CN116987181B - 高生物学活性的天然水蛭素和高收率制备它们的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高生物学活性的天然水蛭素和高收率制备它们的方法，具体地，制备高生物学活性的天然水蛭素的方法包括如下步骤：使成熟、健康的水蛭进行饥饿饲养；向饥饿的水蛭中加入营养液饲喂，再用无菌水浸泡，最后转移到乙酸中浸泡；所述营养液包含：氯化钠、葡萄糖、水等；将水蛭转移到一个挤压桶中，对水蛭进行挤压，以促使其分泌并吐出唾液，用无菌水分清洗水蛭和挤压桶，收集清洗液；向清洗液中加入浓度递增的硫酸铵，使杂质沉淀并将其除去；用半透膜浓缩，冷冻干燥，得粉末状的天然水蛭素。本发明还涉及使用本发明方法制备得到的天然水蛭素。本发明方法具有优良的提取效率或收率，并且所得水蛭素具有相当高的生物学活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种制备天然水蛭素的方法，还涉及使用本发明方法制备得到的天然水蛭素。
背景技术
水蛭素(Hirudin，CAS号8001-27-2)是从吸血性水蛭头部唾液腺内提取出来的一种生物活性物质，它是一种单链环肽化合物，由65~66个氨基酸组成，其分子量很小，仅为7000道尔顿。水蛭除其唾液腺含有水蛭素外，身体其他部位并不含有水蛭素。水蛭素的示意性结构式如下：
水蛭素为白色或灰白色粉末，呈水溶性，脂溶性差，极易溶于水和生理盐水，难溶于乙醚等有机溶剂。水蛭素在高温和强酸或强碱环境下很稳定，活性不降低，人体服用水蛭素后不会被消化道内的胃酸及各种蛋白水解酶所破坏。
目前天然水蛭素是从动物水蛭制得。水蛭俗称蚂蟥，英文名为leech，是蛭纲动物的统称。水蛭一般背腹扁平，前端较窄，身体呈叶片状或蠕虫状，体形可随伸缩的程度或进食的多少而改变。其身体由多个体节组成，前、后端的体节演变成吸盘，前吸盘较小，围绕在口的周围；后吸盘较大，呈杯状，多朝向腹面。全世界的广义的水蛭有多种，例如菲牛蛭(Hirudinaria manillensis Lesson)、蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)、水蛭(Hirudonipponica Whitman)、柳叶蚂蟥(Whitmania acranulata Whitman)、日本医蛭、宽体金线蛭等。
一般品种的水蛭适宜生长水温为20~40℃，主要生活在湖泊、水库、沼泽、池塘、沟渠、水田中，10℃以下便停止进食，30℃以上停止生长。吸血性水蛭只吸食动物的血液，非吸血性水蛭主要吸食水中的浮游生物、昆虫、软体动物等的体液。水蛭雌雄同体，异体交配，体内受精，交配时互相反方向进行，生活中有“性逆转”现象，正所谓阴阳合一。水蛭体内含有17种氨基酸，其中7种为人体所必需的氨基酸，例如赖氨酸、谷氨酸等；还含有水蛭素、脂肪酸、多种微量元素、总多糖、总磷脂等。
目前已有一些文献记载了从水蛭制备水蛭素的方法，例如，CN116496387A(中国专利申请号202310740350.0)公开了一种水蛭素的提取方法，包括以下步骤：准备活体水蛭，并将其放入提取装置，其中提取装置包括箱体、检测装置和注料装置，箱体上能拆卸的安装有盖体和过滤盒，且箱体上安装有出液管，检测装置包括检测管、传动组件和真空泵，盖体上安装有安装板，检测管安装在安装板上，检测管内滑动安装有活塞，活塞上安装有第一连接架，第一连接架从检测管的内部贯穿检测管的外壁延伸至检测管外，安装板上安装有垫架，垫架上安装有压力传感器，传动组件设置在安装板上，真空泵上安装有连接管，真空泵通过连接管与箱体连接，注料装置包括安装架、控制组件和锁止组件，安装架安装在安装板上，安装架上滑动安装有闸板，安装架上还安装有注料管，注料管位于闸板的上方，控制组件设置在安装板上且其用于控制闸板移动，锁止组件安装在安装板上且其用于限制闸板移动，传动组件的两端分别与第一连接架和锁止组件传动连接；启动提取装置，并控制温度至30~60摄氏度；将制得的溶液取出，并对溶液进行分离、沉降；对沉降物进行干燥处理，制得天然水蛭素干粉颗粒原料。
CN115975007A(中国专利申请号202211640263.X)基于电刺激的活体水蛭提取水蛭素的提取方法，步骤如下：先将水蛭进行清洗，并用电解质水体漂洗；接着将处理后的水蛭放入提取设备中；提取设备对水蛭施加刺激电流，使水蛭分泌大量粘液；提取过程中，利用水蛭喜好钻孔的特性，使水蛭穿入提取设备中的预留孔洞，使水蛭表面粘液被刮蹭；最后将分泌完粘液的水蛭捞出，并对提取设备中留下的液体进行进一步的加工提取，得到水蛭素；所述提取设备包括提取池、隔板、盖板、多个细孔机构、第一电极板和第二电极板，所述隔板固定连接在提取池内壁并将提取池内部分割为左侧的第一提取室和右侧的第二提取室，多个所述细孔机构呈纵向阵列贯穿嵌装在隔板靠近下端处，所述第一电极板和第二电极板分别固定连接在提取池的前后内壁上，所述盖板设置在提取池上端，所述细孔机构用于供水蛭穿过隔板并在水蛭穿过隔板的过程中刮蹭水蛭表面。
CN112321703B(中国专利申请号202011328312.7)公开了一种乳状液膜法纯化水蛭素的方法，所述方法，包括以下步骤：水蛭用水煎煮，每次加水量为水蛭重量的6倍量，煎煮2次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.04-1.06，加入乙醇至含醇量为85%，零下温度下静置24小时，离心，取上清液用盐酸调节pH＝5，备用；取膜溶剂大豆油40ml，表面活性剂Span80 4.5ml，膜增强剂液体石蜡2ml，将三者进行混合，取此混合物按1：2的体积比缓慢加入质量分数为5%的NaOH水溶液，在2500转/分的转速下搅拌10min，即制得稳定的乳状液；将得到的备用液与乳状液按照1：3体积比加入到提取器中，在200转/分的低速搅拌提取20min；静置分层，分离出乳液，水浴加热乳液进行破乳，静置后分离得到的水层，即为水蛭素溶液。
CN109527270A(中国专利申请号201811502139.0)公开了一种水蛭特异性营养液，包括：氯化钠100~200mmol/L，复合氨基酸5~15mmol/L，葡萄糖0.5~1.5mmol/L，反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛0.02~0.05mg/ml，加无菌水至终浓度。其使用如下方法提取天然水蛭素：使用预热至36~38℃的水蛭特异性营养液喂食禁食20~40天的水蛭，水蛭特异性营养液的喂食量为5~7mL/g·bw；将喂饱的水蛭置于催吐剂6%~10%乙醇中达15~20min，水蛭与催吐剂比例为1:(1~2)(w/v)，使其吐出体内液体，移除水蛭，得到初级提取液；采用硫酸铵对所述初级提取液进行硫酸铵分级沉淀除杂，离心，透析除盐，浓缩，冷冻干燥，得到天然水蛭素。
CN108727487B(中国专利申请号201810428320.5)公开了一种水蛭素的液膜萃取方法，包括如下步骤：制备水蛭素粗提液；向1体积水蛭素粗提液中加入4~6体积乳化液，搅拌，静置分层后加入破乳剂，静置分层取下相萃取液于40~60℃下静置，冷却即得所述水蛭素；其中所述乳化液为以乳化剂脱水山梨醇脂肪酸酯和异辛烷的混合溶液为膜相，碱性溶液为内相，三辛胺为载体的液膜萃取体系；膜相与内相的膜内体积比为10:2.5，三辛胺与异辛烷的质量比为3:100，内相的pH为10.0，水蛭素粗提液的pH为9.5；乳化液通过如下方法制备得到：乳化剂溶解于异辛烷中，加入三辛胺溶解后，加入碱性溶液于超声条件下乳化即得。
然而，本领域仍然期待有提取天然水蛭素的方法，期待此类方法所得天然水蛭素具有高的生物学活性，并且具有高的提取效率或收率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备天然水蛭素的方法，期待此类方法所得天然水蛭素具有高的生物学活性，并且具有高的收率。已经发现，本发明方法呈现如本文所述一个或者多个方面的效果，本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了制备天然水蛭素的方法，包括如下步骤：
(1)使成熟、健康的水蛭进行饥饿饲养；
(2)向饥饿的水蛭中加入营养液饲喂，再用无菌水浸泡，最后转移到乙酸中浸泡；
(3)将水蛭转移到一个挤压桶中，对水蛭进行挤压，以促使其分泌并吐出唾液，用无菌水分清洗水蛭和挤压桶，收集清洗液；
(4)向清洗液中加入浓度递增的硫酸铵，使杂质沉淀并将其除去；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干，得粉末状的天然水蛭素。
尽管本发明天然水蛭素可以如步骤(5)所示以浓缩液的液体形式提供，本发明更优选的是以粉末或者颗粒状的固体形式提供。
根据本发明第一方面的方法，其中所述水蛭为选自下列物种的水蛭：菲牛蛭(Hirudinaria manillensis Lesson)、蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)、水蛭(Hirudonipponica Whitman)、柳叶蚂蟥(Whitmania acranulata Whitman)、日本医蛭、宽体金线蛭。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，使水蛭在清水池中饥饿饲养20~40天例如饥饿饲养25~30天例如28天。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)是照如下方式操作的：将成熟、健康的水蛭从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述营养液包含：氯化钠、葡萄糖、消旋羟蛋氨酸钙、丝氨酸、猪血粉、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛、和水。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述猪血粉为新鲜猪血通过真空干燥至水分含量少于5%的粉末。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述营养液包含：氯化钠0.8~1%、葡萄糖4~6%、消旋羟蛋氨酸钙0.4~0.5%、丝氨酸0.7~0.8%、猪血粉3.5~4.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.015~0.025%、水适量至100%。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.4%、丝氨酸0.8%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.5%、丝氨酸0.7%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述营养液组成为：氯化钠1%、葡萄糖4%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.025%、水适量至100%。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述营养液组成为：氯化钠0.8%、葡萄糖6%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉3.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.015%、水适量至100%。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)是照如下投料的比例进行操作的：取饥饿的水蛭1000g(沥水10min)，向其中加入营养液800~1200mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，所述挤压桶是一个具有如下尺寸比例的桶顶开口的不锈钢圆桶内径10cm、深35cm，且该挤压桶的四周和底部布满1mm小孔。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，所述挤压是在挤压桶中将水蛭挤压至其初始体积的50~70%。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)是照如下方式进行操作的：将水蛭转移到一个挤压桶中，沥干(5min)后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压水蛭至初始体积的50~70%，以促使菲牛蛭分泌并吐出唾液，用无菌水(例如每1000g水蛭使用500~2000ml例如800~1200ml)分次清洗菲牛蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述浓度递增的硫酸铵是加硫酸铵至浓度达20~80%例如20~60%的范围，例如加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)是照如下方式进行操作的：向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，每1000g水蛭处理至除盐并浓缩至200ml。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，冷冻干燥至干水分小于5%，得粉末状的天然水蛭素。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)是照如下方式进行操作的：用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
进一步的，本发明第二方面提供了一种天然水蛭素，其具有5~50U/mg例如8~25U/mg例如10~15U/mg浓度的抗凝血酶活性。
根据本发明第二方面的天然水蛭素，其是按照本发明第一方面任一项所述方法制备得到的。
进一步的，本发明第三方面提供了一种用于喂饲水蛭以制备天然水蛭素的营养液，其包含：氯化钠、葡萄糖、消旋羟蛋氨酸钙、丝氨酸、猪血粉、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛、和水。
根据本发明第三方面的方法，所述营养液包含：氯化钠0.8~1%、葡萄糖4~6%、消旋羟蛋氨酸钙0.4~0.5%、丝氨酸0.7~0.8%、猪血粉3.5~4.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.015~0.025%、水适量至100%。
根据本发明第三方面的方法，所述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%。
根据本发明第三方面的方法，所述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.4%、丝氨酸0.8%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%。
根据本发明第三方面的方法，所述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.5%、丝氨酸0.7%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%。
根据本发明第三方面的方法，所述营养液组成为：氯化钠1%、葡萄糖4%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.025%、水适量至100%。
根据本发明第三方面的方法，所述营养液组成为：氯化钠0.8%、葡萄糖6%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉3.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.015%、水适量至100%。
下面对本发明作进一步的说明。
在本发明中，涉及%时，若未特别说明，对于固体溶质溶液溶剂的情形，是重量/体积百分数，对于固体分布在固体中的情形，是重量/重量百分数。
众所周知，水蛭属于高度特化的环节动物，始载于《神农本草经》，俗称蚂蟥，是我国传统的中药，味咸、苦，性平。《中华人民共和国药典》载具有破血、逐瘀、通经之疗效，主要用于治疗瘤症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤。1884年，Haycraft首次在欧洲医用水蛭的唾液腺里发现了一种生物活性物质水蛭素。1927年，Shionoya最先把它作为抗血栓的有效药物来进行研究。1955Markwardt指出其为蛋白物质，并命名为水蛭素。天然水蛭素是从医用水蛭中提取的一种抗凝血蛋白质，是由65个或66个氨基酸残基组成的单链多肽，相对分子质量为7000Dalton。水蛭素的N末端有3对二硫键，使N末端肽链绕叠成密集的环肽结构，对蛋白结构起稳定作用。其N末端含活性中心，能识别底物即凝血酶碱性氨基酸富集位点，并与之结合。C末端富含酸性氨基酸残基，最后9个氨基酸中有6个为酸性氨基酸。
水蛭素(Hirudin)在医学上有多方面的作用，主要有：抗凝、溶栓，稀释血液、降低血液粘度，清除血液垃圾，抑制红细胞、血小板聚集，保护血管内膜，扩张、软化血管，消炎镇痛，抑制肿瘤生长，祛斑美容。
水蛭素为低分子多肽，口服容易吸收，分布于细胞外的空间，几乎不被肝脏降解代谢，以原形或衍生物的形式从尿中排出，而这些衍生物也同样具有抗凝血酶的活性，它的消除半衰期约为1.5小时。
水蛭素的作用机理有诸多特点，例如但不限于：作用靶点单一，只与凝血酶结合形成稳定的非共价复合物，具有特异性抑制凝血酶的作用；为世界上迄今为止所发现的最强的抗凝血酶天然物质；不被体内和体外物质所灭活，因而在血浆中活性稳定；直接激活纤维溶解系统，溶解已形成的血栓；仅抑制血小板的聚集，不导致血小板减少。
水蛭素是水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65-66个氨基酸组成的小分子多肽。水蛭含有丰富的水蛭素，水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。 水蛭素具有极强的抑制凝血作用和抗血栓形成作用，在临床治疗和预防各种血栓形成方面有着广阔的应用前景。
水蛭素肽链中部有一个由Pro-Lys-Pro组成的特殊序列，不被一般蛋白酶降解，这一结构有2个方面的作用：①维持水蛭素分子的稳定性；②引导水蛭素分子以正确的方向与凝血酶分子结合。
天然水蛭素是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽，能在极端的pH和热条件下稳定存在。水蛭素的形状类似蝌蚪，蝌蚪头部是多肽的N端，富含半胱氨酸(cys)，半胱氨酸间相互作用形成3个二硫键(Cys6-Cys14，Cys16-Cys28，Cys22-Cys39)使N末端结构紧密；蝌蚪尾部是含有多个酸性氨基酸和一个被磺酸化的酪氨酸(Tyr63)的多肽C末端。凝血酶是血液凝固和止血过程中的中心酶，它不但能剪切纤维蛋白原，将纤维蛋白原转化为纤维蛋白；还能激活其它的凝固血液的酶类，如凝血因子Ⅴ、Ⅷ、ⅩⅢ和抗凝血酶蛋白C等。凝血酶与大分子底物的相互作用取决于三个不同的区域：催化反应位点的初级结合位C，邻近催化位点的非极性结合位点AB和负责凝血酶与纤维蛋白原专一性作用的阴离子结合位点R。水蛭素的N端能封阻凝血酶的活性位点，其疏水结构域与凝血酶的非极性结合位点(AB)互补；该非极性结合位点靠近凝血酶的催化中心。水蛭素C末端有6个酸性氨酸，能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。N端、C端两个功能域以协同的方式结合到凝血酶上，在凝血酶的活性部位形成一个帽子，阻止底物的结合。
水蛭素作用于凝血酶的原理：一系列酶促级联放大反应在内源性和外源性凝血过程中使凝血酶原活化，生成凝血酶。凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在血栓形成过程中起非常关键的作用，包括血凝过程的级联反应、纤维蛋白沉积和血小板活化等。抗凝抑制剂可分为间接凝血酶抑制剂和直接抗凝血酶抑制剂。前者是通过催化凝血酶的天然抑制剂(ATIII或肝素辅助因子II)而产生抗凝作用。而水蛭素是特异性凝血酶抑制剂，能与凝血酶直接结合,其抗凝作用不依赖ATIII或肝素辅助因子II，属直接凝血酶抑制剂。水蛭素通过作用于凝血酶的非活性底物识别位点和酶活性中心2个位点，与凝血酶1:1结合形成不可逆的复合物，从而使凝血酶失去作用。水蛭素的抗凝作用不但专一，而且其抗凝活性明显强于肝素。此外，水蛭素不仅能抑制血浆中游离的凝血酶。
动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。
水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。
动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50>50mgAg，远大于治疗所用的剂量(1mgAg)。尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，这给用药带来很大方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，这就可以解释为何口服中药水蛭提取液仍然有疗效的原理。
天然水蛭素是一种从吸血类水蛭唾液腺及其分泌液中提取的天然活性物质，而重组水蛭素则是通过基因工程获得的人工产品。重组水蛭素的氨基酸序列和结构与天然水蛭素唯一不同的是其在63位酪氨酸残基未硫酸化，该特点使其对凝血酶的抑制作用明显降低，仅为天然水蛭素的1/10。重组水蛭素在药理活性、药代动力学方面与天然水蛭素非常相似。
体内外试验表明，水蛭素是迄今发现的作用最强的凝血酶特异性抑制剂，对各种血栓性疾病都有效。水蛭素的作用机制是它与凝血酶按1:1的比例非共价结合形成一种稳定的复合物，抑制了凝血酶的活性，从而阻止了纤维蛋白原凝固及凝血酶对血小板的作用，达到抗凝的目的，同时水蛭素的作用不依赖于抗凝血酶，其抑制血栓形成的浓度远小于其引起出血的浓度，无明显毒副作用。
水蛭素的一些外文文献提供如下以供参考：
分离：J. B. Haycraft, Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 18, 209 (1884)；
初步鉴定：F. Markwardt, Naturwissenschaften 42, 537 (1955)；
改进分离方法：P. Walsmann, F. Markwardt, Thromb. Res. 40, 563 (1985)；
氨基酸序列：T. E. Petersen et al. in Protides of the Biological Fluidsvol. 23, H. Peeters, Ed. (Pergamon Press, London, 1976) pp 145-149；
抗凝血酶活性：F. Markwardt, Methods Enzymol. 19, 924 (1970)；
人体药代动力学：F. Markwardt et al., Thromb. Haemostasis 52, 160(1984)；
血浆中的显色测定：U. Griessbach et al., Thromb. Res. 37, 347 (1985)；
天然和重组水蛭素的开发、药理学和治疗潜力系列文章：Semin. Thromb.Hemostasis 15, 261-333 (1989)；
药理学和治疗潜力综述：P. H. Johnson, Annu. Rev. Med. 45, 165-177(1994)；心肌梗死的治疗应用的综述：U. Zeymer, K.-L. Neuhaus, Drug Saf. 12, 234-239 (1995)。
本发明提供的提取天然水蛭素的方法，呈现如本文上下文所述一个或者多个方面的效果。
实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
实施例1：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的菲牛蛭(Hirudinaria manillensis Lesson)从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的菲牛蛭1000g(沥水10min，基本沥干，下同)，向其中加入营养液1000mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；
(3)将菲牛蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压菲牛蛭至初始体积的60%，以促使菲牛蛭分泌并吐出唾液，用1000ml无菌水分3次清洗菲牛蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。将该粉末称重并待测定其抗凝血酶活性，下同。
本实施例所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%。
在本发明中，如未特别说明，所用的挤压桶是一个四周和底部布满1mm小孔的不锈钢圆桶，桶顶开口，桶内径10cm、深35cm。
如无另外说明，本文所述(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛的分子式为C10H16O2，分子量为168.2，CAS号为188590-62-7，本文所用猪血粉为新鲜猪血通过真空干燥至水分含量少于5%的粉末。
实施例2：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的菲牛蛭从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的菲牛蛭1000g(沥水10min)，向其中加入营养液1200mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.4%、丝氨酸0.8%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将菲牛蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压菲牛蛭至初始体积的50%，以促使菲牛蛭分泌并吐出唾液，用900ml无菌水分3次清洗菲牛蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例3：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的菲牛蛭从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的菲牛蛭1000g(沥水10min)，向其中加入营养液800mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.5%、丝氨酸0.7%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将菲牛蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压菲牛蛭至初始体积的70%，以促使菲牛蛭分泌并吐出唾液，用1200ml无菌水分3次清洗菲牛蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例4：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的菲牛蛭从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的菲牛蛭1000g(沥水10min)，向其中加入营养液1000mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠1%、葡萄糖4%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.025%、水适量至100%
(3)将菲牛蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压菲牛蛭至初始体积的60%，以促使菲牛蛭分泌并吐出唾液，用1000ml无菌水分3次清洗菲牛蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例5：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的菲牛蛭从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的菲牛蛭1000g(沥水10min)，向其中加入营养液1000mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.8%、葡萄糖6%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉3.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.015%、水适量至100%；
(3)将菲牛蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压菲牛蛭至初始体积的60%，以促使菲牛蛭分泌并吐出唾液，用1000ml无菌水分3次清洗菲牛蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例6：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的菲牛蛭从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的菲牛蛭1000g(沥水10min)，向其中加入营养液1000mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；上述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、丝氨酸0.75%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将菲牛蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压菲牛蛭至初始体积的60%，以促使菲牛蛭分泌并吐出唾液，用1000ml无菌水分3次清洗菲牛蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例7：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的菲牛蛭从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的菲牛蛭1000g(沥水10min)，向其中加入营养液1000mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；上述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将菲牛蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压菲牛蛭至初始体积的60%，以促使菲牛蛭分泌并吐出唾液，用1000ml无菌水分3次清洗菲牛蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例8：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的菲牛蛭从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的菲牛蛭1000g(沥水10min)，向其中加入营养液1000mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；上述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将菲牛蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压菲牛蛭至初始体积的60%，以促使菲牛蛭分泌并吐出唾液，用1000ml无菌水分3次清洗菲牛蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
以上实施例1~8之步骤(1)为同一个大批次处理的成熟、健康的菲牛蛭，因此它们的步骤(2)所取饥饿的菲牛蛭为同一批次，从而后续试验及结果具有可比性。
实施例9：水蛭素的抗凝血酶活性测定
精密称取水蛭素供试品约10mg置10ml量瓶中，加入0.9%氯化钠溶液使溶解，制得水蛭素溶液；
精密量取水蛭素溶液100µl，置试管(8mm×38mm)中，加入含0.5%牛纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液200µl，摇匀，置37°C±0.5°C的水浴中温浸5分钟；
滴加每1ml中含20单位的凝血酶溶液，每1分钟滴加1次，每次5µl，边滴加边轻轻摇匀，至凝固；
记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算：
式中：
U为每1mg供试品含凝血酶活性单位，U/mg；
C1为凝血酶溶液的浓度，µ/ml；
C2为供试品溶液的浓度，mg/ml；
V1为消耗凝血酶溶液的体积，µl；
V2为供试品溶液的加入量，µl。
其中，
中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位；
三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液按如下方法配制：取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1mol/L盐酸溶液约40ml，加水至100ml，调节pH值至7.4，临用配制；
凝血酶溶液按如下方法配制：取凝血酶试剂适量，加生理盐水配制成每1ml含凝血酶20个单位的溶液，临用配制。
经测定，
实施例1~5所得天然水蛭素粉的抗凝血酶活性均在10~12U/mg范围内(例如实施例1天然水蛭素粉的抗凝血酶活性为11.34U/mg)，根据实施例1~5所得天然水蛭素粉的重量计算该实施例所得水蛭素粉的总抗凝血酶活性，5批水蛭素粉的总抗凝血酶活性在14900~16400U范围内(例如实施例1收获水蛭粉1.402g，其总抗凝血酶活性15898U)；
实施例6~8所得天然水蛭素粉的抗凝血酶活性分别为2.52U/mg、2.67U/mg、2.36/mg，根据实施例6~8所得天然水蛭素粉的重量计算该实施例所得水蛭素粉的总抗凝血酶活性，3批水蛭素粉的总抗凝血酶活性分别为3427U(1360mg水蛭粉)、3675U、3382U。
上述结果表明，在给饥饿的菲牛蛭投喂同时添加了消旋羟蛋氨酸钙和丝氨酸的营养液，并经本发明上述步骤制得天然水蛭素粉，其不但蛋白纯度和单位抗凝血酶活性强(达10~12U/mg)，而且总产量高(总计1kg鲜水蛭可获得抗凝血酶活性达14900U以上)，而不添加消旋羟蛋氨酸钙和丝氨酸之一或者二者时蛋白纯度和单位抗凝血酶活性低，而且总产量低，这一发现是现有技术根本无法预见的。
实施例10：制备水蛭粉末
取实施例1步骤(1)所得同一批次的饥饿菲牛蛭1000g，使其干燥，捣碎成粉末后继续干燥至水分小于5%，为药材水蛭的粉末。
精密称取过三号筛的水蛭粉末约1g，精密加入0.9%氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100µl，参照实施例9的方法置试管(8mm×38mm)中，并进行后续操作，测定本实施例所得水蛭粉末的抗凝血酶活性，并计算1000g鲜菲牛蛭所得的总抗凝血酶活性。
经测定，照本实施例10方法，通过直接干燥得到的药材菲牛蛭粉末，其1000g鲜菲牛蛭所得的总抗凝血酶活性为2846U。这表明通过使用本发明方法能够获得显著更大量的水蛭素或者显著更大量的抗凝血酶活性。
实施例11：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的蚂蟥1000g(沥水10min，基本沥干，下同)，向其中加入营养液1000mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将蚂蟥转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压蚂蟥至初始体积的60%，以促使蚂蟥分泌并吐出唾液，用1000ml无菌水分3次清洗蚂蟥及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例12：制备天然水蛭素
(1)同实施例11步骤(1)处理；
(2)取饥饿的蚂蟥1000g(沥水10min)，向其中加入营养液1200mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.4%、丝氨酸0.8%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将蚂蟥转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压蚂蟥至初始体积的50%，以促使蚂蟥分泌并吐出唾液，用900ml无菌水分3次清洗蚂蟥及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例13：制备天然水蛭素
(1)同实施例11步骤(1)处理；
(2)取饥饿的蚂蟥1000g(沥水10min)，向其中加入营养液800mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.5%、丝氨酸0.7%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将蚂蟥转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压蚂蟥至初始体积的70%，以促使蚂蟥分泌并吐出唾液，用1200ml无菌水分3次清洗蚂蟥及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例14：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的水蛭(Hirudo nipponica Whitman)从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的水蛭1000g(沥水10min，基本沥干，下同)，向其中加入营养液1000mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将水蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压水蛭至初始体积的60%，以促使水蛭分泌并吐出唾液，用1000ml无菌水分3次清洗水蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例15：制备天然水蛭素
(1)同实施例14步骤(1)处理；
(2)取饥饿的水蛭1000g(沥水10min)，向其中加入营养液1200mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.4%、丝氨酸0.8%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将水蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压水蛭至初始体积的50%，以促使水蛭分泌并吐出唾液，用900ml无菌水分3次清洗水蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例16：制备天然水蛭素
(1)同实施例14步骤(1)处理；
(2)取饥饿的水蛭1000g(沥水10min)，向其中加入营养液800mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.5%、丝氨酸0.7%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将水蛭转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压水蛭至初始体积的70%，以促使水蛭分泌并吐出唾液，用1200ml无菌水分3次清洗水蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例17：制备天然水蛭素
(1)将成熟、健康的柳叶蚂蟥(Whitmania acranulata Whitman)从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟；
(2)取饥饿的柳叶蚂蟥1000g(沥水10min，基本沥干，下同)，向其中加入营养液1000mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将柳叶蚂蟥转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压柳叶蚂蟥至初始体积的60%，以促使柳叶蚂蟥分泌并吐出唾液，用1000ml无菌水分3次清洗柳叶蚂蟥及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例18：制备天然水蛭素
(1)同实施例17步骤(1)处理；
(2)取饥饿的柳叶蚂蟥1000g(沥水10min)，向其中加入营养液1200mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.4%、丝氨酸0.8%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将柳叶蚂蟥转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压柳叶蚂蟥至初始体积的50%，以促使柳叶蚂蟥分泌并吐出唾液，用900ml无菌水分3次清洗柳叶蚂蟥及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
实施例19：制备天然水蛭素
(1)同实施例17步骤(1)处理；
(2)取饥饿的柳叶蚂蟥1000g(沥水10min)，向其中加入营养液800mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min；所用营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.5%、丝氨酸0.7%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%；
(3)将柳叶蚂蟥转移到一个挤压桶中，沥干5min后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压柳叶蚂蟥至初始体积的70%，以促使柳叶蚂蟥分泌并吐出唾液，用1200ml无菌水分3次清洗柳叶蚂蟥及挤压桶内外壁，收集清洗液(其中含有天然水蛭素)；
(4)向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩(至约200ml)，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干(水分小于5%)，得粉末状的天然水蛭素。
使用实施例9的水蛭素的抗凝血酶活性测定方法，测定实施例11~19所得各批天然水蛭素的抗凝血酶活性，结果：实施例11~13三批天然水蛭素的抗凝血酶活性均在8~10U/mg范围内例如实施例11水蛭素抗凝血酶活性为9.12U/mg，实施例14~16三批天然水蛭素的抗凝血酶活性均在9~12U/mg范围内例如实施例14水蛭素抗凝血酶活性为11.27U/mg，实施例17~19三批天然水蛭素的抗凝血酶活性均在9~11U/mg范围内例如实施例17水蛭素抗凝血酶活性为10.48U/mg。另外，根据实施例11~19所得天然水蛭素粉的重量计算该实施例所得水蛭素粉的总抗凝血酶活性，结果：实施例11~13三批水蛭素粉的总抗凝血酶活性在12700~13100U范围内(例如实施例11水蛭粉总抗凝血酶活性为12950U)，实施例14~16三批水蛭素粉的总抗凝血酶活性在13800~14400U范围内(例如实施例14水蛭粉总抗凝血酶活性为14270U)，实施例17~19三批水蛭素粉的总抗凝血酶活性在13200~13900U范围内(例如实施例17水蛭粉总抗凝血酶活性为13775U)。
从这些结果可见，本发明方法可适用于使用其它种类的水蛭制备天然水蛭素。
本文中所举的实施例仅用以说明本发明的组成及功效，并非因此局限本发明的专利范围，故对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以做出类似修改，均隶属于本发明的专利范畴。这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (17)
1.制备天然水蛭素的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)使成熟、健康的水蛭进行饥饿饲养；
(2)向饥饿的水蛭中加入营养液饲喂，再用无菌水浸泡，最后转移到乙酸中浸泡；所述营养液包含：氯化钠0.8~1%、葡萄糖4~6%、消旋羟蛋氨酸钙0.4~0.5%、丝氨酸0.7~0.8%、猪血粉3.5~4.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.015~0.025%、水适量至100%；
(3)将水蛭转移到一个挤压桶中，对水蛭进行挤压，以促使其分泌并吐出唾液，用无菌水分清洗水蛭和挤压桶，收集清洗液；
(4)向清洗液中加入浓度递增的硫酸铵，使杂质沉淀并将其除去；
(5)用半透膜将上一步骤所得液体进行透析以除盐并浓缩，定量转移至平皿中，冷冻干燥至干，得粉末状的天然水蛭素。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述水蛭为选自下列物种的水蛭：菲牛蛭即Hirudinaria manillensis Lesson、蚂蟥即Whitmania pigra Whitman、水蛭即Hirudonipponica Whitman、柳叶蚂蟥即Whitmania acranulata Whitman、日本医蛭、宽体金线蛭。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(1)是照如下方式操作的：将成熟、健康的水蛭从饲养池中转移到清水池中，每隔2天换清水，不喂食，如此持续28天达成饥饿状态后，从清水池中捞出，用无菌水浸泡3次，每次20分钟。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.4%、丝氨酸0.8%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述营养液组成为：氯化钠0.9%、葡萄糖5%、消旋羟蛋氨酸钙0.5%、丝氨酸0.7%、猪血粉4%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.02%、水适量至100%。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述营养液组成为：氯化钠1%、葡萄糖4%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉4.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.025%、水适量至100%。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述营养液组成为：氯化钠0.8%、葡萄糖6%、消旋羟蛋氨酸钙0.45%、丝氨酸0.75%、猪血粉3.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.015%、水适量至100%。
9.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(2)是照如下投料的比例进行操作的：取饥饿的水蛭1000g，向其中加入营养液800~1200mL饲喂5h，再用无菌水浸泡3次，每次60分钟，最后转移到2%乙酸中浸泡30min。
10.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述挤压桶是一个具有如下尺寸比例的桶顶开口的不锈钢圆桶内径10cm、深35cm，且该挤压桶的四周和底部布满1mm小孔。
11.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述挤压是在挤压桶中将水蛭挤压至其初始体积的50~70%。
12.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(3)是照如下方式进行操作的：将水蛭转移到一个挤压桶中，沥干后，用直径与挤压桶圆桶内径相同的盖板挤压水蛭至初始体积的50~70%，以促使菲牛蛭分泌并吐出唾液，用无菌水分次清洗菲牛蛭及挤压桶内外壁，收集清洗液。
13.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述浓度递增的硫酸铵是加硫酸铵至浓度达20~80%的范围。
14.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(4)是照如下方式进行操作的：向清洗液中加硫酸铵依次至20%、40%和60%浓度并分别静置60min后弃沉淀，最后使上清液3000rpm离心15min，弃沉淀，以除去杂质。
15.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(5)中，每1000g水蛭处理至除盐并浓缩至200ml。
16.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(5)中，冷冻干燥至干水分小于5%，得粉末状的天然水蛭素。
17.用于喂饲水蛭以制备天然水蛭素的营养液，其特征在于，包含：氯化钠0.8~1%、葡萄糖4~6%、消旋羟蛋氨酸钙0.4~0.5%、丝氨酸0.7~0.8%、猪血粉3.5~4.5%、(2E)-3-(3-戊基-2-环氧乙烷基)丙烯醛0.015~0.025%、水适量至100%。
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