JP2907447B2 - 抗血栓剤 - Google Patents
抗血栓剤Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下ヒトＧ−
CSFと略記する）を有効成分とする抗血栓剤に関する。
CSFと略記する）を有効成分とする抗血栓剤に関する。
本発明は人の体にもともと備わった造血の促進，特に
好中球系の分裂，増殖，成熟化を促進する液性因子の１
つであるヒトＧ−CSFを用いて，動，静脈血栓の治療に
役立てようとするものであって，直接これに関連する報
告は見当たらない。
好中球系の分裂，増殖，成熟化を促進する液性因子の１
つであるヒトＧ−CSFを用いて，動，静脈血栓の治療に
役立てようとするものであって，直接これに関連する報
告は見当たらない。
ヒトＧ−CSFはin vitroの実験系において顆粒球の前
駆細胞に働き顆粒球への分化増進を促す機能を有してい
る液性の造血因子〔例えばMetcalf.et.al:Exp.Hematol.
1,185,（1973）等参照〕として知られている。
駆細胞に働き顆粒球への分化増進を促す機能を有してい
る液性の造血因子〔例えばMetcalf.et.al:Exp.Hematol.
1,185,（1973）等参照〕として知られている。
ところがこのヒトＧ−CSFは今迄入手するのがきわめ
て困難であったため，医薬としての有用性または有効性
についての検討が充分進展せず，本発明の目的とする血
栓の治療への可能性についても全く知られていなかっ
た。
て困難であったため，医薬としての有用性または有効性
についての検討が充分進展せず，本発明の目的とする血
栓の治療への可能性についても全く知られていなかっ
た。
従来、抗血栓剤としては血液の凝固を阻止させる薬物
としてペパリン製剤，シグマロール製剤などが使われて
いたが、一度形成されたファブリン塊（線維素）を溶解
する薬物も望まれていた。最近になって線溶系活性化作
用を有するウロキナーゼ，およびプラスミノゲン・アク
チベーター（PA）が大量生産されるようになり、抗血栓
剤として使われるようになった。
としてペパリン製剤，シグマロール製剤などが使われて
いたが、一度形成されたファブリン塊（線維素）を溶解
する薬物も望まれていた。最近になって線溶系活性化作
用を有するウロキナーゼ，およびプラスミノゲン・アク
チベーター（PA）が大量生産されるようになり、抗血栓
剤として使われるようになった。
一方，遺伝子工学等の技術進歩によりヒトＧ−CSFの
製造方法が開発され，純粋均質でしかも大量のヒトＧ−
CSFが入手できるようになった．（特開昭61−227526
号，特開昭62−236497号，特開昭62−236488号）．この
結果をふまえて，線溶系活性化作用を有するPAを産生す
る血管内皮細胞に対するヒトＧ−CSFの影響等を研究し
た結果、ヒトＧ−CSFが、線溶系活性化作用を有するPA
の産生を増強させることから、副作用の少ない優れた抗
血栓剤として用いられることを見いだした。
製造方法が開発され，純粋均質でしかも大量のヒトＧ−
CSFが入手できるようになった．（特開昭61−227526
号，特開昭62−236497号，特開昭62−236488号）．この
結果をふまえて，線溶系活性化作用を有するPAを産生す
る血管内皮細胞に対するヒトＧ−CSFの影響等を研究し
た結果、ヒトＧ−CSFが、線溶系活性化作用を有するPA
の産生を増強させることから、副作用の少ない優れた抗
血栓剤として用いられることを見いだした。
本発明者らは上記目的を達成するため，鋭意研究を重
ねた結果，哺乳動物の内皮細胞例えばウシ頚動脈内皮細
胞を用いて検討した結果 ヒトＧ−CSF存在下で前孵置したウシ頚動脈内皮細胞
（以後内皮細胞）は非存在下で前孵置した内皮細胞に比
べて約５倍のPAの合成分泌増加が認められた。
ねた結果，哺乳動物の内皮細胞例えばウシ頚動脈内皮細
胞を用いて検討した結果 ヒトＧ−CSF存在下で前孵置したウシ頚動脈内皮細胞
（以後内皮細胞）は非存在下で前孵置した内皮細胞に比
べて約５倍のPAの合成分泌増加が認められた。
Ｇ−CSFの添加濃度は約50ng/mlでPA産生の最大値を得
られることから，ほぼ造血系の標的細胞に対する至適濃
度と同じである． ヒトＧ−CSFとの前孵置による内皮細胞のPA合成分泌
促進の程度は,G−CSFの添加濃度と前孵置の時間とに明
かな相関がある． ペトリ皿中にフィブリンゲルを形成させ，そのゲル上
で血管内皮細胞を培養するとき,G−CSFの添加をすると
細胞の増殖に伴いPAが分泌され、培養液中のプラスミノ
ゲンをプラスミンに換え，これがフィブリンゲルを溶解
する． ヒトＧ−CSFをヒトに近縁のアカゲザルに連投すると,
2週間後のその新鮮血をトロンボエラストグラムで分析
すると線溶系活性化に起因すると考えられる血液凝固直
後のフィブリンの溶解が認められたという事実を確認
し，この結果からヒトＧ−CSFは血管内皮細胞に作用
し，そのPAの合成分泌を促進し，血中に大量に存在する
プラスミノゲンをプラスミンに変換し，生じたプラスミ
ンは選択的に血管に蓄積したフィブリン塊を溶解するこ
とを著しく亢進させることが考えられ、本発明に到達し
た． すなわち本発明は、ヒトＧ−CSFを有効成分とする抗
血栓剤を提供するものである． 以下本発明を詳細に説明する． 本発明の抗血栓作用の有効成分であるヒトＧ−CSFは
純度の高いヒトＧ−CSFであればその由来が制限される
ものではなく，例えば人の生体試料から抽出，分離，精
製したもの，ヒトＧ−CSF産生細胞を培養し，その培養
上清から単離したもの，細胞融合法を用いてヒトＧ−CS
F産生ハイブリドーマを形成しそれから取得したもの，
遺伝子組換えによって，大腸菌，動物細胞等の宿主を形
質転換して得た形質転換体から産生せしめ単離精製した
もの，又は天然のヒトＧ−CSFのアミノ酸配列に化学修
飾を施したもの等のいずれも使用することができる． しかし，それらの中でも純度よく均質大量に入手でき
る次の（１）（２）で示すヒトＧ−CSFが特に好ましい
ものである． （１）次の理化学的性質を有するヒトＧ−CSF. 分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による測定で19,000±1,000. 等電点:pI＝5.5±0.1,pI＝5.8±0.1,pI＝6.1±0.1
の３つの等電点のうち少なくとも１つを有する． 紫外部吸収:280nmに極大吸収を有し,250nmに極小値
をもつ． Ｎ末端から21残基目迄のアミノ酸配列が次の如くで
ある． （２）下記のアミノ酸配列またはその一部であらわされ
るヒトＧ−CSF活性を有するポリペプチド又はこれと糖
鎖部を有する糖蛋白質からなるヒト 上記のヒトＧ−CSFは例えば後述する参考例に示す方
法によって製造することができる。即ち，上記（１）の
ヒトＧ−CSFは参考例１によって，又（２）のヒトＧ−C
SFは参考例２に示す方法により得ることができる。（ｍ
＝０の場合を−VSE,m＝１の場合を＋VSEという） なおこれらの方法の詳細な製造条件については，本出
願人が先に出願した特開昭61−227526号，特開昭62−23
6497号，特開昭62−236488号の各明細書を参照された
い。
られることから，ほぼ造血系の標的細胞に対する至適濃
度と同じである． ヒトＧ−CSFとの前孵置による内皮細胞のPA合成分泌
促進の程度は,G−CSFの添加濃度と前孵置の時間とに明
かな相関がある． ペトリ皿中にフィブリンゲルを形成させ，そのゲル上
で血管内皮細胞を培養するとき,G−CSFの添加をすると
細胞の増殖に伴いPAが分泌され、培養液中のプラスミノ
ゲンをプラスミンに換え，これがフィブリンゲルを溶解
する． ヒトＧ−CSFをヒトに近縁のアカゲザルに連投すると,
2週間後のその新鮮血をトロンボエラストグラムで分析
すると線溶系活性化に起因すると考えられる血液凝固直
後のフィブリンの溶解が認められたという事実を確認
し，この結果からヒトＧ−CSFは血管内皮細胞に作用
し，そのPAの合成分泌を促進し，血中に大量に存在する
プラスミノゲンをプラスミンに変換し，生じたプラスミ
ンは選択的に血管に蓄積したフィブリン塊を溶解するこ
とを著しく亢進させることが考えられ、本発明に到達し
た． すなわち本発明は、ヒトＧ−CSFを有効成分とする抗
血栓剤を提供するものである． 以下本発明を詳細に説明する． 本発明の抗血栓作用の有効成分であるヒトＧ−CSFは
純度の高いヒトＧ−CSFであればその由来が制限される
ものではなく，例えば人の生体試料から抽出，分離，精
製したもの，ヒトＧ−CSF産生細胞を培養し，その培養
上清から単離したもの，細胞融合法を用いてヒトＧ−CS
F産生ハイブリドーマを形成しそれから取得したもの，
遺伝子組換えによって，大腸菌，動物細胞等の宿主を形
質転換して得た形質転換体から産生せしめ単離精製した
もの，又は天然のヒトＧ−CSFのアミノ酸配列に化学修
飾を施したもの等のいずれも使用することができる． しかし，それらの中でも純度よく均質大量に入手でき
る次の（１）（２）で示すヒトＧ−CSFが特に好ましい
ものである． （１）次の理化学的性質を有するヒトＧ−CSF. 分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による測定で19,000±1,000. 等電点:pI＝5.5±0.1,pI＝5.8±0.1,pI＝6.1±0.1
の３つの等電点のうち少なくとも１つを有する． 紫外部吸収:280nmに極大吸収を有し,250nmに極小値
をもつ． Ｎ末端から21残基目迄のアミノ酸配列が次の如くで
ある． （２）下記のアミノ酸配列またはその一部であらわされ
るヒトＧ−CSF活性を有するポリペプチド又はこれと糖
鎖部を有する糖蛋白質からなるヒト 上記のヒトＧ−CSFは例えば後述する参考例に示す方
法によって製造することができる。即ち，上記（１）の
ヒトＧ−CSFは参考例１によって，又（２）のヒトＧ−C
SFは参考例２に示す方法により得ることができる。（ｍ
＝０の場合を−VSE,m＝１の場合を＋VSEという） なおこれらの方法の詳細な製造条件については，本出
願人が先に出願した特開昭61−227526号，特開昭62−23
6497号，特開昭62−236488号の各明細書を参照された
い。
又，その他の方法としてＧ−CSF産生細胞と自己増殖
能を有する悪性腫瘍とを細胞融合して得られるハイブリ
ドーマをマイトジェンの存在または非存在下で培養する
ことによって得ることもできる。これらの方法で得たヒ
トＧ−CSFは全て本発明に含まれる． 得られたヒトＧ−CSF含有液は必要により公知の手段
でさらに精製，濃縮した後，ミリポアフィルター等で無
菌濾過して凍結保存とするかまたは凍結乾燥，真空乾燥
などの手段により水分を除去して保存することができ
る。
能を有する悪性腫瘍とを細胞融合して得られるハイブリ
ドーマをマイトジェンの存在または非存在下で培養する
ことによって得ることもできる。これらの方法で得たヒ
トＧ−CSFは全て本発明に含まれる． 得られたヒトＧ−CSF含有液は必要により公知の手段
でさらに精製，濃縮した後，ミリポアフィルター等で無
菌濾過して凍結保存とするかまたは凍結乾燥，真空乾燥
などの手段により水分を除去して保存することができ
る。
また所望によりヒトＧ−CSFを蒸留水または適当な緩
衝液に溶解した後注射液として用いることもできる。
衝液に溶解した後注射液として用いることもできる。
さらに本発明の抗血栓剤はヒトまたは動物医薬用に適
した医薬製剤としての形態を取るために必要な製剤担体
や賦形剤を，さらには安定化剤，吸着防止剤を含ませる
ことができる． 本発明の抗血栓剤に含まれるヒトＧ−CSFの投与量，
投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決めること
ができるが、通常成人一人当り0.1〜1000μg,好ましく
は１〜500μｇのヒトＧ−CSFを含有する製剤を１週間に
１〜７回投与すればよい． しかし本発明はヒトＧ−CSFの含有量によって限定さ
れるものではない。
した医薬製剤としての形態を取るために必要な製剤担体
や賦形剤を，さらには安定化剤，吸着防止剤を含ませる
ことができる． 本発明の抗血栓剤に含まれるヒトＧ−CSFの投与量，
投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決めること
ができるが、通常成人一人当り0.1〜1000μg,好ましく
は１〜500μｇのヒトＧ−CSFを含有する製剤を１週間に
１〜７回投与すればよい． しかし本発明はヒトＧ−CSFの含有量によって限定さ
れるものではない。
以下本発明を参考例（ヒトＧ−CSFの製造例）実験例
（薬理効果），実施例（製剤例）をあげて説明するが，
本発明はこれらに限定されるものではない。
（薬理効果），実施例（製剤例）をあげて説明するが，
本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１ （Ｇ−CSF産生細胞の培養によるヒトＧ−CSFの製造例） 特開昭61−227526号の実施例１に示す方法で樹立した
ヒト口腔底癌細胞由来のＧ−CSF産生細胞株CHU−１（C.
N.C.M受託番号「Ｉ−315」）また同様の方法で樹立した
細胞株CHU−２（C.N.C.M受託番号「Ｉ−483」）をウシ
胎児血清を含有するRPMI 1640培養液に浮遊した後，ロ
ーラーボトルにいれて回転培養を行った．細胞がローラ
ーボトル内壁に密に増殖したところで培養液を血清不含
RPMI 1640にかえ,4日間培養後上清を回収，次いで血清
含有RPMI 1640を加えて３日間培養した後，培養液を血
清不含RPMI 1640に液替し,4日間培養後上清を回収す
る．以下これを繰り返し培養上清を回収した．得られた
血清不含培養上清を限外ろ過で約1000倍に濃縮し精製，
次いで検定を行った。
ヒト口腔底癌細胞由来のＧ−CSF産生細胞株CHU−１（C.
N.C.M受託番号「Ｉ−315」）また同様の方法で樹立した
細胞株CHU−２（C.N.C.M受託番号「Ｉ−483」）をウシ
胎児血清を含有するRPMI 1640培養液に浮遊した後，ロ
ーラーボトルにいれて回転培養を行った．細胞がローラ
ーボトル内壁に密に増殖したところで培養液を血清不含
RPMI 1640にかえ,4日間培養後上清を回収，次いで血清
含有RPMI 1640を加えて３日間培養した後，培養液を血
清不含RPMI 1640に液替し,4日間培養後上清を回収す
る．以下これを繰り返し培養上清を回収した．得られた
血清不含培養上清を限外ろ過で約1000倍に濃縮し精製，
次いで検定を行った。
精製および検定は前記特開昭61−227526号明細書の実
施例と同じ方法で行った． 参考例２ （遺伝子組換えによるヒトＧ−CSFの製造例） 以下の製造例は、前述のアミノ酸配列における＋VSE
または−VSEの各々を製造する方法である。
施例と同じ方法で行った． 参考例２ （遺伝子組換えによるヒトＧ−CSFの製造例） 以下の製造例は、前述のアミノ酸配列における＋VSE
または−VSEの各々を製造する方法である。
本出願人によって微工研に寄託されているエシエリヒ
ア・コリ（E.Coli）χ1776株（−VSEの場合FERM BP−9
55、または−VSEの場合BP−954）から切り出してきたヒ
トＧ−CSF遺伝子を有するcDNA断片をベクターpdKCRに組
み込みpHGV2（−VSEの場合）または、pHGG4（＋VSEの場
合）プラスミドとした後これをSal Iで処理し，次いでD
NAポリメラーゼKlenow断片を反応させる． このDNAにEcoR Iリンカーを付加し，再びEcoR Iで部
分消化した後，アガロースゲル電気泳動にて約2.7Kbの
フラグメントを回収する． 一方,pAdD26SVpAプラスミド（Kaufman,R.G.＆ Sharp,
P,A.（1982）Mol.Cell.Biol,2巻1304〜1319）をEcoR I
で処理し,BAP処理し，脱リン酸する．次いでフェノール
処理後電気泳動でpAdD26SVpAのEcoR I断片を回収した． 上記の2.7Kb断片とpAdD26SVpA断片をアニール化し,E.
coli DHI株に塩化ルビジウム法により形質転換してpHG
V2（−VSEの場合）または、pHGG4（＋VSEの場合）−dhf
rプラスミドを得た． つぎにCHO細胞（dhfr−株，コロンビア大学Dr.L.Chas
inより入手）を9cmのプレート（Nunc社製）中10％仔牛
血清を含むα最小必須培地（α−MEM,アデノシン，デオ
キシアデノシン，チミジン添加）で培養増殖し，これを
リン酸−カルシウム法（Wigler等,Cell 14巻725頁（197
8））によって形質転換した． 即ち，前記のpHGV2（−VSEの場合）または、pHGG4
（＋VSEの場合）−dhfrプラスミド１μｇにキャリア−D
NA（仔牛胸線DNA）を適量加えて,TE溶液375μｌに溶解
し1M塩化カルシウム水溶液125μｌを加える.3〜５分氷
上で冷やし500μｌの２×HBS（50mM Hepes,280mM塩化ナ
トリウム,1.5mMリン酸緩衝液）を加え再び氷冷後，上記
のCHO細胞培養液1mlと混合し，プレートに写し，炭酸ガ
ス存在下インキュベーター中で９時間培養する。
ア・コリ（E.Coli）χ1776株（−VSEの場合FERM BP−9
55、または−VSEの場合BP−954）から切り出してきたヒ
トＧ−CSF遺伝子を有するcDNA断片をベクターpdKCRに組
み込みpHGV2（−VSEの場合）または、pHGG4（＋VSEの場
合）プラスミドとした後これをSal Iで処理し，次いでD
NAポリメラーゼKlenow断片を反応させる． このDNAにEcoR Iリンカーを付加し，再びEcoR Iで部
分消化した後，アガロースゲル電気泳動にて約2.7Kbの
フラグメントを回収する． 一方,pAdD26SVpAプラスミド（Kaufman,R.G.＆ Sharp,
P,A.（1982）Mol.Cell.Biol,2巻1304〜1319）をEcoR I
で処理し,BAP処理し，脱リン酸する．次いでフェノール
処理後電気泳動でpAdD26SVpAのEcoR I断片を回収した． 上記の2.7Kb断片とpAdD26SVpA断片をアニール化し,E.
coli DHI株に塩化ルビジウム法により形質転換してpHG
V2（−VSEの場合）または、pHGG4（＋VSEの場合）−dhf
rプラスミドを得た． つぎにCHO細胞（dhfr−株，コロンビア大学Dr.L.Chas
inより入手）を9cmのプレート（Nunc社製）中10％仔牛
血清を含むα最小必須培地（α−MEM,アデノシン，デオ
キシアデノシン，チミジン添加）で培養増殖し，これを
リン酸−カルシウム法（Wigler等,Cell 14巻725頁（197
8））によって形質転換した． 即ち，前記のpHGV2（−VSEの場合）または、pHGG4
（＋VSEの場合）−dhfrプラスミド１μｇにキャリア−D
NA（仔牛胸線DNA）を適量加えて,TE溶液375μｌに溶解
し1M塩化カルシウム水溶液125μｌを加える.3〜５分氷
上で冷やし500μｌの２×HBS（50mM Hepes,280mM塩化ナ
トリウム,1.5mMリン酸緩衝液）を加え再び氷冷後，上記
のCHO細胞培養液1mlと混合し，プレートに写し，炭酸ガ
ス存在下インキュベーター中で９時間培養する。
以下洗浄,20％グリセロール含有TBS（Trisbuffered s
aline）添加，再び洗浄した後非選択培地（前出α−MEM
培地，ヌクレオシド添加）を添加して２日間インキュベ
ートし，選択培地で1:10に細胞を分割した．次いで２日
毎に選択培地（ヌクレオシド無添加）にて培地交換を行
いながら培養を続行し生じた集塊（foci）を選別して新
しいプレートに移した． 新しいプレートでは0.02μＭメトトレキセート（MT
X）存在下で増殖し再び0.1μＭ MTX存在下で増殖させ
てクローニングを行った． 更にクローニングを続けた結果10mg/l以上（−VSEの
場合）または、1mg/l以上（＋VSEの場合）のヒトＧ−CS
Fの生産を確認した． なお，精製，検定は特開昭62−236488号明細書の実施
例記載の方法によって行った． 実験例１ 〔Ｇ−CSFによるウシ頚動脈内皮細胞のプラスミノゲン
アクチベーター（PA）の産生亢進〕 ウシ頚動脈より採取した血管内皮細胞塊を20％ウシ胎
児血清,50unit/mlペニシリン,50μg/mlストレプトマイ
シンを含むイーグル最小必須培地に分散させ，ペトリ皿
中で、95％空気,5％炭酸ガス,37℃の培養条件で初代培
養を行う．細胞がペトリ皿一面に増殖した後,0.05％ト
リプシン溶液で分散させてから植え継ぎを行う．次にウ
シ胎児血清を10％に替えた初代培養と同一条件で継代培
養を行い，多量の細胞を得る．これらの細胞をペトリ皿
で培養して、参考例２によって得られたＧ−CSFを０か
ら300ng/mlまで濃度変動をさせ添加し，既述のウシ胎児
血清10％を含む培地中で２日間培養を行った．このあと
細胞をＧ−CSF及び血清を含まない培地で洗浄した後，
さらに８時間同様の培地中で培養し、これを条件培地と
した。この条件培地中に分泌されたPAをプラスミノゲン
に作用させ生じたプラスミンを合成基質ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−リジン−４
−メチルクマリル−７−アミド（BOC−Val−Leu−Lys−
MCA）を用いて二段階反応により測定し，ウロキナーゼ
国際単位で表記した． 図１から明らかなようにPA活性はＧ−CSFの添加濃度
の増加と共に劇的に上昇し,50ng/mlでプラトーに達し
た。また、図２に示したごとく、前孵置時間の経過と共
にPA産生は増加し、12時間後にはほぼ最大に達した。こ
れは対照群のPA活性の５倍に相当した。これらの結果は
Ｇ−CSFが血管内皮細胞に作用し，著しくそのPA産生を
促進していることを示したものである．さらに表１では
このPA産生が細胞内でも増加していることを確認するた
め,2日間Ｇ−CSF添加で培養した後，細胞を洗浄し，半
分の細胞を0.5％Triton X−100を添加してホモゲナイズ
し，その抽出液について細胞内PA活性を検討すると共に
残りの半分の細胞は,8時間既述のように培養し，この培
養液について細胞外に分泌されたPA活性を測定した．こ
の結果，細胞内PA活性も細胞外のそれと同様に上昇して
いた．また，このとき蛋白合成阻害剤であるサイクロヘ
キシミドを２日間の培養中に添加すると，これに続く８
時間培養後の細胞内外のPAの産生は完全に抑えられた． 以上の事実は、培地中にＧ−CSFを添加することによ
り、血管内皮細胞によるPA産生が明らかに亢進したこと
を示したものである． 実験例２ 〔Ｇ−CSFによる血管内皮細胞の線溶活性の促進〕 培養皿に入れたフィブリノゲン溶液（13.5mg/ml）2.4
mlにスロンビン（5u/ml）100μｌを加え,37℃ ３時間
インキュベイションしてフィブリンゲルを形成させた．
このゲル上でウシ頚動脈内皮細胞を,10％ウシ胎児血
清，ペニシリン（50u/ml）とストレプトマイシン（50μ
g/ml）を含むイーグル最小必須培地を加えて参考例２に
よって得られたＧ−CSFを500ng/mlの濃度になるように
添加し，無添加の対照群と共に43時間培養した．図３に
示すように対照群では小さな溶解ゾーンが観察され，こ
れは対照群の細胞からわずかなPAの分泌があったことを
意味している．一方,G−CSF添加群でより大きくかつ明
確な溶解ゾーンが観察された．これは,G−CSFの刺激に
より細胞がより多くのPA合成分泌を行い，結果として培
養液中に存在するプラスミノゲンを活性化し，生じたプ
ラスミンがフィブリンゲルを溶解したものである。これ
らの結果はヒトＧ−CSFが血管内皮細胞に作用し,PAの合
成分泌を促進し，分泌したPAはその周囲に存在するプラ
スミノゲンを活性化し，生じたプラスミンが、血栓の主
成分であるフィブリンを溶解することを示したものであ
る。
aline）添加，再び洗浄した後非選択培地（前出α−MEM
培地，ヌクレオシド添加）を添加して２日間インキュベ
ートし，選択培地で1:10に細胞を分割した．次いで２日
毎に選択培地（ヌクレオシド無添加）にて培地交換を行
いながら培養を続行し生じた集塊（foci）を選別して新
しいプレートに移した． 新しいプレートでは0.02μＭメトトレキセート（MT
X）存在下で増殖し再び0.1μＭ MTX存在下で増殖させ
てクローニングを行った． 更にクローニングを続けた結果10mg/l以上（−VSEの
場合）または、1mg/l以上（＋VSEの場合）のヒトＧ−CS
Fの生産を確認した． なお，精製，検定は特開昭62−236488号明細書の実施
例記載の方法によって行った． 実験例１ 〔Ｇ−CSFによるウシ頚動脈内皮細胞のプラスミノゲン
アクチベーター（PA）の産生亢進〕 ウシ頚動脈より採取した血管内皮細胞塊を20％ウシ胎
児血清,50unit/mlペニシリン,50μg/mlストレプトマイ
シンを含むイーグル最小必須培地に分散させ，ペトリ皿
中で、95％空気,5％炭酸ガス,37℃の培養条件で初代培
養を行う．細胞がペトリ皿一面に増殖した後,0.05％ト
リプシン溶液で分散させてから植え継ぎを行う．次にウ
シ胎児血清を10％に替えた初代培養と同一条件で継代培
養を行い，多量の細胞を得る．これらの細胞をペトリ皿
で培養して、参考例２によって得られたＧ−CSFを０か
ら300ng/mlまで濃度変動をさせ添加し，既述のウシ胎児
血清10％を含む培地中で２日間培養を行った．このあと
細胞をＧ−CSF及び血清を含まない培地で洗浄した後，
さらに８時間同様の培地中で培養し、これを条件培地と
した。この条件培地中に分泌されたPAをプラスミノゲン
に作用させ生じたプラスミンを合成基質ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−リジン−４
−メチルクマリル−７−アミド（BOC−Val−Leu−Lys−
MCA）を用いて二段階反応により測定し，ウロキナーゼ
国際単位で表記した． 図１から明らかなようにPA活性はＧ−CSFの添加濃度
の増加と共に劇的に上昇し,50ng/mlでプラトーに達し
た。また、図２に示したごとく、前孵置時間の経過と共
にPA産生は増加し、12時間後にはほぼ最大に達した。こ
れは対照群のPA活性の５倍に相当した。これらの結果は
Ｇ−CSFが血管内皮細胞に作用し，著しくそのPA産生を
促進していることを示したものである．さらに表１では
このPA産生が細胞内でも増加していることを確認するた
め,2日間Ｇ−CSF添加で培養した後，細胞を洗浄し，半
分の細胞を0.5％Triton X−100を添加してホモゲナイズ
し，その抽出液について細胞内PA活性を検討すると共に
残りの半分の細胞は,8時間既述のように培養し，この培
養液について細胞外に分泌されたPA活性を測定した．こ
の結果，細胞内PA活性も細胞外のそれと同様に上昇して
いた．また，このとき蛋白合成阻害剤であるサイクロヘ
キシミドを２日間の培養中に添加すると，これに続く８
時間培養後の細胞内外のPAの産生は完全に抑えられた． 以上の事実は、培地中にＧ−CSFを添加することによ
り、血管内皮細胞によるPA産生が明らかに亢進したこと
を示したものである． 実験例２ 〔Ｇ−CSFによる血管内皮細胞の線溶活性の促進〕 培養皿に入れたフィブリノゲン溶液（13.5mg/ml）2.4
mlにスロンビン（5u/ml）100μｌを加え,37℃ ３時間
インキュベイションしてフィブリンゲルを形成させた．
このゲル上でウシ頚動脈内皮細胞を,10％ウシ胎児血
清，ペニシリン（50u/ml）とストレプトマイシン（50μ
g/ml）を含むイーグル最小必須培地を加えて参考例２に
よって得られたＧ−CSFを500ng/mlの濃度になるように
添加し，無添加の対照群と共に43時間培養した．図３に
示すように対照群では小さな溶解ゾーンが観察され，こ
れは対照群の細胞からわずかなPAの分泌があったことを
意味している．一方,G−CSF添加群でより大きくかつ明
確な溶解ゾーンが観察された．これは,G−CSFの刺激に
より細胞がより多くのPA合成分泌を行い，結果として培
養液中に存在するプラスミノゲンを活性化し，生じたプ
ラスミンがフィブリンゲルを溶解したものである。これ
らの結果はヒトＧ−CSFが血管内皮細胞に作用し,PAの合
成分泌を促進し，分泌したPAはその周囲に存在するプラ
スミノゲンを活性化し，生じたプラスミンが、血栓の主
成分であるフィブリンを溶解することを示したものであ
る。
以上結論すると、ヒトＧ−CSFは血管内皮細胞を刺激
してPA放出を促進することにより，線溶活性の亢進作用
を有することが確認できた。
してPA放出を促進することにより，線溶活性の亢進作用
を有することが確認できた。
実験例３ 〔ヒトＧ−CSF連続投与によるアカゲザルの線溶活性亢
進〕 ヒトＧ−CSFをアカゲザルに連続投与した後，その末
梢血についてクロット・トレーサーTE−400（エルマ社
製）を用いたトロンボエラストグラフ（TEG）において
線溶活性を検討した．図4aに示すように対照群では凝固
が始まると共に振幅が拡大し，その後線溶活性の発現に
より徐々にこのTEGパターンの最大振幅（MA）が減少し
た．ところが，図4bに示すようにヒトＧ−CSFを１μg/k
gを皮下投与しているサルでは投与開始後，最初に測定
した２週間後にはすでにTEGパターンに線溶亢進作用が
顕著に出現し（参考文献1:実戦止血凝固学 藤巻道男他
編集 第189−191頁参照）、血液凝固過程では凝固塊，
フィブリン塊の弾性度が低下しているのが明らかとなっ
た．この現象は図4cに示すように，ヒトＧ−CSFを10μg
/kg連投しているサルではさらにこの線溶活性の亢進が
より著しいことが明らかとなった。（参考文献2:基礎と
臨床vol.12,No.6,Jun.（1978）76−78「Clot tracerパ
ターンの解析」）参考文献２に示されているように正常
ヒト血液にウロキナーゼを添加した際のトロンボエラス
トグラフ、つまり一度凝固後の血液が溶解するために一
本の線状パターンに再びなる現象と全く同じ傾向がほと
んどのヒトＧ−CSF投与例で認められた。
進〕 ヒトＧ−CSFをアカゲザルに連続投与した後，その末
梢血についてクロット・トレーサーTE−400（エルマ社
製）を用いたトロンボエラストグラフ（TEG）において
線溶活性を検討した．図4aに示すように対照群では凝固
が始まると共に振幅が拡大し，その後線溶活性の発現に
より徐々にこのTEGパターンの最大振幅（MA）が減少し
た．ところが，図4bに示すようにヒトＧ−CSFを１μg/k
gを皮下投与しているサルでは投与開始後，最初に測定
した２週間後にはすでにTEGパターンに線溶亢進作用が
顕著に出現し（参考文献1:実戦止血凝固学 藤巻道男他
編集 第189−191頁参照）、血液凝固過程では凝固塊，
フィブリン塊の弾性度が低下しているのが明らかとなっ
た．この現象は図4cに示すように，ヒトＧ−CSFを10μg
/kg連投しているサルではさらにこの線溶活性の亢進が
より著しいことが明らかとなった。（参考文献2:基礎と
臨床vol.12,No.6,Jun.（1978）76−78「Clot tracerパ
ターンの解析」）参考文献２に示されているように正常
ヒト血液にウロキナーゼを添加した際のトロンボエラス
トグラフ、つまり一度凝固後の血液が溶解するために一
本の線状パターンに再びなる現象と全く同じ傾向がほと
んどのヒトＧ−CSF投与例で認められた。
以上の現象はヒトＧ−CSFがin vitroばかりでなくin
vivoのレベルでも線溶活性の亢進をしていることを示し
たものである．上記の実験の結果をまとめると前述した
通り， ヒトＧ−CSF存在下で前孵置した血管内皮細胞は非存
在下で孵置した血管内皮細胞に比べて約５倍のPAの合成
分泌が認められた． ヒトＧ−CSFと血管内皮細胞をフィブリンゲル上で培
養すると,PAの合成分泌が促進され，結果として共存し
ているプラスミノゲンが活性化プラスミンに変換し，血
栓の主成分であるフィブリンゲルを溶解することが明ら
かになった．つまり，ヒトＧ−CSFは血管内皮細胞を刺
激して,PA放出をすることにより，線溶活性の亢進をす
る． ヒトＧ−CSFをアカゲザルに連続投与することによ
り，末梢血でのトロンボエラストグラフを検討した結
果，線溶活性の亢進が認められる． したがってヒトＧ−CSFはin vitroの結果とともに,in
vivo投与実験においても線溶活性を著しく亢進させる
ことが確認された． 実施例１（製剤例） 〔発明の効果〕 本発明のヒトＧ−CSFを有効成分とする抗血栓剤は人
の体にもともと存在しているヒト血管内皮細胞のPA産生
能を増強し，血液中に存在するプラスミノゲンを活性型
のプラスミンに変換し，このものがフィブリンを溶解す
る線溶活性を出現させる．この結果，血栓を溶解させる
と共にさらにＧ−CSF投与で増加する好中球がこれら血
栓溶解物の処理に促進的に働き，これらの作用にもとづ
いて血栓を溶解除去しようとするものであり，副作用の
少ない抗血栓剤として有用なものである． 実施例１（製剤例） 参考例１によって得られ且つ精製されたヒトＧ−CSF
（10mMリン酸緩衝液pH7）50μg/mlに非イオン界面活性
剤であるポリソルベート20（Tween 20:ポリオキシエチ
レンソルビンモノラウレート）を0.1mg/mlとなるように
加え、NaClにて浸透圧比を１に合わせた後、0.22μｍの
ポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌す
る。得られた溶液を滅菌処理を施したバイアル瓶中に充
填し、同様に滅菌処理したゴム栓で打栓し、続いてアル
ミニウムキャプにて巻き締めて注射用溶液製剤を得た。
この注射用溶液製剤は10℃以下の冷暗所に保存する。
vivoのレベルでも線溶活性の亢進をしていることを示し
たものである．上記の実験の結果をまとめると前述した
通り， ヒトＧ−CSF存在下で前孵置した血管内皮細胞は非存
在下で孵置した血管内皮細胞に比べて約５倍のPAの合成
分泌が認められた． ヒトＧ−CSFと血管内皮細胞をフィブリンゲル上で培
養すると,PAの合成分泌が促進され，結果として共存し
ているプラスミノゲンが活性化プラスミンに変換し，血
栓の主成分であるフィブリンゲルを溶解することが明ら
かになった．つまり，ヒトＧ−CSFは血管内皮細胞を刺
激して,PA放出をすることにより，線溶活性の亢進をす
る． ヒトＧ−CSFをアカゲザルに連続投与することによ
り，末梢血でのトロンボエラストグラフを検討した結
果，線溶活性の亢進が認められる． したがってヒトＧ−CSFはin vitroの結果とともに,in
vivo投与実験においても線溶活性を著しく亢進させる
ことが確認された． 実施例１（製剤例） 〔発明の効果〕 本発明のヒトＧ−CSFを有効成分とする抗血栓剤は人
の体にもともと存在しているヒト血管内皮細胞のPA産生
能を増強し，血液中に存在するプラスミノゲンを活性型
のプラスミンに変換し，このものがフィブリンを溶解す
る線溶活性を出現させる．この結果，血栓を溶解させる
と共にさらにＧ−CSF投与で増加する好中球がこれら血
栓溶解物の処理に促進的に働き，これらの作用にもとづ
いて血栓を溶解除去しようとするものであり，副作用の
少ない抗血栓剤として有用なものである． 実施例１（製剤例） 参考例１によって得られ且つ精製されたヒトＧ−CSF
（10mMリン酸緩衝液pH7）50μg/mlに非イオン界面活性
剤であるポリソルベート20（Tween 20:ポリオキシエチ
レンソルビンモノラウレート）を0.1mg/mlとなるように
加え、NaClにて浸透圧比を１に合わせた後、0.22μｍの
ポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌す
る。得られた溶液を滅菌処理を施したバイアル瓶中に充
填し、同様に滅菌処理したゴム栓で打栓し、続いてアル
ミニウムキャプにて巻き締めて注射用溶液製剤を得た。
この注射用溶液製剤は10℃以下の冷暗所に保存する。
実施例２（製剤例） 参考例２によって得られ且つ精製されたヒトＧ−CSF
（10mMリン酸緩衝液pH7）100μg/mlに非イオン界面活性
剤であるポリソルベート８（Tween 80:ポリオキシエチ
レンソルビンモノオレート）を0.1mg/mlとなるように加
え、NaClにて浸透圧比を１に合わせた後、0.22μｍのポ
アサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌す
る。得られた溶液を滅菌処理を施したバイアル瓶中に充
填し、同様に滅菌処理したゴム栓で打栓し、続いてアル
ミニウムキャプにて巻き締めて注射用溶液製剤を得た。
この注射用溶液製剤は10℃以下の冷暗所に保存する。
（10mMリン酸緩衝液pH7）100μg/mlに非イオン界面活性
剤であるポリソルベート８（Tween 80:ポリオキシエチ
レンソルビンモノオレート）を0.1mg/mlとなるように加
え、NaClにて浸透圧比を１に合わせた後、0.22μｍのポ
アサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌す
る。得られた溶液を滅菌処理を施したバイアル瓶中に充
填し、同様に滅菌処理したゴム栓で打栓し、続いてアル
ミニウムキャプにて巻き締めて注射用溶液製剤を得た。
この注射用溶液製剤は10℃以下の冷暗所に保存する。
実施例３（製剤例） 参考例１によって得られ且つ精製されたヒトＧ−CSF
（10mMリン酸緩衝液pH7）50μg/mlに非イオン界面活性
剤であるポリソルベート20（Tween 20:ポリオキシエチ
レンソルビンモノラウレート）を0.1mg/mlとHSA10mg/ml
及びマンニトール50mg/mlとなるように加えて溶解した
後、0.22μｍのポアサイズを有するメンブランフィルタ
ーで濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施したバ
イアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打
栓し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤を得た。この
注射用凍結乾燥製剤は室温以下の温度条件に保存し、注
射用蒸留水にて用時溶解して使用する。
（10mMリン酸緩衝液pH7）50μg/mlに非イオン界面活性
剤であるポリソルベート20（Tween 20:ポリオキシエチ
レンソルビンモノラウレート）を0.1mg/mlとHSA10mg/ml
及びマンニトール50mg/mlとなるように加えて溶解した
後、0.22μｍのポアサイズを有するメンブランフィルタ
ーで濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施したバ
イアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打
栓し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤を得た。この
注射用凍結乾燥製剤は室温以下の温度条件に保存し、注
射用蒸留水にて用時溶解して使用する。
実施例４（製剤例） 参考例２によって得られ且つ精製されたヒトＧ−CSF
（10mMリン酸緩衝液pH7）100μg/mlに非イオン界面活性
剤であるポリソルベート８（Tween 80:ポリオキシエチ
レンソルビンモノオレート）を0.1mg/mlとゼラチン10mg
/ml及びマンニトール50mg/mlとなるように加えて溶解し
た後、0.22μｍのポアサイズを有するメンブランフィル
ターで濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施した
バイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半
打栓し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤を得た。こ
の注射用凍結乾燥製剤は室温以下の温度条件に保存し、
注射用蒸留水にて用時溶解して使用する。
（10mMリン酸緩衝液pH7）100μg/mlに非イオン界面活性
剤であるポリソルベート８（Tween 80:ポリオキシエチ
レンソルビンモノオレート）を0.1mg/mlとゼラチン10mg
/ml及びマンニトール50mg/mlとなるように加えて溶解し
た後、0.22μｍのポアサイズを有するメンブランフィル
ターで濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施した
バイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半
打栓し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤を得た。こ
の注射用凍結乾燥製剤は室温以下の温度条件に保存し、
注射用蒸留水にて用時溶解して使用する。
図１は、本発明のヒトＧ−CSFがウシ血管内皮細胞によ
るPAの産生に及ぼす影響を示す。 図２は、本発明のヒトＧ−CSFがウシ血管内皮細胞に及
ぼすPAの産生と前孵置時間の関係を示す。 図３は、本発明のヒトＧ−CSFが血管内皮細胞の線溶活
性の亢進に及ぼす影響を示す。 図４は、本発明のヒトＧ−CSFのアカゲザル13週間連続
皮下投与における経時的TEGパターンを示す。
るPAの産生に及ぼす影響を示す。 図２は、本発明のヒトＧ−CSFがウシ血管内皮細胞に及
ぼすPAの産生と前孵置時間の関係を示す。 図３は、本発明のヒトＧ−CSFが血管内皮細胞の線溶活
性の亢進に及ぼす影響を示す。 図４は、本発明のヒトＧ−CSFのアカゲザル13週間連続
皮下投与における経時的TEGパターンを示す。
Claims (8)
- 【請求項１】ヒト顆粒球コロニー刺激因子を有効成分と
する抗血栓剤。 - 【請求項２】生体内の全ての動，静脈血管内に形成され
る血栓を対象とする特許請求の範囲第１項記載の抗血栓
剤。 - 【請求項３】ヒト顆粒球コロニー刺激因子が動、静脈血
管内皮細胞のプラスミノゲンアクチベーターの合成分泌
を促進すること，およびこのプラスミノーゲンアクチベ
ーターがプラスミンを生成し，線溶活性の亢進をするこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗血栓剤。 - 【請求項４】ヒト顆粒球コロニー刺激因子がヒト顆粒球
コロニー刺激因子産生細胞の培養上清から得られたもの
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗
血栓剤。 - 【請求項５】ヒト顆粒球コロニー刺激因子が次の理化学
的性質を有するものであることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の抗血栓剤。 「理化学的性質」 分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による測定で19,000±1,000. 等電点:pI＝5.5±0.1,pI＝5.8±0.1,pI＝6.1±0.1の
３つの等電点のうち少なくとも１つを有する． 紫外部吸収:280nmに極大吸収を有し,250nmに極小値を
もつ． Ｎ末端から21残基目迄のアミノ酸配列が次の如くであ
る． - 【請求項６】ヒト顆粒球コロニー刺激因子がヒト顆粒球
コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子を含む組換えベクターを含有する形質転換体か
ら産生されたヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
ポリペプチドまたは糖蛋白質であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の抗血栓剤。 - 【請求項７】ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
ポリペプチドが下記のアミノ酸配列またはその一部で表
される特許請求の範囲第１項記載の抗血栓剤。 - 【請求項８】ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
糖蛋白質が下記のアミノ酸配列またはその一部で表され
るポリペプチドと糖鎖部とを有するものである特許請求
の範囲第１項記載の抗血栓剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1217857A JP2907447B2 (ja) | 1988-08-24 | 1989-08-24 | 抗血栓剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-210376 | 1988-08-24 | ||
| JP21037688 | 1988-08-24 | ||
| JP1217857A JP2907447B2 (ja) | 1988-08-24 | 1989-08-24 | 抗血栓剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02149527A JPH02149527A (ja) | 1990-06-08 |
| JP2907447B2 true JP2907447B2 (ja) | 1999-06-21 |
Family
ID=26518017
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1217857A Expired - Fee Related JP2907447B2 (ja) | 1988-08-24 | 1989-08-24 | 抗血栓剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2907447B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1147777A1 (en) * | 2000-04-18 | 2001-10-24 | Crinos Industria Farmacobiologica S.p.A. | Combination of defibrotide and G-CSF and its use to activate haematopoietic progenitors |
| US8771663B2 (en) | 2000-04-18 | 2014-07-08 | Gentium Spa | Formulation having mobilising activity |
| ES2694239T3 (es) | 2010-11-12 | 2018-12-19 | Gentium S.R.L. | Defibrótido para su uso en profilaxis y/o tratamiento de la enfermedad de Injerto contra huésped (GVHD) |
| RU2627177C2 (ru) | 2012-06-22 | 2017-08-03 | Джентиум С.Р.Л. | Способ определения биологической активности дефибротида, основанный на применении эуглобулина |
| EP3026122A1 (en) | 2014-11-27 | 2016-06-01 | Gentium S.p.A. | Cellular-based method for determining the potency of defibrotide |
-
1989
- 1989-08-24 JP JP1217857A patent/JP2907447B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02149527A (ja) | 1990-06-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |