JPH07188293A - 新規な造血因子および該造血因子を有効成分とする血液細胞増加剤 - Google Patents
新規な造血因子および該造血因子を有効成分とする血液細胞増加剤Info
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- JPH07188293A JPH07188293A JP5334120A JP33412093A JPH07188293A JP H07188293 A JPH07188293 A JP H07188293A JP 5334120 A JP5334120 A JP 5334120A JP 33412093 A JP33412093 A JP 33412093A JP H07188293 A JPH07188293 A JP H07188293A
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- hematopoietic factor
- hematopoietic
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 巨核芽球増幅活性を有し、分子量が３４００
０±４０００の下記Ｎ末端アミノ酸配列を有する新規な
造血因子、および該造血因子を有効成分とする血液細胞
増加剤。 【効果】 本発明の造血因子は巨核芽球増幅活性を有す
るため、造血機能不全の治療剤として用いることができ
る。
０±４０００の下記Ｎ末端アミノ酸配列を有する新規な
造血因子、および該造血因子を有効成分とする血液細胞
増加剤。 【効果】 本発明の造血因子は巨核芽球増幅活性を有す
るため、造血機能不全の治療剤として用いることができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血小板減少症などの疾
患の治療に有用な新規な造血因子および該造血因子を有
効成分として含有する血液細胞増加剤に関する。
患の治療に有用な新規な造血因子および該造血因子を有
効成分として含有する血液細胞増加剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】血小板は、出血時に出血を止めるための
血栓形成や血液凝固の過程において促進的に働く重要な
役割を有している。血小板は骨髄巨核球から産生される
が、その過程に作用する液性因子は、分化初期に作用す
る巨核球コロニー刺激因子（Megakaryocyte-colony sti
mulating factor:Ｍｅｇ−ＣＳＦ）と、ある程度成熟し
た巨核前駆細胞に作用するトロンボポイエチン(Thrombo
poietin:ＴＰＯ）、あるいは巨核球増幅因子（Megakary
ocyte-potentiator:ＰＯＴ）に分けられる。過去２０年
以上の研究にもかかわらず、巨核球血小板系造血に特異
的にかかわる因子は未だ同定されておらず、その発見と
応用が久しく待ち望まれている。
血栓形成や血液凝固の過程において促進的に働く重要な
役割を有している。血小板は骨髄巨核球から産生される
が、その過程に作用する液性因子は、分化初期に作用す
る巨核球コロニー刺激因子（Megakaryocyte-colony sti
mulating factor:Ｍｅｇ−ＣＳＦ）と、ある程度成熟し
た巨核前駆細胞に作用するトロンボポイエチン(Thrombo
poietin:ＴＰＯ）、あるいは巨核球増幅因子（Megakary
ocyte-potentiator:ＰＯＴ）に分けられる。過去２０年
以上の研究にもかかわらず、巨核球血小板系造血に特異
的にかかわる因子は未だ同定されておらず、その発見と
応用が久しく待ち望まれている。
【０００３】近年、分離されたサイトカインのいくつか
は血小板造血系に関与することが明らかにされ、注目さ
れている。
は血小板造血系に関与することが明らかにされ、注目さ
れている。
【０００４】Ｍｅｇ−ＣＳＦ活性は、巨核球前駆細胞
（megakaryocyte colony-forming unit:ＣＦＵ−Ｍｅ
ｇ）の細胞分裂の刺激やコロニーサイズの増加で検出す
ることができ、in vitroではヒトまたはマウスの骨髄細
胞を軟寒天中、あるいはメチルセルロース中で培養する
と巨核球コロニーを形成させる活性として測定される。
現在のところ報告されているＭｅｇ−ＣＳＦとしては、
インターロイキン３（ＩＬ−３）と顆粒球−マクロファ
ージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、Stem c
ell factor（ＳＣＦ＝c-kit ligand）も巨核球前駆細胞
に働く因子とされている。
（megakaryocyte colony-forming unit:ＣＦＵ−Ｍｅ
ｇ）の細胞分裂の刺激やコロニーサイズの増加で検出す
ることができ、in vitroではヒトまたはマウスの骨髄細
胞を軟寒天中、あるいはメチルセルロース中で培養する
と巨核球コロニーを形成させる活性として測定される。
現在のところ報告されているＭｅｇ−ＣＳＦとしては、
インターロイキン３（ＩＬ−３）と顆粒球−マクロファ
ージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、Stem c
ell factor（ＳＣＦ＝c-kit ligand）も巨核球前駆細胞
に働く因子とされている。
【０００５】一方、Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性は、巨核球のサ
イズの増加、巨核球のＤＮＡ量の増加、あるいは巨核球
酵素（アセチルコリンエステラーゼ）量の増加などを指
標とし、in vitroではヒトまたはマウスの骨髄細胞を軟
寒天中あるいはメチルセルロース中で培養し、巨核球コ
ロニー中の細胞のサイズやＤＮＡ量を計測したり、また
液体培養下でアセチルコリンエステラーゼを定量するこ
とで検出される。Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性のあるサイトカイ
ンとしては、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、エリス
ロポイエチン（ＥＰＯ）、マクロファージコロニー刺激
因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Leukemia inhibitory factor（Ｌ
ＩＦ）などが報告されている。
イズの増加、巨核球のＤＮＡ量の増加、あるいは巨核球
酵素（アセチルコリンエステラーゼ）量の増加などを指
標とし、in vitroではヒトまたはマウスの骨髄細胞を軟
寒天中あるいはメチルセルロース中で培養し、巨核球コ
ロニー中の細胞のサイズやＤＮＡ量を計測したり、また
液体培養下でアセチルコリンエステラーゼを定量するこ
とで検出される。Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性のあるサイトカイ
ンとしては、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、エリス
ロポイエチン（ＥＰＯ）、マクロファージコロニー刺激
因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Leukemia inhibitory factor（Ｌ
ＩＦ）などが報告されている。
【０００６】Ｍｅｇ−ＣＳＦおよびＭｅｇ−ＰＯＴ活性
測定法は、具体的には、例えばTanaka et al. の報告
（Blood, 80, 1743-1749, 1992）に詳しく、また各種サ
イトカインの作用の程度については、河北の総説（実験
医学，10, 365-376, 1992 ）に述べられている。
測定法は、具体的には、例えばTanaka et al. の報告
（Blood, 80, 1743-1749, 1992）に詳しく、また各種サ
イトカインの作用の程度については、河北の総説（実験
医学，10, 365-376, 1992 ）に述べられている。
【０００７】上記に述べたＭｅｇ−ＣＳＦあるいはＭｅ
ｇ−ＰＯＴ活性を有する既知のサイトカイン類のほか
に、巨核球血小板系造血に働く因子として、ヒト胎児腎
細胞由来の分子量１５０００［ドデシル硫酸ナトリウム
を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）による測定］、ｐＩ５．１の巨核球促進因子（特
開昭６３−２３９２９８）、ヒト肺ガン細胞由来の分子
量２４０００、ｐＩ４．５〜５．５の巨核球系コロニー
刺激因子（ＷＯ ９０／０３３９７）、ヒト線維芽細胞
由来の分子量２５０００±８０００（ゲル濾過による測
定）、ｐＩ＞９の巨核球増幅因子（特開平４−２９５５
０）、さらにヒト尿由来の分子量５００００（モノマー
２５０００のホモダイマー）の血小板増殖因子（日経バ
イオテク、１９９２年６月８日号）などが報告されてい
る。
ｇ−ＰＯＴ活性を有する既知のサイトカイン類のほか
に、巨核球血小板系造血に働く因子として、ヒト胎児腎
細胞由来の分子量１５０００［ドデシル硫酸ナトリウム
を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）による測定］、ｐＩ５．１の巨核球促進因子（特
開昭６３−２３９２９８）、ヒト肺ガン細胞由来の分子
量２４０００、ｐＩ４．５〜５．５の巨核球系コロニー
刺激因子（ＷＯ ９０／０３３９７）、ヒト線維芽細胞
由来の分子量２５０００±８０００（ゲル濾過による測
定）、ｐＩ＞９の巨核球増幅因子（特開平４−２９５５
０）、さらにヒト尿由来の分子量５００００（モノマー
２５０００のホモダイマー）の血小板増殖因子（日経バ
イオテク、１９９２年６月８日号）などが報告されてい
る。
【０００８】しかし、これらの因子が本来生理的に機能
しているＭｅｇ−ＣＳＦあるいはＭｅｇ−ＰＯＴである
かどうかは未だ不明であり、産業上および医療上、有用
な医薬あるいは診断薬となり得るか否かは立証されてい
ない。
しているＭｅｇ−ＣＳＦあるいはＭｅｇ−ＰＯＴである
かどうかは未だ不明であり、産業上および医療上、有用
な医薬あるいは診断薬となり得るか否かは立証されてい
ない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】上述してきたように、
巨核球を増殖促進あるいは増幅促進させ、血小板増加を
主作用とする造血因子として、従来よりＭｅｇ−ＣＳＦ
あるいはＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有するいくつかの因子が
見出されてきている。しかし、これらの因子の産業上、
医療上の有用性、および各因子間の利用上の優劣も判明
していないのが現状である。したがって、本来生体内で
本質的にＭｅｇ−ＣＳＦあるいはＭｅｇ−ＰＯＴ活性因
子として働いている物質の探索は続けられており、この
ような本質的因子の発見とその利用が産業上および医療
上の解決されるべき重要な課題として残されている。
巨核球を増殖促進あるいは増幅促進させ、血小板増加を
主作用とする造血因子として、従来よりＭｅｇ−ＣＳＦ
あるいはＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有するいくつかの因子が
見出されてきている。しかし、これらの因子の産業上、
医療上の有用性、および各因子間の利用上の優劣も判明
していないのが現状である。したがって、本来生体内で
本質的にＭｅｇ−ＣＳＦあるいはＭｅｇ−ＰＯＴ活性因
子として働いている物質の探索は続けられており、この
ような本質的因子の発見とその利用が産業上および医療
上の解決されるべき重要な課題として残されている。
【００１０】本発明はこの課題を解決すべく、産業上お
よび医療上有用な巨核芽球増幅活性を有する造血因子お
よびこの造血因子を有効成分として含有する血液細胞増
加剤を提供することにある。
よび医療上有用な巨核芽球増幅活性を有する造血因子お
よびこの造血因子を有効成分として含有する血液細胞増
加剤を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、強力に巨
核球の増幅を促進する作用を有する新規な巨核芽球増幅
因子を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成
した。
核球の増幅を促進する作用を有する新規な巨核芽球増幅
因子を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成
した。
【００１２】すなわち本発明は、巨核芽球増幅活性を有
し、下記の性質を有することを特徴とする造血因子であ
る。 （ａ）分子量：３４０００±４０００（非還元条件下の
ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル
電気泳動で測定）、 （ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１に示
す。
し、下記の性質を有することを特徴とする造血因子であ
る。 （ａ）分子量：３４０００±４０００（非還元条件下の
ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル
電気泳動で測定）、 （ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１に示
す。
【００１３】本造血因子は、ヒト培養細胞培養上清から
の精製分離あるいは本造血因子に対応するｃＤＮＡを用
いて、いわゆる遺伝子組換え技術によって作製された細
胞の抽出液あるいは細胞培養上清からの精製分離、さら
には胎児胚に本造血因子に対応するｃＤＮＡを適当なベ
クター系にて注入して得られた、いわゆるトランスジェ
ニック動物の乳などの体液成分からの精製分離すること
によって得られる。
の精製分離あるいは本造血因子に対応するｃＤＮＡを用
いて、いわゆる遺伝子組換え技術によって作製された細
胞の抽出液あるいは細胞培養上清からの精製分離、さら
には胎児胚に本造血因子に対応するｃＤＮＡを適当なベ
クター系にて注入して得られた、いわゆるトランスジェ
ニック動物の乳などの体液成分からの精製分離すること
によって得られる。
【００１４】ヒト培養細胞は、本造血因子を産生する能
力を有する各種の正常組織由来細胞あるいは株化細胞の
いずれでも対象となるが、好ましくは血球系細胞や線維
芽細胞、さらに好ましくは巨核芽球系細胞である。例え
ば、株化巨核芽球系細胞としては、ＭＥＧ−０１、ＥＳ
Ｔ−ＩＵ、ＣＨＲＦ−２８８−１１、Ｋ５６２、ＨＥ
Ｌ、ＬＡＭＡ−８４、Ｍ−０７、Ｄａｍｉ、Ｔ−３３、
ＣＭＫなどが挙げられる。
力を有する各種の正常組織由来細胞あるいは株化細胞の
いずれでも対象となるが、好ましくは血球系細胞や線維
芽細胞、さらに好ましくは巨核芽球系細胞である。例え
ば、株化巨核芽球系細胞としては、ＭＥＧ−０１、ＥＳ
Ｔ−ＩＵ、ＣＨＲＦ−２８８−１１、Ｋ５６２、ＨＥ
Ｌ、ＬＡＭＡ−８４、Ｍ−０７、Ｄａｍｉ、Ｔ−３３、
ＣＭＫなどが挙げられる。
【００１５】遺伝子組換え技術を利用して本造血因子を
調製する場合には、宿主細胞として、ＣＨＯ（チャイニ
ーズハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞などの
哺乳動物細胞、カイコ、夜盗蛾などの昆虫細胞、大腸
菌、枯草菌、酵母などの微生物などを用いることができ
る。さらに、トランスジェニック動物を宿主とする場合
には、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシなどを用いることができる。
調製する場合には、宿主細胞として、ＣＨＯ（チャイニ
ーズハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞などの
哺乳動物細胞、カイコ、夜盗蛾などの昆虫細胞、大腸
菌、枯草菌、酵母などの微生物などを用いることができ
る。さらに、トランスジェニック動物を宿主とする場合
には、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシなどを用いることができる。
【００１６】このようにして調製された本造血因子を含
む細胞培養上清、虫体抽出液、菌体抽出液、生体体液な
どを原料として種々のクロマトグラフィーにより、本造
血因子を精製分離することができる。用いるクロマトグ
ラフィーは本造血因子に親和性を有するものであればい
ずれでもよいが、例えば、二酸化ケイ素（シリカ）やリ
ン酸カルシウムを吸着素材とするカラム、ヘパリンや色
素や疎水量をリガンドとするカラム、金属キレートカラ
ム、イオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどである。
む細胞培養上清、虫体抽出液、菌体抽出液、生体体液な
どを原料として種々のクロマトグラフィーにより、本造
血因子を精製分離することができる。用いるクロマトグ
ラフィーは本造血因子に親和性を有するものであればい
ずれでもよいが、例えば、二酸化ケイ素（シリカ）やリ
ン酸カルシウムを吸着素材とするカラム、ヘパリンや色
素や疎水量をリガンドとするカラム、金属キレートカラ
ム、イオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどである。
【００１７】精製された本造血因子は、骨髄機能抑制に
よる造血機能不全の治療剤として用いることができる
が、好ましくは血小板増加用途の治療薬として利用する
ことができる。例えば、抗癌剤投与後の血小板減少症、
放射線治療後の血小板減少症、巨核球増幅因子欠損によ
る血小板減少症、再生不良性貧血の血小板減少症、骨髄
移植後の血小板減少症、自己免疫疾患の血小板減少症の
治療および予防に用いることができる。また、巨核球系
細胞の減少を伴うような一部の白血病の治療、骨髄異形
成症候群の治療、輸血用骨髄細胞のin vitro事前培養時
の増殖剤、さらには血小板輸血の代替剤あるいは補助剤
として用いることができる。
よる造血機能不全の治療剤として用いることができる
が、好ましくは血小板増加用途の治療薬として利用する
ことができる。例えば、抗癌剤投与後の血小板減少症、
放射線治療後の血小板減少症、巨核球増幅因子欠損によ
る血小板減少症、再生不良性貧血の血小板減少症、骨髄
移植後の血小板減少症、自己免疫疾患の血小板減少症の
治療および予防に用いることができる。また、巨核球系
細胞の減少を伴うような一部の白血病の治療、骨髄異形
成症候群の治療、輸血用骨髄細胞のin vitro事前培養時
の増殖剤、さらには血小板輸血の代替剤あるいは補助剤
として用いることができる。
【００１８】本発明の造血因子は、そのままもしくは自
体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤などと混合
した医薬組成物として、経口または非経口的に投与する
ことができる。
体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤などと混合
した医薬組成物として、経口または非経口的に投与する
ことができる。
【００１９】経口投与のための剤形としては、具体的に
は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳
剤、懸濁剤などが挙げられる。かかる剤形は、自体公知
の方法によって製造され、製剤分野において通常用いら
れる担体もしくは賦形剤を含有するものである。例え
ば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ラクトース、マル
トース、サッカロース、澱粉、ステアリン酸マグネシウ
ムなどが挙げられる。
は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳
剤、懸濁剤などが挙げられる。かかる剤形は、自体公知
の方法によって製造され、製剤分野において通常用いら
れる担体もしくは賦形剤を含有するものである。例え
ば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ラクトース、マル
トース、サッカロース、澱粉、ステアリン酸マグネシウ
ムなどが挙げられる。
【００２０】非経口投与のための剤形としては、例え
ば、軟膏剤、注射剤、湿布剤、塗布剤、座剤、経鼻吸収
剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。溶液製
剤は自体公知の方法、例えば、本発明の造血因子を通
常、注射剤に用いられた無菌の水溶液に溶解、あるいは
抽出液に懸濁、さらには乳化してリポソームに包埋させ
た状態で調製され得る。固体製剤としては、自体公知の
方法、例えば、本発明の造血因子にマンニトール、トレ
ハロース、ソルビトール、ラクトース、グルコースなど
を賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製され得る。
ゲル化剤としては、自体公知の方法、例えば、本発明の
造血因子をグリセリン、ポリエチレングリコール、メチ
ルセルロース、カルボキシルメチルセルロースなどの増
粘剤に溶解した状態で調製され得る。
ば、軟膏剤、注射剤、湿布剤、塗布剤、座剤、経鼻吸収
剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。溶液製
剤は自体公知の方法、例えば、本発明の造血因子を通
常、注射剤に用いられた無菌の水溶液に溶解、あるいは
抽出液に懸濁、さらには乳化してリポソームに包埋させ
た状態で調製され得る。固体製剤としては、自体公知の
方法、例えば、本発明の造血因子にマンニトール、トレ
ハロース、ソルビトール、ラクトース、グルコースなど
を賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製され得る。
ゲル化剤としては、自体公知の方法、例えば、本発明の
造血因子をグリセリン、ポリエチレングリコール、メチ
ルセルロース、カルボキシルメチルセルロースなどの増
粘剤に溶解した状態で調製され得る。
【００２１】いずれの製剤においても、安定化剤として
ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、α２マクロ
クロブリン、アミノ酸などを添加することができ、また
分散剤あるいは吸収促進剤として、本発明の造血因子の
生理活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコー
ル、イオン性界面滑性剤、非イオン性界面活性剤などを
添加することができる。
ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、α２マクロ
クロブリン、アミノ酸などを添加することができ、また
分散剤あるいは吸収促進剤として、本発明の造血因子の
生理活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコー
ル、イオン性界面滑性剤、非イオン性界面活性剤などを
添加することができる。
【００２２】本発明の造血因子の有効投与量および投与
回数は、投与剤形、投与レート、患者の年齢、体重、治
療すべき症状の性質もしくは重篤度によっても異なる
が、通常、成人一人あたり０．０１〜１００ｍｇを、好
ましくは０．１〜１０ｍｇを一回または数回に分けて投
与することができる。
回数は、投与剤形、投与レート、患者の年齢、体重、治
療すべき症状の性質もしくは重篤度によっても異なる
が、通常、成人一人あたり０．０１〜１００ｍｇを、好
ましくは０．１〜１０ｍｇを一回または数回に分けて投
与することができる。
【００２３】
【実施例】以下、本発明をより詳細に説明するために実
施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００２４】実施例１ ＣＭＫ細胞（Satoら，British Journal of Haematolog
y, 72, 184-190, 1989）５×１０4 cell／mlを１０％Ｆ
ＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２００ｍｌでスピナー
ボトル中、３７℃で培養した。約１週間後、細胞数が３
×１０5 cell／mlに達したところで、リン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）２００ｍｌ／回で細胞を２回洗浄し、続
いて培養液を血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地２０
０ｍｌに置換した。さらに、３７℃、２日間培養し、培
養上清を粗原料とした。
y, 72, 184-190, 1989）５×１０4 cell／mlを１０％Ｆ
ＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２００ｍｌでスピナー
ボトル中、３７℃で培養した。約１週間後、細胞数が３
×１０5 cell／mlに達したところで、リン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）２００ｍｌ／回で細胞を２回洗浄し、続
いて培養液を血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地２０
０ｍｌに置換した。さらに、３７℃、２日間培養し、培
養上清を粗原料とした。
【００２５】粗原料５リットルを限外濾過濃縮器（フィ
ルトロン社）で４５ｍｌに濃縮した。濃縮液１５ｍｌず
つをSuperdex pg ２００カラム（２．６×６０ｃｍ、フ
ァルマシア社）で３回に分けてゲル濾過を行った。展開
液は０．３Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いた。後述した巨核芽球増幅活性の
測定法により検出された活性のある画分９０ｍｌをＣ４
逆相カラム（１×２５ｃｍ、Vydac 社）に注入し、０．
１％トリフルオロ酢酸（ｐＨ２）を含む水／アセトニト
リルの濃度勾配溶離法により、巨核芽球増幅因子を溶出
した。活性画分２ｍｌをSpead Vac 濃縮機で減圧乾固
し、１００μｌの蒸留水に溶かした。
ルトロン社）で４５ｍｌに濃縮した。濃縮液１５ｍｌず
つをSuperdex pg ２００カラム（２．６×６０ｃｍ、フ
ァルマシア社）で３回に分けてゲル濾過を行った。展開
液は０．３Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いた。後述した巨核芽球増幅活性の
測定法により検出された活性のある画分９０ｍｌをＣ４
逆相カラム（１×２５ｃｍ、Vydac 社）に注入し、０．
１％トリフルオロ酢酸（ｐＨ２）を含む水／アセトニト
リルの濃度勾配溶離法により、巨核芽球増幅因子を溶出
した。活性画分２ｍｌをSpead Vac 濃縮機で減圧乾固
し、１００μｌの蒸留水に溶かした。
【００２６】次に、この濃縮活性画分をLaemmli の方法
（Nature, 227, 680-685, 1970）に準じて、非還元条件
下でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行った。泳動
後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを２ｍｍ幅でスライスし、ス
ライス片（１×２×４ｍｍ）あたり０．５ｍｌのリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で４℃、一晩浸
漬し、ゲル中のタンパク質を溶出した。活性画分の溶出
液中の巨核芽球増幅因子活性は、１００単位／mlであっ
た。
（Nature, 227, 680-685, 1970）に準じて、非還元条件
下でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行った。泳動
後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを２ｍｍ幅でスライスし、ス
ライス片（１×２×４ｍｍ）あたり０．５ｍｌのリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で４℃、一晩浸
漬し、ゲル中のタンパク質を溶出した。活性画分の溶出
液中の巨核芽球増幅因子活性は、１００単位／mlであっ
た。
【００２７】巨核芽球増幅因子活性を有する画分を、再
度、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、銀染色
したところ、分子量３４０００±４０００の位置に単一
のバンドが検出された。この画分の精製タンパク質１μ
ｇをプロテイン・シーケンサー（Applied Biosystams社
４７０型）でアミノ酸配列を分析したところ、Ｎ末端８
個のアミノ酸配列は配列表の配列番号１の通りであっ
た。
度、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、銀染色
したところ、分子量３４０００±４０００の位置に単一
のバンドが検出された。この画分の精製タンパク質１μ
ｇをプロテイン・シーケンサー（Applied Biosystams社
４７０型）でアミノ酸配列を分析したところ、Ｎ末端８
個のアミノ酸配列は配列表の配列番号１の通りであっ
た。
【００２８】巨核芽球増幅活性は以下の方法により検出
した。巨核芽球系株化細胞であるＣＭＫ細胞（Satoら，
British Journal of Haematology, 72, 184-190, 1989
）を１×１０4 cell／０．５ml medium／wellで２４
ウェルプラスチックプレートに播種した。培養液は５％
胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を
用いた。これに被験サンプル５０μｌを加え、３７℃、
５日間培養した。培養後、細胞数と細胞直径を細胞計数
機（コールター・カウンターＺＭ型）で測定し、細胞直
径が１５μｍ以上に達した細胞の存在比率を算出した。
対象群の存在比率に対する被験群の存在比率を巨核芽球
増幅活性比率として算出し、活性比率５０％を増加する
力価を１単位とした。
した。巨核芽球系株化細胞であるＣＭＫ細胞（Satoら，
British Journal of Haematology, 72, 184-190, 1989
）を１×１０4 cell／０．５ml medium／wellで２４
ウェルプラスチックプレートに播種した。培養液は５％
胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を
用いた。これに被験サンプル５０μｌを加え、３７℃、
５日間培養した。培養後、細胞数と細胞直径を細胞計数
機（コールター・カウンターＺＭ型）で測定し、細胞直
径が１５μｍ以上に達した細胞の存在比率を算出した。
対象群の存在比率に対する被験群の存在比率を巨核芽球
増幅活性比率として算出し、活性比率５０％を増加する
力価を１単位とした。
【００２９】
【発明の効果】本発明の造血因子は巨核芽球増幅活性を
有するため、骨髄機能抑制による造血機能不全の治療剤
として用いることができる。好ましくは巨核球系細胞の
減少を伴う疾患の治療や血小板減少症の治療に利用する
ことができる。
有するため、骨髄機能抑制による造血機能不全の治療剤
として用いることができる。好ましくは巨核球系細胞の
減少を伴う疾患の治療や血小板減少症の治療に利用する
ことができる。
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：８ トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
Claims (3)
- 【請求項１】 巨核芽球増幅活性を有し、下記の性質を
有することを特徴とする新規な造血因子。 （ａ）分子量：３４０００±４０００（非還元条件下の
ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル
電気泳動で測定）、 - 【請求項２】 ヒト巨核芽球系細胞由来である請求項１
記載の造血因子。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の造血因子を有効
成分として含有する血液細胞増加剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5334120A JPH07188293A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 新規な造血因子および該造血因子を有効成分とする血液細胞増加剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5334120A JPH07188293A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 新規な造血因子および該造血因子を有効成分とする血液細胞増加剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07188293A true JPH07188293A (ja) | 1995-07-25 |
Family
ID=18273752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5334120A Pending JPH07188293A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 新規な造血因子および該造血因子を有効成分とする血液細胞増加剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07188293A (ja) |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP5334120A patent/JPH07188293A/ja active Pending
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