JPH04327538A - 新しい医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血管内皮細胞増殖促進
活性を有するポリペプチドに関する。詳しくは、該ポリ
ペプチドを主成分とする、血管内皮損傷に由来する疾患
の治療用医薬組成物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】血管内皮細胞の損傷により種々の疾患が
引き起こされることが知られている。血管の中に血栓が
できる疾患において、血栓ができる過程は、まず血管内
皮細胞が何らかの原因で障害を受けて剥がれ、内皮下組
織に血小板が粘着するところから始まる。粘着した血小
板にさらに血小板が凝集し白色血栓が形成される。つい
で、内皮損傷部位では組織因子が遊離または利用可能な
状態になり、外因系血液凝固系を活性化し、また、内皮
下組織ことにコラーゲンや基底膜などが内因系血液凝固
系を活性化し、血液凝固カスケードが働いて、フィブリ
ン塊が形成され、最終的な赤色血栓に至る。

【０００３】例えば、急性心筋梗塞症に対して、カテー
テルを血管内に挿入し、閉塞部まで到達させ、風船を膨
らませて物理的に閉塞部を広げたり（ＰＴＣＡ）、カテ
ーテルから組織プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔ
ＰＡ）やウロキナーゼなど血栓溶解酵素を放出させたり
する（ＰＴＣＲ）が、これらのＰＴＣＡやＰＴＣＲ等の
閉塞部位開通療法を施した場合は、カテーテルの血管内
挿入により内皮細胞が剥離等の障害を受け、そこに血小
板が粘着・凝集し、さらに血液凝固促進物質により、血
栓が形成され急性期の再閉塞がおこる。また、特にＰＴ
ＣＡの場合、活性化血小板から放出される血小板由来成
長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　　Ｄｅｒｉｖｅｄ　　Ｇｒ
ｏｗｔｈ　　Ｆａｃｔｏｒ、以下　　ＰＤＧＦ）等によ
り血管中膜平滑筋の血管内膜への遊走と増殖がおこり、
異常増殖した血管平滑筋細胞による慢性期または亜急性
期の再閉塞、再狭窄が生じる。

【０００４】また、動脈硬化においても、過酸化脂質、
ラジカル、コレステロール等、種々の原因物質によって
血管内皮細胞が障害を受け、そこに血小板が粘着・凝集
し、その活性化された血小板から放出されるＰＤＧＦ等
により、血管平滑筋の内膜への遊走と異常増殖が起こり
、最終的には粥状の硬化巣を形成する。さらには敗血症
などにおいても、エンドトキシンやサイトカイン等の原
因物質によって血管内皮細胞が損傷を受け、血小板凝集
及び血液凝固、そして血栓形成がおこる。

【０００５】これらの疾患は血管内皮細胞の剥離などの
損傷が大きな発症原因の一つとなっている。よって、内
皮細胞の増殖を促進し、障害をうけた血管内皮を修復す
る医薬が望まれている。血管内皮細胞の増殖因子として
は、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）や、血小板由来内皮
細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）（Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎ
ｏ他　　Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　　Ｖｏｌ．２６２　　Ｎｏ．９　　４０９８−４
１０３，１９８７及びＫ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ他Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ．２８　　Ｎｏ．４　　１７０
４−１７１０　　１９８９　　等）等が知られているが
、これらにはいずれも血小板凝集や、血液凝固に対する
阻害効果はない。

【０００６】一方、血液凝固に関わる蛋白分解酵素（血
液凝固因子）群を阻害する物質として、老人斑アミロイ
ド前駆体蛋白質（以後、ＡＰＰ）中に内在される、蛋白
分解酵素阻害活性をもつ部分であるＡＰＰＩが知られて
いる（欧州特許公開番号０３０４０１３号や、北口ほか
著、神経研究の進歩（１９９０年医学書院発行）第３４
巻３号４０９〜４２１ページ、及びＮ．Ｋｉｔａｇｕｃ
ｈｉ　　ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　　Ｖｏｌ．３３１，
ｐ５３０−５３２，１９８８、Ｐ．Ｐｏｎｔｅｅｔ　　
ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　　Ｖｏｌ．３３１．ｐ５２５−５
２７，１９８８、ＲＥ　　Ｔａｎｚｉ　　ｅｔ　　ａｌ
．Ｎａｔｕｒｅ　　Ｖｏｌ．３３１，ｐ５２８−５３０
，１９８８、公表特許公報平２−５０１７９６など）。

【０００７】ＡＰＰＩは、具体的には、本発明図面図１
中のＡＰＰ７５１（７５１アミノ酸からなるＡＰＰ）中
の斜線部、及びＡＰＰ７７０（７７０アミノ酸からなる
ＡＰＰ）中の斜線部と点々部分をさし、そのアミノ酸配
列はそれぞれ図２及び配列番号２（ＡＰＰ７５１中のＡ
ＰＰＩ）と図３及び配列番号３（ＡＰＰ７７０中のＡＰ
ＰＩ）に示した通りである。

【０００８】配列番号２と配列番号３に共通な配列（図
２、図３の残基番号で２８９のＧｌｕから３４４のＡｌ
ａまでであり、図４及び配列番号１に示した）が蛋白分
解酵素阻害活性に重要と考えられている部分で、以後Ｋ
ＰＩと呼ぶ。ＡＰＰＩはトリプシンを強く阻害すると共
に、血液凝固因子ファクターＸａにも阻害活性を示し（
Ｋｉ＝１．２×１０−６Ｍ）、血しょうカリクレインに
対してもＫｉ＝１．９×１０−７Ｍと強い阻害活性をも
つ（特開平２−１０１０１７号公報、Ｂｉｏｃｈｉｍｉ
ｃａ　　ｅｔ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　　Ａｃｔａ　
　Ｖｏｌ．１０３８１０５−１１３　　１９９０など）
。

【０００９】また、ＡＰＰ７５１またはＡＰＰ７７０の
分泌型蛋白は内因系の血液凝固因子ファクターＸＩａを
極めて強く阻害する（Ｋｉは１０−１０　〜１０−１０
　Ｍ）ことも最近報告された（Ｖａｎ　　Ｎｏｓｔｒａ
ｎｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６５　
　９５９１−９５９４，１９９０．Ｓｍｉｔｈら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４８　　１１２６−１１２８，
１９９０．）。 ファクターＸＩａは血液凝固カスケードのかなり上流の
酵素であり、ファクターＸＩａの１分子の阻害は、最下
流のトロンビンを極めて多数阻害することに匹敵する。

【００１０】さらに、ＡＰＰ７７０またはＡＰＰ７５１
は血小板α顆粒に含まれ、血小板の活性化と共に分泌さ
れるという報告もある。（Ｖａｎ　　Ｎｏｓｔｒａｎｄ
　　ｅｔａｌ．　　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　Ｖｏｌ．２４８
，ｐ７４５−７４８，１９９０）。また、ＡＰＰ７５１
はマウス線維芽細胞株　　Ｓｗｉｓｓ　　３Ｔ３　　に
対して増殖刺激活性をもつ事も知られている（Ｓｃｈｕ
ｂｅｒｔ　　ｅｔ　　ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．１６２　　ｐ
８３−８８，１９８９．）。さらに、ＡＰＰのアンチセ
ンスｍＲＮＡを発現させ、内因性のＡＰＰの発現を減少
させた特殊な線維芽細胞に対して、ＡＰＰ７５１及びＡ
ＰＰ６９５が増殖刺激活性をもつという報告もなされて
いる（Ｓａｉｔｏｈｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ　　Ｖｏｌ．５
８　　ｐ６１５−６２２，１９８９）。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】この発明の目的は、潰
瘍、外傷およびカテーテル挿入などの物理的刺激やエン
ドトキシンなどの種々の原因によって起こされる血管内
皮の損傷を修復し、かつ過度の血液凝固及び血小板の凝
集を阻害して、障害の治癒を早めるという、新しいタイ
プの血管内皮細胞修復剤を提供することである。詳しく
は、極めて強い血管内皮細胞増殖促進活性を有し、かつ
血小板凝集阻害活性と血液凝固阻害活性を合わせ持つ創
傷治療薬（火傷、糖尿病性潰瘍、下肢潰瘍など）、冠状
動脈閉塞開通後の再閉塞防止剤、心筋梗塞治療薬、およ
び敗血症治療薬を提供することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の目
的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、下述する知
見を得、該知見に基づいて更なる研究の結果、本発明の
完成に至ったものである。即ち本発明者らは、ＫＰＩ及
びＫＰＩを含むポリペプチドが、極めて低濃度で血管内
皮細胞の増殖を促進することを見いだし、さらに、該ポ
リペプチドが、内因系血液凝固の阻害活性と血小板凝集
阻害活性とを合わせ持つことを見いだし、これらの知見
に基づき本発明を完成した。

【００１３】従って本発明は、配列表中配列番号１に記
載のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＫＰＩ）を少
なくともその一部に含むポリペプチド、蛋白質、化合物
を有効成分として含有する創傷治療薬、再閉塞防止剤、
心筋梗塞治療薬、および敗血症治療薬を提供する。ここ
でいう化合物とは、生体内で徐放性を持たせるために本
発明にかかるポリペプチドとポリエチレングリコール等
のポリマーを結合した化合物や、他の生理活性を有する
低分子有機化合物と本発明にかかるポリペプチドとの結
合物や、血管内皮細胞への親和性を高めるなどの目的で
本発明にかかるポリペプチドと糖、抗体などの他の蛋白
質とを必要ならば適当な有機分子からなるスペーサーを
介して結合した化合物などを意味する。

【００１４】実施例に示したように、配列番号１のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを含む蛋白は、１０−１
０　Ｍという極めて低濃度で血管内皮細胞の増殖を対照
に比して数倍促進し、また、１０−８Ｍ程度の低濃度か
ら、内因系血液凝固の指標である活性化部分トロンボプ
ラスチン時間（ＡＰＴＴ）を延長し（内因系血液凝固を
阻害する）、さらに１０−７〜１０−６Ｍの濃度で、Ａ
ＤＰ刺激による血小板凝集を阻害する。

【００１５】本発明にかかるポリペプチドの血管内皮細
胞の増殖活性は、１０−８Ｍ位の濃度でも現れるが、１
０−１０　Ｍでも十分活性が高い。低濃度の方が活性が
高い場合さえある。この増殖促進活性の機序は明らかで
はないが、ＫＰＩ部分を含んでさえいれば活性は発現す
る。ＫＰＩを含むＡＰＰの比較的大きな断片（約１００
アミノ酸以上）の場合は内皮細胞増殖促進活性が増強さ
れる場合がある。

【００１６】本発明にかかるポリペプチドの内因系血液
凝固阻害様式は、低濃度から阻害するが比較的高濃度で
もＡＰＴＴを数倍しか延長せず、穏和な阻害といえる。 ヘパリンのようにわずかの濃度の増加で血液の凝固を強
く阻害する結果出血傾向を惹起してしまう薬に比べ、本
発明にかかるポリペプチドは、著しく安全域の広い、即
ち臨床上、使いやすい薬であるといえる。

【００１７】具体的には、実施例に示したように、コン
トロールの凝固時間に対して１．５倍と２．５倍の凝固
時間を与えるサンプル濃度の比（ＥＤｒ）は、ヘパリン
の場合は１．５となり、投与量のコントロールが困難と
考えられた。それに対して、本発明にかかるポリペプチ
ド（実施例１記載のＩＪ）のＥＤｒは２６であり、低濃
度から高濃度にかけて徐々に凝固を阻害することから、
極めて安全域の広い薬剤と成り得るものである。このこ
とは、急性血栓症のみならず、慢性の血栓症の治療の場
合には特に重要である。

【００１８】これら３つの活性、即ち血管内皮細胞増殖
促進、血小板凝集阻害、血液凝固阻害の活性発現には、
ＫＰＩ領域が存在していればよい。また、上記３つの活
性のうち、いづれかまたは全ての活性がヘパリン様物質
の共存によって上昇することがある。配列番号１のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを少なくともその一部に
含むタンパク質として、たとえば、配列番号１のアミノ
酸配列からなるもののほかに、さらに、ＡＰＰ７７０に
特有の１９アミノ酸挿入配列（図１参照。この１９アミ
ノ酸部分には、Ｏ−グリコシレーションが起こるサイト
がある）の一部または全部が付加していても良いし、図
２に示したアミノ酸配列を含む蛋白であってもよい。ま
たＫＰＩにＡＰＰ７５１またはＡＰＰ７７０の一部また
は全部のアミノ酸配列が付加していてもよい。ＡＰＰ７
７０またはＡＰＰ７５１が細胞外へ分泌された物等もＫ
ＰＩを含んでいれば本発明に含まれる。さらに、配列番
号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＮ末端また
はＣ末端のアミノ酸を更に切り縮められる可能性もある
。

【００１９】また、β−ガラクトシダーゼや腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）などとＫＰＩを含むポリペプチドとの融合
蛋白も本発明に含まれる。但し、産生量を上げるためや
精製を容易にするためにこれらの融合蛋白の形で産生し
た場合であって、ＴＮＦ等の生理活性が患者への投与に
望ましくない場合は、融合蛋白の形で産生させた後ＫＰ
Ｉを含む断片をＴＮＦ等から切り離すことが望ましい。

【００２０】更にまた、本発明にかかる蛋白質の蛋白分
解酵素阻害活性の中心付近、例えば活性中心Ｐ１（図４
中の第３０１残基（配列番号１の第１３残基）のＡｒｇ
）のＮ末およびＣ末側それぞれ５個のアミノ酸からなる
ペプチドを、他の蛋白分解酵素阻害剤、たとえばウシ膵
臓トリプシンイソヒビター（以下ＢＰＴＩ）やヒト膵臓
分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＴＩ）やヒトイン
ターαトリプシンインヒビター等の対応する部分と置換
したものも、本発明の目的を達成しうることが期待され
る。

【００２１】また、配列番号１の第１３残基のＡｒｇを
Ｌｙｓなどに、第１５残基のＭｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、
Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅなどに置換したものも、本発明
にかかる蛋白質である。本発明にかかる蛋白質は、その
アミノ酸配列をコードするＤＮＡを適当なプロモーター
の下流に接続し、大腸菌、枯草菌、動物細胞等の適当な
宿主へ形質転換し、形質転換体を培養することにより産
生せしめることができる。

【００２２】かかるＤＮＡは有機化学的に合成したＤＮ
Ａを適当にアニーリング及びライゲーションすることに
よって得られる。またヒト脳アミロイド前駆体蛋白質で
ある、７７０あるいは７５１アミノ酸からなる蛋白質（
欧州特許公開番号０３０４０１３号参照。図１のＡＰＰ
７７０、ＡＰＰ７５１）のｃＤＮＡから、目的とするＤ
ＮＡを得ることもできる。

【００２３】また、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ
の上流に、分泌のためのシグナル配列を接続し、宿主が
動物細胞の時は培地中に、または宿主が大腸菌の時はペ
リプラズムや培地中に本発明の蛋白質を分泌させること
もできる。培地中に、本発明の蛋白質を分泌させるよう
にしたこのようなＤＮＡは、該蛋白質を効率よく精製す
る点で有用である。

【００２４】また、本発明の蛋白質を適当な他の蛋白質
（例えばβ−ガラクトシダーゼやその一部或はＴＮＦな
ど）と接続した融合蛋白として産生させたのち、該接続
蛋白部分の抗原性やその他の性質を用いて、該融合蛋白
の精製、定量をすることもできる。さらに、該融合蛋白
を例えばファクターＸａ（この場合は融合蛋白の連結部
にファクターＸａ認識配列を位置させる）等の適当な蛋
白分解酸素や、シアノジェンプロマイド（メチオニンで
切断）、ヒドロキシルアミン等の切断のための薬剤等で
処理して、目的とする本発明の蛋白のみを単離すること
もできる。

【００２５】本発明に関する蛋白質をコードするＤＮＡ
を、適当なプロモーターの下流に接続し、場合によって
は、そのさらに下流に適当なｐｏｌｙ（Ａ）付加ジグナ
ルなどのターミネーションシグナルを付加し、動物細胞
ヘトランスフェクトすることにより、その細胞中または
上清中に本発明の蛋白を産生させることができる。この
ようなプロモーターとしては、例えばＳＶ４０初期、Ｓ
Ｖ４０後期、ＭＭＴＶなどのウィルスプロモーター、ア
クチン、チューブリン等の細胞構成蛋白のプロモーター
、メタロチオネイン、ヒートショック蛋白などの誘導型
プロモータなどがあげられる。

【００２６】ベクターとしてはＳＶ４０、ウシパピロー
マウィルス（ＢＰＶ）などのウィルスベクターを用いる
ことができるが、また、ベクターを用いず直接動物細胞
へトランスフェクトすることも可能である。この際、適
当なマーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子を接続す
るかまたは同時にトランスフェクト（コトランスフェク
ト）することにより、宿主に抗生物質Ｇ４１８に対する
耐性を与え、形質転換体を効率よく選択することもでき
る。

【００２７】また、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の近く
に本発明にかかる蛋白質産生のためのＤＮＡを位置させ
たプラスミド等をＣＨＯ等の動物細胞にトランスフェク
トし、メトトレキセート（ＭＴＸ）による薬剤圧力をか
けて、遺伝子増幅をはかることも可能である。動物細胞
宿主としては、サル腎臓由来ＣＯＳ細胞、チャイニーズ
ハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞、マウスＣ−１２７細胞
、ヒトＨｅＬａ細胞、ラットＰＣ１２細胞、ヒト腎臓由
来２９３細胞などを用いることができる。

【００２８】さらにまた、本発明にかかる蛋白質は、上
述のＤＮＡをｔｒｐ，ｌａｃ，ｔａｃ等の適当なプロモ
ーターの下流に接続し、場合によってはこれらの下流に
適当なターミネーションシグナルを付加し、さらに複製
可能なベクターを連結して、微生物宿主形質転換し、こ
れを培養することにより産生させることができる。この
とき目的とするペプチドを直接発現させるためにその遺
伝子の５’末端に翻訳開始シグナルのＡＴＧを付加する
ことも可能である。また、培地またはペリプラズム中に
直接分泌させるために、ジグナル配列を付加することも
可能である。

【００２９】低分子ペプチドは微生物中では不安定なこ
とがあるので、適当な担体蛋白との融合蛋白として産生
する事も可能である。この融合蛋白は産生後、適当な蛋
白分解酵素や切断のための薬剤（一般にはシアノジェン
ブロマイドやヒドロキシルアミン等が用いられる）等で
処理して目的とする部分を切り出す事も可能である。宿
主微生物としては、例えば大腸菌、枯草菌、カビ、酵母
等が用いられる。

【００３０】またさらに、本発明にかかる蛋白質は、ア
ミノ酸を出発原料として有機合成により製造することが
できる。その場合の方法としては、例えば、生化学実験
講座第１巻、蛋白質の化学ＩＶ（日本生化学会編、東京
化学同人）に詳しく記されている方法を用いることがで
きる。また別に、ペプチド合成機を用いる固相合成法に
より製造することもできる。

【００３１】本発明にかかる蛋白質を微生物宿主で産生
した場合や化学合成で得た場合、システイン残基間で正
しいＳ−Ｓ結合の形成、即ち、正しい折り畳み（ｆｏｌ
ｄｉｎｇ）ができないことがあるが、この場合は、Ｓ−
Ｓ結合を一旦還元してその後再酸化して自然に正しいｆ
ｏｌｄｉｎｇを起こさせることが必要である。本発明に
かかる蛋白質は、蛋白質またはペプチドの精製方法とし
て知られる各種の方法を組み合わせることによって精製
することができる。そのような方法としては例えば、高
速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、
等電点電気泳動、塩析、硫安沈澱などを用いることがで
きる。また、本発明にかかる蛋白はトリプシンに対する
結合活性が強いので、担体に固定化したトリプシンやア
ンヒドロトリプシン等を用いたアフィニティークロマト
グラフィーは特に有用である。

【００３２】本発明の医薬組成物は、本発明にかかる蛋
白質を単独で、または薬剤として可能な担体と複合して
投与される。その組成は、該蛋白質の溶解度、投与経路
、投与計画等によって異なる。例えば、本発明にかかる
蛋白質を非経口的に静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射
で投与する場合、溶液を等張にするために、食塩あるい
はグルコース等の他の溶質を添加した無菌溶液として使
用される。また、鼻粘膜や直腸の粘膜を通した投与も可
能で、経鼻剤や座剤としても用いられうる。また、適当
なポリマーのマトリックス（ゲル）中に本発明にかかる
ポリペプチドを含有させ皮下などに注射することにより
、１回の投与で長期間徐放させるという剤型も用いられ
うる。

【００３３】さらに、澱粉、乳糖等の適当な賦形剤を含
む錠剤、カプセル剤、顆粒剤や、溶液の状態で経口投与
も可能である。ただし、本発明にかかる蛋白質は分子量
の比較的大きな薬剤なので、腸管吸収性の点から非経口
投与が望ましい。非経口投与では、薬効が早く現れる点
で、静脈内投与、点滴静注等が好ましい。本発明の医薬
組成物の投与量は、投与法、用いる蛋白質の配列、患者
の状態等によって異なり、特に限定されないが、ＰＴＣ
ＡやＰＴＣＲ後の再閉塞防止の際は、静脈内投与で、一
日一人あたり０．１から１００ｍｇ、望ましくは１から
２０ｍｇであり、心筋梗塞等の血栓症の治療の場合は一
日一人当り０．３から３００ｍｇ、望ましくは３から６
０ｍｇである。そして、さらに火傷等の創傷治療のため
には、損傷程度や患部にもよるが一日一人当り０．０１
から１０ｍｇの患部塗布または患部への噴霧が望ましい
。

【００３４】

【実施例】以下に実施例により本発明を詳述するが、本
発明は該実施例によって限定されるものではない。尚実
施例の中の基本操作は下記の文献にしたがった。 ・Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ，　　Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９
８９）．・Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ．，
ＤＮＡ　　ＣＬＯＮＩＮＧ，ＩＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ，（
１９８５）．実施例中に記載の略号、略称で本文中に記
載の無いものは以下の通りである。

【００３５】ＮＡＤ　　　　　　；ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド ＤＴＴ　　　　　　；ジチオスレイトールＰＢＳ（−）
；ダルベッコの燐酸緩衝塩溶液（Ｃａ及びＭｇ不含） ＯＡｃ　　　　　　；ＯＣＯＣＨ３　 ＦＣＳ　　　　　　；ウシ胎児血清 ＤＭＳＯ　　　　；ジメチルスルホキシドＢＡＰ　　　
　　　；バクテリアアルカリフォスファターゼｔＰＡ　
　　　　　；ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータ
ー バッファーＴ；０．２Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）／０
．０２Ｍ　　ＣａＣｌ２／０．００５％　　Ｔｒｉｔｏ
ｎ　　Ｘ−１００ ＭＣＡ　　　　　　；７メチルアミノクマリン実施例１
　　ＩＪ（ＡＰＰＩ−８８，配列番号４）の作成と活性
測定 〔工程１〕　　ＡＰＰ７７０からのＡＰＰＩ部分の切り
出し 発現の母核となる部分として、プロテアーゼ阻害活性を
コードする部分（ＡＰＰＩ）に加えて、Ｎ末側及びＣ末
側にＡＰＰ７７０由来のアミノ酸を十数個含むペプチド
部分を発現させた。

【００３６】このために、ＡＰＰ７７０をコードするＤ
ＮＡを、合成オリゴヌクレオチドを用いたいわゆる部位
特異的変異法で切り縮めた。この反応にはＭｕｔａｎＴ
ＭＧ（宝酒造）システムを用い、特公平２−２００１８
５号公報記載の方法に準じて、付属されるプロトコール
を一部改変して３’側及び５’側の欠失反応を同時に行
った。

【００３７】欧州特許公開番号０３０４１３号公報記載
のヒトアミロイド前駆体遺伝子ｃＤＮＡを含むプラスミ
ドｐＧＢＰ２（ＡＴＣＣ−６７５０２の番号で寄託）を
制限酵素ＢａｍＨＩ消化後アガロースゲル電気泳動で分
画し、ＡＰＰＩ部分を含む、１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片
を回収した。この断片をＢａｍＨＩ切断ＢＡＰ処理した
ベクターＴｖ１８（宝酒造）に接続し、目的の方向に組
み込まれたクローンＴｖＢＢ１を得た。（図５）。

【００３８】５’末側及び３’末側の欠失のため、図７
に示す２本のオリゴヌクレオチドＤ５，Ｄ３をアプライ
ドバイオシステムズＤＮＡ合成機３８０Ａにて合成し、
反応に使用した。Ｄ５による欠失反応が起こると、Ｂａ
ｍＨＩ切断後、ｔＰＡのシグナル配列中に存在するＢｇ
１　ＩＩ　部位と接続した時、ｔＰＡシグナル配列の後
にＡＰＰ７７０由来の７アミノ酸に続き配列番号１に記
したペプチドがつながる構造を持つ（図６）。

【００３９】さらに、Ｄ３による欠失が起こると、配列
番号１の部分に続きＡＰＰ７７０由来のＣ末側２５アミ
ノ酸とそれに続く停止コドンとＢａｍＨＩ部位が導入さ
れる。すなわちＤ３を用いた反応は欠失反応と同時に２
塩基の置換を行うものである（図６及び図７参照）。ま
ず、１本鎖ＴｖＢＢ１ＤＮＡ０．５μｇにキットに付属
するｍｐ１８Ｐ　　ＤＮＡを０．２μｇを加え、１０μ
１の（２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１
ｍＭ　　ＤＴＴ）中で１００℃　　３分、６５℃　　１
０分、３７℃　　１０分インキュベートしてアニールさ
せた。このアニールさせたＤＮＡ溶液４．５μｌに燐酸
化したＤ３，Ｄ５をそれぞれ１６ｎｇ加えて６５℃　　
１５分、３７℃　　１５分インキュベートしアニールさ
せた。ここに３０μｌの５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、６０ｍＭＮＨ４　ＯＡｃ、５ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２　、５ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　ＮＡＤ及
び６０ユニットのＥ．ｃｏｌｉリガーゼ、１ユニットの
Ｔ４ポリメラーゼを加え、２５℃で２時間反応させた。

【００４０】この反応物を大腸菌ＢＭＨ７１−１８株に
トランスフェクトし、１時間培養後ファージ粒子を含む
培養液を大腸菌ＭＶ１１８４株にインフェクトし、プラ
ークを形成させた（使用した大腸菌及びバッファー、酵
素はすべて宝酒造）。このプラークに対して３２Ｐで標
識したＤ５とＤ３を用いてスクリーニングした。Ｄ５，
Ｄ３ともにポジティブなシグナルを与えるプラークのう
ち４つを選定し、Ｍ１３シークエンスキット（宝酒造）
を用いて欠失部位の塩基配列を決定した。Ｄ３の欠失に
は、キャットに付属のユニバーサルプライマーを、Ｄ５
の欠失にはカスタムメイドのプライマー（５’−ＡＣＴ
ＴＴＧＧＧＡＣＡＴＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡ−３’）
を用いた。目的の欠失が起こっているクローンを、Ｔｖ
ＩＪと命名した（図５）。 〔工程２〕分泌シグナルを持つ動物ベクターへの組み込
み 上記の欧州特許公開番号０３０４０１３号公報に記載の
ヒトｔＰＡを発現するプラスミドベクターｐＳＶＭＴｔ
ＰＡを制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩ　で完全消化後、ＢａｍＨ
Ｉで部分消化し、得られる約３．８ｋｂの断片をＴｖＩ
ＪのプラスミドをＢａｍＨＩを消化して得られる約３０
０ｂｐの断片と連結し、目的の方向に組み込まれたクロ
ーンを選択した。

【００４１】これによりｔＰＡのシグナル配列に続くＡ
ＰＰＩ部分をＳＶ４０およびマウスメタロチオネインプ
ロモーターにて発現させるベクターｐＩＪを得た（図８
参照）。 〔工程３〕ＩＪの動物細胞での発現と粗精製液の調製ｐ
ＩＪのプラスミドＤＮＡ２０μｇを、１×１０６　個の
サル由来細胞株ＣＯＳ−１〔グルツマン　　Ｙ．Ｇｌｕ
ｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３１　　７５　　（１９８１）
、大日本製薬〕へ、シュークロース含有燐酸緩衝液（２
７２ｍＭ　　シュークロース、７ｍＭ燐酸ナトリウム（
ｐＨ７．４）、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　）中で導入した
。

【００４２】導入はバイオラッド社のジーンパルサーを
用い、電圧４００Ｖ、キャパシター３μＦ、タイムコン
スタント１．０〜１．３ｍ秒で、３０秒の間をおいて２
回パルスを与えることにより行った。導入後の細胞を、
１０％ＦＣＳを含むダルベッコ変法最小基本培地中で３
７℃、５％　　ＣＯ２　の条件下で２４時間培養後、血
清を含まない培地で洗浄し、血清を含まない培地１０ｍ
ｌを加えて、４８時間培養したのち培地を回収した。さ
らに培地を加え、４８時間後ごとに計３回培養上清を回
収した。この導入を３回行い、合計９０ｍｌの培養上清
を得た。

【００４３】こうして得られた培養上清に対して、アセ
トンを終濃度３０％になるように加え、−２０℃にて１
時間放置後、５０００ｒｐｍ、−１０℃にて２０分間遠
心分離後、上清を回収した。さらに、この上清に終濃度
７０％になるようにアセトンを加えて、−２０℃１時間
放置後、５０００ｒｐｍ、−１０℃にて２０分間遠心分
離後、沈澱を回収した。

【００４４】得られた沈澱を、５ｍｌの２０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．０）に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４℃に
て１０分間遠心分離し、上清を粗精製液として回収した
。この上清に含まれる目的とするＡＰＰＩ蛋白をＩＪと
呼ぶ。ＩＪのアミノ酸配列を図１及び配列表配列番号４
に示す。 〔工程４〕トリプシン固定化アガロースによるＩＪの精
製 工程３で得られた粗精製液を３７℃に保温した後、ＴＰ
ＣＫ処理済みトリプシン固定化アガロースビーズ（シグ
マ社）１００単位を加え、３７℃で１時間振とうするこ
とにより、ＩＪのプロテアーゼ・インヒビター領域を吸
着させた。かかる懸濁液を、５’プライム→３’プライ
ム社のセレクトＳＴＭ空カラムに充填し、アガロースビ
ーズを回収した。アガロースビーズとバッファーとの分
離は、１０００ｒｐｍ１分間の遠心操作により行った（
以下の記述中のアガロースビーズの回収も同様にして行
なった）。

【００４５】回収したビーズを、０．３ＭＮａＣｌ、１
０ｍＭ　　ＣａＣｌ２、１０ｍＭ　　ＨＣｌ（ｐＨ２）
から成る溶出液６ｍｌで溶出した。溶出は計３回行い、
各溶出液をＮａＯＨ水溶液を用いて中和した後、トリプ
シン阻害活性を測定した。 〔工程５〕トリプシン阻害活性の測定 トリプシンの阻害活性のＩＣ５０は（酵素活性を５０％
阻害する阻害剤の濃度）は下記の方法で測定した。

【００４６】９０μｌのバッファーＴに１０μｌのサン
プルを加え、同じくバッファーＴを用いて９６穴プレー
ト上で２〜１０２４倍希釈し、各希釈度のサンプル液５
０μｌを調製した。これに同バッファーで４×１０−９
Ｍに調製したブタ膵臓トリプシン液（シグマ）を５０μ
ｌ加え、１時間室温にて放置後、蛍光基質として同バッ
ファーで調製した（０．４％ＤＭＳＯを含む）０．２ｍ
Ｍ　　Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（シグマ）を１
００μｌ加え、３０℃で０時間後及び１時間後、３６５
ｎｍで励起した時の４５０ｎｍの蛍光をＰａｎｄｅｘ社
製ＦＣＡで測定した。

【００４７】測定値を縦軸に希釈率を横軸にとりグラフ
をかき、バックグラウンドをひいた最大吸光度の半分の
値を与える希釈率からＩＪのＩＣ５０を求めた結果、２
．２ｘ１０−９Ｍであった。 〔工程６〕ＩＪの血小板凝集抑制作用 予め３．８％クエン酸ナトリウム水溶液を採血量の１０
％容入れてある注射筒を用いて採血し、これを静かに混
和した後、２２℃において８００ｒｐｍで１０分間遠心
分離をして上清より多血小板しょう（ＰＲＰ）を得た。 次に、ＰＲＰ分離後の血球部分を、さらに３０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心分離して上清を分取して乏血小板血し
ょう（ＰＰＰ）を得た。

【００４８】血小板凝集惹起剤のＡＤＰ溶液は、市販の
血小板凝集活性測定用ＡＤＰ（ベーリンガー・マンハイ
ム・ジャパン社製、０．２μｍｏｌ）を２ｍｌの精製水
で溶解（１００μＭ）して用いた。ミクロ試験管にＰＲ
Ｐを２００μｌ取り、これを３７℃で１０分間保温した
後、上記のＡＤＰ溶液１０μｌ（最終濃度５μＭ）を加
えて血小板凝集を起こさせ、血小板凝集能をボーンの方
法（Ｎａｔｕｒｅ　　Ｖｏｌ．１９４，９２７−９２９
（１９６２））により求めた｛測定機器：ＮＫＫ　　Ｈ
ｅｍａ　　ＴｒａｃｅｒＩＶ（二光バイオサイエンス社
製）｝。その結果、ＡＤＰ（５μＭ）惹起による血小板
凝集は、５０ｎＭのＩＪで完全に抑制された。一方、対
照として用いた５０ｎＭのＢＰＴＩは、血小板凝集阻害
活性を全く示さなかった。 〔工程７〕ＩＪの血液凝固阻害作用 本実施例１工程４で得られたＩＪについて、内因系凝固
阻害活性の指標である活性化部分トロンボプラスチン時
間（ＡＰＴＴ）に与える影響を検討した。　　まず、市
販のヒト血しょう（商品名：Ｃｙｔｏｓｏｌ　　ミドリ
十字社製）１００μｌとサンプル２０μｌをプラスチッ
ク製のキュベットに入れて、３７℃　　２分間保温した
。次に、市販アクチン（商品名：データファイ・ＡＰＴ
Ｔ，国際試薬−ミドリ十字社製）１００μｌを添加し十
分に混合した。３７℃３分間保温したのち、２０ｍＭ塩
化カルシウム（ミドリ十字社製）１００μｌを添加して
、凝固するまでの時間を測定した。尚、コントロールと
してはサンプルの代わりに生理食塩水（大塚製薬）を用
いた｛測定機器：Ａｍｅｌｕｎｇ−Ｃｏａｇｕｌｏｍｅ
ｔｅｒ　　ＫＣ１０Ａ）。

【００４９】１０−９〜１０−７Ｍの各濃度におけるＩ
Ｊの抗凝固活性を測定し、ヘパリン及びメシル酸ナファ
モスタット（鳥居薬品、商品名フサン）の抗凝固活性と
の比較を行った。その結果、ＩＪは内因系凝固をフサン
より低濃度で効果的に阻害した。即ち、コントロールの
凝固時間に対して２倍の凝固時間を与えるサンプル濃度
（ＥＤ２：Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　　Ｄｏｓｅ）で表すと
、ＩＪは１０−８Ｍであったのに対し、フサンが１０−
６Ｍであり、ＩＪは臨床上有効であると考えられた。

【００５０】さらに、薬剤の安定域を示す指標として、
コントロールの凝固時間に対して１．５倍と２．５倍の
凝固時間を与えるサンプル濃度の比（ＥＤｒ）を次式の
ごとく求めた。 ＥＤｒ＝ＥＤ２．５／ＥＤ１．５ ＥＤ２．５：コントロールの２．５倍の凝固時間を与え
るサンプルの濃度 ＥＤ１．５：コントロールの１．５倍の凝固時間を与え
るサンプルの濃度 その結果、ヘパリンのＥＤｒは１．５３となり、投与量
のコントロールが困難と考えられた。そに対して、ＩＪ
のＥＤｒは２５．９であり、低濃度から高濃度にかけて
徐々に凝固を阻害することから、極めて安全域の広い薬
剤と成り得るものである。 〔工程８〕血管内皮細胞増殖促進活性の測定市販の正常
ヒト血管内皮細胞培養キット（クラボウ製、商品名“Ｅ
ｎｄｏｃｅｌｌ　　Ｋｉｔ−Ｕ”）の正常ヒトさい帯血
管内皮細胞を、このキットに付属のＥ−ＧＭ培地（ウシ
胎児血清ＦＣＳ　　２％、上皮成長因子ＥＧＦ　　１０
ｎｇ／ｍｌ、ハイドロコーチゾン　　１μｇ／ｍｌ，ゲ
ンタマイシン　　５０μｇ／ｍｌ　　アンフォテリシン
Ｂ　　０．２５μｇ／ｍｌを含む改変ＭＣＤＢ１３１培
地）で４８時間培養し細胞数を増やした。その後、キッ
ト付属のトリプシン溶液で細胞を剥し、ついでトリプシ
ン中和液を添加した後、細胞を集めた。こうして得た細
胞を４８穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に播種し（約
２５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、Ｅ−ＧＭ培地で１日
培養した（３７℃、ＣＯ２　濃度５％）。

【００５１】細胞がプレート表面に付着したことを確認
したうえで新しいＥ−ＧＭ培地に交換し、これに、Ｃａ
とＭｇ不含のダルベッコの燐酸緩衝塩溶液｛ＰＢＳ（−
）｝にて希釈・調製したＩＪを添加し、キット付属のウ
シ脳抽出液を添加、または無添加で、６日間培養した後
、細胞数を計測した（顕微鏡観察下での計数及び撮影し
た写真上での計数。いずれも４視野以上の平均値。）そ
の結果、１０−９ＭのＩＪ添加では、ウシ脳抽出液添加
及び無添加何れの場合も、各々の場合の対照（ＩＪ溶液
の代わりにＰＢＳ（−）のみを添加）の場合に比して、
約４倍の細胞数が認められた。 実施例２　　ｓＰＩ（ＡＰＰＩ−７２、配列番号５）の
作成と活性測定 〔工程１〕　　ｓＰＩの発現 上記欧州特許公開番号０３０４１３号公報実施例７に記
載のＳＶＭＴ−ＡＰＰＩをＣＯＳ−１細胞に導入し、本
発明実施例１工程３に記載の方法と同様にして培養上清
からｓＰＩを粗精製した。次に、これを本発明実施例１
工程４に記載の方法で、固定化トリプシンを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーを行って精製した。ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、このｓＰＩ
は１７Ｋｄの単一の蛋白質まで精製された。ｓＰＩのア
ミノ酸配列は図９及び配列表配列番号５に示した。 〔工程２〕ｓＰＩの血小板凝集抑制作用本発明実施例１
工程６に示す方法にしたがって、ｓＰＩの血小板凝集能
を検討した。その結果、ＡＤＰ（５μＭ）惹起による血
小板凝集は、５０ｎＭのｓＰＩで完全に抑制された。 〔工程３〕ｓＰＩの抗血液凝固作用 本発明の実施例１工程７の方法にしたがって、１０−９
〜１０−７Ｍの名濃度におけるｓＰＩの抗凝固活性を測
定した。その結果、ｓＰＩのＥＤ２は１０−８Ｍ、ＥＤ
ｒは２６．０であった。 〔工程４〕ｓＰＩの血管内皮細胞増殖促進活性本発明実
施例１工程８の方法にしたがって、ｓＰＩの血管内皮細
胞増殖促進活性を測定した。

【００５２】ウシ脳抽出物を添加した場合は、対照（ｓ
ＰＩ溶液の代わりにＰＢＳ（−）のみを添加）に比べ、
１０−８ＭのｓＰＩ存在下では約２．７倍の細胞数が、
１０−９ＭのｓＰＩ存在下では約３．８倍の細胞数が１
０−１０　ＭのｓＰＩ存在下では約４．４倍の細胞数が
計測された。ｓＰＩの代わりにＢＰＴＩを添加した系で
は、１０−８Ｍで約３．９倍、１０−９Ｍで約３．２倍
、１０−１０　Ｍで約２．６倍の細胞数が計測された。

【００５３】また、ウシ脳抽出液を加えない場合は、１
０−８ＭのｓＰＩ存在下では対照に比べ約２．９倍の細
胞数が、１０−９ＭのｓＰＩ存在下では約３．６倍の細
胞数が、１０−１０　ＭのｓＰＩ存在下では約５．０倍
の細胞数が計測された。ｓＰＩの代わりにＢＰＴＩを添
加した系では、１０−８Ｍで約４．０倍、１０−９Ｍで
約３．０倍、１０−１０　Ｍで約２．２倍の細胞数が計
測された。 実施例３　　βガラクトシダーゼ・ＡＰＰＩ融合タンパ
クの大腸菌による発現 〔工程１〕融合タンパク発現プラスミドの構築大腸菌β
ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）のＮ末端にｓＰＩ（Ａ
ＰＰＩ−７２）を結合した融合タンパク（ＺＰＩ）を発
現しうるプラスミドを構築した。

【００５４】具体的には発現用ベクターｐＥＸ１（ベー
リンガー・マンハイム山之内社）を制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＰｓｔＩで切断し、直鎖状ベクターＤＮＡ断片を得
た。一方、欧州特許公開番号０３０４０１３号公報の実
施例４に記載のプラスミドｐＰＩｔｒｐ７５−１をＢａ
ｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動
後０．３ｋｂｐの断片を、フナコシ社製ジーン・クリー
ン・キットを用いて単離した。得られた２つの断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結せしめた。

【００５５】該反応物を、マニアティスらの実験書に記
載されている方法に従って調製した大腸菌ＰＯＰ２１３
６株（ベーリンガー・マンハイム山之内社）コンピテン
トセルに加え、形質転換せしめた。アンピシリン耐性形
質転換コロニー６側を選び、各プラスミドを抽出し、Ｂ
ａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断し解析したところ、すべて
目的とするプラスミドを有していた。得られたプラスミ
ドをｐＥＸ−ＺＰＩと命名した。本プラスミドは、ラム
ダ・ファージ由来のＰＲプロモーターの制御により、β
ガラクトシダーゼ・ＡＰＰＩの融合タンパクを発現しう
る。 〔工程２〕　　融合タンパクの生産 工程１で得たプラスミドｐＥＸ−ＺＰＩを保持する大腸
菌ＰＯＰ２１３６／ｐＥＸ−ＺＰＩを、５０μｇ／ｍｌ
のアンピシリン含有Ｌ培地で、３０℃一晩培養せしめた
。本培養液１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有
Ｌ培地５０ｍｌに添加し、３０℃にて３時間培養した後
、４２℃の恒温培養槽に移し、さらに３時間培養した。 ４２℃において、ラムダ・ファージＰＲプロモーターの
リプレッサーは不活化され、ＰＲプロモーターが作動す
ることによって、目的とする融合タンパクが生産される
。

【００５６】該培養液を遠心分離し菌体を集め、菌体の
一部を、レムリーの方法〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，
Ｎａｔｕｒｅ．２２７．６８０−６８５（１９７０）〕
に従って、ＳＤＳ・サンプルバッファー中で煮沸後、１
０％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルをクマ
シー染色した結果、分子量約１２０Ｋｄの目的とする融
合タンパクが存在することが確認された。以下、このβ
ガラクトシダーゼ・ＡＰＰＩ融合タンパクをＺＰＩと略
す。 〔工程３〕　　ＺＰＩの可溶化 工程２で得た培養菌体の一部を、尿素を終濃度０Ｍ，２
Ｍ，４Ｍ，６Ｍ，８Ｍをそれぞれ含む２０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８．０）に懸濁し、オータケ・ソニケーター（
大岳製作所）を用いて菌体を超音波破壊し、遠心分離に
より不溶物を集めた。

【００５７】得られた不溶物を本実施例工程２と同様に
処理して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より解析した。クマシー染色の結果、目的物ＺＰＩのバ
ンドは、尿素０Ｍ，２Ｍおよび４Ｍ含有バッファーで抽
出した不溶画分では検出されたが、尿素６Ｍおよび８Ｍ
含有バッファー抽出後の不溶画分では認められなかった
。

【００５８】以上の結果から、目的融合タンパクは産生
後大腸菌体内で不溶物としてタンパク封入体（ｉｎｃｌ
ｕｓｉｏｎ　　ｂｏｄｙ）を形成し、この不溶物は６Ｍ
以上の尿素で可溶化されることが判明した。 〔工程４〕　　ＺＰＩの部分精製 本実施例の工程２と同様にして、大腸菌ＰＯＰ２１３６
／ｐＥＸ−ＺＰＩを培養し、２００ｍｌの培養液から菌
体を回収した。該培養菌体を、４０ｍｌの４Ｍ尿素を含
む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに懸濁
し、菌体を超音波破壊した。菌体破壊物を遠心分離（１
００００×ｇ，１０分間）し、沈澱物を回収した。

【００５９】次いでこの沈澱物を２０ｍｌの８Ｍトリス
塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに再懸濁し、超音波処理
により沈澱を分散せしめた。遠心分離（１００００×ｇ
，１０分間）後上清を回収した。以上の操作により、４
Ｍ尿素で可溶な大腸菌タンパク、および８Ｍ尿素に不溶
な大腸菌タンパクが除去され、ＺＰＩの部分精製液が得
られた。

【００６０】この部分精製液の一部をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法で解析したところ、全タンパ
ク質のうち５０％以上が目的融合タンパクＺＰＩであっ
た。 〔工程５〕プロテアーゼ・インヒビター領域の抽出本実
施例の工程４で得たＺＰＩ部分精製液２０ｍｌを、２０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）２Ｌに対して２回透析し
、尿素を除去せしめると同時にタンパクの立体構造を回
復せしめた。

【００６１】得られた透析液を３７℃にて保温した後、
ＴＰＣＫ処理済みトリプシン固定化アガロースビーズ（
シグマ社）１００単位を加え、３７℃で１時間振とうす
ることにより、ＺＰＩ中のβガラクトシダーゼ領域を切
断すると同時にプロテアーゼ・インヒビター領域を吸着
させた。かかる懸濁液を、５’プライム→３’プライム
社のセレクトＳＴＭ空カラムに充填し、アガロースビー
ズを回収した。アガロースビーズとバッファーとの分離
は、１０００ｒｐｍ１分間の遠心操作により行った。

【００６２】回収したビーズを、０．３Ｍ　　ＮａＣｌ
、１０ｍＭ、ＣａＣｌ２　、１０ｍＭＨＣｌ（ｐＨ２）
から成る溶出液６ｍｌで溶出した。溶出は計３回行い、
各溶出液をＮａＯＨ水溶液を用いて中和した後、トリプ
シン阻害活性を測定した。各溶出液に含まれるトリプシ
ン・インヒビター活性濃度は、溶出分画の順に、ＢＰＴ
Ｉに換算して１６．４μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、
０．２７μｇ／ｍｌであった。これらの溶出分画を、Ｚ
ｔＰＩとする。 〔工程６〕プロテアーゼ・インヒビターの解析工程５で
得た溶出液に、あらかじめ−２０℃に冷却したアセトン
を４倍容量加え、−２０℃にて１時間冷却した。さらに
、冷却遠心分離（１００００×ｇ　　１５分間）し、沈
澱を回収した。得られた沈澱を１ｍｌの２０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．５）に再溶解し、工程５と同様にしてト
リプシン阻害活性量を測定した。その結果、ｓＰＩに換
算して６２μｇ相当のトリプシン・インヒビターが含ま
れていることが判明した。

【００６３】得られたインヒビター溶液の一部を、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した
ところ、分子量約６Ｋｄのメジャーな蛋白質が検出され
た。 〔工程７〕ＺｔＰＩの血小板凝集抑制作用本発明実施例
１工程６の方法に準じて、ＺｔＰＩの血小板凝集抑制能
を検討した。その結果、ＡＤＰ（５μＭ）惹起による血
小板凝集は、５０ｎＭのＺｔＰＩで完全に抑制された。 〔工程８〕ＺｔＰＩの抗血液凝固作用 本発明の実施例１工程７の方法にしたがって、１０−９
〜１０−７Ｍの濃度におけるＺｔＰＩの抗凝固活性を測
定した結果、ＺｔＰＩのＥＤ２は１０−８Ｍであった。 また、ＥＤｒは２５．０であった。 〔工程９〕ＺｔＰＩの血管内皮細胞増殖促進活性本発明
実施例１工程８の方法にしたがって、ＺｔＰＩの血管内
皮細胞増殖促進活性を測定した。

【００６４】その結果、１０−９ＭのＺｔＰＩ添加では
、ウシ脳抽出液添加及び無添加何れの場合も、各々の場
合の対照｛ＺｔＰＩ溶液の代わりにＰＢＳ（−）のみを
添加｝の場合に比して、約４倍の細胞数が認められた。 実施例４　　ＤＪ（配列番号６）の発現と活性測定（工
程１）ＤＪ型発現プラスミドの作成実施例２で用いたｐ
ＳＶＭＴ−ＡＰＰＩを制限酵素ＢａｍＨＩ消化後アガロ
ースゲル電気泳動で分画し、ＡＰＰＩ部分を含む、１．
６ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。 この断片をＢａｍＨＩ切断後ＢＡＰ処理したＴｖ１８（
宝酒造）に接続し、目的の方向に組み込まれたクローン
ＴｖＰＩを得た。

【００６５】一方、オリゴヌクレオチドデリーターＤＪ
２（５’−ＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＣＧＣＴＧＣ
ＣＡＣＡ−３’）を合成し、以下に示すプロトコールに
従って、図９アミノ酸番号５７以降をコードするＤＮＡ
の除去をおこなった。この反応にはＭｕｔａｎＴＭＧ（
宝酒造）システムを用い、反応は付属されるプロトコー
ルに従った。以下にその概略を述べる。

【００６６】まず、ＴｖＰＩから調製した一本鎖ＤＮＡ
０．５μｇに、キットに付属するｍｐ１８Ｐ　　ＤＮＡ
を０．２μｇ加え、１０μｌの（２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、
５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１ｍＭ　　ＤＴＴ）中で１００
℃　　３分、６５℃　　１０分、３７℃　　１０分イン
キュベートしてアニールさせた。このアニールさせたＤ
ＮＡ溶液４．５μｌに、Ｔ４キナーゼで燐酸化したＤＪ
２を１６ｎｇ加え６５℃　　１５分、３７℃　　１５分
インキュベートしアニールさせた。ここに、３０μｌの
５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍ
Ｍ　　ＮＨ４　ＯＡｃ、５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、５ｍ
Ｍ　　ＤＴＴ、１ｍＭＮＡＤ及び６０ユニットのＥ．ｃ
ｏｌｉリガーゼ、１ユニットのＴ４ポリメラーゼを加え
、２５℃で２時間反応させた。この反応物を大腸菌ＢＭ
Ｈ７１−１８株にトランスフェクトし、１時間培養後フ
ァージ粒子を含む培養液を大腸菌ＭＶ１１８４株にイン
フェクトし、プラークを形成させた（使用した大腸菌及
びバッファー、酵素はすべて宝酒造）。

【００６７】このプラークに対して、３２Ｐで標識した
ＤＪ２を用いてスクリーニングした。ＤＪ２にポジティ
ブなシグナルを与えるプラークを選定し、Ｍ１３シーク
エンスキット（宝酒造）を用いて欠失部位の塩基配列を
決定した。目的の欠失が起こっているクローンを、Ｔｖ
ＤＪと命名した。ＴｖＤＪの二本鎖ＤＮＡをＢａｍＨＩ
で切断して得られる断片を、ＢａｍＨＩ切断後ＢＡＰ処
理をしたｐＳＶＭＴ−ＡＰＰＩのベクター断片に挿入し
目的の方向に組み込まれたクローンを選択した。更に、
確認のために同じプローブを用いてこれをＭａｎｉａｔ
ｉｓの実験書に従いサザン解析を行って、目的の変異を
そのクローンが持っていることを確認した。

【００６８】こうして得られた発現ベクターをｐＳＶＭ
Ｔ−ＤＪと命名した。ｐＳＶＭＴ−ＤＪはｐＳＶＭＴ−
ＡＰＰＩと比較して、エクソン８（図１参照）以下を欠
失させた部分のみ、即ち、ＤＪ（配列表配列番号６）を
発現する。 〔工程２〕　　ＤＪの発現 実施例１工程３に記載の方法でｐＳＶＭＴ−ＤＪをＣＯ
Ｓ−１に細胞に導入し、培養上清からＤＪを粗精製し、
さらに本発明実施例１工程４に記載の方法で、固定化ト
リブシンを用いたアフィニティークロマトグラフィーを
行って、ＤＪを精製した。

【００６９】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の
結果、ＤＪは、単一にまで精製された事がわかった。蛋
白量はブラッドフォード法とローリー法で求めた。 〔工程３〕ＤＪの血小板凝集抑制作用 本発明の実施例１工程６の方法に準じで、ＤＪの血小板
凝集抑制能を検討した。その結果、ＡＤＰ（５μＭ）惹
起による血小板凝集は、５０ｎＭの濃度で完全に抑制さ
れた。 〔工程４〕ＤＪの抗血液凝固作用 本発明の実施例１工程７の方法に従って、１０−９〜１
０−７Ｍの濃度におけるＤＪの抗凝固活性を測定した結
果、ＥＤ２は１０−８Ｍとなり、ＥＤｒと２５．８であ
った。 〔工程５〕ＤＪの血管内皮細胞増殖促進活性本発明実施
例１工程８の方法にしたがって、ＤＪの血管内皮細胞増
殖促進活性を測定した。

【００７０】その結果、１０−９ＭのＤＪ添加では、ウ
シ脳抽出液添加及び無添加何れの場合も、各々の場合の
対照（ＤＪ溶液の代わりにＰＢＳ（−）のみを添加）の
場合に比して、約４倍の細胞数が認められた。 実施例５　　ＩＮＳ５６（配列番号１および７）の発現
と活性測定 配列番号１の蛋白質に比べ、上記実施例４にて得られた
ＤＪはＮ末端にＳｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇが多い（図１参
照）。そこで、これを除いたＩＮＳ５６を作成した。 〔工程１〕発明プラスミドの構築 該Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ欠失のため、以下の配列を有
するデリーターＤＥＮＰＩを合成した（アプライドパイ
オシステムズ社３８０Ａを用いて合成）。

【００７１】５’−ＴＴＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＴＣＴ
ＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴ−３’ＤＥＮＰＩによる欠失反
応が起こるとＤＪ中のＮ末端Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ配
列が除去され、図４のアミノ酸配列が直接ｔＰＡのシグ
ナル配列につながったタンパク質をコードするプラスミ
ドが得られる。この欠失反応にはＭｕｔａｎＴＭＧ（宝
酒造）システムを用い、反応は付属されるプロトコール
に従った。以下にその概略を述べる。

【００７２】まず実施例４工程１で得たＴｖＤＪから調
製した一本鎖ＤＮＡ０．５μｇに、キットに付属するｍ
ｐ１８Ｐ　　ＤＮＡを０．２μｇを加え、１０μｌの（
２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２　、５０ｍＭ、ＮａＣｌ、１ｍＭ　　
ＤＴＴ）中で１００℃、３分、６５℃　　１０分、３７
℃　　１０分インキュベートしてアニールさせた。

【００７３】このアニールさせたＤＮＡ溶液４．５μｌ
に、Ｔ４キナーゼで燐酸化したＤＥＮＰＩを１６ｎｇ加
え６５℃　　１５分、３７℃　　１５分インキュベート
しアニールさせた。ここに３０μｌの５０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ　　ＮＨ４　Ｏ
Ａｃ、５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、５ｍＭ　　ＤＴＴ、１
ｍＭ　　ＮＡＤ及び６０ユニットのＥ．ｃｏｌｉリガー
ゼ、１ユニットのＴ４ポリメラーゼを加え、２５℃で２
時間反応させた。

【００７４】この反応物を大腸菌ＢＭＨ７１−１８株に
トランスフェクトし、１時間培養後ファージ粒子を含む
培養液を大腸菌ＭＶ１１８４株にインフェクトし、プラ
ークを形成させた（使用した大腸菌及びバッファー、酵
素はすべて宝酒造）。このプラークに対して３２Ｐで標
識したＤＥＮＰＩを用いてスクリーニングした。ＤＥＮ
ＰＩにポジティブなシグナルを与えるプラークを選定し
、Ｍ１３シークエンスキット（宝酒造）を用いて欠失部
位の塩基配列を決定した。目的の欠失が起こっているク
ローンを、ＴｖＩＮＳ５６と命名した。

【００７５】ＴｖＩＮＳ５６の二本鎖ＤＮＡをＢａｍＨ
Ｉで切断して得られる断片を、ＢａｍＨＩ切断後ＢＡＰ
処理をしたｐＳＶＭＴ−ＡＰＰＩのベクター断片に挿入
し目的の方向に組み込まれたクローンを選択した。更に
、確認のために同じプローブを用いてこれをＭａｎｉａ
ｔｉｓの実験書に従いサザン解析を行って、目的の変異
をそのクローンが持っていることを確認した。こうして
得られた発明ベクターをｐＳＶＭＴ−ＩＮＳ５６と命名
した。

【００７６】ｐＳＶＭＴ−ＩＮＳ５６は、ＩＮＳ５６即
ちＫＰＩ（図１、４参照、配列表配列番号１、７）を発
現する。 〔工程２〕ＩＮＳ５６の発現 実施例１工程３に記載の方法で、ｐＳＶＭＴ−ＩＮＳ５
６をＣＯＳ−１細胞に導入し、培養上清からＩＮＳ５６
を粗精製したのち、固定化トリプシンを用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーを行ってＩＮＳ５６を調製し
た。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、Ｉ
ＮＳ５６は単一のものまで精製された事がわかったので
、蛋白量はブラッドフォード法とローリー法で求めた値
を採用した。

【００７７】また、ＩＮＳ５６のＮ末端アミノ酸配列を
アプライドバイオシステムズ社気相プロテインシーケン
サー・モデル４７０Ａを用いて決定したところ、目的の
ものが得られていることがわかった。 〔工程３〕ＩＮＳ５６の血小板凝集抑制作用本発明の実
施例１工程６の方法に準じて、ＩＮＳ５６の血小板凝集
抑制能を検討した。その結果、ＡＤＰ（５μＭ）惹起に
よる血小板凝集は、５０ｎＭのＩＮＳ５６で完全に抑制
された。 〔工程４〕ＩＮＳ５６の抗血液凝固作用本発明の実施例
１工程７の方法にしたがって、１０−９〜１０−７Ｍの
名濃度におけるＩＮＳ５６の抗凝固活性を測定した結果
、ＥＤ２は１０−８Ｍとなり、ＥＤｒは２６．２であっ
た。 〔工程５〕ＤＪの血管内皮細胞増殖促進活性本発明実施
例１工程８の方法にしたがって、ＩＮＳ５６の血管内皮
細胞増殖促進活性を測定した。

【００７８】その結果、１０−９ＭのＩＮＳ５６添加で
は、ウシ脳抽出液添加及び無添加何れの場合も、各々の
場合の対照｛ＩＮＳ５６溶液の代わりにＰＢＳ（−）の
みを添加｝の場合に比して、約４倍の細胞数が認められ
た。 実施例６　　静脈注射用バイアルの作製ＩＪを実施例１
工程３〜４の方法を繰り返し行って、大量に取得した。

【００７９】こうして得たＩＪ１０ｍｇ、精製ゼラチン
２０ｍｇ、マンニトール１００ｍｇ、塩化ナトリウム７
．８ｍｇ、燐酸ナトリウム１５．４ｍｇを注射用蒸留水
２ｍｌに溶解し、濾過滅菌して静脈注射用溶液を調製し
た。これを無菌バイアルに入れ、−３５℃で２時間予備
凍結し、−３５℃で真空度０．０７５ｔｏｒｒで３５時
間一次乾燥し、ついで３０℃、真空度０．０３ｔｏｒｒ
で５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。 得られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはぶど
う糖注射液５００ｍｌに溶解して点滴静注するのに用い
られる。

【００８０】また、実施例２工程１、実施例３工程１〜
５、実施例４工程２及び実施例５工程２の方法をそれぞ
れくり返し行って大量に調製したｓＰＩ，ＺｔＰＩ，Ｄ
Ｊ，及びＩＮＳ５６をそれぞれＩＪのかわりに用いた他
は本実施例の上述の方法と全く同じ方法にて有効成分と
してそれぞれｓＰＩ，ＺｔＰＩ，ＤＪ，およびＩＮＳ５
６を含む静脈注射用溶液を調製した。

【００８１】

【発明の効果】本発明の医薬組成物は、血管内皮細胞の
増殖を低濃度で強く促進すると共に、内因性凝固、血小
板凝集も阻害することにより、ＰＴＣＲやＰＴＣＡ後の
再閉塞防止、カテーテル挿入による血管内皮損傷治療、
心臓等の血栓症の治療、動脈硬化治療・予防、さらには
、脳梗塞発作後の再発防止及び治療に有用である。また
一方では、外傷、潰瘍、床ずれ、火傷などの創傷に対し
ても、血管内皮細胞増殖そして血管新生という形で、さ
らに組織の繊維芽細胞の増殖作用によって創傷部の治癒
を早めるのに、本発明の医薬組成物の細胞増殖刺激活性
が有効である。さらには、本発明の医薬組成物は敗血症
などの治療にも有用である。

【００８２】さらに、本発明の医薬組成物はバージャー
病などの慢性血栓症にも有効である。

【００８３】

【配列表】

【００８４】配列番号：１ 配列の長さ：５６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴：ＫＰＩ 配列

【００８５】配列番号：２ 配列の長さ：５７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴：ＡＰＰ７５１中のＡＰＰＩ配列

【００８６】配列番号：３ 配列の長さ：７６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴：ＡＰＰ７７０中のＡＰＰＩ配列

【００８７】配列番号：４ 配列の長さ：８８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴：ＩＪ 配列

【００８８】配列番号：５ 配列の長さ：７６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴：ｓＰＩ 配列

【００８９】配列番号：６ 配列の長さ：５９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴：ＤＪ 配列

【００９０】配列番号：７ 配列の長さ：５６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴：ＩＮＳ５６ 配列

【図面の簡単な説明】

【図１】アミロイド前駆体タンパクＡＰＰ６９５、ＡＰ
Ｐ７５１、ＡＰＰ７７０及びＡＰＰＩ誘導体の模式図で
ある。ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５の黒
く塗りつぶした部分は脳に沈着する老人斑アミロイド部
分、斜線部分はプロテアーゼインヒビター活性を有する
５６アミノ酸（ＫＰＩ、エキソン７産物）からなる領域
、点々部分はＡＰＰ７７０に固有の１９アミノ酸（エキ
ソン８産物）から成る領域を示す。ＩＪ，ｓＰＩ，ＤＪ
，ＩＮＳ５６において、大文字はＡＰＰ７７０中に含ま
れるアミノ酸配列、小文字は発現プラスミド構築のため
に用いたベクターまたはＤＮＡリンカー由来のアミノ酸
配列、ＣＨＯは糖鎖、番号はＡＰＰ７７０での残基番号
を示す。

【図２】ＡＰＰ７５１中のＡＰＰＩのアミノ酸配列を示
す。図中の数字はＡＰＰ７５１のＮ末端から数えたアミ
ノ酸残基の番号を示す。

【図３】ＡＰＰ７７０中のＡＰＰＩのアミノ酸配列を示
す。図中の数字はＡＰＰ７７０のＮ末端から数えたアミ
ノ酸残基の番号を示す。

【図４】ＡＰＰ７５１とＡＰＰ７７０のＡＰＰＩに共通
なアミノ酸配列。図中の数字はＡＰＰ７５１及びＡＰＰ
７７０のＮ末端から数えたアミノ酸残基の番号を、Ｐ１
は酵素阻害活性中心のアミノ酸を示す。

【図５】ＡＰＰ７７０をコードするプラスミドＧＢＰ２
からＭｕｔａｎＴＭＧを用いて、５’側及び３’を側を
欠失させてＴｖＩＪを得るまでを示す。

【図６】ｐＩＪが持つ、ｔＰＡのシグナル配列に続く、
ＡＰＰＩをコードするＤＮＡ配列と、それによってコー
ドされるアミノ酸配列を示す。

【図７】ＴｖＢＢＩの１本鎖ＤＮＡが、合成オリゴヌク
レオチドＤ５及びＤ３とハイブリダイズした結果を示し
たものである。ＤＮＡ配列の上に、それによってコード
されるアミノ酸配列を示し、下に制限酵素切断サイトを
示す。また、欠失を確認するために塩基配列を決定した
際のプライマーの位置を示す。

【図８】ｔＰＡを発現するプラスミドベクターｐＳＶＭ
ＴｔＰＡとＴｖＩＪから、発現ベクターｐＩＪを得るま
でを示す。

【図９】ｐＳＶＭＴ−ＡＰＰＩ及びｐＳＶＭＴＤＪが持
つ、ｔＰＡのシグナル配列に続く、ＡＰＰＩをコードす
るＤＮＡ配列と、それによってコードされるアミノ酸配
列を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　配列番号１のアミノ酸配列を有するポ
   リペプチドを有効成分として含有する血管内皮細胞増殖
   促進剤。