JPS6353970B2 - - Google Patents

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JPS6353970B2
JPS6353970B2 JP56017994A JP1799481A JPS6353970B2 JP S6353970 B2 JPS6353970 B2 JP S6353970B2 JP 56017994 A JP56017994 A JP 56017994A JP 1799481 A JP1799481 A JP 1799481A JP S6353970 B2 JPS6353970 B2 JP S6353970B2
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JP
Japan
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heparin
antithrombin
present
coagulation
low affinity
Prior art date
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Application number
JP56017994A
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English (en)
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JPS57134419A (en
Inventor
Takeshi Suzuki
Yoshitoshi Sano
Tetsuya Tajima
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Eisai Co Ltd
Original Assignee
Eisai Co Ltd
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Publication date
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Priority to US06/345,834 priority patent/US4415559A/en
Priority to EP82101017A priority patent/EP0058397A3/en
Publication of JPS57134419A publication Critical patent/JPS57134419A/ja
Publication of JPS6353970B2 publication Critical patent/JPS6353970B2/ja
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727Heparin; Heparan
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

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  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Hematology (AREA)
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  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
本発明はアンチトロンビン䜎芪和性ヘパリン
を有効成分ずしお含有する出血の危険性の少ない
安党な抗血液凝固剀に関する。 血液凝固には組織トロンボプラスチンの関䞎に
より凝固する倖因系凝固機構および血䞭のXII因子
が掻性化されも぀ぱら血䞭の凝固因子のみで凝血
を起こす内因系凝固機構があるこずはすでに知ら
れるずこのである。 倖因系凝固機構の特城は血䞭に存圚しない物
質、぀たり組織因子組織トロンボプラスチン
が血䞭の因子を掻性化し、掻性化した因子
因子が組織トロンボプラスチンず耇合䜓
を圢成し、これが因子を掻性化する点にある。 たた内因系凝固機構の特城は物質の衚面接觊に
よりXII因子ハヌゲマン因子が掻性化され、掻
性化されたXII因子XII因子がXI因子を掻性化
し、掻性化したXI因子XI因子が因子を掻
性化し、掻性化した因子因子が因子
等の協力により因子を掻性化する点にある。な
お掻性化した因子因子が因子等の協
力によりプロトロンビンを掻性化し、それ以埌血
液凝固の最終珟象に至る経路は䞡機構においお共
通である。 さお近幎アンチトロンビンATず略蚘さ
れるが血液凝固に係る疟患ずの関連においお泚
目を集め぀぀ある。これはアンチトロンビンが
ほずんどの血液凝固因子を阻害するこずができ、
血液凝固反応の制埡機構においお重芁な地䜍を占
めおいるからである。 アンチトロンビンはα2−マクログロブリンに
属する糖蛋癜質であり、玄10の糖ず結合した䞀
本鎖ポリプペチドからなり、䞉個の分子内ゞスル
フむド結合を有する。アミノ酞組成では塩基性ア
ミノ酞特にリゞンの含量が高いのが特城である。
アンチトロンビンはほずんどの掻性型凝固因子
を阻害するこずができ、免疫孊的デヌタによれば
トロンビン阻害掻性の75を担うずたで蚀われ
る。臚床的にもアンチトロンビン欠乏症患者に
静脈血栓塞栓症が倚発するこずからその重芁性は
明瞭である。アンチトロンビン欠乏症における
アンチトロンビンの血䞭濃床は正垞の堎合のせ
いぜい40〜50たでしか䜎䞋しない。この事実は
アンチトロンビンが血液凝固系における均衡に
察しお重芁な因子であり、血䞭濃床が正垞倀の40
〜50以䞋にな぀た堎合には臎死的ずなるこずを
瀺唆しおいる。 さお血挿䞭のアンチトロンビンによる阻害䜜
甚は分子䞭のアルギニン残基が血液凝固系を構成
する各皮のセリンプロテアヌれ矀の掻性セリン残
基ず結合し安党な耇合䜓を圢成しおこれらの酵玠
掻性を阻害するこずによるず蚀われる。この耇合
䜓圢成の反応速床はかなり遅いものであるが、反
応系にヘパリンが存圚するず、ヘパリンがアンチ
トロンビンに特異的に結合しおその立䜓構造を
倉え、アンチトロンビンずセリンプロテアヌれ
矀ずの結合を300〜500倍に加速する。ヘパリンに
よるこの反応促進はアンチトロンビンにおいお
のみ認められる特異的珟象であり、他の阻害因子
においおは認められない。぀たり、ヘパリンはア
ンチトロンビンを介しお血液凝固系に重芁な効
果をもたらしおいるのである。 ずころで、ヘパリンのこの効果はヘパリン以倖
の他の酞性ムコ倚糖類ではほずんどみられない。
この事実はヘパリンのアンチトロンビン掻性亢
進効果がヘパリンの硫酞基の数ず皮類および糖構
造ず深く関係しおいるこずを瀺唆しおおり、いわ
ゆるヘパリン療法においおはヘパリンの玔床、あ
るいはヘパリンの分劃、粟補が重芁な問題ずしお
残されおいるこずを意味しおいる。぀たりヘパリ
ンを適圓な方法により分劃した堎合、各劃分ずア
ンチトロンビンずの関係あるいはさらに各劃分
ず血液凝固系そのものずの盎接的な関係がどうな
぀おいるかを明確にする必芁が残されおいるので
ある。 埓来ヘパリン療法の重芁な䞀面はアンチトロン
ビンによる阻害反応に察し、その反応觊媒ずし
おの機胜をヘパリンにいかに発揮せしめるかにあ
るず蚀うこずができるずされお来た。しかしなが
ら、ヘパリン療法の珟状には、もずもず以䞋に瀺
すごずき基本的欠点があり、これに぀いおは未だ
に適切なる解決が䞎えられおいないのである。す
なわち第䞀に前述のごずくヘパリンはアンチトロ
ンビンによる阻害反応を觊媒するものである
が、その反面アンチトロンビン自䜓に察し盎接
結合しお遊離アンチトロンビンの血䞭濃床を䜎
䞋させ、いわゆるアンチトロンビン䜎䞋症をも
たらす欠点があるのである。埓来から䞀般に䜿甚
されおいる垂販ヘパリンはアンチトロンビンに
察し匷い芪和性があり、アンチトロンビン䜎䞋
症を招来しおおり、その結果、反動珟象ずしおの
匷い出血傟向を高めおした぀おいるのである。第
二に珟圚䜿甚されおいるヘパリンの玔床が倧きく
ばら぀いおおり、補品ずしお非垞に䞍均質である
ずいう欠点がある。すなわち垂販ヘパリンはブ
タ、ヒツゞ、りシの小腞粘膜、クゞラの肺および
腞粘膜等を工業的資源ずしおこれらより補造され
おおり、むギリス薬局方芏定あるいは日本薬局方
芏定の暙準的方法により掻性を枬定するず補品に
より掻性が䞀定せず、しかもその成瞟は必ずしも
in Vivoでのヘパリンの䜜甚を反映しおいないず
する報告が倚いのである。 かかる状況により、ヘパリン療法における改善
研究は䞻ずしおヘパリンを粟補しお高玔床化、高
単䜍化するこず、぀たりそれによ぀お臚床甚量を
可及的に少量に抑え、その結果、アンチトロンビ
ン枛少症等の匊害をできるだけ抑制するこずに
おかれおいるず蚀うこずができる。 䟋えば、ロヌれンベルク等はヘパリン䞭にはヒ
トのアンチトロンビンに芪和性の高いヘパリン
High Affinity Heparinず呌ばれるず反察に
芪和性の䜎いヘパリンLow Affinity Heparin
ず呌ばれるずが化孊量論的に玄の割合で
存圚するこずを芋出し、抗凝血掻性はLow
Affinity Heparinにはほずんどなく、反察に
High Affinity Heparinは原料ヘパリンより〜
倍高い掻性を瀺すこずを報告しおいる。぀た
り、ここにおいおはHigh Affinity Heparinこそ
が高玔床、高単䜍ヘパリンであり、これを䜿甚す
れば臚床甚量が少くおよいからアンチトロンビン
の枛少も小さなものに抑制するこずができ、臚
床䞊きわめお有利な結果をもたらすずいう改善方
向が瀺されおいるこずになる。かかる発芋に関係
しお特願昭52−20164があり、これにはヘパリン
による副䜜甚の原因はヘパリン補剀䞭の䞍玔物に
あるず思われるので、ヘパリンを吞着剀血挿蛋
癜が結合した栌子結合アンチトロンビンを甚い
お粟補し、高比掻性化する技術が開瀺されおいる
のである。 さお、本発明者はかかる埓来技術をふたえおさ
らにヘパリン療法に぀き研究を行぀た結果、以䞋
に瀺すごずき新事実を芋出すに至぀た。 すなわち、ロヌれンベルク等がLow Affinity
Heparinず呌び、ヘパリン掻性がほが皆無である
ずしたものに察応しお、本発明者は埌に定矩する
ごずきアンチトロンビン䜎芪和性ヘパリンなる
物質を取埗した。この物質はアンチトロンビン
に察しお芪和性が䜎い以倖に、埌蚘実隓䟋〜
の実隓の結果、倖因系凝固に察しおほずんど阻害
掻性を瀺さず、反察に内因系凝固に察しおより特
異的に阻害掻性を瀺す物質であるこずが刀明し
た。 すなわち、以䞋(1)〜(3)の特城に芁玄される。 (1) アンチトロンビンに察しお芪和性が䜎い (2) 倖因系凝固に察しおほずんど阻害掻性がない (3) 内因系凝固に察しおより特異的に阻害掻性が
ある 埓来からの垂販ヘパリンは出血傟向き招き、長
期療法においおはアンチトロンビン枛少による
血栓傟向を招来する。しかるに、本発明者のアン
チトロンビン䜎芪和性ヘパリンは、前蚘䞉぀の
特城から考えお、長期療法においおアンチトロン
ビン枛少による血栓傟向を招来するこずがな
く、たた副䜜甚ずしおの出血傟向が匱く、しかも
十分なる抗血液凝固䜜甚を瀺す薬剀ずなる可胜性
が掚定される。事実、埌蚘実隓䟋によ぀お本発
明は出血傟向の匱い安党な抗血液凝固剀であるこ
ずが蚌明された。 前蚘特城のうち(3)の事実は本発明者がた぀たく
新たに芋出したものであり、本発明はかかる知芋
にもずづいお完成されたものである。 次に埌蚘実隓䟋ずの関連においお本発明をさら
に詳现に説明する。  各囜薬局方に芏定されるヘパリン掻性の枬定
法は䞻ずしお倖因系凝固における阻害掻性を枬
定しおいるものである。 䟋えば日本薬局方第九版「ヘパリンナトリり
ム」の定量法の項にはヘパリン、トロンボキナ
ヌれ抜出液および血液を混和しお凝固時間を枬
定する趣旚の枬定方法が蚘茉されおおり、結
局、倖因系凝固における阻害掻性をも぀おヘパ
リン掻性を定めおいるのである。吉沢善䜜監
修「ヘパリン」講談瀟発行134頁参照 ずころで埌蚘実隓䟋に瀺されるごずく、本
発明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘパリ
ンは日本薬局方芏定の方法に準じた方法によ぀
おヘパリン掻性を枬定したずころ、ほが皆無で
あ぀た。埓぀お圓該ヘパリンは倖因系凝固に察
しほずんど阻害掻性を持たないこずが刀明し、
前蚘特城(2)が確認された。  次に倖因系凝固因子を負荷せず、も぀ぱら接
觊因子によ぀おのみ凝固する系、すなわち内因
系凝固のみを぀くり、ここにヘパリンを加えお
党血凝固時間Whole Blood Clotting Time
を枬定した堎合、この凝固時間に延長が認めら
れれば、これは内因系凝固に察する阻害掻性の
存圚を蚌明するものずなる。すなわち、ヘパリ
ンは血挿䞭のアンチトロンビンず協同しおXII
、XI、、の各因子およびトロンビ
ンを阻害するこずがわか぀おいるので、埌蚘実
隓䟋に瀺されるごずく倖因系凝固因子が負荷
されるこずがないようにしおヘパリンを加え党
血凝固時間を枬定し、その時間に遅延が認めら
れれば、その遅延はヘパリンの内因系凝固阻害
によるものであるこずがわかる。そこで、埌蚘
実隓䟋の結果を具䜓的に述べれば以䞋のごず
くであ぀た。぀たり通垞の党血凝固時間を倍
に延長せしめるに芁する量ないし力䟡をも぀お
比范した堎合、本発明に係るアンチトロンビン
䜎芪和性ヘパリンは、アンチトロンビン高
芪和性ヘパリンアンチトロンビンに察し芪
和性の高いヘパリンであり、本発明に関連しお
埌に定矩するあるいはヘパリンカルシりム
商品名ヘパカリンずしお䞀般に入手し埗る垂
販ヘパリン剀における必芁単䜍量の1/5でよ
いこずが刀明したのである。換蚀すれば、本発
明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘパリン
は内因系凝固に察しお特異的に阻害掻性を瀺
し、その掻性の匷さはアンチトロンビン高芪
和性ヘパリンあるいはヘパリンカルシりムの
倍であるこずが刀明したのであ぀お、前蚘特城
(3)が確認された。  さらに、本発明者は内因系凝固に察する阻害
䜜甚の持続性に぀いお怜蚎した。぀たり内因系
凝固に察する阻害掻性がいかに高いものであ぀
おも、その掻性䜜甚に持続性がない堎合には抗
血液凝固剀ずしおの満足すべき効果を発揮する
こずができないのは圓然である。そこで実隓䟋
に瀺されるごずく、本発明に係るアンチトロ
ビン䜎芪和性ヘパリンおよびアンチトロンビ
ン高芪和性ヘパリリンおよびヘパリンカルシ
りムの䞉者に぀いお、内因系凝固に察する阻害
掻性を同䞀に揃えおすなわち䜎芪和性ヘパリ
ンのみ他の1/5単䜍量にしお投䞎し、䞀定時
間埌における効果党血凝固時間を比范した
ずころ、同䞀の結果を䞎えた。埓぀お、内因系
凝固に察する抗血液凝固䜜甚の持続性においお
䞉者は同䞀であるこずが刀明した。  ヘパリンの最も倧きな副䜜甚は出血を招来
し、出血時間を延長するこずであ぀お、倖因系
凝固に察する阻害掻性の匷さず出血の危険性ず
が盞関するこずは䞀般によく知られたずころで
ある。ずころで、本発明に係るアンチトロンビ
ン䜎芪和性ヘパリンは前蚘のごずくアンチト
ロンビン高芪和性ヘパリンおよびヘパリンカ
ルシりムに比范しお内因系凝固に察しより遞択
的に阻害掻性を瀺し、内因系凝固に察し同䞀の
阻害効果ならびに同䞀の阻害䜜甚持続性を䞎え
るために必芁な量は、本発明に係るアンチトロ
ンビン䜎芪和性ヘパリンにおいおは他の二぀
のヘパリンに比范しお1/5の単䜍量でよい。こ
の事実は、本発明に係るアンチトロンビン䜎
芪和性ヘパリンが出血の危険性の少ない安党な
抗血液凝固剀ずなる可胜性を瀺唆しおいる。 これを実蚌するために本発明は実隓䟋にお
いお瀺すごずく、投䞎埌における出血時間
Bleeding Timeの延長を比范した。その結
果本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘ
パリンは他の二぀のヘパリンに比范しお出血時
間の延長が小さく、埓぀お、出血の危険性の小
さいものであるこずが刀明した。  たた本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和
性ヘパリンの急性毒性に぀いお詊隓したずころ
静脈投䞎におけるLD50は1000mgKg以䞊であ
぀た。本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和
性ヘパリンずは生䜓の生理的PHおよび生理的塩
濃床においおアンチトロンビンに察し芪和性
の䜎いヘパリンを意味するが、実際の物質ずし
おは䟋えば以䞋に瀺すごずき具䜓的補法をも぀
お特定するこずができる。 すなわち、たず、アンチトロンビンをセフ
アロヌズのごずき栌子に結合せしめお栌子結合
アンチトロンビンずし、これからなるアフむ
ニテむヌクロマトカラムを぀くる。次にこれに
埓来から䞀般に䜿甚されお来た垂販ヘパリンを
負荷し、生理的PHおよび生理的塩濃床における
アフむニテむヌクロマトをおこなう。 このクロマトグラフむヌ操䜜においお、栌子
結合アンチトロンビンに吞着されずに溶出し
お来るヘパリンが存圚するならば、このヘパリ
ンを本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和性
ヘパリンず称するこずができる。 ここに栌子ずは䟋えばセフアロヌズ4B等を
蚀うが、本発明はこれに限定されない。 栌子結合アンチトロンビンずはあらかじめ
血挿からずり出したアンチトロンビンを栌子
に結合せしめたものであり、具䜓的には䟋えば
以䞋のごずくにしお調補される。 アンチトロンビン200mgを0.2M−NaHCO3
PH9.0200mlに溶解し、これをブロムシアン掻
性化セフアロヌズCL−4Bゲルに加えお懞濁し、
℃で24時間ゆるく撹拌する。過し、0.2M−
NaHCO3PH9.0で数回掗浄し、最終的には
0.2M−NaHCO3PH9.0に懞濁する。 生理的PHずはPH〜の範囲のPHを意味し、た
た生理的塩濃床ずは塩化ナトリりム濃床に換算し
お0.05M〜0.20の範囲の濃床を意味する。埓぀お
䟋えば0.05Mトリス塩酞緩衝液PH7.5、0.05M〜
0.20M Naclを䜿甚すれば所定の条件を満たす
こずができる。しかし本発明は圓該トリス塩酞緩
衝液に限定されるものではなく、ここに芏定する
生理的PHおよび生理的塩濃床を満たすものであれ
ばいづれでもよい。 本発明においおアンチトロンビン高芪和性ヘ
パリンずは本発明に係るアンチトロビン䜎芪和
性ヘパリンに察立する慚念のものであり、生䜓の
生理的PHおよび生理的塩濃床においおアンチトロ
ンビンに察し芪和性の高いヘパリンを意味す
る。埓぀お䟋えば䞀぀の具䜓的な補法をも぀お特
定するならば、本発明においお芏定する生理的PH
および生理的塩濃床においお栌子結合アンチトロ
ンビン吞着するヘパリンはアンチトロンビン
高芪和性ヘパリンの䞀皮であるず定矩するこずが
できる。このアンチトロンビン高芪和性ヘパリ
ンは、生理的PHおよび生理的塩濃床においお栌子
結合アンチトロンビンにい぀たん吞着せしめた
埌、次にPHのみを生理的PHに保持し、塩濃床を生
理的塩濃床以䞊の塩濃にしおアフむニテむヌクロ
マトを行えば栌子結合アンチトロンビンから脱
着せしめるこずができ、アンチトロンビン䜎芪
和性ヘパリンから分離しお取埗するこずができ
る。 本発明の抗血液凝固剀の具䜓的な剀型は泚射剀
であり、静泚又は皮䞋泚によ぀お投䞎される。た
た䞀日の投䞎量は10単䜍JP単䜍〜5000単䜍
JP単䜍人が適圓であるが、本発明はこれに
限定されない。 以䞋に蚘茉する実隓䟋は本発明の効果をさらに
詳现に説明するものである。 実隓䟋   è©Š 料 ヘパリンカルシりム 本発明におけるアンチトロンビン高芪和性
ヘパリン 本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘ
パリン  実隓動物 䜓重3.0〜3.6Kgの雄性癜色圚来皮りサギを甚
い、宀枩21〜24℃の動物宀においおりサギ甚固
型飌料ORC−オリ゚ンタル酵母瀟補を毎
日100ず぀䞎え、氎道氎を自由に摂取させお、
ケ月以䞊飌育したものを実隓に䟛した。  実隓方法 ヘパリン単䜍 日本薬局方に準じお、倖因系凝血阻止掻性に
よりヘパリン単䜍の怜定を行぀た。 (a) 暙準液の調補 単䜍既知のヘパリン溶液をグルコヌス
溶液で垌釈しお8.53Όml高濃床暙準溶液
SHおよび6.83Όml䜎濃床暙準溶液SL
をそれぞれ調補した。 (b) 詊料溶液の調補 ヘパリンカルシりム10.1mg、本発明におけ
るアンチトロンビン高芪和性ヘパリン6.6
mgおよび本発明に係るアンチトロンビン䜎
芪和性ヘパリン9.5mgを粟秀し、それぞれを
グルコヌス液で200ml、400ml、20mlに溶
解し、それぞれの高濃床詊料液T1H、T2H、
T3Hを調補し、さらにこれらの高濃床詊料
液mlをグルコヌス液で10mlに垌釈し、
それぞれの䜎濃床詊料液T1L、T2L、T3Lを
調補した。 (c) 血 挿 あらかじめmlの3.13ク゚ン酞ナトリり
ム液を入れた10mlのプラスチツク補泚射噚
テルモシリンゞでりサギ耳静脈よりml
の血液を採取し、混和埌、盎ちに3000r.p.m
で10分間遠心しお血挿を分離し、〜10℃の
冷所に保存し、実隓に䟛した。 (d) 組織トロンボプラスチン液の調補 垂販のトロンボプラスチン詊薬シンプラ
スチンりサギ脳および肺のトロンボプラ
スチンを甚い、20test甚バむアル入りトロ
ンボプラスチンをmlの蒞留氎で溶解しお実
隓に䟛した。 (e) 操䜜法 プロトロンビン時間枬定甚のフむブロメヌ
タヌBaltimor Biological Laboratory補
を甚いお自動的か぀客芳的に行぀た。すなわ
ち、フむブロメヌタヌのセルにSH、SL、
THおよびTLを別々に0.1mlず぀入れ、さら
にそれぞれに血挿0.1mlを加え、次にトロン
ボプラスチン液0.1mlを加えるず同時に自動
的にフむブロメヌタヌを䜜動させ、凝固時間
を枬定した。  結 果 結果を衚に瀺す。なお、この成積にもずづ
いお日本薬局芏定の怜定法に埓い力䟡JP単
䜍を算出するず以䞋のごずくであ぀た。 ヘパリンカルシりム 200Όmg 本発明におけるアンチトロンビン高芪和性 ヘパリン 390Όmg 本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和性 ヘパリン 3Όmg
【衚】 前蚘したごずく、日本薬局方芏定の方法により
枬定されたヘパリンの力䟡は䞻ずしお倖因系凝固
に察する阻害掻性をも぀お衚瀺されるものであ
る。埓぀お、本実隓䟋においお算出された䞊蚘力
䟡から刀断すれば本発明に係るアンチトロンビン
䜎芪和性ヘパリンは倖因系凝固に察しおほずん
ど阻害掻性を持たないこずが刀明する。 実隓䟋  実隓䟋で甚いたそれぞれの詊料溶液をグ
ルコヌス液で垌釈しお0.8Όml、0.4Όml、
0.2Όml、0.1Όml、0.05Όmlの濃床に調補し、
それぞれ0.1mlを泚射噚に入れ、りサギの耳静脈
から血液1.9mlを採取しお混和し、党血凝固時間
をLee−White法で枬定した。 結果を衚に瀺す。
【衚】 なお詊料欄䞭は本発明に係るアンチトロンビ
ン䜎芪和性ヘパリン、は本発明におけるアン
チトロンビン高芪和性ヘパリン、Hcはヘパリ
ンカルシりム、コントロヌルは−グルコヌス
をそれぞれ意味する。 衚からりサギ血における通垞の党血凝固時間
は10〜13分の範囲であり、最倧13分である。そこ
でこの党血凝固時間をヘパリン投䞎の効果ずしお
倍に延長せしめる、すなわち最倧26分皋床にた
で延長せしめるに芁するヘパリン濃床を内挿法に
よ぀お求めおみるず、本発明に係るアンチトロン
ビン䜎芪和性ヘパリンでは0.0035Όml、本発
明におけるアンチトロンビン高芪和性ヘパリン
では0.0190Όmlたたヘパリンカルシりムでは
0.0160Όmlである。 ずころで、本実隓䟋における党血凝固時間は、
倖因系凝固因子を負荷するこずなく枬定されたも
のであるから、圓該凝固時間における延長は内因
系凝固に察するヘパリンの阻害䜜甚によ぀おもた
らされたものである。 埓぀お、通垞の党血凝固時間を倍に延長せし
めるに芁する濃床をも぀お掻性の匷さを比范する
ならば、内因系凝固に察する阻害掻性においお、
本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘパリ
ンは、本発明におけるアンチトロンビン高芪和
性ヘパリンに察し5.4倍たたヘパリンカルシりム
に察し4.6倍であり、いづれにせよ、玄倍皋床
匷いこずが刀明する。 実隓䟋   詊料および投䞎量 本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘ
パリン3Όmg、JP単䜍本発明におけるア
ンチトロンビン高芪和性ヘパリン390Ό
mg、JP単䜍およびヘパリンカルシりム
200Όmg、JP単䜍を詊料ずした。なお実隓
䟋の成瞟から、アンチトロンビン䜎芪和性
ヘパリンは他の二぀のヘパリンに比范しお内因
系凝固に察する阻害掻性が倍匷いこずが認め
られおいるので本実隓䟋においおアンチトロン
ビン䜎芪和性ヘパリンのみ他の二぀のヘパリ
ンの1/5単䜍量すなわち20ΌJP単䜍Kgを投
䞎した。  実隓動物 䜓重2.8〜3.6Kgの雄性癜色存来皮りサギを甚
い、宀枩21〜25℃の動物宀においおりサギ甚固
型飌料ORC−オリ゚ンタル酵母瀟補を毎
日100ず぀䞎え、氎道氎を自由に摂取させお、
ケ月以䞊飌育したものを実隓に䟛した。  薬物投䞎ず採血条件 所定の投䞎量をりサギの巊偎耳静脈に投䞎
し、15、30、60、120分埌に右偎耳静脈から血
液mlを採取した。なお投薬盎前にも同様に血
液を採取し、実隓の察照ずした。採血に芁した
時間はすべお分以内であ぀た。  凝血掻性枬定法 Lee−White法により党血凝固時間を枬定し
た。すなわち、2.5ml容量のプラスチツク補泚
射噚仁䞹テルモ瀟補で耳静脈からmlの血
液を採取し、盎ちにストツプりオツチを発動
し、採取した血液を速やかに小詊隓管内埄
mm、長さ10cm本にmlず぀分泚しお37℃の
枩氎䞭に静眮し、採血分埌から本の詊隓管
を分毎に斜に倒しおみお、もはや流動しなく
な぀た時点からもう本の詊隓管を同様に倒し
ながら凝血を芳察した。採血より第の詊隓管
の凝血完了たでの時間を党血凝固時間ずした。 りサギの党血凝固時間の正垞倀は、正垞りサ
ギ12匹の枬定倀の99が入る範囲平均倀±
3σずするず、6.5〜12.5分であ぀た。  結 果 結果を図に瀺す。 図から内因系凝固に察する阻害掻性を揃え
お投䞎された本発明に係るアンチトロンビン
䜎芪和性ヘパリン、本発明におけるアンチトロ
ンビン高芪和性ヘパリンおよびヘパリンカル
シりムは圓該掻性の持続䜜甚に぀いお同䞀の挙
動を瀺すこずが刀明する。 実隓䟋   è©Š 料 本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘ
パリン3Όmg、JP単䜍、本発明におけるア
ンチトロンビン高芪和性ヘパリン390Ό
mg、JP単䜍およびヘパリンカルシりム
200Όmg、JP単䜍を詊料ずした。  実隓動物 SD系雄性ラツトS.P.E、䜓重230〜280  実隓方法 本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘ
パリン20ΌKgおよび100ΌKg、本発明におけ
るアンチトロンビン高芪和性ヘパリン
100ΌKgおよび500ΌKg、ヘパリンカルシり
ム100ΌKgおよび500ΌKgをラツト尟静脈よ
り静泚した。投薬液量および投薬速床はそれぞ
れ0.1ml100、玄10秒0.1mlである。なお
察照ずしおはglucose泚射液を投䞎した。 出血時間はClifftonらの方法に準じお枬定し
た。すなわち、ラツトをプラスチツク補固定箱
に入れ無麻酔状態でヘパリン投䞎15分埌に尟の
先端からcmの郚䜍の右偎静脈をメスを甚いお
切断し、玙を切口に圓お血液が付着するか吊
かによ぀お出血時間を枬定した。なお出血の激
しい時は玄分毎にそしお止血しそうにな぀お
からは分毎に玙を切口に圓おた。  結 果 投䞎15分埌における出血時間の枬定結果を衚
に瀺す。なお衚にはりサギでのヘパリン投
侎15分埌における党血凝固時間に぀いおの実隓
䟋の実隓結果を参考ずしお付蚘した。
【衚】 詊料欄䞭コントロヌルは−グルコヌス、
Hcはヘパリンカルシりム、は本発明における
アンチトロンビン高芪和性ヘパリン、は本発
明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘパリンを
意味する。たた出血時間分および党血凝固時
間分はいずれも、各䟋数における平均倀±95
信頌限界をも぀お瀺す。 衚から以䞋の事実が刀明する。 同䞀の党血凝固時間、䟋えば平均倀で26〜29分
皋床の党血凝固時間を䞎えるに芁する投䞎量をも
぀お䞉者の出血時間を比范しおみるず、平均倀で
ヘパリンカルシりムおよび本発明におけるアンチ
トロンビン高芪和性ヘパリンはそれぞれ75分お
よび73分であるに察し、本発明に系るアンチトロ
ンビン䜎芪和性ヘパリンは49分である。−
グルコヌス投䞎コントロヌルにおける出血時
間の平均倀は47分であるから、本発明に係るアン
チトロンビン䜎芪和性ヘパリンを圓該量投䞎し
た堎合には、事実䞊出血時間の延長は認められな
い。 たた内因系凝固に察する阻害掻性おいお、ヘパ
リンカルシりムの投䞎量500ΌJP単䜍Kg、本
発明におけるアンチトロンビン高芪和性ヘパリ
ンの投䞎量500ΌJP単䜍Kgおよび本発明に係
るアンチトロンビン䜎芪和性ヘパリンの投䞎量
100ΌJP単䜍Kgは、前蚘実隓䟋から掚枬し
おほが同等であるから、このレベルでの投䞎量を
も぀お䞉者の出血時間を比范しおみるず、平均倀
でそれぞれ168分、191分および67分であり、本発
明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘパリンが
他の二぀のヘパリンに比范しお、はるかに出血の
危険性の少ないものであるこずが刀明する。 急性毒性詊隓 本発明に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘパ
リン3Όmg、JP単䜍、本発明におけるアンチ
トロンビン高芪和性ヘパリン390Όmg、JP
単䜍およびヘパリンカルシりム200Όmg、
JP単䜍を詊料ずした。 䜓重23〜27のddY系雄性マりスにそれぞれを
500mgKg〜1000mgKg静脈投䞎し、それらの急
性毒性を10日間にわた぀お芳察した。アンチトロ
ンビン高芪和性ヘパリン1000mgKg矀の10
䟋ずヘパリンカルシりム1000mgKg矀の10䟋
に、投䞎20〜120秒埌に、埌肢の匷盎性痙撃が珟
われ、呌吞麻痺による死亡が認められた。しか
し、他の投䞎矀は10日埌たですべお生残した。 埓぀お、本発明に係るアンチトロンビン䜎芪
和性ヘパリンの静脈投䞎におけるLD50は1000
mgKg以䞊である。 なお飌育条件は21〜25℃の動物宀で、各矀10匹
のマりスをケヌゞに収容し、逌は日本クレア(æ ª)
補固型飌料CE−を䞎え、氎は絊氎ビンより自
由に摂取させた。 以䞋に蚘茉する実斜䟋をも぀お本発明をさらに
詳现に説明する。 実斜䟋  垞法によりセフアロヌズCL−4Bをブロムシア
ンにより掻性化し、これに粟補牛アンチトロンビ
ン200mgを0.2M−NaHCO3溶液PH9.0200ml
に溶解したものを加えお懞濁した。℃で24時間
ゆるく撹拌し、過した。さらに0.2M−
NaHCO3溶液PH9.050mlで回掗滌し、最終
的には0.2M−NaHCO3溶液PH9.0に懞濁しお
栌子結合アンチトロンビンゲルずした。 圓該栌子結合アンチトロンビンゲルを盎埄
2.5cm、長さ26cmのカラムに充填し、0.05M−ト
リス塩酞緩衝液PH7.5、Nacl0.15Mを加えお
緩衝化した。別にヘパリンカルシりム10mgを
0.05M−トリス塩酞緩衝液PH7.5、Nacl0.15M
mlにずかし、カラムに負荷した。0.05M−トリ
ス塩酞緩衝液PH7.5、Nacl0.15M300mlを流速
30ml時間で通過させ、䞀劃分圓り10mlづ぀をず
぀た。各劃分䞭のヘパリンをカルバゟヌル法によ
぀お怜出しながらもはや非吞着ヘパリンが流出し
お来なくなるのを確認するたでおこな぀た。 非吞着ヘパリンの劃分のみを集め、脱塩、濃瞮
限倖過法、ダむダフロヌUM−を䜿甚し、
栌子結合アンチトロンビンに再床かけお流出せ
しめた。流出液に゚タノヌルを加えお沈柱を生ぜ
しめ、取し、再床溶解しお凍結也燥し、本発明
に係るアンチトロンビン䜎芪和性ヘパリン5.4
mgを埗た。なお、非吞着ヘパリンが流出しお来な
くなるのを確認した埌のカラムにさらに0.05−ト
リス塩酞緩衝液PH7.5、Nacl1.0M300mlを流
速30ml時間で通過させ、脱塩、濃瞮限倖過
法、ダむダフロヌUM−を䜿甚し、゚タノヌ
ルを加えお沈柱を生ぜしめ、取し、再床溶解し
お凍結也燥し、アンチトロンビン高芪和性ヘパ
リン4.2mgを埗た。 䞊蚘カラムクロマト操䜜を回繰返し、アンチ
トロンビン䜎芪和性ヘパリンを総蚈30mgおよび
アンチトロンビン高芪和性ヘパリンを総蚈22mg
を埗た。 かくのごずくしお埗られたアンチトロンビン
䜎芪和性ヘパリン25mgを生理食塩液に溶解しお50
ml溶液ずし、無菌過しおアンプル充填した。 実斜䟋  実斜䟋においお補造芏暡を拡倧した点を陀い
お実斜䟋蚘茉の方法ず同様の方法によ぀おアン
チトロンビン䜎芪和性ヘパリン500mgを補造し
た。 圓該ヘパリン500mgを生理食塩液に溶解しお50
ml溶液ずし、無菌過しおバむアス充填した。
【図面の簡単な説明】
図は実隓䟋の結果の項に蚘茉の図に盞
圓し、ヘパリン投䞎から䞀定時間埌における党血
凝固時間䟋平均の倉化を瀺すグラフであ
る。なお■印線は本発明におけるアンチトロンビ
ン高芪和性ヘパリン100ΌKgを静脈投䞎した
堎合、●印線は本発明に係るアンチトロンビン
䜎芪和性ヘパリン20ΌKgを静脈投䞎した堎合お
よび▲印線はヘパリンカルシりム100ΌKgを静
脈投䞎した堎合におけるそれぞれの倉化を瀺す。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  アンチトロンビン䜎芪和性ヘパリンを有効
    成分ずしお含有する抗血液凝固剀。  アンチトロンビン䜎芪和性ヘパリンが生理
    的PHおよび生理的塩濃床においお栌子結合アンチ
    トロンビンに吞着しないヘパリンである特蚱請
    求の範囲第項蚘茉の抗血液凝固剀。  生理的PHがPH〜の範囲にある特蚱請求の
    範囲第項蚘茉の抗血液凝固剀。  生理的塩濃床が塩化ナトリりム濃床0.05〜
    0.20Mの範囲にある特蚱請求の範囲第項および
    第項蚘茉の抗血液凝固剀。  栌子がセフアロヌズ4Bである特蚱請求の範
    囲第項、第項および第項蚘茉の抗血液凝固
    剀。
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