JP2000504310A - 敗血症の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、成熟または修飾ＫＣ［配列番号：１］、ｇｒｏα［配列番号：２］、ｇｒｏβ［配列番号：３］またはｇｒｏγ［配列番号：４］から選択されるケモカインあるいはそれらの多量体を単独で、あるいは抗感染剤と組み合わせて使用する、敗血症の予防および治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 敗血症の治療方法 発明の分野 本発明はある種のケモカインまたはその生物学的に活性なフラグメントを単独 でまたは抗感染剤と組み合わせて用いる、敗血症の治療および予防方法に関する 。 発明の背景 本明細書の用語、敗血症は、広く、微生物による宿主の侵入が、限定されるも のではないが、感染症の臨床的発現： （１）体温が３８℃より高いかまたは３６℃未満；（２）心拍数が１分間当た り９０拍より多い；（３）呼吸数が１分間当たり２０回より多いかまたはＰａＣ Ｏ₂が３２ｍｍＨｇ未満；（４）白血球の数が１２０００個／立方ｍｍより多い かまたは４０００個／立方ｍｍ未満、あるいは未成熟（バンド）形のものが１０ ％よりも多い；（５）器官機能不全、低潅流または低血圧に関連付けられる状況 を意味するのに定義される。低潅流および潅流異常は、乳酸アシドーシス、尿量 過少症または精神状態の急激な変化を包含する（Chest1992;101:1644-1566）が 、これらに限らない。 敗血症は、入院患者を血流侵入に対して感受性にする疾患または症状の患者、 または熱傷、外傷または術後の患者において起こり得る。敗血症の多くの患者に おける、主たる病原体は、エシェリシア・コリ（Escherichiacoli）であり、つ いでクレブシエラーエンテロバクター-セラチア（Klebsiella-Enterobacter-Ser ratia）群などの他のグラム陰性菌、シュードモナス（Pseudomonas）である。感 染の割合は幾分小さいが、スタフィロコッカス（Staphylococcus）などのグラム 陽性菌および全身的ウイルス感染および真菌感染が本明細書に用いられる敗血症 なる用語に含まれる。尿生殖器管が感染する最も一般的な部位であり、胃腸管お よび気管が次に敗血症の頻繁に生じる源である。他の一般的な病巣は損傷、熱 傷および骨盤感染であり、静脈内カテーテルで感染する。 細菌性感染の結果、敗血性ショックとなることがしばしばである。敗血性ショ ックは、組織に十分な酸素を供給できなくなる不当な組織潅流、低血圧および尿 量過少症により特徴付けられる。 細菌産物が細胞ならびに凝固、補体、フィブリン溶解およびブラジキニン系の 成分と反応し、細胞を傷つけるプロテアーゼを放出し、特に毛細管における血流 を変えるために、敗血性ショックが起こる。 微生物が、しばしば、古典的補体活性化経路を活性化し、エンドトキシンが別 の経路を活性化する。補体活性化、ロイコトリエン生成および好中球に対する細 菌産物の直接的作用が、これらの炎症性細胞の肺における蓄積、肺内皮細胞を傷 つけ、成人呼吸窮迫症候群（「ＡＲＤＳ」）を罹患するその蛋白質分解酵素およ び毒性酸素基の放出をもたらす。ＡＲＤＳは敗血性ショックの患者における主た る死亡原因であり、肺うっ血、顆粒球凝集、出血および毛細管血栓により特徴付 けられる。 敗血性ショックが集中治療部での主な死亡原因である。米国では１年当たり推 定２０００００件の敗血性ショックの患者がおり、技術の進歩 (すなわち、呼吸 維持装置)および抗生物質療法にもかかわらず、敗血性ショックの死亡率は４０ ％を越えたままである。実際、確立された敗血性ショックに関する死亡率は、Wa isbrenの包括的記載（Arch.Intern.Med.８８：４６７−４８８（１９５１））に よればほとんど減少していない。効果的な抗生物質を利用することができ、敗血 性ショック症候群についての認識が増加しているにもかかわらず、過去数十年に わたる敗血性ショックの発生率は、事実、増加している。抗菌剤で敗血症死亡を 根絶することができない以上、近年の確立された療法の欠点を修正するために、 単独でまたは抗菌剤と組み合わせて用いられる別の薬剤を開発する必要があるの は明らかである。 発明の概要 本発明は、ＫＣ、ｇｒｏα、ｇｒｏβ、およびｇｒｏγから選択されるケモカ イン由来の蛋白の有効量を敗血症の予防または治療が必要なヒトまたはヒトでな い動物に投与することを含む、敗血症の予防または治療方法に関する。最も好ま しくは、本発明方法に用いるケモカインは、修飾ＫＣ［配列番号：１の全長蛋白 のアミノ酸５〜７２］、修飾ヒトｇｒｏβ［配列番号：３の全長蛋白のアミノ酸 ５〜７３］または修飾ヒトｇｒｏγ［配列番号：４の全長蛋白のアミノ酸５〜７ ３］あるいはそれらの多量体を包含する。また、成熟ケモカインを本発明方法に 用いてもよい。 本発明方法を、単独で、あるいは抗感染剤の投与と組み合わせて行ってもよい 。 本発明に関する他の態様および利点を、下記の本発明の好ましい具体例の詳細 な説明においてさらに説明する。 発明の詳細な説明 本発明の目的は、敗血症の治療を必要とするヒトを包含する動物に有効量のケ モカインを投与することを含む、敗血症の新たな治療方法を提供することである 。本発明方法において有用なケモカインは、ＫＣ［配列番号：１］、ｇｒｏα［ 配列番号：２］、ｇｒｏβ［配列番号：３］、ｇｒｏγ［配列番号：４］、また はそれらの修飾蛋白および多量体蛋白を包含し、それらは国際特許出願公開ＷＯ ９４／２９３４１に記載されており、これを参照により本明細書に記載されてい るものとみなす。修飾ＫＣ［配列番号：１のアミノ酸５〜７２］、修飾ｇｒｏβ ［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］、修飾ｇｒｏγ［配列番号：４のアミノ酸 ５〜７３］、および二量体修飾ｇｒｏβ［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］が 特に望ましい。 これらのケモカインはすでに記載されたものであるが、敗血症の予防および治 療におけるそれらの使用は報告されていない。成熟ＫＣ［配列番号：１］、ヒト ｇｒｏα［配列番号：２］、ヒトｇｒｏβ［配列番号：３］またはヒトｇｒｏγ ［配列番号：４］、および特に、それらに由来する修飾および多量体ケモカイン が、致命的な敗血症を引き起こす生物に攻撃を受けた動物の生存率を有意に上昇 させることが、今回、見いだされた。胸部または腹部の外科手術前における、本 発明医薬または化合物を単独で、または抗感染剤と組み合わせて用いる処置は、 術後の敗血症の可能性を低下させることにおいて有用であろう。すでに述べたよ うな種々の理由により引き起こされる敗血症の治療のために、術後にそれを使用 してもよい。 上記のごとく、医薬の製造および本発明方法に有用な蛋白は、成熟ケモカイン 、修飾ケモカイン、およびそれらの多量体を包含する。 本明細書の用語「成熟ケモカイン」は、「インタークリン」としても知られ、 当該分野においてＫＣ、ｇｒｏα、ｇｒｏβ、およびｇｒｏγと慣用的に呼ばれ ている蛋白であると定義する。便利のため、７２個の残基を有するネズミ蛋白Ｋ Ｃのアミノ酸配列を配列番号：１に示す。これらの配列はGenbankの受託番号Ｊ ０４５９６から利用可能である。ヒト蛋白ｇｒｏα（アミノ酸１〜７３）の配列 を配列番号：２に示す。ヒト蛋白ｇｒｏβ（アミノ酸１〜７３）を配列番号：３ に示す。ヒト蛋白ｇｒｏγの配列を配列番号：４に示す。ｇｒｏγのＤＮＡおよ びアミノ酸配列は国際特許出願公開ＷＯ９２／００３２６（１９９２年１月９日 ）にも示されている。これらのｇｒｏγ配列は、さらに国際特許出願公開ＷＯ９ ４／２９３４１（１９９４年１２月２２日）において公表されており、参照によ り本明細書に記載されているものとみなす。 用語「修飾ケモカイン」は、上で引用した国際出願において定義されている。 修飾ケキカインはＫＣ、ｇｒｏβ、ｇｒｏα、およびｇｒｏγ由来、より好まし くはｇｒｏβ、ｇｒｏα、およびｇｒｏγ、最も好ましくはｇｒｏβ由来のもの である。修飾ケモカインは、成熟蛋白のアミノ末端における約２個ないし約８個 のアミノ酸の除去により特徴づけられるデスアミノ蛋白を包含する。最も好まし くは修飾ケモカインはアミノ（Ｎ−）末端における最初の４個のアミノ酸の除去 により特徴づけられる。特に、組み換え法により発現される場合、本発明におい て有用なデスアミノケモカインは、挿入されたＮ−末端Ｍｅｔを含んでいてもよ い。発現を目的として蛋白中に挿入されるＮ−末端メチオンニンを、宿主細胞に よる蛋白プロセッシングの間に、あるいは既知方法を用いて合成的に開裂しても よい。別法として、所望ならば、このアミノ酸を酵素消化または他の既知手段に より開裂してもよい。特に望ましい修飾ケモカインは、修飾ＫＣ［配列番号：１ のアミノ酸５〜７２］、修飾ヒトｇｒｏβ［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］ および修飾ヒトｇｒｏγ［配列番号：４のアミノ酸５〜７３］を包含する。 成熟蛋白の生物学的活性を有しているＫＣ、ｇｒｏα、またはｇｒｏγの他の アナログまたは誘導体も、用語「修飾ケモカイン」に包含される。ここに定義す るように、かかるアナログおよび誘導体は、蛋白、例えば配列番号：１〜４に示 される蛋白の既知アミノ酸配列において作成された変化によっても特徴づけられ る修飾蛋白を包含する。かかるアナログは、８個またはそれ以下のアミノ酸残基 、好ましくは約５個またはそれ以下のアミノ酸残基が成熟蛋白のものとは異なる アミノ酸配列を有することにより特徴づけられる。蛋白のアミノ酸配列における 相違は保存的アミノ酸置換のみを包含することが好ましい。１のアミノ酸が置換 されるべきアミノ酸と実質的に同じ電荷を有しており、その置換が蛋白の局部的 なコンホーメーションまたはその生物学的活性に対して有為な影響を与えない場 合に、保存的アミノ酸置換が起こる。あるいはまた、配列中への１のアミノ酸の 導入のごとき変化が、蛋白の安定性を変化させることができるものであり、ある いは所望宿主中での発現を可能にしうるものであることが好ましい。これらの修 飾蛋白のもう１つの特徴は、成熟蛋白と比較した場合の向上した生物学的活性で あってもよい。 本明細書の用語「多量体蛋白」または「多量体」は、本発明において有用な成 熟および／または修飾蛋白の多量体形態、例えば二量体、三量体、四量体および 他の凝集形態を意味する。合成または組み換え発現によりかかる多量体形態を調 製することができ、かかる多量体形態は、後で説明するような合成および組み換 え法の組み合わせにより製造されるケモカインを含む。多量体は、発現により自 然にできるものであってもよく、あるいはかかる多量体形態に構築されるもので あってもよい。多量体ケモカインは、同じ修飾ケモカインからなる多量体を包含 してもよい。異なる修飾蛋白の凝集により別の多量体を得てもよい。本発明の修 飾ケモカインと既知の成熟ケモカインとの凝集によりさらに別の多量体を得ても よい。好ましくは、本発明において有用な二量体または多量体は、少なくとも１ つのデスアミノケモカイン蛋白および少なくとも１つの他のケモカインまたは同 じタイプの生物学的活性を有することにより特徴づけられる他の蛋白を含むであ ろう。この他の蛋白はさらなるデスアミノケモカイン、または別の既知蛋白であ ってもよい。１の特に望ましい具体例において、本発明方法は、二量体末端切断 ｇｒｏβ蛋白［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］を用い、これを後でより詳細 に説明する。 望ましくは、本発明方法において有用なケモカインは医薬の製造において用い られ、そして／あるいは医薬組成物の製造において有用である。よって、ケモカ インを医薬組成物中に処方し、例えば国際特許出願公開ＷＯ９０／０２７６２( １９９０年３月２２日) およびＷＯ９４／２９３４１（１９９４年１２月２２日 ）に記載されたのと同じやり方で投与することができる。 敗血症の予防または治療のための、本発明方法において有用なこれらの医薬ま たは医薬組成物は、ＫＣ［配列番号：１］、ヒトｇｒｏα［配列番号：２］、ヒ トｇｒｏβ［配列番号：３］、およびヒトｇｒｏγ［配列番号：４］由来の有効 量の成熟、修飾または多量体ケモカイン蛋白を含有しており、敗血症の予防また は治療を必要とする動物に投与される。特に望ましい具体例は、修飾ケモカイン 、またはそれらの多量体を用いる。これらのケモカイン組成物を、単独で、ある いは他の抗感染剤の投与と組み合わせて投与してもよい。 よって、ＫＣ［配列番号：１］、ｇｒｏα［配列番号：２］、ｇｒｏβ［配列 番号：３］、およびｇｒｏγ［配列番号：４］蛋白由来の１またはそれ以上の蛋 白を用いて医薬組成物を調製する。適当な医薬担体は当業者によく知られており 、容易に選択される。現在、好ましい担体はセイラインである。本発明医薬組成 物は他の有効成分を含有していてもよく、あるいは他の治療薬と組み合わせて投 与されてもよい。例えば、本発明組成物は、特に、抗感染剤と組み合わせた投与 に適する。 適当な抗感染剤は、アミノグリコシド類（例えば、アミカシン、トブラマイシ ン、ネチルマイシン、およびゲンタマイシン）、セフタジジムのごときセファロ スポリン類、マクサラクタムのごとき関連ベーターラクタム類、イミペネムのご ときカルボペネム類、アズトレオナムのごときモノバクタム剤ならびにP.aerugi nosa、Enterobacter種、インドール陽性Proteus種、およびSerratiaに対して有 効なアンピシリンおよび広スペクトルペニシリン類（例えば、ペニシリナーゼ耐 性ペニシリン類、ウレイドペニシリン類または抗シュードモナスペニシリンまた はアウグメンチン）のごとき敗血症の治療に通常的に用いられる抗細菌剤を包含 するが、これらに限らない。抗真菌剤、アンホテリシン等ならびにファムビルお よびアシクロビルのごとき抗ウイルス剤も、抗感染剤の定義に含まれる。 本明細書記載のケモカインは、ヒトならびに酪農牛、ウマ、子ウシまたは家禽 のごとき他の動物における敗血症の治療に有用である。ヒトまたは他の動物を効 果的に治療するために、成熟、修飾または多量体のＫＣ［配列番号：１］、ｇｒ ｏα［配列番号：２］、ｇｒｏβ［配列番号：３］またはヒトｇｒｏγ［配列番 号：４］あるいはそれらの多量体（例えば、二量体、末端切断ｇｒｏβ、配列番 号：３のアミノ酸５〜７３）を、約１０ないし約１００００ｆｇ／ｋｇ／１回の 範囲の用量で注射により、あるいは１回あたり約１０ないし約１００００ｆｇ／ ｋｇ体重の範囲の用量で経口的に投与してもよく、輸液または同様の方法で投与 する場合には、用量は約１０ないし約１００００ｆｇ／ｋｇ／１回の範囲であっ てよく、皮下注射により投与する場合には、用量は約１０ないし約１００００ｆ ｇ／ｋｇ／１回の範囲であってよい。 患者の状態に応じて、本発明化合物を予防的および／または治療的処置のため に投与することができる。治療への適用において、疾病およびその合併症を少な くとも部分的に停止させるに十分な量の化合物を、常に疾病に苦しむ患者に投与 する。術後いずれの時にも、好ましくは術後２４時間までに化合物を与えること ができる。予防への適用において、成熟、修飾または多量体のＫＣ［配列番号： １］、ｇｒｏα［配列番号：２］、ｇｒｏβ［配列番号：３］またはｇｒｏγ［ 配列番号：４］あるいはそれらの多量体を含有する組成物を、まだ疾病状態でな い患者に投与して患者の抵抗力を高める。手術の１日または１週間前、好ましく は手術の１ないし２日前に組成物を与えてもよい。組成物を非経口的または経口 的に投与してもよい。 担当医師により選択される用量レベルおよび投与パターンで、化合物の１回ま たは複数回の投与が行われる。いずれの場合にも、患者の有効に治療するに十分 な量の本発明化合物を投与すべきである。 本発明方法において有用なケモカインを、別個に投与される、本明細書にすで に開示したような慣用的抗感染剤、例えばゲンタマイシン、アウグメンチンまた はセフタジジムと組み合わせて投与してもよい。選択される特定の抗感染剤は、 それに対して生物が感受性を有するものであるべきで、感染微生物がより詳細に 同定されるに伴って、治療期間中に選定され変更される。 さらに、敗血性ショックの治療における種々の付加的な作用剤も、本発明組成 物と組み合わせた場合に有効であるかもしれない。それらは、ノルエピネフリン 、エピネフリン、イソプロテレノール、ドパミン、およびドブタミンのごとき交 感神経様作用アミン（昇圧剤）；メチルプレドニソロン抗炎症剤（例えば、イン ドメタシンおよびフェニルブタゾン）のごとき抗炎症剤；ブタメタゾン、ヒドロ コルチゾン、メチルプレドニソロン、またはデキサンタソンのごときコルチコス テロイド；ヘパリン、抗スロンビンＩＩＩまたはある種の症状およびスケジュー ル用のクマリンタイプの薬剤のごとき抗凝血剤；フロセミドまたはエタクリン酸 のごとき利尿剤；およびナロキソンのごときアヘン剤およびベータエンドルフィ ンのアンタゴニスト；腫瘍壊死因子またはインターロイキン−１のアンタゴニス ト；フェノチアジン；抗ヒスタミン剤；グルカゴン；α−アドレナリン作動性遮 断剤、血管拡張剤；血漿増量剤；パックされた赤血球；血小板；寒冷沈降物；新 鮮凍結血漿；細菌の透過性蛋白；クリンダマイシン；ならびにE.coliのＪ５変異 株またはエンドトキシンコア糖脂質（リピドＡ）に対する抗体を包含する。かか る抗体の製造方法は広く文献に記載されている。 臨床的な敗血性シヨック症候群の治療における最も重要な様相の１つは、種々 の非常に有効な抗微生物剤の効果に対する明らかに手に負えない耐性である。よ り新しい抗微生物剤の開発にもかかわらず、臨床的な敗血症の正味の発生率は増 大し、死亡率は許容できないほど高く、しばしば、診断された患者の６０％に達 する。全長、修飾および多量体のＫＣ［配列番号：１］、ｇｒｏα［配列番号： ２］、ｇｒｏβ［配列番号：３］、またはｇｒｏγ［配列番号：４］での予防的 および感染後における治療により生存率が向上するという知見は、敗血症の新し い有用な治療を提供するものである。 修飾ＫＣ［配列番号：１］、修飾ヒトｇｒｏβ［配列番号：３］、修飾ヒトｇ ｒｏｙ［配列番号：４］、および二量体修飾ヒトｇｒｏγの生物学的活性は下記 アッセイにより示される。これらの実施例は本発明の好ましい方法を説明する。 これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。 ラット Taconic farmから得た体重２００ないし２５０ｇのオスのFischer344 ラットを用いた。標準的なプラスチックケージ１つにつき２匹のラットを飼育し 、labエサおよび水を自由に取らせた。 修飾ＫＣ［配列番号：１］、修飾ヒトｇｒｏβ［配列番号：２］または修飾ヒ トｇｒｏγ［配列番号：３］あるいはそれらの多量体を、実施例１記載の方法に よりE.coliにおいて製造した。０．５％熱不活性化自己由来の正常ラット血清を 含有するＤＰＢＳ中に化合物を溶解した。感染２４時間前および２時間前に動物 にＫＣを腹腔内注射した。同じスケジュールで対照動物に希釈バッファーを与え た。感染２時間後から開始して、ラットに１日２回ゲンタマイシンを皮下注射し て治療した。 E.coli 敗血症患者から単離されたE.coliの臨床単離体を用いた。ディスク−寒 天拡散法により抗生物質感受性について生物を試験し、ゲンタマイシン、アンピ シリン、セファロシン、クロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサイクリ ン、トリメトプリン／スルファメトキサゾールに対して感受性があり、ペニシリ ンＧ、エリスロマイシン、およびバンコマイシンに耐性があることがわかった。 生物をマウス中で動物継代し、次いで、回収し、MacConkey 寒天上に撒いた。再 単離された生物を脳−心臓浸潤ブロス中で一晩増殖させ、次いで、−７０℃で凍 結保存した。フィブリンクロットに接種するために、融解保存物からの生物を脳 心臓浸潤ブロス中に接種し、ロータリーシェーカー（１２０ｒｐｍ）上、３７℃ でインキュベーションした。遠心分離によりE.coliを集め、標準セイラインで３ 回洗浄し、最後に標準セイラインに懸濁した。濁度測定により生物数を定量し、 標準セイラインで濃度を調節した。すべての接種物サイズは、MacConkey 寒天上 のコロニー形成ユニットを評価することにより決定した。 フィブリンクロット 滅菌セイライン中のウシフィブリノーゲン（タイプ１− Ｓ，Sigma）の１％溶液から、E.coli感染したフィブリンクロットを作成した。 ヒトスロンビン(Hanna Pharma)、細菌、次いでフィブリノーゲン溶液を２４ウェ ルプラスチックプレートに順次添加することによりクロットを得た。２．０ない し３．０ｘ１０⁹個の細菌数を用いてフィブリンクロットに接種した。次いで、 移植する前に、得られた混合物を室温で３０分インキュベーションした。 動物モデル ケタミン／キシラジン（４０ｍｇ／ｋｇ／５ｍｇ／ｋｇ）でラッ トを麻酔し、その後、腹部を剃毛し、正中線で開腹した。E.coliを含有するフィ ブリン−スロンビンクロットを腹腔内に移植することにより細菌性腹膜炎を誘発 した。移植後、筋肉層を４−０絹糸で綴じ、傷を手術用ステイプルで閉じた。動 物を詳しく観察し、明らかに瀕死の動物を安楽死させた。 ゲンタマイシン ５日間にわたり１日２回、硫酸ゲンタマイシン（Elkins−Si nn,NJ）５ｍｇ／ｋｇを皮下注射してラットを治療した。 統計 いくつかのプールした研究から、すべての変数データを生存率のパーセ ント値として表す。Fisher'sExtract検定を用いて、１４日目における生存率の 間の相違の統計学的有意性を決定した。ｐ＜０．０５である場合に群間の相違を 統計学的に有意とみなした。 実施例１−末端切断ＫＣおよびＧＲＯβの製造 Ａ．組み換え末端切断ＫＣおよび末端切断ｇｒｏβの発現 末端切断したネズミＫＣ（配列番号：１のアミノ酸５〜７２）およびヒトｇｒ ｏβ（配列番号：３のアミノ酸５〜７３）をE.coliにおいて細胞内発現させた場 合、ＫＣ（配列番号：１のアミノ酸５〜７２）は開始Ｍｅｔを保持した。真正の Ｎ末端組み換え蛋白を得るために、末端切断ＫＣ（配列番号：１のアミノ酸５〜 ７２）のＮ末端に特異的開裂タグを作成した。ＮｄｅＩ部位をコードしている正 プライマーおよびＸｂａＩ部位を含む逆プライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）により、相捕的ＤＮＡ配列を含むプラスミドから末端切断したネズ ミＫＣおよび末端切断したヒトｇｒｏβ（配列番号：３のアミノ酸５〜７３）の 各コーディング配列を増幅した。末端切断ＫＣ（配列番号：１のアミノ酸５〜７ ２）、決定されたエピトープタグ（ＤＥＴ）部位およびエンテロキナーゼ開裂部 位も使用した。これらのＰＣＲフラグメントをE.coli LPlL−依存性発現ベクタ ーｐＥＡＫｎ（ｐＳＫＦ３０１の誘導体）のＮｄｅＩおよびＸｂａＩ部位間にサ ブクローン化した。野生型（ｉｎｄ＋）リプレッサー遺伝子（ｃＩ＋）ＡＲ１２ ０を含有するE.coliの溶原性株中のＬＰＬプロモーターを化学的に誘導すること により各ポリペプチドを発現させた。 Ｂ．末端切断ｇｒｏβ（配列番号：３のアミノ酸５〜７３）の精製および再生 非特異的空気酸化を回避するために２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含 有するｐＨ６．０のバッファー中でE.coliのペレットを溶解させた。大部分の末 端切断ｇｒｏβは不溶性溶解物ペレット中にあり、２０ｍＭＤＴＴを含有する２ ＭグアニジンＨＣｌ，ｐＨ８．０バッファー中で可溶化させた。可溶化した末端 切断ｇｒｏβを２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ６.０のバッファーに対して透析 した。大部分のE.coli蛋白は透析中に沈殿したが、末端切断ｇｒｏβは単量体形 態として溶液中にとどまった（純度９５％より大）。末端切断ｇｒｏβの溶液を ｐＨ８．５に調節し、空気酸化させるために一晩撹拌した。再生した末端切断ｇ ｒｏβの溶液を０．１％ＴＦＡ溶液とし、Ultrasphere C18（Beckman）カラムに 適用して単量体形態を二量体形態から分離した。各形態を別個にプールし、蒸発 させてアセトニトリルを除去し、濃縮し、ＰＢＳに対して透析し、次いで、−７ ０℃で保存した。 Ｃ．末端切断ＫＣ（配列番号：１のアミノ酸５〜７２）の精製 末端切断ｇｒｏβについて説明したように、ＤＥＴ−ＤＤＤＤＫケモカインを 精製し、再生させた。再生したＤＥＴ−ＤＤＤＤＫケモカインをエンテロキナー ゼで消化してＮ末端ＤＥＴ−ＤＤＤＤＫを除去し、抗ＤＥＴモノクローナル抗体 カラムを用いて未消化分子を除去した。消化された分子を上記のごとくＣ１８逆 相ＨＰＬＣを用いてさらに精製した。 Ｄ．特徴づけ Ｎ末端配列決定および分子量についてのＭＡＬＤ−ＭＳを行い、分子が単量体 または二量体いずれかの無傷の形態のＮ末端からＣ末端に至るものであることを 確認した。アミノ酸分析により各ケモカイン濃度を決定し、各標品のエンドトキ シンレベルは０．０５Ｕ／ｍｌ未満であった。 実施例２−末端切断ＧＲＯβ二量体の製造 Ａ．細胞の溶解 ５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．０、４０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤ ＴＡ、５％グリセロール、０．０５％ツイン８０、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、ロイ ペプチンおよびペプスタチンＡ各１ｍｇ／ｍｌを含有する４リットルの溶解バッ ファー中のE.coli LW 細胞４００ｇを、Microfluidics(M110Y 型)ホモジナイザ ー（１１０００ｐｓｉ）に２回通すことにより溶解した。細胞溶解物を１７００ ０ｇで遠心分離（４℃で１時間）し、上清を捨てた。 Ｂ．末端切断ＧＲＯβ二量体の可溶化および再生 溶解物ペレット中の不溶性の末端切断ｇｒｏβ［配列番号：３のアミノ酸５〜 ７３］を、５０mＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．０、２ＭグアニジンＨＣｌ、２０ ｍＭ ＤＴＴを含有するバッファー１．３リットル中で、室温において一晩撹拌 することにより可溶化させた。可溶化した末端切断ｇｒｏβ［配列番号：３のア ミノ酸５〜７３］を２５０００ｇにおける遠心分離により回収し、２ｍＭ ＥＤ ＴＡを含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．０に対して徹底的に透析を 行ってグアニジンＨＣｌおよびＤＴＴを除去して、可溶性で還元型の末端切断ｇ ｒｏ β［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］を得た。末端切断ｇｒｏβの溶液を３ｍ ｇ／ｍｌまで濃縮し（Amicon YM3膜を用いる）、０．５Ｍ Trizma塩基を用いて ｐＨを８．５に上昇させた。室温で一晩撹拌することにより、末端切断ｇｒｏβ ［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］の空気酸化を行った。０．１％ＴＦＡ中の アセトニトリルを３０分で２０％から４０％までとする直線的グラジエントを用 いるVydac C18（Nest）により二量体の生成をモニターした。 Ｃ．二量体の精製 二量体生成が最大に達した時、１０％酢酸を用いて再酸化溶液をｐＨ８．０と し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８.０（バッファーＡ）中で平衡化したToy opearl SP-65OM 上に二量体を捕捉した。４リットルのバッフアーＡ、次いで２ リットルのバッファーＡ中０．１２５Ｍ ＮａＣｌでカラムを洗浄し、バッファ ーＡ中０．１２５〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的グラジエントで４リットル溶出 した。流速は４０ｍｌ／分であった。末端切断ｇｒｏβ二量体は末端切断ｇｒｏ βおよび他のオリゴマー形態の末端切断ｇｒｏβから十分に分離された（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）。末端切断ｇｒｏβ二量体を含有するフラクションを一緒にし、１ ０％ＴＦＡ溶液でｐＨ３．０とし、４％アセトニトリル中０．１％ＴＦＡで平衡 化したVydac C18（２．１ｘ２５ｃｍ）に適用した。０．１％ＴＦＡ中２０〜４ ０％アセトニトリルのグラジエント（３０分）で末端切断ｇｒｏβが溶離された 。末端切断ｇｒｏβ二量体は３０％までのアセトニトリルとともに溶出された。 末端切断ｇｒｏβ二量体を含有するフラクションをプールし、凍結乾燥してアセ トニトリルを除去し、Spectrapor 3K MWCO透析チューブ中に入れてＰＢＳに対し て透析した。 Ｄ．収量 再生を０．１ｍg／ｍｌで行った場合、末端切断ｇｒｏβ二量体の典型的な収 率は０．１５ｍｇ／細胞１ｇであり、再生を３ｍｇ／ｍｌで行った場合、末端切 断ｇｒｏβ二量体の典型的な収率は０．７ｍｇ／細胞１ｇであった。 Ｅ．特徴づけ 非還元的SＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された末端切断ｇｒｏβ二量体の分子 量は末端切断ｇｒｏβの分子量の約２倍であった。還元すると、両形態は同じス ポッ トとして移動し、末端切断ｇｒｏβ二量体がジスルフィド結合した二量体である ことが示された。ＭＡＬＤ−ＭＳ分析により決定された末端切断ｇｒｏβ二量体 の分子量は１５０６９Ｄａ（推定分子量１５０７３Ｄａ）であったが、末端切断 ｇｒｏβの分子量は７５３６Ｄａ（推定分子量７５３７Ｄａ）であった。末端切 断ｇｒｏβ二量体のＮ−末端配列決定により、最終生成物の５〜１０％が開始Ｍ ｅｔを保持していることが示された。末端切断ｇｒｏβ二量体のジスルフィド対 合パターンは末端切断ｇｒｏβと同じ（Ｃ５−Ｃ３１、Ｃ７−Ｃ４７）［配列番 号：３のアミノ酸５〜７３］であったが、すべての対合は分子内というよりはむ しろ分子間のものであった。ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中におけるゲル濾過分析およ び超遠心沈降平衡分析により、末端切断ｇｒｏβ二量体は０．２５ｍｇ／ｍｌの 濃度においては八量体から十六量体への可逆的集合を示すが、末端切断ｇｒｏβ ［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］は２０ｍg／ｍｌの濃度においてでさえ、 非共有結合二量体であることが示された。末端切断ｇｒｏβ二量体の濃度は定量 的アミノ酸分析により決定された。 実施例３−E.coliによる敗血症において予防的に投与された末端切断ＫＣ 感染２４時間前および２時間前に、用量１０、３３、１００または３３３ｆｇ ／ｋｇの末端切断ＫＣ［配列番号：１のアミノ酸５〜７２］を動物に腹腔内投与 した。対照動物には同じスケジュールで希釈バッファーを与えた。感染２時間後 から、ラットを１日２回ゲンタマイシンを皮下注射して治療を開始した。０日目 にE.coli含有フィブリン−スロンビンクロットをラットに移植した。感染２時間 後から、１日２回ゲンタマイシンをラットに皮下注射して治療を開始した。３３ または１００ｆｇ／ｋｇの末端切断ＫＣで予防的に処置され、次いで、ゲンタマ イシン治療されたラットは、ゲンタマイシン治療のみを受けた希釈バッフアー処 置対照ラットよりも有意に改善された生存率を示した。 結果 用量（ｆｇ／ｋｇ） 生存率（生存／死亡） 対照 ８／１７ １０ １０／１５ ３３ １７／８ １００ １８／７ ３３３ １０／１５ 実施例４−E.coliによる敗血症において治療的に投与された末端切断ＫＣ ０日目にE.coli含有フィブリン−スロンビンクロットをラットに移植した。感 染２時間後に、用量３３、１００、３３３または１０００ｆｇ／ｋｇの末端切断 ＫＣ［配列番号：１のアミノ酸５〜７２］を動物に１回腹腔内投与した。対照動 物には同じスケジュールで希釈バッファーを与えた。感染２時間後から、１日２ 回ゲンタマイシンをラットに皮下注射して治療を開始した。１００または３３３ ｆｇ／ｋｇの末端切断ＫＣで治療的に処置され、次いで、ゲンタマイシン治療を 受けたラットは、ゲンタマイシン治療のみを受けた希釈バッファー処置対照ラッ トよりも有意に改善された生存率を示した。 結果 用量（ｆｇ／ｋｇ） 生存率（生存／死亡） 対照 ９／１６ ３３ １１／１４ １００ １７／８ ３３３ １８／７ １０００ １０／１５ 実施例５−S.aureusによる敗血症において治療的に投与された末端切断ＫＣ ０日目にS.aureus含有フィブリン−スロンビンクロットをラットに移植した。 感染２時間後に、用量３３、１００、３３３または１０００ｆｇ／ｋｇの末端切 断ＫＣ［配列番号：１のアミノ酸５〜７２］を動物に１回腹腔内投与した。対照 動物には同じスケジュールで希釈バッファーを与えた。感染２時間後から、１日 ２回ゲンタマイシンをラットに皮下注射して治療を開始した。１００または３３ ３ｆｇ／ｋｇの末端切断ＫＣで治療的に処置され、次いで、ゲンタマイシン治療 を受けたラットは、ゲンタマイシン治療のみを受けた希釈バッファー処置対照ラ ットよりも有意に改善された生存率を示した。 結果 用量（ｆｇ／ｋｇ） 生存率（生存／死亡） 対照 ８／１７ ３３ １１／１４ １００ １７／８ ３３３ ２１／４ １０００ １２／１３ 実施例６−E.coliによる敗血症において治療的に投与された末端切断ｇｒｏβ ０日目にE.coli含有フィブリン−スロンビンクロットをラットに移植した。感 染２時間後に、用量３３、１００、３３３または１０００ｆｇ／ｋｇの末端切断 ｇｒｏβ［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］を動物に１回腹腔内投与した。対 照動物には同じスケジュールで希釈バッファーを与えた。感染２時間後から、１ 日２回ゲンタマイシンをラットに皮下注射して治療を開始した。１００または３ ３３ｆｇ／ｋｇの末端切断ｇｒｏβで治療的に処置され、次いで、ゲンタマイシ ン治療を受けたラットは、ゲンタマイシン治療のみを受けた希釈バッファー処置 対照ラットよりも有意に改善された生存率を示した。 結果 用量（ｆｇ／ｋｇ） 生存率（生存／死亡） 対照 ９／１６ ３３ １２／１３ １００ ２０／５ ３３３ １８／７ １０００ １０／１５ 実施例７−S.aureusによる敗血症において治療的に投与された末端切断ｇｒｏβ ０日目にS.aureus含有フィブリン−スロンビンクロットをラットに移植した。 感染２時間後に、用量３３、１００、３３３または１０００ｆｇ／ｋｇの末端切 断ｇｒｏβ［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］を動物に１回腹腔内投与した。 対照動物には同じスケジュールで希釈バッファーを与えた。感染２時間後から、 １日２回ゲンタマイシンをラットに皮下注射して治療を開始した。１００または ３３３ｆｇ／ｋｇの末端切断ｇｒｏβで治療的に処置され、次いで、ゲンタマイ シン治療を受けたラットは、ゲンタマイシン治療のみを受けた希釈バッファー処 置対照ラットよりも有意に改善された生存率を示した。 結果 用量（ｆｇ／ｋｇ） 生存率（生存／死亡） 対照 ９／１６ ３３ １２／１３ １００ ２０／５ ３３３ １８／７ １０００ １０／１５ 実施例８−E.coliによる敗血症において治療的に皮下注射された末端切断ｇｒｏ β ０日目にE.coli含有フィブリン−スロンビンクロットをラットに移植した。感 染２時間後に、用量０．１、０．３、１．０、または３．３ｐｇ／ｋｇの末端切 断ｇｒｏβ［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］を動物に１回皮下注射した。対 照動物には同じスケジュールで希釈バッファーを与えた。感染２時間後から、ゲ ンタマイシンを１日２回皮下注射することによりラットを治療した。０．３また は１．０ｐｇ／ｋｇの末端切断ｇｒｏβで治療的に処置され、次いで、ゲンタマ イシン治療を受けたラットは、ゲンタマイシン治療のみを受けた希釈バッファー 処置対照ラットよりも有意に改善された生存率を示した。 結果 用量（ｐｇ／ｋｇ） 生存率（生存／死亡） 対照 １０／１５ ０．１ １２／１３ ０．３ １８／７ １．０ ２０／５ ３．３ １１／１４ 実施例９−S.aureusによる敗血症において治療的に皮下注射された末端切断ｇｒ ｏβ ０日目にS.aureus含有フィブリン−スロンビンクロットをラットに移植した。 感染２時間後に、用量０．１、０．３、１．０、または３．３ｐｇ／ｋｇの末端 切断ｇｒｏβ［配列番号：３のアミノ酸５〜７３］を動物に１回皮下注射した。 対照動物には同じスケジュールで希釈バッファーを与えた。感染２時間後から、 ゲンタマイシンを１日２回皮下注射することによりラットを治療した。０．３ま たは１．０ｐｇ／ｋｇの末端切断ｇｒｏβで治療的に処置され、次いで、ゲンタ マイシン治療を受けたラットは、ゲンタマイシン治療のみを受けた希釈バッファ ー処置対照ラットよりも有意に改善された生存率を示した。 結果 用量（ｐｇ／ｋｇ） 生存率（生存／死亡） 対照 ８／１７ ０．１ １３／１２ ０．３ １８／７ １．０ ２０／５ ３．３ １２／１３ 実施例１０−E.coliによる敗血症において予防的に投与されたＧＲＯβ二量体 二量体を形成した２個の末端切断Ｇｒｏβ蛋白［配列番号：３のアミノ酸５〜 ７３］を感染２４時間前に０．１、０．３、１．０または３．３ｐｇ／ｋｇの用 量で動物に皮下注射した。対照動物には同じスケジュールで希釈バッファーを与 えた。感染２時間後から、ラットを１日２回ゲンタマイシンを皮下注射して治療 を開始した。０日目にE.coli含有フィブリン−スロンビンクロットをラットに移 植した。感染２時間後から、１日２回ゲンタマイシンをラットに皮下注射して治 療を開始した。０．３または１．０ｐｇ／ｋｇの末端切断Ｇｒｏβ二量体で予防 的に処置され、次いで、ゲンタマイシン治療されたラットは、ゲンタマイシン治 療のみを受けた希釈バッファー処置対照ラットよりも有意に改善された生存率を 示した。 結果 用量（ｐｇ／ｋｇ） 生存率（生存／死亡） 対照 ８／１７ ０．１ １０／１５ ０．３ １８／７ １．０ ２０／５ ３．３ ８／１７ 実施例１１−S.aureusによる敗血症において治療的に投与されたＧＲＯβ二量体 ０日目にS.aureus含有フィブリン−スロンビンクロットをラットに移植した。 二量体を形成した２個の末端切断ｇｒｏβ蛋白［配列番号：３のアミノ酸５〜７ ３］を感染２時間後に０．０３、０．１、０．３、１．０、３．３、または１． ０ｐｇ／ｋｇの用量で末端切断ｇｒｏβ二量体を動物に１回皮下注射した。対照 動物には同じスケジュールで希釈バッファーを与えた。 感染２時間後から、１日２回ゲンタマイシンをラットに皮下注射して治療を開 始した。０．１、０．３または１．０ｐｇ／ｋｇの末端切断ｇｒｏβ二量体で治 療的に処置され、次いで、ゲンタマイシン治療を受けたラットは、ゲンタマイシ ン治療のみを受けた希釈バッファー処置対照ラットよりも有意に改善された生存 率を示した。 結果 用量（ｐｇ／ｋｇ） 生存率（生存／死亡） 対照 １１／１４ ０．０３ １２／１３ ０．１ １８／７ ０．３ ２３／２ １．０ ２４／１ ３．３ １７／８ １０．０ １２／１３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ジョハンソン，キュング・オー アメリカ合衆国19010ペンシルベニア州 ブリン・モー、ヘイマーケット・レイン28 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）ＫＣ 配列番号：１、（ｂ）ｇｒｏα 配列番号：２、（ｃ）ｇｒ ｏβ 配列番号：３、および（ｄ）ｇｒｏγ 配列番号：４からなる群より選択 されるケモカイン由来の有効量の蛋白を敗血症の治療を要する動物に投与するこ とを含む敗血症の治療方法。 ２．ケモカインが （ａ）成熟ｇｒｏβ； （ｂ）配列番号：３のアミノ酸５から７３までからなる修飾ｇｒｏβ； （ｃ）２個またはそれ以上の（ａ）または（ｂ）からなる会合体を含んでなる 多量体ケモカイン蛋白；および （ｄ）第２のケモカインと（ａ）または（ｂ）との会合体を含んでなる多量体 ケモカイン蛋白 からなる群より選択される請求項１記載の方法。 ３．ケモカインが２個の修飾ｇｒｏβ蛋白からなる二量体蛋白である請求項２ 記載の方法。 ４．該ケモカインが （ａ）成熟ｇｒｏα； （ｂ）配列番号：２のアミノ酸５から７３までからなる修飾ｇｒｏα； （ｃ）２個またはそれ以上の（ａ）または（ｂ）からなる会合体を含んでなる 多量体ケモカイン蛋白；および （ｄ）第２のケモカインと（ａ）または（ｂ）との会合体を含んでなる多量体 ケモカイン蛋白 からなる群より選択される請求項１記載の方法。 ５．該ケモカインが （ａ）成熟ｇｒｏγ； （ｂ）配列番号：４のアミノ酸５から７３までからなる修飾ｇｒｏγ； （ｃ）２個またはそれ以上の（ａ）または（ｂ）からなる会合体を含んでなる 多量体ケモカイン蛋白；および （ｄ）第２のケモカインと（ａ）または（ｂ）との会合体を含んでなる多量体 ケモカイン蛋白 からなる群より選択される請求項１記載の方法。 ６．該ケモカインが （ａ）成熟ＫＣ； （ｂ）配列番号：１のアミノ酸５から７２までからなる修飾ＫＣ； （ｃ）２個またはそれ以上の（ａ）または（ｂ）からなる会合体を含んでなる 多量体ケモカイン蛋白；および （ｄ）第２のケモカインと（ａ）または（ｂ）との会合体を含んでなる多量体 ケモカイン蛋白 からなる群より選択される請求項１記載の方法。 ７．該有効量が約１０ないし約１０００ｆｇ／ｋｇ／１回である請求項１記載 の方法。 ８．該ケモカインが術後２時間から２４時間までに投与される請求項１記載の 方法。 ９．該ケモカインが経口的に投与される請求項１記載の方法。 １０．該ケモカインが皮下注射により投与される請求項１記載の方法。 １１.さらに、有効量の抗感染剤と組み合わせてケモカインを投与する工程を 含む請求項１記載の方法。 １２．抗感染剤がゲンタマイシン、アウグメンチンまたはセフタジジムからな る群より選択される請求項１１記載の方法。 １３．（ａ）ＫＣ 配列番号：１、（ｂ）ｇｒｏα 配列番号：２、（ｃ）ｇ ｒｏβ 配列番号：３、および（ｄ）ｇｒｏγ 配列番号：４からなる群より選 択されるケモカイン由来の有効量の蛋白を敗血症の予防を要する動物に投与する ことを含む敗血症の予防方法。 １４．ケモカインが （ａ）成熟ｇｒｏβ； （ｂ）配列番号：３のアミノ酸５から７３までからなる修飾ｇｒｏβ； （ｃ）２個またはそれ以上の（ａ）または（ｂ）からなる会合体を含んでなる 多量体ケモカイン蛋白；および （ｄ）第２のケモカインと（ａ）または（ｂ）との会合体を含んでなる多量体 ケモカイン蛋白 からなる群より選択される請求項１３記載の方法。 １５．ケモカインが２個の修飾ｇｒｏβ蛋白からなる二量体蛋白である請求項 １４記載の方法。 １６．該ケモカインが （ａ）成熟ｇｒｏα； （ｂ）配列番号：２のアミノ酸５から７３までからなる修飾ｇｒｏα； （ｃ）２個またはそれ以上の（ａ）または（ｂ）からなる会合体を含んでなる 多量体ケモカイン蛋白；および （ｄ）第２のケモカインと（ａ）または（ｂ）との会合体を含んでなる多量体 ケモカイン蛋白 からなる群より選択される請求項１３記載の方法。 １７．該ケモカインが （ａ）成熟ｇｒｏγ； （ｂ）配列番号：４のアミノ酸５から７３までからなる修飾ｇｒｏγ； （ｃ）２個またはそれ以上の（ａ）または（ｂ）からなる会合体を含んでなる 多量体ケモカイン蛋白；および （ｄ）第２のケモカインと（ａ）または（ｂ）との会合体を含んでなる多量体 ケモカイン蛋白 からなる群より選択される請求項１３記載の方法。 １８．該ケモカインが （ａ）成熟ＫＣ； （ｂ）配列番号：１のアミノ酸５から７２までからなる修飾ＫＣ； （ｃ）２個またはそれ以上の（ａ）または（ｂ）からなる会合体を含んでなる 多量体ケモカイン蛋白；および （ｄ）第２のケモカインと（ａ）または（ｂ）との会合体を含んでなる多量体 ケモカイン蛋白 からなる群より選択される請求項１３記載の方法。 １９．該有効量が約１０ないし約１０００ｆｇ／ｋｇ／１回である請求項１３ 記載の方法。 ２０．手術の１ないし２日前に該ケモカインが投与される請求項１３記載の方 法。 ２１．さらに、有効量の抗感染剤と組み合わせてケモカインを投与する工程を 含む請求項１３記載の方法。 １２．抗感染剤がゲンタマイシン、アウグメンチンまたはフセタジジムからな る群より選択される請求項２１記載の方法。