CN102178929B - 犬钩虫抗凝肽及其突变体在制备溶血栓药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了犬钩虫抗凝肽及其突变体在制备溶血栓药物中的用途。本发明通过大量的药理实验发现，犬钩虫抗凝肽5(AcAP5)及其突变体(rAcAP5m)(SEQ ID No.3)在体外或体内均有优秀的溶血栓活性，其活性呈剂量依赖性。另外，rAcAP5及其突变体rAcAP5m只有在血栓形成时发挥溶血栓作用，而不激活机体正常的纤溶系统，其可能具有的出血副作用较轻，另外rAcAP5及其突变体rAcAP5m也可增强尿激酶的溶栓作用，可将其制备成注射或口服制剂用于治疗血栓性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及犬钩虫抗凝肽及其突变体的一种新的药理用途，尤其涉及犬钩虫抗凝肽及其突变体在制备溶血栓药物中的用途，属于犬钩虫抗凝肽及其突变体的药理用途领域。
背景技术
血栓性疾病包括心肌梗死、脑栓死、肺血栓和周围血管拴塞等，是严重危害人类健康和生命的疾病，其发病率、致残率和死亡率都很高。据世界卫生组织统计，世界每年死于血栓病人数约2600万，中国每年新血管病死亡者占因病死亡总人数的40.7％，其比例远高于癌症，居各类死因之首(桂清.血栓疾病已成为威胁人类健康和生命的重要疾病.中华检验医学杂志，2004，8(27)：487)。溶栓被认为是治疗血栓性疾病的重要方法之一。
犬钩虫抗凝肽5(Ancylostoma caninum anticoagulant peptide，AcAP5)是从食血成年钩虫，犬钩口线虫(Ancylostoma caninum)可溶性提取物中分离出来的一种肽类FXa抑制剂，由77个氨基酸组成，分子量8.7KD，已获得其重组产物rAcAP5。AcAP5是迄今为止报道的活性最强的多肽类FXa抑制剂，能够抑制动脉、静脉血栓的形成(United StatesPatent5，427，937、6，534，629et al.)。在犬冠状动脉血栓模型中，仅皮下给药一次就可维持药效6小时，与其它蛋白类F X a抑制剂相比，AcAP5的一个突出优点就是给药方便和作用持续时间长(Sam S.Rebello，HowardS.(2000)Thrombosis Research 98：531-540)。
公开号为CN101041690A、发明名称为“重组犬钩虫抗凝肽5突变体、其编码基因、其制备和应用”的中国发明专利公开了一种重组犬钩虫抗凝肽5突变体(rAcAP5m)，体内和体外的试验表明，所述的重组多肽rAcAP5m与rAcAP5的抗血栓活性相当，有希望成为一类新型的治疗血栓栓塞性疾病的药物。
迄今为止，尚未有任何文献报道犬钩虫抗凝肽5及其突变体具有溶血栓活性，可应用于治疗血栓性疾病。
发明内容
本发明的主要目的是提供犬钩虫抗凝肽及其突变体的一种新的药理用途。
本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明通过大量的药理实验发现，犬钩虫抗凝肽5(AcAP5)及其突变体(rAcAP5m)在体外或体内均有优秀的溶血栓活性，其活性呈剂量依赖性，可将它们制备成治疗血栓性疾病的药物。
具体的，本发明发现犬钩虫抗凝肽5(r AcAP5)及其突变体(rAcAP5m)具有抑制凝血酶活化的纤溶抑制物(TAFI)的活性，且均可浓度依赖地抑制TAFI的活性，IC50为6.37×10-8M-7.23×10-8M。
rAcAP5和其突变体rAcAP5m可明显缩短纤溶时间，增强尿激酶的纤溶活性；rAcAP5及其突变体rAcAP5m可明显促进尿激酶的体外溶栓作用，它们单独应用也有明显体外溶栓作用；rAcAP5及其突变体rAcAP5m具有剂量依赖的体内溶栓作用。rAcAP5及其突变体rAcAP5m对正常大鼠的优球蛋白溶解时间、血浆纤维蛋白原含量和血浆纤维蛋白(原)降解产物FDP都无影响，说明rAcAP5及其突变体rAcAP5m只有在血栓形成时发挥溶栓作用，并不激活机体正常的纤溶系统，因此出血副作用可能较轻，表明犬钩虫抗凝肽5(rAcAP5)及其突变体(rAcAP5m)的溶栓作用是源于它对凝血酶活化的纤溶抑制物(TAFI)的抑制作用。
其中，所述的“犬钩虫抗凝肽5”是从食血成年钩虫，犬钩口线虫(Ancylostoma caninum)可溶性提取物中分离出来的一种肽类FXa抑制剂，由77个氨基酸组成，分子量8.7KD(Michael Cappello，John M.Hawdon，Brian F.Jones，W.Poindexter Kennedyb，Peter J.Hotez.Ancylostomacaninum anticoagulant peptide：cloning by PCR and expression of soluble，active protein in E.coli.Molecular and Biochemical Parasitology 1996，80：113-117.)，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；此外，本领域技术人员也可通过常规的DNA重组技术制备得到所述的重组犬钩虫抗凝肽5；本领域技术人员还可通过肽合成方法、化学修饰或传统的化学合成方法制备得到所述的犬钩虫抗凝肽5，这些方法均是本领域技术人员所熟知。
所述的“犬钩虫抗凝肽5突变体”的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，编码该氨基酸的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。本领域技术人员可通过DNA重组技术制备得到所述的犬钩虫抗凝肽5突变体(rAcAP5m)，具体制备方法可参考公开号为“CNl01041690A”，发明名称为“重组犬钩虫抗凝肽5突变体、其编码基因、其制备和应用”的中国发明专利。本领域技术人员也可通过肽合成方法、化学修饰或传统的化学合成的方法制备得到所述的犬钩虫抗凝肽5突变体，这些方法同样是本领域技术人员所熟知。
本发明所述的“血栓性疾病”包括急性心肌梗塞、中风、外周动脉塞阻、肺栓塞、深度静脉血栓形成以及其它的有可能造成溶栓后再阻塞或再生血栓形成危险的血管血栓性疾病。
将犬钩虫抗凝肽5(AcAP5)及其突变体(rAcAP5m)用于治疗血栓性疾病时，其给药剂量和给药方式可参考现有的已应用于临床的溶血栓活性蛋白的给药剂量和给药方式，例如，链激酶、尿激酶、anistrepalse、重组纤维蛋白溶酶原激活剂等溶血栓剂。通常的，可将犬钩虫抗凝肽5(AcAP5)或其突变体(rAcAP5m)制备成注射制剂，通过静脉注射，单次或多次快速注射或静脉注射；或将犬钩虫抗凝肽5(AcAP5)或其突变体(rAcAP5m)制备成口服制剂如肠溶胶囊、结肠定位胶囊、微球、纳米粒等。
此外，还可将编码犬钩虫抗凝肽5(AcAP5)或其突变体的核苷酸(例如：SEQ ID No.1)构建成适合在人体内表达的表达载体以制备成基因治疗药物，这些方法都是本领域技术人员所熟练掌握。
附图说明
图1rAcAP5及其突变体5(rAcAP5m)的体内溶栓作用试验结果；(
n＝8)。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1rAcAP5及其突变体5对TAFI的抑制作用(in vitro)
1.实验方法
雄性家兔，体重2.5-3kg，耳中动脉取血，3.8％的枸橼酸钠抗凝，3000rpm离心10min，制备血浆。30μl血浆与不同浓度(见表1和表2)的rAcAp5或其突变体5在室温下孵育10分钟，依次加入凝血酶(10unit/ml)、血栓调节蛋白(10nM)、CaCl2(17mM)，用Hepes缓冲液(pH7.4)将体积调整到60μl，室温下反应10分钟。加入150μM的PPACK(Merck，Germany)10μl终止活化。在活化后的反应体系中加入20mM的Hippuryl-Arg(Sigma-Aldrich USA)20μl，反应10分钟。加入20μl 1M HCl终止反应，再加入1M NaOH 20μl中和盐酸。加入50μl 0.5M的磷酸钠(pH7.4)和60μl含3％氰尿酰氯的1，4-二氧六环溶液进行显色反应。14000rpm离心5分钟，取100μl上清液加至96孔板于酶标仪405nm处读吸光度值。由于血液中含有CPN，同样能与底物反应，以不含凝血酶、血栓调节蛋白和CaCl2的反应管为TAFI未激活的对照，该管中血浆TAFI未激活。
TAFI活性＝总羧肽酶活性-CPN活性，rAcAP5及其突变体5对TAFI的抑制率通过I％＝([OD]con[OD]test)/([OD]con)×100％计算.
2.实验结果
rAcAP5及其突变体5能够剂量依赖地抑制TAFI的激活(见表1和表2)，提示rAcAP5及其突变体5为TAFI抑制剂。
表1rAcAP5对TAFI的抑制作用
表2rAcAP5m对TAFI的抑制作用
实施例2rAcAP5及其突变体5对尿激酶体外纤溶作用的影响
1.实验方法
雄性家兔，体重2.5-3kg，耳中动脉取血，3.8％的枸橼酸钠抗凝，3000rpm离心10min，制备血浆。30μl血浆与不同浓度(见表3)的rAcAP5或其突变体5在室温下孵育10分钟，加入血栓调节蛋白(5nM)后迅速混合溶液并且转移到含1μl50U/ml凝血酶、1μl 1M CaCl2和8μl 25000U/ml尿激酶的96孔板内。用FlexStation3酶标仪持续测定其405nm处的吸光值。血浆凝固时，浊度升高，可见光光吸收上升；凝固的血浆因尿激酶的作用而溶解时，光吸收下降。纤溶反应温度37℃，反应时间2h，测定间隔2min。用纤溶时间表示凝固的血浆(纤维蛋白)溶解的速度，纤溶时间定义为血浆浊度(A405)降低为最大浊度50％所需的时间。
2.实验结果
由表3可见在激活TAFI情况下，rAcAP5能够剂量依赖地缩短纤溶时间，突变体5(40nM)也可显著缩短纤溶时间。提示rAcAP5及其突变体5均有较强促纤溶作用，该作用可能与抑制TAFI活性有关。
表3.rAcAP5及其突变体对体外纤溶的影响(
n＝3)
与空白对照组比较：++P＜0.01，与模型组比较：**P＜0.01
实施例3rAcAp5及其突变体5体外溶血栓作用
1.实验方法
雄性大鼠，体重250-300g，用水合氯醛(350mg/Kg)麻醉，腹主动脉取血，立即放入0.5ml的EP管中，插入不锈钢小螺旋以固定血栓。20分钟后取出擦干，精确称量，放入1.5ml的EP管中，加入rAcAP5或其突变体5或生理盐水(对照)。在37℃孵育1小时，取出擦干，称重，计算孵育前后血栓减重。
2.实验结果
rAcAP5或其突变体5能增加尿激酶的血栓减重作用，单独使用也具有血栓减重作用(见表4)，提示它们可增强尿激酶(UK)的溶栓作用，自身也可溶栓。
表4rAcAP5及其突变体5体外溶栓作用(
n＝5)
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
与尿激酶比较：+P＜0.05
实施例4rAcAP5及其突变体5体内溶栓作用
1.实验方法
(1)纤维蛋白血栓的制备
雄性SD大鼠，250300g，用水合氯醛(350mg/kg，ip)麻醉，仰卧位固定。分离右颈总动脉，于近心端用动脉夹阻断血流，在远心端小心剪一斜口，插入一端拉成尖管的聚乙烯管，从管中放出0.5ml动脉血后重新夹住动脉。将取出的动脉血迅速注入垂直固定的玻璃管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封)，放入血栓固定螺旋(直径0.2mm的不锈钢丝绕成，呈问号型)。15分钟后，打开玻璃管底部胶塞，从玻璃管中取出被纤维蛋白血栓填充的螺旋，精确称重。
(2)大鼠颈动静脉旁路插管
旁路插管有3段组成，中段为聚乙烯胶管，长60mm，内径3.5mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm，该管的一端拉成尖管(用于插大鼠颈动脉或静脉)另一端的外部套一段长7.0mm，外径为3.5mm的聚乙烯管(加粗，用于插入中段的聚乙烯管内)，3段管的内壁均硅烷化。将含有血栓的螺旋放入中段聚乙烯管内，连好三段管，用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/ml)，备用。分离大鼠的左颈外静脉，在暴露的左颈外静脉上剪一斜口，将上面制备好的旁路一端的尖管插入左颈外静脉开口的近心端，固定，注射器推入准确量的肝素溶液(50IU/kg)。推入肝素后，另一端连接右颈总动脉，固定好位置。
(3)给药
打开动脉夹，血流通过旁路从动脉流向静脉，即大鼠动静脉旁路溶栓模型。将生理盐水(阴性对照)、尿激酶(阳性对照)、rAcAP5或其突变体5通过旁路的中段注入到大鼠静脉。从开始注射计时，1小时后从旁路管中取出血栓固定螺旋，精确称重，计算血栓减重，作为溶栓程度评价指标。
2.实验结果
单次静脉给药，生理盐水组动物的血栓重量有一定程度减小，rAcAP5组以及其突变体5两组动物的血栓重量较生理盐水组明显减轻，且呈剂量依赖性(见图1和表5)，提示rAcAP5或其突变体5均具有溶栓作用。阳性药尿激酶组的血栓重量也明显减轻。
表5rAcAP5及其突变体5体内溶栓作用(
n＝8)
与NS空白对照组比较：**P＜0.01。
实施例5rAcAP5及其突变体5对正常大鼠优球蛋白溶解时间的影响(exvivo)
1.实验方法
雄性SD大鼠，体重250-300g。大鼠用水合氯醛(350mg/kg)麻醉后，仰卧位固定，舌下静脉给药(rAcAP5或其突变体5)。空白对照组在相同时间给予等体积溶媒(生理盐水)，阳性药组给予尿激酶。给药¨分钟后，腹主动脉取血，3.8％枸橼酸钠抗凝，收集于洁净的塑料离心管中，以3000rpm，4℃离心10min后取上清。取0.5ml血浆加到预先冷却并含有9ml乙酸溶液的离心管中，混匀后放在4℃冰箱内静置10min，优球蛋白呈絮状沉淀析出，分离沉淀(3000rpm，离心5min)，轻轻倾去上清液，保留沉淀部分，将离心管倒置在滤纸上约2min，取尽剩余酸液，加入0.5mlpH 9.0硼酸溶液，用细玻棒小心搅拌，使沉淀溶解，再将离心管放置在37℃恒温水浴中，加0.025mol/L氯化钙溶液混匀，管内液体开始凝固，然后溶解，记录从凝块形成到凝块完全溶解的时间，为优球蛋白溶解时间(ELT)。
2.实验结果
正常大鼠单次静脉给药，rAcAP5及其突变体5三个剂量组大鼠的ELT与溶媒组相比无明显差异，而阳性药尿激酶组大鼠的优球蛋白溶解时间明显延长，提示rAcAP5及其突变体5与尿激酶的作用机制不同，不直接作用于纤溶酶原。
表6rAcAP5及其突变体5对正常大鼠优球蛋白溶解时间的的影响(
n＝9)
与NS空白对照组比较：**P＜0.01。
实施例6rAcAP5及其突变体5(rAcAP5m)对正常大鼠血浆纤维蛋白原含量的影响
1.实验方法
雄性SD大鼠，体重250300g。大鼠用水合氯醛(350mg/kg)麻醉后，仰卧位固定，单次舌下静脉给药(rAcAP5或其突变体5)，空白对照组在相同时间给予等体积溶媒(生理盐水)，阳性药组给予尿激酶。给药15分钟后，腹主动脉取血，3.8％枸橼酸钠抗凝，收集于洁净的塑料离心管中，以3000rpm离心10min后取上清。取100μl血浆，用pH6.3的KH2PO4-NaOH缓冲液稀释后，加热至56℃，纤维蛋白原沉淀，采用热沉淀比浊法测定纤维蛋白原含量。
2.实验结果
舌下静脉单次给药，rAcAP5及其突变体5对正常大鼠的血浆纤维蛋白原含量无明显影响，阳性药尿激酶也不减少纤维蛋白原含量。
表6rAcAP5及其突变体5对正常大鼠血浆纤维蛋白原含量的影响(
n＝9)
实施例7rAcAP5及其突变体5(rAcAP5m)对正常大鼠纤维蛋白降解产物(FDP)的影响
1.实验方法
雄性SD大鼠，体重250-300g。大鼠用350mg/kg水合氯醛麻醉后，仰卧位固定，舌下静脉给药(rAcAP5或其突变体5)，空白对照组在相同时间给予等体积溶媒(生理盐水)，阳性药组给予尿激酶。给药15分钟后，腹主动脉取血，3.8％枸橼酸钠抗凝，收集于洁净的塑料离心管中，以3000rpm，4℃离心10min后取上清。用大鼠FDP ELISA试剂盒测试FDP含量。
2.实验结果
静脉单次给药，rAcAP5及其突变体5对正常大鼠的FDP含量无影响。提示，rAcAP5及其突变体5不引起纤维蛋白(原)降解。
表7rAcAP5及其突变体5对正常大鼠FDP的影响(
n＝9)
<110> 北京大学
<120> 犬钩虫抗凝肽及其突变体在治疗血栓性疾病中的用途
<130> pt00215
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
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<213> Ancylostoma caninum
<400> 1
Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly
1 5 10 15
Thr Gln Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys Asn Glu Glu Pro Pro Glu Glu
20 25 30
Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser Arg Gly Cys Leu Leu Pro Pro Ala Cys
35 40 45
Val Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Val Ile Gly Asp Cys Val
50 55 60
Arg Glu Glu Glu Cys Asp Gln His Glu Ile Ile His Val
65 70 75
<210> 2
<211> 162
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223>
<220>
<221> CDS
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<400> 2
aag gct tac cca gag tgt ggt gag aac gag tgt cca atc tgt aga agt 48
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aga gac acc gtc atc ggt gac tgt gtc aga gag gag gag tgt gac cag 144
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His Glu Ile Ile His Val
50
Claims (7)
1.犬钩虫抗凝肽5在制备溶血栓性药物中的用途。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的犬钩虫抗凝肽5的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
3.SEQ ID No.3所示的犬钩虫抗凝肽5突变体在制备溶血栓药物中的用途。
4.编码犬钩虫抗凝肽5的基因在制备溶血栓药物中的用途。
5.编码SEQ ID No.3所示的犬钩虫抗凝肽5突变体的基因在制备溶血栓药物中的用途。
6.按照权利要求4或5所述的用途，其特征在于：所述的药物是基因治疗药物。
7.按照权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的基因为SEQ IDNo.2所示的核苷酸。
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