu Arg Asp Glu Glu Arg Ile Thr Ala Cys Leu Ile Arg 35 40 45 Vai Cys Phe Arg Pro Gly Ala Cys Vai Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg 50 55 60 Asn Arg Thr Gly Ser Cys Vai Glu Glu Asp Asp Cys Glu Tyr Glu Asn 65 70 75 80 Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro Glu 85 238 ΡΕ0788546 <210> 49

<211> 82 <212> PRT <213> Ancyclostoma ceylanicum <400> 49

Vai Pro Ile Cys Gly Ser Asn Glu Arg Tyr Ser Asp Cys Gly Asn Asp 1 5 10 15 Lys Gin Cys Glu Arg Lys Cys Asn Glu Asp Asp Tyr Glu Lys Gly Asp 20 25 30 Glu Ala Cys Arg Ser His Vai Cys Glu Arg Pro Gly Ala Cys Vai Cys 35 40 45 Glu Asp Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Ser Cys Vai Glu Ser Asp 50 55 60 Asp Cys Glu Tyr Asp Asn Met Asp Phe Ile Thr Phe Ala Pro Glu Thr 65 70 75 80 Ser Arg <210> 50 <211> 84 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 50 Lys Ser Ala Lys Lys Cys Gly Leu Asn Glu Lys Leu Asp Cys Gly Asn 1 5 10 15 Leu Lys Ala Cys Glu Lys Lys Cys Ser Asp Leu Asp Asn Glu Glu Asp 20 25 30 Tyr Lys Glu Glu Asp Glu Ser Lys Cys Arg Ser Arg Glu Cys Ser Arg 35 40 45 Arg Vai Cys Vai Cys Asp Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Gin 50 55 60 Cys Vai Thr Arg Asp Asp Cys Glu Tyr Asp Asn Met Glu Ile Ile Thr 65 70 75 80 Phe Pro Pro Glu <210> 51 <211> 84

<212> PRT 239 ΡΕ0788546 <213> Ancyclostoma caninum <400> 51

Lys Ser Ala Lys Lys Cys Gly Leu Asn Glu Lys Leu Asp Cys Gly Asn 1 5 10 15 Leu Lys Ala Cys Glu Lys Lys Cys Ser Asp Leu Asp Asn Glu Glu Asp 20 25 30 Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Lys Cys Arg Ser Arg Glu Cys Ile Gly 35 40 45 Arg Vai Cys Vai Cys Asp Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Gin 50 55 60 Cys Vai Thr Arg Asp Asp Cys Glu Tyr Asp Asn Met Glu Ile Ile Thr 65 70 75 80 Phe Pro Pro Glu <210> 52 <21: L> 83 <212> PRT <213> Ancyclostoma duodenale <400> 52 Lys Ala Ala Lys Lys Cys Gly Leu Asn Glu Arg Leu Asp Cys Gly Asn 1 5 10 15 Leu Lys Gin Cys Glu Pro Lys Cys Ser Asp Leu Glu Ser Glu Glu Tyr 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ser Lys Cys Arg Ser Arg Glu Cys Ser Arg Arg 35 40 45 Vai Cys Vai Cys Asp Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Lys Cys 50 55 60 Vai Ala Lys Asp Vai Cys Glu Asp Asp Asn Met Glu Ile Ile Thr Phe 65 70 75 80 Pro Pro Glu <210> 53 <211> 78

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 53 240 ΡΕ0788546

Asp Lys Cys Gly Pro Asp Glu Trp Phe Asp Trp Cys Gly Thr Tyr Lys 1 5 10 15 Gin Cys Glu Arg Lys Cys Asn Lys Glu Leu Ser Glu Lys Asp Glu Glu 20 25 30 Ala Cys Leu Ser Arg Ala Cys Thr Gly Arg Ala Cys Vai Cys Asn Asp 35 40 45 Gly Leu Tyr Arg Asp Asp Phe Gly Asn Cys Vai Glu Lys Asp Glu Cys 50 55 60 Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys His 65 70 75 <210> 54 <211> 78 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 54 Asp Lys Cys Gly Pro Asp Glu Trp Phe Asp Trp Cys Gly Thr Tyr Lys 1 5 10 15 Gin Cys Glu Arg Lys Cys Ser Glu Glu Leu Ser Glu Lys Asn Glu Glu 20 25 30 Ala Cys Leu Ser Arg Ala Cys Thr Gly Arg Ala Cys Vai Cys Asn Asp 35 40 45 Gly Leu Tyr Arg Asp Asp Phe Gly Asn Cys Vai Glu Lys Asp Glu Cys 50 55 60 Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys His 65 70 75 <210> 55 <211> 77

<212> PRT <213> Ancyclostoma duodenale <4 0 0> 55

Lys Cys Pro Thr Asp Glu Trp Phe Asp Trp Cys Gly Thr Tyr Lys His 1 5 10 15 Cys Glu Leu Lys Cys Asp Arg Glu Leu Thr Glu Lys Glu Glu Gin Ala 20 25 30 Cys Leu Ser Arg Vai Cys Glu Lys Ser Ala Cys Vai Cys Asn Asp Gly 35 40 45 241 ΡΕ0788546

Leu Tyr 50 Arg Asp Lys Phe Gly 55 Asn Cys Vai Glu Lys 60 Asp Glu Cys Asn Asp 65 Met Glu Ile Ile Thr 70 Phe Ala Pro Glu Glu 75 Thr Lys <210> 56 <211> 78 <212> PRT <213> Ancyclostoma duodenale <400> 56 Asp Glu Cys Gly Pro Asp Glu Trp Phe Asp Tyr Cys Gly Asn Tyr Lys 1 5 10 15 Lys Cys Glu Arg Lys Cys Ser Glu Glu Thr Ser Glu Lys Asn Glu Glu 20 25 30 Ala Cys Leu Ser Arg Ala Cys Thr Gly Arg Ala Cys Vai Cys Lys Asp 35 40 45 Gly Leu Tyr Arg Asp Asp Phe Gly Asn Cys Vai Pro His Asp Glu Cys 50 55 60 Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys His 65 70 75 <210> 57 <21: L> 75 <212> PRT <213> Ancyclostoma ceylanicum <400> 57 Lys Ala Phe Pro Lys Cys Asp Vai Asn Glu Arg Phe Glu Vai Cys Gly 1 5 10 15 Asn Leu Lys Glu Cys Glu Leu Lys Cys Asp Glu Asp Pro Lys Ile Cys 20 25 30 Ser Arg Ala Cys Ile Arg Pro Pro Ala Cys Vai Cys Asp Asp Gly Phe 35 40 45 Tyr Arg Asp Lys Tyr Gly Phe Cys Vai Glu Glu Asp Glu Cys Asn Asp 50 55 60 Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys 65 70 75 242 ΡΕ0788546 <210> 58 <211> 77

<212> PRT <213> Ancyclostoma ceylanicum <400> 58

Arg Thr Vai Lys Lys Cys Gly Lys Asn Glu Arg Tyr Asp Asp Cys Gly 1 5 10 15 As η Ala Lys Asp Cys Glu Thr Lys Cys Gly Glu Glu Glu Lys Vai Cys 20 25 30 Arg Ser Arg Glu Cys Thr Ser Pro Gly Ala Cys Vai Cys Glu Gin Gly 35 40 45 Phe Tyr Arg Asp Pro Ala Gly Asp Cys Vai Thr Asp Glu Glu Cys Asp 50 55 60 Glu Trp Asn Asn Met Glu Ile Ile Thr Met Pro Lys Gin 65 70 75 <210> 59 <211> 84 <21; >> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 59 Lys Ala Thr Met Gin Cys Gly Glu Asn Glu Lys Tyr Asp Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Lys Glu Cys Asp Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Gly Vai Glu Glu Glu 20 25 30 Asp Asp Glu Glu Pro Asn Vai Pro Cys Leu Vai Arg Vai Cys His Gin 35 40 45 Asp Cys Vai Cys Glu Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Asp Asp Lys Cys 50 55 60 Vai Ser Ala Glu Asp Cys Glu Leu Asp Asn Met Asp Phe Ile Tyr Pro 65 70 75 80 Gly Thr Arg Asn <210 > 60 <211> 58

<212> PRT 243 ΡΕ0788546 <213> Heligmosomoides polygyrus <40 0> 60

Lys Thr Cys Gly Pro Asn Glu Glu Tyr Thr Glu Cys Gly Thr Pro Cys 1 5 10 15 Glu Pro Lys Cys Asn Glu Pro Met Pro Asp Ile Cys Thr Leu Asn Cys 20 25 30 Ile Vai Asn Vai Cys Gin Cys Lys Pro Gly Phe Lys Arg Gly Pro Lys 35 40 45 Gly Cys Vai Ala Pro Gly Pro Gly Cys Lys 50 55 <210> 61 <211> 61 <212> PRT <213> Necator americanus <400> 61 Lys Arg Asp Cys Pro Ala Asn Glu Glu Trp Arg Glu Cys Gly Thr Pro 1 5 10 15 Cys Glu Pro Lys Cys Asn Gin Pro Met Pro Asp Ile Cys Thr Met Asn 20 25 30 Cys Ile Vai Asp Vai Cys Gin Cys Lys Glu Gly Tyr Lys Arg His Glu 35 40 45 Thr Lys Gly Cys Leu Lys Glu Gly Ser Ala Asp Cys Lys 50 55 60 <210> 62 <211> 171 <212> PRT <213> Ancyclostoma ceylanicum <400> 62 Lys Pro Asn Asn Vai Met Thr Asn Ala Cys Gly Leu Asn Glu Tyr Phe 1 5 10 15 Ala Glu Cys Gly Asn Met Lys Glu Cys Glu His Arg Cys Asn Glu Glu 20 25 30 ΡΕ0788546 - 244 -

Glu Asn Glu Glu Arg Asp Glu Glu Arg Ile Thr Ala Cys Leu Ile Arg 35 40 45 Vai Cys Phe Arg Pro Gly Ala Cys Vai Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg 50 55 60 Asn Arg Thr Gly Ser Cys Vai Glu Glu Asp Asp Cys Glu Tyr Glu Asn 65 70 75 80 Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro Glu Vai Pro Ile Cys Gly Ser Asn 85 90 95 Glu Arg Tyr Ser Asp Cys Gly Asn Asp Lys Gin Cys Glu Arg Lys Cys 100 105 110 Asn Glu Asp Asp Tyr Glu Lys Gly Asp Glu Ala Cys Arg Ser His Vai 115 120 125 Cys Glu Arg Pro Gly Ala Cys Vai Cys Glu Asp Gly Phe Tyr Arg Asn 130 135 140 Lys Lys Gly Ser Cys Vai Glu Ser Asp Asp Cys Glu Tyr Asp Asn Met 145 150 155 160 Asp Phe Ile Thr Phe Ala Pro Glu Thr Ser Arg 165 170 <210> 63 <211> 162 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 63 Lys Ser Ala Lys Lys Cys Gly Leu Asn Glu Lys Leu Asp Cys Gly Asn 1 5 10 15 Leu Lys Ala Cys Glu Lys Lys Cys Ser Asp Leu Asp Asn Glu Glu Asp 20 25 30 Tyr Lys Glu Glu Asp Glu Ser Lys Cys Arg Ser Arg Glu Cys Ser Arg 35 40 45 Arg Vai Cys Vai Cys Asp Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Gin 50 55 60 Cys Vai Thr Arg Asp Asp Cys Glu Tyr Asp Asn Met Glu Ile Ile Thr 65 70 75 80 Phe Pro Pro Glu Asp Lys Cys Gly Pro Asp Glu Trp Phe Asp Trp Cys 85 90 95 Gly Thr Tyr Lys Gin Cys Glu Arg Lys Cys Asn Lys Glu Leu Ser Glu 100 105 110 Lys Asp Glu Glu Ala Cys Leu Ser Arg Ala Cys Thr Gly Arg Ala Cys 115 120 125 245 ΡΕ0788546

Vai Cys Asn Asp Gly Leu Tyr Arg Asp Asp Phe Gly Asn Cys Vai Glu 130 135 140 Lys Asp Glu Cys Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr 145 150 155 160 Lys His <210> 64 <21: L> 162 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 64 Lys Ser Ala Lys Lys Cys Gly Leu Asn Glu Lys Leu Asp Cys Gly Asn 1 5 10 15 Leu Lys Ala Cys Glu Lys Lys Cys Ser Asp Leu Asp Asn Glu Glu Asp 20 25 30 Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Lys Cys Arg Ser Arg Glu Cys Ile Gly 35 40 45 Arg Vai Cys Vai Cys Asp Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Gin 50 55 60 Cys Vai Thr Arg Asp Asp Cys Glu Tyr Asp Asn Met Glu Ile Ile Thr 65 70 75 80 Phe Pro Pro Glu Asp Lys Cys Gly Pro Asp Glu Trp Phe Asp Trp Cys 85 90 95 Gly Thr Tyr Lys Gin Cys Glu Arg Lys Cys Ser Glu Glu Leu Ser Glu 100 105 110 Lys Asn Glu Glu Ala Cys Leu Ser Arg Ala Cys Thr Gly Arg Ala Cys 115 120 125 Vai Cys Asn Asp Gly Leu Tyr Arg Asp Asp Phe Gly Asn Cys Vai Glu 130 135 140 Lys Asp Glu Cys Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr 145 150 155 160 Lys His <210 > 65

<211> 161 <212> PRT <213> Ancyclostoma duodenale 246 ΡΕ0788546 <4 Ο 0> 65

Lys Ala Ala Lys Lys Cys Gly Leu Asn Glu Arg Leu Asp Cys Gly Asn 1 5 10 15 Leu Lys Gin Cys Glu Pro Lys Cys Ser Asp Leu Glu Ser Glu Glu Tyr 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ser Lys Cys Arg Ser Arg Glu Cys Ser Arg Arg 35 40 45 Vai Cys Vai Cys Asp Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Lys Cys 50 55 60 Vai Ala Lys Asp Vai Cys Glu Asp Asp Asn Met Glu Ile Ile Thr Phe 65 70 75 80 Pro Pro Glu Asp Glu Cys Gly Pro Asp Glu Trp Phe Asp Tyr Cys Gly 85 90 95 Asn Tyr Lys Lys Cys Glu Arg Lys Cys Ser Glu Glu Thr Ser Glu Lys 100 105 110 Asn Glu Glu Ala Cys Leu Ser Arg Ala Cys Thr Gly Arg Ala Cys Vai 115 120 125 Cys Lys Asp Gly Leu Tyr Arg Asp Asp Phe Gly Asn Cys Vai Pro His 130 135 140 Asp Glu Cys Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys 145 150 155 160

His < 210 > 66 <211> 9

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (4) 247 ΡΕ0788546 <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (9) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 66

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 LO

<210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido 248 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (9) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 67

Cys 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 249 ΡΕ0788546

<210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (D <223> Xaa é qualquer aminoácido, desde que pelo menos um de Xaa na localização 1 seja Glu ou Asp <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido, desde que pelo menos um de Xaa na localização 1 seja Glu ou Asp <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 68 250 ΡΕ0788546

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 69 Gly Phe ! Tyr Arg Asp 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 70 Gly Phe i Tyr Arg Asn 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 71 Gly Tyr Tyr Arg Asp 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 72 251 ΡΕ0788546

Gly Tyr Tyr Arg Asn 1 5 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 73 Gly Leu i Tyr Arg Asp 1 5 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 74 Glu Ile i Ile His Vai 1 5 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 75 Asp Ile i Ile Met Vai 1 5 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 76 252 ΡΕ0788546

Phe Ile Thr Phe Ala Pro

1 LO <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 77

Met Glu Ile Ile Thr

1 LO

<210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (D <223> Xaa é qualquer aminoácido, desde que pelo menos um Xaa seja Glu ou Asp <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido, desde que pelo menos um Xaa seja Glu ou Asp <400> 78

Xaa Xaa Gly Phe Tyr Arg Asp

1 LO <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> 253 ΡΕ0788546 <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1) <223> Xaa é qualquer aminoácido, desde que pelo menos um Xaa seja Glu ou Asp <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido, desde que pelo menos um Xaa seja Glu ou Asp <400> 79

Xaa Xaa Gly Phe Tyr Arg Asn 1 5 <210> 80 <211> 7

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1) <223> Xaa é qualquer aminoácido, desde que pelo menos um Xaa seja Glu ou Asp <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido, desde que pelo menos um Xaa seja Glu ou Asp <400> 80

Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Arg Asp 1 5 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum ΡΕ0788546 254 <220> <221> CARACTERÍSTICA_ .MI SC <222> (D <223> Xaa é qualquer aminoácido ou Asp <220> <221> CARACTERÍSTICA_ .MI SC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido ou Asp <400> 81 Xaa Xaa l Gly Tyr Tyr Arg Asn 1 5 desde que pelo menos um Xaa seja Glu desde que pelo menos um Xaa seja Glu <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (D <223> ou Asp Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) <223> ou Asp Xaa é qualquer aminoácido <400> 82 Xaa Xaa Gly Leu Tyr Arg Asp 1 5 desde que pelo menos um Xaa seja Glu desde que pelo menos um Xaa seja Glu

<210> 83 <211> 9 <212> PRT 255 ΡΕ0788546 <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (9) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 83 256 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 84 <211> 4

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1) <223> Xaa é Leu <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (3) <223> Xaa é Arg <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 84

Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 85 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (D <223> Xaa é qualquer aminoácido 257 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 85

Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5) 258 ΡΕ0788546 <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (9) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 86

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 259 ΡΕ0788546 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (9) <223> Xaa é qualquer aminoácido 260 ΡΕ0788546 <4 0 0> 87

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 LO <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 88 tcagacatgt ataatctcat gttgg 25 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotídica YG101 <400> 89 aaggcatacc cggagtgtgc tg 22 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> Base_modificada <222> (3) <223> "r" representa a ou g 261 ΡΕ0788546 <220> <221> Base_modificada <222> (6) <223> "n" representa qualquer base <220> <221> Base_modificada <222> (9) <223> "y" representa c ou t <220> <221> Base_modificada <222> (12) <223> "r" representa a ou g <220> <221> Base_modificada <222> (13) <223> "m" representa a ou c <220> <221> Base_modificada <222> (18) <223> "n" representa qualquer base <220> <221> Base_modificada <222> (21) <223> "y" representa c ou t <400> 90 aarccntgyg armggaartg y 21 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> Base_modifiçada <222> (2) <223> "w" representa a ou t ΡΕ0788546 262 <220> <221> Base_modificada <222> (3) <223> "r" representa a ou g <220> <221> Base_modificada <222> (4) <223> "w" representa a ou t <220> <221> Base_modificada <222> (6) <223> "n" representa qualquer base <220> <221> Base_modificada <222> (9) <223> "r" representa a ou g <220> <221> Base_modificada <222> (12) <223> "y" representa c ou t <220> <221> Base_modificada <222> (15) <223> "r" representa a ou g <220> <221> Base_modificada <222> (18) <223> "r" representa a ou g <220> <221> Base_modificada <222> (21) <223> "r" representa a ou g <400> 91 twrwanccnt cyttrcanac rca 23 263 ΡΕ0788546

<210> 92 <211> 13 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 92

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp 1 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 93

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp 1 5 10 <210> 94 <211> 33 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> Base_modificada <222> (3) <223> "r" representa a ou g <220> <221> Base_modificada <222> (6) <223> "n" representa Inosina <220> <221> Base_modificada <222> (9) <223> "y" representa c ou t <220> <221> Base_modificada 264 ΡΕ0788546 <222> (12) <223> "n" representa Inosina <220> <221> Base_modificada <222> (15) <223> "r" representa a ou g <220> <221> Base_modificada <222> (18) <223> "y" representa c ou t <220> <221> Base_modificada <222> (21) <223> "r" representa a ou g <220> <221> Base_modificada <222> (24) <223> "r" representa a ou g <220> <221> Base_modificada <222> (27) <223> "y" representa c ou t <220> <221> Base_modificada <222> (30) <223> "r" representa a ou g <400> 94 aargcntayc cngartgygg ngaraaygar tgg <210> 95 <211> 28 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum 265 ΡΕ0788546 <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica <400> 95 aattcgcggc cgcttttttt tttttttt 28 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 96 24 ggtggcgacg actcctggag cccg <210> 97 <211> 20 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 97 Cys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly 1 5 10 15 Gin Lys Pro 20 <210> 98 <211> 10 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 98 cggaattccg 10 <210> 99 <211> 18 266 ΡΕ0788546 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 99 tggcctagcg tcaggagt 18 <210> 100 <211> 18 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 100 cctgacgcta ggccatgg 18 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 101 agcggataac aatttcacac agga 24 <210> 102 <211> 66 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 102 atgttctctc caattttgtc cttggaaatt attttagctt tggctacttt gcaatctgtc 60 ttcgct 66 <210> 103 <211> 57 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum 267 ΡΕ0788546 <4 Ο 0> 103 cagccaggta tctccactac cgttggttcc gctgccgagg gttctttgga caagagg <210> 104 <211> 51 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 104 cctatccgcg gaattcagat ctgaatgcgg ccgctcgaga ctagtggatc c <210> 105 <211> 41 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica YG103 <400> 105 gctcgctcta gaagcttcag acatgtataa tctcatgttg g <210> 106 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 106

Lys Ala Tyr Pro Glu

1 LO <210> 107 <211> 36 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum 268 ΡΕ0788546 <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica YG102 <400> 107 gaccagtcta gacaatgaag atgctttacg ctatcg 36 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 108 23 gtgggagacc tgatactctc aag <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 109 Arg Thr Vai Arg Lys Ala Tyr 1 5 <210> 110 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <400> 110 Arg Thr Vai Arg Lys 1 5 <210> 111 269 ΡΕ0788546 <211> 33

<212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc

<223> Descrição da Sequência Artificial: fragmento de sequência iniciadora de PCR amplificada por vector pDONG <400> 111 33 atccgaagct ttgctaacat actgcgtaat aag

<210> 112 <211> 60 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <223> Descrição da Sequência Artificial: fragmento de sequência

iniciadora de PCR amplificada por vector pDONG <400> 112 tatgggatgg ccgacttggc ctccgcctga gcctccacct ttatcccaat ccaaataaga 60 <210> 113

<211> 60 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <223> Descrição da Sequência Artificial: fragmento de sequência

iniciadora de PCR amplificada por vector pDONG <400> 113 atgggatggc cgacttggcc ctccgcctga gcctccacct ttatcccaat ccaaataaga 60 270 ΡΕ0788546 <210> 114

<211> 60 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <223> Descrição da Sequência Artificial: fragmento de sequência

iniciadora de PCR amplificada por vector pDONG <400> 114 tatgggatgg ccgacttggc cgatccgcct gagcctccac ctttatccca atccaaataa 60 <210> 115 <211> 45

<212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <223> Descrição da Sequência Artificial: fragmento de sequência

iniciadora de PCR amplificada por vector pDONG <400> 115 45 aggaggggat ccgcggccgc gtgatatggg atggccgact tggcc <210> 116 <211> 24

<212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência iniciadora pUC119 <400> 116 24 cgccagggtt ttcccagtca cgac 271 ΡΕ0788546 <210> 117 <211> 28 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <400> 117 gtttcgagtt ccgggatata taaagtcc 28 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Necator americanus <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5) <223> Xaa é Arg, Pro ou Lys <400> 118

Lys Pro Cys Glu Xaa Lys Cys

1 LO <210> 119 <211> 8 <212> PRT <213> Necator americanus <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) <223> Xaa é Val,Ile ou Gin <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4) <223> Xaa é Lys,Asp,Glu ou Gin <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5) 272 ΡΕ0788546 <223> Xaa é Asp ou Glu <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (7) <223> Xaa é Phe ou Tyr <400> 119

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Gly Xaa Tyr

1 LO <210> 120 <211> 44 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica <400> 120 gaccagtcta gaccaccatg gcggtgcttt attcagtagc aata 44 <210> 121 <211> 40 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica <400> 121 gctcgctcta gattatcgtg aggtttctgg tgcaaaagtg 40 122 <210> <211> 24 273 ΡΕ0788546 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica <400> 122 aaagcaacga tgcagtgtgg tgag 24 <210> 123 <211> 47 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica <400> 123 gctcgctcta gaagcttcag tttcgagttc cgggatatat aaagtcc 47 <210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica <400> 124 gagactttta aatcactgtc ggatcagaag 30 <210> 125 <211> 33 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum 274 ΡΕ0788546 <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica <400> 125 ttcaggacta gttcatggtg cgaaagtaat aaa 33 <210> 126 <211> 28 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica <400> 126 gcgtttaaag caacgatgca gtgtggtg 28 <210> 127 <211> 46 <212> DNA <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> característica_misc <223> Sequência iniciadora oligonucleotidica <400> 127 cgctctagaa gcttcatggg tttcgagttc cgggatatat aaagtc 46 <210> 128 <211> 91 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 128 <400> ΡΕ0788546 - 275 -

Leu Vai Ser Tyr Cys Ser Gly Lys Ala Thr Met Gin Cys Gly Glu Asn 1 5 10 15 Glu Lys Tyr Asp Ser Cys Gly Ser Lys Glu Cys Asp Lys Lys Cys Lys 20 25 30 Tyr Asp Gly Vai Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro Asn Vai Pro Cys 35 40 45 Leu Vai Arg Vai Cys His Gin Asp Cys Vai Cys Glu Glu Gly Phe Tyr 50 55 60 Arg Asn Lys Asp Asp Lys Cys Vai Ser Ala Glu Asp Cys Glu Leu Asp 65 70 75 80 Asn Met Asp Phe Ile Tyr Pro Gly Thr Arg Asn 85 90 <210> 129 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 129 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 130

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 276 ΡΕ0788546 <210> 131 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 131

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 132

Cys Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 133 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 133 277 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Cys 1 <210> 134

<211> 21 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(21) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 134

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 135 <211> 20 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(20) <223> Xaa é qualquer aminoácido 278 ΡΕ0788546 <4 Ο 0> 135

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 136 <211> 19

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(19) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 136

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa <210> 137 <211> 18 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (D . . (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido 279 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(18) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 137

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa <210> 138 <211> 17

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(17) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 138

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa <210> 139 <211> 16 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 280 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(16) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 139

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 140 <211> 15

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 140

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 141 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

CARACTERÍSTICA MISC <221> 281 ΡΕ0788546 <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 141

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 142 <211> 13

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(13) <223> Xaa é any amino aicd <400> 142

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 143 <211> 12 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido 282 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(12) <223> Xaa ia any amino aicd <400> 143 Xaa Xaa . Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 144 <211> 11 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(11) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 144

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 145

<211> 10 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220>

CARACTERÍSTICA MISC <221> ΡΕ0788546 283 <222> (5) . . (10) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 145 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Xaa 10 <210> 146 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 146 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 147 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 147

Cys Xaa Xaa Xaa 1

<210> 148 <211> 6 <212> PRT 284 ΡΕ0788546 <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 148

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 149

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 150 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 150

Cys Xaa Xaa Xaa 1 285 ΡΕ0788546 <210> 151 <211> 15

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 151

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 152 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (4)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 152

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 153 <211> 13 286 ΡΕ0788546 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4)..(13) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 153

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 154 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 154

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys

1 LO <210> 155 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido 287 ΡΕ0788546 <4 Ο 0> 155

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 156 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 156

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 157 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 157

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 158 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> ΡΕ0788546 <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 158 Cys Xaa . Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 159 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 159 Cys Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 160 <211> 23 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(23) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 160 ΡΕ0788546 289

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 Xaa Xaa Xaa <210> 161 <211> 22 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(22) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 161

Xaa Xaa Xaa Cys 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20

Xaa Xaa <210> 162 <211> 21 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_ _MI SC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> ΡΕ0788546 290 <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(21) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 162 Xaa Xaa Xaa Cys 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20

Xaa <210> 163 <211> 20 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(20) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 163 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 164 <211> 19 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 291 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(19) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 164

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa <210> 165

<211> 18 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(18) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 165

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa 292 ΡΕ0788546 <210> 166 <211> 17

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(17) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 166

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa <210> 167

<211> 16 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(16) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 167 10 15

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 293 ΡΕ0788546 <210> 168 <211> 15

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 168

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 169 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(14) <223> Xaa é any amino aicd <400> 169

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 170 <211> 13 294 ΡΕ0788546

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(13) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 170

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 171

<211> 12 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(12) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 171

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 172 <211> 11 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 295 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(11) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 172

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 173

<211> 10 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(10) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 173

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 174 <211> 5

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

CARACTERÍSTICA MISC <221> 296 ΡΕ0788546

<222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoác. <40 0> 174 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 175 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERíSTICA_ _MI SC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoác. <400> 175 Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 176 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_ _MI SC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoác. <400> 176 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 177 <211> 5 <212> PRT 297 ΡΕ0788546 <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 177 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 178 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 178 Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 179 <211> 15 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido 298 ΡΕ0788546 <4 Ο 0> 179

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 180 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (4)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 180

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10

<210> 181 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 181

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 182 299 ΡΕ0788546 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 182 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 183 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 183 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 184 <211> 26 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(26) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 184 300 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 185 <211> 25 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(25) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 185

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 186 <211> 24 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(24) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 186

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 301 ΡΕ0788546

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 187 <211> 23 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(23) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 187

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 188 <211> 22 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(22) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 188

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 302 ΡΕ0788546 <210> 189

<211> 21 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(21) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 189

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 190

<211> 20 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(20) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 190

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 191 <211> 19 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 303 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(19) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 191

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa <210> 192

<211> 18 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(18) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 192

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa <210> 193 <211> 17 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(17) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 193 304 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa <210> 194

<211> 16 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(16) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 194

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 195 <211> 15

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 195

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 196 <211> 14 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 305 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 196

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 197 <211> 13 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(13) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 197

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 198 <211> 12 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(12) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 198

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 10 1 5 306 ΡΕ0788546 <210> 199

<211> 11 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(11) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 199

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10

<210> 200 <211> 10 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(10) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 200

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 201 <211> 9 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(9) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 201 307 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 LO <210> 202 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 202

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 LO <210> 203 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 203

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 LO <210> 204 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) 308 ΡΕ0788546 <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 204

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 205 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 205

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 206 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 206

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 207 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 309 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 207 Cys Xaa . Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 208 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 208 Cys Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 209 <211> 23 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(23) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 209 ΡΕ0788546 310

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 Xaa Xaa Xaa <210> 210 <211> 22 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(22) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 210

Xaa Xaa Xaa Cys 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20

Xaa Xaa <210> 211 <211> 21 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_ _MI SC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> ΡΕ0788546 311 <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(21) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 211 Xaa Xaa Xaa Cys 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20

Xaa <210> 212 <211> 20 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(20) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 212 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 213 <211> 19 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 312 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(19) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 213

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa <210> 214

<211> 18 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(18) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 214

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa 313 ΡΕ0788546 <210> 215 <211> 17

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(17) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 215

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa

<210> 216 <211> 16 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(16) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 216 314 ΡΕ0788546

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 217 <211> 15

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 217

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 218 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 218

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 315 ΡΕ0788546 <210> 219 <211> 13

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(13) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 219

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10

<210> 220 <211> 12 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(12) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 220

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 221 <211> 11 316 ΡΕ0788546

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(11) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 221

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 222 <211> 10 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(10) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 222

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 223 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 317 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 223

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

<210> 224 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 224

Cys Xaa Xaa Xaa 1

<210> 225 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 225

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 226 318 ΡΕ0788546 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 226

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 227 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 227

Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 228 <211> 15 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4)..(15) 319 ΡΕ0788546 <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 228

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 229 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (4)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 229

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 230

<211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 230

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 320 ΡΕ0788546 <210> 231 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 231 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 232 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 232 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 233 <211> 26 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(26) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 233 321 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 234 <211> 25 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(25) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 234

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 235 <211> 24 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(24) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 235

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 322 ΡΕ0788546

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 236 <211> 23 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(23) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 236

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 237 <211> 22 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(22) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 237

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 323 ΡΕ0788546 <210> 238

<211> 21 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(21) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 238

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 239

<211> 20 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(20) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 239

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 240 <211> 19 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 324 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(19) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 240

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa <210> 241

<211> 18 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(18) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 241

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa <210> 242 <211> 17 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(17) <223> Xaa é qualquer aminoácido 325 ΡΕ0788546 <4 Ο 0> 242

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa <210> 243

<211> 16 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(16) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 243

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 244 <211> 15

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 244

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 245 <211> 14 326 ΡΕ0788546

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 245

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 246 <211> 13 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(13) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 246

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 247 <211> 12 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(12) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 247

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 10 1 5 327 ΡΕ0788546 <210> 248

<211> 11 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(11) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 248

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 249

<211> 10 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(10) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 249

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 250 <211> 9 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(9) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 250 328 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 251 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 251 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 252 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 252 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 253 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) 329 ΡΕ0788546 <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 253

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 254 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 254

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 255 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 255

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 256 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 330 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 256 Cys Xaa . Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 257 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 257 Cys Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 258 <211> 23 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(23) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 258 ΡΕ0788546 331

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 Xaa Xaa Xaa <210> 259 <211> 22 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(22) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 259

Xaa Xaa Xaa Cys 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20

Xaa Xaa <210> 260 <211> 21 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_ _MI SC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> ΡΕ0788546 332 <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(21) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 260 Xaa Xaa Xaa Cys 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20

Xaa <210> 261 <211> 20 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(20) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 261 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 262 <211> 19 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 333 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(19) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 262

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa <210> 263

<211> 18 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(18) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 263

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa <210> 264 334 ΡΕ0788546 <211> 17

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(17) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 264

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa <210> 265

<211> 16 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(16) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 265

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 335 ΡΕ0788546 <210> 266 <211> 15

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 266

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 267 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 267

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 268 <211> 13 336 ΡΕ0788546

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(13) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 268

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 269

<211> 12 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(12) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 269

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 270 <211> 11 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 337 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(11) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 270

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 271

<211> 10 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(10) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 271

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 272 <211> 5

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

CARACTERÍSTICA MISC <221> 338 ΡΕ0788546

<222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoác. <40 0> 272 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 273 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERíSTICA_ _MI SC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoác. <400> 273 Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 274 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_ _MI SC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoác. <400> 274 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 275 <211> 5 <212> PRT 339 ΡΕ0788546 <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 275 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 276 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 276 Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 277 <211> 15 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido 340 ΡΕ0788546 <4 0 0> 277

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 278 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (4)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 278

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 279 <211> 13 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4)..(13) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 279 341 ΡΕ0788546

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 280 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 280

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 LO <210> 281 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 281

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 LO <210> 282 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) ΡΕ0788546 342 <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 282 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 283 <211> 26 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(26) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 283

Cys Xaa Xaa Xaa 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 25 <210> 284 <211> 25 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(25) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 284 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 343 ΡΕ0788546

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 285 <211> 24 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(24) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 285

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 286 <211> 23 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(23) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 286

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 344 ΡΕ0788546 <210> 287 <211> 22 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(22) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 287

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 288 <211> 21 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(21) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 288

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 289 <211> 20 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 345 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERíSTICA_ _MI SC <222> (2)..(20) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 289

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 290 <211> 19 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(19) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 290

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa <210> 291 <211> 18 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(18) 346 ΡΕ0788546 <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 291

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa <210> 292 <211> 17

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(17) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 292

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa <210> 293 <211> 16 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(16) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 293 347 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 294 <211> 15

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 294

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 295 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 295

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 296 <211> 13 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(13) 348 ΡΕ0788546 <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 296

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 297

<211> 12 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(12) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 297

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 298

<211> 11 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(11) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 298

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 299 <211> 10 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 349 ΡΕ0788546 <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(10) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 299

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 300 <211> 9

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(9) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 300

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 301

<211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 301

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 302 350 ΡΕ0788546 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 302 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 303 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 303 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 304 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 304 ΡΕ0788546 351

Cys 1

Xaa Xaa Xaa Xaa 5 <210 <211 <212 <213 <220 <221 <222 <223 <400 Cys 1 > 305 > 4 > PRT > Ancyclostoma caninum > > CARACTERÍSTICA_ _MI SC > (2)..(4) > Xaa é qualquer amino. > 305

Xaa Xaa Xaa <210 <211 <212 <213 <220 <221 <222 <223 <400 Cys 1 > 306 > 3 > PRT > Ancyclostoma caninum > > CARACTERÍSTICA_ _MI SC > (2)..(3) > Xaa é qualquer amino. > 306

Xaa Xaa <210 <211 <212 <213 <220 <221 <222 > 307 > 2 > PRT > Ancyclostoma caninum > > CARACTERÍ STICA_MISC> (2)..(2) 352 ΡΕ0788546 <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 307

Cys Xaa 1 <210> 308 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 308

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 309 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 309

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 310 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 353 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 310 Cys Xaa . Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 311 <211> 5 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 311 Cys Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 312 <211> 23 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(23) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 312 ΡΕ0788546 354

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 Xaa Xaa Xaa <210> 313 <211> 22 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(22) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 313

Xaa Xaa Xaa Cys 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20

Xaa Xaa <210> 314 <211> 21 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_ _MI SC <222> (D · · (3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> ΡΕ0788546 355 <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(21) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 314 Xaa Xaa Xaa Cys 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20

Xaa <210> 315 <211> 20 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(20) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 315 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 316 <211> 19 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 356 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(19) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 316

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa <210> 317

<211> 18 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(18) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 317

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa 357 ΡΕ0788546 <210> 318 <211> 17

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(17) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 318

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa <210> 319

<211> 16 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(16) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 319

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 358 ΡΕ0788546 <210> 320 <211> 15

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 320

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 321 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 321

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 322 <211> 13 359 ΡΕ0788546

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(13) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 322

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 323

<211> 12 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (5)..(12) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 323

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 324 <211> 11 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 360 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(11) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 324

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 325

<211> 10 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (1)..(3) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (5)..(10) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 325

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 326 <211> 5

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

CARACTERÍSTICA MISC <221> 361 ΡΕ0788546 <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoác <40 0> 326 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 327 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoác <400> 327 Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 328 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoác <400> 328 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

<210> 329 <211> 5 <212> PRT 362 ΡΕ0788546 <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 329 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 330 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 330 Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 331 <211> 15 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido 363 ΡΕ0788546 <4 Ο 0> 331

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 332 <211> 14

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (4)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 332

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 333

<211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 333

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 334 364 ΡΕ0788546 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <40 0> 334 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 335 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 335 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 336 <211> 26 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(26) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 336 365 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 337 <211> 25 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(25) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 337

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 338 <211> 24 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(24) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 338

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 366 ΡΕ0788546

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 339 <211> 23 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(23) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 339

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 340 <211> 22 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(22) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 340

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 367 ΡΕ0788546 <210> 341

<211> 21 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(21) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 341

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 342

<211> 20 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(20) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 342

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 343 <211> 19 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 368 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(19) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 343

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa <210> 344

<211> 18 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(18) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 344

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa <210> 345 <211> 17 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(17) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 345 369 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa <210> 346

<211> 16 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(16) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 346

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 347 <211> 15

<212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(15) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 347

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 348 <211> 14 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum 370 ΡΕ0788546 <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(14) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 348

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 349 <211> 13 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(13) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 349

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 350 <211> 12 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(12) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 350

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 10 1 5 371 ΡΕ0788546 <210> 351

<211> 11 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(11) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 351

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 352

<211> 10 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(10) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 352

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 353 <211> 9 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(9) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 353 372 ΡΕ0788546

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 354 <211> 8 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2) . . (8) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 354 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 355 <211> 7 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(7) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 355 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 356 <211> 6 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(6) 373 ΡΕ0788546 <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 356 Cys Xaa Xaa 1 Xaa Xaa Xaa 5 <210> 357 <211> 4 <212> PRT <213> Ancyclostoma caninum <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (4)..(4) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 357

Leu Xaa Arg Xaa 1

Lisboa, 7 de Fevereiro de 2007

Claims (71)

1 ΡΕ0788546 REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína isolada tendo actividade anti- coagulante e tendo um ou mais domínios de proteínas anticoagulantes extraídas de nemátodos (domínios NAP), em que cada domínio NAP inclui a sequência: Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8- Cys-A9-Cys-A10, em que resíduos (a) AI é uma sequência de aminoácidos de 7 a 8 de aminoácidos; resíduos (b) A2 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 de aminoácidos; resíduos (c) A3 é uma sequência de aminoácidos de 3 de aminoácidos; resíduos (d) A4 é uma sequência de aminoácidos de 6 a 19 de aminoácidos; (e) A5 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 4 resíduos de aminoácidos; 2 ΡΕ0788546 (f) A6 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 resíduos de aminoácidos; (g) A7 é um aminoácido; (h) A8 é uma sequência de aminoácidos de 11 a 12 resíduos de aminoácidos; (i) A9 é uma sequência de aminoácidos de 5 a 7 resíduos de aminoácidos; e (j) AIO é uma sequência de aminoácidos de 5 a 25 resíduos de aminoácidos.

2. A proteína da reivindicação 1 em que a actividade da referida proteína inclui a actividade inibidora de Factor Xa.

3. A proteína da reivindicação 1 ou 2, em que A3 tem a sequência Glu-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados.

4. A proteína da reivindicação 3, em que A3 tem a sequência Glu-A3a-A3b, em que A3a é seleccionado do grupo consistindo em Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu e Thr e A3b é seleccionado do grupo consistindo em Lys, Thr e Arg.

5. A proteína de qualquer uma das reivin dicações 3 a 4, em que A3 é seleccionada do grupo consistindo em 3 ΡΕ0788546 Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys e Glu-Thr-Lys.

6. A proteína da reivindicação 1, em gue A3 tem a sequência Asp-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados.

7. A proteína da reivindicação 1 ou 6, em que A3 é Lys-Lys.

8. A proteína de qualquer uma das reivindi cações 1 a 7, em que A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica.

9. A proteína de qualquer uma das reivindi cações 1 ou 6 a 8, em que A5 tem a sequência A5a-A5b-A5c-A5d [SEQ. ID. NO. 84], em que A5a a A5d são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados.

10. A proteína da reivindicação 9, em que em que A5a é Leu e A5C é Arg. 4 ΡΕ0788546

11. A proteína de quaquer uma das reivindicações 1 a 10, em que A7 é seleccionado do grupo consistindo em Vai e Ile.

12. A proteína de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que A8 inclui a sequência de aminoácidos A8a-A8b-A8c-A8d-A8e-A8f-A8g [SEQ. ID. NO. 68], em que (a) A8a é o primeiro resíduo de aminoácido em A8, (b) pelo menos de um de A8a e A8b é seleccionado do grupo consistindo em Glu ou Asp e (c) A8C a A8g são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados.

13. A proteína da reivindicação 12, em que (a) A8a é Glu ou Asp, (b) A8b é um resíduo de aminoácido seleccionado independentemente, (c) A8C é Gly, (d) A8d é seleccionado do grupo consistindo em Phe, Tyr e Leu, (e) A8e é Tyr 5 ΡΕ0788546 (f) A8f é Arg e (g) A8g é seleccionado entre Asp e Asn.

14. A proteína da reivindicação 12 ou 13, em que (a) A8a é um resíduo de aminoácido seleccionado independentemente, (b) A8b é Glu ou Asp, (c) A8C é Gly, (d) A8d é seleccionado do grupo consistindo em Phe, Tyr e Leu, (e) A8e é Tyr, (f) A8f é Arg e (g) A8g é seleccionado entre Asp e Asn.

15. A proteína de qualquer uma das reivindicações 12 a 14, em que A8c-A8d-A8e-A8f-A8g é seleccionada do grupo consistindo em Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 70], 6 ΡΕ0788546 Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 71] , [SEQ. ID. NO. 72] e [SEQ. ID. NO. 73] .

16. A proteína da reivindicação 15, em que A8C-A8d-A8e-A8f-A8g é Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 70].

17. A proteína de qualquer uma das reivindicações 2 a 16, em que AIO inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] e Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77].

18. A proteína da reivindicação 17, em que AIO inclui a sequência de aminoácidos Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74] .

19. A proteína da reivindicação 17, em que AIO inclui a sequência de aminoácidos Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75].

20. A proteína da reivindicação 19 tendo um domínio NAP com uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de homologia com a de AcaNAP48 [Fig. 16].

21. A proteína da reivindicação 17, em que AIO 7 ΡΕ0788546 inclui a sequência Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] .

22. A proteína da reivindicação 21 tendo um domínio NAP com uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de homologia com um domínio NAP seleccionado entre os domínios NAP de AcaNAP23 [Fig. 16], AcaNAP24 [Fig. 16], AcaNAP25 [Fig. 16], AcaNAP44 [Fig. 16], AcaNAP31 [Fig. 16], AceNAP4-dl [Fig. 16] AceNAP4-d2 [Fig. 16].

23. A proteína da reivindicação 17, em que AIO inclui a sequência Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77].

24. A proteína da reivindicação 23 tendo um domínio NAP com uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de homologia com um domínio NAP seleccionado entre os domínios NAP de AcaNAP45-dl [Fig. 16], AcaNAP45-d2 [Fig. 16], AcaNAP4 7-dl [Fig. 16], AcaNAP47-d2 [Fig. 16], AduNAP7-dl [Fig. 16], AduNAP7-d2 [Fig. 16], AduNAP4 [Fig. 16], AceNAP5 [Fig. 16] e AceNAP7 [Fig. 16].

25. A proteína da reivindicação 1 ou 2, em que (a) A3 tem a sequência Glu-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga aniónica global; ΡΕ0788546 (c) A7 é seleccionada do grupo consi stindo em Vai e Ile; (d) A8 inclui uma sequência de seleccionada do grupo consistindo em aminoácidos Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 69] , Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 70] , Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 71] , Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 72] e Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 73] . (e) AIO inclui uma sequência de seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] e Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77]. aminoácidos

26. A proteína da reivindicação 1 (a) A3 é seleccionado do grupo consi Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, ou 2, em que stindo em 9 ΡΕ0788546 Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys e Glu-Thr-Lys. (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A7 é Vai ou Ile; (d) A8 inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em A8a-A8b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 78], A8a-A8b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn[SEQ. ID. NO. 79], A8a-A8b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 80], A8a-A8b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. NO. 81] e A8a-A8b-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. NO. 82], em que pelo menos um de A8a e A8b é Glu ou Asp; (e) A9 é uma sequência de aminoácidos de cinco resíduos de aminoácidos; e (f) AIO inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. NO. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. NO. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. NO. 76] e Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. NO. 77]. 10 ΡΕ0788546

27. A proteína da reivindicação 18, 25 ou 26 tendo um domínio NAP possuindo pelo menos 90% de homologia com os domínios NAP seleccionados entre AcaNAP5 [Fig. 16] e AcaNAP6 [Fig. 16].

28. A proteína da reivindicação 25 ou 26 tendo um domínio NAP possuindo pelo menos 90% de homologia com um domínio NAP seleccionado do grupo consistindo em AcaNAP5 [Fig. 16], AcaNAP6 [Fig. 16], AcaNAP48 [Fig. 16], AcaNAP23 [Fig. 16], AcaNAP2 4 [Fig. 16], AcaNAP25 [Fig. 16], AcaNAP44 [Fig. 16], AcaNAP31 [Fig. 16], AceNAP4-dl [Fig. 16] AceNAP4-d2 [Fig. 16], AcaNAP45-dl [Fig. 16], AcaNAP45-d2 [Fig. 16], AcaNAP4 7-dl [Fig. 16], AcaNAP47-d2 [Fig. 16], AduNAP7-dl [Fig. 16], AduNAP7-d2 [Fig. 16], AduNAP4 [Fig. 16], AceNAP5 [Fig. 16] e AceNAP7 [Fig. 16].

29. Uma proteína isolada tendo actividade anti- coagulante seleccionada do grupo consistindo em AcaNAP5 [Fig. 16] , AcaNAP6 [Fig. 16] , AcaNAP48 [Fig. 16], AcaNAP23 [Fig. 16] , AcaNAP24 [Fig. 16] , AcaNAP25 [Fig. 16], AcaNAP44 [Fig. 16] , AcaNAP31 [Fig . 16] , AceNAP4 [Fig. 16] AcaNAP45 [Fig. 16] , AcaNAP4 7 [Fig . 16] , AduNAP 7 [Fig. 16], AduNAP4 [Fig. 16] , AceNAP5 [Fig. 16] e AceNAP7 [Fig. 16].

30. Uma proteína isolada tendo actividade inibidora do factor Xa seleccionada do grupo consistindo em AcaNAP5 [Fig. 16] e AcaNAPô [Fig. 16]. 11 ΡΕ0788546

31. A proteína da reivindicação 1, em que (a) A3 tem a sequência Asp-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos independentemente selec-cionados; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A5 tem a sequência A5a-A5b-A5c-A5d [SEQ. ID. NO. 85] em que A5a a A5d são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados; e (d) A7 é seleccionado do grupo consistindo em Vai e Ile.

32. A proteína da reivindicação 1, em que (a) A3 é Asp-Lys-Lys; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A5 tem a sequência A5a-A5b-A5c-A5d em que A5a é Leu, A5C é Arg e A5b e A5d são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados [SEQ. ID. NO. 357]; (d) A7 é Vai; e 12 ΡΕ0788546 (e) A8 inclui uma sequência de aminoácidos A8a-A8b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn[SEQ. ID. NO. 79],em que pelo menos um de A8a e A8b é Glu ou Asp.

33. A proteína da reivindicação 31 ou 32 tendo um domínio NAP com uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de homologia com o domínio NAP de AcaNAPc2 [Fig. 16] .

34. Uma proteína isolada tendo actividade inibi-dora de Factor VIIa/TF, possuindo um domínio de proteína anticoagulante, extraída de nemátodo com pelo menos 90% de homologia com o domínio NAP de AcaNAPc2 [Fig. 16].

35. Uma proteína isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34 tendo actividade anticoagulante, em que a referida proteína inibe especificamente a actividade catalítica do complexo fVIIa/TF na presença de fXa ou de um derivado de fXa cataliticamente activo e não inibe especificamente a actividade de FVIIa na ausência de TF e não inibe especificamente protrombinase.

36. Uma proteína da reivindicação 35, em que a proteína é AcaNAPc2 [Fig. 16].

37. Uma proteína tendo actividade anticoagulante e tendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de homologia com AcaNAPc2 [Fig. 16]. 13 ΡΕ0788546

38. Uma proteína isolada tendo actividade inibi-dora de serina-proteases e tendo um ou mais domínios de proteína anticoagulante extraídos de Nemátodos (domínios NAP) com uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de homologia com domínios NAP seleccionados entre HpoNAP5 [Fig. 16] e NamNAP [Fig. 16]. em que (a) AI é uma sequência de aminoácidos de 7 a 8 resíduos de aminoácidos; (b) A2 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 resíduos de aminoácidos; (c) A3 tem a sequência Glu-A3a-A3b, em que A3a e A3b são resíduos de aminoácidos seleccionados independen temente ; (d) A4 é uma sequência de aminoácidos de 6 a 19 resíduos de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A5 tem a sequência A5a-A5b-A5c-A5d, em que A5a a A5C são resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados; (f) A6 é uma sequência de aminoácidos de 3 a 5 resíduos de aminoácidos; (g) A7 é Gin; 14 ΡΕ0788546 (h) A8 é uma sequência de aminoácidos de 10 a 12 resíduos de aminoácidos; (i) A9 é uma sequência de aminoácidos de 5 a 7 resíduos de aminoácidos; e (j) AIO é uma sequência de aminoácidos de 1 a 25 resíduos de aminoácidos.

39. A proteína da reivindicação 38, em que (a) A3 é Glu-Pro-Lys; (b) A4 é uma sequência de aminoácidos tendo uma carga global aniónica; (c) A5 é seleccionado entre Thr-Leu-Asn e Thr- Met-Asn; e (d) A7 é Gin.

40. Uma proteína isolada tendo actividade inibi-dora de serina-proteases e tendo um ou mais domínios de proteína anticoagulante extraídos de Nemátodos (domínios NAP) com uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de homologia com domínios NAP seleccionados entre HpoNAP5 [Fig. 16] e NamNAP [Fig. 16]. 15 ΡΕ0788546

41. Uma proteína de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 25, 26, 31, 32, 38 ou 39 em que a referida proteína tem dois domínios NAP.

42. Uma proteína tendo dois domínios de proteína anticoagulante extraída de Nemátodos (NAP), em que a referida proteína é seleccionadado grupo consistindo em AceNAP4 [Fig. 17], AcaNAP45 [Fig. 18], AcaNAP47 [Fig. 19] e AduNAP7 [Fig. 20].

43. A proteína de qualquer uma das reivindicações 1 a 42, em que a referida proteína deriva de uma espécie de nemátodo que é seleccionada do grupo consistindo em Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus e Heligomosomoides polygyrus.

44. Uma molécula de cDNA recobinante isolada codificadora de uma proteína de qualquer uma das reivindicações 1 a 42.

45. Uma molécula de cDNA codificadora da proteína da reivindicação 18 ou 25 tendo uma sequência nucleo-tídica tendo pelo menos 90% de homologia com a codificadora de AcaNAP5 [Fig. 1] e AcaNAPô [Fig. 3].

46. Uma molécula de cDNA codificadora da proteína tendo actividade inibidora do Factor Xa seleccionada 16 ΡΕ0788546 do grupo consistindo em proteínas tendo domínios NAP tendo pelo menos 90% de homologia com AcaNAP5 [Fig. 16] e AcaNAP6 [Fig. 16].

47. Uma molécula de cDNA tendo uma sequência nucleotídica possuindo pelo menos 90% de homologia com a codificadora de AcaNAP48 [Fig. 13h].

48. Uma molécula de cDNA codificadora da proteína da reivindicação 21 tendo uma sequência nucleotídica possuindo pelo menos 90% de homologia com a seleccionada do grupo consistindo em cDNAs codificadores de AcaNAP23 [Fig. 13A] , AcaNAP24 [Fig. 13b], AcaNAP25 [Fig. 13c], AcaNAP44 [Fig. 13e], AcaNAP31 [Fig. 13d] e AceNAP4 [Fig. 7a].

49. Uma molécula de cDNA codificadora da proteína da reivindicação 23 tendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 90% de homologia com as seleccionadas do grupo consistindo nos cDNAs codificadores de AcaNAP45 [Fig. 13f], AcaNAP47 [Fig. 13g] , AduNAP7 [Fig. 7e], AduNAP4 [Fig. 7d], AceNAP5 [Fig. 7b] e AceNAP7 [Fig. 7c].

50. Uma molécula de cDNA codificadora da proteína da reivindicação 26 que é seleccionada do grupo consistindo nos cDNAs codificadores de AcaNAP5 [Fig. 1], AcaNAPô [Fig. 3], AcaNAP48 [Fig. 13h], AcaNAP23 [Fig. 13A] , AcaNAP2 4 [Fig. 13b], AcaNAP25 [Fig. 13c], AcaNAP44 [Fig. 13e], AcaNAP31 [Fig. 13d], AceNAP4 [Fig. 7a], AcaNAP45 17 ΡΕ0788546 [Fig. 13f] , AcaNAP47 [Fig. 13g] , AduNAP7 [Fig. 7e] , AduNAP4 [Fig. 7d], AceNAP5 [Fig. 7b] e AceNAP7 [Fig. 7c].

51. Uma molécula de cDNA codificador da proteína da reivindicação 38 tendo uma sequência nucleotídica tendo pelo menos 90% de homologia com sequências seleccionadas entre os cDNAs codificadores de HpoNAP5 [Fig. 7f] e NamNAP [Fig. 14].

52. Uma molécula de cDNA codificadora de uma proteína tendo actividade anticoagulante seleccionada do grupo consistindo em cDNAs tendo pelo menos 90% de homologia com cDNAs codificadores de AcaNAP5 [Fig. 1], AcaNAPô [Fig. 3], AcaNAP48 [Fig. 13h], AcaNAP23 [Fig. 13A] , AcaNAP2 4 [Fig. 13b], AcaNAP25 [Fig. 13c], AcaNAP44 [Fig. 13e] , AcaNAP31 [Fig. 13d], AceNAP4 [Fig. 7a], AcaNAP45 [Fig. 13f], AcaNAP47 [Fig. 13g], AduNAP7 [Fig. 7e], AduNAP4 [Fig. 7d], AceNAP5 [Fig. 7b] e AceNAP7 [Fig. 7c].

53. Uma molécula de cDNA recombinante isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 52 codificadora da proteína tendo actividade anticoagulante, em que a referida proteína inibe especificamente a actividade catalítica do complexo fVIIa/TF na presença de fXa ou derivado de fXa cataliticamente inactivo e não inibe a actividade de FVIIa na ausência de TF e não inibe especif icamente protrombinase. 18 ΡΕ0788546

54. A molécula de cDNA da reivindicação 53, em que o DNA codifica AcaNAPc2 [Fig. 16].

55. Uma molécula de cDNA isolada codificadora de uma proteína tendo actividade anticoagulante possuindo pelo menos 90% de homologia com AcaNAPc2 [Fig. 9].

56. Uma molécula de cDNA recombinante isolada codificadora de uma proteína da reivindicação 32.

57. A molécula de cDNA da reivindicação 56 tendo uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de homologia com AcaNAPc2 [Fig. 16].

58. A molécula de cDNA de qualquer uma das reivindicações 44 a 57 derivada de uma espécie de nemátodo.

59. A molécula de cDNA da reivindicação 58, em que a referida espécie de nemátodo é seleccionada do grupo consistindo de Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus e Heligomoso-moides polygyrus.

60. Um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência nucleotídica seleccionada entre NAP-1: AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY [SEQ. ID. NO. 90]e NAP-4.RC TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NC-RCA [SEQ. ID. NO. 91]. 19 ΡΕ0788546

61. Utilização de uma proteína de qualquer uma das reivindicações 1 a 42 para a produção de uma composição farmacêutica para inibição da coqulação do sangue.

62. A utilização da reivindicação 61, em que a proteína é seleccionada do qrupo consistindo em AcaNAP5 [Fiq. 16], AcaNAPô [Fig. 16], AcaNAPc2 [Fig. 16], HpoNAPõ [Fig. 16], NamNAP [Fig. 16].

63. A utilização da reivindicação 61 em que a proteína tem um domínio NAP tendo pelo menos 90% de homo-logia com domínios NAP seleccionados do grupo consistindo em AcaNAP5 [Fig. 16], AcaNAP6 [Fig. 16], AcaNAP48 [Fig. 16], AcaNAP23 [Fig. 16], AcaNAP24 [Fig. 16], AcaNAP25 [Fig. 16], AcaNAP4 4 [Fig. 16], AcaNAP31 [Fig. 16], AceNAP4-dl [Fig. 16], AceNAP4-dl [Fig. 16], AcaNAP45-dl [Fig. 16], AcaNAP45-d2 [Fig. 16], AcaNAP47-dl [Fig. 16], AcaNAP47-d2 [Fig. 16], AduNAP7-dl [Fig. 16], AduNAP7-d2 [Fig. 16], AduNAP4 [Fig. 16], AceNAP5 [Fig. 16] e AceNAP7 [Fig. 16] .

64. Uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de qualquer uma das reivindicações 1 a 42.

65. A composição farmacêutica da reivindicação 64 compreendendo uma proteína seleccionada do grupo consistindo em AcaNAP5 [Fig. 16], AcaNAP6 [Fig. 16], AcaNAPc2 [Fig. 16], HpoNAP5 [Fig. 16], NamNAP [Fig. 16]. 20 ΡΕ0788546

66. A composição farmacêutica da reivindicação 64 compreendendo uma proteína tendo um domínio NAP possuindo pelo menos 90% de homologia com um domínio NAP seleccionado do grupo consistindo em AcaNAP5 [Fig. 16], AcaNAPô [Fig. 16], AcaNAP48 [Fig. 16], AcaNAP23 [Fig. 16], AcaNAP24 [Fig. 16], AcaNAP25 [Fig. 16], AcaNAP44 [Fig. 16], AcaNAP31 [Fig. 16], AceNAP4-dl [Fig. 16], AceNAP4-dl [Fig. 16], AcaNAP45-dl [Fig. 16], AcaNAP45-d2 [Fig. 16], AcaNAP47-dl [Fig. 16], AcaNAP47-d2 [Fig. 16], AduNAP7-dl [Fig. 16], AduNAP7-d2 [Fig. 16], AduNAP 4 [Fig. 16], AceNAP5 [Fig. 16] e AceNAP7 [Fig. 16].

67. Uma proteína isolada tendo uma seguência de aminoácidos de AcaNAPc2 [Fig. 16] tendo um resíduo de prolina adicional no extremo C.

68. Uma proteína isolada tendo actividade inibi-dora de Factor VIIa/Factor Tecidular e uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de homologia com a sequência de aminoácidos de AcaNAPc2 [Fig. 16] tendo um resíduo de prolina adicional no extremo C.

69. Uma molécula de ácido nucleico isolado codificadora da sequência de aminoácidos de AcaNAPc2 [Fig. 16] tendo um resíduo de prolina adicional no extremo C.

70. Uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora de uma proteína tendo actividade inibidora de Factor VIIa/Factor Tecidular e tendo pelo menos 90% de 21 ΡΕ0788546 homologia com a sequência de aminoácidos de AcaNAPc2 [Fig. 16] tendo um resíduo de prolina adicional no extremo C.

71. Uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora de uma proteína tendo actividade inibidora de Factor VIIa/Factor Tecidular e possuindo pelo menos 90% de homologia com a sequência de ácido nucleico codificadora da sequência de aminoácidos de AcaNAPc2 [Fig. 16] tendo um resíduo de prolina adicional no extremo C. Lisboa, 7 de Fevereiro de 2007