JPH06501244A - ヒトマクロファージ炎症性タンパク質２β - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトマクロファージ炎症性タンパク質２β発明の背景 マクロファージ炎症性タンパク質（Ｍ　Ｉ　Ｐ　Ｓ）は、微細なバクテリア脂質 多糖類の侵入に反応する過程で、ある種の細胞（たとえば、マクロファージまた はリンパ細胞）によって生産されるタンパク質の一種であることを示すものであ る。

したがって、それらは、その細胞（ホスト生体）のその種の刺激に対する反応の 重要な参加者となることもある。そのため、これらの分子は、伝染病、癌、骨髄 生成機能障害および自己免疫疾患の処置の中で治療の可能性を持つこともある。

ＭＩＰの異なる２つの形は、マクロファージ腫瘍細胞の栽培の過程でマウスＭＩ Ｐ−１およびマウスＭＩＰ−２から発見された。

ネズミ科ＭＩＰ−Ｉ ぶグミ科（ｍ）ＭＩＰ−１は、脂質多［１！（ＬＰＳ）から抽出される主要な隠 しタンパク質であり、ＲＡＷ２６４．７細胞で刺激された（ネズミ科マクロファ ージ腫瘍細胞線）である。これは浄化されているとともに、２つの関連タンパク 質、ｍＭＩＰ−１＃およびｍＭＩＰ−１＃　（１４ｏ１ｐｅ、　ｅｔａｌ、、１ ９８７．　Ｊ、　Ｅｘｐ、門ｅｄ。

１６７、５ｈｅｒｒｙ、　ｅｔａｌ、、１９８８．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 １６８　：　２２５１）によって構成されていることが発見されている。

ｍＭｒＰ　ＩαとｍＭＩＰ−１βの両方のｃＤＮＡは、分校されて、順番に配列 されている（Ｄａｖａｔｅｌｉｓ、　ａｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、　Ｅｘ ｐ、　Ｍｅｄ、　１６７　：　１９３９　；５ｈｅｒｒｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　 ｏｐ、　ｃｉｔ、）。

ｍＭＩＰ−１αとｍＭＩＶ−１βに対応するｃＤＮＡの分校と配列は、ブラウン 他によって報告されており（１９８９，Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４２　：６ ７９）、クオン、ワイズマン（１９８９，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６　：１９６３）およびブラウン他によって、それぞれ報 告されている。

ｃＤＮＡライブラリから分離されたｍＭＩＰ　ｌαとｍＭＩＰ−１βの同相の両 グループは、コンコナヴアリンＡで処置することによって活性化されたネズミ科 ヘルパーＴ細胞のＲＮＡから作成されている。これらの結果は、ＭＩＰ−１αと ＭＩＰ−１βかＴ細胞活動の中で役割を果たすことがあることを示唆している。

ヒトＶＩＰ−１ホモロジー 分岐されたいくつかのグループは、ｍＭＩＰ−１αとｍＭＩＰ−１βのヒトホモ ロジーであることもある。すべてのケースで、ｃＤＮＡｓは、活性化された人間 ＴＩ胞からＲＮＡに基づくライブラリと分離されている。したがって、オバル他 （１９８６，Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９９　：　８８５）およびジッベル他（ １９８９，Ｊ。

１＋＋ｕｎｎｏ１．、　１４２　：　１５８２）は、ｍＭＩＰ−１α（７６％） に対して高い相同性を持つタンパク質を予測するｃＤＮＡの分岐をともに報告し ている。同様に、ブラウン、ｏｐ、　ｃｉｔ、、ジノペル、ｏｐ、　ｃｉｔ、、 リップス（１９８Ｂ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５　：　７９０４）およびミラー（１９８９， Ｊ、　Ｉｍｏ＋ｕｎｏ１．。

１４３：２９０７）他が、ｍＭＩＰ　１β（７５％）に対して高い相同性を持つ タンパク質を予測する人間ｃＤＮＡｓの分枝と配列を報告している。ＭＩＰ−］ αとＭＩＰ（βは、免疫調整活動を持つ関連タンパク質の新説族に属している（ その見直しについてはシェリー他０１１．　ｃｉｔ、を参照のこと）。

ネズミ科ＭＴＰ−２ ネズミ科ＭＩＰ−２（ｍＭＩＰ−２）はまた、ＬＰＳ刺激によるＲＡＷ２６４゜ ７細胞（ウォルペ他、１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ、８６：３１２１）の条件付き媒体から浄化された導出タンパク質で もある。ネズミ科ＭＩＰ−２を符号化しているｃＤＮＡが、分校され配列されて いる。

ｍＭＩＰ−２または、相同の多重遺伝子族のメンバーでもある。この族のメンバ ーには、ｇｒｏ／ＭＧＳＡ、血小板要因４、血小板基礎タンパク質、ペプチド（ ＣＴＡＰ−Ｉ［［）とＢ−）ロンボグロブリンを活性化している結合組織の前身 、タンパク質導出性のガンマ・インターフェロン、ＩＰ−１０、およびインター ロイキン８　（ＩＬ−８）などが含まれており、さらに３−１０Ｃ，ＭＤＮＣＦ 、ＮＡＰ−１およびＮＡＦも知られている。タンパク質の配列の中でもっとも高 い相同性を持つこの族のメンバー（通常分岐されたｃＤＮＡから予測する）は、 ＭＧＳＡとＫＣを含んでいる。ＭＧＳＡ　（リノチモンド他、１９８８．ＥＭＢ ＯＪ、。

７：２０２５）は、人間の黒色細胞腫によって隠された有基遺伝子活動を持つ自 生頭髪成長要因であり、人間ｇｒｏ遺伝子（Ａｎｉｓｏｗｉｃｚ、　ｅｔ　ａｌ 、、　１９８７　、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、ＵＳＡ　８４　：　７１８　Ｂ　）から産出 されたものである。　ＭＣ，ＳＡは、ネズミ科ＶＩＰ−２に対してアミノ酸配列 中で５７，９％の独自性を持っており、ＭＧＳＡ　（ｉｂｉｄ、）の推定ハムス ター相同の予測されたタンパク質配列は、ｍＭＩＰ−２に対して６８．３％の独 自性を持っている。ネズミ科ＫＣ遺伝子の産出物（Ｏｑｕｅｎｄｏ、　ｅｔａｌ 、、１９８９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２６４　：　４２３３）は、血 小板導出の成長要因（ＰＤＧＦ）によって誘発さ娠人間ＭＧＳＡ／ｇｒｏ遺伝子 （ｍＭＩＶ−２に対して６３．０％のアミノ酸独自性）のネズミ科相同であると 考えられている。

ＭＩＰの組替え発現 ＭＩＰ−２遺伝子族のメンバーはもちろんのこと、関連するＭＩＰ−１遺伝子族 が発現されていても、組替え子ＭＴＰ−２または人間ＭＩ　Ｐ−２αおよびＭＩ Ｐ−２βの発現に関する先行技術は存在しない、ネズミ科ＭＩＰ−２または人間 ＶＩＰ−２の式に対するこれらの結果の適切さは疑問があり、外来系における発 現に特有の性質を与えられている。それでもこの文献では、その要点を述べるこ ととする。

ｍＭＴＰ−１αとｍＭＩＰ−１βは、ＣＯ３細胞（Ｇｒａｈａｍ、　ｅｔ　ａｌ 、、１９９０゜Ｎａｔｕｒｅ、　３４４　：　４４２）中に独立して表されてい る。ネズミ科ＭＩＰ−１ｃｘのヒト相同であるようなタンパク質をコードするＬ Ｄ７８　ｃＤＮＡ　（Ｏｂａｒｕ、　ｅｔ　ａｌ、。

ｏｐ、　ｅｉｔ、）は、ＣＯＳ細胞（Ｙａｓａｍｕｒａ、　ｅｔ　ａｌ、＋　１ ９８９．Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、。

８４：１７０７）と同様に、ヒトインターロイキン２に対するカルボキシル基末 端としてＥ、ｃｏＨ中に表されている。

ＭＩＦ−１族タンパク質のメンバーと相同性を持つタンパク質をコードするＣＤ ＮＡであるヒトｌ−３０９は、分泌されたタンパク質（Ｍｉｌｌｅｒ、　ｅｔ　 ａｌ、、　ｏｐ。

ｃｉｔ、）をコードすることを確認するためにＣＯ３−１細胞中に表されている 。

Ｌｉｐｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、（ｏｐ、　ｃｉｔ、）が、Ａｃｔ−２ｃＤＮＡのバ キュロウィルス発現（ネズミ科ＭＩＰ−１４の人間の相同に書き直されたタンパ ク質が分泌されたということを示し、そして成熟したＮ　−ｔｅｒｍｉｎａｌな 配列を確認するために）を記述した。ＪＥ（ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βに 相同であるタンパク質をコードするネズミｃＤＮＡは、およそ１２　ｋＤａ　（ Ｒｏｌｌｉｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、１９８８．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５　：　３７３　Ｂ　）のポリペ プチド芯をコードしていると確証するためにＣＯ５−１細胞の中で発現された。

ＫＣ（ｍＭＩＰ−２に相同のタンパク質をコード化するネズミ科ｃＤＮＡ）はそ れが分泌されたタンパク質（Ｏｑｕｅｎｄｏ、　ｅｔ　ａｌ−＋　Ｏｐ、　ｃｉ ｔ、）を符号化するということを示すためにＣＯ３−１細胞の中で発現された。

活性化ペプチド−ＩＩＩ　（ＣＴＡＰ、　Ｍｕｌｌｅｎｂａｃｈ、　ｅｔ　ａｌ 、、　１９８６．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｔ、２６１　：　７１９）およびＩ 　Ｐ　１０　Ｌｕ５ｔｅｒ、そしてＲａｖｅｔｃｈ　（１９８７，Ｊ、Ｅｘｐ、 　Ｍａｄ　（１６６）　：　１１０８４）［’−２遺伝子族の両方のメンバーは 、イースト中でα因子融合物として、そしてＥ、ｃｏｌｉ中でそれぞれ発現され た。　Ｍａｉｏｎｅ（ｅｔ　ａｌ）、　（１９９０５ｃｉｅｎｃｅ。

２４１７？）が、人間の血小板要因４、Ｅ、ｃｏｌｉ中のＭＩＰ−２族Ｅ、ｃｏ ｌｉＢ−グルクロニダーゼの３５アミノ酸ペプチドフラグメントに融合したペプ チドとして発現した。溶解しない溶解タンパク質は、生物活性材料を生成するた めにシアン臭化物によって開裂される。

Ｌｉｎｄｌｅｙ（ｅｔ　ａｌ）　（１９８８，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　ＵＳＡ８５　）は、ＮＡＦ　（ＭＩＰ−２な家族のメンバーＥ、ｃｏｌｉ Ｏ中で）（ＩＬ−８）を発現した。

精製および再生の後、この組替え体タンパク質は、それが生来の分子のために確 認した同じ生物活性を持つことがわかった。

Ｆｕｒｕｔａ（ｅｔ　ａｌ）　（１９８９，Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　Ｉ　０ ６　：　４３６）は、また、Ｉ　Ｌ−８（Ｌｃｏｌｉの中のＭＤＮＣＦ）を発現 した。

最後に、Ｇｉｍｂｒｏｎｅ　（ｅｔ　ａｌ）　（１９８９，５ｃｉｅｎｃｅ、　 ２４６　：　１６０１　）は、人間の２９３細胞の中でエンドテリアル（ｅｎｄ ｏｔｈｅｌｉａｌ）なＩ　Ｌ−８を発現して、そしてその組替え体および自然の 材料が同じ生物活性を持つということを示した。

ＶＩＰの生理活性 ＭＴＰ−１及びＭＩ　Ｐ−２の研究は、進歩しており、天然マウスＭＩＰ−１と ＭＩＰ−２、及びごく最近組換え型マウス（ｒｍ）ＭＩＰ−１ａ、ｒｍＭＩＰ− １β及びｒｍＭＩＰ−２が利用されてきた。これらの生理活性の中で、岨換え型 および天然ｍＭＩＰ−１及びＶＩＰ−２の両方のために、コロニー刺激因子並び に炎症において機能を果たす役割が規定されている。ハツカネズミＭ［’−２は 、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪハツカネズミの足踏の皮下に注入された時、局所的な炎症性反 応を誘発し、人間の多形態核白血球（ＰＭＮ）ための有力な細胞遊走活性を有し 、かつβグルクロニダーゼ（Ｗｏｌｐｅ、など、１９８９年）ではなく、リソチ ームのＰＭＮ脱顆粒を引起すということがわかった。さらに、ｍＭＩＰ−２−は ＣＦＵ−ＱＭ　（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ　、など、１９８９年、Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、１７０　：１５８３）　ｆｏｒ骨髄造血機能を増大する活性を持ってい ることが分かった。これらの因子の種々の生物学的活性を与えられた状況では、 それらのヒト同族体を分離することが望ましい、生理活性の定義を追求する数量 の精製された因子の必要、および細胞培養体液からこれらの因子を分離する費用 のために、これらの材料を組換え型デオキシリボ核酸技術を用いて、製造するの が望ましい。

発明の要約 ｍＭＩＰ−２のヒト対照物を識別する試みは、予期されないことではあったが、 １つでなく２つの候補配列を示す結果になった。これらの２つの配列はそれぞれ ｈｕ−ＭｒＰ−２ｃｒおよびｈｕ−ＭＩＰ−２８と定義された。

人間の他の蛋白質から本質的冒されていないヒトＭＩＰ−２β（ｈｕ−ＭＩＦ’ −２β）ポリペプチドを提供すること、ｈｕ−ＭＩＰ−２βのために核酸コーデ ィング配列を提供することが、本発明の目的である。

ｈｕ−ＭＩＰ２βに対して反応性を持つ抗体のための診断方法を提供することも 本発明の別の目的である。

ｈｕ−ＶＩＰ−２の検波に、あるいはｈｕ−ＭＩＦ’−２βのための核酸コーデ ィング配列の診断の方法を提供することも、また本発明の別の目的である。

これら、および他の目的は、本文の記載から明白になるが、本発明の１つの局面 によれば次のような蛋白質組成が得られる。すなわち、この組成はｈ　ｕ　−Ｍ 　ＩＰ−２βポリペプチドを含んでおり、人間の組織を本質的に含んでおらず、 また、人間の他の蛋白質を好適には実質的に含まない。

別の局面において、この発明は、ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドをコード化す る他種族から領域を含む、デオキシリボ核酸分子を提供する。

また別の局面において、本発明は、ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドをコード化 する異種領域を含む、デオキシリボ核酸分子で変換された細胞からなる組換え型 プロダクシヨン・システムを提供する。

この発明は、さらにｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドに対して反応性をもつ抗体 を提供する。さらに、発明の別の局面においては、組織または体液中のｈｕ−Ｍ ＩＰ−２９を決定するための免疫検定法、および生体試料中のｈｕ−ＭＩＰ−２ ８のためのポリヌクレオチド配列コーディングを検出するための核酸プローブ方 法に関する。

発明の別の局面としては、ｈｕ−ＭＩＰ−２βレセプタと相互に作用し、反発的 活性あるいは相反する活性を有するポリペプチド、および小さな有機分子を提供 する。

また、発明の別の局面としては、同族の多重遺伝子ファミリーのメンバーのうち のいかなるものへの、反発的活性を示す、ｈｕ−ＶＩＰ−２βポリペプチドを提 供する。

さらに、発明は、効果的量のｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドを投与することに よって、傷を治癒する方法、骨髄造血を調節する方法および補助薬活性を引起す 方法を提供することを目的とする。

この発明は、さらに、悪性腫瘍、自己免疫的疾病および炎症性疾病を治療する方 法を提供する。この場合、炎症性疾病は、乾廖を含む病的好中性浸潤、リウマチ 状関節炎、および肺の病気などを含むものである。治療は、同族多重遺伝子ファ ミリーのメンバーに対して相反する活性をもつ適量のｈｕ−ＭＩＰ−２βまたは ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドを投与することによって行なう。本発明によっ て提供されるデオキシリボ核酸配列および組換え型システムを利用することによ って次のことが可能になる。すなわち、組換えシステムにおいてただ一つのヒト 蛋白質が表現されているので、他のヒト蛋白質を実質的に含まないｍＭＩＰ〜２ のヒト同族体のうちの一方を大量に製造することが可能である。このような組成 物は、自然物から精製することによって得ることは困難である。

図面の簡単な説明 図４．ハッカ不ズミのＶＩＰ−２のヌクレオチド配列および予測蛋白質配列を示 す。

図２．ｈｕ−ＶＩＰ−２αの、ヌクレオチド配列および予測された蛋白質配列を 示す。

図３．ｈｕ−ＭＩＰ−２βのヌクレオチド配列および予測された蛋白質配列を示 す。

図４．ＭＩＰ−２同族体のヌクレオチド配列同族関係を示す。相補ＤＮＡ　（Ａ ）、コーディング領域（Ｂ）および未翻訳領域（Ｃ）における、ｍＭＩＰ−２、 とｈｕ　ＭＩＰ　２ａ、ｈｕ−ＭＩＰ−２β、ｈｕ−ｇｒｏ／ＭＧＳＡ、および ハッカネズミのＫＣ間のヌクレオチド配列一致の確率を示す。

図５．ＭＩＰ−２同族体とヒトＩＬ−８との、アミノ酸同族関係、および配列を 示す、　（Ａ）ヒトＩ　Ｌ−８並びに同様にＭＩＰ−２同族体の予測アミノ酸配 列間の一致確率を示す、　（Ｂ）提携したアミノ酸配列を示す。

図６．ＢａｍＨ１、’Ｂ’　、ＥｃｏＲｌ、°Ｅ′あるいはＥｃｏＲＶ、　′Ｒ ゛で消化された、ハツカネズミおよび人間のＭＴＰ−２相補ＤＮＡを持つゲノミ ックデオキシリボ核酸のサザン分析を示す、（Ａ）ｍＭＩＰ−２相補ＤＮＡで雑 種形成されたハツカネズミデオキシリポ核酸を示す。制限されたヒトデオキシリ ボ核酸のプロットは、まず、標識されたｈｕ−ＭＩＰ−２β相補ＤＮＡ　（Ｃ） によって雑種形成さ娠次いでフィルタが標識されたｈｕ−ＭＩＰ−２α相補ＤＮ Ａ（Ｂ）でストリップされ再雑種形成された。

詳細な説明 もし他に示されていない限り、本発明の実施は、従来の分子生物学、細菌学、そ して従来の技術の範囲にある組換え型デオキシリボ核酸技術を使用する。このよ うな技術は、以下の文献に完全に説明されている。たとえばマニアナイス、フリ ッシュ、サムプルツク（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆　Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ）著「分子クローン化ニラボラトリーマニュアル；」「デオキシリボ核酸 クローン化：実際的なアプローチ」巻１．　ｎ　：　（Ｄ、　Ｎ、グラバ−編、 １９８５年、）「オリゴヌクレオチド合成Ｊ　（Ｍ、Ｊ、ゲイトＷ、１９８４年 、）；「核酸ハイブリッド形成法」（Ｂ、Ｄ、ヘイムズ＆Ｓ、Ｊ、ヒギンズ編、 １９８５年）「転写と翻訳」（Ｂ。

Ｄ、ヘイムズ＆Ｓ、Ｊ、ヒギンズ編、１０８４年）「動物細胞培養Ｊ　（Ｒ，Ｉ 。

フレンシュニイ編、１９８６年）「固定化細胞および酵素Ｊ　（ＩＲＬプレス、 １９８６年）；Ｂ、パーパル［分子クローン化への実際的手引きＪ　（１９８４ 年）を参照せよ。

本発明を説明するさいに、以下の技術用語は下記に示す定義に従って使用される 。

ｒレプリコン」は、生体内でのデオキシリボ核酸復製の自律単位として４ｓｌ能 する、つまり、それ自身の統制の下で復製が可能な遺伝因子の要素（たとえばプ ラスミド、染色体、ウィルス）である。

ｒベクター」はプラスミド、ファージあるいはコスミドなどのレプリコンであり 、これに別のデオキシリボ核酸断片が付けられ、その付けられた断片の復製を引 起すようにしてもよいようなりプリコンである。

「二重鎖のデオキシリボ核酸分子」は、その正常、二重鎖の耳輪でのデオキシリ ボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンあるいはシトシン）のポリマー形 を言及している。この技術用語は分子の第一次および第２次の構造を言及してい るだけであり、特別な第三次形に限定していない、したがって、この用語は、と りわけ、線形デオキシリボ核酸分子（たとえば制限フラグメント）、ウィルス、 プラスミドおよび染色体の中にみられる二重鎖のデオキシリポ核酸を含んでいる 。

特別の二重鎖のデオキシリボ核酸分子の構造を述べるさいに、連鎖は、デオキシ リボ核酸の非転写ストランド（つまりメツセンジャＲＮＡへの配列相同を有する ストランド）にそって５′末端から３′末端の方向にだけ配列する通常の規定に 従って本文で記述説明されてもよい。

デオキシリポ核酸「コーディング配列」は適切な調節範囲配列統制の下に置かれ た時、生体内ポリペプチドに転記され翻訳される、デオキシリボ核酸配列である 。コーディグ配列の境界は５′　（アミノ）末端でスタートコードンにより、ま た３′　（カルボキシ）末端で翻訳ストップコードンにより決定される。コーデ ィング連鎖は、原核連鎖、真核性メツセンジャＲＮＡからの相補ＤＮＡ、真核性 （たとえば乳類）デオキシリポ核酸からのゲノミックデオキシリボ核酸連鎖、お よび合成デオキシリボ核酸配列を含んでもよいが、これに限定されない、ポリア ゾニレ−シロン信号および転写終結配列は、コーディング配列の３′末端に通常 位置する。

「プロモータ配列」は細胞内のりボ核酸ポリメラーゼを結合することができ、下 ２ｉｔ（３’末端の方向）コープインク配列の転写を開始することができる、デ オキシリボ＄ＪＪ調節領域である０本発明を定義する目的で、プロモータ配列は 、３′末端でコーディング配列の翻訳スタートコードンにより限定さ娠上流５′ 末端方向に広がり、バックグラウンド上方で検出可能なレベルで転写を開始する のに必要な最低限の数の塩基か元素を含んでいる。プロモータ配列内で、リボ核 酸ポリメラーゼの結合の原因となる蛋白質結合定義領域（コンセンサス配列）と 共に、転写開始サイト（ヌクレアーゼＳ１と並べるこｔにより便利に定義された ンが見られる。真核性プロモータは、常にではないがしばしばｒＴＡＴＡ、箱、 およびｒＣＡＴＪ箱を含有している。原核性プロモータは、−１０および−３５ のコンセンサス配列に加えてシャインーデルガルノ配列を含有している。

プロモーター配列を結合するリボ核酸ポリメラーゼが、コーディング配列をメツ センジャＲＮＡに転写して、そのメンセンジャＲＮＡをコーディング配列によっ てコード化された蛋白質に順番に翻訳するとき、コーディング配列は、細胞内の プロモータ配列の「統制の下」にあるという。

外因性デオキシリボ核酸が細胞壁内に導入されたとき、細胞はそのような外因性 デオキシリボ核酸によって「転換された」。外因性デオキシリボ核酸は、細胞の ゲノムをつくっている染色体デオキシリボ核酸に組み込ませられるかもしれない し組み込ませられないかもしれない（連係された共有結合）。たとえば、原核住 物とイーストで、外因性デオキシリボ核酸は、プラスミドのようなエビソーム元 素上に維持されるかもしれない。真核性細胞に関して、安定して転換された細胞 は、外因性デオキシリボ核酸が、それが染色体復製を介して娘細胞によって遺伝 するように、染色体に組み込まれたような細胞である。この安定度は、外因性デ オキシリボ核酸を含有している娘細胞の集団で構成された、細胞系あるいはクロ ーンを株化する真核性細胞の能力によって実証される。「クローン」は、有基核 分裂による単一細胞あるいは共通の先祖から引き出された細胞の集団である。

「細胞系」は、多くの世代にわたって試験管内で安定した成長ができる一次細胞 クローンである。

ヌクレオチドの少なくとも約８５％（好ましくは少なくとも約９０％、最も望ま しくは約９５％）が、デオキシリポ核酸配列の定義された長さとマツチするとき 、２つのデオキシリポ核酸配列は「実質的に相同である」。実質的に相同である 配列は、例えば特にそのシステムに定義されるような厳格な条件のもとての南の ハイブリッド形成性実験で識別することができる。適切なハイブリッド形成法条 性を定義することは、従来の技術内にある。たとえばマニアナイスなど、上記； デオキシリボ核酸クローン化、巻■および■上記：核酸ハイブリッド形成法、上 記。

デオキシリボ核酸構成子の「異Ｗｉｎ域あるいはドメインは、実在するより大規 模な分子と関連しては見られない、より大規模なデオキシリボ核酸分子内で見分 けられるデオキシリポ核酸の断片である。したがって、異種領域がは乳類の遺伝 子をコード化した場合、遺伝子は、源有機体のゲノム内では乳類デノミンクデオ キシリボ核酸の側面にないデオキシリポ核酸によって通常側面にある。「異種」 領域のもうひとつの例は、コーディング配列自体が実在しない構造である（たと えば、ゲノミックコーディング配列がイントロンを含有している相補ＤＮＡ、あ るいは在来の遺伝子以外の種々のコードンを持っている合成の配列）。対立的変 動あるいは当然体しる突然変異性事象は、ここに定義されたようなデオキシリポ 核酸の異種領域の原因とはならない。

技術用語“′検体ポリヌクレオチド”、および“検体ストランド”は、ターゲン ト配列を含有していると考えられている、また生物サンプルに存在するであろう 、単−鎮、または二重鎖の核酸分子に関連する。

本文で使用されているように、技術用語“プローブとは、標的領域内に配列を持 つプローブ中に少なくとも１つ配列相補性のために、標的配列をもつ雑種構造を 形成するポリヌクレオチドで構成された構造を指す。プローブのポリヌクレオチ ド領域は、デオキシリポ核酸、及び／またはリボ核酸及び／または合成のヌクレ オチド同族体類から構成されていてもよい。

本文で使用されているように、技術用語”槓的饋域”とは、増幅されかつ／また は検出される核酸領域を指す。技術用語″標的配列”とは、プローブあるいはプ ライマーが所望の条件の下で安定した雑種を形成する配列を指す。

本文で使用されているように、技術用語“標的ポリヌクレオチド配列”とは、標 的ヌクレオチド配列に相補性ヌクレオチドで構成される、ポリヌクレオチド配列 を指す。この配列は、意図された目的のために十分な安定度を持っている二重鎖 を形成する、標的配列を持つ、十分な長さと相補性のあるものである。

本文で使用されているように、技術用語”結合相手”とは、例えば、このために 特異的に働く抗原および抗体のような、リガンド分子に高い特異性を結合するで きる分子を指す、一般的には、特異的な結合相手は、分離条件の下で検体（ある いは、補足プローブの場合には、コピー／相補性ストランド二重鎖）を動かない ようにするために、十分な親和力をもって結合しなければならない、特異的な結 合相手は、当業者に公知であり、たとえば、ビチオンおよびアビジン、あるいは ストレプトアビジン、免疫グロブリンＧおよびタンパク質Ａ、多数の既知のレセ プタリガンド対、及び相補性ポリヌクレオチドストランドを含んでいる。相補性 ポリヌクレオチド結合相手の場合には、相手が、少なくとも長さが約１５の基で あるのが通常であり、最小長さが４０基であってもよい：さらに、それらは、少 な（とも約４０％から約６０％のグアニンとチトシンの内容物を一般に有してい る。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸、リボ核酸あるいは合成のヌクレオ チド同族体類から構成されてもよい。

本文で使用されているように、技術用語「連結された」とは、共有ボンドによる 、あるいは強い非共有ボンド相互作用（例えば疎水性の相互作用、水素結合など ）での連結を指す。共有ボンドとは、例えば、エステル、エーテル、フォスフオ ニステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄ボンド、炭素リンボンドおよ び同種のものであってもよい。

技術用語゛′担体“とは、所望の結合相手を連結することができる任意の固体あ るいは半固体表面を指す、適切な担体としては、ガラス、プラスチック、金属、 ポリマーゲルおよび同種のものが含まれまたビード、ウェル、ディノブスティノ ク、皮膜および同種のもの形をとっていてもよい。

本文で使用されるような技術用語“ラベル°°とは、検出可能な（好適には数量 化可能な）信号を提供するために、使用することができ、それは結合したポリヌ クレオチドあるいはポリペプチドでありうる、任意の原子あるいは成分を指す。

本文で使用されているように、技術用語“ラベルプローブとは、検体ポリヌクレ オチド中に検出される標的配列に相補性、標的ポリヌクレオチド配列が含まれて いるポリヌクレオチドを指す。この相補性領域は、ラベルによって検出される° °ラベルプローブおよび“標的配列”で構成される二重鎖を提供する、標的配列 に対して、十分な長さ、および相補性をもつものである。それは、互いに対して 高い特異性を持つ１セツトのりガン分子によってラベルに直接あるいは間接的に 、連結している。高い特異性をもつセットのりガント分子は、スプラ（“結合相 手”を参照）と記述される。

本文で使用されているように、“生体試料”とは、個人から分離された組織ある いは体液の試料を指し、以下に例示のものに限定されるわけではないが、例えば 、血漿、血清、を椎体液、リンパ液体液、皮膚の外部切片、呼吸器官、器官、お よび尿生殖路、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、組織および試験管中の細胞培養成分 の試料をも含む、（この試験管中の細胞培養成分には、限定されるわけではない が、細胞培地における細胞成長から生じる調製培地、推定上にウィルスに惑染し ている細胞、組換え型細胞、および細胞成分類がふくまれる）。

“ヒト組織“とは、固体を構成していてもよい細胞の集合体である。この技術用 語はまた、血球のようなヒト細胞、あるいはヒト細胞株の懸濁液を含む。

選択成分Ａを含む成分は、成分Ａが、成分ＡとＢを組合わせた重量の、少なくと も約７５％でできている場合、別の成分Ｂに「本質的に冒されていない」。そし て、好適には、選択成分Ａは、組合わせ重量の約９０％含むことが望ましく、最 も好適には、組合わせ重量の約９９％を含むことが望ましい０選択された生物学 上活性タンパクｉｔ（それは本質的に汚染タンパク質に冒されていない）を含む 成分の場合には、関心のあるタンパク質の活性を持っている成分が単一分子量（ つまり“均質”成分）をもつ種を含有することが、時として要望される。

２つのアミノ酸配列は、少なくともアミノ酸の約９０％が、好適には、少なくと も約９２％、より好適には少なくとも約９５％が、アミノ酸配列の定義された長 さにマツチする場合、本質的に同族である。

マウスＭＩＰ−２のヒト同族体 マウスＭＵ’−２に対する相補ＤＮＡは、浄化されたタンパク質上で決定された Ｎ−末端アミノ酸配列の部分に対応する、退化したオリゴヌクレオチドプローブ プールを使用して、クローン化された。マウスのＭＩＰ−２相補ＤＮＡのコーデ ィング領域を表現する、ヌクレオチドプローグが、リボ多Ｗ（例２を参照）２で 刺激された、ヒト大食細胞細胞株から相補ライブラリを打診するために、使用さ れた時、種々の候補相補ＤＮＡ配列が識別された。これらの２つの相補ＤＮＡ配 列によってコード化されたタンパク質はそれぞれヒト−ＭＩＰ−２αおよびヒ） −ＭＩＰ−２βと指定された。これら３つのタンパク質の核酸およびアミノ酸配 列の例が図に示される：第１図＝マウスのＭｌ−２、図２−人間ＭＩＰ−２α、 図３＝人間ＭＩＰ−２β。

“ヒトマクロファージ炎症性タンパク譬２βポリペプチド”　（ヒトーＭＩＰ− ２βポリペプチド）は、ヒト−ＭＴＰ−２βおよびヒト−ＭＩ　Ｐ−２β同族体 類を包含する。

゛ヒトーＭＩＰ−２β”とは、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質２βであり 、自然に生じる、リボ多糖に刺激されたマクロファージによって、他のものと一 緒に分泌される成熟したヒトタンパク質であって、さらにヒト−ＭＩＰ−２βの 、前駆体類すべておよび対立的な変種すべてを包含し、生体内での一貫しない処 理から生ずることがある、不均質分子量の形も同様に含むものである。ヒトーＭ ＩＰ−２β配列の例は図２に示される。

“°ヒトーＭＩ　Ｐ−２β同族体類”とはつぎのちのを含んでいるペプチドの属 である： Ｉ）゛ヒトーＭＩＰ−２β突然変異タンパク質”　（それらはヒト−ＭＩＰ−２ βに本質的に同族のポリペプチドである）、好適には、“突然変異タンパク質” のアミノ酸配列は、８あるいはより少数のアミノ酸残留物、好適には、７あるい はより少数の残留物、より好適には約５あるいはより少数の残留物：そして、最 も好適には、約２あるいはより少数の残留物によって、ヒト−ＭＩ　Ｐ−２βの それと異なる。２つのタンパク質のアミノ酸配列の任意の相違が保存的アミノ酸 置換物だけを含んでいることが、時々要望される。アミノ酸がそれが置換される アミノ酸および置換物がタンパク質のローカル、自局側コンホメーシヨンに対す る重要な結果を持っていないのと同し代価を本質的に持っている場合、保存的ア ミノ酸置換が発生する。二者択一的に言えば、活性を変更するシステムの除去あ るいはタンパク質の安定度のような変更が要望されてもよい。

２）“切断ヒト−ＶＩＰ−２８ペプチド”　（パヒト−ＭＩＰ−１β″あるいは 好適には保持する゛′ヒトーＭＩＰ〜２β突然変異タンパク質”のいずれか、す なわち、（ｉ）ヒト−ＭＩＰ−２β、（ｉｉ）ヒト−ＭＩＰ−２βにユニークな エピトープあるいは（由）ＭＩＰ−２活性にユニークなアミノ酸配列の断片を含 む。

３）“ヒトーＭＩＰ−２β融合タンパク質”　（これは異種ポリペプチドを含む ）は、任意の異種アミノ酸配列に融合させられた、上記のポリペプチド（ヒト− ＭＩ　Ｐ−２βおよびヒ）−ＭＩＰ−２β突然変異タンパク質あるいは切捨てら れたヒトーＭＩＰ−２Ｂペプチド）の１つでできている。好適には、このような 異種配列は、ヒ）−ＭＩＰ配列のＮ−末端終端へ融合させら娠直接分泌へのり− ダ配列を含む。

アミノ酸配列あるいは核酸配列であって、それらをコード化する“特異”ヒトー ＭｒＰ−２β配列は、ヒトーＭＩＰ−２βポリペプチド配列と同一の配列である が、これは、少なくとも１つのアミノ酸あるいはヌクレオチド残留物において、 ｈＭＧＳＡ、ヒト−ＭＩＰ−２ａ、ｍＭＩＰ−２およびマウスのＫＣの配列とは 異なり、好適には、ヒトゲノムにほかのところに見つけられない。同様に、それ がヒ）−ＭＩＰ−２βポリペプチド上に見つけられるが、同族の遺伝子ファミリ ーの任意のメンバー上には見つけられない場合、エピトープはヒトーＭＩＰ−２ βポリペプチドに対して“特異的である”。

−れるアミノ　の ｍＭＩＰ−２、ｈ　ｕ　−Ｍ　１．Ｐ−２ｃｒおよびｈｕＭＩＰ−２βのオーブ ン・リーディング・フレームは、それぞれ１００．１０７および１０７アミノ酸 からなるポリペプチドをコードしている。この３つのポリペプチドのそれぞれの 最初の約３０アミノ酸はシグナル配列の特性（Ｐｅｒｌｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、、 １９８３．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

１６７：３９１；ｗｏｎ）Ｉｅｉｊｎｅ、１９８４．Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１ ７３：２４３；ｖａｎＨｅｉｊｎｅ、１９８６．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　１４　：　４６８３　）を有している。ＬＰＳで活性化されたＲＡ Ｗ２６４．７細胞（Ｗｏｌｐｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９　）の制限培地か ら精製された分ｉｍＭＩＰ−２について決定されたＮ末端アミノ酸配列から、予 想されるアミノ酸配列中の成熟ｍＭＩＰ−２蛍白質の始点を決定することができ る。

ｈｕ−ＭＩＰ−２αおよびｈｕ−ＭＩＰ−２βについての予ゼ成熟ペプチド配列 の始点は、ｍＭＩＰ−２のものと整合しており、共通のシグナルペプチド切断部 位（Ｐｅｒｌｍａｎ、　ｅｔａｌ、１９８３　：ｖｏｎｔｌｅｉｊｎｅ、１９８ ４．　１９８６）を有している、これらの３つの蛋白質すべてについて、成熟ペ プチド配列の予想された長さは７３アミノ酸である。不ズミ類ＭＴＰ−２は塩基 性蛋白質であり、ヒトＭＩＰ−２ポリペプチドは、ｈｕ−ＭＩＰ−２ｔｒおよび ｈｕ−ＭＩＰ−２βの予想等電点がそれぞれ９．９および９．７であることに基 づき、同様に塩基性である。天然のまたは組み換え蛋白質は、０−グリコシド結 合＄１鎖を有していてもよい。これらの３つの予想ポリペプチドは、Ｎグリコシ ド結合の共通シグナル部位を有していない。

ネズミ　およびヒトＭＩＰ−２ｃＤＮＡのｍＭＩＰ−２、ｈ　ｕ　−Ｍ　Ｉ　Ｐ −２ｅｘおよびｈｕ−ＭＩＰ−２８のｃＤＮＡの塩基配列は、それぞれ１つのオ ーブン・リーディング・フレームをコードしている。

ｍＭＩＰ−２の開始ＡＴＧコドンのまわりの塩基配列は、高等真核生物の多くの ｒｒ＋ＲＮＡに見られる共通配列（にｏｚａｒｋ、１８８６．　Ｃｅ１１．４４ 　：２８３；Ｋｏｚａｒｋ。

１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　１５　：　８１２５　）を 形成している。ヒトＭＩＰ−２αおよびＭＩＰ−２βについては、−３位の高度 に保存されたプリン塩基が欠損しているが、−１、−２および一４位のＣ残基お よび＋４位のＣ残基を含む、共通配列の多くの特徴を有している。

ｍＭｒＰ−２の３′非翻訳領域については、＋７１９−７２４位に真核生物に共 通のポリＡ付加シグナルＡＡＴＡＡＡ　（Ｂｒｉｎｓｔｉｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、 、　１９８５．　Ｃｅ１ｌ。

４１：３４９）を有しており、その後に＋７３５塩基から始まるポリＡ鎖を有し ている。ｈｕ−ＭＩＰ−２βのｃＤＮＡのクローンｈｕ−ＶＩＰ−２−４ａある いはｈｕ−ＶＩＰ−２−７ｄ、またはｈ　ｕ　−Ｍ　Ｉ　Ｐ−２ｃｒのｃＤＮＡ クローンには、３′非翻訳領域にＡＡＴＡＡＡのポリＡ化シグナルが見いだされ なかった。

これは、ポリＡ鎖が存在しなかったことから、これらのクローンは欠失３′非翻 訳領域を存していたためであると考えられる。

多くのサイトカイン遺伝子の３′非翻訳領域に見いだされ（Ｃａｐｕｔ、　ｅｔ 　ａｌ、。

１９８６、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３　： １６７０）、ｍＲＮＡの安定性（Ｓｈａｍ、　ｅｔａｌ、、１９８６．　Ｃｅ１ １．４６　：６５９）および翻訳の効率（Ｋｒｕｙｓ。

ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ、８４　：　６０３０　：Ｈａｎ、　ｅＬａｌ、、、１９９０．　Ｊ、　Ｅ ｘｐ、　Ｍｅｄ、、１．７１　：　４６５）に関係する共通配列ＴＴＡＴＴＴＡ Ｔが、これらの３つのｃＤＮＡすべてに多コピー存在する。この配列は、ｍＭＩ 　Ｐ−２の３′非翻訳領域中の４つの位ｉｆ（＋１２２、＋１２６、＋１４２お よび＋１４６）に存在し、そのうち２つは重なっている。また、ヒトＭＩＰ−２ βおよびＭＩＰ−２αの３′非翻訳領域においては、それぞれ２コピー（＋１５ ８および＋４７１）および５コピー（＋１４８、＋１５２、＋１５６、＋１６０ および＋４９２、うち２つは重なっている）に存在する。

ネズミ　およびヒトＭＩＰ−２のホモロジー３つのＭＩＰ−２のｃＤＮＡ（不ズ ミ類４つおよびヒト２つ）の間で一致するＲｉｃｈｍｏｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、＋ 　１９８８　）および不ズミ類ＫＣのｃ　ＤＮＡ　（Ｏｑｕｅ＋＋ｄｏ、　ｅｔ 　ａｌ、。

１９８９　；　Ｃｏｃｈｒａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３、Ｃｅ１１．３３ 　：　９３９）とともに図４Ａに示す。ヒトｇ　ｒ　ｏ／ＭＧＳＡのｃＤＮＡは メラノーマ成長促進活性を有する蛋白質をコードしており　（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ 、　ｅｔ　ａｌ−＋　１９８６．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、＋　１ ２９：３７５）；不ズミ類ＫＣは血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を誘導しうる 遺伝子であって、不ズミ類における、ヒトＭＧＳＡの相同遺伝子であると推定さ れている。注目すべき点は、３つのヒトｃＤＮＡの間、特にｈＭＧｓＡとｈｕ− ＭＩＰ−２αに高度の塩基配列のホモロジーがあることである。図４Ｂに示され るように、コード領域において、３つのヒトの相同遺伝子の間にさらに強い塩基 配列の一致が見られる。ヒｌ−ＭＩＰ−２の相同遺伝子の３′非翻訳領域におけ る塩基配列の一致は、コード領域において見られる一致に比べてはるかに小さい 、ただし、ｈｕ−ＭＩＰ−２αとｈＭＧｓＡのそれぞれの領域は例外である。こ れらの２つのｃＤＮＡは、３′非翻訳領域の全体にわたり高い割合の塩基配列の ホモロジーを示している。

ＭＩＰ−２の相同遺伝子、すなわち、ｈｕ−Ｍ［’−２α、ｈｕ−ＭＩＰ−２β 、ヒトｇｒｏ／ＭＧＳＡ、ハムスターにおけるｇｒｏ／ＭＧＳＡの相同遺伝子（ ｈａ−ｇｒｏ）、ｍＭＩＰ−２およびｍＫｃの前駆体蛋白質のホモロジー比較お よび予想アミノ酸配列を図５（ＡおよびＢ）に示す、３つのヒト蛋白質は高いホ モロジーを有しているが（８７−９０％）、アミノ酸の相違は予想配列の全体に わたって見ら娠特に成熟蛍白質のカルボキン末端において多く見られる。予想ア ミノ酸配列のホモロジーのみに基づくと、ｈｕ−ＭＩＰ−２α、ｈｕ−ＭＩＰ− ２βまたはヒトｇｒｏ／ＭＧＳＡを、ｍＭＩＰ−２または不ズミ類ＫＣのヒト相 同遺伝子であるということはできない。

塩基配列の一致の割合は、ｈｕ−ＭＩＰ−２αとｈＭＧｓＡの間で最も高く、ｃ ＤＮＡの全領域にわたって高い一致を示している。ＬＰＳおよびフォルポルミリ スチルアセテート（ＰＭＡ）の双方で活性化した細胞から得られたポリＡ＋ＲＮ Ａを用いて調整したＵ９３７ｃＤＮＡライブラリーには、ｈｕ−ＭＴＰ−２αお よびｈｕ−ＭＩＰ−２βのいずれも存在することから、このライブラリーからｈ ＭＧｓＡのスクリーニングを試みた。ｈＭＣ，ＳＡに特異的な（かつ、ｈｕ−Ｍ Ｉ　Ｐ−２α／βに特異的でない）オリゴヌクレオチドを用いて増幅したのち、 ライブラリーから５Ｘ１０’のプラークをスクリーニングしたところ、ポジティ ブな信号は得られなかった。これに対し、５６個のｈｕ−ＭＩＰ−２αポジテイ ブな信号が検出された。このことは、ＰＭＡおよびＬＰＳで活性化したＵ９３７ 細胞においては、ｈｕ−ＭＩＰ−２α遺伝子の転写と比較して、ｇｒｏ／ＭＧＳ Ａの転写が誘導されていないことを示している。

祉土且ニス■活性 Ｌ　Ｐ　Ｓ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞の制限培地から精製された不ズミ類ＭＩ Ｐ−２は、ＣＦＵ−ＧＭに対するＣ３Ｆ依存性骨髄造血促進活性（Ｂｒｏｘｍｅ ｙｅｒ、ｅｔ　ａｌ、。

１９８９Ｌ皮下注射後の局所炎症反応の刺激、およびヒトＰＭＨに対する走化活 性の可能性（−〇ｌρｅ、ｅｔ　ａｌ、、１．９８９　＞等の多様な活性を有し ている。後者の活性１よヒトＩＬ−８（ｈｕ−ＩＬ−８）の特徴である。この機 能的同等性にのみ基づけば、ｍＭＩＰ−２は不ズミ類におけるｈｕ−［Ｌ８の相 同遺伝子であることが示唆される。しかし、ｍＭＩＰ−２とｈｕ−ＩＬ８のアミ ノ酸のホモロジーは、ｍＭＩＰ−２のｈｕ−ＭＩＰ−２ｃｔ、ｈｕ−ＭＩＰ−２ βまたはｈｕ−ＭＧＳＡ　（図５）、ｍＭＩＰ−２に対するホモロジーと比べて 低く、ｍＭＩ　Ｐ−２とｈｕ−ＩＬ８は不ズミ類／ヒトの相同遺伝子とは見えな い。サイトカイン間の機能の過剰は一般的ではない；カケクチン／　Ｔ　Ｎ　Ｆ 　−ａおよびインターロイキン１は重なり合う活性特性を有している（Ｍａｎｏ ｇｕｅ、ｅｔ　ａｌ−＋　１９８８．”Ｃｅ１ｌ−ｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ”　、　Ｐｏ５ ｔｅ、ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、{　Ｐｌｅｎｕｍ。

ＮＹ、ｐ、１２３）。

ＭＩＰ−２およびＩ　Ｌ−８はこの機能的冗長性のもうひとつの例であろう。

そのｃＤＮＡ配列に基づいて、ｈｕ−ＭＩＦ’−２βは、マウスＭＩＰ−２を含 むホモロガスな多重遺伝子族の一員として分類できる。この遺伝子族の一員は、 好中球活性化、好中球走化性、ＭＧＳＡ一様マイトジエン活性、繊維芽細胞マイ トジェン活性、Ｃ３Ｆコーフアクター活性、単球走化性、血管新生促進活性およ び炎症活性を含むｉｎ　ｖｉｙ印−生物活性を有する。Ｈｕ−ＭｒＰ−２βポリ ペプチドは、多重遺伝子族の任意の一員によって発現されたひとつまたはひとつ 以上の生物活性を有するものを選ぶことができる。Ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプ チドは骨髄造血の刺激のためにワクチン配合物中のアジュバントとして治療的に 、ならびに損傷治癒用に使用され得る。

Ｈｕ−ＭＩＰ−２β生物活性を−ｏｌｐｅら（１９８９）またはＢｒｏｘｖｎｅ ｙｅｒら（１９８９）（それぞれ参照としてここに編入される）により記載され たアッセイにより測定できる。好中球活性化または走化性などのＨｕ−ＭＩＰ− ２β活性に関する他のアッセイを、Ｗａｌｔｚら（１９８９）ム」狂２題虹、上 工立：　１７４５、Ｃ１ａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら（１９９１）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、３０：３１２８およびＤｅｒｎｙｃｋら（１９９０）　Ｂｉｏｃｈｅｗ、、２ ９　：１０２２５　（すべて参照によりここに編入された。）に記載されたよう にｉｎ　ｖｊｔｒｏ　測定できるｍ　ＤｅｒｎｙｃｋらはＭＧＳＡバイオアッセ イも記載する。Ｃ３Ｆコーフアクター活性に関するアッセイはＢｒｏｘｍｅｙｅ ｒら（１９９０）　、Ｂｌｏｏｄ、工６：１１１０およびＢｒｏ化ｅｙｅｒら（ １９８９）、ム」社ユ題虹、上ユＯ：１５８（両方とも参照によりここに編入さ れる）に記載されている。

個々のｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドは上記多重遺伝子族の任意の員のひとつ またはひとつ以上のアゴニストまたはアンタゴニストとして役立つ。上記の生物 活性アッセイ、およびＭＩＰ−２−多重遺伝子族に関するレセプターでのレセプ ター結合アッセイは、アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてｈｕ−ＶＩ 　Ｐ−２βポリペプチドをスクリーンするために使用される。アンタゴニスト活 性を現しているｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドはレセプターへの結合に関して 多重遺伝子族の所望する員と競合するであろうが、所望の員の生物活性を阻害も するであろう、アゴニスト活性を存するＨｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドは、増 大した生物活性または所望の多重遺伝子族に匹敵する活性を有するであろう、ア ゴニスト活性を有するｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドの中には、ツーファクタ ーとして働きもうひとつの多重遺伝子族の員の活性を増すものもある。他のｈｕ −ＭＩＦ’−２βポリペプチドは、異なる多重遺伝子族の員からのふたつまたは それ以上の非−重複活性を現す。Ｈｕ−ＶＩＰ−２βポリペプチドの中には、例 えば好中球活性化を阻害し、単球活性化活性を増大するひとつのポリペプチドの ようにひとつの活性に対してはアゴニストとして働き、もうひとつの活性に対し てはアンタゴニストとして働くものもある。

治療として、アゴニスト活性を有するｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドは、他の 多重遺伝子族の員の治療的応用と同様にｈｕ−ＭＩＰ−２βと同し治療的応用に 可動である。アンタゴニストの活性を有するｈｕ−ＭＴＰ−２βポリペプチドは 悪性疾患を抑制し、乾田、リュウマチ関節炎および肺疾患を含む好中球の異常浸 潤のような炎症状態および自己免疫疾患を予防するであろう。

目的のｈｕ−ＶＩＰ−２βポリペプチドの組の例は、ＩＬ−８のレセプター結合 部位に結合するポリペプチドである。Ｈｕ−ＭｉＰ−２βはＩＬ−８とＩＬ−８ レセプターについて効果的に競合する。Ｉ　Ｌ−８のアゴニストであるｈｕ−Ｍ ＩＰ−２βポリペプチドは、レセプターに結合するＩ　Ｌ−８と三次元構造の同 し部分を有するのであるろう、ｒＬ−８に関するＮＭＲおよびＸ−線構造の最近 の研究はレセプター結合部位の決定に可動である。　（Ｃ１ｏｒｅら、１９８９ ．　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ｓ、　２６４　：１８９０７　；Ｃ１ｏｒｅら、１９９０．　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、、２９　：１６８９：　Ｃ１ｏｒｅら、１９９１．Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ ｌ、２上ユニ６１１およびＢａｌｄｗｉｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、８旦：５０２）。

造血細胞の骨髄造血の刺激のために“有効量”のＨｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチ ド量は、骨髄造血において検出され得る増加を作る量である（例えばＢｒｏｘｏ ＋ｅｙ−ｅｒら、１９８９のアッセイを参照）そのようなポリペプチドの他の活 性に関するｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドの有効量は、上記したような適当な アッセイにおいて検出し得る応答を作る量である。

ｈｕ＝ＭＩＰ−２る　のＷ 実質的に他のヒトタンパク質を含まないｈｕ−ＭＴＰ−２βポリペプチドを含有 する組成物は天然源から精製することにより、化学合成によりまたは組み替えＤ ＮＡ法により調製できる。天然に生産されたｈｕ−ＭＩＰ−２βの粗抽出物は、 天然タンパク質の任意の便利な資源から調製できる。好ましい源はＬＰＳに刺激 されたヒトマクロファージ細胞系である。ｈｕ−ＭＩＰ−２βを含有する無細胞 系抽出物は、例えば以下の免疫アッセイで決定されるが、さらなる精製の開始物 質として役立つ、この精製は、タンパク質精製技術において周知である技術に従 って達成できる０例えば、種々のタイプのクロマトグラフィーを使用できる。使 用できるカラムは、ゲル濾過カラムと同様にＤＥＡＥセルロースカラム、または 陰イオン交換カラムである。好ましい精製法は、Ｗｏｌｐｅら（１９８９）の教 示に従う。この精製工程を以下に記載する、Ｗｏｌｐｅ　（１９８９）またはＢ ｒｏｘｍｅｙａｒら（１９８９）による免疫アッセイまたはＭＩＰ−２活性アツ セイにより監督することができ、これらは参照によりここに編入される。

Ｈｕ−ＭＴＰ−２βまたはそのペプチド断片は、免疫アフィニティー技術を使用 しても精製できる０本発明のタンパク質を精製するための本発明の抗体の使用は 、これらのほとんど同じようなタンパク質から良好な分離をもたらす。もちろん 、当業者には精製の他の技術も知られ、本発明のペプチドを精製するために使用 できる。

他の方法として本発明のｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドを化学合成によって調 製できる０例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔ工ｖｏ１．８５．ｐｐ、２１４９ −２１５４．１９６８）を使用できる。

適当な組織／液体供給源からｈｕ−ＭＩＰ−２βを精製することが可能である； しかしながら、化学的に合成でき又はいくつかの方法の一つで単離できる。ｈｕ −ＭＩＰ−２βコ一ドＤＮＡ配列から組換え法で製造することが好ましい６合成 すべきＤＮＡ配列は、ｈｕ−ＭＩＰ２βアミノ酸配列の適当なコドンを用いて設 計することができる。一般に、該配列を発現用に用いるのであれば、意図する宿 主のために好ましいコドンが選択されるであろう、完全な配列は、標準的方法で 調製されそして完全コード配列に集成される、重複オリゴヌクレオチドから集成 される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９２ニア５６；Ｎａｍ ｂａｉｒら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９；ジェイ（Ｊａｙ ）ら、（１９８４）Ｊ。

Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｗヨ　、λ５９：６３１１を参照されたい。単離方法はその 一部を、適当なオリゴヌクレオチドプローブを用いた核酸のハイブリダイゼーシ ョンに依存する。そのようなプローブは、本明細書に開示されているＤＮＡまた はアミノ酸配列に基づいて合成反応で構築可能であり、或いはこれも本明細書に 記載されているゲノムもしくはＤＮＡクローンから単離可能である。

−イブラリ−のを　１１ オリゴヌクレオチドプローブ及びＤＮＡライブラリーの調製のための基本的戦略 、並びに該ライブラリーを核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングす る基本的戦略は、当業者に周知である。例えば、ＤＮＡクローニング（ＤＮＡＣ ｌａｎｉｎｇ　）第１　ｊｅ　（Ｄ、　Ｐ、　（：Ａｏｖｅｒｍ、１９８５　） 　；核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉ ｚａｔｉｏｎ）　（Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅｓ　＆　Ｓ、Ｊ、ｔｌｉｇｇｉｎｓ　ｊＬ 　１　９　８@５　）； オリゴヌクレオチドの合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓ ｉｓ）　（Ｍ、　Ｊ、　Ｇａｔｅｄ、１９８４　）　；　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉ ｓら、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ） 　（１９８２）　；　Ｂ、　Ｐｅｒｂ−ａｌ、ア・プラクティカルガイド・ツー ・モレキュラー・クローニング（＾Ｐｒａｃｔ−４ｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　丁ｏ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（１９８４）を参照されたい。先ず、Ｄ ＮＡライブラＩＪ−を調製する。ライブラリーはヒト起源のゲノムＤＮＡライブ ラリーであってよい。ヒトのゲノムライブラリーは、この分野で知られている。

例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、　（１９７８）Ｃｅ１１．　１５：６８７　’７ ０１；Ｅ、ａｗｎら、　（１９７Ｂ）咄、上５　：　１１’５７−１１７４を参 照されたい。より好ましいのは、逆転写反応によりポリ−Ａ　ＲＮＡ　（ｍＲＮ Ａ）から調製されたｃＤＮＡからなるＤＮＡライブラリーである。例えば米国特 許４．４４６．３２５；４．４４０．８５９：４．４４３．１４０；４．４３１ ．７４０．４，３７０，４１７；４，３６３．８７７を参照されたい。ｍ　ＲＮ 　Ａは、マクロファージ細胞ラインの様なｈｕ−Ｍ１’　Ｐ−２βを発現すると 信しられる細胞ラインまたは組織から単離される。ｃＤＮＡライブラリー構築の ための適当なｍＲＮＡｆｉは、Ｕ９３７細胞ラインである。

ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡはライブラリーの構築に適するベクターにクローニ ングされる。好ましいベクターはハクテリオファージヘクター、例えば任意のラ ムダファージである。適当なライブラリーの構築は当業者の技術範囲内である。

例えばＢ、　Ｐｅｒｂａｌ　（前記）を参照されたい。

核酸１三二１Ω調製 ライブラリーが構築できたら、オリゴヌクレオチドを用いてこのライブラリーを プローブ処理し、ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドをコードする配列を担うセグ メントを突き止める。一般にプローブは、好ましくは公知の核酸配列もしくはｃ ＤＮＡクローンからの推定アミノ酸配列に基づいて化学合成される。

或いは、ｍＲＮＡ用に良好な組織源不存在においては、タンパク質由来の配列を 得ることが必要になることがある。Ｎ末端の配列は、Ｎ末端配列分析によって得 ることができる。内部配列の決定は、例えば、通常の方法で精製されたタンパク 質のスタフ（Ｓｔａｐｈ）　Ｖ　８タンパク質加水分解に続いて、消化産物の還 元的アルキル化および高速液体クロマトグラ２イーによる分離によって行うこと ができる。次に、分離した酵素断片に対応する溶離ピークは標準法によって配列 順序決定することができる。そのアミノ酸配列から、オリゴヌクレオチドを、ハ イブリダイゼーシタンブローブとして用いてゲノムＤＮＡのｃＤＮＡ配列かまた はエキソンの位置を決定するように設計し且つ製造することができる。最終的に 、単離されたエキソンを、成熟タンパク質をコードしている核酸配列に対してそ れらが対応するように互いに連結させる。

ヌクレオチド配列を選択して、アミノ酸配列をコードするコドンに対応するよう にする。遺伝暗号は重複しているので、通常、タンパク質の特定の領域をコード する全部または相応の数の可能なヌクレオチド配列を包含する数種類のオリゴヌ クレオチドを合成する必要がある。したがって、一定領域の配列を選択してそれ に基づいたプローブにする場合、その領域はコドンが高度に縮重しているアミノ 酸を含まないのが概して好ましい、しかしながら、ヒトには希にしか用いられな い（ライブラリーを製造する）コドン含有プローブを製造する必要はない。

更に、抗体は、選択された組織、細胞抽出物または体液中に存在する何等かの望 ましいタンパク質を免疫沈降させるのに用いることができる０次にこの源由来の 精製されたＭＩＰ−２は、前記に記載の特定のプローブを設計するための基準と して配列決定し且つ用いることができる。

当業者は、対応する核酸配列において高度に重複性を有するであろうアミノ酸配 列のかなり長いおよび／または包含領域であるプローブを製造することが望まし いことを理解することができる。完全な遺伝子または遺伝子の実質的部分を包含 するプローブは、更に相同性の予想された程度ゆえに適当であることができる。

配列は種糸列にわたって高度に保存され、そしてマウスなどの別の種由来のコー ド配列を含むプローブを容易に用いて、ヒトＤＮＡから製造されたライブラリー をスクリーンすることができる。他の場合において、それぞれが遺伝子の異なる 領域に対する二組のプローブを同時に用いるのが望ましいことがある。用いられ た任意のプローブの正確な長さは臨界的ではないが、典型的なプローブ配列の長 さは１０００ヌクレオチド以下であり、更に典型的には、それらは２５０ヌクレ オチド以下であり；それらは１００ヌクレオチド以下であってよいし、更に、７ ５ヌクレオチド以下の長さであってよい、概して、当該技術分野において、約１ ４〜約２０塩基対のプローブが通常有効であると確認される。ｈｕ−ＭＩＰ−２ βは極めて相同のタンパク質の群に属するので、ｈｕ−ＭＩＰ−２βに特有の配 列を含むプローブは、関連配列間の識別に好適である。一層長い配列は、関連標 的配列を識別できるように十分に異なる特有のポリヌクレオチド領域を包含する のに必要であることがある。この理由のために、プローブの長さは約１０〜約１ ００ヌクレオチドであるのが好ましく、更に好ましくは、約２０〜約５０ヌクレ オチドである。

プローブ　いるクローンの゛ 当該技術分野で知られているように、オリゴヌクレオチドプローブを標準法を用 いる放射性ヌクレオチドまたはビオチンなどのマーカーで標識する８次に、プロ ーブの標識されたセットを標準法にしたがって、ライブラリーから単離された５ ｓＤＮＡに対して一重鎖プローブをハイプリント形成させることから成るスクリ ーニング工程で用いる。緊縮かまたは許容ハイブリダイゼーション条件は、制限 されないが、プローブの長さ、プローブおよびライブラリーが同一種由来である か否かおよび種が進化的に近縁か遠隔かどうかを含むいくつかの因子に応して適 当であることができる。相同配列が単離され且つ検出可能な上記のバックグラウ ンドハイブリダイゼーションであるようにハイブリダイゼーション条件を最適に することは当該技術の範囲内である。基本的要件は、ハイブリダイゼーション条 件が、選択的ハイブリダイゼーションを生じるような十分なＴｉ１ｉ縮から成る 、すなわち、非特異的結合とは反対に、ハイブリダイゼーションが最小の程度の 核酸相同性（例えば、少なくとも約７５％）に依存するまたはハイブリダイゼー ションが一層低い程度の相同性に依存するということである。概して、「核酸ハ イブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　［Ｉｙｂｒｉｄｉｚａｔｆ ｏｎ）　Ｊ　、上記、を参照されたい。

ｍＭｒＰ−２と近い関係にある配列数ゆえに、特有のプローブ配列および緊縮ハ イブリダイゼーション条件双方が好ましい、スクリーンされたライブラリーから のクローンが正のハイブリダイゼーションによっていったん確認されたら、それ を更に、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって特徴化して、特定のクロー ンが望ましいタンパク質のコード配列を含むことを確証することができる。

ゲノＪ弓すセニＺ 部分ゲノムクローンは、いくつかの技法の一つによって完全なりローンに延長す ることができる。クローンを３′かまたは３′方向で「染色体歩行」技法を用い て延長して、完全な遺伝子コード領域の包含を確実にすることができる０次に、 これらのクローンの制限断片を、例えば、望ましいタンパク質をコードしている ｃＤＮＡを用いて精査することができる。これらのエキソン中に十分な相同性が 存在する場合、他のエキソンは同一のｃＤＮＡクローンで確認することができる 。

ゲノムクローンの他のコード領域は、現在のＭ１３−ジデオキシ配列決定法を用 いるクローン化されたエキソンのＤＮＡ下流の直接配列決定によって速やかに確 認することができる０次に、配列を３種類の読み枠金部において点検して読み取 り枠を明らかにする。更に、他のエキソンは、それらがイントロン−スプライシ ングシグナルによって両側に結合するものであり且つ異なる種由来のＭＩＰ−２ ’ｓに共通するアミノ酸をコードしなければならないので明らかである。

更に具体的に、ｈｕ−ＭＩＰ２βの少なくとも一つのエキソンに対する正しい遺 伝子コード配列が分かったら、それを用いて、下記の手段の１種類以上によって 酵素の完全なタンパク質コード領域を得ることができる。最初に、望ましい配列 断片をクローンから削除し且つ一層好都合なベクター、例えば、ＰＢＲ３２２に 入れて、断片自体のみを含む多量のＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブと して得且つ用いることができるようにすることができる。或いは、コード領域の 特有のＮ域に対応するオリゴヌクレオチドを合成することができる。双方ともゲ ノムＤＮＡライブラリーのためのハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いる ことができる。

ｃＤＮＡクローン 遺伝子の最長の挿入断片を含む哺乳動物ゲノムクローン（部分または完全な長さ ）は、ネオマイシンおよびメタロチオネイン耐性遺伝子などのマーカーを含むプ ラスミドＤＮＡと一緒にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に同時ト ランスフェクトすることができる。抗生物質Ｇ４１８およびＣｄ”の存在下で選 択された生存細胞を、タンパク質をコードする配列に対してハイブリッド形成す るＲＮＡ転写物の存在に間して、抽出されたＲＮＡのノーザンブロントによって 分析することができる。次に、望ましい転写物を含むクローンを、ｃ　ＤＮＡラ イブラリー構築のためのｍＲＮＡ源として用いることができる。或いは、種々の 源、例えば、腹腔細胞および膿汁、内皮組織並びに末梢液口血球、リンパ球およ び大食細胞から得られたｍＲＮＡのノーザンプロットを、プローブに対するハイ ブリダイゼーションに間して試験することができる。更に、種々の細胞系、例え ば、ＬＰＳに刺激されたＵ９３７およびＨＬ６０からのｍＲＮＡを試験すること もできる１次に、検出可能な濃度のハイブリッド形成ｍＲＮＡを含む任意の組織 または細胞源を用いて、望ましいタンパク質をコードする完全な長さのｃＤＮＡ を検出するために同一のプローブでスクリーンされるｃＤＮＡライブラリーを製 造する。

亡の抗り来　・　逢 上述のように、ＭＩＰ−２をコードするＤＮＡは、クローン化よりもむしろ合成 によって製造することができる。合成りＮＡ配列は、ｈｕ−ＭＩＰ−２β類似体 、特に、「突然変異タンパク質」を発現する遺伝子の好都合な構築を可能にする 。或いは、突然変異タンパク質をコードするＤＮＡは、本来のＭＩＰ−２遺伝子 またはｃＤＮＡｓの特定部位の突然変異誘発によって製造することができるし、 突然変異タンパク質は、慣用的なポリペプチド合成法を直接用いて製造すること ができる。

特定部位の突然変異誘発は、望ましい突然変異を示す有限誤対合を除いて、突然 変異させる配列を含む一重鎖ファージＤＮＡに相補的なプライマー合成オリゴヌ クレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応方法論によって実施するのが好ましい 、簡単には、合成オリゴヌクレオチドを、ファージに相補的な鎖の直接合成に対 するプライマーとして用い、そして得られた二重１ＪＤＮＡをファージ支持宿主 細菌中に形質転換させる。形質転換された細菌の培養物を上部寒天にプレートし 、ファージを含んでいる単一細胞からプラークを形成させる。理論的には、新規 のプラークの５０％が一重鎖として突然変異型を有するファージを含み；３０％ は元の配列を有する。得られたプラークを、正確な対合のハイブリダイゼーショ ンを可能にするが、元の鎖との誤対合がハイブリダイゼーションを妨げるのに十 分である温度でキナーゼ合成（ｋｉｎａｓｅｄ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ）プライマ ーとハイブリッド形成させる。次に、プローブとハイブリッド形成するプラーク を選択し、培養し、そしてＤＮＡを回収する。

のためのクローニング ｈｕ−ＭＩＰ−２βのためのコード配列を製造しまたは単離したら、それを任意 の適当なベクターまたはレプリコン中にクローン化し、それによって、Ｍｌ＝２ コード配列を含まないベクターを実質的に含まない（例えば、ライブラリーから の他のクローンを含まない）組成物中で維持することができる。多数のクローニ ングベクターが当業者に知られており、適当なりローニングベクターの選択は選 択の種類の問題である。クローニングのための組換え体ＤＮＡベクターおよびそ れらが形質転換することができる宿主細胞の例としては、種々のバタテリオファ ージラムダベクター（大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ））　、ｐＢＲ３２２（大腸菌） 、ｐＡｃＹｃ１７７　（大腸菌Ｌ　ｐｋＴ２３０　（グラム陰性細菌）、ｐＧＶ １１０６（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲｌ　（グラム陰性細菌）ｐＨＶ１４（ 大腸菌および枯草＠　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌｉｓ））、ｐＢＤ９ 　（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　、ｐ　ＩＪ６１　（ストレプトミセス属 （Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏ＊ｙｃｅｓ）　）、ｐＵＣ６（ストレプトミセス属）、ア クチノファージ、ｄｃ３１（ストレプトミセス属）、ＹＩｐ５（サツカロミセス 属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ＞）　、ＹＣｐ　１９　（サツカロミセス属） およびウシ乳頭腫ウィルス（＠乳動物細胞）がある、概して、ｒＤＮＡクローニ ング（Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｊ第■および■巻、上記；Ｔ、マニアティス（Ｍａｎ ｉａｔｉｓ）ら、上記；１３．ハーバル（Ｐｅｒｂａｌ）　、上記、を参照され たい。

本発明のＤＮＡ配列およびＤＮＡ分子は、広範囲の宿主／ベクター組合せを用い て発現させることができる０例えば、有用なベクターは、染色体、非染色体（例 えば、ＳＶ４０の種々の既知の誘導体および既知の細菌プラスミド、例えば、Ｃ Ｏ１，Ｅ　Ｉ、ｐｃＲＩ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびＲＰ４を含む大腸菌か らのプラスミド）または合成りＮＡ配列、ファージの誘導体（例えば、ＮＭ９８ ９）および繊維状−重鎮ＤＮＡファージを含むファージＤＮＡ５　（Ｍ１３Ｌ酵 母で有用なベクター（例えば、２ミクロンプラスミド）、真核細胞で有用なベク ター（例えば、動物細胞で有用なベクター、例えば、５Ｖ−４０、アデノウィル スおよびレトロウィルスに誘導されたＤＮＡ配列を含むもの）およびプラスミド およびファージＤＮＡ５の組合せから誘導されたベクター（例えば、ファージＤ ＮＡを用いるように修飾されたプラスミド）またはそれらの他の誘導体の断片を 含むことができる。

本発明により、ｈｕ−組成物−２βポリペプチドのコード配列を、プロモーター 、リポソーム結合部位（細胞の発現に対して）、そして場合により、オペレータ ー（本明細書中において集合的に「制御」要素と称する）の制御下に置き、その 結果、ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、この発現構 築物を含むベクターによって形質転換された宿主細胞においてＲＮＡ中に転写さ れる。コード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいてよいし または含まなくてもよい、コード配列がシグナルペプチドを含む場合、それはｈ ｕ−ＭＩＰ−２βに当然関係したシグナル配列であってよいしまたはなくてもよ い、細菌では、例えは、成Ｐｈｕ−ＭＩＰヤ２βは、哺乳動物シグナルペプチド を含まないコード配列の発現によるが、むしろ翻訳後処理において細菌宿主によ って除去されるリーダー配列を含むコード配列の発現によって製造するのが好ま しい０例えば、米国特許第４．４３１．．７３９号明細書：同第４．、４２５． 　４３７号明細書−同第４，３３８，３９７号明細書を参照されたい。

好ましくは、発現ベクターは少なくとも１１１１１の発現制御配列を既に含み、 それは、クローン化したＤＮＡ配列の発現を制御し且つ調節するためにはそれを ベクターに挿入した時に、ＤＮＡコード配列に対して操作によって結合すること ができる。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ｔａ ｃシステム、ｔｒｃシステム、ラムダファージの主オペレーターおよびプロモー ター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター（例えば 、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター）、酵母酸ホスファターゼの プロモーター（例えば、Ｐｂｏ２）、酵母アルファ接合因子のプロモーターおよ びポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルスまたはシミアンウィルスから誘 導されたプロモーター（例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター）並び に原核または真核細胞およびそれらのウィルスまたはそれらの組合せの遺伝子の 発現を制御することが知られている他の配列である。

発現ベクターを本発明によって構築し、その結果、ｈｕ−ＭＩＰ−２βコ一ド配 列は、そのコード配列が、制御配列の「制御」下で転写されるような適当な調節 配列と一緒にベクター中に位置する（すなわち、制？ｉｌ配列でＤＮＡ分子に結 合するＲＮＡポリメラーゼはコード配列を転写する）。制御配列は、前記に記載 したクローニングベクターなどのベクター中に挿入する前に、コード配列に連結 することができる。或いは、コード配列は、制御配列および適当な制限部位を既 に含んでいる発現ベクター中に直接クローン化することができる。原核生物およ び酵母における望ましいタンパク質の発現に対して、必然的に、制御配列はコー ド配列と異種である。宿主細胞が原核生物である場合、更に、そのコード配列は イントロンを含まないことが不可欠である（例えば、ｃＤＮＡ）、選択された宿 主細胞が哺乳動物細胞である場合、その制御配列はｈｕ−ＭＩＰ−２βコ一ド配 列と異種または相同であることができ、そしてそのコード配列はゲノムＤＮＡ　 （イントロンを含む）かまたはｃＤＮＡであることができる。ゲノムかまたはｃ ＤＮＡニード配列は酵母において発現することができる。

更に、それぞれの特異的発現ベクター中の種々の部位を、本発明のＤＮＡ配列の 挿入用に選択することができる。これらの部位は、通常、それらを切断する制限 エンドヌクレアーゼによって指定される。それらは当業者によって十分に認めら れている。当然ながら、本発明において有用な発現ベクターは、選択されたＤう ことは理解される。その代わりに、ベクターを別の手段によって断片に結合する ことができる０発現ベクター、特に、選択されたＤＮＡ断片を挿入するためにそ こにおいて選択された部位およびそこにおいて発現制御配列に対するその操作に よる結合は、欅々な因子、例えば、特定の制限酵素に敏感な部位の数、タンパク 質の大きさ並びに発現特性、例えば、ベクターに関係する開始および停止コドン の位置によって決定される。ＤＮＡ配列のための挿入部位は、ある与えられた。

状態に等しく有効である選択全部ではなく、これらの因子の均衡によって決定さ れる。多数の原核生物発現ベクターが当該技術分野において知られている０例え ば、米国特許第４．４４０．８５９号明細書；同第４．４３６，８１３号明細書 ；同第４，４３１．７４０号明細書；同第４．４３１．７３９号明細書：同第４ ゜４２８．９４１号明細書；同第４．４２５．４３７号明細書；同第４，４１８ ゜１４９号明細書；同第４．４Ｌ１，９９４号明細書；同第４，３６６．２４６ 号明細書；同第４．３４２．８３２号明細書を参照されたい；更に、英国特許公 開公報筒ＧＢ２，１２１．０５４号明細書；同第ＧＢ２，００８．１２３号明細 書；同第０８２．００７．６７５号明細書；および欧州特許公開公報第１０３． ３９５号明細書を参照されたい、好ましい原核生物発現システムは大腸菌の場合 である。他の好ましい発現ベクターは真核生物システムにおいて用いるためのも のである。好ましい真核生物発現システムは、当該技術分野において周知である ワタソニアウイルスを用いるものである。例えば、マケント（Ｍａｃｋｅｔｔ） ら（１９８４）ｊ、νｉｏ１．４９　：　８３７　；　’ＤＮＡＤＮＡコ−ド配 列■巻、１９１〜２１１頁。

上記；ＰＣＴ特許公開公報第ＷＯ８６１０，７５９３号明細書を参照されたい。

酵母発現ベクターは当該技術分野において知られている３例えば、米国特許第４ ゜４４６．２３５号明細書；同第４．４４３．５３９号明細書；同第４．４３０ ゜４２８号明細書を参照さたい；更に、欧州特許公開公報第１０３．４０９号明 細書；同第１．００．５６１号明細書、同第９６．４９１号明細書を参照された い。

もう一つの発現システムは、チャイニーズハムスター卵巣細胞を形質転換するベ クターｐＨ３＋である。ベクターの使用はＰＣＴ特許公開公報第ＷＯ３７１０２ ０６２号明細書に記載されている。

有用な発現宿主としては、周知の真核生物および原核生物宿主、例えば、大腸菌 の菌株、例えば、大腸菌５Ｇ−９３６、大腸菌ＨＢ　１０１、大腸菌Ｗ３１ｊＯ ２大腸菌Ｘ、１７７６、大腸菌Ｘ２２．８２、大腸菌り旧および大腸菌ＭＲとＩ 、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属、例えば、枯草菌 、ストレプトミセス属、酵母および他の真菌、動物細胞、例えば、ＣｏＳ細胞お よびＣＨＯ細胞並びに組織培養中のヒト細胞および植物細胞を挙げることができ る。

当然ながら、全ての宿主／発現ベクター組合せが、本発明のＤＮＡ配列を発現す る場合にまたは本発明のポリペプチドを製造する場合に等しく効率的に機能する わけではない。しかしながら、宿主／発現ベクター組合せの特別な選択は、当業 者によって行うことができる。例えば、その選択は多数の因子の均衡に基づ０て いなければならない。これらには、宿主およびベクターの適合性、ＤＮＡ配列に よってコードされたタンパク質の宿主に対する毒性、望ましレゾンノイク質の回 収の容易さ、ＤＮＡ配列およびそれらに対して操作によって結合した発現制御配 列の発現特性、生物安全性、費用並びに望ましいタンパク質の折りたたみ、形態 または任意の他の必要な発現後修飾がある。好ましくは、宿主細胞は、ｈｕ−Ｍ Ｉ　Ｐ−２βを分解するプロテアーゼを発現しないものである。

シスームにおしるクローニング 好ましい発現システムは酵母である。ｈｕ−ＭＴＰ−２βは、ｈｕ−ＭＩＰ−２ βに対するＤＮＡコード配列を含む発現ベクターを用いて酵母プロモーターの制 御下げ形質転換した酵母細胞によって発現することができる。このような発現ベ クターは下記のように構築することができる。

酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し且つｍＲＮＡ中へのコー ド配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３′）の転写を開始することができる任 意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５′末端付近に通常位置 している転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的に、ｍＲＮＡポリ メラーゼ結合部位（ｒＴＡＴＡボ・ノクス」）および転写開始部位を含む。更に 、酵母プロモーターは、上流活性化配列（ＵＡＩＳ）と称する第二のドメインを 有することができ、通常それは、存在する場合、構造遺伝子のｖ：端である。Ｕ ＡＳは調節された（誘導しろる）発現を可能にする。構成性発現はＵＡＳ不存在 におし１て生しる。調節された発現は正かまたは負であることができ、それによ って転写を増大させるかまたは減少させる。

酵母は活性代謝経路を有する発酵性生物であり、したがって、代謝経路における 酵素をコードする配列は特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、 アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許庁特許公開公報第２８４０４ ４号明細書）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、クールコース−６−リン酸イソメ ラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧ ＡＰＤＨ）　、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリ ン酸ムターゼおよびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許庁特許公開公報第 ３２９２０３号明細書）がある、酸ホスファターゼをコードする酵母ＰＨ０５遺 伝子は、更に、有用なプロモーター配列を提供する〔ミャノハラ（Ｍｉｙａｎｏ ｈａｒａ）ら、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ、１立＝１〕。

更に、天然に存在していない合成プロモーターも、酵母プロモーターとして機能 する。例えば、一つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーター の転写活性領域と結合することができ、合成ハイブリッドプロモーターを生しる 。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＣＡＰ転写活性領域に結 合したＡＤＨ調節配列がある（米国特許第４．８７６．１９７号明細書；同第４ ．８８０．７３４号明細書）、ハイブリッドプロモーターの他の例としては、遺 伝子ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、（、ＡＬｌｏ、’＋４た＋！Ｐｌ（０５（７）調節配 列から成る、ＧＡＰまたはＰｙＫなどの解糖酵素遺伝子の転写活性領域と組合わ されたプロモーターがある（欧州特許庁特許公開公報第１６４５５６号明細書） 。更に、酵母プロモーターとしては、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し且つ転写 を開始する能力を有する非酵母起源の天然に存在するプロモーターを挙げること ができる。例ンバーグ（Ｈｏｌ　ｌｅｎｂｅｒｇ）　ら、　（１９８１）すｒｒ 、　Ｔｏ　ｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、−９６：１１９；ホ レンバーグら、Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌεｎｖｉｒｏｎｍｅｒ ＋ｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｏ烏−＋ａｅｒｃｉａｌ　Ｉｓ　ｏｒｔａｎｃｅ　（Ｋ、 Ｎ、ティミス（Ｔｉｍｓｉｓ）およびＡ、ピューラー（Ｐｕｈ−Ｉｅｒ）監修） の「ビール酵母菌における細菌の抗生物質耐性遺伝子の発現（ＴｈｅＥｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ　ｏｆ　８ａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｒｅ５ｉｓｔ ａｎｃｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓ煤@Ｓａｃｃｈａ− ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｔａｅ）　Ｊ　；ノルセル−１ビガロン（Ｍｅ ｒｃｅｒｅａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎ）ら（１９８０）　Ｇｅｎｅ、上１　：１６ ３　；パンチア（Ｐａｎｔｈｉｅｒ）ら（１９８０）　、　Ｃｕｒｒ。

蝕凹ｈ１ス：１０９を参照されたい。

ＤＮＡ分子は細胞内で発現することができる。プロモーター配列はＤＮＡ分子と 直接結合することができ、その場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ 酸は常にメチオニンであり、それがＡＴＧ開始コドンによってコードされる。

所望ならば、Ｎ末端のメチオニンを、インビトロでの臭化シアンとのインキュベ ーションによってタンパク質から開裂させることができる。

融合タンパク質は直接発現に対する変法を提供する。典型的に、内因性酵母タン パク質または他の安定なタンパク質のＮ末端をコードするＤＮＡ配列を、異種の コード配列の５′末端に融合させる。発現によって、この構築物は２種類のアミ ノ酸配列の融合を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドムター ゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、異種の遺伝子の５′末端に結合し且つ酵母で発現するこ とができる。２種類のアミノ酸配列の結合部のＤＮＡ配列は、開裂しうる部位を コードしてもよいしまたはしなくてもよい。例えば、欧州特許庁特許公開公報第 １９６０５６号明細書を参照されたい、もう一つの例は、ユビキチン融合タンパ ク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、プロセッシング酵素（ 例えば、ユビキチン特異的プロセッシングプロテアーゼ）のための部位を保持し て、異種のタンパク質からのユビキチンを開裂させるユビキチン「リーダー」ま たは’ｐｒｏ　ｒ領域を用いて製造される。したがって、この方法により、未変 性の異種タンパク質を単離することができる「参考としてその開示が本明細書中 に包含されテイル、Ｐ、Ｃ，Ｔ、特許第ＷＯ３８１０２４０６６号明細書；１９ ８９年８月７日出願の同一所有の米国特許出願第３９０，５９９号明細書または （ダーウェント・パブリケーシぢン・リミテッド（［ｌｅｒｗｅｎｔ　Ｐｕｂｌ ｉｃａｔｉｏｎｓ。

Ｌｔｄ、）によって作製された世界特許索引（Ｗｏｒｌｄ　Ｐａｔｅｎｔｓ　Ｉ ｎｄｅｘ）に記載の）それから優先権を主張する外国特許若しくは出ＩＩ］　。

別法として、酵母内での分泌を提供するリーダー配列断片と外来遺伝子からなる 融合蛋白質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより、細胞から生育 培地中に外来蛋白質を分泌させることもできる。好ましくは、該リーダー配列と 該外来遺伝子との間にプロセンシング部位（インビボまたはインビトロ）を有す る。リーダー配列は、典型的には細胞からの蛋白質の分泌をさせる親水性アミノ 酸からなるシグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌された酵母蛋白質遺伝子、例え ば酵母インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開番号第１２，８７３号、Ｊ、Ｐ。

０、公開番号第６２．０９６，０８６号）およびＡ−外因遺伝子（米国特許第４ ゜５８８．６８４号）由来でありうる。

分泌用リーダー配列の好ましい集団は、「プレＪシグナル配列、および「プロ」 シグナル領域両方を含む、酵母α−因子遺伝子の断片を用いるものである。使用 できるα−因子断片の種類は、完全長のプレープロα−因子リーダー（約８３ア ミノ酸残基）並びに切りつめられたα−因子リーダー（約２５から約５０アミノ 酸残Ｓ）（欧州特許第４，５４６．０８３号および第４，８７０．００８号；欧 州特許公開番号第３２４２７４号）を含む０分泌を提供するα−因子リーダー断 片を用いる追加のリーダーは、第一の酵母のプレ配列と、第二の酵母のα−因子 のプロ領域で作られた雑種α−因子リーダーを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開第 ８９１０２４６３号を参照されたい）。

典型的には、酵母により認識される転写終結配列は、転写終止コドンの３′側に 位置する制御領域であり、即ちプロモーター、コーディング配列の周辺を含む。

これらの配列はＤＮＡによりコードされたポリペプチドに翻訳されうるｍＲＮＡ の転写を制御する。転写終結配列の例としては、野生型α−因子転写終結配列お よび酵母が認識する他の終結配列、例えば解糖酵素のものを含む。

典型的には、プロモーター、リーダー（必要ならば）、興味のあるコーディング 配列、および転写終結配列からなる上記成分は共に発現構成物となる。発現構成 物はしばしば、レプリコン、例えば酵母または細菌等の宿主中で安定に保持され うる染色体外要素（例えば、プラスミド）中に保持される。レプリコンは、２つ の複製系を有してよく、即ち例えば、発現のために酵母中で、クローニングおよ び増幅のために原核生物中で保持される。そのような酵母−バクテリアのシャト ルヘクターの例は、ＹＥＰ２４［ポンドシュタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）ら、１ ９７９、Ｇｅｎｅ　８　：　１７−２４）、ｐＣＬ／Ｉ　Ｃブレイク（Ｂｒａｋ ｅ）ら、１９８４、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１　：４６４２−４６４６） 、およびＹＲｐ１７（スティンシュコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）　、１９８２ 、Ｊ、Ｎｏ１．８ｉｏ＋、、１５８：１５７）を含む、さらに、レプリコンはハ イコピー数、ローコピー数のいずれのプラスミドでもよい、ハイコピー数のプラ スミドは、通常約５から約２００、典型的には約ＩＯから約１５０の範囲のコピ ー数を有する。ハイコピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも 約１０、より好ましくは少なくとも約２０を含む。

ハイコピー数またはローコピー数のいずれかのベクターは、ベクターおよび外来 遺伝子の宿主への効果に依存して選んでよい０例えば、上記ブレイクらの文献を 参照されたい。

別法として、発現構成物は挿入ベクターを用いて酵母ゲノム中に挿入されうる。

挿入ベクターは典型的には、ベクターの挿入を許容する酵母染色体に相同な少な くとも１つの配列、好ましくは発現構成物周辺の２つの相同配列を含む。挿入は 、ベクター中の相同ＤＮＡと酵母染色体間の組換えによりもたらされるようであ る（オル−ウニバー（Ｏｒｒ４ｅａｖｅｒ）ら、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　［、ｎｚｙｍｏｌ、＋　１０１　：２２８−２４５．）。挿入ベクターは、 ベクターに含まれるための適切な相同配列を選択することにより、酵母中の特定 の部位に挿入されてよい、上記のオル−ウニバーらの文献を参照されたい、ひと つまたは複数の発現構成物が入り込み、たぶん生産される組換え蛋白質のレベル に影響を及ぼす「ライン（Ｒｉｎｅ）ら、１９８３、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０　：　６７５０　）　ｍベクターに含ま れる染色体配列は、ヘククー全部の挿入をもたらす、ベクター中の単一セグメン トとして、または染色体中の隣接セグメントに相同なセグメントと、発現構成物 のみの安定な挿入をもたらしうる、ベクター中の発現構成物の周辺セグメントの ２つのセグメントとして生じうる。

典型的は、染色体外および挿入発現構成物は、選択可能なマーカーを含むことに より、形質転換された酵母の選択を可能にする０選択可能なマーカーは、生合成 遺伝子、例えばＡＤＥ２．Ｈ［Ｓ４．ＬＥＵ２．ＴＲＰＩ、およびＬＩＲＡ３を 含んでよい。選択可能なマーカーは、薬荊耐性遺伝子、例えばＡｌＯ２およびＧ ４１８耐性遺伝子も含んでよく、それらは酵母中でそれぞれチュニヵマイシンお よび０４１８に耐性を与える。さらに、適切な選択可能なマーカーは、金属のよ うな有害な化合物の存在下で酵母を生育可能にするものでもよい。例えば、二足 １の存在は、銅イオンの存在下で酵母を生育可能にする〔ブッ）　（Ｂｕｔｔ） ら。

１９８７、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、＋　５１　：　３５１　）　＠染色 体外レプリコンまたは挿入ベクターのいずれかの発現ベクターが、多くの酵母を 形質転換するために開発された０例えば発現ベクターは、中でも以下の酵母のた めに開発された：キャンシダ・アービカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎ ｓ）　（クルツ（Ｋｕｒｔｚ）ら、１９８６、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ 、、　６　：　１４２）　、キャンシダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌ ｔｏｓａｌｌ　（クンゼ（Ｋｕｎｚｅ）ら、１９８５、Ｊ、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、。

２’５　：　１４１Ｌハンセニユラ・ポリモルフｙ　（Ｈａｒ＋５ｅｎｕｌａ　 ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）　［グレフソン（Ｇｌｅｓｓｏｎ）ら、１９８６、Ｊ、 　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１３２　：　３４５９　；ローゲンキャン プ（Ｒｏｇｇｅｉ＋ｋａｍｐ）　ら、１９８６、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅ ｔ、’、２０２　：　３０２　）、タルイベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙ ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）　（ダス（Ｄａｓ）ら・１９８４、Ｊ 、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５８　：　１１６５　）　、タルイベロマイセ ス・ラクテイス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　Ｌａｃｔｉｓ）　（デル−ヘン コート（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ）ら、１９８３、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ、＋　１５４　：　７３７　；ファンデンベルグ（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒ ｇ）ら、１９９０、Ｂｊｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋　８　：　１３５　〕、ビ チア・グイレリモンデイイ（Ｐｉｃｈｉａｇｕｉｌｌｅｒｔｍｏｎｄｉｉ）　Ｃ クンゼ（Ｋｕｎｚｅ）ら、１９８５、Ｊ、　Ｂａ５ｊｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 、　２５　：１４１Ｌビチア・バストリス〔フレラグ（Ｃｒｅｇｇ）ら、１９８ ５、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、５コ３３７６　；米国特許第４，８３７．１４８号および第４．９ ２９，５５５号〕、サツカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｙｅ ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｃヒンネン（）ｌｉｎｎｅｎ）ら、１９７８、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５　：　１９２ ９　；イト−（Ｉｔｏ）ら、１９８３、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５３ 　：　１６３　）　、シゾサノカロマイセス・ボンベ〔ビーチとナース（Ｂｅａ ｃｈ　ａｎｄ　Ｎｕｒｓｅ）、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、３０Ｑニア０６）、お よびヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａ）　（ ダビドウ（［ｌａｖｔｄｏｗ）ら、１９８５、Ｃｊｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、、１０ 　：　３９　４８　；ゲイラルデイン（Ｇａｉ　１ｌａｒｄｉｎ）　ら、　１９ ８５、　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、、１　０　：　３９−４９）　。

酵母宿主に外来Ｄ’ＮＡを挿入する方法は、当業界においてよく知られており、 かつ、典型的には、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理された完全 な酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換法は、形質転換される酵母の 種により通常変えられる０例えば、クルツ（Ｋｕｒｔ２）ら、１９８６、Ｍｏ１ ．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　６　：　１４２、クンゼ（Ｋｕｎｚｅ）ら、１９８５、Ｊ、　Ｂ ａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋　２５　：１４１（キャンヂダ）；グレッソ ン（Ｇｌｅｓｓｏｎ）ら、１９８６、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ−ｏｌ、 、１３２：３４５９．　ローゲンキャンプ（Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ）ら、１９８ ６、Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　２０２　：　３０２　（ハンセニュラ）；ダス（ Ｄａｓ）ら、１９８４、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５８　：　１１６５、デ　ルーベンコー）　（Ｄｅ　 Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ）　ら、１９８３、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１ ５４　：　７３７．ファンデンベルグ（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇ）ら、１９９ ０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：１３５（タルイベロマイセス）；フレ ラグ（Ｃｒｅｇｇ）ら、１９８５、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｊｏｌ、、５　： 　３３７６．　クンゼ（ｌｕｎｚｅ）ら、１９８５、Ｊ、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、、　２５　：　１４１、米国特許第４，８３７，１４８号および 第４，９２９．５５５号（ビチア）；ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら、１９７８、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ、　７５：　１９２９ ．　イト−（Ｉｔｏ）ら、１９８３、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５３　：　１６３　（サツカロマイセス）；ダビドウ （［ｌａｖｔｄｏｗ）ら。

１９８５、Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、＋　１０　：　３９．　ゲイラルディン（ Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ）　ら、１９８５、Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、＋　１０　 ：　４９　（ヤロウイアリボリチカ）を参照されたい。

蛋口！例発現 選択された発現系および宿主に依存して、蛋白質が発現される条件下で、ｈｕ− ＭＩＰ−２βをコードする配列を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細 胞を生育させることにより蛋白質が生産される０次に、蛋白質を宿主細胞から単 離し、そして精製する。適切な生育条件および回収法の選択は当業界の範囲内で ある。

本発明の調製物を得るための一つの好ましい手段は、適切な培養条件を用いて、 ｈｕ−ＭＩＰ−２８に対応する、イントロンを含まないＤＮＡからなる発現ベク ターでトランスフェクトした細胞を培養することである１次に、細胞を回収し、 そして細胞画分を標準的な分離方法、例えば遠心分離により単離してよい。発現 系が生育培地にポリペプチドを分泌するのであれば、ポリペプチドは直接無細胞 培地から精製できる。蛋白質が分泌されないのであれば、細胞溶解物から単離さ れる。ｈｕ−ＭＩＰ−２βを含む粗抽出物が得られれば、標準的な技術を用いて 、上記のように精製を実施できる。

一般的には、ｈｕ−Ｍ’ＩＰ−２βポリペプチドの組換え体の生産により、他の ヒト蛋白質を実質的に含まないこのサイトカイニンの組成物を提供できる。ノ＼ イレベルの精製を得る可能性は、インビボの源に対して実質的な量のｈ　ｕ−Ｖ 　Ｉ　Ｐ−２βポリペプチドを生産することもできる。即ち、組換え体培養物に 慣用的技術を適用することにより、ｈｕ−ＭＴＰ−２βポリペプチド組成物をよ り容易に生産できる。当業者であれば、実質的に純粋な本発明のペプチドを調製 するために、上記技術の中から選択できる。

ｈｕ−ＭＩＰ−２−０（ＩＩ５） 他のヒト蛋白質を実質的に含まないｈｕ−ＭＩＰ−２β類似体の貯蔵物を含む組 成物も、好ましくは組換えＤＮＡ法または化学合成により調製できる。これらの 貯蔵物はりセプター結合アッセイまたは上記のあらゆる生物活性アツセイを用い 、所望の活性を有するｈｕ−ＭＩＰ−２β類似体をスクリーニングできる。

例えば、ここに引用により本明細書の一部をなすバームレイとスミス（Ｐａｒ蒙 １ｅｙ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ）、１９８８、Ｇｅｎｅ、７３　：　３０５におい て、組換えＤＮＡ法を用いた、蛋白質の貯蔵物の生産およびスクリーニングのた めのプロトコルが記載されている。ＭＴＰ’−２マルチ遺伝子フアミリーメンバ ーのりセプターを用いたこのプロトコルは、ｈｕ−ＭＩＰ−２β変異蛋白質、切 りつめたｈｕ−ＭＩＰ−２βペプチド、またはｈｕ−ＭｒＰ−２ｌ融合蛋白質の 貯蔵物のスクリーニングに使用できる。最初に、異なったｈｕ−ＭＩＦ−２β類 似体をコードするＤＮＡ断片の貯蔵物を作ることができる０次に、ＤＮＡ断片の 貯蔵物は、バームレイとスミスにより記載された、繊−状ファージのゲノムに挿 入することができる。このフプージのライブラリーはコロニーを生じ、その発現 産物はスクリーニングすることができる。所望のコロニー由来のＤＮ、Ａを単離 し、そして使用することにより、所望のｈｕ−ＶＩＰ２βＩ！（１２体を同定で きる。

ｈｕ−ＭＩＰ−２β類似体の貯蔵物も合成できる。リセブター結合アッセイにお ける便宜のため、ブロック上に９６ビンの配列に並べられたポリエチレンのビン （標準的な９６ウエルのマイクロタイタープレートの間隔に合わせた）上で、ｈ ｕ−ＶＩＰ−２β＝＜以体を合成できる。例えば、ここに引用により本明細書の 一部をなすゲイエセン（Ｇｅｙｅｓｅｎ）の米国特許第４．７０８．８７１号に おいて、口蹄疫ウィルスのＶＰＩ蛋白質に通用されたポリペプチド合成法が記載 されている。ポリペプチドのライブラリーを作成するため、および特定の特性を 有するポリペプチドの選択するための他の方法は、ここに引用により本明細書の 一部をなす米国特許第５．０１０，１７５号、および１９９１年２月６日に出願 された米国特許出願第０７／６５２．１９４号、またはデルベント出版社（Ｄｅ ｒｉｉｅｎｔ　Ｐｕｂ−１ｉｓｈｉｎｇ　Ｌｔｄ、）により作成されたワールド バテンツに掲載された、それらを基に優先権主張された外国特許または出願に記 載されている。

ｈｕ−ＭＩＰ−”２βに関連のないポリペプチドの貯蔵物は、組換えＤＮＡ法ま たは化学合成法を用いて生産でき、そしてＭＩＰ−２遺伝子フアミリーのメンバ ーのりセブターへの結合可能性によりスクリーニングできる０次に、リセブター を結合したポリペプチドを、上記生物活性アッセイにおいてアッセイすることに より、それらのアゴニストまたはアンタゴニスト活性を測定できる。そのような ポリペプチドは、ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドと同様の治療のための応用に 効果的である。ペプチドの貯蔵物のスクリーニングのための他の方法は、ここに 引用により本明細書の一部をなすクウイルラ（Ｃｗｉｒｌａ）ら、１９９０、Ｐ ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８７：６３７８に記載されている。

薬剤投与の苦痛を取り除くために、小さな有機分子をこれらポリペプチドアゴニ ストまたはアンタゴニストにかぶせることが好ましい、ポリペプチドの構造から 、これらポリペプチドの形および活性に似せた小さな有機分子を見つけてもよい 。これらｈｕ−ＭＩＰ−２βアゴニストまたはアンタゴニストの構造を決定する ための方法は、当業界において公知であり、そしてＸｗＡ結晶解析および２次元 磁気共鳴を含む。

抗体の生産 天然、組換え体または合成のｈｕ−ＭｊＰ−２βポリペプチド（ひとつまたは複 数のエピトープを含む完全長または断片）を使用することにより、ポリクローナ ル抗体およびモノクローナル抗体の両方を生産できる。ポリクローナル抗体が必 要であれば、ｈｕ＝ＶＩＰ−２８ポリペプチドを使用して、選択された哺乳動物 （例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等々）を免疫し、そして後に、既知の方 法により、免疫された動物から血清を回収し、そして処理するや本発明のｈｕ− ＭＩＰ−２βポリペプチドを使用することにより、調製物を有する動物を免疫し て、抗体の生産を高めることができる。そのような免疫は、大きい免疫物質、例 えばキーホールリンペットヘモシアニンに、ポリペプチドを任意にカップリング してよい、抗体を生産するための、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ヤギ等々 の免疫は当業界において公知である。

ポリクローナル抗体調製物は、本発明の合成または組換えポリペプチドを用いた 免疫親和性技術により部分精製できる。そのような精製法は当業界において公知 である。特に、所望の蛋白質に加えてさまざまな抗原に対するポリクローナル抗 体を含む組成物は、免疫親和性クロマトグラフィーにより、他の抗原に対する抗 体を実質的に含まずに作成できる０本発明のポリペプチドの実質的に純粋な調製 物を使用することにより、ｈｕ−ＶＩＰ−２βポリペプチドと反応性の抗体を親 和精製できる。抗体の親和精製のために、ポリペプチドを不活性マトリックス、 例えばアガロースビーズにカップリングできる。そのようなカップリングの技術 は当業界において公知である。

ポリペプチドの調製物も、抗体調製物または他の生物学的サンプル中のｈｕ−Ｍ Ｉ　Ｐ−２βに特異的な抗体の検出および定量に使用できる。そのような場合、 合成ペプチドは通常、大きな物質、例えば子ウシ血清アルブミンまたは固形支持 体にカップリングさせる。再び、そのようなマトリックスへのポリペプチドのカ ップリング技術は当業界において公知である。

％／久旦二±四抗体 ｈｕ−ＭＩＰ−２βに反応性のモノクローナル抗体も、以下の開示に従い、当業 者により容易に生産される。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の作成の ための一般的方法論はよく知られている。唯一のｈｕ−ＭＩＰ−２βエピ）　− ブに反応性のモノクローナル抗体を生じさせることができる。一般的には、ラン トまたはマウスを本発明のポリペプチドで免疫し、そして後にげつ歯頚を犠牲に し、そしてミエローマ細胞と融合した＊ｍ細胞を回収する。融合細胞は当業界に おいて知られた技術に従い選択できる。各融合細胞の抗体の生産は、ｈｕ−ＭＩ Ｐ−２βのエピトープ上に結合した抗体を選択するために、個々にスクリーニン グできる。

ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドに唯一のエピトープと免疫反応性の抗体をスク リーニングするために、単一バッテリーの試験を実施できる。抗体は、本発明の ｈｕ−ＭＩＰ２βポリペプチドの実質的に純粋な調製物を用いて、ｈｕ−ＭＩＰ −２βポリペプチドとの免疫反応性に関して試験できる。所望の特定の抗体は、 この試験において陽性であるべきである０次に、抗体は、ＭＩＰ−２マルチ遺伝 子フアミリーの他のメンバーとの免疫反応性に関して試験できる。一般には、こ の試験で陰性の抗体はｈｕ−ＭＩＰ−２βの唯一のエピトープと反応する。

不死の、抗体産生セルラインも、融合以外の技術、例えばオンコジーンＤＮＡを 用いたＢ白血球の直接形質転換、またはエプスタインパールウィルスを用いたト ランスフェクションにより作成できる。例えば、シュライヤー（Ｓｃｈｒｅｉｅ ｒ）ら、「ハイブリドーマ技術Ｊ　（１９８０）　；　Ａンマリング（Ｈａ＋ｕ ｅｒｌｊｎｇ）　ら、　「モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイプリドーマＪ　 （１９８１）；ケンネット（Ｋｅｎ−ｎｅｔｔ）　’モノクローナル抗体ｊ　（ １９８０）；または米国特許第４．　３４１．　７６１号、第４，３９９，１２ １号、第４．４２７．７８３号、第４．　４４４．８８７号、第４．４５１．５ ７０号、第４，４６６．９１７号、第４．　４７２．５００号、第４．４９１， ６３２号、第４．４９３．８９０号を参照されたい。

ｈｕ−ＭＩＰ−２βに対して生産されたモノクローナル抗体のパネルは、さまざ まな特性、例えばアイソタイプ、エピトープ、親和性、等々に関してスクリーニ ングできる。特に興味のあるモノクローナル抗体は、ＭＩＰ−２またはｈｕ−Ｍ ＩＰ−２βペプチドの活性を中和するものである。そのような抗体は、ＭＩＰ− ２活性アツセイ、例えばここに引用により本明細書の一部をなすウォルベ（Ｗｏ ｌｐｅ）ら（１９８９）およびブロックスマイヤー（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ）ら（ １９８９）において教示されたアッセイを用いて容易に同定できる。高親和性の 抗体も、天然または組換えｈｕ−ＭＩＰ−２βの免疫親和性精製において有用で ある。

本発明により企画された抗体の種類は、を椎動物の抗体、特に哺乳動物（ポリク ローナルおよびモノクローナル）、雑種抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、改変抗体 、−価抗体、単一ドメインの抗体、並びに機能的抗体の断片、例えばＦａｂ蛋白 質を含み、エピトープに選択的に結合さえすればよい、一般的な総論はウィンタ ーとミルスタイン（Ｗｉｎｔｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、１９９１．Ｎａｔ ｕｒｅ、３４９：２９３；リーヒマン（Ｒｉｅｃｈａ＋ａｎｎ）ら、１９８Ｂ、 Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３；ワード（Ｗａｒｄ）ら、１９８９、Ｎａｔｕｒ ｅ、３４９　：　５４４　；米国特許第４，８１６，４６７号；およびグレニ− （Ｇｌｅｎｎｉｅ）ら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９５　：　７１２を参照さ れたい。

エピトープはポリペプチドの抗原決定基である。ひとつのエピトープは、該エピ トープに唯一の空間コンフォメーション中に３またはそれ以上のアミノ酸を含み うる。一般的には、エピトープは少なくとも５つのそのようなアミノ酸からなり 、そしてもっとも通常には少なくとも８−１０のそのようなアミノ酸からなる。

アミノ酸の空間コンフォメーションの決定法は、当業界において公知であり、そ して例えばＸ線結晶解析および２次元核磁気共鳴を含む。

ｈｕ−ＭＩＰ２　の−ア・セイ ｈｕ−ＭｒＰ−２βの検出はヌクレオチドまたはペプチドレベルに基づいてよい 。上記のようにｈｕ−ＭＩＰ−２βのポリペプチドに対応する配列から発現され るペプチドで哺乳動物を免疫し、そして当業界においてよく知られている技術を 用いてｈｕ−Ｍ［Ｐ−２βに特異的なそれらの抗体を選択することにより、抗体 を調製することができる。

免疫ヱヱ土歪法 抗体は診断への応用に有用である。ｈｕ−ＭＩＰ−２βに特異的な抗体はあらゆ る慣用免疫アッセイのフォーマント；例えば均−系または不均一系、ラジオイム ノアッセイまたはＥＬＩＳＡに公式化することができる。さまざまなフォーマ７ トが当業界においてよく知られている０例えば、ここに引用により本明細書の一 部をなす「イムノアッセイ：実用ガイド（Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ ）」（チャンとバールスタイン（Ｄ、　Ｗ、　Ｃｈａｎ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｔ、　 Ｐｅｒｌｓｔｅｉｎ）　！ｉ集、１９８７）を参照されたい。

本発明の抗体は、ｈｕ−ＭＩＰ−２βに結合することができ、そしてｈｕ−ＭＩ Ｐ−２αに結合しないことが好ましい、これらの抗体も、アイソトープ、結合し た抗体、または他のりガントを用いたインメージング分析に使用できる。適切な インメージング物質の一例は、ｈｕ−ＭＩＰ−２βに特異的な抗体に結合した１ ２５Ｉである。

本発明の抗体を使用することにより、組織の組織学的セクション、並びに血清中 のｈｕ−ＭＩＰ−２βエピトープを検出することができる。当業界において知ら れているあらゆる検出手段、例えばラジオイムノアッセイ、酵素結合特異的抗体 吸着体アッセイ、補体の固定、比濁度アッセイ、免疫拡散、免疫電気泳動アッセ イおよび類似物により、組織セクションに結合した抗体を検出できる。

特に有用な染色剤はパーオキシダーゼ、過酸化水素および色素産生物質例えばア ミノエチルカルバゾルである。パーオキシダーゼ（よ（知られた酵素であり、多 くの源から入手できる）はｈｕ−ＭＩＰ−２βに特異的な抗体にカップリングす ることができ、また単にひとつまたは複数の抗体と複合体を作ることができる。

他の色素産生物質および酵素も使用してよい。そのような技術は当業界において よく知られている。放射性標識抗体はｈｕ−ＭＩＰ−２βに特異的でありえ、あ るいはｈｕ−ＭＩＰ−２βに特異的な抗体と免疫反応性の二次抗体でありえる。

再び、そのような技術はよく知られている。ｈｕ−ＭＩＰ−２βを検出する詳細 な技術は、本発明において重要ではない。

生物学的サンプル中のｈｕ−ＭＩＰ−２βを検出および／または定量するための 一つの特に好ましい方法は、競合アッセイである。ｈｕ−ＭＩＰ２βに見いださ れるが、ｈｕ−ＭＩＰ−２αに見いだされないエピトープと免疫反応性の抗体は 、当業界において公知の技術を用いて、固形支持体、例えばポリスチレンマイク ロタイターディツシュまたはニトロセルロースペーパーに付着させる０次に、抗 体−抗原が複合体を形成し、かつ安定であるような条件下で、分析されるサンプ ルの存在下において固形支持体をインキュベートする。過剰の未結合サンプル成 分を除去し、そして抗体−抗原の複合体が固形支持体上に残るように固形支持体 を洗浄する０次に、ｈｕ−ＭＩＰ−２３に見いだされるが、ｈｕ−ＭＩＰ−２α に見いだされないエピトープを含む標識ポリペプチドの固定量を固形支持体と共 にインキュベートする。標識ポリペプチドは、当業界において公知の検出可能な モイエティ、例えばビオチン、パーオキシダーゼまたは放射性標識にカップリン グされた。標識ポリペプチドは、固形支持体に付着したｈｕ−ＭＩＰ−２βに免 疫反応性の抗体に結合する。過剰の未結合のサンプル成分を除去し、そして上記 のように固形支持体を洗浄する。固形支持体に付着した検出可能なモイエテイを 定量する。ｈｕ−ＭＩＰ−２βとポリペプチドは同一の抗体結合部位に対して接 合するので、サンプル中のｈｕ−ＭＩＰ−２βは、ポリペプチドの固形支持体へ の結合の減少により定量することができる。別法としては、サンプルと標識ポリ ペプチドを同じ時間、固形支持体と共にインキュベートする。

兄１＞ｆ±１１旦二ズヱヱ立乙 本発明により提供されるヌクレオチド配列を使用することにより、あらゆる標準 的技術に従い、遺伝子プローブを作成できる。プローブの大きさは約２０ヌクレ オチド未満から数百ヌクレオチドまで変えられる。プローブは放射性標識、また は蛍光物質による標識、または類似物により標識される。ヌクレオチドプローブ の調製および標識法は当業界においてよく知られている。

ヌクレオチドプローブを用いる診断試験は個々の生物学的サンプルを用いる。

当業界においてよ（知られている標準的技術を用いて、核酸はサンプルから回収 される０次に、核酸をプローブとインキュベートし、そしてその後ハイブリダイ ズを検出する。

以下の記載は例示の目的のみに提供される本発明の実施例である。これらは、請 求の範囲内の真人なり捧が本開示に照らして当業者に明らかであるように、いか なる場合も本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、本出願中で引用さ れた文献に精通しており（あるいは容易に入手できる）、そしてその開示は引用 により本明細書の一部をなす。

医土 ネズミＶＩＰ−２コード　るｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの　およびクローニングｃＤＮＡ− イブーリーの 大腸菌ＬＰＳで刺激したネズミＲＡＷ２６４．７細胞からのポリ−Ａ″ＲＮＡの 単離およびｃＤＮＡライブラリーの構築は以前に記述した（ダハテルズ（Ｄａｖ ａｔｅ−１１ｓ）ら、１９８８）。

ネズミＭＩＰ−２ｃＤＮＡの ＭＩＰ−２のＮ末端の配列のアミノ酸９−１４（ウォルベ（Ｍｏｌ　ｐｅ）ら、 １９８９）に対応する縮重したオリゴヌクレオチドの混合物を合成した。この配 列は高度に保存されているヨー１４Ｎ域中にあると予想さ娠しかも部分配列の他 の部分と比較するとコドンの縮重がより少ないので、部分配列のこの部分を選択 した。

得られたプローブは１７ヌクレオチドの長さのオリゴマーで、縮重のために１２ ８個の混合物から成る。

ＲＡＷ２６４．７ｃＤＮＡライブラリーを培養しく５Ｘ１０’プラーク）２枚の ニトロセルロースのフィルターへＤＮＡを結合させて、４２”Ｃで５ｘＳＳＣ， ２×デンハルト溶液、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ＰＨ６，５，５０％ホル ムアミド、０．２％ＳＤＳおよび０．２５■／ｄの超音波処理したサケ精子ＤＮ Ａ中でブレハイブリダイズし、次に一晩４２°Ｃで５ＸＳＳＣ１１×デンハルト 溶液、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液Ｐ　Ｈ６，５，５０％ホルムアミド、１ ０％デキストラン硫酸、０．１％ＳＤＳ、０．１■／Ｉｄの超音波処理したサケ 精子ＤＮＡおよびミリリットル当たり縮重ごとに５ｘｔｏ’　Ｃｐｍの”Ｐ−Ａ ＴＰで５′末端を標識した合成オリゴヌクレオチドのプローブの混合物中でハイ ブリダイズした。ハイブリダイゼーション後にＴＭＡＣ（ウッド（Ｗｏｏｄ）ら 、１９８３、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、竪紅８２　：　１５８５　）を用いてフィルターを洗浄し た。２枚のフィルターでともに陽性だったプラークについて密度を低くプラーク を形成させてセカンドスクリーニングに進んだ、陽性なファージクローンを単離 し、さらなる解析のためにそれからＤＮＡを調製した。

ネズミＭＩＰ−２ｃＤＮＡのクローニングＲＡＷ２６４．７細胞から抽出したポ リＡ″ＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーの、ネズミＭＩＰ−２のＮ末端の 配列（ウォルペ（ｌｌｏｌｐｅ）ら、１’１８９）に特異的な縮重したオリゴヌ クレオチドの混合物を用いたスクリーニングによってクローンＭＩＰ−２−２０ αを単離した。インサートｃＤＮＡ（約１１００ｂｐ）を単離して、Ｍ１３にク ローニングして、ヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチド配列および推定ア ミノ酸配列を図１に示す、１位で始まる推定される成熟したタンパク質の配列は 、精製したＭ［’−２について以前に決定したＮ末端のペプチド配列（ウォルベ （Ｗｏｌｐｅ）ら、１９８９）に一致する。

例ヱ ヒトＭＩＰ−２αおよび　コード　るｃＤＮＡの　お　びクローニングネズミＭ Ｈ’−２ｃＤＮＡに１！億するヒトの遺伝子を単離するために、成熟したｍＭＩ Ｐ−２タンパク質の大部分をコードする断片を単離してプローブとし、ＰＭＡで 処理したおよびＬＰＳで刺激した細胞のポリＡ″ＲＮＡから調製したＣ９３７　 ｃ　ＤＮＡライブラリーをスクリーニングした０弱い条件で洗浄して陽性になっ たプラークからＤＮＡを単離して、制限酵素で分析して、２つのクラスのクロー ンが存在することを示した。各グループの代表のクローンからインサートｃＤＮ Ａを単離してＭ１３にサブクローニングしてヌクレオチド配列を決定した。

ｃＤＮＡ−イブ′″１−の ヒト単核白血球様細胞系列Ｕ９３７の刺激（サンドストローム（Ｓｕｎｄｓ　ｔ ｒｏｍ）ら、１９７６、匠　Ｊ、Ｃａ匹肛、上ユニ５６５）、全ＲＮＡおよびポ リ−Ａ”　ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡライブラリーの構築は以下の欅に行った 。Ｃ９３７細胞（アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション、ロツクブイ ル（Ｒｏｃｋｖｉ　１ｉｅ）、メリーランド州）を細胞同士が接触するまで成長 させて、最終濃度５Ｘ１０’ＭのＲＭＡの添加によって分化させるために刺激し た。ＰＭＡ存在下で２４時間培養した後に、ＬＰＳ　（ＬＰＳＷ、大腸菌０１２ ７：Ｂａ；ディフコラボラトリーズ社（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、　Ｉｎｃ、）　％デトロイト、ミシガン州）を最終濃度がｌμｇ／ｄになるよ うに加えて、細胞をさらに３時間３７“Ｃで培養した。全ＲＮＡの調製は本質的 には記述されたように行った（キャセラ（Ｃａｔｈｅｌａ）ら、１９８３、旦Ｎ Ａ、ス：３２９）。

ポリ−Ａ’　ＲＮＡは、本質的には記述されたように（マニアチス（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ）ら、１９８２ＬオリゴｄＴセルロースに１回通して調製した。

二本［ｃＤＮＡはｃＤＮＡ合成のためのキット（ファルマシアＬＫＢバイオテク ノロジー社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉ ｎｃ、）、プリーザントヒル（Ｐｌｅａｓ−ａｎｔ　Ｈｉｌｌ）　、カリフォル ニア州）を用いて調製し、λｇｔｌＯにクローニングしてパッケージングした。

ネズミＭＩＰＩに　゛　るヒトの゛　−のＣ９３７ｃＤＮＡライブラリーの培養 、ニトロセルロースフィルターの作成、フィルターのブレハイブリダイゼーショ ンおよびハイブリダイゼーションはＲＮＡ、２６４．７　ｃ　ＤＮＡライブラリ ーのスクリーニングに関して例１で記述した様に行った。プローブのＤＮＡはｍ ＭＩ　Ｐ−２ｃＤＮＡから単離した１８６ｂｐのＢａｌｌ−Ｂｇｌｎ断片だった 。突然変異誘発性プライ？−５’　−ＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＡＧ −３’を用いて試験管内突然変異誘発によって８ｇ１■サイトを導入した。Ｂａ ｌｌ−Ｂｇｌｌｌ断片は成熟したｍＭＩＰ−２のアミノ酸配列の大部分をコード するが、３つのＮ末端のおよび８つのＣ末端のアミノ酸をコードする塩基対を欠 いている。この断片を二ックトランスレーシゴンによって標識し、ミリリットル 当り約５００．０００ｃｐｍになるようにハイブリダイゼーション溶液に加えた 。

ハイブリダイゼーション後に、フィルターを室温で各３０分間、２ＸＳＳＣ２０ ，１％ＳＤＳ中の弱い条件で３回洗浄した。２枚のフィルターでともに陽性のプ ラークは低密度でプラークを形成させてセカンドスクリーニングに進んだ。陽性 のファージクローンを単離して、さらなる解析のためにＤＮＡをそれから調製し た。

クローニングおよびＤＮＡ　１の７ ｃＤＮＡインサートをＭ１３ファージベクターへサブクローニングして、ＤＮＡ の配列決定はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）　らのジデオキシチェインターミネーシ ョン法（１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ 、ユ４：５４６３）によって行った。

ｈｕ−ＭＩＰ−２αのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図２に示す。

この配列は４つの独立なりローンに関して確認されて、ｍＭ［’−２に類似する ヒトｃＤＮＡの２つのクラスの中でより数の多い方を代表する。ｈｕ−ＭＩＰ− ２βのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列はｍＭＩＰ−２に類似なヒトＣ ＤＮＡの２番目のクラスの代表であり、図３に示す。

例１ 期限断片分析 ＲＡＷ２６４．７細胞からＤＮＡをジレラ（ＤｉＬｅｌｌａ）らによって記述さ れたように単離した（１９８７、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓにおいて、ヘルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら編、 アカデミツクブレス（Ａｃａｄｅｓ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　、オリアンド（Ｏｒ ｉａｎｄｏ）、１９９ページ）、ヒトゲノミックＤＮＡおよびネズミＣ３Ｈ／Ｈ ｅＮゲノミックＤＮＡをクロンチック（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）　（パロアルト（Ｐ ａｌｏ　Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州）から購入した。

ゲノミックＤＮＡを制限酵素でその供給者の仕様書に従って消化した。消化した ＤＮＡを１％アガロースゲルで分離して、次にハイボンド（ＨｙＢｏｎｄ）ナイ ロン膜（アマ−ジャム（Ａｓｅｒ　Ｓｈａｍ）、アルリングトンハイ゛ン（Ａｒ ｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ）、イリノイ州）へ転写した。５０ｍＭリン酸 ナトリウムｐＨ６，５，５ｘＳＳＣ，１ｍＭビロリン酸ナトリウム、４０％ホル ムアミド、１０％デキストラン硫酸、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳおよ び１００■／ｄの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ中でフィルターをプレハイブリ ダイズし、ハイブリダイズした。サザン分析のために用いたＤＮＡは、１．１． Ｋｂ　ｍＭＩＰ−２ｃＤＮＡ（クローンｍＭＩＰ−２−２０ａ）、０．９８Ｋｂ 　ｈｕ−ＭＩＰ−２βｃＤＮＡ（クローンｈｕ−ＭＩＰ−２−４ａ）および１． ０５Ｋｂ　ｈｕ−ＭＩＰ−２ｃｒｃＤＮＡ（クローンｈｕ−ＭＴＰ−２５ａ）だ った。全てのｃＤＮＡをマルチプライマーＤＮＡラベリングシステム（アマ−ジ ャム（Ａｗｅｒｓｈａｍ）　、アルリングトンハイ゛ン（＾ｒｌｉローｇｔｏｎ 　Ｈｅｉｇｈｔｓ）　、イリノイ州）を使用し、”Ｐ−ｄＣＴＰでランダムブラ イミングによって標識した。２−４時間３７°Ｃでプレハイブリダイゼーシタン を行った後に、標識したＤＮＡをミリリンドル当りｌＸ１０’ｃｐｍになるよう に加えた。

ハイブリダイゼーションは１６−１８時間３７゛Ｃで行った。フィルターを室温 で１０分間２ＸＳＳＣ５０，１％ＳＤＳ中でゆすぎ、次に３回６５°Ｃで４５分 づつ０、ｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で洗浄した。いくつかの場合には、リハ イブリダイゼーシジンを可能にするためにハイブリダイズしたプローブを４５分 間６５°Ｃで０，５ｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミド中で処 理することでプロットからはがした。

丈１ヱ分析 ＲＡＷ２６４．７ＤＮＡを３つの制限酵素ＢａｍＨ１，ＥｃｏＲＩおよびＥｃ。

ＲＶの各々で消化してアガロースゲル電気泳動で分離して、２２ｐで標識したｍ ＭＩＰ−２ｃＤＮＡをプローブにしてハイブリダイズさせた。図６Ａに示す結果 は単一遺伝子を規定するｍＭＩＰ−２ｃＤＮＡと一致する。マウスＣ３ｔ（／Ｈ ｅＪＤＮＡを同様に解析したときに同し結果を得た（データは示していない）。

ヒトゲノミンクＤＮＡのサザン分析はｈｕ−ＭＩＦ’−２αおよびｈｕ−ＭＩＰ ＝２βｃＤ’ＮＡプローブを用いて行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄 の条件は、各々のｃＤＮＡをプローブとしたときにｈｕ−ＭＩＰ−２αおよびｈ ｕ−ＭＩＰ−２βを区別できるように決定した。しかし用いた条件ではｈｕ−Ｍ ＩＰ−２αおよびｈｕ−ｇｒｏ／ＭＧＳＡに特異的な配列を区別できない、ゲノ ミックヒトＤＮＡをＢａｍＨＬ　ＥｃｏＲＩまたはＥｃｏＲＶで消化してｈｕ− ＭＩＰ−２αまたはｈｕ−ＭＩＰ−２βｃＤＮＡをプローブとしたサザン分析を それぞれ図６ＢおよびＣに示す。各ｃＤＮＡを用いて得られたハイブリダイゼー ションのパターンは明らかに異なる。ＭＩＰ−２αｃＤＮＡは約２３および１． 　Ｉ　ＫｂのＥｃｏＲＶ断片に強くハイブリダイズし、一方でＭＩＰ−２ＳｃＤ ＮＡは７、　ＯＫ　ｂのＥｃ　ｏＲＶ断片にハイブリダイズした。同様に、ｈｕ −ＭＬＰ−２βｃＤＮＡは１．８　Ｋ　ｂおよび３．３Ｋｂ（弱く）のＥｃｏＲ Ｉ断片にハイブリダイズし、一方でｈｕ−ＭＩＰ−２αは３．３　Ｋ　ｂのＥｃ ｏＲＩ断片に強く、および約１、　Ｉ　Ｋ　ｂに、および４．６　Ｋ　ｂおよび ３．８ＫｂのＥｃｏＲＩ断片に弱くハイブリダイズした。最後にＭＩＰ−２βｃ ＤＮＡは２．４　Ｋ　ｂのＢａｍＨＩ断片に強く、および４．３　ＫｂＰのＢａ ｍＨＩ断片にとても弱くハイブリダイズし、一方でヒトＭＩＰ−２αｃＤＮＡは ２０．２．０および１．　Ｉ　Ｋ　ｂのＢａｍＨＩ断片に強くおよび４、３　Ｋ 　ｂのＢａｍＨＩ断片により弱くハイブリダイズする。特にＢａｍＨＩで消化し たＤＮＡから、ｈｕ−ＭＩＰ−２αｃＤＮＡプローブを用いて得たハイブリダイ ゼーシゴンのパターンが、ｈｕ−ＭＩＰ−２βｃＤＮＡプローブを用いたものと 比較してより複雑であることは、ｈｕ−ＭＩＰ−２αプローブは１つ以上の遺伝 子、恐ら＜ｈｕ−ＭＩＰ−２αのみならずｈｕ−ｇｒｏも検出していることを示 唆する。ここに示すデータからｈｕ−ＭＩＰ−２βおよびｈｕ−ＭＩＰ−２αは ２つの別個の遺伝子であると私達は結論することができる。

氾 クローニングおよび　タ　での （アメリカンタイプカルチャー　コレクシラン、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｉ ｅ）　、メリーランド州に１９８５年８月２７日に加入番号５３２４６で寄託し た）プラスミドＡＲＶ−２ｐ２５ｇａｇは、ｔａｃプロモーター、シャイン　デ ルガルノ配列（Ｓｈｔｎｅ　Ｄｅｌｇａｒｎｏ　５ｅｑｕｅｎＣｅｓ）　、およ び元のｐＢＲ３２２の配列の代わりとしてＥｃｏＲＩおよび１）ｖｕＩｌ制限サ イトの間から成るポリリンカーを含むｐＢＲ３２２の誘導体である。ＥＰ１８１ ，１５０も見よ。

クローンｈｕ−ＭＩＰ−２−４ａ　（例３）をＰｖｕｌ？およびＢａ１ｌで切断 して、次の配列をもつリンカ−にライゲーションする：ＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＣ ＣＣＣＴＣ，ＧＴＡＣＣＧＣＧＧＧＧＡＣＣ プラスミドＡＲＶ−２ｐ２５ｇａｇを次にＥｃｏＲＩ　およびＰ’ｖ　ｕ　ＩＩ で切断して、ライゲーションしたｈｕ−ＭＩＰ−２−４ａを挿入した。コヘン（ Ｃｏｈｅｎ）ら、ヒ匹、他、届、鋭Ｌ　胆Ａ　（１９７２）旦？２１１０の手順 に従って得た構築物で次にコンピテント大腸菌ＤＩ２’ｌＯ細胞をトランスフォ ーメーションする。

２２５−５０ｎの構築物で細胞をトランスフォーメーションして、形質転換体の 混合物を１００μｇ／ｄのアンピシリンを含むＬ−ブロスで作成したアガープレ ート上で培養した。プレートを３７゛Ｃで１２時間インキュベートして、アンピ シリン耐性のコロニーを１００μｇ／ｌｌ１１！のアンピシリンを含む１３１１ ！のし一ブロスへ移した。細胞を３７°Ｃで生長させて、１０μｌの１００ｍＭ 　ＩＰＴＧを加えて最終濃度１ｍＭにすることで発現を誘導し、その後３７“Ｃ で２時間インキユヘーシッンする１次に細胞を溶解させｔ、産物を精製する。

医旦 ±コム土工９発里 プラスミドｐＧＡ１１は、イーストグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナ ーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの転写制御下で、イーストα−因子先頭配列、 ヒトプロインシュリンの遺伝子、およびα−因子終結配列をコードするＤＮＡを 含む。ベクターはＥＰ３２４．２７４によく記述されている。

次のプライマーを用いてλｇ＋１０クローン（７ｇ＋１Ｏ−ｈｕ−ＶＩＰ−２− ４ａ）に由来する断片のポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＢ）増幅によ ってｈｕ−ＭＩＰ−２βのタンパクをコードする配列を得た：ＰＣＲ増幅の３０ サイクル後に、ＤＮＡをＫｐｎｌおよびＳａｌ、Ｉで消化して、α−因子の先頭 配列の４つのＣ末端のアミノ酸、二塩基のプロセッシングサイトおよび完全な７ ３個のアミノ酸の成Ｐｈ　ｕ　−Ｍ　Ｉ　Ｐ−，２βをコードする２４４ｂｐ断 片をアクリルアミドゲル電気泳動によって単離した。次にこの断片を、Ｋｐｎｒ および５ａｌｌで消化してアガロースゲル上で精製したｐＧＡ■１中にライゲー ションした。バクテリアをトランスフォーメーションしてスクリーニング後に、 プラスミドｐＭＩＰ５４０を得てＤＮＡシークエンシングで推定ヌクレオチド配 列をもつことが明らかになった０発現プラスミドルＹＭＩＰ５４０を提供するた めにこのプラスミドをＢａｍＨＩで消化して、ＧＡＰＤＨプロモーター配列、α −因子先頭配列／ｈｕ−ＭＩＰ−２β融合タンパク、およびα−因子転写終結配 列を含む得られた１１６３ｂｐの断片を、発現ベクターｐＡＢ２４のＢａｍＨＩ サイトへクローニングした。

サツカロマイセス　セレヴジアエ（シ皇１虹卯り狙Ｌｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の 菌株ＭＢ２　１　（Ｉｅｕ２−３、Ｉｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３４１　、ｈｉｓ ３−１５　、ｕｒａ３Δ、ＣＡＮ　、　Ｃｉｒ’）をプラスミドｐＹＭＩＰ５４ ０で標準的な手順によりトランスフォーメーションして、形質転換体をｕｒａ原 栄養性で選択した。発現は、独立の形質転換体の単一コロニーのロイシン選択培 地への接種および約４８時間の生長によって解析した。次に培養を遠心して、ウ ラシルを欠いた培地に細胞を懸濁して、２０倍にｕｒａ選択培地で希釈した０次 に培養を約７−２時間生長させて、次に収穫して細胞を含まない上清を調製した 。条件を設けた培地をｈｕ−ＭＩＰ−２βの存在について５ＤＳ−ＰＡＧＥおよ びその後のクマンー染色で解析した０本来のｍＭＩＰ−２標＊（Ｂ、シェリー（ Ｂ、　５ｈｅｒｒｙ）、ロンケフエラー大学（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ　ｕｎｉ ｖｅｒｓｔｔｙ）によって提供された）と同しく移動するハンドが５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ上で見えた。

形 呻　の　におしる Ａ　Ｃｏ５−７　における プラスミドｐｓＶ７ｔＰＡ２１　（ＡＴＣＣ加入番号４０１６３．１９８５年２ 月１４日に供託された）は、ＳＶ４０複製起源、初期プロモーターおよびポリア ゾニレーシぢンサイトに隣接するポリリンカー配列中に全長のヒトＬＰＡをコー ドするＤＮＡを含む哺乳類の発現ベクターである。このプラスミドもＰＣＴ特許 出願ＷＯ３６１０５５１４に記述されている。

プラスミドｐＳＶ−ＭＩＰ２Ｓを作成するためにｈｕ−ＭＩＰ−２３をコードす る配列をプラスミドＰＹＭＩＰ５４０からＰＣＲで増幅して、そのサイトの５′ に５ｖ４０？ｊｌ製起源および初期プロモーターおよび挿入サイトの３′にポリ アゾニレ−ジョンサイトをもつ発現ベクターｐＳＶ７　ＬＰＡ２１のサイトへ挿 入する。

グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびファン　デルＥ　ｂ、（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ 、）、　Ｖｉｒｏｌ、　（１９７３）、５２：４５６−６７に記述された手順を 修飾したものを用いてＣＯ３−７細胞をｐＳＶ−ＭＩＶ２βでトランスフェクシ ヨンする。サンプルを２枚の皿に加えて、６時間ＣＯ２インキュベーター中で３ ７°Ｃで細胞上へ置く。培養後に細胞を穏やかに、カルシウムおよびマグネシウ ムを含まないＰＢＳでゆすぐ。次に皿をアジュバントとしてのグリセロールに３ 〜４分間さらして、ゆすぎ、４．５１ｇ／ｉグルコース、３．７■／ｄ重炭酸ナ トリウム、２９２馬／ｄグルタミン、１１ＯＩ＠ｌｙｄピルビン酸ナトリウム、 １００ｔＪ／ｎペニシリン、１００　Ｕ／ｄストレプトマイシン、および１０％ 牛脂児血清（ＥＣ３）を補ったＤＭＥＭ培地で栄養を与える。培養をグリセロー ルの衝撃から回復させた後、培地を血清を含まない培地に代える。血清を除去し てから１２時間後に、条件を設けた培地をｈｕ−ＭＩ　Ｐ−２βについてアッセ イする。

Ｂ　ＣＨ○　にお番る Ｃ　ＨＯｄｈｆｒ−細胞を５Ｘ１０’から１０’ｉｉｌ胞／皿（ＩＯＣＩＩ）の 密度でトランスフエフシコンの前日に、１．１８　Ｋ／ｄ　Ｎ　ａ　ＨＣＯｘ、 ２９２　ｔ１ｇ／Ｍ１グルタミン、１１０ｇ／ｄ　ピルビン酸ナトリウム、１０ ００７ａｆ！ペニシリン、１００Ｕ／ｄストレプトマイシン、１５０■／威プロ リン、および１０％ＥＣ３を補ったＦ１２培地中で培養した。次に上のパート（ Ａ）で記述したように細胞をトランスフエフシコンするが、さらにアデノウィル ス主要後期プロモーターに結合したｄｈｆｒ遺伝子をもつマーカープラスミドを 含める（カルシウムリン酸中で共沈させる）、４８時間培養後に細胞を１：２０ に分けて、選択培地（ＤＭＥＭ、１５０　［／ｄプロリン、および１０％ＥＣ３ ）中で生長させて、１−２週間培養する。

例ユ Ａ、　２　マーカー　コー′　るブースミ′の瞥ネズミＤＨＦＲｃＤＮＡをもつ プラスミドｐＡｄ−ＤＨＦＲは、アデノウィルス−２（Ａｄ−ＭＬＰ地図単位　 １６−２７．３）の主要後期プロモーターのマウスＤＨＦＲｃＤＮＡ　（Ｊ、Ｈ ，ヌンベルグ（Ｊ、　Ｈ，Ｎｕｎｂｅｒｇ）ら、釦旦（１９８０）１９：３５５ −６４）の３′非翻訳配列への融合によって構築した。初期転写単位の部分をコ ードし、小を抗原遺伝子のイントロンを含み、ＳＶ４０初期部分転写終結部分を もつ５Ｖ４０ＤＮＡをｐｓＶ２−ｎｅｏから得て（サザン（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ 　）およびベルブ（Ｂｅｒｇ）　、Ｊ、Ｍｏ１．　ＡＩ！Ｐｉ、　Ｇｅｎ、　（ １９８２）　１　：３２７−４１Ｌ　ＤＨＦＲｃＤＮＡの３′非翻訳末端に融合 させた。これらの３つの部分をｐＢＲ３２２ヘサブクローニングしてプラスミド ｐＡＤ−ＤＨＦＲを得た。

発現カセットを、哺乳類細胞発現ベクターｐｓＶ７ｄ　（２４２３ｂｐ）を用い て調製した。

プラスミドｐＳｖ７ｄ（トルエツト（Ｔｒｕｅｔｔ）ら、１９８５、ＤＮＡ、ｉ ：３３３を見よ）を次のように構築した：５Ｖ９０複製起源および初期プロモー ターを含む４００ｂｐのＢａｍＨＩ／Ｈ４ｎｄｌＩ［断片を（ボール　ベルブ（ Ｐｏｕｌ　Ｂｅ−「ｇ）、スタッフォード大学（Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｊｖｅ ｒｓｉｔｙ）、カリフォルニア州から得た）ｐｓＶｇｔｌから切り出して、精製 した。ＳＶ４０のポリＡ付加サイトを含む２４０ｂｐのＳＶ４０　ＢｃｌＩ／Ｂ ａｍＨＩ断片をｐｓＶ２／ＤＨＦＲ（サブラマ＝　（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）ら、 Ｎｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（１９８１）上：８５４−８６４）から切り 出して精製した。断片を次のリンカ−を通して結合したニストップ　コドン このリンカ−は全ての３つの読みわく中にストップコドンを含むのみならず５つ の制限サイトを含む。ＳＶ４０複製起源、ＳＶ４０初期プロモーター、ストップ コドンの入ったポリリンカーおよびＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンサイトを含む 得られた６７０ｂｐの断片を、約１．５　Ｋ　ｂの欠損のあるｐＢＲ３２２ｇ導 体であるｐＭＬ　（ラスキー（Ｌｕｓｋｙ）およびボンチャン（３ｏｔｃｈａｎ ）、Ｃｅ１ｌ（１９８４）３６：３９１）のＢａｍＨＩサイトクローニングして ｐＳＶを得た。ｐｓＶ６のｐＭＬ配列中（７）ＥｃｏＲＩおよびＥＣ０Ｒｖサイ トはＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲ■で消化して除去して、Ｂａ１３１ヌクレアーゼ で処理して両末端の約２００ｂｐを除去して、最後に再びライゲーションしてｐ ＳＶ７ａを作成した。Ｂａ１３の切除で、ＥｃｏＲＶサイトから約２００ｂｐ離 れた、ＳＶ４０部分に隣接する１つのＢａｍＨＩ制限サイトも除去された。ＳＶ ４０部分に隣接する２番目のＢａｍＨＩサイトを除去するために、ｐｓＶ７ａを Ｎｒｕｌで消化し、Ｎｒｕ　Ｉは複製開始点の上流のＰＭＬ配列中を切断する。

ｐＳＶ７ｃおよびｐＳＶ７ｄは連続したポリリンカーの置き換えを代表する。

まずｐＳＶ７ｂを５ｔｕｌおよびＸｂａ　Ｉで消化した。次に下のリンカ−をベ クター中にライゲーションしてｐＳＶ７ｃを作成した：その後、ｐＳＶ７ｃをＢ ｇｌ■およびＸｂａ　Ｉで消化して、下のリンカ−をライゲーションしてｐｓＶ ７ｄを作成した：２．１旦ＭＶ旦互 異質なタンパク質のメツセンジャーＲＮＡの転写および安定の水準を改善するた めの努力においてＳＶ４０初期転写開始部分をヒト巨細胞つィルス掻初期部分の 配列（ポシャルト（Ｂｏｓｈａｒｔ）ら、Ｃｅ１ｌ（１９８５）４：５２１−５ ３０）で置き代えた。さらにはＳＶ４０初期部分によってメツセンジャーＲＮＡ に寄与する５′非翻訳配列を、第１イントロンを含めたＨＣＭＶ　ＩＥＩ遺伝子 の５′非翻訳配列と置き換えた。スプライシングされる転写物はより早くプロセ ッシングされてより安定なｍＲＮＡになるという仮定の下に、このイントロンを 含める０発現ベクターはＣＯ３７細胞において一過性の発現を可能にするための ＳＶ４０複製起源およびアンピシリン耐性の選択でＤＮＡのクローニングを可能 にするためのバクテリアのβ−ラクタマーゼ遺伝子も持っている。

プラスミドは、（例７、セクション８．　１で記述された）ＳＶ４０ポリアデニ レーシテン部分を含むｐＳＶ７ｄの７００ｂｐの５ａｉｌ−ＰｖｕＴ断片、ＳＶ ４０複製開始点および残りのβ−ラクタマーゼ遺伝子を提供するｐｓＶＴ２　（ ミャーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、ｑ旦（１９８１）２５：３７Ｂ−８４；リオ（Ｒｉ ｏ）ら、Ｃｅ１ｌ（１９８３）３又：ｔ２２７−４０）の１４００ｂｐの（クレ ノーポリメラーゼでフィルインした）Ｐｖｕ　Ｔ−ＥｃｏＲＩ断片、ＩＥＩタン パク質の翻訳開始点の近くに試験管内突然変異誘発によって５ａｌｌサイトを導 入したもつヒト巨細胞ウィルス（タウン菌株（Ｔｏｗｎｅ　５ｔｒａｉｎ）　） のサブクローンのプラスミドに由来する１７００ｂｐの３ｓｐＩ−３ａｉｌ断片 、および因子Ｖｌｌｌ：Ｃ９Ｃ９２Ｋ糖タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む ｐｓＶＦ８−９２Ｃの４３００ｂｐの５ａｉｌ−３ａｉｌ断片から構築した。

ｐｃＭＶ６ａ１２０−３Ｆ２プラスミドは、因子Ｖｎ［：Ｃ９Ｃ９２Ｋタンパク 質をコードする５ａｉｌ−３ａｉｌ断片を、異質で遺伝子に融合させたヒトｔＰ Ａの５′非翻訳およびシグナル配列を含む発現カセットに置き換えたことを除い ては、上に述べたｐ　ＣＭＶ　６　ａに等しい。このベクターを、寄託番号６８ ２４９でＡＴＣＣに寄託した大腸菌にトランスフォーメーシゴンした。ｐｃＭＶ ６ａ１２０−５Ｆ２をＮｈｅｌおよび５ａｉｌで消化すると異質な遺伝子が除去 されるだろう。任意のｈｕ−ＶＩＰ−２βポリペプチド遺伝子と、哺乳類の発現 へクタ−ｐｃＭＶ６ａ１２０−３Ｆ２中に挿入したリンカ−へライゲーションで きる。

例えばｈｕ−ＭＩＰ−２β遺伝子をイーストプラスミドからポリメラーゼチェイ ンリアクション（ＰＣＲ）増幅で得る。ＰＣＲ反応を行うためのプライマーは、 図３に示したｈｕ−ＭＩＰ−２βの核酸の配列を下にして容易に構築することが できて、増幅した遺伝子をベクターへ挿入するためのＮｈｅｌおよび５ａｉｌの ような適当な制限サイトを含むようにプライマーを構築することができる。便利 なようにＤＨＦＲ遺伝子をこの新しいｈｕ−ＭＩＰ−２β発現カセットへ挿入す ることができる。この新しいベクターをｐＣＭＶ−ＭＩＰ２βと呼ぶ。

Ｃ，ＭＩＰ−２二ｌの゛　１１ この例は本来のｈｕ−ＭＩＰ−２βを生産する安定なｃｎｏｍ胞系列の調製を記 述する。

ＤＨＦＲ−ＣＨ○細胞系列ＤＧ４４（Ｇ、ウルラウブ（Ｇ、　Ｌｌｒｌａｕｂ） ら、江釦旦、艶ム　釦匹ｔ、（１９８６）１又：５５５−６６）をまずプラスミ ドｐＣＭＶ−ＭＩＰ〜２βでトランスフェクションする。このプラスミド中で（ 例７Ｂ−２で記述された）ＣＭＶプロモーターは、（例５で記述された）ｐＹＭ １５５０に由来するＭＩＰ−２β遺伝子を制御し、（例７Ｂ−２で記述された） ｔＰＡ先頭配列はコードするｈｕ−ＭＩＰ−２βの分泌を指図し、（例７Ａで記 述された）ｐＡｄ−ＤＨＦＲに由来するＡｄ−ＭＬＰ−ｄ　ｈ　ｆ　ｒカセット の下流を含む。

Ｗ、チヤ不イ　（Ｗ、　Ｃｈａｎｅいら、５ｏｔｓ、Ｃｅ旦、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ ｅｔ、　（１９８６）　１又：２３７−４４によって記述されたポリブレン法を 用いて細胞をトランスフェクションした。（ＤＭＥＭ＋１０％ＤＦＳＣ中で）Ｄ Ｉ（ＦＲ”細胞に対する選抜によって多くのｈｕ−ＭＩＰ−２β生産株を単離す る。

寄託情報 次の物を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１ バークローンドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）　、ロフクヴイル（Ｒ ｏｃｋｖｉ　１ｉｅ）、メリーランド州２０８５２に寄託した： １　日　１ チャイニーズハムスター卵巣細胞Ｃｌｌ０−ＤＧ４４　１９９０年３月８日　Ｃ ＲＬ　１０３７８大腸菌ＨＢ　１０１　ｐｃＭＶ６ａ１２０−ＳＦ２　１９９０ 年３月８日　６Ｂ２４９サツカロマイセス　セレヴジアエ（Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）　１９９０年６月２０日　７４００２ＭＢ　２−１　（ｐＹＭＩＰ５４ ０） これらの物を、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的な承認に関する ブダペスト条約の約定の下に供託した。これらの寄託物は便利な物として該当分 野で熟練した人々に提供されて、寄託が３５０．　Ｓ、Ｃ，セクション１１２に 従って要求されるという承認を表わさない。寄託された物に含まれるポリヌクレ オチドの配列およびそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、 この言及によって本明細書中に含まれるものとし、本明細書中に書かれた配列の 記述についての任意の争議の成り行きを支配する。寄託された物を構築する、使 用する、または売るためには認可を要求されるかもしれず、そしてそのような認 可を本明細書によって承諾しない。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、４ Ａ、ｃＤＮＡ ｈｕ−ＭＩＰ−２β　ｈｕ−ＭＩＰ−２αｈｕ−ｇｒｏ　ｍｕ−ＫＣ０３′未翻 訳 ０口 Ｊ＝ シ＝ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　５Ｂ−Ｉ ＭＩＰ−２同族体のアライメント ＦＩＧ、　５Ｂ−２ ＫＫエエＥＫＭＬｎｓｄＫＳＮ ＫＫ工工ＥＫＭＬｋｎＧＫＳＮ ＋１１１１１　１　１ ＱＫ工ＩＥＫｉＬｎＫＧｓｔＮ ＱＫ工ＶＱＫＭＬ　Ｋ　ＧＶｐＫ Ｉｌｌ　ＩＩ　Ｉ　Ｉ　＋ ＱＫ工１ＱＫｉＬｎＫ　Ｇｋａｎ ＦＩＧ、６ ｋｂ　Ｂ　Ｅ　Ｒｋｂ　Ｂ　Ｅ　ＲＢ　Ｅ　Ｒ・ １．４− 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） ］ 平成　４年１２月２２日′１

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト組織を実質的に含まないヒトＭＩＰ−２βポリペプチドからなる組成物 。
2. ２．実質的に他のヒト蛋白質を含まない請求項１の組成物。
3. ３．実質的に他の蛋白質を含まない請求項１の組成物。
4. ４．ｈｕ−ＭｉＰ−２βポリペプチドがｈｕ−ＭＩＰ−２βである請求項１の組 成物。
5. ５．ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドをコードしている外来領域からなるＤＮＡ 分子からなる組成物であって、実質的に他のＤＮＡを含まない組成物。
6. ６．ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドをコードしている上記領域がイントロンを 含まないＤＮＡ配列である請求項５の組成物。
7. ７．ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドのアミノ酸配列をコードしている、イント ロンを含まないＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子。
8. ８．ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドがｈｕ−ＭＩＰ−２βである請求項７のＤ ＮＡ分子。
9. ９．請求項５のＤＮＡ分子によって形質転換された細胞集団であって、該ＤＮＡ 分子によって形質転換されない細胞を実質的に含まない細胞集団。
10. １０．ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドを製造する方法であって、下記段階から なる方法： 請求項９の形質転換された細胞集団を提供し；該細胞集団を上記ポリペプチドが 発現される条件下に生育させ；そして該ポリペプチドを回収する。
11. １１．該ポリペプチドが該細胞によって分泌される請求項１０の方法。
12. １２．少なくとも１０個の配列ヌクレオチドからなる一本鎖ＤＮＡ分子であって 、該配列ヌクレオチドが、ｈｕ−ＭＩＰ−２βに特有の配列またはその相補性Ｄ ＮＡ配列からなる一本鎖ＤＮＡ分子。
13. １３．ヒトＭＩＰ−２βをコードしている配列に対して実質的に相同なポリペプ チドの存在を決定する方法であって、下記段階からなる方法：該ポリペプチドを 含むことが推測される試料を提供し；該試料を、請求項１２の一本領ＤＮＡに相 補性の配列を有するヌクレオチドプローブとともに、該プローブが上記試料由来 の核酸とハイブリッドを形成するであろう条件下にインキュベートし；そして核 酸ハイブリッドを検出する。
14. １４．ｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチド上のエビトープとは反応性であるが、ネ ズミのＭＩＰ−２、ヒトｇｒｏタンパク質またはネズミのＫＣ遺伝子によってコ ードされたタンパク質とは反応しない抗体。
15. １５．該抗体はモノクローナルである請求項１４の抗体。
16. １６．請求項１４の抗体からなる組成物であって、実質的に他の免疫グロブリン 分子を含まない組成物。
17. １７．請求項１５のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞株。
18. １８．試料中のヒトＭＩＰ−２βの存在を決定する方法であって、下記段階から なる方法： 上記試料をｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドと反応性の抗体とインキュベートし ；そして 免疫複合体を検出する。
19. １９．試料中の抗ｈｕ−ＭＩＰ−２β抗体の存在を決定する方法であって、下記 段階からなる方法： 上記試料を請求項２の組成物とインキュベートし；そして免疫複合体を検出する 。
20. ２０．有効量のｈｕ−ＭＩＰ−２βポリペプチドからなる、骨髄造血細胞での骨 髄造血を促進する医薬組成物。