PT98073B - Processo para a preparacao de polipeptidos contendo proteina macrofagica inflamatoria humana mip-2 beta por metodos recombinantes e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 98 073
REQUERENTE: CHIRON CORPORATION, americana, industrial e comercial com sede em 4560 Horton Street,Emeryville, Califórnia 94608, Estados Unidos da América
EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE POLIPÉPTIDOS CONTENDO
PROTEÍNA MACROFÁGICA INFLAMATÓRIA HUMANA MIP-2 BETA POR MÉTODOS RECOMBINANTES E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM
INVENTORES: PATRÍCIA TEKAMP-OLSON e CAROL GALLEGOS
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4? da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883..
nos Estados Unidos da América ém 22 de Junho de 1990, sob o N9 07/541,898 e em 19 de Junho de 1991, sob o N9 07/715,195.
INPI. MOO ,13 R F ,8732
A invenção refere-se ao processo por métodos recombinantes para a preparação de uma composição contendo um polipéptldo MIP-2 beta humano. Ao tentar identificar a contrapartida humana da proteína macrofágica inflamatória murínica 2, obteve-se inesperadamente como resultados, não uma, mas duas sequências possíveis, designadas hu-MIP-2 beta e hu-MIP-2 beta, respectivamente. Utilizando as sequências de ADN e sistemas recombinantes propostos pela invenção obtém-se huMIP-2 beta, uma das duas contrapartidas humanas do mMIP-2, substancialmente isento de outra proteína humana.
A invenção refere-se também a anticorpos reactivos coir polipéptidos de hu-MIP-2 beta, assim como aos processos de ensaios imunológicos para determinar amostras de hu-MIP-2 beta e nucleótido, para detectar as sequências de nucleótido com o código de hu-MIP-2 beta em amostras biológicas.
Antecedentes da invenção
As proteínas inflamatórias macrofágicas (Mips) representam uma classe de proteínas que são produzidas por certas células (por exemplo, macrõfagos ou linfócitos) em resposta a estímulos invasivos, tais como lipopolissacarídeos de bactérias gram-negativas. Assim, podem ser participantes importantes na resposta da célula (organismo hospedeiro) a estes estímulos. Nesta qualidade estas moléculas podem ter potencial terapêutico no tratamento de infecçÓes, do cancro, de disfunção mielopoiética e doenças autoimunes. Foram encontradas duas formas distintas de MIP em culturas de células de tumores macrofágicos do rato! KIP-1 e MIP-2.
MIP—1 de murina
A (m)MIP-l de murina é uma proteína principal segregada por células RAV 264.7 estimuladas por lipopolissacarídeos(LPS), uma linha de células de tumor de macrõfagos de murina. Foi purificada e verificou-se que consistia em duas proteínas aparentadas, a>HIP-lc<e mMlP-1 (Wolpe et al, 1987,-J. Exp. Med., 167;570; Sherry et al, 1988, J. Sxp. Med. , 168:2251).
Os clDNs tanto do mMIP-1 =<,cono do mMIP-1 \h> foram cl ona dos e sequenciados (Davatelis et al, 1988 J. Sxp. Med., 167:1939; Sherry et al, obra citada). A clonagem e sequenciação dos eAEffe correspondentes a mSSIP-l^e mMIP-1 ÇS foram referidos igualmente por Brown et al (1989, J. Immunol» , Kwon e Weissman ( 1989, Proc. Natl. Acad. Sei, USA , 86:1963) e por Brown et al, obra citada, respectivamente. Ambos os grupos isolaram homólogos de mMIP—loíe/ou de mMIP-1 G>a partir de bibliotecas de cADN preparadas a partir de ARff de células T auxiliares murínicas que tinham sido motivadas por tratamento com conconavalina A. Estas resultados sugerem que a ΜΙΡ-loUe a MIP-1βpodem desempenhar um papel importante na activaçSo de células T.
Homólogos d» MXP-1 humana
Diversos grupos domaram o que podem ser os homólogos humanos de mMIP-1 <=-< e mMIP-1^, Em todos os casos oa cADNs foram isolados a partir de bibliotecas com base em ARN de células T humanas aetlvadas. Assim, Obaru et al (1986, J. Biochewu, 99:885) a Zipfel et al (1989, J. Immunol. , 142-1582) relataram ambos a clonagem de cADN que prediz uma proteína tendo elevada homologia com mMIP-1 <=><-( 76%). Analogamente Brown et al, obra citada, Zipfel et al, obra citada, bipes et al (198% Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 85:9704) e Miller et al (1989, Jt Immunol. , 143:2907) referem a clonagem e sequeneiaçSo de cADNs humana que prediz uma proteína com alta homologia com mMIP-1£(75%). A MIP-lc<e a MIP-1pertencem a uma família recém-deserita de proteínas relacionadas que possuem actividades imunomoduladoras (ver Sherry et a.l, obra citada, para * uma revisSo).
MIP-2 de Murina
A MIP-2 de murina (mMIP-2) é uma proteína induzívml que também foi purificada a partir do meio condicionado de célu-
las RAW 264.7 estimuladas por LPS (Wolpe et al, 1989, Proc» Natl. Acad» Sei, USA, 86:3121 ). .0 cADN que codifica a MIP-2 murínica foi clonado e sequenciado.
A íaMIP-2 também é um membro de uma família multigene homóloga. Os membros desta família incluem gro/MGSA, o factor de plaquetas 4, a proteína básica de plaquetas, o precursor de peptídeo que activa o tecido conjuntivo (CTAP-III) e B-tromboglobulina, una proteína induzível por interferona gama, IP-10, e interleucina 8 (IL-8) também por 3-10C, MDNCF, NAP-1 e NAF. Os membros desta família que têm a maia alta horaologia na se» quência de proteínas (geralmente preditaá a partir de cADN clonado) incluem MGSA e KG. Á KGSA (Riehmond et al, 1988, SMBO d. , 7:2025) é um factor de crescimento autócrino co» actividade mitogénica segregada por células de melanoma humano e é o produto do gene gro humano (Anisowicz et al, 1987, Proc. Natl, Acad. Sei. USA , 84:7188). A MGSA tem 57,9« de identidade na sequência de aminoácidos com MIP-2 murínica? a sequência de proteínas predita do provável homólogo de hamster de MGSA (ibid.) tem 68,3% de identidade com mMIP-2. 0 produto do gene KC murínico (Oquendo et al, 1989, J. Biol. Chem. , 264: 4233) é induzido pelo factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e pensa-se que seja o homólogo murínico do gene MGSA/gro humano (63^0% de identidade de aminoácidos com mRIP-2)»
Expressão recombinante de MI?
Não há experiência anterior sobre a expressão de MIP-2 recombinante, ou de MIP-2c<e MIP-2 humanas embora já tinham sido expressos membros da família genética MIP-2, bem como membros da família genética aparentada MIP-1. A pertinência destes resultados para a expressão de MIP-2 murínica ou humana é questionável, dada a natureza idiossincrática da expressão em sistemas heterálogos. A literatura será apesar disso indicada.
As «MIP-l.=<e raMIP-1 foram expressas independentemente em células COS (Graharn et al, 1990, Nature, 344-442). 0 cADN de LD78 ÍObaru et al, obra citada) ou* codifica uma proteína que provavelmente é o horaélogo humano de MIP-1 =< murínica, foi expressa em E. coli como uma fusão na parte terminal earboxilo com interleucina-2 humana, bem como em células COS (Yamamura et al, 1989, J. Clln. Invest. 84:1707). O 1-309 humano, um cADN que codiiica um proteína com homologia a membros da família de proteínas MIP—1, foi expresso em células COS-1 a fim de confirmar que codifica uma proteína segregada (Miller et al, obra citada). Lipes et al (obra citada) descreveu a expressão era baeulovirus de cADíf de Act-2, o homálogo humano de MIP-1 (3 murínica, para mostrar que a proteína codificada foi segregada e para identificar a sequência N—terminei maduras JE, um cADN murínico que codifica uma proteína com hoBiologia a MIP-1 o< e MIP-1Ç3, foi expressa em células COS-1 pae confirmar que codifica ura nácleo polipeptídico co» cerca de 12 KDa (Rollins et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Scl. CSA , 85:3738).
KC, um cADN murínico que codifica uma proteína com horaologia a mMIP-2, foi expressa em células COS-1 para mostrar
que codifica uma proteína segregada (Oquendo et al, obra citada)* 0 peptídeo-III que activa o tecido conjuntivo (CTAD.Xql·»· lenbach et al, 1986, J. Biol, Chem* , 201:719) e IP-10 (Luster and Ravetch (1987, J. Exp* Med. , 196:1084) ambos membiOs da família genética MIP-2, foram expressos numa levedura como fusão de factor e em E, colí , respectivamente. Maione et al, (1990, Science , 247:77) exprimiram o factor 4 de plaquetas humanas (família MIP-2) em S. colí como um peptídeo de fusão con u» fragmento pepfídâco com 35 aminoêcidos de (3 -glucuronidase de E. coli* A proteína de fusão insolúvel teve quê ser sujeita a clivagem com brometo de cianogêneo a fim de gerar UB produto bioactivo.
L i nd1ey et al (1983, Proc* Natl* Acad. Sei. USA ,85: 9199) exprimiram NAF (IL-8) um membro da família MIP-2» em B, coli . Depois da purificação e renaturação, esta proteína recombinante provou ter a mesma bioactividade que a identificada para a molécula nativa* Furuta et al (1989, J. Biocheau» 1064:43*») também exprimiram IL-8 (MDNCF) em E.coli . Finalmente, Gimbron» et al (1989, Science , 246:1601) exprimiram IL-8 do endotêlio em células 293 humanas e mostraram que o produto natural e o recombinante tSra a stesma bioactividade,
Bioactividade da MIP
Os estudos sobre as bioactividades de MIP-1 e -2 estão em progresso e utilisaram MIP-1 ou MIP-2 murínicas nativas e muito recentemente MIP-1 ^recombinante murínica (rm), raiMIP-1 β e rraMIP-2 . Entre aa bioactividades definidas pararaMIP-l e
iaMlP-2, tanto recombinante como nativa, citam-se a promoção de actividade do factor estimulante de colónias, bem como o papel na inflamação.
Provou-se que a MIP-2 murínica desencadeia uma resposta inflamatória localizada quando injectada por via subcutânea na nata traseira de ratos C3H/Hej, possui potente actividade quimiotáctica para leucócitos polimorfonueleares humanos (PMIÍ) e induz a desgranulação de PMN de lisozimas mas não de Çi-glucuronidase (Wolpe et al, 1989). Adicionalmente a mMIP-2 provou ter actividade mielopoiética favorável para CFU-GK (Broxmeyer et al, 1989, J» £xp. Med» , 170:1583). Dadas as diversas nctividades biológicas destes factores, ó desejável isolar os seus homólogos humanos. Devido à necessidade de quantidades de factores purificado» para se procurar obter a definição de bioactívidades e a dificuldade de isolamento destes factores a partir dos fluidos das culturas celulares, ê desejável produzir estes produtos empregando a tecnologia de ADN recombinante.
Sumário da invenção lima tentativa para identificar a contrapprtida , humana da mMIP-2 resultou inesperadamente não mma mas 2 sequências candidatas, Estas 2 sequências foram designadas hu-MIP-2 <^<, e hu-MIP-2 , respectivamente.
Constitui um objectivo da presente invenção revelsr um po·· lipeptídeo MIP-2 β humano (hu-MIP-2 p) essencialmente isento
óe outras proteínas hunanss e revelar uma sequência codificante de ácidos nucleicos para a hu—MIP—2 (3.
Constitui áiftàâ outro objectivo da invenção revelar anticorpos reactívos com a hu-MIP-2 p.
ainda um outro objectivo da invenção revelar métodos de diagnóstico para a detecção de hu-MIP-2 p ou de écidO3 nucleicos que codificam sequências para hu-MIP-2 .
3e acordo com estes e outros objectivos que sa tornarão evidentes a partir da descrição adiante, um aspecto da presente invenção refere-se a uma composição de proteína compreendendo polipeptídeo» hu-MIP—2 Ç3 , sendo a corapo3lç3o essenciAmente isenta de outras proteínas humanas.
Hum seu outro aspecto a invenção refere-se a uma molécula de ADN compreendendo uma região heteróloga que codifica o polipeptídeo hu-MIP-2 Ainda nua outro aspecto a invenção refere-se a um sistema de produção.recambinante compreendendo células transformadas cora uma molécula de ADN compreendendo uma região heteróloga que codifica o polipeptídeo hu-MIP-2^» ) A invenção refere-se também a anticorpos que são reactivos com os polipeptídeos hu-MIP-2 p. Outros aspectos ainda da invenção referem«se a métodos de imunoensaios para a determinação de hu-MIP-2 p era tecidos ou fluídos e a métodos de amostra de ácidos nucleicos para a detecção de sequências de polinucleóticos que codificara a hu-MIP-2 Çi era amostras biológicas»
Um outro aspecto da invenção refere—se a pclipeptídeos e a pequenas moléculas orgânicas que reagem cora o receptor ou receptores de hu-MIP-2 ^>e possuem actividades agonístieas
ou antagoníatiças.
Ainda ua outro aspecto da invençSo refere-se a polipeptídeos hu-MIP-2 que exibem actividade agonística e antagonística a qualquer dos membros da família de multigenes homólogos.
Além disso a invençSo refere-se a um método para a indução da cura de feridas, a um método de modulação de mielopoiese e a um método de indução de actividade adjuvante, pela administração de uma quantidade eficaz de polipeptídeos hu—MIP-2 .
A invençSo refere-se também a um método de tratamento de doenças malignas, autoimunes e inflamatórias, tais como infiltraçSo patológica de neutrófilos, incluindo psorfase, artrite reumatoide e doenças dos pulmões, pela administração de uma quantidade eficaz de antagonistas de hu-MIP-2 ^ou de polipeptídeos hu-MIP-2 com actividade antagonística aos membros da família de multigenes homólogos.
Utilizando as sequências de ADN e o sistema recombinante revelado pela presente invençSo, é possível produzir grandes quantidades de um dos 2 homólogos de mMIP-2 essencialmente isentos de outras proteínas humanas, porque apenas uma pmoteína humana é expressa no sistema recombinante. As composições tais como esta, contendo apenas um homólogo de MIP-2, seriam difíceis de obter por purificação a partir de fontes naturais.
desenhas
Figura 1. Sequência nucleótida e sequência de proteína predita de MIP-2 murínica.
Figura 2. Sequência nucleótida e sequência de proteína predita de hu-MIP-2 <=-<.
Figura 3. Sequência nucleõtida e sequência de proteína predita de hu-KIP-2 φ .
Figura 4. Homologia de sequências nucleõtidas de homõlogos de MIP-2. Percentagens de identidade de sequências nucleótidas entre mMIP-2, hu-MIP-2 hu-MIP-2 , hu-gro/MGSA e KC de murina no cADN (A), na região codificante (8) e na regi&o nSo transladada 3* (C).
Figura 5. Horaologia de arainoácidos e alinhamento de homólogos de MXP—2 e de II.-8 humana. (A) percentagens de identidade entre as sequências de aminoâcidas preditas de homólogos de MIP-2, hem como de IL-8 humana. (8) as sequências de aminoácidos alinhadas·
Figura 5. Análise Southern de ADN de MIP-2 murínica e humana digerido com BarnHI, »B’*; EcoRl, »2« ou EcoRV, «R, (A) ADN de murina hiBridisado com cADN de mMlP-2* Uma mancha de ADN humano restrito foi hibridisada primeiro com cADN de hu-MIP-2 marcado (C) e depois o filtro foi raspado e rehibridisado com cADN de hu-MIP-2 «=<(8).
Descrição_pormenorizada
A prática da presente invenção emprega, excepto quando indicado o contrário, técnicas de biologiq molecular convencional, de microbiologia e de ADN recombinante, dentro do âmbito da técnica actual. Esta é amplamente descrita na literatura da especialidade. Ver por exemplo, Maniatis, Fritsch & Saabrod^ Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)ϊ DNA Cloning: A Prmtâtical Approach, Volumes I e (D.N* Glover, ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gaít, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames 4 S.J, Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (8.D* Hames 4 S.J. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture(R.I. Freshney, ed., 1986); Immobilized Cells and Enzimas (IRL Prema, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
DefiniçSes
Na descrição da presente invenção a terminologia adiante é utilizada de acordo com as definiçSes expostas a seguir.
Dm replicão é qualquer elemento genético (por exemplo plasmideo, cromossoma, virus) que funciona como uma unidade autónoma de replicão de ADN in vivo; isto é, capaz de replicação sob o seu próprio controle.
Dm vector é um replicão, tal como um plasmideo, fago ou cosmídeo, ao qual se podem ligar outros segmentos de ADN de modo que tenha lufcar a replicação do segmento ligado.
Umamolécul& de AON de dupla cadeia refere-se à forna polimérica de desoxirribonucleótidos (andenina, guanina, tinina ou citosina) na sua forma normal de hélice de cadeia dupla. Este termo refere-se apenas % estrutura primária e secundária da molécula e não a limita a qualquer forma terciária particular. Deste modo este termo inclui ADN de cadeia dupla que se encontra, entre outros, en moléculas de ADN lineares ( por exemplo, fragmentos de restrição) virus, plasmídeos e cromossomas· Na discussão da esijrutura de moléculas de ADN de cadeia dupla particulares, as sequências pode» ser aqui descritas de acordo com a convenção normal de se indicar apenas a sequência na direcção 5* para 3* ao longo da cadeia não transcrita de ADN (isto é, a cadeia que tem una sequência homóloga ao »ARN).
Uma sequência codificante de ADN é uma sequência de ADN que é transcrita e transladada para um polipeptídeo in vivo, quando colocada sob controle de sequências reguladoras apropriadas. As froçteiras da sequência eodificante são determinadas por um codão de partida na extremidade 5* (amino) e um codão de paragem de translação na extremidade 3’ (carboxi). Uma sequência codificante pode incluir, não estando no entanto limitada a estas, sequências · procarióticas, cADN de mARN cucar iÓt ico, sequências de ADN genómico de ADN eucariótico (por exemplo de mamífero) e mesmo sequências de ADN sintéticas. Um sinal de poliadenilação e a sequência de terminação de transcrição estão geralmente localizadas numa configuração 3* relativamente à sequência codificante.
Uma sequência promotora é uma região reguladora de ADN capaz de ligar AHN-polimerase numa célula e iniciar a transcrição de uma sequência codificante para jusante (direcção 3')
Para od fins de definição da presente invenção a sequência promotora está ligada pela sua extremidade 3* pele codão de partida de translação de uma sequência codificante e estendendo-se para montante (direcção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectáveis acima do fundo. Dentro da sequência promotora encontra-se um sitio de iniciação de transcrição (definido convencionalmente por indicação com nuclease Sl) bem como domínios de ligação com proteínas (sequências consensuais) responsáveis pela ligação de ASN—polimerase. Os promotores aurariótícos contêm frequentemente, mas não sempre, caixas TATA e caixas “CAT”. Os promotores procarióticos contêm sequências de Shine-Delgarno adicionalmente às sequências consensuais -10 e —35.
Uma sequência codificaste está sob o controle da sequehcia promotora numa célula quando a ARN-polímerase que li<a a sequência promotora transcreve a sequência codificante ea mARN que á depois por sua vez transladada para a proteína codificada pela sequência codificante.
Uma célula foi transformada por ADN exógeno quando este ADN exógeno foi introduzido no interior da parede celular. 0 ADN exógeno pode ser ou não integrado (ligado por covalência) ao ADN de cromossomas que forma o genoma da célula. Sm procariotes e leveduras, por exemplo, o ADÍi exógeno pode ser mantido sobre um elemento episomal tal como um plasmídeo. Relativamente às células eucarióticas, uma célula transformada estávelmente é uma célula na qual o ADR exógeno foi integrado num cromossoma de modo que seja herdado por células filhas através da repllcação de cromossomas. Esta estabilidade é demonstea-dái pela capacidade da célula eucariótics de estabelecer linhas de células ou clones constituídos por uma população de células filhas contendo o ADN exógeno. Um clone é uma popu-
lação de células derivadas de unta célula simples ou antepassado comum por mitose. Uma ”linha de células’* é um clone de uma célula primária que é capaz de crescimento estável in vitro durante muitas gerações.
r·
Duas sequências de ADH são ‘'essenciàlmente homólogas” quando pelo menos 85% ( e de preferência pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%) dos nucleótidos se correspondem mutuamente ao longo do comprimento definido das sequências de ADH. As sequências que são essencialmente homólogas podem ser identificadas por uma experiência de hibridisação de Southern, por exemplo sob condições estritas, como são definidas para o sistema particular, A definição de condições de hibridisação apropriadas está dentro do âmbito dos especialistas na técnica. Ver por exemplo Maniatis et a}, obra citada; DNA Cloning, vol I e XI obra citada; Nucleic Acid Hybridization, obra citada.
Uma região ‘'heteróloga” ou domínio de um construído de ADN ê segmento indentificável de ADN dentro de uma molécula maior de ADN que não se encontra em asaociação com a molécula maior na natureza, assí, quando a região heteróloga codifica um gene mamífero, o gene será geralmente flanqueddo por ADN que não flanqueia o ADN genómico de mamífero no genoma do organismo fonte. Outro exemplo de uma região heteróloga é um construído no qual a própria sequênéía codificante não se encontra na natureza {por exemplo, um cADN em que a sequência codificante genómica contém intrões, ou sequências sintéticas tendo codões diferentes dos do gene natural). As variações alélicas ou fenómenos de mutação de ocorreência natural não dão origem a uma região heteróloga de ADN, tal como ê aqui definida.
Os termos polinucleétido analito e ” cadeia analito re· feremmse a uma molécula de ácido nucleico de cadeia simples ou de cadeia dupla cue se suspeita conter uma sequêneia alvo e que pode estar presente numa amostra biolégica.
Tal como é aqui usado» o termo ‘‘amostra*' refere-se a uma estrutura constituída por um polinucleõtido que forma uma estrutura híbrida com uma sequência alvo» devido ã complementaridade de pelo menos uma sequêsttia na amostra com uma sequência na região alvo, as regiões de poliriucleétidos da amostra podem ser compostas por ADN, e/ou ARN, e/ou nucleétidos sintéticos análogos.
Tal como é «pi usado o termo regijlo alvo” refere-se a uma região do ácido nucleico que deverá ser ampliada e/ou detecta?· da. 0 termo “sequência alvo refere-se a uma sequência com a qual uma amostra ou primer” formará um híbrido estável sob condições desejáveis.
termo “sequência polimícleétida de alvo, tal como £ aqui usada, refere-se a uma sequência de polinucleétídos qua é constituída por nucleétidos que são complementares de uma sequência de nêcleétidos alvo; a sequência £ de comprimento suficiente e de complementaridade co» a sequência alvo, de modo a formar ura duplex que tem estabilidade suficiente pa±a os fins pretendidos.
termo “parceiro de ligarão” tal como ê aqui usado, refere-se a uma molécula capaz de ligar uma molécula ligante com alta especificidade» tal como por exemplo um antigene e um anticorpo específico para aquele. Em geral os parceiros de ligação específicos devera ligar-se cora afinidade suficiente para imobilizar o analito (ou a cópia /duplex de cadeia complementai', no caso de amostras de captura) nas condiçSes de isolamento. Os parceiros de ligação específicas são conhecidos na técnica e incluem por exemplo biotina e avidina ou estreptavidina, IgG e proteína A, os numerosos pares receptor-ligante conhecidos, e cadeias de polinucleõtidos complementares: No caso de parceiros de ligação polinucleotidos complementares, os parceiros têm normalmente pelo menos cerca de 15 bases de comprimento e podem ter pelo menos 40 bases de comprimento; adicionalmente têm geralmente um teor de Gs e de Gs de pelo menos cerca de 40% · no máximo cai'ca de 50%, Os polinucleótidoa podem ser compostos por ADN, ARN, ou nucleótidos sintáticos análogos.
termo “acoplado” tal como ê aqui usado refere-se a uma ligação por ligação covalente ou por interacções não covalentes fortes ( por exemplo interacções hidrofóbicas, pontes hidrogénio, etc). As ligações covalentes podem ser por exemplo ligações de éster, de éter, de fosfoéster, de amida, de peptídeo, de imida, ligações de carbono-enxofre, ligações carbono-fóáforo e semelhantes» termo suporte” refere-se a qualquer superfície sólida ou semi-sólida â qual se pode- fixar um parceiro de ligação desejado. Os suportes apropriados incluem vidro, plástico, metais, gela» polimêricos, e semelhantes, e podem tomar a forma de esferas, cavidades, varetas de imersão, membranas, etc, termo “marcação” tal como & aqui usado refere-se a qualquer átomo ou parte de molécula que pode ser usada para propo* cionar um sinal detectável (preferivelmente qualificávei ) e que pode ser ligado ao polinucleótído ou polipeptídeo.
Tal conto é squl usado, o termo amostra marcada” refere-se a um polinucleôtldo que ê constituído por uma sequência de polinucleótidos de marcação, que é complementa» relativamente a uma sequêneia alvo a ser detectada no polinucleõtido analito. esta região complementar tem comprimento e complementaridade suficientes em relação â sequência alvo para proporcionar um duplex constituído pela amostra marcada” e pela sequência alvo a serem deteetadas pela marcação. S acoplada a uma marcação quer directamente quer indireetamente através de un conjunto de moléculas ligantes com alta . especifícidadt para cada uma das outras. Os conjuntos de moléculas ligantes cot alta especificidade são descritos acima (verparceiros de ligação).
Tal como é aqui usado, umaamostra biológica” refere-se a uma amostra de tecido ou de um fluido isolada de um indivíduo, incluindo, mas não se limitando a estas,por exemplo plasma, soro, fluido espiral, linfa, secções exteriores da pele, dos tractos respiratórios, intestinal e génito-urinário, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, tumores, orgãos, e também amostras de eonstltuintas de culturas celulares in vivo (incluindo, sem estar limitado a estas, meio condicionado resultante do crescimento de células num meio de cultura de células, células provavelmente infectadas por virus, células reeombinantes, e componentes de células).
Tecido humano” δ ; um agregado de células humanas que po·* de constituir uma massa sólida. Zste termo também abrange uma suspensão de células humanas, tais como células sanguíneas,ou uma linha de células humana.
Urna composição coapx^eenae ua componentes A selecionado está essencialmente isenta de outro componente S quando o caaponente A constitui pelo amnos cerca de 75% eia peso do peso combinado dos coapoaentes A e 3. Preferivelmente o componente selecionado. A constitui pelo menos cerca de 90% em peso do peso coatoinado, e inais preferivelmente pelo menos cerco de em peso do peso combinado. No caso de uma composição comprecndendo urna proteína biologicamente acúiva selecionada, que cu cá cssencialmenue isenta de proteínas contamiuantes, é por veses preferível que a composição tenéo a actividade da proteína de interesse contenha espécies apenas com um peso molecular único (isto é» uma composição homogénea}»
Duas sequências de aminoácidee são essencialraente homólogas quando pelo menos cerca de S0% dos aminoácidos se correspondem mutuamente ao longo do eonpi’imento definido . da sequência de aminoácidos, de preferência uma correspondência de pelo rnenoâ cerca de 92% e mais preferivelmente uma corresponúência de pelo menos cerca de 95%,
Homólogos humanos de MIP-2 de muifina cADN para ΚΣΡ-2 de murina foi clonado utilizando um aglutinado de amostras de oligonucleótidos degenerados correspondentes a uma porção de sequência de aminoácidos N-terminal determinada na proteína purificada. Quando as amostras de nucleõtid03 representando a região codificante de cADN de MIP-2 murínica foram usadas para comprovar unta biblioteca de cADN proveniente de una linha de células aacrofágicas humana esti-
mulada com LPS (ver exemplo 2) identificaram-se 2 sequências de cADN candidatas diferentes. As proteínas codificadas por estas 2 sequências de cADN foram designadas por hu-MIP-2 <&<e hu-MIP-2 p , respectivamente, Os exemplos de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos destas 3 proteínas estão representados nas figuras: fig,..i= Μϊ?«δ de munina, fig. 2- MIP-2 humana, fig. 3= MIP-2^2> humana.
Os polipeptídeos da proteína 2^ inflamatória macrofágice humana*' (polipepfídeos hu-MIP-2^) compreendem hu-MIP-21^ c análogos de hti-MIP-2 Ç) .
A hu-MIP—2 *’ é a proteína 2 Ç3 inflamatória macrofágica humana, uma proteína humana madura, de ocorrência natural, segregada entre outros por macrofagos estimulados com L?S, e ffcrer.genj ainda todos os percursores e variaçóes alélicao de hr-MIP- 2 , e incluí também ainda formas de peso molecular heterogéneo que possam resultar de um processamento inconsistente in vivo» Um exemplo de sequências de hu-MIP-2está representado na fig. 2.
Os “análogos de hu-MIP-2 Ç>“ sSo uma classe de peptídeos que incluem;
1) “muteinas de hu-MIP-2(3 M que são substâncias poli peptídicas homólogas de hu-MIP-2 (3 t Preferivelmente a sequência de aminoácídso da muteina difere da hu-MIP-2 por 8 resíduos de aminoácidos ou menos, mais preferivelmente 7 resíduos ou menos, e ainda mais preferivelmente cerca de 5 resíiuos ou menos, e muito mais preferivelmente cerca de 2 resíduos ou menos. 2 por vezes preferível que qualquer diferença na sequência de aminoácidos das 2 proteínas envolva apenas substituiçêes eonservativas dos aminoácidos. Substituiçêes conservativas de
aminoácidos ocorram quando um aminoácido tam essencialmente a mesma carga que o aminoácido que ele substitui e a substituição não tem efeito significativo sobre a conformação local da proteína. Como alternatitea, alterações tais como a eliminação de ciateina, que altera a actividade ou a estabilidade da proteína, pode» ser preferidas.
2) “Peptídeos hu-MIP-2(3 truncados, que inclui feagmentos quer de hu-MIP-2 ^3 ” ou de muteinas de hu-MIP-2 ^3 ”, que preferivelmente retêm ou (i) uma sequência de aminoácidos única para au-MIP-2 , (ii) um epítopo único de hu-MIP-2 ou (iii) actividade de MIP-2,
3) “proteínas de fusão de hu-MIP-2 (3 ”, que incluem polipeptídeos heterólogos, e são constituídos por um dos polipeptídeos anteriores (hu-MIP-2 , muteinas de hu-MIP-2 φ ou peptídeos hu-MIP-2 ^3 truncados) fundidos a qualquer sequência de aainoácidos heteróloga. Preferivelmente estas sequências heterólogas fundem-se na extremidade M-terminal da sequência de hu-MIP e compreendem uma sequência leader para dirigir a secreção.
As sequências “únicas de hu-MIP-2 quer as sequências de aminoácidos, quer as sequências de ácidos nucleicos que as codificam, são sequências que são idênticas a uma sequência de um polipetídeo hu-MIP-2ψ, mas que diferem em pelo menos um aminoácido ou um resíduo nucleótido das sequências de hMGSA, hu-MIP-2<j><, mMIP-2 e KC murínica, e preferivelmente não se encontram em qualquer outro ponto no genoma humano. Analogamente, um epítopo é único para polipeptídeos hu-MIP-2 (3 se estiver presente em polipeptídeos hu-MIP-2 (3 mas não estiver era qualquer membro da família genética homóloga.
Características da sequência de aminoácidos predita
As estruturas de leitura abertas de mMIP-2, hu-MIP-2 «<e hu-MIP-2 codificam polipeptídeos de 100, 107 e 107 aminoácidos, respectivamente. Os aproximadamente 30 aminoácidos iniciais de cada um destes 3 polipeptídeos têm marcas características de uma sequência sibal (Perlman et al, 1983, J. Mol.Biol 167: 391j von Heijne, 1984, J, Mol. Biol., 173:243; von Heijne, 1985, Nucleíc Acide Res., 14:4683). A sequência de aminoácidos N-ter»inal determina para mMIP-2 segregada purificada a partir do meio condicionado de células RAV 264.7 estimuladas com LPS (Wolpe et al, 1989) determinou o inicio da proteína mMIP-2 madura na sequência de aminoácidos predita. 0 inicio da sequência de peptídeos madura predita para hu-MIP-2 <=< e hu-MIP-2 (â alinha com a de mMIP-2 e tem um sítio de divergem de peptídeos sinal de consenso (Perlman et al, 1983; von Heijne, 1984, 1986 ). 0 comprimento predito da sequência pep— tídíca madura para todas estas 3 proteínas é de 73 aminoácidos. A MIP-2 de murina é uma proteína básica e os polipeptídeos MIP-2 humanos são igualrnente básicos, com base nos pontos isoelêctricos previstos de 9,9 e 9,7 , respectivamente, para hu-JÍIP-2 e hu-MIP-2 ^3 . As proteínas nativa ou recombinante podem ser O-glicosiladas. Nenhum dos 3 polipeptídeos preditos tem um sinal de consenso para glicosilaçáo ligado a azoto.
Características de cADNs de MIP-2 murínica e humana
As sequências nucleótidas em cADNs para mMIP-2, hu-MIP-2m» e hu-MIF-2 φ codificam, cada uma, uma estrutura de leitura aberta simples. 0 enquadramento da sequência de nucleótidos do codão ATG de iniciação de mMIP-2 conforma-se com a sequência de consenso partilhada por muitos mARNs de eucariótidos superiores Kozark 1986, Cell, 44; 283; Kozark, 1987, Nucleic Acid Res., 15:8125) ;&s de MIP-2 **<e MIP-2 ^humanas falta a purina altaaente conservada na posição -3, mas possuem muitas características das sequências de consenso incluindo resíduos C nas posições -1,-2 e —4 e ura resíduo G na posição +4.
A região não transladada 3’ de mMIP-2 inclui o sinal de poliadenilação de consenso eucariótíco AATAAA (Birnatiel et al, 1985,Cell, 41:349) na posição +719-724, seguido por uma cadeia poli-A que começa no nua&eótido +735. Não se encontrou um sinal de poliadenilação AATAAA na região não transladada era 3’ de clones hu-MIP-2-4a ou hu-MIP-2-7d de cADN de hu-MIP-2 0 ou em. * clones de cADN de hu-MIP-2 Isto ó muito provavelmente devido ao facto de estes clones terem uma região não transladada 3' truncada, uma vez que não estã presente uma cadeia poli-A.
A sequência de consenso TTATTTAT presente na região não transladada 3* de muitos genes de citoquina(Caput et al,1986, Proc.Natl Acad. Sei.USA, 83:1670) e implicada na estabilidade do mARN (Shaw et al, 1986, Cell, 46:659) e na eficiência da translação(Kruys et al, 1987,Proc.Natl. Acad.Sei.USA 84:6030; Han et al, 1990, J, Exp.Med.,171:465) estã presente em múltiplas cópias de todos os 3 cADNs. Esta sequência estã presente em 4 posições, duas sobrepostas, na região não transladada 3' de mMIP—2 (posições +122, +126, +142, +146) ;e está presente 2 vezes (posições +158 e +471 ) e 5 vezes , 2 so —
brepostae (posições +148, +152, +160 β +492) nas regiões ηδο transladadas 3’ de MIP-2 (3 β MIP-2 -^humanas, respectivamente.
Homólogos de MIP-2de narina < huaana
A percentagea da identidade da sequêmcia de nucleótidos entre os 3 cADNe de MIP»2, uma murínica e 2 humanas» bem como a de cADN de gro/MSSA humana (Anisowicz et al, 1987; Richmond et al» 1988) e a de cADN de KC murínica (Oquendo et al» 1989; Cochran et al» 1983; 33:939) está representada na fig. 4Ai 0 cADN de gro/MGSA humano codifica uma proteína com actividade estimulante do crescimento de melanoma (Richmond et al, 1986; J. Cell, Physiol, 129:375); a KC murínica £ um gene induzível pelo factor de crescimento (PDGF) derivado de plaquetas, que se presume ser o homólogo murínico do NCSA humano. Deve destacar-se o alto grau de homologia de nucleótidos entre os 3 cADNs humanos» particularmente entre hMGSA e hu-MIP-2 . Há um grau de identidade de sequência de nucleótidos ainda mais pronunciado entre os 3 homólogos na região codificante, como se mostra a fig. 4B. A identidade da sequência nucleótidos nas regiões ηδο transladadas 3* dos homólogos de MIP-2 humanos £ consideravelmente menor do que a que £ observada nas regiões codlfieantss» com a excepção das respectivas regiões de hu-XIP-2*<e hMGSA. Estes 2 cADNs exibem uma alta percentagem de homologia de sequência também e® toda a regiSo nio transladada 3*.
As comparações de homologia e os alinhamentos das sequências de aminoácidos preditas das proteínas precursoras de homólogos de MIP-2, incluindo hu-HIP-2 hu-MIP-2 , gro/MGSA humana, o homólogo de hamster de gro/MGSA (ha-gro), mMIP-2 e □XC são apresentados na fig. 5 (A,B). Estas 3 proteínas humanas sãtí altamente homólogas (37-90%) mas ocorrem diferenças de aminoácidos ao longo das sequências preditas, particularmente nas extremidades carboxi das sequências das proteínas maduras. Com base apenas nos homólogos de aminoácidos preditos, não é possível designar hu-MIP-2 &<., hu-MIP-2 Ç> ou gro/MGSA humana com os homólogos humanos de mMIP-2 ou KC murínica.
A percentagem de identidade de sequências nucleótidas ê maior entre hu-MIP-2 <=<e hMGSA e estende-se por toda o cADN.
A presença tanto de hu-MIP-2 -»<como também de hu-MIP-2 ^5 numa biblioteca de cADH de U937, preparada utilizando poli-A+ AÍIN de células estimuladas tanto com L?3 como com miristil-acetato de forbol (PMA), permitiu aos investigadores selecionar tam·· 5 bãm hMGSA. A pesquisa de 5 X 10 placas da biblioteca depois de amplificação com oligonucleótido3 específicos para hMGSA (e não hu-MIP-2 <=</^ ) não deu sinais positivos; em contraste detectaram-se 56 sinais positivos com hu-MIP-2<s*c. Isto sugere que a transar,ição de gro/MGSA não ó induzida era células V937 estimuladas por PMA e LPS, em contraste co» a transcrição do gene hu-MIP-2«»<.
Actividades de_KIP-2
A HIP-2 muríniea purificada a aprtir do meio condicionado de células HAW 264,7 estimuladas por LP3 tem diversas activi— caces, incluindo a actividade de favorecimento mielopoiêtieo dependente de CSF para CFC-GM (Broxmeyer et al, 1989) desencadeamento de uma resposta inflamatória localizada depois de administração subcutânea, e uma potente actividade quimiotactica para PMN humana (Volpe et al, 1969). Esta última activitíace é característica de IL-8 humana (hu-IL-8), Com base apenas nesta equivalência funcional foi sugerido que mMIP-2 poderia ser o homólogo murínico de hu-IL-3. Todavia, uma vez que a homologia de aminoácidos de mMIP—2 para hu-IL—8 é baixa, relativamente à homologia de mMIP~2 para hu-MIP-2s=><, hu-MIP-2 {3.ou hu-MGSA {fig.5), as mMIP-2 e hu-IL-8 não parecem ser homólogos raurínico/humano. A redundância de função entre citoquinas, não é invulgar; as catequina/TNF-a e interleucina 1 têm um po* fil de actividade que se sobrepõem (Manogue et al, 1988, em Cellular and Molecular Aspects of Inf lamraation*', Poste et al, eds. Plenurn, Ny- pág. 123 ). MIP—2 e IL—S podem ser outro exemplo desta redundância funcional.
Com base na sua sequência de cAQN, a hu-MIP-2 {3 pode ser classificada como ura membro da família de raultigenes homólogos, que inclui MIP-2 muríniea. Os membros desta família genética possuem actividades biológicas in vitro, incluindo activação de neutrófilos, quiraiotaxis de neutrófilo, actividade mitogénica tipo MGSA, actividade mitogenica de fibroblaato, actividade de cofactor CSF, quiraiotaxis de raonócito, activida» ds angiogênica, e actividade inflamatória* Podem ser seleccionados polipeptídeos hu-KIP-2 que possuam uma ou mais das actividades biológicas exibidas por qualquer membro da família de multigenes. Os polipeptídeos hu-MIP-2 (¾ podem ser utiliza-
dos terapeutleamente para estimular a mielopoise, como adjuvantes na formulação de vacinas, e para a cura de feridas.
A actividade biológica de hu—MIP—2 (3> pode ser medida por ensaios descritos por Volpe et al, (1989) ou Broxaeyer et al, (1989) (cada um aqui incorporado para referência). Outros ensaios para actividade de hu-MIP-2 , tais como activação de neutrõfilos ou quimiotaxis, podem ser medidos in vitro como é descrito em Valtz et al (1989), J» Exp.Med., 170;1745, Clark-Lewis et al (1991) Biochem., 30:3128, e Dernyck et al, (1990X Biochem., 29:10225 (todos aqui incorporados para referência). Dernyck et al também descreve um bioensaio de MGSA. Ensaios para actividade do eofactor CSF são descritos em Broxmeyer et al, 1990, Blood, 76:1110 e Broxmeyer et al, 1989, J. Sxp. Med*, 170:158 (todos aqui incorporados para referência).
0s polipeptídeos hu-MIP-2 Ç3 individuais servem como agonistas ou antagonistas de uma ou mais das actividades de qualquer dos membros da família multigetoêtica acima mencionada. Os ensaios de actividade biológica descritos acima, e os ensaios de ligação de receptor com receptores para membros da família de multigenes MIP-2, são usados para pesquisar polipetídeos hu-MIP-2 Ç3 quanto ãs actividades antagonística·; ou agonística. Os polipeptídeos hu-MIP-2 Çi que exibem actividade antagonístiea completam-se com o membro pretendido da família de multigenes para a ligação a um receptor, mas também inibem a actividade biológica do membro pretendido. Os polipeptídeos hu-MIP—2 Çb com actividade; agonística possuirão actividade biológica favorecida ou actividades comparáveis aos membros pretendidos da família multigenética. Alguns polipeptídeos hu-HEP-2 (3 com actividade agonística actuam como cofactores para aumentar a actividade de outros membros da família multigenética. Outros polipeptídeos hu-MIP-2 exibem 2 ou mais activida-
des, que não se sobrepõem, de membros diferentes da família multigenêtiea. Alguns polipeptídeos hu-MIP-2 Ç2> actuam como a@>nistas para uma actividade e como antagonistas para outra actlvidade, por exemplo quando um polipeptídeo inibe a activaç&> neutrôflla e aumenta a actividade de activação de monócito.
Como agentes terapêuticos os polipeptídeos hu-MIP-2 Ç3 cora actividade agonística são eficazes para as mesmas aplicações terapêuticas que hu-KIP-2 , bem como aplicações terapêuticas de outros membros da família multigenÓtica. 0 polipeptídeo hu-MIP-2 com actividade antagoníStica suprime as condições malignas e impedem as condições inflamatórias e as doenças autoimunes, tais como infiltração patológica de neutrófilos, incluindo psoríase, artrite reuraatoide e doenças pulmunares*
Como exemplo de um conjunto de polipeptídeos hu-MIP-2 ^de interesse citam-se os polipeptídeos que se ligam ao sítio de ligação de reeeptor de IL-8. 0 hu-MIP-2 pode competir eficazmente co» IL-8 pelo reeeptor de IL-8» Os polipeptídeos hu-SIP-2 £3 que são agonistas de IL-8 tem uma estrutura tridimensional semelhante à porção de IL-8 que se liga ao reeeptor. Estudos recentes das estruturas de RMN e raios X para IL-8 são úteis para a determinação do sítio de ligação ao reeeptor (Clore et al., 1989, J. Biol*_Chem*, 264:18207; Clore et al.,
1030, Biochem», 29:1639; Clore et al., 1991, J» Mol. Biol., 217;611, e Baldwin et al., 1991, Proc. Natl.Acad.Sci. OS A, 88: $©2 ).
Uma quantidade de polipeptídeo hu-MIP-2 que é umaquarl·· tidade eficaz* para a simulação de aielopoleae era células mielopoiéticas ê a quantidade que produz um aumento detectável na mielopoiese (ver por exeraplo o ensaio era Sroxmeyer et al
1989). Uma qunatidade eficaz de polipeptídeo hu-SIP-2 relativamente às outras actividades destes pêptidos ê analogamente a quantidade que pxOduz uma resposta detectével no ensaio apropriado como € descrito acima.
Produção de composiçSes contendo hu-MIR-2 (5
As composiçães contendo polipeptídeos hu-MIP-2 ^essencialmente isentos de outras proteínas humanas podem ser preparadas por purificação a partir de fontes naturais, por síntese quimica ou por métodos de ADN recombinante. Um extracto bruto de hu-MI?-2 produzida naturalraente pode ser preparado a partir de qualquer fonte convencional da proteína nativa. Uma fonte preferida é uma linha de células macrofágica humana que foi estimulada com LPS» Um extracto isento de células, contendo hu—MIP-2 φ, como ê determinado por exemplo por imunoensaio como ê descrito adiante, serve como material de partida para uma posterioi' purificação. Ssta purificação pode ser realizada de acordo com técnicas que são bem conhecidas na técnica de purificação de proteínas. Ror exemplo, vários tipos de cromatografia podem ser utilizados. Podem ser utilizadas colunas que ixicluera uma coluna de DSAE-celulose, ou uma coluna permwtadora de aniães, bera como uma coluna de permeaçâo por gel.
Um método de purificação preferido segue aa indicações de Wo^pe et al (1989). 0 processo de purificação pode ser acompanhado por exemplo por ura imunoensaio, como ê descrito abaixo, ou por ensaios de actividade de MIP-2 de acordo com Wolpe et al (1969) ou Sroxmeyer et al (1939), que são aqui incorporados para referência.
hu-MIP-2 (¾ ou fargmentos peptídicos do mesmo também podem ser purificados utilizando técnicas de imunoafinidatíe, 0 uso dos anticorpos da presente invenção para purificar a proteína da invenção permite uma boa separação das proteínas que são mais semelhantes àquela» Como é evidente outras técnicas do purificação são conhecidas na técnica e podem também ser utilizadas para purificar os peptídeos da invenção.
Como alternativa os polipeptídeos nu-.iX?-2 φ da presente invenção podem ser preparados por síntese química. Por exemple, pode ser utilizada a técnica dc Kerrifiel (Jounal of American Chemical Society, vol 25, págs 2149-2154, 1988).
possível purificar hu-MIP-2 φ a partir de uma fonte apropriada de tecido/fluido; todavia é preferível procuz£-la por métodos recombinantes a partir do uma sequência de άΡΠ que codifique a hu-MIP-2 |Ç5, que pode ser sintetizada quimicamente ou isolada por uma de várias tentativas. Λ sequência de ADN a sintetizai’ pode ser previstas com os codães apropriados para a sequência de aminoácidos da »iu-MIP-2 . Sm geral serão seleccionados os codSes preferidos para o hospedeiro previsto se a sequência for utilizada para expressão. Λ sequência completa é construída a partir de oligonucleátidos que se sobrepõem, preparados por métodos Standard e juntas de modo a formarem a sequência codificante completa. Ver por exemplo Sege (1981)Matura 292:756; Kamhair et al, (1984) Science 223:1299; Jay et al (1984) J.Biol. Chea., 259:5311. Os métodos de isolamento assentam em parte na hibridização , dos ácidos nucleieos utilizando amostras de oligonueleétidos apropriados» Estas amostras podem ser construídas sinteticamente, com base nas sequências dc ADN ou de aminoácidos aqui apresentadas, ou isoladas a partir de clones genámicos ou clones de cADíí também aqui descri-
Preparação__ÉS__bibliotecas de ácidos__nucleicos
As estratégias básicas para a preparação de amostras de oligonucleótidos e de bibliotecas de ADN, assim como a sua pesquisa por hibridização de ácidos nucleicos, são bem conheci»» das dos especialistas na técnica. Ver por exemplo DNA Cloni^’ Vol. 1 (D.P.Glover, ed*, 1985); Nueleic Acid Hybridization (B.D. Hames lr S* J. Higgins, eds„, 1985); Oligonucleotide Syntheis (M.J.Gate, ed., 1984); T.Haniatis, et al., Molecular Cloning: a Lrboratory Manual (1982); B.Perbal, A Praticai Guide To Molèeular Cloning (1984), Prepara-se primeiro uma biblioteca de ADN. A biblioteca pode consistir numa blbli» teca de ADN genémico obtida de uma fonte humana. As bibliotecas são conhecidas na técnica. Ver por exemplo Maniatis et al, (1973) Cell, 15:687-701; Lawn et al (1978), Cell, 15:1157-1174. Maia preferivelmente são construídas bibliotecas de ADN a partir de cADN preparado a partir de ARN poli-A (mARN) por transcrição inversa. Ver por exemplo as patentes americanas números 4 448 325; 4 440 859; 4 443 140; 4 431 740: 4 370 417; 4 363 877. 0 mARN é isolado de uma linha de células ou de um tecido que se crê exprimir hu-MIP-2 , tal como uma liçha de células macrofãgica. Uma fonte apropriada de mARN para a construção de bibliotecas de cADN ê a linha de células U937. 0 ADN genõraico ou cADN é clonado num vector apropriado para a construção de uma biblioteca. Um vector preferido é um vector bacteriôfago, tal cpmo qualquer dos fagos lambda. A construção de uma biblioteca apropriada está dentro do âmbito dos especialistas na técnica. Ver por exemplo B.Perbal, obra citada.
Preparação de aaosfagg ce âcido3 nucleicos
Uma vez construída a biblioteca, utilizam-se oligorsucleõt.idO3 para comprovar a biblioteca de modo a identificar o segmento que transporta uma sequência codificante de polipeptídeo hu-MIP-2^ . Sm geral as amostras são sintetizadas quimicamente, de preferência com base em sequências de ácidos nucleicos conhecidas, ou como alternativa em sequências de arainoácidos preditas a partir de clones de cADN.
Como alternativa, na ausência de uma boa fonte de tecido para o mARN, pode tornar-se necessário obter-se sequências a partir de proteína. A sequência N-terminal pode ser obtida por análise de sequência N-terminal. A determinação da 3equêneia interna pode aer realizada por eaemplo por proteôlise de Staph-V-3 da proteína purificada por via habitual, seguida por alquilação reductiva e separação por HPLC dos produtos de digestão. Os picos de eluição correspondentes a fargmentos ensiná— ticos discretos podem depois ser sequenciatíos por métodos convencionais. A partir das sequências de aminoácidos os oligonucleõtidos podem ser previstos e produzidos para utilização como amostras de hibridização para localizar quer sequências de cADH» quer os exóes em ADN genómico. Por fim os exoes isolados são ligados entre si de tal modo que correspondam à sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína madura.
As sequências de nucleõtidos são seleccionadas de modo a corresponder aos codões que codificam a sequência de aminoácidos* Uma vez que o código genético ê redundante, será necessário geralmente sintetizar vários oligonucleótidos para cobrir todas, ou pelo menos um número razoável, das possíveis sequências de nucleõtidos que codificam uma região particular da proteína. Assim, é geralmente preferido, so seleccionar uma regiSo de sequência sobre a qual as amostras se baseiam, que a região não contenha aminoácidos cujos codões estSo altamente degenerados. Pode não ser necessário, todavia, preparar amostras contendo codães cuja utilização ê rara no homem (a partir do qual foi preparada a biblioteca).
Podem ser utilizados anticorpos dirigidos àqueles para ínunoprecipitar qualquer das proteínas desejadas presente num tecido seleccionado, extracto de células, ou fluido corporal.
A MIP-2 purificada obtida desta fonte pode depois ser seQuenciada e utilizada como base para desencolver amostras específicas, tal como foi descrito «cima.
Os especialistas na técnica podem achar desejável preparar amostras que sejam moderadamente mais longas e/ou que abranjam regiSes da sequência de aminoácidee que tenham um maior g«au de redundância nas sequências de ácidos nucleicos correspondentes. As amostras cobrindo o gene completo ou ume parte substancial do gene, também pedem ser apropriadas por causa do grau esperado de homologia. Λ sequência é altamente conservada através de linhas de espécies e assim as amostras contendo a sequência codificante de outras espécie, tal co.mo o rato, podem ser utilizadas imetíiatamente pa«*a pesquizar bibliotecas preparadas a partir de ADN humano. Noutros casos pode ser desejável utilizar dois conjuntos de amostras simultaneamente, cada uma para uma região diferente do gene. Embora o comprimento exacto de cada amostra empregue não seja crítico, as seqifceias de amostras típicas não são maiores que 1000 nucleótidos de comprimento, e mais tipicamente não são maiores do que 500 nucleotidos, e mesmo mais tipicamente não são maiores do que 250 nucleótidos ; podem ser maiores do que 100 nucleótidos, e também podem ser não maiores do 75 nucleótidos de comprimento. Geralmente ê aceite na técnica que amostras com cerca de 14 a cerca de 20 pares base são habitualmente eficazes. Visto que a hu-MIP-2 V pertence a um grupo de proteínas altamente homólogas, as amostras contendo sequências únicas de hu-MIP-2 são preferíveis a fim de discriminar entre as sequências relacionadas. As sequências de amostras mais longas podem ser necessárias para abranger regiões de polinucleótidos únicas com diferenças suficientes para permitir que se distingam sequências alvo relacionadas. Por esta razão são preferíveis amostras tendo de cerca de 10 a cerca de 100 nucleõtldos de comprimento e r.ais preferivelmente de cerca de 20 a cerca tíe 50 nucleótidos.
Utilização de amostras para clones seleccionados
Como já S conhecido na técnica, as amostras de oligonualeó·· J idos são marcadas con um isarcader, tal como um ratíior.ucleótido cu biotina, utilizando processos Standard. 0 conjunto de amostras marcadas é depois utilizado na fase de pesquisa, que cerziste em permitir que a amostra de cadeia simples hibèidirc com ssAD.V isolado da biblioteca» de acordo com técnicas Standard. Poderiam ser apropriadas tonto condições de hibridiração severas como permissivas, consoante diversos factores incluindo, sem se ester limitado a estes, a dimensão de amostre, ce a amostra c a biblioteca provêm da mesma espécie, e se espécies são próximas ou afastadas em termos evolucionais» Está dentro do âmbito da técnica optimizar condições de hibridização de modo que as sequências homólogas sejam isoladas e detectáveis acima de hibridizações residuais. A exigência básica é que as condições de hibridização sejam de suficiente severidade de modo qn&e ocorra-a hibridização selectiva;isto é,
δ hi.bri.d‘.cação δ devida a un grau nínino de homologia de ácidos nueleicos (por exemplo, pelo menos cerca de 75%) ao contrário da ligação não específica ou hibridização devida a um neaor grau de homologia. Ver genericamente, “Uucleic Acid Eybridization·’, obra citada. Devido ao número de sequências estreitamente relacionadas com mKIP-2, são preferíveis tanto uma sequência de amostra única como condições de hibridização severas. Uma vez que um clone da biblioteca pesquisada tenha sido identificado por hibridização positiva, pode ser posl.eriça* mente caracterizado por análise de enzimas de restrição e sequêneíaçSo de ADU para confirmar que o clone particular contém una sequência codificante para a proteína pretendida.
Clones genómicos
Os clones genômicos podem ser prolongados para clones completos por uma de várias técnicas. Um clone pode ser prolonga» •o quer na direcção 5* quer na direcção 3* utilisando técnicas “chxOicosome Walking para assegurar © inclusão de toda a região codificante do gene. Os fragmentos úe restrição testes clones podem então ser comprovados, por exemplo, com cADX que ccíifiea a proteína pretendida. 8e existie horaologia suficiente dentro destes exões poderiam aer identificados outros exões com o mesmo clons de cADN.
Outras regiões codificanter nos clones genórnícos podem sse rapidamente identifiçadas dirigindo a sequênciação do ADN para jusante dc um e«3e. clonado, utilizando as modernas técnicas de sequênciação '113-didesoxi* A sequência ê então ins-
peccionada em todas as 3 estruturas de leitura para revelar uma estrutura de leitura aberta. Outros exoes tornam*se também aparentes, uma vez que ficarão ligados de ambos os lados ror ninais de secção de íntrões e deverão codificar amínoácidos qúe são comuns ãs MIP-2 de diferentes espécies.
Pais concretamente, uma vez que seja conhecida a sequência codifícante genética correcta para pelo menos um exão de ίΠ-Μ.ΓΡ-2 , pode ser utilizada para se obter a região codificante da proteína completa do enzima nor meio de um ou maia '’os 3cruínte3 meios. Primeiranente o fragmento com a sequência • rrtendida pode ser extraído d® um clone e colocado num vector mais conveniente, tal como pBS322, de modo que se possa •ibter grandes quantidades de ADN contendo apenas o próprio fragnento, e usadas como amostras de hibridização.
Como alternativa pode aer sintetizado um oligonucleótldo correspondente a regiões únicas da região codificaçte. Qualquer destes pode ser utilizado como uma amostra de hibridizsqão p?ra uma biblioteca ce ADN pcnómico.
Clones de cADN
Clones genómieos de mamíferos (de comprimento parcial ou total) contendo os insertos mais longos do gene podem ser co-transfectados para células de ovário de hamster chinís (CHO) com ADN do plasmídeo contendo um marcador, tal como genes de resistência a neomieina e metalotionina. As células sobreviventes, seleccionadas na presença de antibiótieâ G418 e de Cd^l
Μ
pode» ser analisadas quanto à presença de transcritos de ARN cue hibridizam na sequência cue codifica a proteína por análise de mancha Northern de ARN extraído. Os clones contendo os •'•arnocrítos desejados podem a então ser usados como una fonte dc mARN para a construção de uma biblioteca de cADH, Como alternativa as manchas northern de mARN obtidas a partir de várias fontes, tais como células do peritoneu c pus, tecido endotelial, leucócitos e linfócítos dc sangue periférico e tiacrofagos» podem ser ensaiados quanto ã hibrtdizaçao â amostra Adicionalmente também podem ser ensaidos mARN proveniente de várias linhas de células, tais como U937 estimulada com ' c NX.SQ. Qualquer tecido ou fonte de células contendo níveis detectãveia de mARN hibridizante é então utilizada para produzir uma biblioteca de cADN que será pesquizada. cpm as mesma amostras a fim de se deáactar um cADN de cadela completa cue codi.fica a proteína pretendida.
‘liagénese dirigida__localizada
Como se referiu anteriormente, uma sequência de ABt que codifica HIP-2 pode ser preparada sinteticamente em. vez c'c cer clorada. As sequências de ADN sintéticas permitem a construção conveniente de genes que irão exprimir análogos de hu~NI?~2 , particularmente fflavôlnas”. Como alternativa pode produzir-se ADN cue codifica mwteínas por mutagênese dirigida localizada de genes MIP-2 nativos ou cADNs, e as muteínas podem ser produzidas directamente utilizando a síntese convencional de polipeptídeos.
Λ mutagénese dirigida localizada é realizada de preferência por wetodologia de reação eun cadeia com polímerase utilizando um olègonuncleéiído sintético primário(primer) conpleren*-cr a um ADTT de faço de cadeia simples compreendendo a seruência a ser sujeita a mutagénese, excepto numa não-corresondÔncís limitada que representa a mutação pretendida, Surtariamente, o olígonuncleétido sintético ê utilizado como prinor para dirigir a síntese de una cadeia eonpleaentaamente ao foço, e o ADN de cadeia dupla resultante ê traasfowmado numa bactéria hospedeira que suporta uma fago. As culturas da bactéria transformada 33o aplicadas em to£ arar, permitindo a formação de placa a partir de células 3implea que criam o faço. Teoricamente 50% das novas placas contêm o fago que tem, como cadeia simples., a forna mutada; 50% Lerão a sequeçcie original. As placas resultantes são hibrtdizadas com o pri.mer sintético transformado con cinase, a una temperatura que nernite a hibridização do uma correspondência exacta, mas em que le não-correspondência3 com a cadeia original são suficientes mra impedir a hibridização. As placas que hibridizam con a rnostra são então recolhidas, cultivadas e ^ecupera-sc Ao ΛΠΜ
Clonagem acra expressão
Uma vez preparada ou isolada uma sequência codificante sara hu-MIP-2 (2> , ela poda ser clonada em qualquer vector apro pelado ou replicão e mantida de3te modo numa composição que ontá esseneialmente iqenta de vectores que não contêm uma sequência codificante do MIP—2 (por exemplo, Isenta de outros clones da biblioteca ). São conhecidos numerosos veetores de
elonagem pelos especialistas na técnica, e a seleção de um vector de elonagem apropriado é uma questão de escolha. Os «amplos de vectores de ADN recombinante para a elonagem e de células hospedeiras que eles podem transformar, incluem os vários vectores lambda bacteriófagos(E. coli), pBR322 (E. coli] pACYC177 (S. coli), pKT230 (bactérias gram-negativas), pGVllOÊ (bactérias gram-negativas), pLAFRl (bactérias gram-negativas), pHV14 (E. coli e Bacillua subtilis), pBD9 (Baclllus), pIJÓl (Streptomyces), pUC6 (Streptomycea), actinofage, dC31(Streptom^ces), YIpS (Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces) e virus papiloma de bovino (células de mamífero). Ver na generalidade DNA Cloning, vol I e II, supra; T. Maniatis et al supra; B. Perbal, supra.
As sequências de ADN e as moléculas de ADN da presente invenção pode ser expressas utilizando uma vasta variedade de combinações hospedeiro/vector. Por exemplo os cvectores úteis podem compreender segmentos de sequências de ADN cromosomal» não cromosomal (tais como vários derivados conhecidos e plasmídeos de bactérias conhecidos, por exemplo plasmídeos de E. coli, incluindo colEl, pcRl pR322, pMB9 e RP4) ou sintéticas ADN fágico (M13) incluindo derivados de fagos (por exemplo NM989) e fagos de ADN de cadeia simples filamentosos, vectores úteis em leveduras (tal como plasmídeo de 2 microna) vectores úteis em células eucarióticas (tais como vectores úteis em células animais, por eaemplo os que «contêm sequências de ADN derivados de adenovirus SV40 e retrovirus) e vectores derivados de combinações de plasmídeos e ADN fágico (tais como piasmídeos que foram modificados para empregar ADN fágico) ou outros derivados dos mesmos.
De acordo com a presente invenção a sequência codificante para o polipeptídeo hu-MIP-2 é colocada sob o controle de
um promotor, de um sítio de ligação de ribosoma (para expressão bacteriana) e eventualmente um operador (designados colectivamente aqui como elementos de controle) de modo que a sequência de ADN que codifica o polipeptídeo hu-MIP-2 seja transcrita para o ASN na célula hospedeira transformada por um vector que contêm este constuido ds expressão. A sequência codificante pode conter ou não um peptídeo sinal ou uma seqxhcia leader. Se a sequência codificante contiver um peptídeo sinal, pode ser ou não a sequência sinal associada naturalmente com hu-MIP—2 . Em bactérias por exemplo, a hu-MIP—2 ^3 madura é construída de preferência pela expressão de uma sequência codificaçte que não contêm o peptídeo sinal de mamífero mas, pelo contrário, por expressão de uma sequência codificante que contém uma sequência leader que é removida pelo hospedeiro bacteriano no processamento prõs-translaccional. Ver por exemplo, Patentes Americanas n®s. 4 431 739j 4 425 437j 4 338 397.
vector de expressão contém já, preferivelmente, pelo menos uma sequência de controle de expressão que pode estar ligada operativamehte & sequência de codificação de ADN quando é inserido no vector a fim de controlar e regular a empressão de sequência de ADN clonado» Os exemplos de sequências de controle de expressão úteis são o sistema lac, o sistema trp, o sistema tac, o sistema trc, regiêes de operador e promotor maioritários de fago lambda, a região de controle de proteína fd coat, os promotores glicolíticos de leveduras (por exemplo, o promotor para 3-fo^fogllcerato-cinase) os promotores de fosfatase ácida de leveduras (por exemplo Pho5) os promotores de factores de união de leveduras, e promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus, ou virus de símios (por exemplo, os promotores inicial e final de SV40) e outras sequências conhecidas para controlar a expressão de genes de células
prooarióticas ou eucarióticas e os seus virus ou as suas combinações.
Um vector de expressão 6 construído de acordo com a presente invenção de modo que a sequência codificante de hu-MIP— -2 (ã> fique localizada no vector com aa sequências reguladores apropriadas de tal «odo qu«. a sequência codificante seja transcrita sob o ” controle” das sequências de controle {isto é, a ARN-polimerase que se liga às moléculas de AON nas sequências de controle transcreve a sequência codificante). As sequências de controle podem ser ligadas à sequêcntia codificante antes da inserção num vector, tal como o vector de clonagem descrito acima. Como alternativa, a sequência codificante pode ser clonada directamente num vector de expressão que já contenha a sequência de controle e um sitio de restrição apropriado. Para expressão da proteína desejada em proceriotes e leveduras, as sequências de controle serão necessariamente heterólogas relativamente à sequência codificante» Se a célula hospedeira fôr um procariote, é também necessário que a sequência codificante esteja isenta de intrões (por exemplo, cADN). Se a célula hospedeira selecionada fõr uma célula de mamífero, as sequências de controle podem aer heterólogas ou homólogas relativamente â sequência codificante de hu-MIP-2fà, e a sequência codificante pode o.u ser ADN genómico (contendo intrões) ou cADN. Quer as sequências codificantes_genómica§;; quer as sequências codificantes de cADN, podem ser expressas em leveduras.
Além disso, dentro de cada vector de expressão específico» podem ser selecionados vários sítios para inserção das sequências de ADN da presente invehção. Estes sítios são habitualmente designados pela endonuclease de restrição que os corta. São bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Note-se
evidentemente que ura vector de expressão útil na presente invenção não necessita ter um sítio de restrição de endonuclesse para inserção no fragmento de ADN escolhido. Em vez disso o vector pode ser junto ao fragmento por meios de alternativa. 0 vector de expressão e en particular o sítio escolhido no mesmo para inserção de ura fragmento de ADN selecionado e a sua ligação operativa no mesmo a uma sequência de controle de expressão, é determinada por uma variedade de factores, por exemplo o número de sítios súsceptíveis a um enzima de restrição particular, o tamanho da proteína e características de expressão, tais como a localização dos codões de partida e interrupção relativa ao vector. Um sítio de inserção para uma sequência de ADN £ determinado por um equilíbrio destes factores, não sendo todas as seleôções igualmente eficazes para dado caso.
São conhecidos na técnica um certo número de vectores de expressão procarióticos. Ver por exemplo as patentes americanas n*s. 4 440 859; 4 436 815; 4 431 740; 4 431 739;
428 941; 4 425 437; 4 418 149; 4 411 994; 4 366 246;
342 832; ver também U.K. Pub. Nos. GB 2 121 054; GB 2 008 123; GB 2 007 675; · European Pub. No» 103 395. Os sistemas de expressão procariétic·» preferidos estão em S. coli. outros vectores de expressão preferidos são os que são usados em sistemas eucarióticos. Um sistema de expressão eucariótíco preferido é o que emprega virus de vacinas, que é bem conhecido na técnica. Ver por exemplo Mackett et al (1984) J. Virol. 49:857; DNA Oloning, vol. II, pSgs. 191-211, supra; PCT Pub. n® V0 86/07593, Os vectores de expressão de levedura são conhecidos na técnica. Ver por texenapl® Patente» Americanas n®s«
446 235; 4 443 539; 4 430 428; ver também European Pub.n®s,
103 409; 100 561; 96 491, Outro sistema de expressão é o vector pHSl, que transforma as células de ovãrio de hamster chinês. 0 uso do vector é descrito na PCT Pub. n* ¥0 87/02062.
Os hospedeiros de expressão úteis podem incluir hospedeiros eucariótico» bem conhecidos e procarióticos, tais como as estirpes de E. coli, tais como E, coli SG-936, E. coli HB 101, g. coli »3110, E. coli X2232, g. coll DHI, e fi, coll SíRCl, Pseudomonas, Bacillus, tais como Bacillus subtilis.Streptomycea , leveduras e outros fungos, células animais tais como células COS e células CHO, e células humanas e células de plantas era culturas de tecidos.
Corao é evidente, nem todas as combinações hospedeiro/vector de expressão funcionara com igual eficiência na expressão de sequências de ADN da presente invenção ou na produção dos polipeptídeos da invenção. Todavia, pode ser feita pelos especialistas na técnica uma selecção particular para uma combinação hospedeiro/vecton de expressão. Por exemplo, a selecção poderá ser baseada num equilíbrio de ura certo número de factores. Estes incluem a compatibilidade do hospedeiro e vector, a toxicidade das proteínas codificadas pela sequência de ADN no hospedeiro, a facilidade de recuperação proteína desejada, as características de expressão das sequências de ADN e das sequências de controle de expressão operativamente ligadas àquelas , seguraçça biológica, custos e outros factores, ou qualquer outras modificações pôs-expressão necessárias da proteína pretendida. Preferívelmente a célula hospedeira não deverá exprimir proteases que degradem a hu-MIF-2(2>.
Clonagea nua sistema de expressãodelevedura
Um sistema de expressão preferido é a levedura. A hu-MIP-2 (3 pode ser expressa por uma célula de levedura transformada com um vector de expressão contendo a sequência codificante f/W' J V $ de ADN para hu-MIP-2 sob controle de um promotor de levedura. Sstes vectores de expressão podem ser construídos do seguinte modo..
Um promotor de levedura ê qualquer sequência de ADN capaz de ligar ARN-polimerase de levedura e iniciar a transcrição para jusante {3*) de uma sequência codificante (por exemplo gene estrutural) no mARN. Um promotor tem uma região de iniciação de transcrição que estâ geralmente colocada próximo da extremidade 5* da sequência codificante. Ssta região de iniciação de transcrição inclui tipicamente um sítio de ligação de ARN-polimerase (a caixa TATA”) e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor de levedura pode também ter um segundo domínio chamado sequência de activador para montante (UAS) que, se estimer presente, está geralmente afastado do gene estrutural. 0 UAS permite a expressão regulada (induzível). A expressão constituitiva ocorre na ausência de um UAS. A ex-»pressãc regulada- pode ser positiva quer negativa, e deste modo ou favorecendo ou reduzindo a transcrição*
A levedura ê um organismo de fermentação com um percurs» metabolicamente activo, e por conseguinte as sequências que codificam enzimas no percurso metabólico proporcionam sequências promotoras particularmente õtcis, Os exemplos incluem deehidrogenase de álcool (ADH) (E.P.O Pub, n® 284 044) enolase, glucocinase, glucose-Ó-fosfato-isomerase, gliceraldeído-3-fosfato-deshidrogenase (SAP ou SAPDH), hexoxinase, fosfmfructocinase, 3-fosfogliceratoautaae, e piruvato-cinase (Pyk) (Ei Pi 0: Pub, n®329 203). 0 gene de levedura PH05 que codifica fosfatase ácida, também proporciona sequências de promotor úteis Qliyanohara et al, (1983) proc, natl. Acad*. Sei. USA, 80:lJ .
Adicionalmente, promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores de levedura» Por exemplo, sequências UAS de um promotor de levedura podem aer juntas com a região de activação de transcrição de outro promotor de levedura, criamdo um promotor híbrido sintético. Os exemplos destes promotores híbridos incluem a sequência reguladora ADN ligada â região de activação de transcrição GAP (patentes americanas n« 4 876 197; 4 880 734), Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que consistem nas sequências reguladoras de qualquer dos genes ADH2, GAL4(. ,GAL1Q, ou PH05, combinadas com a região de activação de transcrição de um gene de enzima glicolítico, tal como GAP pu Pyk (lí.P.O. Pub, n4 164 556). Além disso um promotor de levedura pode incluir promotores de ocorrência natural, cuja origem não é uma levedura, que tem a capacidade de ligar ARN-polimerase de levedura e iniciar a transcrição, Ver por exemplo Cohen, et al.
(1380) Proc. Natl. Acad. Scí» USA, 1073; Henikoff, et al., (1981) Nature, 283:835; Kollenberg, et al., (1981) Curr. Toplcs Mlcrobiol, Immunol., 96:119; fíollenberg, et al., The Expressicr of Sacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccha— romyces cerevisiae, in: Plasnids of Medicai Environmental snã Commercial laportance (eds., &.N. Timmis e A. Puhler); Mercereau-Puigalon, et al. (1930) Gaae 11:163; Panthier, et ai. (1983 Curr» ftenet., 2:10S.
Uma molécula de ADN pode ser expressa intracelulermente. Uma sequêania de promotor pode ser ligada directamente com a molécula de ADN, em cujo caso o primeiro aminoácido na extremidade azoto da proteína recombinante será sempre uma metlonina, que ô codificada pelo codão de iniciação ATG, Se desejado a metionina na extremidade azofco pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.
Z.s proteínas tíe fusão proporcionam uma alternativa para dirigir a expressão. Tipicamente uma sequência de ADI» que codifica a parte N-terminal de uma proteína de levedura endógena, ou outra proteína estável, é fundida à extremidade 5’ de sequências coúifieantes heteróiogas. Ror expressão este construído proporciona uma fusão das 2 sequências de aminoácidos. Por exêippio, o gene superóxido-tíismutase (SOD) de levedura ou humano pode ser ligado na exteemidade 5* de um gene estranho o ser expresso na levedura. A sequência de ADN na junção das 2 sequências de aminoácidos pode codificar ou não um sítio sus· ceptível de clivagem. Ver por exemplo E.P.O. ?ub. n2 133 056. Outro exemplo é uma proteína de fusão ubiquitina. Esta proteína de fusão ê construída com a região leader ou pro~” de ubiquitina que preferivelmente retém um sítio para ua enzima de processamento (por exemplo protease de processamento específica de ubiquitina) para clivar a ubiquitina da proteína estranha. Através deste método, por conseguinte, pode ser isolada a proteína estranha nativa (?„Ç,T, W0 83/024066; pedido de patente americana de propriedade comum, n2 de série 390 599, depositada em 7 de Agost.· de 1389, ou patentes estrangeiras ou pedidos de patente que reivindicam a prioridade daquela (tal como são enumerados no World Patents índex produzido por Derwent Publications; Ltd) cujo conteúdo é aqui incorporado para referência.
Lm alternativa as proteínas estranhas também podem ser segregadas a partir da célula para o meio de crescimento-, criando moléculas de ADN quiméricas que codificam uma proteína, de fusão constituída por um fragmento de sequência leader que pro· porciona a secreção em levedura e no gene estranho. Preferivelmente existem sítios de processamento (in vivo ou in vitrej codificados entse o fragmento leader e o gene estranho* 0 frqg· mento de sequência leader codifica tipicamente um peptídeo si-
nal constituído por aminoácidos hidrófobos que dirige» a secreção da proteína pela célula*
ADN que codifica sequências sinal apropriadas pode ser derivado de genes para proteínas de levedura segregados, tais como o gene de invertase de levedura (Ε. P. 0. Pub* n2 12 873; J. P, 0» Pub* n2 62 096 086) e o gene de factor A (Patente Americana n2 4 588 684). Como alternativa existem também leaders de origem que não ê levedura, tais como um leader de interferona, que também proporcionam a secreção em levedura(E,
P. 0. Pub. n® 60 057).
Uraa classe preferida de leaders de secreção são os que empregam um fragmento do gene do factor de levedura, que contém tanto uma sequência de sinal “pré”, como uma região ”pro”. Os tipos de fragmentos de factor «=< que se empregar in·· cluem o leader de factor <=<pré-pro de comprimento total (cerca de 83 resíduos de aminoácido ) bem como leaders de factor;
truncados ( tipicamente cerca de 25 a cerca de 50 resíduos de aminoácido ) (Patentes Ameriísanas n^s. 4 546 083 e 4 870 008; E.P.O. Pub. n2 324 274). Leaders adicionais que empregam um fragmento leader de factor «=»< que proporciona a secreção incluem leaders de factor «=<-híbridos construídos com uma pré-sequência de uma primeira levedura, mas com uma regias pro-obtida de um segundo factor °<άο levedura (ver por exemplo P.C.T. WO 89/02463).
Tipicamente, as sequências de terminação de transcrição reconhecidas pela levedura são regiões reguladoras localizadas em posição 3* relativamente ao codão de interrupção de translação, e deste modo, era conjunto com o promotor, flanqueiam a sequência codificaçte. Estas sequências dirigem a transcrição de mARN que pode ser transladado para o polipeptídeo codifi48
cado pelo ÂDN* Os exemplos de sequências de terminador de trascriçao incluem a sequência de terminação de transcrição do factor c?4 de tipo ” selvagem” e outras sequências de terminação reconhecidas pela levedura, tais como as dos enzimas glicolíticos►
Tipicamente os componentes descritos acima, compreendendo um promotor, um leader (se desejado), a sequência codificante de interesse e a sequência de terminação de transcrição, sao reunidos no coastruido da expressão. Os construídos de expressão são frequentemente mantidos num replicão/ tal como um elemento extracromossómico (por exemplo, plasmídeo) capaz de manutenção estável num hospedeiro, tal como uma levedura ou bactéria, 0 replicão pode ter dois sistemas de replicação, permitindo deste modo que seja mantido, por exemplo, na levedura para expressão e num hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação* Os exemplos destes vectores mensageiros levedura-bactéria incluem YSp24 t>o tstein, et al., (1S7S) Gene 8: 17-24^ , pCl/l [Brake, et al,, (1984), Proc» Hatl, Acad. Sei. USA, 81:4642-4S446J , e YSpl7 [$tinchcomb» et al., (1982),
Mol. Biol., 158: IS?]. Adicíonalmente, um replicão pode ser ua plasmídeo tanto com elevado número de cópias como com baixo número, Um plasmídeo com elevado número de cópias gèralmente tem um número de cópias que oscila entre cerca de 5 a cerca de 200, e tipicamente de cerca de 10 a cerca de i.50. Um hospedeiro contendo um plasmídeo com elevado número de cópias terá preferivelmente pelo menos cerca de 10 e mais preferivelmente pelo menos cerca de 20« Poâe ser selecionado um vector quer com elevado número de cópias quer com baixo número, consoante o efeito do vector e a proteína estranha no hospedeiro, ver por exemplo Brake et al, supra.
Como alternativa os construídos de expressão podara ser integrados no genoma de levedura com um vector integrante. Os vectores integrantes contêm tipicamente pelo menos uma sequmcia homóloga a um cromossema da levedura que permite integrar o vector, e contêm preferivelmente duas sequências homólogas flanqueando o construído de expressão. As integrações parecera Resultar de recombinações entre ADN homólogas no vectoi' e no cromossoma da levedura (Orr-Weaver et al, 1983} Methods in Snsymol 101:228-245). Um vector integrante pode ser dirigido a um sítio específico na levedura por selecção da sequência homóloga apropriada para inclusão no vector. Ver Orr-Weaver et al, supra,. Um ou roais constuuidos de expressão podero integrar, afectando possivelmente os níveis de proteína recombinante produzida Csine et al (1983), Proc, Natl. Acad» Sei, USA, 80: ó7S0j . As sequências croroossómicas incluídas no vector podem ocorrer quer como um segmento simples no vector, que resulta na integração de todo o vector, ou dois segmentos homólogos a segmentos adjacentes no cromossoma e flanquea»do o construído de expressão no vector, que pode resultar na integração estável apenas do construído de expressão.
Tipicamente os construídos de expressão extracromossómico e integrante podem conter maraedores seleccionáveis para permitir a selecção de estirpes de levedura que tenham sido transformadas. Os marcadores seleccionáveis podem incluir genes biossintêticos, tais como ASS2, HIS4, TRP1, e URAS. Os marcadores seleccionáveis podem também incluir genes resistentes aos fármacos, tais como ALG7 e o gene de resistência G41S, o que confere resistência em células de levedura a tunicamina e G41S, respectivamente. Adicionalmente, um marcador soleccíonãvel apropriado pode também proporcionar à levedura a capacidade de crescer na presença de compostos tóxicos, tais como metais. Por exemplo, a presença de CUP1 permite à levedura
δ Ο crescer na presença de iões cobre |2.Βπ^ al» (1987) Microbiol. Rev», 51:351^ ·
Foram desenvolvidos vectores de expressão, quer raplicões extracromossómicos ou vectores integrantes, para a transformação em muitas leveduras, por exemplo, foram desenvolvidos vectores de e&pressão para, entre outras, as- seguintes leveduras: Candída ; albícans £Κΐ1ΓΪΖ* et sl,, (1986), Mol, Cell» Biol», iô:142j|, Candída maltosa J^Kunze, et al., (1985), J. Basic Microbiol,, 25:14Í3 , Hansenula polymorpha QGleeson, et al., (1983), J.Gen. Microbiol., 132:3459; Roggenkamp, et al.JlSSÕ) Mol» gen. Genet., 202:3023 » Kluyveromyces fragilis {Das, et al., (1984), J. Bacteriol., 158:11653 , Kluyveromyces lactis ]j3e Louvencourt et al., (1933), J. Bacteriol., 154:737; Van den Berg, et al*, (1990) Bio/Technology, 8:1353 , Pichia guillerlmondii Tjíunze et al., (1985), J» Basic Microbiol., 25:14¾ Pichia pastoris tCregg, et al., (1985), Mol» Cell Biol., 5:3376 ; Patentes U»'S* Nos» 4 837 148 e 4 929 5553, Saccharomyces_cerevislae Qíinnen et al., (1978), Proc. Natl* Acad. Sei»
75:1929; Ito, et al», (1983) J. Bacteriol., 153:1633 , Schigosaceharoisyces pombe pBeach e Nuese (1981), Nature, 300:706*], e Yarrowia llpolytica f^Davidox?, et al., (1985), Çurr, Genet., 10:39-48; Gaillardin, et al. (1985), Curr. Genet», 10:493»
Os métodos de introdução de ADN exógeno na levedura hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem tipicamente quer a transformação de esferoplastos ou de células de leveduras intactas tratadas com catiões alcalinos. Os processos de transformação habitualmente variam com a espécie de levedura a ser transformada. Ver por exemplo Kurtz, et al, (1986), Mol. Cell» Biol», 6:142, Kunze, et al. (1985), J» Basic. Mcroblol., 25:141, para Candída; Gleeson, et al», (1988), J. Gen. Microbiol. , 132:3459·, Roggenkamp, et al. (1986), Mol. Gen:·genet.,
202:302, para Hensenala; Das, et al., (1984), J. Bacteriol., 153:1135, De Louvencourt et al., (1983), J. Bacteriol., 154: 1165, Van den Berg, et al., (1990), Bio/Technology, 8:135,para Kluyverofnyces; Cregg, et al», (1985), Mol. Cell Biol» 5:3376, Kunze, et al* (1985), J. Basic. Micgbbíol, 25:141, Patentes U.S. Nos. 4 837 148 e 4 929 555, para Pichla; Hinnen, et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:1929, Ito, et al. (1933} J» Bacteriol., 153:163, para Saccharomyces; Davidow, et al», (1985) Curr. Genet», 10:39, Gaillardin, et al. (1985), Curr» Genet», 10:49, para Yarrowia»
Expressão da proteína
Consoante o sistema de expressão e o hospedeiro seleccionado, a proteína é produzida fazendo crescer células hospedeiras transformadas por um vector de expressão contendo a sequência codificante para hu-MIP-2 (3 , em condições nas quais a proteína é expressa. A proteína é depois isolada das células hospedeiras e purificada. A selecção das condições de crescimento apropriada» e dos métodos de recuperação estão dentro do âmbito dos especialistas.
Um meio preferido para obter as preparações da presente invenção é a cultura de células transformadas com um vector de expressão compreendendo o ADN isento de intrões correspondentes a hu-MIP-2 (5 , utilizando condições de cultura apropria?· das. As células são depois recolhidas e a fraeção de células pode ser separada por processos de separação convencionais, tais como centrifugação. Se o sistema de expressão segregar o polipeptídeo para o meio de crescimento, o polipeptídeo pode ser purificado directamente a partir do meio isento de células. Se a proteína não segrega, é isolada a partir de lisados das células. Uma vez obtido um extracto bruto contendo a hu-MIP-2^ a purificação pode ser realizada como se descreveu anteriormente, utilizando técnicas convencionais.
Em geral a produção recombinante do polipeptídeo hu-MIP.2 pode ... composições desta citoquina essencialJ mente isentas de outras proteínas humanas. A capacidade de se obterem níveis elevados de pureza é um resultado da utilização de sistemas de expressão recombinante que pode também produzii’ polipeptídeos hu-MIP-2 ^3 em quantidade substância! face ãs fontes in vivo. Assim, aplicando técnicas convencionais para culturas recombinantes, podem ser produzidas mais rapidamente composições do polipeptídeo hu-MIP-2 . Os especialistas na técnica podem seleccionar entre as técnicas descritas acima para preparar - ospeptídeos essencialmente puros da presente invenção.
Aglomerados de análogos de hu-MIP-2^>
As composições contendo aglomerados de análogos de hu-MIP-2 essencialmente isentos de curtas proteínas humanas também podem ser preparadas, de preferencia, por métodos de ADií recombinante ou síntese química. Estes aglomerados podem ser pesquizados utilizando um ensaio de ligação a receptor ou qual*· quer dos ensaios de actividade biológica descritos anteriormente para os análogos de hu-MIP-2(5 com às actividades dese53 jadas*
Por exemplo» Parmley e Smith, 1988, Sene» 73i305 (aqui incorporada para referência) descrevem u» protocolo para a produção e pesquisa de aglomerados de proteínas utilizando os métodos de ΑΒΪ1 recombinante. Este protocolo, com um receptor para um membro da família multigenética ÍSIP-2, pode ser utilizado para pesquizar aglomerados de muteínas de hu-SEIP-2 , peptídeos hu-IíXP-2 (3> tráaeados, ou proteínas de fusão nu-ϊ-ίΧΡ-2 . Primeiramente podem ser produzidos aglomerados de frqgmentos de ADH que codificam diferentes análogos de hu-MlP—2(3» Em seguida o aglomerado de fragmentos de ADH pode ser inseride no genoma do fago filamento descrito em Parmley e Smith. A biblioteca de fagos produzirá colónias cujos produtos de expressão podem ser pesquisados. 0 ADH das colónias desejadas pode ser isolado e utilizado para identificar o análogo ou análogos de ãu-MIP-2 desejados.
Os aglomerados de análogos de hu-&’IP—2^ também podem ser sintetizados* Por conveniência, num ensaio de ligação a receptor, aos análogos de hu-HIP—2 (3> podem ser sintetizados sobre pinos de polietileno dispostos numa série de 96 pinos sobre um bloco (adaptado às distâncias de uma placa de microtítulo de 96 cavidades convencionais,). Ver poi‘ exemplo Geyesen, Patente Americana n2 4 708 871 (aqui incorporada para referência completa) que descreve este processo de sintetização de polipeptídeos aplicado à proteína VP1 de virus de doenças dos pés e boca. Outros métodae para a produção de bibliotecas de polipeptídeos e a selecção de polipeptídeos com propriedadess específicas são descritos na Patente Americana iW 5 010 175 (aqui incorporada para referência total) e no Pedido de Patente Americana n2 07/652 194 depositado em 8 de fevereiro de
1991 (aqui incorporado para referência) ou em patentes e pedi54
dos de patente estrangeiros reivindicando a sua prioridade (tal como estão enumeradas no World Patents Index produzido por Derwent Publishing Ltd).
Os aglomerados de polipeptídeos não relacionados cora hu-MIP-2 podem ser produzidos utilizando os métodos do ADN recombinante e de síntese química anteriores, e ser pesquizados quanto à sua capacidade de ligação a receptores para membros da família genética HIP-2. Seguidaraente os polipeptídeos que se ligara aos receptores podem ser então ensaiados em ensaios de actividade biolégiea descritos acima para determinar as suas actividades agonístíca. ou antagonística. Bstes põli— peptídeos são eficazes pata as mesmas aplicações >êrs©êutlcas que os polipeptídeos hu-MIP-2 «=>< . Outro método de pesquisa de grupos de peptídeos esté descrito em Cwirie et al, 1990, Proc» Natl. Acad. Sei* USA, 87:6378 (aqui incorporado para referência )«
Para facilidades de administração farmacêutica, podem ser preferidas pequenas moléculas orgânicas em vez destes agonistas e antagonistas polipeptídicos, a partir das estruturas dos polipeptídeos podem obter-se moléculas orgânicas menores que copiara a forma e actividades destes polipeptídeos. Os métodos para determinação das estruturas destes , agonistas e antagonistas hu-HIP-2'(2> são conhecidos na técnica e incluem Cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional.
Produção de anticorpos polipeptídeo hu-MIP-2(3 nativo» recombinante ou sintético ( comprimento total de fragmentos contendo ura ou mais epítopos) pode ser utilizado para produsix·* anticorpos quer policlonais quer monoelonais. Se se pretenderem anticorpos policlonais o polipeptídeo hu-,ííIP-2^> é utilizado para imunizar ura maraífero seleccionado (por exemplo rato, coelho» cabra» cavalo, etc) e o soro do animal imunizado ê mais tarde recolhido e tratado de acordo com processos conhecidos. 0 polipeptídeo hu-MIP-2(3 da presente invenção pode ser utilizado para estimular a produção de anticorpos num mamífero por imunização do mamífero com a preparação. Esta imunização pode eventualmente empregar o acoplamento do polipeptídeo a uma substância ímonogênica maior tal oorao Eeyhole limpet hemocyanxn”.
A imunização de mamíferos* tais como coelhos, ratos» cabras, etc, para produzir anticorpos ê bem conhecida na técnica.
As preparações de anticorpos policlonais podem ser parcialmente purificadas utilizando técnicas de imunoafinidade que empregam um polipeptídeo sintético ou recombinante da presente invenção. Estes métodos de purificação são bera conhecidos na técnica. Em particular, composições contendo anticorpos policlonais para uma variedade de antigenes, adicionalraente à proteína pretendida, podem-se tornar essencialmente isentos de anticorpos que sejam dirigidos aos outros antigenes por cromatografia de imunoafinidade. A preparação essencialmente pura do polipeptídeo da presente invenção pode ser utilizada para purificar por afinidade anticorpos reactivos com o polipeptídeo hu-MIP-2^3> . Para a purificação por afinidade de anticorpos, o polipeptídeo pode ser acoplado a uma matriz inerte, tal como esfêrulas de agarose. As técnicas para este acoplamento são bem conhecidas na técnica.
Uma preparação do polipeptídeo também pode ser utilizada para se detectar ou quantificar anticorpos específiaos para hu-MIP-2 numa preparação de anticorpos ou qualquer outra amostra biológica. Neste caso o peptídeo sintético será geralmente acoplado a uma substância maior, tal como albumina de soro de bovino ou um suporte sólido. Mais uma vez, as técnicas para o acoplamento de polipeptídeos a estas matrizes são bem conhecidas na técnica.
Anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais reactivos com hu-MIP-2 Ç3 são também produzidos rapidamente pelos especialistas na técnica seguindo a descrição apresentada. A metodologia geral para a produção de anticorpos monoclonais por meio de hibrídomas é já bem conhecida. Podem desenvolver—se anticorpos monoclonais que sejam reactivos com epítopos únicos de hu-MIP-2 Ç3. Genericamente um rato é imunizado com polipeptídeo da presente invenção e o roedor é mais tarde sacrificada e as células doteço são recuperadas para fusão com células de mieloma. As células híbridas podem ser seleccionadas de acordo com técnicas conhecidas, A produção de anticorpos para cada célula híbrida pode ser pesquizada individualmente para se seleccionarem anticorpos que se liguem a epítopos sobre hu-MIP-2^ .
A fim de se pesquizarem anticorpos que sejam imunoreactieôs com epítopos únicos a polipeptídeos hu-MIP-2 , pode realizar-se uma baierià simples de ensaios, Os anticorpos podem ser ensaiados quanto à imunoreactividade com o polipeptí57 deo hu-MIP-2 Ç3 utilizando uma preparação essencialmente pura do polipeptídeo hu-MIP-2 (2> da presente invenção. Os anticorpos específicos pretendidos deverão ter reacção positiva neste ensaio. 0 anticorpo pode depois ser ensaiado quanto 1 imu*? noreactividade com outros membros da família multigenétíca MIP-2. Genericamente, os anticorpos que apresentam reacção negativa neste ensaio reagem com epítopos únicos de hu-MIP-2
Também podem ser criadas linhas de células imortais produtoras de anticorpo por técnicas diferentes da de fusão, tais como a transformação directa de linfécitos B com ADN oncogénico, ou a transfecção com o virus de Epstein-Barr. Ver por exemplo M. Schreier, et al., Hibridoma Techniques” (1980);Jíammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas” (1981); Kennett, et al., Monoclonal Antibodies” (1980); ver também Patente Americana Nos. 4 341 761; 4 399 121; 4 427 783; 4 444 887; 4 451 570; 4 466 917; 4 472 500; 4 491 632; 4 493090,
0s painéis de anticorpos monoclonais produzidas contra hu-MIP-2 podem ser pesquizados quanto a várias propriedades; isto á, isétipos, etpítopos, afinidade, etc. Têm particular interesse anticorpos monoclonais que neutralizam a actividade dos peptídeo· MIP-2 ou hu-MIP-2 . Estes anticorpos monoclonais podem ser prontamente identificados utilizando ensaios de actiWidade de MIP-2, tais como os que são divulgados em Wolpe et al., (1989) e Broxmeyer et al (1989) que são aqui incorporados para referência. Os anticorpos de alta afinidade também são úteis na purificação por imunoafinidade de hu-MIP-2 (S nativo ou recombinante.
Os tipos de anticorpos contemplados pela presente invenção incluem anticorpos de vertebrados, particuiarmente de mamíferos (policlonais e monoclonais) anticorpos híbridos, anti58
corpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos alterados, anticorpos univalentes, anticorpos de domínio simples, hem como fragmentos de anticorpos funcionais, tais como proteínas Fab, desde que se ligeara selectivaaente a um epltopo. Para uma revisão geral veja-se Winter St Milstein, 1991, Wature, 349:293; Rieehmann et al. 1938, Nature, 332:323; Ward et al., 1989, Mature 341:544; Patente Americana 8o. 4 816 467; e Glennie et al. 1982, Nature 295:712.
Os epítopos são determinantes antigénicos de um polipeptídeo» Um epítopo pode compreender 3 ou mais aminoácidos numa conformação espacial única do epítopo. Geralmente um epítopo consiste e» pelo menos 5 destes aminoácidos e mais geralmente ainda consiste em pelo menos oito a dez destes aminoácidos. Os métodos para determinação da conformação espacial dos ami— noácidos são conhecidos na técnica e incluem por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bldiaensional.
Ensaios de diagnóstico para hu-MIP
A detecção de hu-MIP-2 Ç3 pode ser realizada ao nível do nueleótido ou do peptídeo. Podem ser preparados anticorpos imunizando um mamífero, com peptídeos expressos a partir de sequências correspondentes a polipeptídeos hu-MIP-2 (2» , como se indicou acima, e a selecçâo destes anticorpos específicos a hu-MIP-2 Ç2> utilizando técnicas que são bem conhecidas dos especialistas. Os processos particulares pafca ensaios de araosteas genéticas e imunoensaios são bem conhecidos dos especialistas
Métodos de imunoensaio
Os anticorpos são úteis ea aplicações de diagnóstico, os Os anticorpos específicos para hu-MIP-2 (2> podem ser formilades em qualquer formato de imunoensaio convencional; por exemplo, ensaios homógeneos ou heterogéneos, radioimunoensaios ou ELISA. Os vários formatos são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Ver por exemplo “Immunoassay: A Pracfcical Guide” (D, W. Chan and Μ, T. Perlstein eds. 1987) cujo contéudo é aqui incorporado para referência.
Os anticorpos da presente invenção são capazes de se ligar a hu-MIP-2 (ò , e preferivelmente são se ligam a hu-MIP. Estes anticorpos também permitem o uso de análise por formação de imagem com isétpos, anticorpos conjugados, ou outro< .ligantes. Um exemplo de um material para formação de iaa125 gea apropriado é I conjugado com anticorpos específicos para hu-MIP-2.
Oa anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para detectar epítopos de hu-MIP-2 em secções histológicas de tecidos, bem como no soro. Pode-se detectar anticorpos que se ligam a secções de tecidos por qualquer meio de detecçâo conhecido na técnica, po» exemplo radioimunoensaio, ensaio de iaunoaflsorvente ligado por enzima, fixação de complemento,ensaio nefelométrico, iraunodifusão, ensaio imunoelectroforético e semelhantes.
Um processo dô coloração particularmente útil emprega pe— roxidase, peróxído de hidrogénio e uma substância eromogénea, tal como amlnoetil-carbazol. A peroxidase (um enzima bea conhecido, susceptível de obtenção a partir de muitas fontes) pode ser acoplada ao anticorpo específico para hu-MIP-2 ou eer simplesmente complexado com ele através de ua ou mais anticorpos. Também podem ser usadas outras substâncias croraogêneas e enzimas. Estas técnicas são bem conhecidas dos especialistas* Os anticorpos marcados radioaetivamente podem ser específicos para hu-MIP-2 ou podem ser segundos anticorpos imunoreactivos co» anticorpos específicos para hu-MIP-2 . Novavamente estas técnicas são bem conhecidas. A técnica precisa por meio da qual ê detectado o hu-MIP—2 não é crítica para os fins da invenção.
Um método particularmente preferido para detecção e/ou quantificação de hu-MIP-2 (3> em amostras biológicas emprega um ensaio competitivo. Um anticorpo iraunoreaetivo com um epítopo que se encontram em hu-MIP-2 ^6 mas que se encontra em hu-MIP- 2 <=x£., é ligado a um suporte sólido tal como ura disco de raicrotitulação de poliestireno ou papel de nitrocelulose, utilizando técnicas conhecidas. Este supojete sólido S depois incubado na presença da amostra a analisar sob condições em que os complexos anticorpo-antigene se formam e são estáveis. Os componentes em excesso e não ligados da amostra são removidos e o suporte sólido ê lavado de modo que os complexos anticorpo-antigene fiquem retidos sobre o suporte sólido. Uma quantidade fixa de u» polipeptídeo marcado, contendo um epítopo que se encontra no hu-MIP-2 mas que não se encontra em hu-MIP»2 cs«í, é depois incubado com o suporte sólido. 0 polipeptídeo marcado foi acoplado a uma parte detectável, tal como biotina, peroxidase ou um radioligante, por meios bem conhecidos na técnica. 0 polipeptídeo marcado liga-se a um anticorpo
ι. ·
V* %
imunoreactivo com hu-MIP-2 Çò que se fixa ao suporte sólido.
polipeptídeo em excesso e o não ligado é removido e o suporte sólido é lavado como anteriormente. A fracção detestável c
fixada ao suporte sólido é quantificada. Uma vez que o hu-MIP-2 Çà e o polipeptídeo competiram para os mesmos sítios de ligação ao anticorpo, o hu-MIP-2 na amostra pode ser qantlficado pela sua diminuição na ligação do polipeptídeo ao suporte sólido · Como alternativa a amostra e o polipeptídeo mareado podem ser incubados como o suporte sólido ao mesmo tempo.
Ensaios de amostra de nucleótido
As sequências de nucleótido proporcionadas pela invenção podem ser utilizadas para formar amostras de genes de acordo com qualquer das técnicas convencioçais. A dimensão de uma amostra pode variar desde menos do que aproximadamente 20 nucleótidos até centenas de nucleótidos. A amostra pode ser marcada radioactivamente, marcada com ura produto fluorescente,ou semelhante. Os processos para a preparação e marcação de amostras de nucleótidos são bera conhecidas na técnica* ensaio de diagnóstico empregando uma amostra de nucleótido emprega uma amostra biológica proveniente de um indivíduo. Os ácidos nucleicos são recuperados da amostra empregando técnicas convencionais bem conhecidas dos especialistas,0 ácido nucleico é depois incubado com a amostra e detecta-se depois a hibridização.
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Abaixo são descritos exemplos da presente Invenção que são fornecidos apenas com fins ilustrativos. Não são destinando» a limitar o âmbito da presente invenção de qualquer forrn^ visto que inúmeras variantes dentro do âmbito das reivindicações serão evidentes para os especialistas na técnica â luz da presente êxpQ&içãa. Presume-se que os especialistas na técnica esteja» familiarizados (Ou tenham acesso rápido) com as referências citadas na Memória Descritiva e os respectivos contêudos são aqui incorporados para referência.
Exemplo 1
Isolamento e clonagem de cADN que codifica MIP-2 murínica
Construção de uma bibliotecade cADN isolamento de poll-A+ ARN a partir de células RAM 264.7 murínicas estimuladas com LPS em E. Coli e a construção de uma biblioteca de cADN já foram anteriormente descritas (Davatelis et al, 1988)*
Isolamento de cADN de MIP-2 Murínica
Sintetizou-se um aglomerado de amostras de oligonucleótidos degenerados, correspondentes aos aminoácidos 9-14 na sequência NHg-terminal de MIP-2 (Wolpe et al, 1989). Esta porção da sequência parcial foi escolhida porque foi predita comc estando numa região codificante altamente conservada e por causa da sua baixa degenerescência de cocão, quando cora as outras partes da sequência parcial. A amostra resultante era um aglomerado degenerado 123 veaes de oligómeros com 17 nucleótidos de comprimento.
ííxtractos de duplicados de filtros de nitrocelulosc da biblioteca de cADN de células PAV 234,7 em placas (5 X 10® placas) foram pré-hibridizados a 42SC en 5 X SSC, 2 X Denhardfs, tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 8,5 , formamida a 50%, SDS a e 0,25 mg/ml de ADN de esperma de salmão submetido a ultrassons e depoi3 hibridizaram-se uma noite a 42aC em 5 X SSC, 1 X Denhardf s, tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 6,5 , 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, 0,1% te SDS, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmão submetido a ul4 trassons e 5 X 10 cpm por ml por degenerescência de um aglomerado de amostras de oligonucleótidos sintéticos marcados na extremidade 5’ com P-ATP. Depois da hibridização os filtros foram lavados empregando-se TMAC (Wood et al, 1985, Proc.Watl. Acad. Sei. USA, 32:1585). As placas cora reacção positiva nos duplicados dos filtros foram submetidas a uma segunda repetição da aplicação em placa ' de baixa deusiâade e pesquisa. Os clones de fagos positivos foram isolados, a partir dos quais se preparou·. ADN para posterior análise.
murínica
A pesquiza da biblioteca tíe células ARAtf 264.7 com um degenerado específico para a de cADIí tíe poli-A+ ARN a partir aglomerado de oligonucleótidos sequência N-terminal de MIP-2
murínica (tfolpe et al, 1989) resultou no isolamento do clone 2JIP-2-2G <=><· 0 inserto de cADN (aproximadamente 1100 bp) foi, Isolado, clonado em M13 e determiíiou-se a sequência de nucleótidos. A sequência de nucleótidos e a sequência de proteína px’edita estão representadas na fig. 1. A sequência de proteína com inicio na posição 1 corresponde exactamente à sequência peptidica N-terminal determinada anteriormente para MIP-2 purificado (tfolpe et al, 1389).
Exemplo 2
Isolamento eclonagem de cADN que codifica a MIP-2 <=a< e_-^a> humanas
A fim de se isolar os homólogos humanos de cADN de MIP-2 murínica, isolou-se um fragmento que codifica a maior parte da proteína roMIP-2 madura e usou-se esta para comprovar uma biblioteca de cADN de U937 preparada a partir de poli-A+ ARN de células tratadas com PMA e estimuladas com LPS. 0 ADN proveniente de placas positivas por lavagem de baixa severidade foi isolado e submetido a análise de endonuclease de restrição que sugeriu a presença de duas classes de clones. 0 inserto cADN dos clones representativos de cada classe ’ foi subclonatío em M13 e as sequências de nucleótidos foram determinadas.
Construção da biblioteca__de cADN
A estimulação da linha de células humana tipo monocítica U937 (Sundstrom et al, 1976, Int. J. Câncer, 17:565) o isolamento de ARN total e poli-A+ e a construção de uma biblioteca de cADN foram realizadas do seguinte modo. Células U937 (American Type Culture Collection, Rockville MD) foram cultivadas para confluência e estimuladas para diferenciação pela g
adição de PMA até uma concentração final de 5 X 10 M. Após 24 horas na presença de PMA, adicionou-se LPS (LPS W, E^_Coli 0127:B8; Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI) até uma concentração final de 1 μ§/πι1 e as células foram incubadas durante um período adicional de 3 horas a 37eC. 0 ARN total foi preparado essencialmente como é descrito (Cathala et al, 1983, DNA, 2:329). 0 ARN poli-A+ foi preparado por uma passagem simples sobre oligo dT celulose essencialmente como é descrito (Maniantis et al, 1982). 0 cADN de cadeia dupla foi preparado utilizando um Kit para a síntese de cADN (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Pleasant Hill, CA) e foi clonado e embalado em AgtlO.
Isolamento de homólogos humanos de MIP-2 murínica
A aplicação em placas da biblioteca de cADN de U937, a pré-hibridização em filtros de nitrocelulose e a hibridização dos filtros foram realizadas como é descrito no exemplo 1 para a pesquiza da biblioteca de cADN das células RAW 264.7 . 0 ADN da amostra era um fragmento BalI-BglII de 186 bp isolado·· · aipartirdo cADN de mMIP-2. 0 sítio BglII foi introduzido por mutagénese in vitro utilizando o primor mutagênico
5,-CAAAÂGATCTTGAACAAAG-3*. 0 fragmento BalI-BglII codifica a maior parte da sequência de aminoácidos de «ΪΙΙΡ-2 madura, faltando os pares base que codificam os três aminoácidos N-terminaõs e 8 aminoácidos C—terminais» Este fragmento foi submetido a translação ”nick” & aproximadamente SOO 000 cpm por ml foram incluídos na solução de hibridização»
Depois da hibridização os filtros fèram submetidos a três lavagens de baixa severidade â temperatura ambiente durante 30 minutos . cada uma em 2 X SSC, 0,1% SDS. As placas positivas nos duplicados dos filtros foram submetidas a uma segànda repetição de aplicação em placa de baixa densidade e pesquiza. Oq clones de fagos positivos foram Isolados, a partir dos quais se preparou ASN para análise posterior»
Clonagem e análise de sequência de ASN
Os insertos de gADN foram subclonados em vectores de fago M13 e a sequenciação do ADN foi realizada pelo método de terminação de cadeia de didesoxí de acordo com Sanger et al, (1977, Proc. Natl. Acad» Sei, USA», 74:5483)*
A sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos predita de hu-MIP-2 «==«£. está apresentada na fig. 2. Esta sequência foi confirmada em 4 clones independentes e é representativa do mais abundante destas duas classes de homólogos de cADN humanos para mMIP~2» A eequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos predita hu-MIP-2 representativos de uma se-j
Exemplo 3
Análise do fragmento de restrição
ADN genésico de células EAW 264.7 foi isolado domo é descrito por DiLella et al (1987, em **<3uide to Molecular Cloning Techniques, 3erger et al, Eds., Academic Press, Orlando, pég. 199). 0 ADN genéaieo humano ô o ASN genésico C3H/HeN aurínic: foram adquiridos através de Clontech (Paio Alto, GA).
A ADN genómico foi digerido com enzimas de restrição de acordo com as especificações do fornecedor. 0 ADN digerido fói separado sobre gel de agarose a 1% e depois transferido para membranas de nylon HySond (Amersham, Arlingto Heights, IL).
Os filtros foram prê-bibridízados e hibridizados em fosfato de sódio 50 aM, pH 6,5 , 5 X SSC, 1 raíí de fosfato de sódio,
40% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, 5 X solução de
Denhardfs, 0,1% SDS e 100 mg/ml de ADN de esperma de salmão submetido a ultrassons. Os ADNs usados para análise Southern foram o cADN de mMIP«2 de 1,1 Kb (clone mMIP-2-20a) o cADN de de 0,98 Kb (clone hu-MIP-2-4a) e um cADN de h
-MIP-2 «=><de 1,05 Kb (clone hu-MIP-2~5a). Todos os cADNs for 32 marcaá®^ por *’priming“ aleatória com P-CTP empregando um s tema Multiprimer DNA Labelllng System (Amersham, Arlington
Heights, IL). Depois da pré-hibridização durante 2 a 4 horas 0 a 37SC, o cADN marcado foi adicionado ,'â 1 X'.10 cpm por ml;, hibridização foi realizada durante 16-18 horas a 37sc. Os filtros foram lavados â temperatura ambiente durante 10 minutos em 2 X SSC, 0,1% SDS, e depois lavados 3 vezes a 65SC durantí 45 minutos de cada vez em 0,1 X SSC, 0,1% SDS. Em alguns casos as amostras hibridizatías foram removidas da mancha por tratamento durante 45 minutos a SS^C es 0,5 X SSC, 0,1% SDS e 50% de formamida para permitir a rehibridisação.
uara
LsAnálise Southern
Λ ADN de RAtf 264,7 foi digerido co» cada um dos três enzimas de restrição, BaraHl, EeoRl e EcoRV, sepaâados por electroforese em gel de agarose e foram comprovados com cADN de 32 mííIP-2 marcado com p« Os resultados, representados na fig. 6A, são consistentes com o cADN de KIP—2 definindo um gene único, Os meemos resultados foram obtidos quando ADN CBN/HeJ de rato foi analisado analogamente (dados não representados),
A análise Southern de ADN genómico humano foi realizada com amostras de cADN de hu-MIP-2 o< e hu-MIP-2 Çí> . A hibridização e condições tíe lavagem foram determinadas de modo que tornassem possível distinguir entre hu-MIP-2 <o< e hu-MIP-2 quando comprovados com os respectivos cADNs* As condições usadas no entanto não distinguem entre as sequências especificas de hu-MIP-2 «=<0 hu-gro/MQSA. 0 resultado da análise Southern de ADN humano genõmico submetido a restrição com BamHl, EcoBl,, ou EcoRV e comprovado com cADN de hu-MIP-2 ‘Xou de hu-MIP-2 estão representados nas figs. 6B e 0, respectivamente* Os parceiros de hibridização obtijBos com cada cADN diferem nitidamente* 0 câDN de MIP-2 <=»<hibridízou fortemente com fragmentos de EcoRV de aproximadamente 23 e 1,1 kb, enquanto que o cADN de MIP-2^> hibridizou com o fragmento de EcoRV de 7,0 kb. Anãlogamente, o cADN de hu-MIP-2 hibridizou co» fragmentos de ScoRl de 1,8 kb e 3,3 kb (fracamente) enquanto que hu-KIP-2«É-< hibridizou fortemente com fragmentos de ADN d© EcoRl de 3,3 e de aproximadamente 1,1 kb e hibridizou fracamente com fragmentos de EcoRl de 4,6 e 3,8 kb, Finalraente, o cADN de MIP-2p hibridizou fortemente com um fragmento BamHl de 2,4 kb e muik fracamente com um fragmento BamHl de 4,3 kb, enquanto que o cADN tíe MIP-2 <=<humano hibridizou fortemente cora fragmentos BamHl de 20, 2,0 e 1,1 kb e menos fortemente com um fragmento
BaraHl de 4,3 kb, A maior complexidade das configurações de hibridização obtidas com amostras tí© ©ASN de hu-MIP-2 especialmente de ADN digerido com BaraHl, relativamente ao obtido com a amostra de cADN de hu-MIP-2 '(Ss , sugere que a amostra de hu-MIP-2 «=·< detecta mais do que um gene, presumivelmente hu-gro bera corao hu-MIP-2 «=K. Podemos concluir dos dados aqui representados que hu-MIP-2 e hu-MIP-2 «=<são dois genes distintos»
Exemplo__4
Clonagem e expressão era procarxotes plasmídeo ARV-2 p25 gag (depositado no American Type Culture Colleetion, Rockville, Maryland era 27 de Agosto de 198ζ com o número de acesso 53 246) é ura derivado de pSR322 contendo o promotor tac, sequências Shine Delgarno, e ura polilínker como uma substituição das sequências de pBR322 originais compreendidas entre os sítios de restrição EcoRl a PvuII* Ver também a Especificação EP 181 150.
clone hu-MIP-2-4a (exemplo 3) ê clivado cora Pvull e Bali e ligado cora ura linker tendo a sequência;
aattatsocggggctgg
TAGCGCGGGGACC
plaemídeo ARV-2 p25 gag é depois clivado em EcoRI e Pvull, e é inserido hu-MIP-2-4a ligado. 0 construído resultante é depois transformado em células E. coli D1210 competentes, seguindo o protocolo de Cohen et al, Proc, Natl» Acad. Sei.USA, (1972) 62:2110). As células são transformadas com 25 a 50 ng do construído e a mistura de transformação é aplicada em placas de agar feita em calda L contendo 100 pg/ml*de ampicilina. As placas são incubadas a 37®C durante 12 horas e as colónias resistentes à aapicilina são transferidas para 1 ml de calda I» contendo 100 pg/ml de ampicilina. As células são cultivadas a 37»C e a expressão é induzida adicionando 10 pL de IPTG 100 mX, seguido por incubação a 37«C durante 2 horas. As células são depois Usadas e o produto é purificado.
Exemplo 5
Expressão em levedura plasmideo pGAIl contém ADN que codifica o leader do factor de levedura, um gene para proinsulina humana, e um terminador do factor , sob o controle de transcrição do promotor de levedura gliceraldeído-3—fosfato-desidrogenase (GAPDH). 0 vector é descrito completamente na Especificação EP 324 274.
A sequência codificante para hu-MIP-2 foi obtida por amplificação por reacção em cadeia de polimerase (PGR) de um fragmento derivado de um clone de lambda gtlO (lambda gtl0-hu-MIP-2-4a) utilizando os seguintes primers:
5* Priaer:
’ -GAGTGCGGTACCG7TGGATAAAAGAGACGTCCGTGGTCACTGAACTGCGCTGCC-3·
Kpnl j->hu-MIP-2p
3’ Priaer;
S·-GAGTGCGTGGAC7CATCAGTTGGTGGTCCCCTTGTTCAG -3 * t
SAXI - - |«-hu-HIP-2 interrupção
Depois de 30 ciclos de amplificação PCB, o ADN foi digerido com Kpnl e Sall , e o fragmento de 244 bp que codifica os 4 amináácidos carboxi-terminais do leader do factor o<» o sítio de processamento dibâsico, e os 73 aminoácidos inteiros de hu-MIP-2 (b madura foi isolado por electroforese em gel de acrilamida. Este fragmento foi depois ligado em pGAll que tida sido digerido com Kpnl e Sall e purificado sobre um gel de agarose. Depois da transformação bacteriana e pesquisa, foi obtido o plasmídeo pMIP540, o qual, por sequênciação de ADN, provou ter a sequência de nucleótidos predita. Este plasmídeo foi digerido com BamHI e o fragmento de 1163 pb resultante incluindo a sequência de promotor GAPDH, a proteína da fusão leader de factor /hu-MIP-2 (3 , e o terminador de transcrição do factor «k<foi acionado no sítio BamHI do vector de expressão pAB24 para proporcionar o plasmídeo de expressão pYMIP540.
Saccharomyces cerevisiae estirpe MB2-1 (leu2-3, leu2-112, his3-ll, his3-15, ura3*0 , CAH, Cire) foi transformado com o plasmídeo pYMIP540 por processos convencionais e os tras-> fermentes foram seleceionados para prototrofia ura. A espressão foi analisada por inoculação de colónias simples de transformantes individuais em meio selectivo de leucinã e cultimou72
-se durante cerca de 48 horas. As culturas fora» dapois centrifugadas, as células foram postas de novo era suspensão em meio isento de uracilo, e foram diluídas 20 veaes em meio selectivo ura, as culturas foram depois cultivadas cerca de 72 horas» depois recolheram-se e prepararam-se os sohrenadentes isentos da células. 0 meio condicionado foi analisado quanto à presença de hu-MIP-2 por meio de SDS-PAGE seguido por co loração com Coomaseie* Observou-se uma banda em SDS-PAGE que migrou analogamente a u» padrão de MIP-2 nativa (fornecido por B» Sherry, Rockefeller Onlversity).
Exemplo 6
Expressão em células de mamífero (A) Expressão em células COS-7 plasmídeo pSV7tPA21 (ATCC n9 de acesso 40163, depositado e» 14 de Fevereiro de 1985) é um vector de expressão de mamífero contendo ΑβΝ que codifica tPA humana de comprime» to total numa sequência polllinker flaqueada pela origem SV40, um promotor prematuro, e um Sitio de poadenilação. Este plasmídeo é também descrito na especificação PCT Application V0 86/05514.
A sequência que codifica hu-MIP-2(b é amplificada a partir do plasmídeo pYMIP540 por PCR e é inserido nus sítio do vector de expressão p5V7tPA2I» tendo a origem SV40 e o promotor prematuro na posição 5* do sítio de poliadenilação em po73
siçâo 3* do sítio de inserção, para formar o plasmídeo pSVMIP2 {5b . Células CGS-7 são transfeetadas com pSV-MIP21»> utilizando uma modificação do processo descrito por Graham e van der Eb.» Virai. (1973), 52:456-67, As amostras são adicionadas aos discos em duplicado e permite-se que assentam sobre as eélula, duraat. 6 hor.. nu. incubador d. C02 .37.0, D.poi. d. cultura as células são lavadas moderadamente com PBS isento de cálcio e de magnésio* Os discos são depois expostos a glicerina como adjuvante durante 3-4 minutos, são lavados e alimentados com meio DMBM suplementado com 4,5 mg/ml de glucose,
3,7 mg/ml de bicarbonato de sédio, 291 pg/ml de glutamina,110 j*g/al de piruvato de sédio, 100 U/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomicina e 10% de soro de vitelo fetal (FCS). Depois de se permitir que a cultura recupere do choque de glicerina, O meio é substituído por meio isento de soro. Decorridas 12 horas depois da remoção do soro o meio condicionado £ ensaiado quanto a hu-MIP-2 .
(B) Expressão em células CHO
Células CHO dhfr~ são aplicadas em placa a uma densi* 5 6 dade de 5 X 10 a 10 célula/disco (10 cm) no dia anterior â transfecção em meio F12 suplementado com 1,18 mg/ml de NaHCO^, 292 pg/ml de glu£amina, 110 pg/ml de piruvato de sédio, 100 ϋ/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomicina, 150 mg/al de prolina e 10% de 7C8. As células são depois transfeetadas como se descreve na parte (A) acima, incluindo adicíonalmente um plasmídeo marcador que transporta um gene dhfr ligado ao promotor posterior principal de adenovirus (copreeipitado em
fosfato de eâlcio). Apõe a cultura durante 48 horas* as células são divididas a 1:20* ssão cultivadas era raeio selectivo (DMEM, 150 pg/ml de prolina e 10% FCS) e cultivadas durante 1 a 2 semanas.
Exemplo 7
A. PreparagSo de um plasmídeo que codifica um mercador seleccionével plasmídeo pAd-BHFR, que transporta o cADN de DHFR murínico* foi constuido por fusão do promotor posterior principal de adenovirus-2 (Ad-MLB, unidades de mapa 16-27*3) com aa sequências não transladadas e» 5» do cADN de DHFR de rato (J. H. Nunberg et al, Cell (1980) 19:355-646, 0 ADN de SV40 que codifica parte da unidade de transcrição anterior, incluindo o intrão do pequeno gene antigene t, e tendo a região de terminação de transcrição da região anterior SV40, foi obtido a partir de pSV2-neo (Southern and Berg, J, Mol. Appl. Gen. (1982) 1:327-41) e foi fundido δ extremidade não transladada 3* do cADN de DHFR. Estes trés segmentos foram subclonados ea pBR322 para se obter o plasmídeo pAD-DHFR.
B. Preparação do vector de expressão de mamífero
1. pSV7d:
As cassetes de expressão fora» preparadas utilizando o vector de expressão de células de mamíferoM pSV7d {2423 bp).
plasmídeo pSV7d {ver Truett et al, a985, DNA, 4i 333 ) foi construído do seguinte modo: o fragmento de 400 bp BamHl/Hlndlll contendo a origem de replicação SV40 e o promotor anterior foi excisado pSVgtl (obtido de Paul Berg, Stanfbrd Univereity, Califórnia ) e purificado. 0 fragmento de 240 bp SV40 Bell/BamHl contendo o sítio de adição poliA de SV40 foi excisado de psV2/DHFR (Subramani et al, Mol. Cell. Biol.(1981) 1;854-864) a purificado. Oq fragmentos foram fundidos através de seguinte linker:
codões de interrupção
3
5«-AGCTAGATCTCCCGGGTCTAGATAAGTAAT -3* { TCTAGAGGGCCCAGATCTATTCATTACT&G
Bell salientes
HindiII BglII Smal Xbal linker conté» 5 sítios de restrição, bem como codões de interrupção em todas as 3 estruturas de leitura. 0 fragmento resultante de 670 bp contendo a origem de replicação de SV40, o promotor anterior SV40, o poliiinker com codões de interrupção e c áíti*O de poliadenilação de SV40 foi clonado no sítio BamHI de pML, um derivado de pBR322 tendo cerca de 1,5 Kb el£minados (Lusky e Botchan, Cell (1984) 36: 391) para produzir pSVS, Os sítios EcoRI e EcoRV nas sequências pML de psVS foram eliminados por digestão com EcoRI e EcoRV, tratados com nucle-
ase de Bal31 para remover cerca de 200 bp em cada extremidade, e finalmente religados para produzir pSV7a. A resecção de Bal31 também eliminou um sítio de restrição BamHI flanqueando a região de SV40, aproximadamente 200 bp afastado do sítio BcoRV.
Para eliminar o 2a sítio BamHI flanqueando a região 3V40 o pSV7a foi digerido co» Nrul que corta na sequência de pML a montante da origem de replicação. Este foi recircularizado por ligação de exteemidade truncada produzindo pSV7b.
Os pSV7c e pSV7d representam substituições sucessivas de polilinker. Primeiro o pSV7b foi digerido com Stul e Xbal. Depois o linker seguinte foi ligado no vector para produzir pSV7c
BglII EcoRI Suai Kpnl Xbal
5'-AGATCTCGAATTCCCCGGGGGTACCT
TCTAGAGCTTAAGGGGCCCCCATGGAGATC
Seguidamente o pVS7c foi digerido com Bglil e Xbal e depois foi ligado co» o seguinte linker para produzir pSV7d:
BglII EcoRI Smal Xbal BamHI Sall i l I ί i i
51-GATCTCGAATTCCCCGGGTCTAGAGGATCCGTCGAC
AGCTTAAGGGGCCCAGATCTCCTAGGCACGTGGATC
2. pCMVÓa
Nua esforço para melhorar o nível de tranacriçSo e a estabilidade do ARN mensageiro de proteínas beterólogaa, a região de iniciação transcricional de SV40 foi substituída por sequências obtidas da região anterior imediata de citomegalovirus huaano (Boshart et al, Cell (1905) 4:521-530). Adicíonalmente as sequências não transladas 5’ co» a contribuição da região anterior de SV40 para o ARN mensagmíro fora» substituídas pelas sequências não transladadas 5* do gene HCXV 1X1, incluindo o primeiro intrão. Este intrão é incluído pressupondo que os transcritos seccionados conduze» a u» processamento mais rápido e a mARN mais estável.0 vector de expressão também tem uma origem de replicação SY40 para permitir a empressão transiente em células C037, e um gene p-lactamase bacteriano para permitir a clonagem de ADN por selecção para resistência á amplcilina» plasmídeo foi construído a partir de um fragmento de 700 bp Sall-Pvul (descrito no exemplo 7, Secção B, 1) contendo a região de poliadenllação SV40, u» fragmento de 1400 bp Pvul-èEcoRI (preenchido com polímerase de Klencw) de p3VX2 (Myers et al, Cell (1981) 25:373-34; Rio et al, Cell (1983) 32:1227-40) proporcionando a origem de replicação SV40 e o resto do gene (b —lactamase, u» fragmento de 1700 bp Sspl-Sall derivado de u» subclone de plasmídeo do cítomegelovirus(estirpe de Towne) no qual o sítio Sall foi introduzido por mutagénese in vitro próximo do sítio de iniciação de translação para a proteína 1Z1, e o fragmento de 4300 bp Sall-Sall de pSVF8-92C contendo o cADN que codifica o factor VIIIíC 92 KXp glieoprotelaa.
ί/ plasmídeo pCMV6a 120-SF2 é semelhante ao pGMVSa descrito acima, excepto que o fragmento Sall-Sall que codifica a proteína factor VIII:C 92 Κ M foi transladada em 5» e r de sianl de tPA humano fundida a um gene heterélogo. Este vector foi transformado em células E. coli que são depositados no ATCC, ns de acesso 68 249. A digestão de pCMVÔal20-SF2 com Nhel e Sall remove o gene heterélogo, Qualquer gene do polipeptídeo hu-MIP-2 pode ser ligado a linkers para ser inserido no vector de ex>>essão de mamífero pCMV6al20-SF2. 5’q.c ........exemplo, o gene hu-MIP-2 Çò é obtido a partir do plasmídeo de | levedfira por amplificação por reacção de cadeia de polímerase (PCR). Os primers para dirigir a reacção PCR podem ser facilmente construídos com base na sequência de ácidos nucleicos de hu-MIP—2 Ç5 representada na fig. 3, e os primers podem ser construídos de modo a incluir sítios de restrição apropriados, tais como Nhel e Sall, para inserir o gene amplificado no vector . Por conveniência o gene DHFR pode ser inserido nesta nova cassete de expressão hu-MIP-2 ξό . Este novo vector é designado pCMV-MIF2(p> .
Preparação de uma linha ds células de expressão de MIP-2 de mamífero
Este exemplo descreve a preparação de uma linha de células CHO estável que produz hu-MIP-2 nativa.
A linha de células CHO de DHFR~ DG44 (G, Urlaub et al,
Som. Gell. Mol* Genet. (1966) 12:555-66) é primeiramente tranefectada com o plasmídeo pCMV-MIP-ã Çs · Neste plasmídeo o promotor CMV (descrito no exemplo 7B-2) regula o gene 1(12-2^derivado de pYMIPSSG (descrito no exemplo 5/ o lider tPA {descrito no exemplo 7B-2) dirige a secreção de hu-MIP-2^? codificada, e contém a jusahte a cassete AdrMLP/dhfr derivada de pAd-DHFR (descrita no exemplo 7A). As células são transfectadas utilizando o método de polibreno descrito por Ϊ. Chaney et al, Som. Gell. Mol., Genet. (1986) 12:237-44. Por selecçSo de células para DHFR+ (em DMEM + 10% DFSC) são isolados vários produtores de hu-MIP-2 (2> .
Informação sobre depósito
Os seguintes produtos foram depositados no American Type Culture Colemtion (ATGC)12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852:
Nome Dfeta de deposito Ns de aoeaao
Células de ovário de hamster chinês 8 de Março 1990 CRL 10378 de Março 1990 68249
CH0-DG44
2.coli HB101 pCMV6al2Q~3F2 S. ecerevlsiae MB2-1 (p¥MIP540) de Junho 1990
74002 ,Λ
Estes produtos foram depositados nos termos do tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganiseos para Fins do Processo de Patente . Estes depósitos são promovidos por conveniência dos especialistas e não representam uma admissão de que. se exige um depósito sob 35 U. S. C. secção 112. A sequência dos polinucleótidos contida nos produtos depositados, bem como aa sequências de aminoácidos dos polipeptídeos codificados por aqueles, são aqui incorporados para referência e estão em controle no caso de qualquer conflito com descrição escrita das sequências indicadas, pode ser requerida uma licença para produzir, utilizar ou vender os materiais depositados, e tal licença não é aqui garantida.
Claims (20)
- REIVINDICAÇÕES:1 - Processo para a preparação de polipéptidos contendo proteina macrofágica inflamatória humana hu-MIP - 2 beta por métodos recombinantesr caracterizado pelo facto de compreender as seguintes operações:obtenção de uma população de células transformadas com moléculas de ADN que compreendem uma região heteróloga que codifica o polipéptido hu-MIP - 2 beta;desenvolver a citada população em condições em que se expressa o referido polipéptido; e recuperar o citado polipéptido.
- 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o mencionado polipéptido ser segregado pelas referidas células.
- 3 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se obter uma composição contendo um polipéptido MIP-2 beta humano substancialmente isenta de tecido humano.
- 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a referida composição ser substancialmente isenta de outras proteinas humanas. ·
- 5a - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadc pelo facto de a mencionada composição ser substancialmente isenta de outras proteinas.
- 6a - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o mencionado polipéptido hu-MIP - 2 beta conter hu - -MIP - 2 beta.g
- 7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter uma composição contendo moléculas de ADN que compreendem uma região heteróloga que codifica o polipéptido hu-MIP-2 beta, sendo a composição substancialmente isenta de outras moléculas de ADN.
- 8a - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a referida região que codifica o polipéptido hu-MIP-2 beta ser uma sequencia de ADN isenta de intrões.
- 9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter uma molécula de ADN compreendendo uma sequencia de ADN isenta de intrões e que codifica uma sequencia de aminoácidos do polipéptido hu-MIP-2 beta.
- 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o mencionado polipéptido hu-MIP-2 beta ser em hu-MIP-2 beta.g
- 11 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se transformar uma população de células com a mencionada molécula de ADN e a citada população de células ficar substancialmente isenta de células não transformadas pela referida molécula de ADN.g
- 12 - Processo de acordo com as reivindicações 9 e 10, caracterizado pelo facto de uma molécula ADN com uma só tira que compreende pelo menos 10 nucleótidos sequenciais, cada um dos quais compreende uma subsequencia única para o hu-MIP-2 beta ou uma sua sequencia de ADN complementar.
- 13 - Processo para a preparação de anticorpos reactivos, caracterizado pelo facto de se obter um anticorpo reactivo com um epítopo de um polipéptldo de hu-MIP-2 beta mas não reactivo com MIP-2 murino, protéina gro humana ou a protéina codificada pelo gene KC murino.
- 14a - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o mencionado anticorpo ser monoclonal.
- 15 - Processo para a preparação de composições contendo anticorpos de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de ficar substancialmente isenta de outras moléculas de imunoglobulina.
- 16 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de se empregar uma linha de células de hibridoma que produz os referidos anticorpos.
- 17 - Processo para determinar a presença de um polinucleótido substancialmente homólogo de uma sequencia de codificação para o polipéptldo MIP-2 beta humano, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em obter-se uma amostra suspeita de conter o referido polipéptldo;incubar-se a amostra com uma amostra de nucleótidos tendo uma sequencia complementar do ADN com uma única tira de acordo com a reivindicação 12, sob condições em que a citada amostra forma híbridos com ácido nucleico da amostra; e detectar-se os hibridos de ácido nucleico.
- 18 - Processo para determinar a presença de MIP-2 beta humano numa amostra, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em incubar-se a citada amostra com um anticorpo reactivo com polipéptido hu-MIP-2 beta; e detectar-se o imunocomplexo.
- 19 - Processo para determinar a presença de anticorpos antihu-MIP-2 beta numa amostra, caracterizado pelo facto de se incubar a referida amostra com a composição de acordo com a reivindicação 4 e se detectar o imunocomplexo.
- 20 - Processo para a preparação duma composição farmacêutica para estimular a miclopoiese em células miclopoiéticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de polipéptido hu-MIP-2 beta com a mistura de substancias veiculares e/ou auxiliares farmaceuticamente aceitáveis.
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