JPS61186327A - 感染防禦剤 - Google Patents
感染防禦剤Info
- Publication number
- JPS61186327A JPS61186327A JP60023777A JP2377785A JPS61186327A JP S61186327 A JPS61186327 A JP S61186327A JP 60023777 A JP60023777 A JP 60023777A JP 2377785 A JP2377785 A JP 2377785A JP S61186327 A JPS61186327 A JP S61186327A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- human
- acid sequence
- infection
- stimulation factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
略す）を有効成分とする感染防禦剤に関する。
ＣＳＦはヒトまたは動物の骨髄細胞の顆粒球系幹細胞に
作用して、単球マクロファージおよび好中球への分裂増
殖と分化とを誘導することが知られている（例えば、Ｍ
ｅｔｃａｌｆ．Ｄ．等Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈａ
ｅｍａｔｏｌｏｇｙ上１８５ （１９７３）を参照）。
作用して、単球マクロファージおよび好中球への分裂増
殖と分化とを誘導することが知られている（例えば、Ｍ
ｅｔｃａｌｆ．Ｄ．等Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈａ
ｅｍａｔｏｌｏｇｙ上１８５ （１９７３）を参照）。
ヒｌ−ＣＳＦに関してはこれまでヒト正常組織由来のＣ
ＳＦやヒト腫瘍細胞由来のＣＳＦについて多数報告され
ている（例えば、ＳｔａｎｌｅｙＱ！ＦｅｄＰｒｏｃ．
旦２２７２（１９７５）、 Ｂｕｒｇｅｓｓ等Ｂｌｏｏ
ｄ Ａｉ５７３（１９７７）、 Ｓｈａｈ等Ｂｌｏｏｄ
且８１１ （１９７７）、 Ｆｏｊｏ等Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 ｌｌ ３１０９ （１９７８）、 ０ｋａｂｅ等Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ 且３９１０（１９７８）、 Ａｓ
ａｎｏ等Ｂｌｏｏｄ 川８４５（１９７７）、 Ｇｏｌ
ｄｅ等Ｂｌ ｏ ｏ ｄ ５１１３２１ （１９８１）
、 Ｗｕ等Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ ２丘圭 ８
２２Ｅｌ（１９７９）、 Ｄｉｐｅｒｓｉｏ 等Ｂ
ｌｏｏｄ ｈ旦７１７（１９８０） などを参照。） しかしながらこれ等のヒトＣ８Ｆは完全に純化されたも
のではなく従ってヒトＣ８Ｆの医薬としての有用性また
は有効性については未だ不明のままである。
ＳＦやヒト腫瘍細胞由来のＣＳＦについて多数報告され
ている（例えば、ＳｔａｎｌｅｙＱ！ＦｅｄＰｒｏｃ．
旦２２７２（１９７５）、 Ｂｕｒｇｅｓｓ等Ｂｌｏｏ
ｄ Ａｉ５７３（１９７７）、 Ｓｈａｈ等Ｂｌｏｏｄ
且８１１ （１９７７）、 Ｆｏｊｏ等Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 ｌｌ ３１０９ （１９７８）、 ０ｋａｂｅ等Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ 且３９１０（１９７８）、 Ａｓ
ａｎｏ等Ｂｌｏｏｄ 川８４５（１９７７）、 Ｇｏｌ
ｄｅ等Ｂｌ ｏ ｏ ｄ ５１１３２１ （１９８１）
、 Ｗｕ等Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ ２丘圭 ８
２２Ｅｌ（１９７９）、 Ｄｉｐｅｒｓｉｏ 等Ｂ
ｌｏｏｄ ｈ旦７１７（１９８０） などを参照。） しかしながらこれ等のヒトＣ８Ｆは完全に純化されたも
のではなく従ってヒトＣ８Ｆの医薬としての有用性また
は有効性については未だ不明のままである。
近年、感染症領域に於ける化学療法剤の顕著な発達は広
範囲なスペクトルを有し、かつ強力な殺菌力を有する抗
菌剤の登場を促す一方で従来の特定の病原性を有する強
毒物質産生菌からヒトの正常細菌叢を構成するダラム陰
性菌などへの原因菌の菌交代現象を招いており、臨床的
には日和見感染など新たな問題を引き起こしている。さ
らに、強力な抗生物質の使用により減少した細菌類にか
わって、最近はＣａｎｄ Ｉｄａなどのカビ類が患者体
内で増殖するため臨床的に重要な問題となっているが、
抗真菌剤は一般的に極めて副作用が強く、その使用は大
幅に制限されている。、これ等の感染症の治療には従来
の化学療法剤の効果に加え、宿主の防禦機能を賦活する
ような薬剤の使用が望まれているが現在まで有効な薬剤
は見出されていない。
範囲なスペクトルを有し、かつ強力な殺菌力を有する抗
菌剤の登場を促す一方で従来の特定の病原性を有する強
毒物質産生菌からヒトの正常細菌叢を構成するダラム陰
性菌などへの原因菌の菌交代現象を招いており、臨床的
には日和見感染など新たな問題を引き起こしている。さ
らに、強力な抗生物質の使用により減少した細菌類にか
わって、最近はＣａｎｄ Ｉｄａなどのカビ類が患者体
内で増殖するため臨床的に重要な問題となっているが、
抗真菌剤は一般的に極めて副作用が強く、その使用は大
幅に制限されている。、これ等の感染症の治療には従来
の化学療法剤の効果に加え、宿主の防禦機能を賦活する
ような薬剤の使用が望まれているが現在まで有効な薬剤
は見出されていない。
細菌感染の初期には宿主のもつ防禦機能のうち白血球の
禽食殺菌作用が最も強く影響すると考えられている事か
ら好中球やマクロファージの増殖、分化成熟を高めるこ
とにより宿主の感染防禦能を亢進することができれば有
効な感染治療薬となり得る可能性が示唆される。
禽食殺菌作用が最も強く影響すると考えられている事か
ら好中球やマクロファージの増殖、分化成熟を高めるこ
とにより宿主の感染防禦能を亢進することができれば有
効な感染治療薬となり得る可能性が示唆される。
従って純粋なヒ）Ｃ８Ｆの大量生産の研究が活発に行わ
れているが現在まで成功したものはない。
れているが現在まで成功したものはない。
このような状況に於いて本発明者等は口腔底癌患者の腫
瘍細胞から極めて高いＣ８Ｆ産生能を存し、かつ良好な
増殖能を示す細胞株を樹立しくＣＮＣＭ受託番号ｒＩ−
３１５Ｊ）、この細胞株の培養上清からヒト好中球のコ
ロニー形成促進活性を示す純粋なヒ）Ｃ８Ｆの単離に初
めて成功した（特願昭５９−１５３２７３号）。
瘍細胞から極めて高いＣ８Ｆ産生能を存し、かつ良好な
増殖能を示す細胞株を樹立しくＣＮＣＭ受託番号ｒＩ−
３１５Ｊ）、この細胞株の培養上清からヒト好中球のコ
ロニー形成促進活性を示す純粋なヒ）Ｃ８Ｆの単離に初
めて成功した（特願昭５９−１５３２７３号）。
本発明者等は感染動物モデルを用いてこのヒトＣ８Ｆの
感染防禦効果を調べたところ、ヒトＣ８Ｆが１ｎｖｉｖ
ｏ に於いて顕著な好中球の成熟能を何し、従って感染
防禦効果を示したことから感染症治療薬として有効であ
ることを見出し、本発明を完成した。
感染防禦効果を調べたところ、ヒトＣ８Ｆが１ｎｖｉｖ
ｏ に於いて顕著な好中球の成熟能を何し、従って感染
防禦効果を示したことから感染症治療薬として有効であ
ることを見出し、本発明を完成した。
本発明は新規な感染防禦剤の提供に係るものである。
すなわち、本発明はヒトＣ８Ｆを有効成分とする感染防
禦剤である。
禦剤である。
本発明の有効成分であるヒトＣ８Ｆは前述の特許出願に
開示された方法に従って得ることができる他、例えばＣ
８Ｆ産生細胞と、該細胞と区別可能な性質を有し且つ自
己増殖を有する悪性腫瘍細胞とを細胞融合して得られる
ハイブリドーマをマイトジェンの存在または非存在下で
培養することによって得るか、またはヒトＣ８Ｆをコー
ドする遺伝子を用いて組換体ＤＮＡを作成し、これを適
当な宿主細胞（例えば大腸菌、酵母菌、チャイニーズハ
ムスターの卵巣細胞等）で発現させることによって得る
こともできる。
開示された方法に従って得ることができる他、例えばＣ
８Ｆ産生細胞と、該細胞と区別可能な性質を有し且つ自
己増殖を有する悪性腫瘍細胞とを細胞融合して得られる
ハイブリドーマをマイトジェンの存在または非存在下で
培養することによって得るか、またはヒトＣ８Ｆをコー
ドする遺伝子を用いて組換体ＤＮＡを作成し、これを適
当な宿主細胞（例えば大腸菌、酵母菌、チャイニーズハ
ムスターの卵巣細胞等）で発現させることによって得る
こともできる。
これ等の方法で得たヒトＣ８Ｆは全て本発明に含まれる
。
。
得られたヒ）Ｃ８Ｆ含有液は必要により公知の手段でさ
らに精製、濃縮した後凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。また所望によりヒ）Ｃ８Ｆを適当な緩衝液に
溶解した後、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射
剤とすることもできる。
らに精製、濃縮した後凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。また所望によりヒ）Ｃ８Ｆを適当な緩衝液に
溶解した後、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射
剤とすることもできる。
さらに本発明の感染防禦剤はヒトまたは動物医薬用に適
した医薬製剤としての形態をとるために必要な製薬担体
や賦形剤を、さらには安定化剤、吸着防止剤を含むこと
ができる。
した医薬製剤としての形態をとるために必要な製薬担体
や賦形剤を、さらには安定化剤、吸着防止剤を含むこと
ができる。
本発明の感染防禦剤に含まれるヒ）Ｃ８Ｆの投与量、投
与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決めることが
できるが、通常成人−人当たり０．１〜５００ μｇ好
ましくは５〜１１００ｔｔのヒ）Ｃ８Ｆを含有する製剤
を１週間に１〜７回投与することができる。しかし本発
明はヒトＣ８Ｆの含有量によって限定されるものではな
い。
与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決めることが
できるが、通常成人−人当たり０．１〜５００ μｇ好
ましくは５〜１１００ｔｔのヒ）Ｃ８Ｆを含有する製剤
を１週間に１〜７回投与することができる。しかし本発
明はヒトＣ８Ｆの含有量によって限定されるものではな
い。
本発明のヒトＣ８Ｆを有効成分とする感染防禦剤が使用
され得る対象感染菌としては種々の菌を挙げることがで
き、特に限定されるものではないが、なかでもスタフィ
ロコッカス属、ストレプトマイセス属などのダラム陽性
球菌、ニジエリシア属、セラチア属、クレブシェラ属な
どの腸内細菌やヘモフィルスなどを含むダラム陰性通性
嫌気性菌、７ユードモナス属、アルカリ土類金属などの
ダラム陰性好気性菌、バクテロイデスなどのダラム陰性
嫌気性菌、およびキャンディダ属、アスペルギス属など
の真菌等による単独感染又はいくつかの菌による複合感
染に対して高い感染防禦効果が得られる。
され得る対象感染菌としては種々の菌を挙げることがで
き、特に限定されるものではないが、なかでもスタフィ
ロコッカス属、ストレプトマイセス属などのダラム陽性
球菌、ニジエリシア属、セラチア属、クレブシェラ属な
どの腸内細菌やヘモフィルスなどを含むダラム陰性通性
嫌気性菌、７ユードモナス属、アルカリ土類金属などの
ダラム陰性好気性菌、バクテロイデスなどのダラム陰性
嫌気性菌、およびキャンディダ属、アスペルギス属など
の真菌等による単独感染又はいくつかの菌による複合感
染に対して高い感染防禦効果が得られる。
く参考例１〉アッセイ法
ヒトＣ８Ｆによるコロニー形成促進活性（以下Ｃ８Ａと
略す）は以下の方法によって測定された。
略す）は以下の方法によって測定された。
ウマ血清０．４〜Ｉ 被検検体０．１ｍ１． Ｃ３Ｈ
／Ｈｅ（メス）マウスの骨髄細胞浮遊液０．１ｍ１（０
，５〜Ｉ Ｘ １０Ｓ有核細胞）、寒天を０．７５％含
む改変ＭｃＣｏＹ’ ｓ５Ａ培養液０．４〜Ｉ を混
合し直径３５ｍｍの組織培養用プラスティックディツシ
ュに入れて固まらせたのち、３７℃、５％炭酸ガス／９
５％空気、１００％湿度の条件下にて５白間培養し、形
成されたコロニー数（５０個以上の細胞からなる集落を
１コロニーとする）を数え、１個のコロニーを形成する
活性を１単位（Ｕｎｉｔ）としてＣ５Ａを求めた。
／Ｈｅ（メス）マウスの骨髄細胞浮遊液０．１ｍ１（０
，５〜Ｉ Ｘ １０Ｓ有核細胞）、寒天を０．７５％含
む改変ＭｃＣｏＹ’ ｓ５Ａ培養液０．４〜Ｉ を混
合し直径３５ｍｍの組織培養用プラスティックディツシ
ュに入れて固まらせたのち、３７℃、５％炭酸ガス／９
５％空気、１００％湿度の条件下にて５白間培養し、形
成されたコロニー数（５０個以上の細胞からなる集落を
１コロニーとする）を数え、１個のコロニーを形成する
活性を１単位（Ｕｎｉｔ）としてＣ５Ａを求めた。
く参考例２〉 ヒトＣ８Ｆの単離
ヒトＣ３Ｆ産生細胞（ＣＮＣＭ受託番号ｒＩ−３１５Ｊ
）が完全に密に増殖した１５０ｃｍの培養フラスコ２本
より細胞を回収し、これをウシ胎児血清を１０％含有す
るＦ−１０培溶液５００ｍ１に浮遊させたのち、１５８
０ｃｍのガフス製ローラーボトル（Ｂｅｌｃｏ社製）に
移し、０．５ｒ、ｐ。
）が完全に密に増殖した１５０ｃｍの培養フラスコ２本
より細胞を回収し、これをウシ胎児血清を１０％含有す
るＦ−１０培溶液５００ｍ１に浮遊させたのち、１５８
０ｃｍのガフス製ローラーボトル（Ｂｅｌｃｏ社製）に
移し、０．５ｒ、ｐ。
ｍ、の速度で回転培養を行った。細胞がローラーボトル
の内壁に完全に密に増殖した時点で培養液を血清を含ま
ないＲＰＭＩ １６４０に交換し、４日間培養したのち
培養上清を回収し、ウシ胎児血清を１０％含有するＲＰ
Ｍ１１８４０を加えて培養を続行する。３日間培養した
のち再び血清を含まないＲＰＭ１１６４０に液替を行い
、４日後に培養上清を回収した。以下同様の操作をくり
返すことにより、毎週１ボトルより５００ｍ１ずつの血
清を含まない培養上清が得られ、しかもこの方法により
かなり長期間にわって細胞を維持し、培養上清を回収す
ることが可能であった。
の内壁に完全に密に増殖した時点で培養液を血清を含ま
ないＲＰＭＩ １６４０に交換し、４日間培養したのち
培養上清を回収し、ウシ胎児血清を１０％含有するＲＰ
Ｍ１１８４０を加えて培養を続行する。３日間培養した
のち再び血清を含まないＲＰＭ１１６４０に液替を行い
、４日後に培養上清を回収した。以下同様の操作をくり
返すことにより、毎週１ボトルより５００ｍ１ずつの血
清を含まない培養上清が得られ、しかもこの方法により
かなり長期間にわって細胞を維持し、培養上清を回収す
ることが可能であった。
得られた培養上清５Ｌを１バツチとし、これに０．０１
％ツイーン２０を添加後ＨｏｌｌｏｗＦｉｂｅｒＤＣ
−４およびＡｍｉｃｏｎＰＭ−１０（アミコン社製）を
用いた限外ろ適法により約１０００倍に濃縮したのち、
これを以下の順序で精製した。
％ツイーン２０を添加後ＨｏｌｌｏｗＦｉｂｅｒＤＣ
−４およびＡｍｉｃｏｎＰＭ−１０（アミコン社製）を
用いた限外ろ適法により約１０００倍に濃縮したのち、
これを以下の順序で精製した。
■ 直径 ４．６ｃｍ＋ 長さく３０ｃｍ（Ｄ Ｕ
ｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ ５４ カラム（ＬＫＢ社製
）を用い、０．１５Ｍ ＮａＣｌ および０．０１
％ツイーン２０（牛丼化学社製）を含むＯ，ＯＩＭ ト
ＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて前記濃縮した
培養上清５ｍｌを流速約５０ｍ１／時間でゲルろ過した
。尚カラムはあらかじめウシ血清アルブミン（分子量二
６７０００）、オボアルブミン（分子量：４５０００）
、チトクロームＣ（分子Ｍ： １２４００）にてキャリ
プレーシロンを行った。ゲルろ過終了後各フラクション
より ０．１〜Ｉずつ採取し、１０倍に希釈した後、前
述したＣ３Ａの測定方法により活性を示す画分を調べた
。この結果、先ずＶｅ＝４００〜７００ｍ１画分がマク
ロファージ優位のＣ８Ａを示し、Ｖｅ＝８００〜１２０
０ｍ１の両分が好中球優位のＣ３Ａを示すことがわかっ
たので、後者の両分を集めＰＭ−１０（アミフン社製）
を用いる限外ろ過器によって約５ｍｌに濃縮した。
ｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ ５４ カラム（ＬＫＢ社製
）を用い、０．１５Ｍ ＮａＣｌ および０．０１
％ツイーン２０（牛丼化学社製）を含むＯ，ＯＩＭ ト
ＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて前記濃縮した
培養上清５ｍｌを流速約５０ｍ１／時間でゲルろ過した
。尚カラムはあらかじめウシ血清アルブミン（分子量二
６７０００）、オボアルブミン（分子量：４５０００）
、チトクロームＣ（分子Ｍ： １２４００）にてキャリ
プレーシロンを行った。ゲルろ過終了後各フラクション
より ０．１〜Ｉずつ採取し、１０倍に希釈した後、前
述したＣ３Ａの測定方法により活性を示す画分を調べた
。この結果、先ずＶｅ＝４００〜７００ｍ１画分がマク
ロファージ優位のＣ８Ａを示し、Ｖｅ＝８００〜１２０
０ｍ１の両分が好中球優位のＣ３Ａを示すことがわかっ
たので、後者の両分を集めＰＭ−１０（アミフン社製）
を用いる限外ろ過器によって約５ｍｌに濃縮した。
■上記濃縮画分にｎ−プロパツール（東京化成社製、ア
ミノ酸配列決定用）を３０％含む０．１％トリフルオロ
酢酸水溶液を添加し、水中（こ１５分程度放置したのち
、１５．０ＯＯｒ、 ｐ、ｍ、１０分の遠心により沈殿
を除去した。次いで先のｎ−プロパツールおよびトリフ
ルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化したμＢＯｎｄａｐａ
ｋｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ 社製、セミ分取用、８
ｍｍＸ３０ｃｍ）に吸着後、３０〜６０％の直線濃度勾
配のｎ−プロパツールを含む０．１ ％トリフルオロ酢
酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマト装置は日立
Ｅｆ８５−５０型を、検出は日立６３８−４１型検出器
（いずれも日立製作新製）を用い、２２０ ｎｍと２８
０ｎｍの吸収を同時に測定した。溶出後、各両分より１
０μｍを分取し１００＠希釈したのち、活性を示す画分
を調べた。この結果、ｎ−プロパツール４０％にて溶出
されるピークに好中球優位のＣ８Ａが認められたので、
このピークを集め再度同じ条件で再クロマトを行い上記
と同様にしてＣ８Ａを調べたところ、やはりｎ−プロパ
ツール４０％の位置のピークに好中球優位のＣ８Ａが認
められたので、このｌピークを集め（４フラクション＝
４ｍｌ）凍結乾燥した。
ミノ酸配列決定用）を３０％含む０．１％トリフルオロ
酢酸水溶液を添加し、水中（こ１５分程度放置したのち
、１５．０ＯＯｒ、 ｐ、ｍ、１０分の遠心により沈殿
を除去した。次いで先のｎ−プロパツールおよびトリフ
ルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化したμＢＯｎｄａｐａ
ｋｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ 社製、セミ分取用、８
ｍｍＸ３０ｃｍ）に吸着後、３０〜６０％の直線濃度勾
配のｎ−プロパツールを含む０．１ ％トリフルオロ酢
酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマト装置は日立
Ｅｆ８５−５０型を、検出は日立６３８−４１型検出器
（いずれも日立製作新製）を用い、２２０ ｎｍと２８
０ｎｍの吸収を同時に測定した。溶出後、各両分より１
０μｍを分取し１００＠希釈したのち、活性を示す画分
を調べた。この結果、ｎ−プロパツール４０％にて溶出
されるピークに好中球優位のＣ８Ａが認められたので、
このピークを集め再度同じ条件で再クロマトを行い上記
と同様にしてＣ８Ａを調べたところ、やはりｎ−プロパ
ツール４０％の位置のピークに好中球優位のＣ８Ａが認
められたので、このｌピークを集め（４フラクション＝
４ｍｌ）凍結乾燥した。
■上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパツールを４０％含む０
．１ ％トリフルオロ酢酸水溶液２００μｌに溶解し
、ＴＳＫ−Ｇ３００ＳＷカラム（東洋曹達社製＋ ２
．５ ｍｍＸｍｍＸ６Ｏを用いた高速液体クロマトグラ
フィーにかけた。溶出は同水溶液によ リ ０．４ｍｌ
／分の流速で行い、フラクションコレクターＦＲＡＣ−
１００（ファルマシア社製）により ０．４ｍｌずつ分
取した。分取した各両分についてＣ８Ａを前記と同様に
して調べた結果、保持時間が３７〜３８分の画分（分子
量約２万に相当）に好中球優位のＣ８Ａが認められたの
で、この画分を回収し、更に分析用μＢｏｎｄａｐａｋ
ｃ１８カラム（４，８ｍｍ Ｘ ３０ｃｍ）による精製
を施したのち、メインピークを回収し凍結乾燥した。
．１ ％トリフルオロ酢酸水溶液２００μｌに溶解し
、ＴＳＫ−Ｇ３００ＳＷカラム（東洋曹達社製＋ ２
．５ ｍｍＸｍｍＸ６Ｏを用いた高速液体クロマトグラ
フィーにかけた。溶出は同水溶液によ リ ０．４ｍｌ
／分の流速で行い、フラクションコレクターＦＲＡＣ−
１００（ファルマシア社製）により ０．４ｍｌずつ分
取した。分取した各両分についてＣ８Ａを前記と同様に
して調べた結果、保持時間が３７〜３８分の画分（分子
量約２万に相当）に好中球優位のＣ８Ａが認められたの
で、この画分を回収し、更に分析用μＢｏｎｄａｐａｋ
ｃ１８カラム（４，８ｍｍ Ｘ ３０ｃｍ）による精製
を施したのち、メインピークを回収し凍結乾燥した。
このようにして得られたヒトＣ８Ｆは以下の理化学的性
質を有していた。
質を有していた。
■）分子量ニドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による測 定で約１８０００゜ ■）等電点： ｐＩ＝５．７３． ｐＩ＝６．０３お
よびｐＩ＝６．３７ の三つの等電点のうち少なくとも
１つを有する。
ミドゲル電気泳動法による測 定で約１８０００゜ ■）等電点： ｐＩ＝５．７３． ｐＩ＝６．０３お
よびｐＩ＝６．３７ の三つの等電点のうち少なくとも
１つを有する。
ＩＩＩ）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２
５０ｎｍに極小値をもつ。
５０ｎｍに極小値をもつ。
ＩＶ）アミノ酸組成：明細書中の表−■に示すアミノ酸
組成を有する。
組成を有する。
表−■
■６ＮＨＣ１１１０°Ｃ２４時間
■４Ｎメタンスルホン酸＋０．２％３− （２−アミノ
エチル）インドール、１１０℃ ２４時間、４８時間、７２時間 ・Ｔ ｈ ｒ＋ Ｓ ｅ ｒ＋ １／ ２ ＣＶ ８
１ Ｍｅ ｔ＋ Ｇ ａ １ＮＨ２は補正・Ｖａｌ、Ｉ
ｌｅは７２時間値 Ｖ）Ｎ末端から２！残基目迄のアミノ酸配列が次の如く
である。
エチル）インドール、１１０℃ ２４時間、４８時間、７２時間 ・Ｔ ｈ ｒ＋ Ｓ ｅ ｒ＋ １／ ２ ＣＶ ８
１ Ｍｅ ｔ＋ Ｇ ａ １ＮＨ２は補正・Ｖａｌ、Ｉ
ｌｅは７２時間値 Ｖ）Ｎ末端から２！残基目迄のアミノ酸配列が次の如く
である。
８２Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ −Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｕ−ｘ−Ｖａ Ｉ −〈実験例〉ヒ）Ｃ８Ｆの感染防禦
効果 ８〜９週令（体重３５．３±１．３８ｇ）のＩＣＲ系マ
ウス（雄）にエンドキサン（ジオツギ社製、商品名）２
００ｍｇ／ｋｇを腹腔的投与した後３群に分け、その２
群にヒトＣ３Ｆ（２５０００ｕ／マウス又は５００００
ｕ ／マウス）を含む溶媒（１％プロパツール、５
％（Ｗ／Ｖ）マウス血清アルブミン）を、そして別の１
群には溶媒のみを、それぞれ２４時間毎に０．１ｍｌず
つ４回皮下投与した。４回目の投与後３時間して各々の
群にシュードモナスアエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＧＮＢ−１３９（３，９
Ｘ １０ＳＣＦＵ／マウス）を皮下投与して感染させ
た。感染後２１時間してさらにもう一度ヒトＣ８Ｆ （
２５０００ｕ／？ウス又は５００００ ｕ／？ウス）
を含む溶媒又は溶媒のみをそれぞ対応する群に皮下投与
した。
ｌａ−−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ −Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｕ−ｘ−Ｖａ Ｉ −〈実験例〉ヒ）Ｃ８Ｆの感染防禦
効果 ８〜９週令（体重３５．３±１．３８ｇ）のＩＣＲ系マ
ウス（雄）にエンドキサン（ジオツギ社製、商品名）２
００ｍｇ／ｋｇを腹腔的投与した後３群に分け、その２
群にヒトＣ３Ｆ（２５０００ｕ／マウス又は５００００
ｕ ／マウス）を含む溶媒（１％プロパツール、５
％（Ｗ／Ｖ）マウス血清アルブミン）を、そして別の１
群には溶媒のみを、それぞれ２４時間毎に０．１ｍｌず
つ４回皮下投与した。４回目の投与後３時間して各々の
群にシュードモナスアエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＧＮＢ−１３９（３，９
Ｘ １０ＳＣＦＵ／マウス）を皮下投与して感染させ
た。感染後２１時間してさらにもう一度ヒトＣ８Ｆ （
２５０００ｕ／？ウス又は５００００ ｕ／？ウス）
を含む溶媒又は溶媒のみをそれぞ対応する群に皮下投与
した。
感染後１００回目での生存マウス数により感染防禦効果
を調べた（表■） （菌液の調製） ハートインフュージョン寒天平板（Ｄｉｆｃ。
を調べた（表■） （菌液の調製） ハートインフュージョン寒天平板（Ｄｉｆｃ。
社製、商品名）を用いて３７℃で一夜Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＧＮ Ｂ −１３９
を振とう培養する。培養液を生理食塩水に懸濁させて調
製した。
ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＧＮ Ｂ −１３９
を振とう培養する。培養液を生理食塩水に懸濁させて調
製した。
゛に
８週令（体重４０．５±１．６０ｇ）のＩＣＲ系マウス
（雄）にエンドキサン（ジオツギ社製：商品名）２００
ｍｇ／ｋｇを腹腔的投与した後２群に分け１群にヒト
ＣＳ Ｆ （５００００ｕ ／ ？ ウス）を含む溶媒
（１％プロパツール、１０％（Ｗ／Ｖ）同種マウス血清
）を、別の１群には溶媒のみをそれぞれ２４時間毎に０
．１ｍｌずつ４回皮下投与した。４回目の投与後４時間
して各々の群にキャンディダアルビカンス（Ｃａｎｄｔ
ｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｕ−５０−１（白血病患者
尿分離株、東北穴細菌学教室分与） ５．８ Ｘ
１０５ＣＦＵ／マウスを静脈内投与して感染させた。感
染後１０日自主での生存マウス数により感染防禦効果を
調べた（表ＩＩＩ）。
（雄）にエンドキサン（ジオツギ社製：商品名）２００
ｍｇ／ｋｇを腹腔的投与した後２群に分け１群にヒト
ＣＳ Ｆ （５００００ｕ ／ ？ ウス）を含む溶媒
（１％プロパツール、１０％（Ｗ／Ｖ）同種マウス血清
）を、別の１群には溶媒のみをそれぞれ２４時間毎に０
．１ｍｌずつ４回皮下投与した。４回目の投与後４時間
して各々の群にキャンディダアルビカンス（Ｃａｎｄｔ
ｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｕ−５０−１（白血病患者
尿分離株、東北穴細菌学教室分与） ５．８ Ｘ
１０５ＣＦＵ／マウスを静脈内投与して感染させた。感
染後１０日自主での生存マウス数により感染防禦効果を
調べた（表ＩＩＩ）。
（菌液の調製）
サブロー液体培地（２％デキストロース（純正化学社製
）１０％トリプトケースペプトン（ＢＢＬ社製：商品名
）、５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃ。
）１０％トリプトケースペプトン（ＢＢＬ社製：商品名
）、５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃ。
社製：商品名）、ｐＨ５，６）を用いて３７℃で一夜
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ｕ−５０−１
を振とう培養する。培養液を生理食塩水で２回洗浄した
後、生理食塩水に懸濁させて調製した。
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ｕ−５０−１
を振とう培養する。培養液を生理食塩水で２回洗浄した
後、生理食塩水に懸濁させて調製した。
表Ｕ Ｐｓｅｕｃｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
に対する効果 表ｍ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ に対する
感染防禦効果 表■、■に示される如く本発明のヒトＣ８Ｆは顕著な感
染防禦効果を有することが認められた。
に対する効果 表ｍ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ に対する
感染防禦効果 表■、■に示される如く本発明のヒトＣ８Ｆは顕著な感
染防禦効果を有することが認められた。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれ等に限定されるものではない。
発明はこれ等に限定されるものではない。
実施例１
参考例２の方法によって得られたヒ）Ｃ８Ｆ含有フラク
シヨンを無菌処理した後−２０℃で凍結された凍結物を
用いて注射剤とした。
シヨンを無菌処理した後−２０℃で凍結された凍結物を
用いて注射剤とした。
実施例２
参考例２の方法によって得られたヒトＣ８Ｆを無菌操作
で１０ｍ１バイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０°Ｃで凍
結乾燥後ゴム栓にて施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤
とした。
で１０ｍ１バイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０°Ｃで凍
結乾燥後ゴム栓にて施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤
とした。
Claims (3)
- （１）ヒトコロニー刺激因子を有効成分とする感染防禦
剤。 - （２）ヒトコロニー刺激因子が好中球コロニー刺激因子
であることを特徴とする特許請求の範囲第一項記載の感
染防禦剤。 - （３）ヒトコロニー刺激因子が次の理化学的性質を有す
るものであることを特徴とする特許請求の範囲第一項記
載の感染防禦剤。 「理化学的性質」 I ）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による測定で約１８，０００。 II）等電点：ｐ I ＝５．７３、ｐ I ＝６．０３および
ｐＩ＝６．３７の三つの等電点のうち少なくとも１つを
有する。 III）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２５
０ｎｍに極小値をもつ。 IV）アミノ酸組成：明細書中の表− I に示すアミノ酸
組成を有する。 Ｖ）Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如く
である。 【アミノ酸配列があります】
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60023777A JPH0615477B2 (ja) | 1985-02-08 | 1985-02-08 | 感染防禦剤 |
| AT86901138T ATE65798T1 (de) | 1985-02-08 | 1986-02-07 | Menschlicher granuloxcyt-koloniestimulierungsfaktor. |
| EP86901138A EP0215126B1 (en) | 1985-02-08 | 1986-02-07 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| PCT/JP1986/000053 WO1986004506A1 (en) | 1985-02-08 | 1986-02-07 | Infection-protective agent containing human granulocyte colony-stimulating factor as effective ingredient |
| DE8686901138T DE3680613D1 (de) | 1985-02-08 | 1986-02-07 | Menschlicher granuloxcyt-kolonie-stimulierungsfaktor. |
| PCT/JP1986/000052 WO1986004605A1 (en) | 1985-02-08 | 1986-02-07 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| HK662/93A HK66293A (en) | 1985-02-08 | 1993-07-08 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| BG098614A BG61925B2 (bg) | 1985-02-08 | 1994-02-28 | Фактор,стимулиращ човешки гранулоцитни колонии |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60023777A JPH0615477B2 (ja) | 1985-02-08 | 1985-02-08 | 感染防禦剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61186327A true JPS61186327A (ja) | 1986-08-20 |
| JPH0615477B2 JPH0615477B2 (ja) | 1994-03-02 |
Family
ID=12119764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60023777A Expired - Lifetime JPH0615477B2 (ja) | 1985-02-08 | 1985-02-08 | 感染防禦剤 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0615477B2 (ja) |
| WO (1) | WO1986004506A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63101330A (ja) * | 1986-10-18 | 1988-05-06 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 感染症治療剤 |
| JPH02502147A (ja) * | 1986-11-21 | 1990-07-12 | ネクソ ディストリビュシオン | 可聴周波数電気信号処理装置 |
| JPH03504854A (ja) * | 1988-03-29 | 1991-10-24 | イミュノメヂックス・インコーポレーテッド | 細胞毒素療法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5532341A (en) * | 1985-03-28 | 1996-07-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor |
| US6004548A (en) * | 1985-08-23 | 1999-12-21 | Amgen, Inc. | Analogs of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| JPH0618778B2 (ja) * | 1985-10-04 | 1994-03-16 | 中外製薬株式会社 | 白血球減少症治療剤 |
| EP0347041A3 (en) * | 1988-05-13 | 1990-11-22 | Amgen Inc. | Compositions and method for treating or preventing infections in animals |
| US6979442B1 (en) | 1998-08-17 | 2005-12-27 | Pfizer Inc. | Stabilized protein compositions |
| UA118536C2 (uk) | 2008-07-23 | 2019-02-11 | Амбркс, Інк. | Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування |
| AR083006A1 (es) | 2010-09-23 | 2013-01-23 | Lilly Co Eli | Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5859924A (ja) * | 1981-10-03 | 1983-04-09 | Kagaku Gijutsucho Hoshasen Igaku Sogo Kenkyusho | Ｃｓｆ産生腫瘍移植法を用いたｃｓｆの製造法 |
| JPS59210027A (ja) * | 1983-05-14 | 1984-11-28 | Kagaku Gijutsucho Hoshasen Igaku Sogo Kenkyusho | Ｃｓｆの製造法 |
-
1985
- 1985-02-08 JP JP60023777A patent/JPH0615477B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-02-07 WO PCT/JP1986/000053 patent/WO1986004506A1/ja unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5859924A (ja) * | 1981-10-03 | 1983-04-09 | Kagaku Gijutsucho Hoshasen Igaku Sogo Kenkyusho | Ｃｓｆ産生腫瘍移植法を用いたｃｓｆの製造法 |
| JPS59210027A (ja) * | 1983-05-14 | 1984-11-28 | Kagaku Gijutsucho Hoshasen Igaku Sogo Kenkyusho | Ｃｓｆの製造法 |
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|---|---|---|---|---|
| JPS63101330A (ja) * | 1986-10-18 | 1988-05-06 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 感染症治療剤 |
| JPH02502147A (ja) * | 1986-11-21 | 1990-07-12 | ネクソ ディストリビュシオン | 可聴周波数電気信号処理装置 |
| JPH03504854A (ja) * | 1988-03-29 | 1991-10-24 | イミュノメヂックス・インコーポレーテッド | 細胞毒素療法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0615477B2 (ja) | 1994-03-02 |
| WO1986004506A1 (en) | 1986-08-14 |
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