JPH01131120A

JPH01131120A - 新規の低血糖剤及び成長促進剤

Info

Publication number: JPH01131120A
Application number: JP63194693A
Authority: JP
Inventors: Victor Medina; ビクター　メディナ; Alfred Stracher; アルフレッド　ストレイチャー; Leo Kesner; レオ　ケスナー
Original assignee: Protor Co
Current assignee: Protor Co
Priority date: 1987-08-07
Filing date: 1988-08-05
Publication date: 1989-05-24
Also published as: CA1338824C; DE3875845D1; EP0302445B1; DE3875845T2; EP0302445A3; EP0302445A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、インシュリンホルモンの薬理学的有効性を高
める方法に関する。

〔従来の技術〕

現在、多くの非インシユリン含有性低血糖剤が存在し、
そしてこれらは最近、再調査されて来た（Ａｓｍａｌ、
など、　、釘」巨、　２８．６２〜７８（１９８４）及
びＷｏｌｆ、など、　、Ｄｉａｂｅｔｏ、Ｉｏ　ｉａ、
　２２．４５６〜４６３（１９８２）　）。スルホニル
尿素薬は、膵臓からのインシュリン分泌を刺激し、そし
て今までのところ知られていない末梢効果を及ぼし；ビ
グアニドは糖新生、腸のグルコース吸収及びミトコンド
リアの酸化を阻害し；２−ブロモパルミテート、ω−メ
チル−２−テトラデシルグリセレート、８８０７−２７
及びアシルアミノカルニチンは、長鎖脂肪酸の酸化を阻
害するカルニチンバルミトイル−トランスフェラーゼｌ
酵素を阻害する。

インシュリンは、膵臓から分泌され、そしてグルコース
の恒常性の維持に関与する、６，０００ドルトンの分子
量のポリペプチドホルモンである。

糖尿病患者は、インシュリンが生造されず（タイプＩ糖
尿病）又は適切に利用されない（タイプ■糖尿病）かい
ずれかの場合、高められた血液グルコースレベル及び妨
害された代謝の多くの有害な効果を阻止するために、イ
ンシュリン又は他の低血糖剤により処理されるべきであ
る。種々の病理学的欠陥が糖尿病状態を鹿びくことは明
確に理解されている。治療のための現在の対策は、最近
報告されている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｄｉａｌｏｇｕｅ
、八ｍ　、　Ｊ　、　Ｍｅｄ　、＋７９（Ｓｕｐｐｌ　
２Ｂ）、　　１〜４４（１９８５））。

多くの糖尿病は、食後、それらの血液中のグルコースレ
ベルを通常の範囲内で維持するために、１日ｌ又は複数
回のインシュリン注入を必要とする。

注入されたインシュリンは組織プロテイナーゼによりす
ばやく分離されるので、血液中の糖を低めるその有効性
は一時的である。注入後、プロテアーゼインシュリナー
ゼによるインシュリンの分解は、約４０分のｔｌ／２で
生じ、そしてこの短い期間の作用のために、多くの方法
により、その有効性を長くするためにインシュリンのタ
ンパク質分解不活性化を阻害しようと努めて来た。イン
ビトロでインシュリナーゼを阻害するような１種の薬物
は、抗生バシトラシンであることが文献に報告されてい
る。

バシトラシンは、ヒトにおいて抗菌剤として及び動物に
おいて成長促進剤として有用であることが見出されてい
るポリペプチド抗生物質である。

市販されているバシトラシンの抗菌性質は、主に１種の
両分、すなわちバシトラシンＡに存在する。

それは、グラム−陽性細菌の膜機能、細胞壁合成及びタ
ンパク質代謝を妨害することによって、それらの細菌に
対して最っとも作用する。

成長促進のために最っとも広く使用されている食物添加
物は、亜鉛バシトラシン及びこの抗生物質のバシトラシ
ンメチルジサリチレート形である。

低レベルの抗生物質の食物への添加が動物の成長及び生
成物を改良することができることは、−Ｃ的に許容され
ているが、その作用の機構は知られていない（Ｆｒｏｙ
ｓｈｏｖ、　Ｄｒｕ　ｓ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｎ
ｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、　チャプター２４，６６５
〜６９４ページ（１９８４）　）。

市販の製剤は、それぞれ合計含有量の６５〜７０％及び
１５〜２０％を示す少なくとも２０種の異なった化合物
とバシトラシンＡ及びＦとの混合物であることがこれま
で知られて来た（ＴＳＬＩＪ　ｉ＋など０、ム舅Ｅ辺り
中■工、似、５９７〜６０Ｂ（１９７４）　）。その抗
生性質の他に、バシトラシンの市販の製剤は、種々のイ
ンビトロ実験状況においてたとえば単暉されたラットの
肝細胞及び脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）によりイ
ンシュリンの分解を阻害することができることが示され
た（Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ、など、　、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏ　　＋１０８．１１４２〜１１４７（１９８１）
、　Ｒｏｔｈ、など、　、３ｉｏｃｈｅｍ。

肛並り紅ヒｈ並ｖ胆１１皿、４３１〜４３８（１９８１
）及びＰｅａｖｙ、など、　、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　３
４．２１７〜２２０１９８５）　）。

従って、バシトラシンは、グルコースの使用に基づいて
インシュリンの作用を強化することが示された。

本発明によれば、約２０％以下、好ましくは約１０％以
下及び最っとも好ましくは約５％以下の重量のバシトラ
シンを含有する両分か市販のＵＳＰバシトラシンから単
離された。この両分は明らかに、抗生物質的に活性では
ないが、しかし出発のバシトラシン混合物に関する抗−
インシュリナーゼ活性においては不均等ではあるが高い
。

それは、身体が十分なインシュリンを製造するいくつか
のタイプの糖尿病において、それ自体単独で投与され得
る。しかしながら、はとんどの場合、この物質は、それ
らと共に混合された又はそれらに共有結合されたインシ
ュリンと共に投与されるであろう。インシュリンは、そ
の混合の前又は新規のバシトラシン画分との反応の前、
他のプロテアーゼインヒビターにより前もって変性され
得る。

本発明のさらにもう１つの観点によれば、新規のバシト
ラシン画分は、成長プロモーターとして動物の飼料に使
用され得る。バシトラシンは動物の成長を早めることが
知られているが、しかし−船釣な飼料においては所望さ
れない。なぜならば、その広範囲な使用は、バシトラシ
ンに耐性である細菌への動物の暴露及びその細菌に対す
る１物の消費をもたらすであろう。非−抗生画分の使用
は、この問題を克服する。

その成長促進は別として、その活性画分はそれ自体低血
糖性である。明らかにそれは、長時間ヒト又は動物の体
内でインシュリンを保持し、すなわちその分解を阻害す
る。

活性インシュリナーゼインヒビター画分の使用は、個人
が消費する食物中に微量の抗生物質を含む食物生成物に
暴露された個人に時々進展する抗生物質耐性に関連する
問題を克服するであろう。

所望するポリペプチド画分を得るために、バシトラシン
は従来の方法で製造される。その主成分は、バシトラシ
？’Ａ及びＦと命名されているが、しかしこれらは実質
的に抗−インシュリナーゼ活性を示さない。従って、バ
シトラシンは種々の方法で分別され、そして非−Ａ、非
−Ｆ成分は、さらに分別され、そして／又は精製され得
る所望する物質を構成する。

好都合により、分別は、選択的溶媒及び希釈剤、緩衝液
、等を用いて、従来の吸着剤、たとえばセファロース、
活性化された炭素、イオン交換体及び同様のものからの
選択的又は優先的な吸収及び／又は溶離を含む。従って
、より粘り強く保持されるであろう両分は、条件の選択
により調整され得る。

回収された両分は単離され、そして実質的な抗−インシ
ュリナーゼ活性を示さない両分は捨てられる。所望する
両分は、バシトラシンＡ又はＦとおよそ同じの約１４０
０の分子量を有すると思われる。

それらの抗−インシュリナーゼ及び抗菌活性は、従来の
方法でアッセイされ得る。たとえば、インシュリナーゼ
抑制活性は、Ｄｕｃｋｗｏｒ　ｔｈ　、など９、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　６９　、３６９８
〜３７０２　（１９７２）の方法に従って測定され、そ
して抗菌活性は、Ｐａｔｒｉｃｋ。

など０、＾ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ａｎｄ　ＣｈｅＩＩ
Ｉｏｔｈｅｒａ　　、　　１　＋１３３〜１３７（１９
５１）の方法に従って測定された。

この精製された両分の投与は、対象のシステムにおいて
インシュリナーゼと戦う。従って、十分なインシュリン
を産生ずるが、しかしその問題は過剰のインシュリナー
ゼである患者の場合、この物質自体で十分であろう。し
かしながら、インクある。これは、患者の状態に依存し
て、異なった時間で及び種々の割合で行なわれ得る。

その物質はそれらの有効性を破壊しない態様で都合良く
一緒に投与され、そしてさらに都合良くお互い共有結合
される。

インシュリンは、ポリペプチド画分の重量の約１〜１及
び好ましくは０．２〜２０倍で都合良く存在する。

存在する場合、共有結合は、多価、好ましくは２価の化
合物、たとえばジカルボン酸、ジアミン、アミノカルボ
ン酸、ジアルデヒド、ジイミド、ジイソシアネート、等
に由来することができる。鎖の長さは種々であるが、し
かし好都合には、約４〜２０個の原子の長さである。適
切なカップラーは、たとえばε−アミノカプロン酸、グ
ルタルアルデヒド、カルボジイミド、ヘキサメチレンジ
イソシアネート、ホスゲン及び同様のものを含む。

種々の利用できる方法が報告され、そしていくつかの最
近の総説に収集されている〔にｅｎｎｅｄｙなど、（：
１ｉｎｉｃａ　Ｃｈｅｍ、Ａｃｔａ＋　７０＋　　１〜
３Ｈ１９７６）　；ＭｅｔｈｏｄＥｎｚｙｍｏｌｏｇＶ
　１１２．　Ｐｔ、Ａ（１９８５）チャプター１６　、
１７　。

１９　、２０　、２１　、２３）。

カップラーの量は、組合されたインシュリン及びポリペ
プチド画分のＯ〜約１０又はさらに２０重量％であるこ
とができる。そのようなカップリングは、溶媒中にすべ
ての３種の成分を混合することによる又は初めにカップ
ラーと１つの成分とを反応せしめ、そして次にその結合
された中間体と他の成分とを段階的に反応せしめること
による従来の方法でもたらされ得る。次に、所望する物
質は副生成物及び／又は不純物を含まず、そして単独で
又は従来の添加物、たとえば緩衝液、充填剤、溶媒、安
定剤、等と共に容易に使用され得る。・新規の両分は、
経口、非経口又はいずれか適切な他の処理手段により投
与され得る。すべての場合において、投与は、インシュ
リン処理と同時、適切な量のインシュリンの投与の前又
は後のいずれかであり得る。

正確な投与量は、患者の状態、体重、等に依存するであ
ろう。１日当り約１〜１００単位及び好ましくは約２〜
２０単位のインシュリンが成人のために適切である。し
かながら、これは医師により必要とされる場合、特別に
超過され又は・残じられ得る。

ポリペプチド画分が動物の飼料補足物として使用される
場合、それは約１〜１００重量ｐｐｍ及び好ましくは約
３〜５０重ｆｆ１ｐｐｒ＠で存在することができるが、
しかし動物の飼料によりさらに希釈され得る。投与され
る量は、動物及び発育のその段階に依存する。

本発明は次の例によりさらに説明されるであろう。ここ
で特にことわらないかぎり、すべての部は重量によって
である。

■−１充填カラム（２，８ｘ５６ｃｍ）中の３５０−のべ・ノ
ド体積のＣＭ−セファロースを、０．０５Ｍの酢酸アン
モニウム（ｐＨ４，５）により平衡化した。５０ｒｎｌ
の緩衝液中に溶解された１ｇの市販のバシトラシン溶液
を、前記充填されたカラムに適用した。その物質を平衡
緩衝液２１により希釈し、続いてＩＭの酢酸アンモニウ
ム緩衝液（ｐＨ４，５）３５０ｍｊにより希釈した。５
−の両分を集め、そして２５２．２８０及び２９０ｔ＋
ａ＋での吸光度測定を行なった。さらに、インシュリナ
ーゼ抑制活性の測定をそれぞれのピークに対して行なっ
た。無視してよいインシュリナーゼ抑制活性を示すバシ
トラシンＦ及びＡを、第１の緩衝液により別々のピーク
として希釈した。

それらのピークを集め、凍結乾燥せしめ、重量を計り、
そして比活性の測定のために５■／ｍ７の濃度で水中に
溶解した。第２１１街液により集められた物質は、適用
された物質の合計重量の５〜１０％及び合計インシュリ
ナーゼ抑制能力の９０％を含んだ。この物質の比活性は
、市販の出発物質の比活性の１０〜１２倍であった。肝
ＬＣ及びゲル濾過の研究は、この画分が種々のインシュ
リナーゼ抑制能力のいくつかの成分を含むことを示した
。

貫−１例１の活性画分の１０Ｍモル（分子量＝約１４００）を
、乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＺ中に溶解
する。これに、１−エチル−３，３−ジメチルアミノプ
ロピルカルポジイミド（ＣＤ　Ｉ）２０μモル及びＮ−
ヒドロキシスクシンイミド２０μモルを添加する。この
塊状物を室温で２時間反応せしめ、そして次に撹拌しな
がら、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム溶液３〇−中に溶解
されたインシュリン１．５ｇモルの溶液を滴下すること
によってその生成物をインシュリンと結合する。室温で
２時間後、その生成物を、５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ２０
支持材により充填された直径３．５　ｃｍの５０ａｍク
ロマトグラフィーカラムに適用する。溶離は、０．９％
のＮａＣｌ溶液によりもたらされ、そして百分が集めら
れる。抗−インシュリナーゼ活性を示すこれらの両分を
、臨床的に使用することができる。

■−主ａ）例１の活性画分１０μモルを、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド１５０ｎモル、カルボジイミド５００μモル
及びジアミノブタン誘導体モルにより処理する。その反
応を室温で４時間進行せしめ、そしてその混合物を例２
におけるようにして５ｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフイ
ーにより分離し、そして種々の両分をビクリルスルホン
酸によりアミノ官能基について試験した。初めのアミノ
含有画分は、バシトラシンのジアミノブタン誘導体であ
る。

この両分を凍結乾燥せしめる。

ｂ）インシュリン１０μモルを、０．０１ＭのＨｔＪ中
に？理解し、０．６■／−の濃度にし、カルボジイミド
を導入し、０．１　Ｍの濃度にし、そしてそのｐＨを希
釈ＮａＯＨにより７．０に調整する。（ａ）の生成物を
水２ｃｃ中に溶解し、そして１時間ｐ１１７で維持され
ているインシュリン溶液に滴下する。

例２及び３の生成物を５ｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフ
イーにより単離し、そしてその活性成分を適切な量の投
与の前、凍結乾燥せしめる。

この発明の好ましい態様を詳細に説明し、そして記載し
たが、これによってこの発明の範囲を限定するものでは
な（、そして本発明の特許請求の範囲内で修飾及び変更
を行うことができることは理解されるであろう。

Claims

【特許請求の範囲】１、バシトラシンから単離され、そして重量を基礎に、
前記バシトラシンの少なくとも５倍の抗−インシュリナ
ーゼ活性を示すポリペプチド画分。２、バシトラシンから単離され、そして重量を基礎に、
前記バシトラシンの少なくとも５倍の抗−インシュリナ
ーゼ活性を示すポリペプチド画分及びインシュリンを含
んで成る組成物。３、前記インシュリンが前記ポリペプチド画分の重量の
約０．２〜２０倍で存在する請求項２記載の組成物。４、前記インシュリンが前記ポリペプチド画分に共有結
合される請求項２記載の組成物。５、請求項２記載の物質及び医薬的に許容できる希釈剤
を含んで成る組成物。６、前記共有結合がジカルボン酸、ジアミン、アミノカ
ルボン酸、ジアルデヒド、ジイミド、ジイソシアネート
及びカルボン酸ジハリドから成る群から選択された少な
くとも１種の構成員を含有する請求項４記載の組成物。７、前記共有結合がε−アミノカプロン酸、グルタルア
ルデヒド、カルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシア
ネート及びホスゲンから成る群から選択された少なくと
も１種の構成員を含有する請求項４記載の組成物。８、請求項４記載の物質を製造するための方法であって
、インシュリンとその重量の約０．２〜２０倍のポリペ
プチド画分及びそのモル量の約１〜３倍の多官能価結合
剤とを混合することを含んで成る方法。９、患者へのインシュリンの投与において、請求項１記
載のポリペプチド画分と共にインシュリンを投与するこ
とを含んで成る改良方法。１０、前記インシュリンが前記ポリペプチド画分に共有
結合される請求項９記載の方法。１１、食用の飼料基材及び動物の成長促進効果量の請求
項１記載のポリペプチド画分を含んで成る動物成長促進
性組成物。１２、動物の成長促進効果量の請求項１記載のポリペプ
チド画分を投与することを含んで成る動物の成長を促進
する方法。１３、低血糖症患者に請求項１記載のポリペプチド画分
の有効量を投与することを含んで成る、それを必要とす
る患者の低血糖症を処理するための方法。