TWI392738B

TWI392738B - 去整合蛋白變異體及其醫藥組成物

Info

Publication number: TWI392738B
Application number: TW096150026A
Authority: TW
Inventors: Wen Mei Fu; Turfu Huang; Chih Hsin Tang; Woeijer Chuang; wen ya Huang; Chiuyueh Chen
Original assignee: Univ Nat Taiwan; Univ Nat Cheng Kung
Priority date: 2006-12-26
Filing date: 2007-12-25
Publication date: 2013-04-11
Also published as: NZ598176A; JP5908666B2; WO2008088548A3; MX2009007065A; EP2522676A3; IL199564A; ES2389697T3; KR20090108049A; US7943728B2; AU2007343734A1; AU2007343734B2; EP2124548A2; JP2010514444A; TW200848070A; WO2008088548A2; EP2124548B1; RU2012148887A; CN101677537A; HK1136160A1; AU2007343734A2

Description

去整合蛋白變異體及其醫藥組成物

本發明係關於一去整合蛋白變異體，特別是關於以去整合蛋白變異體作為選擇性αvβ3整合蛋白拮抗劑，可用於治療及預防與αvβ3整合蛋白相關之疾病。

骨骼是複雜的組織，其係由數種細胞類型所組成，這些細胞持續地參與骨骼的新生及修補過程，此一過程稱為「骨再塑」。負責骨再塑的兩種主要細胞類型為蝕骨細胞以及造骨細胞，前者主要負責骨骼的再吸收，而後者則負責建造新的骨骼。目前已知數種體荷爾蒙(如，副甲狀腺素、維生素D3、性荷爾蒙及抑鈣素)以及局部因子(如，一氧化氮、前列腺素、生長因子及細胞激素)都可調節骨再塑作用。[1]

整合蛋白為αβ異二聚體基質受體，其可將細胞固定至基質，並可將外部信號通過原生質膜傳遞至細胞內[5]。不論是在體內[6]或體外[7，8]，整合蛋白αvβ3均參與了與蝕骨細胞相關之骨骼再吸收過程。此種異二聚體分子可識別諸如造骨蛋白及造骨細胞胞外基質[7，8]之類的骨基質蛋白質中所含的胺基酸基序(motif)Arg-Gly-Asp(RGD,SEQ ID NO：2)。整合蛋白αvβ3可表現於蝕骨細胞中[9]，且其表現受到吸收性類固醇及細胞激素之調節[10]。由阻斷實驗發現，αvβ3整合蛋白為蝕骨細胞上的主要功能性黏貼受體。整合蛋白αvβ3之抑制劑可降低蝕骨細胞和骨骼結合以及再吸收骨骼之能力[7，11]。整合蛋白αvβ3在蝕骨細胞之功能中扮演了關鍵性的角色[7，11，12]，目前認為整合蛋白之抑制劑可預防骨質疏鬆症[11]、蝕骨性癌細胞轉移[13]及惡性腫瘤引起之高血鈣症。

已知有多種骨骼疾病與蝕骨細胞相關的骨質溶解，而骨質疏鬆症是其中最常見的一種。當骨骼之再吸收以及形成兩種作用不一致，且骨骼的崩解凌駕於骨骼建構時，就會導致骨質疏鬆症。也有其他可能引起骨質疏鬆症的原因，例如荷爾蒙不平衡、疾病、或藥物(如，皮質類固醇或抗癲癇藥物)[2]。骨骼通常也是癌細胞經常轉移的器官，一般來說乳癌、前列腺癌、肺癌及甲狀腺癌均非常容易轉移至骨骼[3,4]。更年期後的雌激素缺乏也會造成骨質疏鬆症。而風濕性關節炎也可能和次級骨質疏鬆症相關。骨骼癌細胞轉移在蝕骨細胞骨骼再吸收過程中，也表現一種非常獨特的現象，這在其他器官的癌細胞轉移中是不曾出現的。目前已經廣泛接受與癌症相關之骨質溶解，主要係與蝕骨細胞有關，而此一過程似乎可間接由造骨細胞活化或直接由癌細胞活化[4]。此外，高血鈣症(血液中鈣濃度增加)是溶骨性骨骼疾病的重要併發症。通常好發於骨骼破壞嚴重的病患中，且特別常見於乳癌、肺癌、腎臟癌、子宮頸癌及胰臟癌以及骨髓瘤患者中[4]。

去整合蛋白屬於低分子量且含有RGD之多胜肽家族，其可專一性地和血小板及其他細胞中表現之整合蛋白 αIIbβ3、α5β1、及αvβ3結合，上述其他細胞包括血管內皮細胞及某些腫瘤細胞[14，15]。除了其潛在的抗血小板活性之外，關於去整合蛋白的相關研究顯示了數種新用途，其包括心血管疾病診斷、以及動脈血栓、骨質疏鬆症、及與血管生成相關之腫瘤生長及癌細胞轉移等方面的治療藥物[15]。馬來亞蝮素(Rho,Rhodostomin)是一種由馬來亞蝮(Colloselasma rhodostoma )之蛇毒中分離出來的去整合蛋白，已知其可藉由阻擋血小板醣蛋白αIIbβ3而在活體內與活體外抑制血小板凝集[16，17]。更有甚者，已知馬來亞蝮素可抑制乳癌及前列腺癌細胞和未礦化及礦化骨骼細胞外基質二者之黏貼，前述抑制作用與劑量高低成正相關，且不會影響腫瘤細胞之存活力。此外，馬來亞蝮素可抑制乳癌及前列腺癌細胞的移轉以及侵入能力[18]。也已經知道馬來亞蝮素能夠抑制脂肪新生及肥胖[19]。然而，由於因為馬來亞蝮素係以非專一性之形式和整合蛋白αIIbβ3、α5β1、及αvβ3結合，因此將馬來亞蝮素用於醫藥用途時，會產生嚴重的副作用。舉例而言，利用馬來亞蝮素治療癌症時，會產生抑制血小板凝集的不良副作用。

因而，相關領域亟需一種能夠解決上述問題的方案，特別是關於如何製造能專一且選擇性地和整合蛋白αvβ3結合之去整合蛋白變異體。

根據本發明，本發明的一種態樣提出一種對αvβ3整合蛋白具有選擇性(或專一性)之單離多胜肽。相較於野生型去整合蛋白，根據本發明具體實施例之單離多胜肽對於αIIbβ3和/或α5β1整合蛋白的結合力較低。此多胜肽係由一種改造的去整合蛋白核苷酸序列(其編碼產生一改造的胺基酸序列)所編碼而成，其具有較低之αIIbβ3和/或α5β1整合蛋白結合活性。上述多胜肽可能經過聚乙二醇化(pegylated)或和白蛋白結合。

去整合蛋白核苷酸序列係衍生自一蛇毒蛋白。去整合蛋白可以是馬來亞蝮素(rhodostomin)、白唇竹葉青蛇素(albolabrin)、百步蛇素(applagin)、墨西哥西海岸響尾蛇素(basilicin)、矛頭蝮素(batroxostatin)、鼓腹巨蛇素(bitistatin)、西部亞種響尾蛇素(cereberin)、角響尾蛇素(cerastin)、西部菱背響尾蛇素(crotatroxin)、南美響尾蛇素(duressin)、麗紋龜殼花蛇素(elegantin)、黃綠龜殼花蛇素(flavoridin)、黃綠龜殼花蛇毒解離素(flavostatin)、日本蝮素(halysin)、西伯利亞蝮蛇毒解離素(halystatin)、巴西蝮素(jararacin)、巴西蝮蛇毒解離素(jarastatin)、馬來亞紅口蝮素(kistrin)、亞馬遜巨蝮素(lachesin)、西部亞種響尾蛇素(lutosin)、黑尾響尾蛇素(molossin)、韓國短尾蝮素(salmosin)、白眉蝮素(saxatilin)、北美侏儒響尾蛇素(tergeminin)、黃綠龜殼花蛇毒解離素(trimestatin)、台灣龜殼花蛇素(trimucrin)、台灣龜殼花去整合蛋白(trimutase)、烏蘇里蝮素(ussuristatin)、或草原響尾蛇素(viridin)。

本發明之另一態樣為一種多胜肽，其為馬來亞蝮素之變異體，該馬來亞蝮素包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。

本發明之另一態樣為一種多胜肽，其包含選自SEQ ID NO：30-42之胺基酸序列。

本發明之另一態樣為一種多胜肽，其包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，且該序列更包含在對應於SEQ ID NO：1之第48、50、52、或53個胺基酸位置中之四種胺基酸取代中，有一、二、三個胺基酸取代。

本發明之另一態樣為一種多胜肽，其包含選自下列之SEQ ID NO：1的胺基酸取代：在第48個位置可為Ala；在第50個位置可為Leu、Ile及His；在第52個位置可為Asp、Met、及Asn；以及在第53個位置可為Val、Leu、及Met。

本發明之另一態樣為一種多胜肽，其係由選自SEQ ID NOs：43-56之核苷酸序列所編碼。

本發明之另一態樣為多胜肽，相較於馬來亞蝮素，根據本發明實施例之單離多胜肽對αIIbβ3和/或α5β1之親和力降低至少約5、50、或100倍。在本發明一具體實施例中，相較於馬來亞蝮素，多胜肽對αIIbβ3和/或α5β1整合蛋白之親和力降低至少約200倍。在本發明另一具體實施例中，相較於馬來亞蝮素，多胜肽對αIIbβ3和/或α5β1整合蛋白之親和力降低至少約1000或2000倍。在本發明另一具體實施例中，相較於馬來亞蝮素，多胜肽對血小板之親和力降低至少約5、50、100、1000、或2000倍。在本發明又另一種具體實施例中，相較於馬來亞蝮素和/或野生型去整合蛋白，多胜肽對於延長血液凝結時間之活性大幅降低。

本發明之又另一種態樣為生理上可接受的組合物，其包含根據本發明具體實施例之單離多胜肽、以及藥學上可接受的載體。

本發明之另一態樣為一種多胜肽，其包含選自SEQ ID NO：57-69之胺基酸序列。

本發明之又另一種態樣為一種利用去整合蛋白變異體以治療和/或預防與αvβ3整合蛋白相關之哺乳類動物疾病之方法，該哺乳類動物包括人類。該方法包含下列步驟：對有需要之哺乳類動物投予有效劑量之去整合蛋白變異體。本方法中所用之單離多胜肽可經過聚乙二醇化或和白蛋白結合。

在本發明的一種態樣中，去整合蛋白可衍生自蛇毒蛋白，且可以是馬來亞蝮素、白唇竹葉青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸響尾蛇素、矛頭蝮素、鼓腹巨蛇素、西部亞種響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、麗紋龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、日本蝮蛇素、西伯利亞蝮蛇毒解離素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解離素、馬來亞紅口蝮素、亞馬遜巨蝮素、西部亞種響尾蛇蛇素、黑尾響尾蛇素、韓國亞種短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、台灣龜殼花素、台灣龜殼花去整合蛋白、烏蘇里蝮素、或草原響尾蛇素。

在本發明一實施例中，去整合蛋白為馬來亞蝮素。

在本發明另一實施例中，馬來亞蝮素包含馬來亞蝮素之變異體，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。

在本發明另一實施例中，馬來亞蝮素包含RGD基序(motif)變異體，其包含選自SEQ ID NO：30-42之胺基酸。

在本發明另一實施例中，馬來亞蝮素包含選自SEQ ID NO：57-69之胺基酸。

在本發明一態樣中，與αvβ3整合蛋白相關之疾病包括但不限於骨質疏鬆症、骨瘤或骨癌生長以及相關症狀、與血管生成相關之腫瘤生長及癌細胞轉移、骨骼中腫瘤癌細胞轉移、惡性腫瘤引起之高血鈣症、與血管生成相關之眼部疾病、派傑氏症(Paget’s disease)、風濕性關節炎及退化性關節炎。

在本發明另一態樣中，本發明實施例之單離多胜肽可用以治療和/或預防與血管生成相關之眼部疾病，包括但不限於老年性黃斑病變、糖尿病視網膜病變、角膜神經血管增生病變、局部缺血導致之神經血管增生視網膜病變、高度近視、及早熟性視網膜病變。

在本發明之又另一種態樣中，本發明實施例之單離多胜肽可用以治療和/或預防骨質疏鬆症。骨質疏鬆症可能和下列病理情形相關，包括更年期後的雌激素缺乏、次級骨質疏鬆症、風濕性關節炎、卵巢切除、派傑氏症、骨癌、骨瘤、退化性關節炎、蝕骨細胞形成過多、及蝕骨細胞活性增加。更有甚者，骨質疏鬆症包括但不限於，由卵巢切除所引發或更年期後之骨質疏鬆症或骨質流失。

本發明之又另一種態樣為一種利用本發明實施例之單離多胜肽以治療和/或預防哺乳類動物體內因卵巢切除所引發之生理狀況改變之方法，該哺乳類動物包括一人類。

本發明之又另一種態樣為一種利用去整合蛋白變異體以抑制和/或預防哺乳類動物骨骼中腫瘤細胞生長及相關症狀之方法，該哺乳類動物包括一人類。

本發明之又另一種態樣為一種製備本發明實施例之單離多胜肽的方法。該方法包含下列步驟：(a)以編碼上述單離多胜肽之聚核苷酸轉染一宿主細胞；(b)在培養基中培養上述宿主細胞；以及(c)分離上述單離多胜肽。該方法可更包含在無胺基酸培養基中培養宿主細胞；以及收集上清液以得到上述多胜肽。該方法可更包含在培養基中加入甲醇，以誘導多胜肽在宿主細胞中之表現。該方法可更包含進行管柱層析以得到上述多胜肽。在一具體實施例中，該方法可更包含進行HPLC以得到分離之單離多胜肽。

本發明之另一態樣為聚核苷酸，其可編碼對αvβ3整合蛋白具專一性之單離多胜肽，其中多胜肽可以是由蛇毒蛋白分離之去整合蛋白的變異體。

在本發明另一態樣中，去整合蛋白可以是馬來亞蝮素、白唇竹葉青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸響尾蛇素、矛頭蝮素、鼓腹巨蛇素、西部亞種響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、麗紋龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、日本蝮蛇素、西伯利亞蝮蛇毒解離素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解離素、馬來亞紅口蝮素、亞馬遜巨蝮素、西部亞種響尾蛇蛇素、黑尾響尾蛇素、韓國亞種短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、台灣龜殼花素、台灣龜殼花去整合蛋白、烏蘇里蝮素、或草原響尾蛇素。

在本發明另一態樣中，去整合蛋白包含馬來亞蝮素。

在本發明另一態樣中，去整合蛋白包含馬來亞蝮素之變異體，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。

在本發明另一態樣中，多胜肽包含一RGD基序變異體，其具有選自SEQ ID NO：30-42之胺基酸序列。

在本發明另一態樣中，聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：43-56及78-135之序列。

在本發明另一態樣中，聚核苷酸編碼之單離多胜肽在對應於SEQ ID NO：1之第48、50、52、或53個胺基酸位置中之四種胺基酸取代中，具有一、二、三個胺基酸取代。

本發明之另一態樣為聚核苷酸，其可在一嚴緊條件下雜合成本發明之實施例之聚核苷酸。

本發明之另一態樣為多胜肽，其係由可雜合成本發明之實施例之聚核苷酸序列的聚核苷酸所編碼。

可由下文多種具體實施例之實施方式參照附隨圖式瞭解本發明之上述及其他態樣，然而可在不悖離本說明書之創新概念的精神及範圍的前提下，進行各種變化及修飾。

附隨圖式闡明本發明之一或更多種具體實施例，且可連同書面描述闡明本發明之原理。

實施方式中將詳述本發明之其他目的及優點，其可由相關說明中輕易得知，或可藉由實施本發明而得到。可利用附隨申請專利範圍中明確指出之方法及元件實踐並獲致本發明之目的及優點。

可以理解，上述發明說明以及下文實施方式僅為示範及說明，而非用以限制由申請專利範圍界定之本發明。

附隨圖式係作為說明書之一部分，其闡明本發明之具體實施例，且連同書面說明可用以解釋本發明之原理。

於下列實施例中明確闡明本發明，然其用意僅為說明本發明，因為習知此技術者可對其進行各種修飾及改變。此處闡明本發明之多種具體實施例。在本說明書以及附隨申請專利範圍中，「一」、及「該」等詞彙包含複數型態，除非上下文中為相反之明示。再者，在本說明書以及附隨申請專利範圍中，「在...之中」一詞包含「在...之中」以及「在...之上」，除非上下文中為相反之明示。此外，下文將定義本說明書中所用之某些詞彙。本說明書中引用或討論之所有參考文獻，皆應整體納入作為參照。

此處將詳細敘述本發明中所含之具體實施例(示範性具體實施例)，附隨圖式中並闡明其實施例。

名詞定義

本說明書中所用之名詞通常具有在習知領域中所通用的意義，不論是在本發明之脈絡下或任何其他脈絡下皆然。本說明書中利用某些名詞，以便讓閱讀本發明之相關人士能夠理解本發明。說明書中提供了某些名詞的同義詞。然而，提及一或更多種同義詞，不代表排除了其他的同義詞。在本說明書中，運用例示的說明方式時，包括此處所述之任何名詞的舉例，都僅具備說明性，且不應認定其可限定本發明或任何例示名詞之範圍及意涵。本發明不限於說明書中所述之多種具體實施例。

除非另為相反之定義，此處所用之所有技術及科學專有名詞的意義，皆和習知此技術者之一般理解相同。當二者有所衝突時，本說明書包括名詞定義部分，會加以避免。

「約」、「大約」、「約略」等詞通常係指差異在一指定數值或範圍的百分之20以內、百分之10以內、百分之5、4、3、2、或1以內。文中所提之數值、數量皆為約略數值，亦即即便文中未明確指出「約」、「大約」、「約略」等詞彙，仍然隱含此一意義。

「聚核苷酸」、「核苷酸」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸序列」、「聚核苷酸序列」、及「核苷酸序列」等詞可互換，以表示任何長度之核苷酸的高分子聚合形式。聚核苷酸可包含去氧核醣核苷酸、核醣核苷酸、和/或其類似物或衍生物。上述詞彙包含變異體。變異體可包含插入、加入、缺失、或取代。核苷酸序列之方向為5'至3'。

「多胜肽」、「胜肽」、及「蛋白質」等詞可互換，以表示何長度之胺基酸的高分子聚合形式。上述胺基酸可包含自然界存在之胺基酸、編碼及非編碼之胺基酸、化學或生化修飾、衍生、或設計之胺基酸、胺基酸類似物、擬胜肽、及縮酚羧酸肽(depsipeptide)、以及其具有經修飾、環狀、雙環、縮酚羧酸環、或縮酚羧酸雙環肽主鏈之單離多胜肽。上述名詞包含單鏈蛋白質以及單體集合體。上述名詞亦包含與標記結合之蛋白質。常用的標記例如FITC；生物素；放射性同位素，包括但不限於⁶⁴ Cu、⁶⁷ Cu、⁹⁰ Y、⁹⁹ mTc、¹¹¹ In、¹²⁴ I、¹²⁵ I、¹³¹ I、¹³⁷ Cs、¹⁸⁶ Re、²¹¹ At、²¹² Bi、²¹³ Bi、²²³ Ra、²⁴¹ Am、以及²⁴⁴ Cm；具有可偵測產物之酵素(例如螢光素酶、過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、及與其相似者)；螢光增白劑及螢光標記、發螢光金屬，例如¹⁵² Eu、或其他鑭系元素、電化學發光化合物、化學發光化合物，例如，發光胺(luminol)，異發光胺(isoluminol)、或吖啶酯鹽類(acridinium salt)；專一結合分子，例如雌性粒子、微米球型、奈米球型、及與其相似者。上述名詞亦包含與藥劑結合之胜肽。

上述名詞亦包含融合蛋白質，包括但不限於，麩胺基硫轉移酶(GST,Glutathione S-Transferase)融合蛋白質；具有異源胺基酸序列之融合蛋白質，前述異源胺基酸序列如生物發光蛋白質，例如螢光素、或水母發光蛋白(綠色螢光蛋白質)；具有異源及同源前導序列之融合蛋白質；具有及不具有N端甲硫胺酸殘基之融合蛋白質；聚乙二醇化蛋白質；以及具有免疫標籤或具有組胺酸標籤之蛋白質。此類融合蛋白質亦包含與抗原決定區(epitope)融合者。此類融合蛋白質可包含本發明實施例之胜肽的單體集合體，如同源二具體或同源單體集合體、以及異源二具體及異源單體集合體。上述名詞亦包含胜肽適體。

「專一性雜合」一詞在聚核苷酸的脈絡中係指在嚴緊條件下進行之雜合。相關領域中習知多種方法，可使得DNA/DNA及DNA/RNA雜合反應之條件更加嚴緊。嚴緊雜合條件包含在4 X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中於約65-70℃下進行雜合、或在4 X SSC加上50%甲醯胺中於約42-50℃下進行雜合；其後以1X SSC於約65-70℃下清洗一至數次。

「配位體」一詞係指與另一分子結合之一種分子，包括受體。

「宿主細胞」係指一個別細胞或細胞培養物，其可作為或已經成為任何重組載體(們)或聚核苷酸之重組受體。宿主細胞包含單一宿主細胞之子代細胞，且該子代細胞可能不必然和原始母代細胞完全相同(不論是型態或整體DNA組成)，此一情形可能是人為、意外、或蓄意之突變和/或改變所致。宿主細胞包含在活體內或活體外，以本發明之聚核苷酸的載體轉染或感染之細胞。包含本發明之重組載體的宿主細胞可稱為「重組宿主細胞」。

「治療」涵蓋對於哺乳類動物之疾病提供或給予任何治療方法，上述哺乳類動物包括人類。所謂治療及包含抑制疾病、阻止疾病發展、減緩疾病，例如藉使其退化、或回復或修補遺失、缺失、或缺損之功能；或刺激沒有效率的生理過程。上述名詞包含得到一種理想的藥理學和/生理學效果，涵蓋對於哺乳類動物中任何的病理情況或疾患的治療，上述哺乳類動物包括人類。上述效果可以是預防性的，亦即能夠完全或部分地防止疾患和或相關症狀；或者可以是治療性地，亦即能夠部分或完全地治癒疾患和/或該疾患所導致之不良影響。因此，本發明提供了治療及預防。其包含(1)防止可能罹患疾病但尚未出現症狀的患者患病或復發；(2)抑制疾患，例如阻止疾患之發展；(3)停止或終止疾患或至少相關之症狀，而使得患者不再受疾患或其症狀所苦，例如使得疾患或其症狀退化，例如藉由回復或修補遺失、缺失、或缺損之功能；或刺激沒有效率的生理過程；以及(4)減輕、緩和或改善疾患或相關症狀，其中「改善」一詞廣義地係指能夠減輕至少一種參數的強度，例如發言、疼痛、和/或腫瘤大小。

「藥學上可接受的載體」係指非毒性地固態、半固態或液體填料、稀釋劑、封裝材料、配方輔劑、或任何習知類型之賦型劑。藥學上可接受的載體在所用的劑量及濃度下，對於使用者而言是沒有毒性的，且可和配方中其他成分相容。

「組合物」係指一種混合物，其通常含有載體，例如藥學上可接受的載體或習知賦型劑，且適合投予患者，以便進行治療、診斷或預防。其可包括細胞培養物，其中在細胞或培養基中存有多胜肽或聚核苷酸。舉例而言，口服組合物可以是溶液、懸浮液、錠劑、藥丸、膠囊、緩釋性配方、漱口水或粉末。

「疾病」係指需要醫學處置或應進行醫學處置之任何狀況、感染、疾患、或症狀。上述醫學處置包含治療、診斷、和/或預防。

胜肽

可利用習知方法來表現本發明實施例之胜肽。利用細胞之方法以及無細胞之方法皆適於產生本發明實施例之胜肽。利用細胞之方法通常係在活體外將核酸構築體引入宿主細胞中，並在適合表現的情形下培養宿主細胞，之後可由培養基或宿主細胞(舉例而言，使宿主細胞破裂)或二者中收集胜肽。本發明亦提供以無細胞方法產生胜肽之方法，其係在活體外進行習知的無細胞轉錄/轉譯方法。

適當宿主細胞包含原核或真核細胞，包括如細菌、酵母菌、真菌、植物、昆蟲、及哺乳類動物細胞。

傳統上，異源胜肽，不論是否經過修飾，皆可如上所述獨立表現、或以融合蛋白質之形式表現，且不僅可包含分泌信號，亦可包含分泌性前導序列。本發明之分泌性前導序列可將某些蛋白質導引至內質網(ER)。ER可將與細胞膜結合之蛋白質和其他蛋白質分離開來。一旦定域至ER後，可進一步將蛋白質導引至高基氏體，以供分散至囊泡中，包括分泌泡、原生質膜、溶體、及其他胞器。

此外，可將胜肽部分體和/或純化標籤加入胜肽中。此一部分可在最終製備多胜肽前移除。將胜肽部分體加入多胜肽可引起分泌或排出(excretion)，以便提升穩定性且有助於純化，同時基於其他理由，使得習知領域非常熟悉且常用此一技術。適當的純化標籤包括，例如V5、聚組胺酸、抗生物素、及生物素。可利用習知技術將胜肽結合至化合物，如生物素。(Hermanson ed.(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press)。亦可利用習知技術將胜肽和放射性同位素、毒素、酵素、螢光標記、膠質金、核酸、長春花鹼(vinorelbine)、及阿黴素類(doxorubicin)結合。(Hermanson ed.(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press；Stefanoet al. (2006))。

適用於本發明之融合部分包括，例如胎球蛋白、人類血清白蛋白、Fc、和/或上述物質之一或更多片段。亦提供了結合蛋白質，例如聚乙二醇結合物。

亦可利用習知技術化學合成本發明實施例之胜肽(參見，如Hunkapilleret al. ,Nature,310：105111(1984)；Grant ed.(1992)Synthetic Peptides,A Users Guide,W.H.Freeman and Co.；U.S.Patent No.6,974,884)。舉例而言，可利用胜肽合成儀或習知的固相方法，合成和一單離多胜肽之片段相對應之單離多胜肽。

更有甚者，若有需要，可將非傳統的胺基酸或化學胺基酸類似物以取代或加入的方式引入多胜肽序列中。非傳統胺基酸包括但不限於，常見胺基酸之D-異構物、2,4-二胺基丁酸，a-胺基異丁酸，4-胺基丁酸、Abu、2-胺基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-胺基己酸、Aib、2-胺基異丁酸、3-胺基丙酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、肉胺酸、瓜胺酸、高瓜胺酸、磺基丙胺酸、t-丁甘胺酸、t-丁丙胺酸、苯甘胺酸、環己丙胺酸、b-丙胺酸、氟-胺基酸、特殊設計胺基酸例如b-甲基胺基酸、鈣-甲基胺基酸、鈉-甲基胺基酸、及一般胺基酸類似物。更有甚者，胺基酸可以是D型(右旋)或L型(左旋)。

可利用標準方法由化學合成及重組細胞培養物中取得並純化本發明實施例之單離多胜肽，上述方法包括但不限於，硫酸銨或乙醇沈澱法、酸萃取法、陰離子或陽離子交換層析法、磷纖維素(phosphocellulose)層析法、疏水作用層析法、親和力層析法、氫氧磷灰石層析法及凝集素層析法。在一具體實施例中，利用高性能液相層析法(HPLC)進行純化。當蛋白質在分離和/或純化過程中變性時，可利用習知的方法來重新折疊蛋白質，以重新產生具有活性之構型。

可修飾本發明實施例之胜肽或擬胜肽，或可將其共價地和多種親水性聚合物結合，以增加胜肽之可溶性及循環半衰期。能夠和胜肽結合的非蛋白親水性聚合物包括但不限於，聚烷基醚如聚乙二醇及聚丙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧伸烷烴(polyoxyalkenes)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素及纖維素衍生物、聚葡萄糖、及聚葡萄糖衍生物。一般而言，此種親水性聚合物平均分子量為約500至約100,000道爾敦(dalton)、約2,000至約40,000道爾敦、約5,000至約20,000道爾敦。可利用下列文獻中提出之任何方法，將上述聚合物用以衍生或結合至胜肽：Zallipsky,S.(1995)Bioconjugate Chem.,6：150-165； Monfardini,C.,et al. (1995)Bioconjugate Chem.6：62-69；U.S.Pat.Nos.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；4,179,337,or WO 95/34326

在某些具體實施例中，在習知領域中熟知的多種具有藥學上可接受的載體、賦型劑、及稀釋劑之配方中，提供本發明實施例之胜肽。USP醫藥賦型劑列表中包含這些醫藥載體、賦型劑、及稀釋劑。USP及NF賦型劑的分類列表，請見：p.2404-2406,USP 24NF 19,United States Pharmacopeial Convention Inc.,Rockville,Md.(ISBN 1-889788-03-1)。藥學上可接受的賦型劑，例如載具、佐劑、載體、或稀釋劑皆可輕易取得。此外，藥學上可接受的輔助劑，例如pH調節及緩衝劑、滲壓性調節劑、安定劑、潤濕劑、及與其相似者皆可輕易取得。

適當的載體包括但不限於，水、右旋糖、甘油、生理食鹽水、乙醇、及上述之組合。載體可含有額外的藥劑，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、或佐劑，這些額外的藥劑能夠加強配方的有效性。局部性載體包含液化石油、異丙醇棕櫚酸鹽、聚乙二醇、乙醇(95%)、聚氧乙烯單月桂酸酯(5%)於水中、或硫酸月桂酯鈉(5%)於水中。有必要時，亦可加入其他材料如抗氧化劑、保溼劑、黏度安定劑、及類似藥劑。亦可包括透皮穿透力增強劑例如氮酮(Azone)。

在藥品劑量的形式中，本發明之組合物能夠以其藥學上可接受的鹽類之形式投藥，或亦可單獨使用該組合物、或和其他具有藥物活性之化合物以適當的聯合或組合方式使用。根據可能的投藥方式來合成目標組合物。

治療方法

與αvβ3整合蛋白相關之疾病，包括但不限於，骨質疏鬆症、骨瘤或骨癌生長及相關症狀、與血管生成相關之腫瘤生長及癌細胞轉移、骨骼中的腫瘤癌細胞轉移、惡性腫瘤引起之高血鈣症、與血管生成相關之眼部疾病、派傑氏症、風濕性關節炎及退化性關節炎。

將本發明實施例之胜肽投予給有治療需要之患者時，可利用全身性注射，例如靜脈注射；或注射或施用相關部位，例如當該部位在手術中暴露於外時，直接注射、或直接給藥至該部位；或局部施用，例如針對皮膚上之疾患部位。

本發明實施例之胜肽可用作單一藥物治療。或者是，可將本發明實施例之胜肽和其他用以治療與αvβ3整合蛋白相關之疾病之標準療程合併使用。

可利用各種給藥途徑，包括口服、經口腔粘膜、鼻腔、直腸、腸道外、腹膜內、皮內、透皮、皮下、靜脈內、動脈內、心臟內、心室內、顱內、氣管內、及脊髓腔內給藥等，或以其他方式植入或吸入。因此，可將組合物配製成固態、半固態、液態、或氣態形式，例如錠劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射液、吸入劑、噴霧劑。下列方法及賦型劑僅作為例示，且不具限制性。

適當的賦型劑載具可為，例如水、生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇、及與其相似者、及上述之組合。此外，若有需要，載具可含有少量輔助性物質，例如潤濕劑、乳化劑、或pH緩衝劑。製備上述劑型的實際方法為習之此技術者所熟之或可輕易知悉。無論如何，用於投藥的組合物或配方含有之藥劑數量足以使得欲治療患者達到所想狀態。

可將本發明實施例之單離多胜肽溶解、懸浮、或乳化於液體及非液體溶劑中，以形成製劑。上述溶劑例如植物油或其他類似油脂、合成脂肪酸甘油酯、多碳脂肪酸之酯類、或丙二醇；此外，若有需要，還可具有傳統添加物例如助溶劑、等滲壓劑、懸浮劑、乳化劑、安定劑、及防腐劑。亦可如習之技術一般，利用其他口服或直腸給藥配方。

「去整合蛋白」係指一多胜肽家族，其係由蛇毒蛋白純化而成。該蛇毒蛋白含有精胺酸(R)-甘胺酸(G)-天門冬胺酸(D)序列(簡稱RGD)。在不受限於任何理論或機制的前提下，據信RGD三胜肽對於整合蛋白具有高度的結合親和力，可阻斷整合蛋白和含有RGD之蛋白質間的互動。因此，去整合蛋白能夠阻斷黏著功能且可作為血小板凝集抑制劑。

「Rho」為「馬來亞蝮素」的縮寫，這是一種由馬來亞蝮(Colloselasma rhodostoma)的蛇毒血清所衍生的去整合蛋白。馬來亞蝮素可非專一性地和整合蛋白αIIbβ3、α5β1及αvβ3結合，且因為其能夠和血小板醣蛋白αIIbβ3結合，所以能藉著抑制血小板凝集而延長血液凝固時間。

「去整合蛋白變異體」或「馬來亞蝮素變異體」係指具有功能活性之蛋白質、多胜肽或任何其衍生物，該衍生物包含由野生型去整合蛋白例如馬來亞蝮素衍生、修飾或突變而成之胺基酸序列。具功能活性之去整合蛋白/馬來亞蝮素變異體可專一性地和整合蛋白αvβ3結合並抑制其活性。可利用任何適當方法來構築本發明之去整合蛋白或馬來亞蝮素變異體。在一具體實施例中，係利用定點突變方法，且在另一具體實施例中，係利用聚合酶連鎖反應法。相較於原型多胜肽，變異體可包含插入、加入、缺失、或取代。多胜肽序列之變異體包含具生物活性之多型變異體。

本發明實施例之胜肽可包含自然界中存在及不存在的胺基酸。上述胜肽可包含D-胺基酸、D-胺基酸及L-胺基酸之組合、及各種「特殊設計」或「合成」胺基酸(例如，β-甲基胺基酸、Cα-甲基胺基酸、及Nα-甲基胺基酸、等)以便表現特殊的性質。此外，上述胜肽可以是環狀的。上述胜肽可包含非典型胺基酸，以便產生具有特定構型之基序(motifs)。可利用任何已知的非典型胺基酸。可將胺基酸類似物及擬胜肽加入一胜肽中，以產生或易於產生特定次級結構，包括但不限於，LL-Acp(LL-3-胺基-2-哌啶酮-6-羧酸，LL-3-amino-2-piperidone-6-carboxylic acid)、β-轉角誘導二胜肽類似物、β-折疊誘導類似物、β-轉角誘導類似物、α-螺旋誘導類似物、γ-轉角誘導類似物、甘胺酸-丙胺酸轉角類似物、醯胺鍵同電子排列體、或四唑、及與其相似者。

可在胜肽的末端形成去胺基或去羧基殘基，而使得末端沒有胺基或羧基，以便降低其被蛋白酶分解之機會或限制其構型。C端官能基包含醯胺基、短碳鏈烴基醯胺基、二烴基醯胺基、短碳鏈烷氧基、羥基、及羧基、以及上述之短碳鏈酯類衍生物、及其藥學上可接受的鹽類。

「IC₅₀ 」或「半效抑制濃度」(half maximal inhibitory concentration)等詞係指Rho或其變異體將其受體抑制達50%所需之濃度。IC₅₀ 可用以量測Rho或其變異體將一生理作用抑制達50%所需的量。上述生理作用例如變異體對其受體之親和力。

「有效治療劑量」、或「有效劑量」係指當將一數量投予一患者時可在該患者身上達到一所想的效果。舉例而言，本發明之去整合蛋白或Rho變異體投予患者之有效劑量為可防止和/或治療整合蛋白αvβ3媒介之疾病所需的量。實際的使用量將隨著治療目的而不同，且習知此技術者可利用已知技術確定該數量。相關領域中也已經知道，可能需要針對全身或局部投藥、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食習慣、投藥時間、藥物交互作用、及嚴重性等情形，來調整劑量，且習知此技術者可經由慣常試驗確定該數量。

「受體拮抗劑」一詞係指受體之一種結合配位體，其可藉由阻斷促效劑和受體之結合以抑制受體之功能，或允許促效劑與受體結合但抑制促效劑活化受體之能力。

「整合蛋白αIIbβ3和/或α5β1受體阻斷活性實質降低」係指相較於野生型馬來亞蝮素或其他去整合蛋白，其阻斷整合蛋白αIIbβ3和/或α5β1受體之活性至少降低5倍。舉例而言，欲計算αIIbβ3和/或α5β1受體阻斷活性的降低程度，可將用以抑制整合蛋白αIIbβ3和/或α5β1和基質蛋白質如纖維蛋白原的馬來亞蝮素變異體之IC₅₀ 和Rho之IC₅₀ 進行比較。

「RGD基序變異體」一詞係指相對於相對應野生型序列之RGD序列，例如至少包含馬來亞蝮素之RGD的序列，一胜肽在跨RGD序列之位置中包含一胺基酸序列之改變。「RGD基序變異體」之實施例包含⁴⁸ ARGDDP⁵³ 、⁴⁸ PRLDMP⁵³ 、⁴⁸ PRIDMP⁵³ 、以及⁴⁸ ARLDDL⁵³ 。

「RD」一詞係指馬來亞蝮素變異體具有RGD基序變異體⁴⁸ PRLDMP⁵³ 。

「PGP」一詞係指馬來亞蝮素變異體具有RGD基序變異體⁴⁸ PRGDGP⁵³ 。

ARLDDL一詞係指馬來亞蝮素變異體具有RGD基序變異體⁴⁸ ARLDDL⁵³ 。

「整合蛋白αvβ3相對於αIIbβ3和/或α5β1受體之抑制選擇性」係指變異體對於整合蛋白αvβ3之結合選擇性相較於其對αIIbβ3和/或α5β1受體之之結合選擇性，其表示方法為變異體抑制αIIbβ3和/或α5β1受體之IC₅₀ 和變異體抑制αvβ3受體之IC₅₀ 的比例。

「延長流血時間之活性實質降低」一詞係指根據本說明書所述之流血時間實驗所測量之結果，抑制血液凝塊之能力降低，且此一結果具有統計學上的顯著差異。

「聚乙二醇化-RD」一詞係指RD蛋白質經聚乙二醇化之產物。

「白蛋白-RD或HSA-RD」一詞係指RD蛋白質和人類白蛋白結合之產物。

發明概述

本發明係關於去整合蛋白變異體，其為選擇性之αvβ3整合蛋白拮抗劑。去整合蛋白變異體，例如RD相關化合物，能夠在活體外抑制蝕骨細胞分化。在動物研究中，其亦可亦抑制蝕骨細胞再吸收活性及卵巢切除所引發之蝕骨細胞過量增生。此外，RD可抑制人類前列腺之腫瘤生長以骨骼中的乳癌細胞。RD相關蛋白質亦可有效阻止惡性腫瘤引起之高血鈣症。派傑氏症(亦稱為畸形性骨炎)是一種慢性骨骼疾患，其通常會造成骨骼增大及變形，這是因為骨骼組織不規則的分解及形成。雙膦酸酯類已經獲准可用以治療派傑氏症。退化性關節炎亦與蝕骨細胞活性增加相關。基於類似的作用機制，RD衍生物應當亦可有效用於治療這些骨骼疾患。以30 mg/kg的大劑量進行RD或PGP之靜脈注射，不會影響小鼠的存活率(n=3)。此外，長期給予PGP(I.V.,0.5 mg/kg/day)達六週，不會影響血清中肌酸酐、GOT、及GPT等之濃度。以上資料顯示，其對於腎臟及肝臟不會造成副作用。因而，RD及其衍生物為治療骨質疏鬆症、骨瘤、惡性腫瘤引起之高血鈣症、派傑氏症、風濕性關節炎、退化性關節炎及與血管生成相關之眼部疾病的可能候選藥物。

許多蛇毒蛋白含有包含一RGD區域(RGD domain)之蛋白質。這些含有RGD區域之蛋白質稱為去整合蛋白。改變跨越RGD區域之序列，會產生一種非常獨特的多胜肽變異體，其對於其他種整合蛋白的結合親和力降低，但對於αvβ3整合蛋白的選擇性則變高。上述去整合蛋白變異體包括馬來亞蝮素變異體，其經證實為治療骨質疏鬆症、抑制骨骼中腫瘤生長、及與血管生成相關之眼部疾病、及其他疾病之可能候選藥物。此外，去整合蛋白變異體包括馬來亞蝮素變異體，其具有一RGD-基序區域，在該區域中的至少一胺基酸取代乃是開發αvβ3整合蛋白之選擇性拮抗劑的有利工具。

本發明的一種態樣為一單離多胜肽，其具有整合蛋白αvβ3受體拮抗活性，且相較於一野生型去整合蛋白，其整合蛋白αIIbβ3和/或α5β1之受體阻斷活性降低。上述多胜肽係由可編碼改造胺基酸序列之改造去整合蛋白核苷酸序列所編碼產生的，所產生之單離多胜肽對於整合蛋白αIIbβ3和/或α5β1之受體阻斷活性降低。上述多胜肽可經聚乙二醇化或和白蛋白結合。

去整合蛋白核苷酸序列可由蛇毒蛋白衍生。根據本發明，去整合蛋白包括但不限於，白唇竹葉青蛇素(來自白唇竹葉青，Cryptelytrops albolabris )、百步蛇素(來自百步蛇，Agkistrodon piscivorus piscivorus )、墨西哥西海岸響尾蛇素(來自墨西哥西海岸響尾蛇，Crotalus basiliscus )、矛頭蝮素(來自矛頭蝮，Bothrops atrox )、鼓腹巨蛇素(來自鼓腹巨蛇，Bitis arietans )、西部亞種響尾蛇素(來自西部響尾蛇cerberus亞種，Crotalus oreganus cerberus )、角響尾蛇素(來自角響尾蛇，Crotalus cerastes cerastes )、西部菱背響尾蛇素(來自西部菱背響尾蛇，Crotalus atrox )、南美響尾蛇素(來自南美響尾蛇，Crotalus durissus durissus )、麗紋龜殼花蛇素(來自麗紋龜殼花，Protobothrops elegans )、黃綠龜殼花蛇素(來自黃綠龜殼花，Trimeresurus flavoviridis )、黃綠龜殼花蛇毒解離素(來自黃綠龜殼花，Trimeresurus flavoviridis )、日本蝮素(來自，Gloydius blomhoffi )、西伯利亞蝮蛇毒解離素(來自西伯利亞蝮，Gloydius halys )、巴西蝮蛇素(來自巴西蝮，Bothrops jararaca )、巴西蝮蛇毒解離素(來自巴西蝮，Bothrips jararaca )、馬來亞紅口蝮素(來自馬來亞紅口蝮，Calloselasma rhodostoma )、亞馬遜巨蝮素(來自亞馬遜巨蝮，Lachesis muta muta )、西部亞種響尾蛇素(來自西部響尾蛇lutosus亞種，Crotalus oreganus lutosus )、黑尾響尾蛇素(來自黑尾響尾蛇，Crotalus molossus molossus )、韓國短尾蝮素(來自韓國短尾蝮，Gloydius blomhoffi brevicaudus )、西伯利亞蝮蛇素(來自西伯利亞蝮，西伯利亞蝮)、北美侏儒響尾蛇素(來自北美侏儒響尾蛇，Sistrurus catenatus tergeminus )、黃綠龜殼花蛇毒解離素(來自黃綠龜殼花，Trimeresurus flavoviridis )、台灣龜殼花蛇素(來自台灣龜殼花(棕斑龜殼花)，Protobothrops mucrosquamatus )、台灣龜殼花去整合蛋白(來自台灣龜殼花，Protobothrops mucrosquamatus )、烏蘇里蝮素(來自烏蘇里蝮，Gloydius ussuriensis )、或草原響尾蛇素(來自草原響尾蛇，Crotalus viridis )。

本發明之另一態樣為一單離多胜肽，其為一馬來亞蝮素之變異體，其中該馬來亞蝮素包含SEQ ID NO：1定義之胺基酸序列，且該變異體包含一RGD基序變異體。

在本發明一具體實施例中，RGD基序變異體可含有選自SEQ ID NO：30-42之胺基酸序列。

本發明之另一態樣為一種多胜肽，其包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，其更包含在對應於SEQ ID NO：1之胺基酸的第48、50、52、或53個位置等四個位置上有一、二、三個胺基酸取代。

本發明之另一態樣為一種多胜肽，其包含選自SEQ ID NO：1之下列位置的胺基酸取代：在第48個位置取代為Ala；在第50個位置取代為Leu、Ile、及His；在第52個位置取代為Asp、Met、及Asn；以及在第53個位置取代為Val、Leu、及Met。

本發明之另一態樣為一單離多胜肽，其係由選自SEQ ID NO：43-56之核苷酸序列所編碼。

具體舉例而言，在本發明另一具體實施例中，RGD基序變異體可包含至少一胺基酸取代，上述胺基酸取代發生於和SEQ ID NO：29之野生型RGD基序的Gly⁵⁰ 或Met⁵² 相對應的殘基。上述至少一胺基酸取代發生於和SEQ ID NO：36-37之Leu⁵⁰ 相對應的殘基；和SEQ ID NO：39之Ile⁵⁰ 相對應的殘基；和SEQ ID NO：40之His⁵⁰ 相對應的殘基；和SEQ ID NO：41之Asn⁵² 相對應的殘基；或和SEQ ID NO：42之Gly⁵² 相對應的殘基。

在本發明另一具體實施例中，RGD基序變異體可包含至少二胺基酸取代，上述胺基酸取代發生於和SEQ ID NO：29之野生型RGD基序的Pro⁴⁸ 及Met⁵² 、或Met⁵² 及Pro⁵³ 相對應的殘基。上述至少二胺基酸取代發生於和SEQ ID NO：30之Ala⁴⁸ 及Asp⁵² 相對應的殘基；或和SEQ ID NO：35之Asp⁵² 及Met⁵³ 相對應的殘基。

在本發明又另一種具體實施例中，RGD基序變異體可包含在和SEQ ID NO：29之野生型RGD基序的Pro⁴⁸ 、Met⁵² 及Pro⁵³ ，或Gly⁵⁰ 、Met⁵² 及Pro⁵³ 相對應的殘基中有至少三胺基酸取代。上述至少三胺基酸取代發生於和SEQ ID NO：31之Ala⁴⁸ 、Asp⁵² 及Val53相對應的殘基；和SEQ ID NO：32之Ala⁴⁸ 、Asp⁵² 及Leu⁵³ 相對應的殘基；和SEQ ID NO：34之Ala⁴⁸ 、Asp⁵² 及Met⁵³ 相對應的殘基；以及和SEQ ID NO：37之Leu⁵⁰ 、Asp⁵² 及Leu⁵³ 相對應的殘基。

在本發明又另一種具體實施例中，RGD基序變異體可包含在SEQ ID NO：29之野生型RGD基序的Pro⁴⁸ 、Gly⁵⁰ 、Met⁵² 及Pro⁵³ 相對應的殘基中有至少四胺基酸取代。至少四胺基酸取代發生於和SEQ ID NO：38之Ala⁴⁸ 、Leu⁵⁰ 、Asp⁵² 及Leu⁵³ 相對應的殘基。

本發明之另一態樣為一單離離多胜肽，其係由具有選自SEQ ID NO：44-56之基因改造馬來亞蝮素核苷酸序列的DNA編碼。相較於馬來亞蝮素，該單離多胜肽對於αIIbβ3和/或α5β1之親和力降低至少約5、50、或100倍。在本發明一具體實施例中，相較於馬來亞蝮素，該單離多胜肽對αIIbβ3和/或α5β1整合蛋白之親和力降低至少約200倍。在本發明另一具體實施例中，相較於馬來亞蝮素，該單離多胜肽對αIIbβ3和/或α5β1整合蛋白之親和力降低至少約1000或2000倍。在本發明另一具體實施例中，相較於馬來亞蝮素，該單離多胜肽對血小板之親和力降低至少5、50、100、1000、或2000倍。在本發明又另一種具體實施例中，相較於馬來亞蝮素或野生型去整合蛋白，該單離多胜肽對於延長血液凝塊時間之活性實質降低。

本發明之又另一種態樣為一種生理上可接受的組合物，包含本發明實施例之單離多胜肽以及一種藥學上可接受的載體。

本發明之又另一種態樣為一種利用去整合蛋白變異體治療和/或預防哺乳類動物與αvβ3整合蛋白相關之疾病的方法。上述哺乳類動物包括一人類。上述方法包含向有需要之哺乳類動物投予有效劑量之一單離多胜肽、或其藥學上可接受的鹽類。其中該單離多胜肽具有整合蛋白αvβ3受體拮抗活性，且相較於一野生型去整合蛋白，該單離多胜肽之整合蛋白αIIbβ3和/或整合蛋白α5β1受體阻斷活性實質降低，且因而使得可治療和/或預防哺乳類動物與αvβ3整合蛋白相關之疾病。上述之單離多胜肽係由編碼基因改造去整合蛋白胺基酸序列之基因改造去整合蛋白核苷酸序列所編碼，所產生之一單離多胜肽的整合蛋白αIIbβ3和/或整合蛋白α5β1受體阻斷活性實質降低。本方法中所用之單離多胜肽可經聚乙二醇化或和白蛋白結合。

如上所述，去整合蛋白核苷酸序列可衍生自蛇毒蛋白，如馬來亞蝮素、白唇竹葉青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸響尾蛇素、矛頭蝮素、鼓腹巨蛇素、西部亞種響尾蛇素、角響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、日本蝮去整合蛋白、西伯利亞蝮蛇毒解離素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解離素、馬來亞紅口蝮素、亞馬遜巨蝮素、西部亞種響尾蛇蛇素、黑尾響尾蛇素、韓國亞種短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、台灣龜殼花素、台灣龜殼花去整合蛋白、烏蘇里蝮素、或草原響尾蛇素。

在本發明一具體實施例中，上述方法包含投予哺乳類動物有效劑量之一分離之單離多胜肽、或其藥學上可接受的鹽類，其中該單離多胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，且該變異體包含RGD基序變異體。

在本發明另一具體實施例中，上述方法包含投予哺乳類動物有效劑量之一分離之單離多胜肽、或其藥學上可接受的鹽類，其中該單離多胜肽為一馬來亞蝮素之變異體包含SEQ ID NO：1定義之胺基酸序列，且該變異體包含RGD基序變異體，其中該RGD基序變異體具有選自SEQ ID NO：30-42之胺基酸序列。

在本發明又另一種具體實施例中，上述方法包含投予哺乳類動物有效劑量之一分離之單離多胜肽、或其藥學上可接受的鹽類，其中該單離多胜肽包含選自SEQ ID NO：57-69之胺基酸序列。

在本發明一具體實施例中，本發明實施例之單離多胜肽可用以治療和/或預防與αvβ3整合蛋白相關之疾病，上述疾病包括但不限於，骨質疏鬆症、骨瘤或骨癌生長及相關症狀、與血管生成相關之腫瘤生長及癌細胞轉移、骨骼中的腫瘤癌細胞轉移、惡性腫瘤引起之高血鈣症、與血管生成相關之眼部疾病、派傑氏症、風濕性關節炎、及退化性關節炎。

在本發明另一具體實施例中，本發明實施例之單離多胜肽可用以治療和/或預防與血管生成相關之眼部疾病，上述疾病包括但不限於，老年性黃斑病變、糖尿病視網膜病變、角膜神經血管增生病變、局部缺血導致之神經血管增生視網膜病變、高度近視、或早熟性視網膜病變。

在本發明又另一種具體實施例中，本發明實施例之單離多胜肽可用以治療和/或預防骨質疏鬆症。骨質疏鬆症可能和下列病理情形相關，包括更年期後的雌激素缺乏、次級骨質疏鬆症、風濕性關節炎、卵巢切除、派傑氏症、骨癌、骨瘤、退化性關節炎、蝕骨細胞形成過多、及蝕骨細胞活性增加。更有甚者，骨質疏鬆症包括但不限於，由卵巢切除所引發或更年期後之骨質疏鬆症或骨質流失。

本發明之又另一種態樣為一種利用去整合蛋白變異體治療和/或預防哺乳類動物體內因卵巢切除或更年期後骨質疏鬆症引發之生理狀態改變之方法。上述哺乳類動物包括一人類。上述方法包含投予哺乳類動物有效劑量之一單離多胜肽、或其藥學上可接受的鹽類，其具有整合蛋白αvβ3受體拮抗活性，且相較於一野生型去整合蛋白其整合蛋白αIIbβ3和/或α5β1之受體阻斷活性實質降低，且因而能夠治療和/或預防哺乳類動物體內卵巢切除所引發之生理狀態改變。上述多胜肽係由編碼基因改造胺基酸序列之基因改造去整合蛋白核苷酸序列所編碼，所產生之單離多胜肽的整合蛋白αIIbβ3和/或α5β1受體阻斷活性實質降低。去整合蛋白核苷酸序列可衍生自蛇毒蛋白，如馬來亞蝮素、白唇竹葉青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸響尾蛇素、矛頭蝮素、鼓腹巨蛇素、西部亞種響尾蛇素、角響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、日本蝮蛇素、西伯利亞蝮蛇毒解離素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解離素、馬來亞紅口蝮素、亞馬遜巨蝮素、西部亞種響尾蛇蛇素、黑尾響尾蛇素、韓國亞種短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、台灣龜殼花素、台灣龜殼花去整合蛋白、烏蘇里蝮素、或草原響尾蛇素。

用以治療和/或預防哺乳類動物體內卵巢切除所引發或更年期後生理狀態改變之上述多胜肽變異體可含有RGD基序變異體，其包含選自SEQ ID NO：30-42之胺基酸序列。

在本發明一具體實施例中，上述方法包含投予哺乳類動物有效劑量之一單離多胜肽、或其藥學上可接受的鹽類，其中該單離多胜肽變異體包含選自SEQ ID NO：57-69之胺基酸序列。在另一種具體實施例中，該單離多胜肽變異體經聚乙二醇化或和白蛋白結合。

本發明之又另一種態樣為一種利用去整合蛋白變異體抑制和/或預防哺乳類動物骨骼中之腫瘤細胞生長及相關症狀的方法。上述哺乳類動物包括一人類。上述方法包含投予哺乳類動物有效劑量之一單離多胜肽、或其藥學上可接受的鹽類，其具有整合蛋白αvβ3受體拮抗活性，且相較於一野生型去整合蛋白其整合蛋白αIIbβ3和/或α5β1之受體阻斷活性實質降低，且因而能夠抑制和/或預防哺乳類動物骨骼中之腫瘤細胞生長及相關症狀。上述多胜肽係由編碼基因改造胺基酸序列之基因改造去整合蛋白核苷酸序列所編碼，且因而造成上述多胜肽對於整合蛋白αIIbβ3和/或α5β1之受體阻斷活性實質降低。

去整合蛋白核苷酸序列可衍生自蛇毒蛋白，如馬來亞蝮素、白唇竹葉青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸響尾蛇素、矛頭蝮素、鼓蝮巨蛇素、西部亞種響尾蛇素、角響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、日本蝮蛇素、西伯利亞蝮蛇毒解離素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解離素、馬來亞紅口蝮素、亞馬遜巨蝮素、西部亞種響尾蛇蛇素、黑尾響尾蛇素、韓國亞種短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、台灣龜殼花素、台灣龜殼花去整合蛋白、烏蘇里蝮素、或草原響尾蛇素。

與骨骼中腫瘤細胞生長相關之病理症狀包括蝕骨細胞活性過高、骨骼再吸收過度、骨病灶、高血鈣症、體重減輕、及上述之任意組合。骨骼中腫瘤細胞生長包含骨癌細胞及原發於前列腺癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌、腎癌、卵巢癌、胰臟癌、及骨髓瘤癌之一或更多者的轉移性癌細胞。

在本發明一具體實施例中，上述方法包含投予哺乳類動物有效劑量之一單離多胜肽、或其藥學上可接受的鹽類，其中該單離多胜肽為一馬來亞蝮素之變異體，其中該馬來亞蝮素包含SEQ ID NO：1定義之胺基酸序列，且該變異體包含RGD基序變異體。RGD基序變異體可包含選自SEQ ID NO：30-42之胺基酸序列。

在本發明另一具體實施例中，上述方法包含投予哺乳類動物有效劑量之一單離離多胜肽、或其藥學上可接受的鹽類，其中該單離多胜肽包含選自SEQ ID NO：57-69之胺基酸序列。該單離多胜肽變異體可經聚乙二醇化或和白蛋白結合。

本發明之又另一種態樣為一種製備本發明實施例之單離多胜肽的方法，上述方法包含下列步驟：(a)以可編碼上述多胜肽之聚核苷轉染宿主細胞以獲得一或多轉形體；(b)選擇一轉形體，其具有一或超過一個上述DNA構築體之複本插入至該轉形體中；(c)在培養基中培養該轉形體以擴增細胞群；(d)收集轉形體細胞；(e)在不具有胺基酸的培養基中培養步驟(d)所得之轉形體細胞；以及(g)收集上清液以得到上述多胜肽。

上述步驟(e)可更包含將甲醇加入培養基中，以誘導轉形體細胞中之單離多胜肽表現。在一具體實施例中，步驟(g)可更包含進行管柱層析以得到上述多胜肽。在又一具體實施例中，上述方法可更包含進行HPLC以得到純化、單離多胜肽。

下文將詳述本發明之上述及其他態樣。

人類重組RANKL及M-CSF係來自R&D Systems(Minneapolis,MN)。第I型膠原蛋白ELISA kit之碳端胜肽係來自Cross Laps(Herlev,Denmark)。所有其他化學藥品皆來自Sigma。

實施例1

構築編碼馬來亞蝮素及其變異體之DNA

在載體pGEX-2KS[20]中選殖並表現馬來亞蝮素作為模版。編碼Rho之DNA係由通常用於酵母菌(Pichia pastoris )中之密碼子所組成。利用聚合酶連鎖反應(PCR)擴增Rho DNA，所用之義股引子(sense primer)為5’-GAATTCGAATTCCATCATCATCATCATCATCATGGTAAGGAATGTGACTGTTCTT-3’(Rho-Pic-1；SEQ ID NO：3)，其具有Eco R1辨識序列以及六個組胺酸殘基有助於後續純化。反義股引子為5’-CCGCGGCCGCGGTCAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3’或5’-CCGCGGCCGCGGTTAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3’(Rho-Pic-2；SEQ ID NO：4)其具有Sac II辨識序列以及TAA(或TGA)停止密碼子。將PCR產物純化，且之後接合至酵母菌重組載體pPICZαA之Eco R1及Sac II限制酶切點。利用該重組質體轉殖XL1-blue品系，並以低鹽LB(1%胰化蛋白(tryptone)，0.5%酵母菌抽出物，0.5%氯化鈉，1.5%洋菜，pH 7.0)以及25μg/ml之Zeocin抗生素在洋菜培養基上選出轉殖群落。

利用一重疊寡核苷酸法以帶有Eco RI及SacII限制酶切點之引子進行聚合酶連鎖反應(PCR)，以便合成並擴增馬來亞蝮素變異體。表1列出用以合成或確認變異體之多種引子核苷酸序列。利用限制酶切割及連接的方式，建構HSA-RD融合蛋白質。人類血清白蛋白之cDNA係購自Invitrogen，且將白蛋白之結構基因融合至Rho基因之N-端，該Rho基因之N-端具有GT限制酶切割處胺基酸序列及GGGGS重複三次的連接子胺基酸序列。

其中，引子α-factor係作為定序引子；5’-AOX1以及3’-AOX1引子係用以檢查嵌入DNA是否存在，也可作為定序引子。

聚合酶連鎖反應進行條件如下：95℃下1分鐘，55℃下1分鐘，之後72℃下1分鐘，共進行25個循環。可利用不同引子之混合物以產生多重突變部位。在2%之洋菜凝膠上分離出PCR產物，且利用溴化乙錠(EtBr)染色即可以在UV燈下目視辨別之。將所要之PCR產物純化，且之後接合至酵母菌轉移載體pPICZα A之Eco RI及Sac II限制酶切點中。利用重組質體以轉殖大腸桿菌(Escherichia coli )XL1-blue品系，且可在含有抗生素Zeocin的洋菜培養基上選出轉殖群落。選取E.coli XL1-blue群落、分離質體DNA、並藉由DNA定序來確認序列。表2列出用以合成編碼馬來亞蝮素及多種變異體之DNA的引子序列的序列編號。

實施例2

馬來亞蝮素及其變異體之蛋白質表現及純化

將Pichia EasyComp^TM Kit提供之操作流程稍作更動，以測定馬來亞蝮素及其變異體在酵母菌中之蛋白質表現。簡言之，將總計10 μg之含有編碼馬來亞蝮素或其變異體之DNA的質體純化出來，並以Sac I剪切之，使得該質體成為線狀。使用購自Invitrogen®之Pichia EasyComp^TM kit，利用熱休克法以上述線狀之構築體來轉殖酵母菌品系X33。轉形體在5’AOX1基因座形成單點交換(single crossover)而整合至該位置。利用細胞溶解酶(Sigma)將該些細胞溶解後，以PCR來分析該酵母菌整合子(integrant)是否已將Rho基因整合至酵母菌之基因體中。在洋菜培養基上選出群落，上述之洋菜培養基含有YPD(1%酵母菌抽出物，2%消化蛋白(peptone)，2%葡萄糖，及2%洋菜)以及100 μg/ml之抗生素Zeocin。利用小量表現方式從這些群落選出Rho蛋白質表現最佳之選殖株。

利用下述方法產生重組Rho及其變異體蛋白質：在30℃下利用含有100 μg/ml抗生素YPD培養基(1%酵母菌抽出物，2%消化蛋白，及2%葡萄糖)培養所選群落。48小時後，利用離心法收集細胞，並在1公升甲醇最基本培養基(含有1.34%酵母菌氮鹼含硫酸銨且不含胺基酸、以及4×10^-5 %生物素)中培養。每隔24小時加入佔總量1%之甲醇，以誘導Rho或變異體蛋白質表現，共進行2天。利用離心法收集上清液，並置於5公升水及緩衝液A(20 mM Tris，200 mM NaCl，pH 8.0)中各透析兩次。將最終溶液置入鎳-螯合管柱中，並以梯度200 mM之咪唑沖洗。進一步以HPLC(反相C18 HPLC)純化重組馬來亞蝮素及其變異體。利用三羥甲基甲甘胺酸-十二基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠(tricine-SDS-PAGE)電泳法測定純化之重組Rho，得知其純度大於95%。

接著將Rho及其變異體進行電灑質譜測定(electrospray mass spectrometry)分析，以確認分子量。表3中列出了Rho及變異體之RGD部分體的胺基酸序列。

實施例3

RD及其衍生物對流血時間的影響

測量流血時間之方法如下：利用三氯乙醛(200 mg/kg)將小鼠(ICR，雄性，平均體重23.5±1.8 g)麻醉，且利用文獻所述方法[21]稍做更動以測量流血時間。經由小鼠尾部血管靜脈注射生理食鹽水或蛋白質。注射後5分鐘，在小鼠尾部尖端造成約0.5 mm之銳利切口。立刻將尾部浸潤於注入生理食鹽水的燒杯中，保持在約37℃，並測量流血時間。

第1圖闡明RD及ARLDDL蛋白質對於小鼠尾部流血時間的影響。在靜脈施打生理食鹽水、RD、ARLDDL、馬來亞蝮素(各0.6 mg/kg)、HSA-RD(5 mg/kg)5分鐘之後，測量尾部流血時間。靜脈注射馬來亞蝮素(0.5 mg/kg)對於延長小鼠血液凝塊時間有明顯的效果。然而，RD及ARLDDL(0.5 mg/kg)對於αvβ3整合蛋白具有選擇性，相較於馬來亞蝮素，RD及ARLDDL僅會稍微影響小鼠的血液凝塊時間。實驗結果以平均值±S.E.M(n=6)表示。

實施例4

血小板凝集測定

由至少過去二週內未接受任何治療的健康捐贈者取得靜脈血液樣本並放置於3.8%檸檬酸鈉中，血液樣本與檸檬酸鈉的體積比為9：1。將血液樣本以150 x g離心10分鐘，以收集得到富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)。將剩餘血液以2000x g離心25分鐘，得到缺血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP)。將190 μl之PRP溶液以及10 μl之Rho、其變異體、或者是PBS緩衝液放置於Hema Tracer 601血小板凝集測定儀中並定溫培養於37℃下1分鐘。加入10 μl濃度為200 μM之二磷酸腺苷(ADP)誘導血小板凝集，並藉由光線透射情形來觀察血小板凝集反應。而血小板抑制定義為：抑制%=100%-(以馬來亞蝮素變異體處理之樣本的透光度/未處理樣本的透光度)×100%。最後利用計算軟体GraphPad PRISM^® (version 3.02)將不同濃度所測得的抑制%計算出IC₅₀ 。

實施例5

細胞黏貼抑制測定

利用文獻所述方法[27]進行細胞黏貼抑制測定。簡言之，使用96孔之Immulon-2微滴定盤(Costar,Corning,USA)，將100 μl含有基質蛋白質的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS，pH 7.4)塗覆於孔中，並定溫培養於4℃下經過一夜，其中上述基質蛋白質濃度為50-500 nM。上述基質及其塗覆濃度分別為纖維蛋白原(Fg)200 μg/ml、體外粘連蛋白(vitronectin,Vn)50 μg/ml、及纖維連接蛋白(fibronectin,Fn)25 μg/ml。加入200 μl熱變性之1%牛血清白蛋白(BSA,Calbiochem)，在室溫(25℃)下將所有井定溫培養1.5小時，以阻斷非專一性蛋白質結合部位。去除熱變性之BSA，並利用200μl之PBS沖洗每一井兩次。

將表現αvβ3(CHO-αvβ3)及αIIbβ3(CHO-αIIbβ3)整合蛋白之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞保持於100 μl之DMEM培養基(Dulbecco’s modified eagle medium)中。上述表現αvβ3(CHO-αvβ3)及αIIbβ3(CHO-αIIbβ3)整合蛋白之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞係由Y.Takada博士(Scripps Research Institute)慷慨提供。人類紅血球性白血病K562細胞係購自ATCC，並培養於含有5%胎牛血清之RPMI-1640培養基中。利用胰化作用(trypsinization)分離出在對數增殖期中生長的CHO及利用離心方式分離K562細胞，並分別以3 x 10⁵ 及2.5 x 10⁵ 細胞/ml的濃度進行測定。將Rho及其變異體加入培養之細胞中，並於37℃以及 5%二氧化碳下定溫培養15分鐘。利用濃度約0.001-500 μM之Rho及其變異體作為抑制劑。之後將處理過之細胞加入上述塗覆之滴定盤中，並在37℃以及5%二氧化碳下反應1小時。之後，去除定溫培養溶液，並以200 μl之PBS沖洗兩次，以移除非黏貼型細胞。利用結晶紫定量貼附之細胞。簡言之，以100 μl之10%甲醛水溶液將井固定10分鐘後乾燥。接著在室溫下將50μl之0.05%結晶紫加入井中，並放置20分鐘。之後以200 μl之蒸餾水將每一井沖洗四次並乾燥。加入150 μl之著色溶液(50%乙醇以及0.1%乙酸)進行著色。測量在600 nm下之吸收度，其測得的讀數和黏貼型細胞之數目成正相關。將抑制定義為：抑制%=100%-(以馬來亞蝮素變異體處理之樣本的OD₆₀₀ /未處理樣本的OD₆₀₀ )×100%。

實施例6

RD及其衍生物對整合蛋白αvβ3、αIIbβ3、以及α5β1之抑制效果

利用實施例5所述之細胞黏貼測定，得到RD及其衍生物對整合蛋白結合之IC₅₀ 。簡言之，將基質蛋白質例如纖維連接蛋白、體外粘連蛋白、或纖維蛋白原以固定濃度塗覆於微滴定盤上，如實施例5所述。且之後將濃度介於0.001~500 μM不等之Rho及其變異體加入表現整合蛋白之細胞中，以得到IC₅₀ 。IC₅₀ 越小，代表變異體之效力越高。

改變Rho之RGD基序對於Rho之生物活性有獨特之影響，例如：抑制整合蛋白αIIbβ3或α5β1和基質蛋白質結合之活性會下降；且對於整合蛋白αvβ3之選擇性會提高，這是因為序列改變的緣故。表4闡明Rho及其衍生物抑制細胞黏貼之IC₅₀ 。

由表4可以發現，相較於Rho，馬來亞蝮素變異體對於αIIbβ3和/或α5β1之親和力低了許多。如表4所示，例如與Rho相較之下，RD(即，PRLDMP)抑制整合蛋白αIIbβ3及α5β1之IC₅₀ 分別增加了超過104倍及10倍。更有甚者，相較於Rho，ARLDDL抑制整合蛋白αIIbβ3及α5β1之IC₅₀ 增加超過2000倍。由表5可以發現，相較於Rho，聚乙二醇化之RD及和人類白蛋白結合之RD和αIIbβ3結合之IC₅₀ 分別增加了超過113.7倍以及129.9倍。因而，由表5可得知，相較於Rho，變異體對血小板之親和力明顯降低。

實施例7

RD及其衍生物對蝕骨細胞新生作用的影響

蝕骨細胞為特化之單核細胞/巨噬細胞家族成員，其係由骨髓造血前驅物分化而來。蝕骨細胞前驅物培養株在有M-CSF(20 ng/ml)以及sRANKL(50 ng/ml)的環境下培養8天，可誘發形成具有多核之大型成熟蝕骨細胞，其特徵在於具有成熟表現型標記，例如TRAP。下文將詳述由培養之骨髓造血細胞進行蝕骨細胞新生作用之方法，以及RD及其衍生物對蝕骨細胞新生作用之影響。

表5 RD及其衍生物抑制血小板凝集、細胞黏貼、及蝕骨細胞新生作用之效果

骨髓細胞之製備方法如下。由6~8週大之SD大白鼠(Sprague-Dawley rat)取出股骨，並以a-MEM沖洗骨髓腔，上述a-MEM尚具有20 mM HEPES及10%熱去活化之FCS、2 mM麩醯胺、盤尼西林(100 U/ml)及鏈黴素(100 μg/ml)。24小時候，收集非黏貼型細胞(造血細胞)以作為蝕骨細胞前驅物。將細胞以1×10⁶ 細胞/井(0.5 ml)之量播種於24井的滴定盤中，presence of人類重組可溶性RANKL(50 ng/ml)及鼠M-CSF(20 ng/ml)。每三天更換一次培養基。在第8天，利用抗酒石酸性磷酸鹽(TRAP)來測定蝕骨細胞形成。簡言之，以10%甲醛溶於磷酸鹽緩衝生理食鹽水來固定黏貼型細胞，進行3分鐘。以乙醇/丙酮(50：50 v/v)處理1分鐘，之後風乾細胞表面，並在室溫下於醋酸鹽緩衝液(0.1 M醋酸鈉，pH 5.0)中定溫培養10分鐘，其中上述醋酸鹽緩衝液(0.1 M醋酸鈉，pH 5.0)含有0.01%萘酚AS-MX磷酸鹽(Sigma)及0.03%固紅紫LB鹽(Sigma)，尚有50 mM酒石酸鈉。計算每一井中之似蝕骨細胞之TRAP陽性細胞時，採記TRAP陽性且多核化具有超過三個核之細胞。

RD衍生物明顯地抑制蝕骨細胞之分化，而此一效果可和其對於αvβ3之抑制活性交互相關(表5)。另一方面，AKGDWN及PRGEMP對於抑制整合蛋白αvβ3及蝕骨細胞之分化效果較差(表5)。

實施例8

卵巢切除所引發之骨質疏鬆症

本實施例係採用雌性SD大白鼠(3個月大，體重約270-290 g)或ICR小鼠(4週大，體重約22-28 g)。在三氯乙醛麻醉下，將大白鼠或小鼠進行雙側卵巢切除(OVX)，而對照組大白鼠則進行假性手術(Sham)，以供比較。所有動物都處於相同的控制條件：室溫(22±1℃)；以及12小時之光暗週期。以Purina Laboratory Rodent Diet(PMI；St.Louis,MO)(0.95%鈣)餵食所有動物，飲水則為任食。每週紀錄大白鼠的體重。

實施例9

骨密度(BMD)及骨礦含量(BMC)分析

將大白鼠或小鼠斷頭，移除脛骨及股骨、並清除軟組織。以精準卡尺(±0.05 mm)測量脛骨及股骨之長度及重量，如Weinrebet al. [26]所述。利用雙能量X光吸收儀(DEX,XR-26；Norland,Fort Atkinson,WI)測定脛骨之BMD及BMC。採用適用於體型嬌小測試對象之模式。請參見，Chih-Hsinet al. ,“Enhancement of Fibronectin Fibrillogenesis and Bone Formation by Basic Fibroblast Growth Factor via Protein Kinase C-Dependent Pathway in Rat Osteoblasts,”Mol.Pharmacol：66：440-449,(2004)。持續一年每日測量腰部區域之BMD，藉以計算出變異係數為0.7%[22，23]。掃瞄整個脛骨及股骨，並以吸收儀測定其BMD及BMC。

實施例10

骨骼組織型態測量

以4%甲醛固定脛骨，且之後以12% EDTA去鈣，並在乙醇溶液及丙酮之遞增列中脫水，以及鑲嵌於石蠟中。縱向切開該列而形成切面(5 mm)，並以Mayer氏蘇木紫-伊紅染色溶液染色。利用Olympus顯微鏡拍攝生長板及脛骨近端之影像。利用影像分析軟體(Image-pro plus 3.0)測量次級骨鬆質中之骨體積，次級骨鬆質位於初級骨鬆質下方，其特徵在於具有較大軟骨桁之網絡。以抗酒石酸性磷酸鹽(TRAP)染色上述切面，以測量蝕骨細胞數目。

實施例11

生物機械三點彎曲法

在材料測試系統中(MTS-858,MTS System Inc.,Minneapolis,MN)進行三點彎曲法，以測量骨骼組織的機械特性。兩個支撐點之間的距離為20公釐，且變形速率為1 mm/min。利用Team 490軟體(version 4.10,Nicolet Instrument Technologies Inc.,Madison,WI)將載重/變形曲線輸入電腦中並進行分析。由相片測量剖面參數，並將之用以計算剖面物量力率。計算剖面物量力率時，假設該剖面為橢圓形[24]：I=π[(ab3 x(a x 2t)(b x 2t)3)/64

其中a為剖面在中側方向之寬度；b為剖面在前後向之寬度；且t為皮質平均厚度。利用影像軟體Image Pro Plus 3.0 for Windows(Media Cybernetics,Silver Spring,MD)得到上述參數。利用下列方程式計算最大應力、極限應力、以及彈性模數(楊氏模數)[25]：σ=FLc/4I

其中σ為極限應力；c為和總量中心的距離(等於上述b值的二分之一)；F為所施加之載重(N)，d為位移(mm)；且L為兩個彎曲固定之支撐點間的距離(mm)。此外，藉由分別計算應力應變曲線下方之面積，來測量極限應力中所用的能量。

實施例12

RD衍生物抑制小鼠因OVX引發之骨質流失的效果

為了確認RD衍生物對骨質流失之影響，如實施例8所述，利用卵巢切除術(OVX)在雌性小鼠體內誘發骨質疏鬆症。OVX小鼠全身表現出BMD及BMC降低的現象。以RD衍生物(I.M.,1.5 mg/kg/每兩天)或阿崙磷酸鹽(alendronate)(p.o.,1.5 mg/kg/每兩天)治療小鼠持續2週，可抑制BMD及BMC之流失(表6)。血液中膠原蛋白之碳端胜肽的濃度可反應溶骨活性。如表6所示，RD衍生物或阿崙磷酸鹽亦可抑制卵巢切除所引發之蝕骨細胞活性增加(表6)。其中某些RD衍生物比起阿崙磷酸鹽更為有效。此外，每週以RD(I.M.,1.5 mg/kg)治療一次，持續2週，亦可抑制BMD及BMC之流失(表6)。這些資料顯示，即使在較長的給藥間隔下，RD及其衍生物仍可抑制骨質疏鬆症。

實施例13

PGP及RD衍生物抑制大白鼠因OVX引發之骨質流失的效果

選用PGP(一種RD衍生物)進一步確認其對OVX所引發之骨質流失的抑制效果。如實施例8所述，將成年雌性大白鼠(3個月大)之卵巢切除，並如實施例9-11所述，在卵巢切除後6週測量骨骼體積。實驗結果顯示，PGP蛋白質可抑制卵巢切除所引發之骨骼體積減少，且可抑制蝕骨細胞數目增加。

如第2A圖所示，相較於進行假性手術之大白鼠(Sham)，卵巢切除(OVX)會造成骨小樑的大幅流失。然而，以PGP(IV,0.3 mg/kg/day或IM,1.5 mg/kg/兩天一次)治療可顯著抑制卵巢切除所引發之次級骨鬆質中的骨小樑流失。

在第2B圖中，抗酒石酸性磷酸鹽(TRAP)染色顯示蝕骨細胞主要位於骨小樑周圍，且PGP可抑制OVX所引發之蝕骨細胞形成過多現象。

在實驗末期，OVX大白鼠亦呈現出體重增加的情形。以PGP(I.V.,0.3 mg/kg/day或I.M.,1.5 mg/kg/兩天一次)治療可顯至抑制OVX所引發之體重增加。

在卵巢切除6週後，大白鼠股骨及脛骨之濕重、BMD及BMC皆降低(表7)。以PGP治療(不論是I.V.或I.M.)可抑制OVX大白鼠股骨及脛骨之濕重、BMD及BMC的減低。組織型態檢驗顯示卵巢切除會導致次級骨鬆質中骨小樑的流失(第2圖)。以PGP治療可大幅降低骨骼體積流失之情形(第2圖及表7)。此外，TRAP染色顯示蝕骨細胞住要位於骨小樑周圍，且OVX導致蝕骨細胞數目增加。長期施用PGP可中和OVX所引發之蝕骨細胞形成(第2圖及表7)。血清中膠原蛋白之碳端胜肽的濃度可反應蝕骨細胞活性。研究發現，相較於進行假性手術之對照組，OVX實驗組中蝕骨細胞數目明顯較高，然而以PGP治療可有效中和OVX所引發之蝕骨細胞活性增加(表7)。

對股骨進行三點彎曲測試，以得知骨骼之機械活動力。相較於假性手術對照組，OVX大白鼠中之最大載重、最佳載重、楊氏模數、及最佳應力皆呈現下降之情形。以PGP治療對於OVX所引發之上述骨骼強度降低，具有保護效果(表8)。這些結果顯示，似PGP蛋白質之藥物可顯著抑制卵巢切除引發之骨質流失。

實施例14

RD蛋白質後期治療可抑制OVX所引發之蝕骨細胞活化

為了確認RD衍生物對活體內蝕骨細胞活性的動態療效，將雌性大白鼠進行卵巢切除以誘發骨質疏鬆症，並在不同時間間隔中測量血液中第I型膠原蛋白之碳端胜肽濃度。與進行假性手術之大白鼠(Sham)相比較，卵巢切除(OVX)會導致蝕骨細胞活性明顯增加。測量碳端胜肽COL(1)α1鏈之血清濃度顯示，OVX大白鼠中蝕骨細胞活性增加。卵巢切除後第28天，第I型膠原蛋白之碳端胜肽由基礎值約361±25.6(n=15)增加至708±50.7 ng/ml(n=15)。

在卵巢切除後1個月，以RD或阿崙磷酸鹽進行後期治療。以RD(I.M.,1.5 mg/kg/兩天一次)或阿崙磷酸鹽(p.o.,1.5 mg/kg/兩天一次)進行後期治療，可反轉卵巢切除所引發之蝕骨細胞活性增加，且RD之效果遠高於阿崙磷酸鹽(第3圖)。當停止RD或阿崙磷酸鹽治療之後，蝕骨細胞活性便會回復。在以阿崙磷酸鹽治療之群組中，蝕骨細胞活性回復的速度遠快於以RD治療者。然而，重新施用RD 可有效抑制卵巢切除所引發之蝕骨細胞活性的增加。對RD治療有回應之蝕骨細胞數目遠低於對阿崙磷酸鹽治療者(第3圖)。這些結果顯示，RD相關蛋白質對於卵巢切除所引發之蝕骨細胞活化造成的骨質流失具有療效。

在第二個藥物治療期之後，測量大白鼠脛骨及股骨之BMD及BMC。如表9中所示，RD後期治療可有效反轉卵巢切除對骨質流失之影響。就保持骨骼體積方面觀之，RD比阿崙磷酸鹽更為有效。

實施例15

RD抑制動物退化性關節炎之軟骨細胞受損的效果

對雄性SD大白鼠的右膝進行手術，以得到退化性關節炎動物模型。手術包括前十字韌帶切斷以及部分內半月板切除術。手術後，經由肌內途徑(1.5 mg/kg/兩天一次)或局部關節注射(每週一次)投予RD蛋白質或，直到手術後第6週為止。將每一關節固定於石蠟中，切片並以0.1%番紅O及蘇木精染色。如第4B圖所示，右膝關節軟骨細胞層因關節炎而受損，而不論是以RD進行肌內注射(第4D圖)或局部施用(第4C圖)皆可抑制軟骨細胞層受損。

實施例16

RD抑制退化性關節炎大白鼠血液中細胞激素升高的效果

利用上述方式得到退化性關節炎大白鼠。手術後第6週，取得大白鼠血清以測量血液中細胞激素濃度。如第5A-5C圖所示，在退化性關節炎大白鼠中，細胞激素如c-反應性蛋白質、IL-1β及IL-6之血清濃度會增加，且以RD治療可顯著抑制退化性關節炎所引發之細胞激素升高。

實施例17

RD抑制退化性關節炎小鼠血液中細胞激素升高之效果

利用上述方式得到退化性關節炎小鼠。手術後第6週，取得小鼠血清以測量細胞激素濃度血清。如第6A-6C圖所示，在退化性關節炎小鼠中，細胞激素如c-反應性蛋白質、IL-1β及IL-6之血清濃度會增加，且以RD治療可顯著抑制退化性關節炎所引發之細胞激素升高。

數值為平均值±SD。^＊和假性對照組相比較，p<0.05§和OVX實驗組相比較，p<0.05RD採用I.M.注射(1.5/mg/kg/兩天一次)阿崙磷酸鹽採用p.o.(1.5 mg/kg/兩天一次)每一群組n=5。

實施例18

對小鼠脛骨內注射前列腺癌細胞或乳癌細胞

利用在無特定病原(SPF)條件以及22±2℃下於動物隔離箱(IVC racks)中飼育之嚴重混合性免疫缺乏(SCID)雄性小鼠或BALB/c-nu/nu雄性裸鼠，其體重約20-22 g(6週大)。在第1天分別將人類前列腺癌PC-3細胞或人類乳癌MDA-MB-231細胞(15毫升無菌PBS中有1×10⁶ 細胞)注射至SCID小鼠或裸鼠之左、右脛骨的骨髓中。在第11天，將動物隨機分為3組，並開始投予試驗藥物。RD(1.5 mg/kg)係透過肌內注射(IM)，且阿崙磷酸鹽(1.5 mg/kg)係透過皮下注射(SC)，每天給藥一次，一共給予15劑(5天給藥，休息2天，持續3週)。在實驗期間，每週觀察紀錄體重及腫瘤生長情形。1個月後犧牲小鼠，並測量小鼠後腿重量。減去對照組腿部的重量，以反映相對之腫瘤重量。此外，在實驗末期取得血液樣本，以測量紅血球細胞(RBC)、白血球細胞(WBC)及血小板之計數，以及測量第I型膠原蛋白之C碳端胜肽(CTX)及血清鈣濃度。

利用軟X光產生機(Young-kid Enterprise Co.,Ltd.,Taipei,Taiwan)拍攝放射線照片，以決定骨骼骨質溶解。以三氯乙醛一水化合物將動物深度麻醉，以面向下的姿勢放置於Kodak Scientific Imaging底片(13×18 cm)上，並曝光於45 kV之X光中5秒。利用影像分析軟體(Image-pro plus 3.0)測量骨質溶解。

實施例19

對骨骼中腫瘤生長及高血鈣症之抑制

骨骼中腫瘤細胞生長和骨骼再吸收活性相關。因此，本實驗在確認RD蛋白質對骨骼中前列腺癌細胞之腫瘤生長的影響。將PC-3細胞(1×10⁶ )局部注射至SCID小鼠雙邊脛骨骨髓腔中。在植入腫瘤細胞後，施用RD或阿崙磷酸鹽。RD(1.5 mg/kg)係透過肌內注射(IM)，且阿崙磷酸鹽(1.5 mg/kg)係透過皮下注射(SC)，每天給藥一次，一共給予15劑(5天給藥，休息2天，持續3週)。在第33天計算後腿腫脹情形，以反映腫瘤生長情形。實驗期間紀錄小鼠體重。結果顯示，RD之使用量為1.5 mg/kg時，在第33天對於腫瘤細胞所引發之後腿腫脹有明顯的抑制(43.8±4.1%，n=21-22)(第7圖)。然而，皮下注射1.5 mg/kg之阿崙磷酸鹽不會抑制後腿之腫瘤生長(第7圖)。

第8圖闡明以RD蛋白質治療之SCID小鼠中，對於腫瘤生長所引發之體重減輕的影響。未經處理的對照組小鼠在實驗後期呈現體重減輕之情形。以RD治療可防止腫瘤生長導致的體重減輕。阿崙磷酸鹽則是作為陽性對照組。

第9圖闡明RD蛋白質對於SCID小鼠中之抑制。利用軟X光產生機拍攝放射線照片，以決定骨骼骨質溶解情形。在第9A圖中，於脛骨內注射PC-3細胞後第33天拍攝照片。由脛骨近端長出了一肉眼可見的球狀腫瘤生長。以RD治療(I.M.,1.5 mg/kg/兩天一次)可抑制腫瘤生長。在第9B圖中，於第33天拍攝之放射線照片顯示癌細胞注射之脛骨中出現溶骨性病灶，以及以RD治療可抑制骨質溶解。第9C圖闡明資料之定量結果。第9D圖利用一ELISA方法，闡明RD可抑制腫瘤所引發之第I型膠原蛋白碳端胜肽之增加(其可佐證蝕骨細胞活性之增加)。第9E圖闡明RD及阿崙磷酸鹽(1.5 mg/kg/兩天一次)亦可抑制腫瘤所引發之血清中鈣濃度的增加(即高血鈣症)。^＊與對照組相比較，p<0.05。#與注射PC-3之群組相比較，p<0.05。

乳癌非常容易轉移至骨骼。第10圖闡明在裸鼠中，RD對腫瘤生長之抑制。將人類乳癌細胞MDA-MB-231(1×10⁶ )局部注射至裸鼠雙邊脛骨之骨髓腔中。在植入腫瘤細胞後第10天施用RD(I.M.,1.5 mg/kg/day)，總共治療14天。以RD(IM，1.5 mg/kg/day)治療兩週可抑制MDA-MB-231所引發之骨骼中腫瘤生長增加(第10A圖)。更有甚者，RD亦可防止腫瘤所引發之蝕骨細胞活性增加(第10B圖)及高血鈣症(第10C圖)，但不會影響RBC、WBC及血小板數目(第10D-10F圖)。^＊與對照組相比較，p<0.05。#與注射MDA-MB-231之群組相比較，p<0.05。

實施例20

RD蛋白質之聚乙二醇化

聚乙二醇化之蛋白質或與白蛋白結合之蛋白質可延長蛋白質藥物的壽命以及抗原性。為了將抗原性降到最低，同時又能延長RD蛋白質的壽命，利用如下方法製備聚乙二醇化RD蛋白質：RD蛋白質(4 mg)置於20 mM之NaCNBH₃ (pH 5)，和5 mM之PEG5K-丙醛(鄰甲基-鄰'-[2-(6-側氧己醯胺)乙基]聚乙二醇5,000)(Sigma)在4℃下反應12小時。利用反相C18 HPLC純化聚乙二醇化RD蛋白質。純化後聚乙二醇化RD蛋白質之產量大於60%。

如表6中所示，聚乙二醇化-RD可抑制蝕骨細胞之分化。此外，以聚乙二醇化-RD(I.M.,1.5 mg/kg，每週一次)治療2週可抑制BMD及BMC之流失(表6)。這些資料顯示聚乙二醇化-RD在活體內不會喪失其活性。

實施例21

MATRIGEL ^TM 基質膠塞抗血管生成測定

已知整合蛋白αvβ3和抗血管新生作用相關。因此本實施例根據文獻[32]所述稍做更動，運用MATRIGEL^TM 基質膠塞血管生成測定，以確認RD蛋白質是否可抑制血管生成。簡言之，將小劑量(500μl)之含有MATRIGEL^TM (Becton Dickinson Lab.)皮下注射到6-8週大之C57BL/6小鼠的背部區域，該MATRIGEL^TM 含有200ng/ml之VEGF。MATRIGEL^TM 會立刻形成一膠塞。每天(RD/1d)或每兩天(RD/2d或HSA-RD)肌內注射RD(3 mg/kg)，直到實驗結束。8天後，取出基質膠塞並照相(第11A圖)。利用Drabkin法以及Drabkin reagent kit 525(Sigma)測量基質膠塞之血紅素來定量新生血管，其係以基質膠塞來指示血管形成(第11B圖)。如第11A圖及第11B圖所示，利用MATRIGEL^TM 基質膠塞測定可以發現，RD蛋白質能夠有效地抑制血管生成。^＊與對照組相比較，P<0.05。

實施例22

放射性配位體結合測定：RD相關蛋白質之專一性

為了決定RD及其PGP衍生物是否可和αvβ3整合蛋白以外之其他受體結合，利用RD及其PGP衍生物分析其對於配為體為蛋白質之受體的標的專一性(由MDS Pharma services,Taipei,Taiwan測定)。

如表10所示，RD及PGP不會影響抑鈣素、內皮素ETA、內皮素ETB、胰島素、瘦脂素、鈉離子通道、轉化生長因子-ß(TGF-ß)、腫瘤壞死因子(TNF)、及血管內皮生長因子(VEGF)對其個別受體之結合活性。結果顯示，RD相關蛋白質在活體內對於標的蛋白質αvβ3展現了選擇性結合活性。

實施例23

RD抑制小鼠早熟性視網膜病變之血管生成的效果

如Wilkinson-Berkaet al. [28]所述，利用缺氧引發血管生成，以得到小鼠早熟性視網膜病變之動物模式。簡言之，將7天大的幼鼠及其母親置於含有75%氧氣及空氣的密封室中。將小鼠放置在密封室中5日(缺氧期，出生後第7至12日，或P7至P12)，且之後再將之放置於室內空氣中7日(缺氧引發之血管生成期，出生後第12至19日，或P12至P19)。在第12日經由玻璃體內投予RD(2 μg)且在第19日將小鼠犧牲。

在每隻小鼠雙眼其中之一產生三個切口、清除石蠟、以蘇木精及洋紅染色。計算內網膜中之血管側影(BVPs)，包括貼附於內膜之血管。利用照相顯微鏡(Leica)放大100倍來進行計算。

如第12A圖所示，RD蛋白質可抑制小鼠早熟性視網膜病變(ROP)之血管生成。第12B圖闡明以RD蛋白質治療，使得小鼠早熟性視網膜病變(ROP)之BVP減低。由三個蘇木精及洋紅染色之切片中，計算內網膜以及透明液腔中之血管側影(BVP)，以定量血管生成。以RD(2 μg)治療之ROP組(即，ROP+RD)與未治療之ROP組(即ROP)相較之下，前者的血管生成降低約46%。(每一ROP群組n=7；假性對照組n=2)。數值為平均值±SE。#：與假性對照組相比較，p<0.01。^＊＊：與ROP組相比較，p<0.001。

實施例24

白蛋白結合RD抑制卵巢切除所引發之骨質疏鬆症的效果

利用切除卵巢之雌性小鼠，確認與白蛋白結合之RD對骨質疏鬆症的影響。如第13A及13B圖中箭頭所示之方式施用與人類血清白蛋白結合之RD(即，RD-白蛋白)。第13A-13D圖闡明RD之相關資料，以供進行比較。分別以第I型膠原蛋白之碳端胜肽及鹼性磷酸酶(ALP)的血清濃度作為蝕骨細胞及造骨細胞活性的指標。每兩天測量一次BMD及BMC，如第13C及13D圖所示。以RD-白蛋白(15 mg/kg/週)治療可顯著降低蝕骨細胞數目，但會增加ALP 活性，然而此一活性增加是可反轉的。

蝕骨細胞為特化之家族成員，其係由骨髓造血前驅物分化而來。蝕骨細胞前驅物培養株在有M-CSF(20 ng/ml)以及sRANKL(50 ng/ml)的環境下培養8天，可誘發形成具有多核之大型成熟蝕骨細胞，其特徵在於具有成熟表現型標記，例如TRAP。下文將詳述由培養之骨髓造血細胞進行蝕骨細胞新生作用之方法，以及RD及其衍生物對蝕骨細胞新生作用之影響。

實施例25

RD抑制風濕性關節炎之效果

風濕性關節炎是一種慢性的全身性發炎疾患，其病因不詳，其特徵為侵入性的滑膜增生，會逐步造成關節受損。蝕骨細胞係由單核細胞/巨噬細胞家族衍生而來，其對於風濕性關節炎之次軟骨受損扮演關鍵性的角色。放射線攝影研究顯示，在風濕性關節炎患者中，早期會出現次軟骨骨量減少以及骨骼腐蝕之情形，且會逐漸惡化[29]。在腐蝕性關節滑膜/骨骼介面會出現骨骼再吸收蝕骨細胞[30]。新近研究也討論了蝕骨細胞在風濕性關節炎中之角色[31]。因而，由於RD相關蛋白質能夠顯著抑制蝕骨細胞功能，因此可有效用於治療風濕性關節炎。

路易斯(Lewis)大白鼠以皮內/皮下(SC)注射牛之第II型膠原蛋白(2 mg/ml於弗氏不完全佐劑中)。當大白鼠出現風濕性疾病時，將其隨機分成數組。在出現明顯可見關節炎症狀的第一天開始治療，例如踝關節腫脹時。當測量爪體積之後，犧牲大白鼠，並取得踝及膝關節以供觀察組織病理上之改變。

第14A-D圖分別以SEQ ID NO：1、以及57-69闡明Rho及其變異體之胺基酸序列。第15A-C圖闡明馬來亞蝮素變異體之核苷酸序列，SEQ ID NO：43-56。第16A-H圖闡明去整合蛋白變異體之胺基酸及核苷酸序列，SEQ ID NO：78-135。

上文提出本發明之示範性具體實施例，以用於闡明並描述本發明，而非窮舉本發明之形式或將本發明之範圍限定為所述實施例。雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技術者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

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為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：

第1圖闡明相較於馬來亞蝮素蛋白質，RD及HSA-RD及ARLDDL對小鼠流血時間的影響較小。

第2A圖為骨小樑之照片，闡明在以PGP蛋白質治療之大白鼠中，對於卵巢切除所引發之骨小樑骨質流失的抑制。橫條代表1 mm。

第2B圖為以抗酒石酸性磷酸鹽(TRAP)染色之骨小樑的照片，闡明以PGP蛋白質治療之大白鼠中，對於卵巢切除所引發之蝕骨細胞數目增加的抑制。橫條代表100 mm。

第3圖闡明以RD蛋白質或阿崙磷酸鹽(藥物治療)治療之大白鼠中，對於卵巢切除所引發之蝕骨細胞活化的抑制、停藥期間之蝕骨細胞標記濃度回升、以及重新投予RD或阿崙磷酸鹽後對於卵巢切除所引發之蝕骨細胞活性提升之反轉。

第4A-4D圖為以番紅O及蘇木紫染色之膝關節的照片，闡明以RD蛋白質治療之大白鼠中，對於關節炎部位軟骨細胞層破壞之抑制。箭號表示軟骨細胞層。

第5A-5C圖闡明以RD蛋白質治療之大白鼠中，對於退化性關節炎部位中血液中細胞激素升高之抑制。

第6A-6C圖闡明以RD蛋白質治療之小鼠中，對於退化性關節炎部位中血液中細胞激素升高之抑制。

第7圖闡明以RD蛋白質治療且未以阿崙磷酸鹽治療之小鼠中，對於SCID中PC-3骨瘤生長之抑制。

第8圖闡明以RD蛋白質治療之SCID小鼠中，對於腫瘤生長所引發之體重減輕的抑制。

第9A圖為照片，闡明以RD蛋白質治療之小鼠中，在脛骨內注射PC-3細胞後在每一條腿的脛骨近端中出現了肉眼可見的球狀腫瘤生長(中間圖式中箭頭所示)以及對於SCID中骨瘤生長之抑制。

第9B圖為脛骨之放射線照片，闡明以RD蛋白質治療之小鼠中，對於SCID中PC-3腫瘤細胞所引發之溶骨性骨病灶之抑制。

第9C圖為第9B圖之資料的定量分析，闡明以RD蛋白質治療之小鼠中，對於SCID中PC-3腫瘤細胞所引發之骨質溶解的抑制。

第9D圖闡明以RD蛋白質治療之小鼠中，對於SCID中PC-3腫瘤所引發之第I型膠原蛋白之碳端胜肽增加的抑制。

第9E圖闡明以RD蛋白質或阿崙磷酸鹽治療之小鼠中，對於SCID中PC-3腫瘤所引發之血清鈣濃度增加的抑制。

第10A圖闡明以RD蛋白質治療之裸鼠中，對於MDA-MB-231骨瘤生長的抑制。

第10B圖闡明以RD蛋白質治療之裸鼠中，對於MDA-MB-231骨瘤所引發之第I型膠原蛋白之碳端胜肽增加的抑制。

第10C圖闡明以RD蛋白質治療之裸鼠中，對於MDA-MB-231骨瘤所引發之高血鈣症的抑制。

第10D圖闡明在注射MDA-MB-231細胞並以RD蛋白質治療之裸鼠中白血球細胞數目並未改變。

第10E圖闡明在注射MDA-MB-231細胞並以RD蛋白質治療之裸鼠中紅血球細胞數目並未改變。

第10F圖闡明在注射MDA-MB-231細胞並以RD蛋白質治療之裸鼠中血小板數目並未改變。

第11A圖為照片，闡明相較於未治療之對照組小鼠，以RD或HSA-RD蛋白質治療之C57BL/6小鼠在MATRIGEL^TM 基質膠塞中的血管密度較低。

第11B圖闡明相較於未治療之對照組小鼠，以RD(每日治療：RD/1d；或每隔一日治療：RD/2d)或HSA-RD(-每隔一日：HSA-RD/2d)蛋白質治療之C57BL/6小鼠在MATRIGEL^TM 基質膠塞中血紅素含量較低。

第12A圖為照片，闡明小鼠模式中，早熟性視網膜病變中之血管生成(ROP)；以及以RD蛋白質治療之早熟性視網膜病變小鼠(ROP+RD)可抑制血管生成。箭號表示血管側影(BVP)。

第12B圖闡明小鼠模式中，以RD蛋白質治療之早熟性視網膜病變小鼠(ROP+RD)的BVP較少。

第13A圖闡明以RD或RD-白蛋白蛋白質治療之小鼠中，對於卵巢切除所引發之蝕骨細胞活化之抑制。

第13B圖闡明以RD或RD-白蛋白蛋白質治療之小鼠中，對於卵巢切除所引發之鹼性磷酸酶(ALP)不活化之抑制。

第13C圖闡明對於卵巢切除所引發之骨密度減低之抑制。

第13D圖闡明對於卵巢切除所引發之骨礦含量減低之抑制。

第14A-D圖闡明馬來亞蝮素變異體之胺基酸序列SEQ ID NO：1，以及SEQ ID NO：57-69。

第15A-C圖闡明馬來亞蝮素變異體之核苷酸序列SEQ ID NO：43-56。

第16A-H圖闡明去整合蛋白變異體之胺基酸序列及核苷酸序列SEQ ID NO：78-135。

Claims

一種用於治療和/或預防與αvβ3整合蛋白相關疾病的醫藥組成物，包含一單離多胜肽、或其藥學上可接受的一鹽類，以及一種藥學上可接受的載體，其中該單離多胜肽包含對αvβ3整合蛋白具專一性之一去整合蛋白變異體，該去整合蛋白變異體包含SEQ ID NO：29之一變異體，該去整合蛋白變異體包含在SEQ ID NO：29之第3個位置與第6個位置同時各出現一個胺基酸取代，以及選擇性在第1個位置及第5個位置出現至少一個胺基酸取代，且當該第3個位置取代為Leu、Ile及His時，該第5個位置只取代為Asp及Met。
如請求項1所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白為選自由下列物質組成之群組之任一者的一變異體：馬來亞蝮素(rhodostomin)、白唇竹葉青蛇素(albolabrin)、百步蛇素(applagin)、墨西哥西海岸響尾蛇素(basilicin)、矛頭蝮素(batroxostatin)、鼓腹巨蛇素(bitistatin)、西部亞種響尾蛇素(cereberin)、角響尾蛇素(cerastin)、西部菱背響尾蛇素(crotatroxin)、南美響尾蛇素(duressin)、麗紋龜殼花蛇素(elegantin)、黃綠龜殼花蛇素(flavoredin)、黃綠龜殼花蛇毒解離素(flavostatin)、日本蝮蛇素(halysin)、西伯利亞蝮蛇毒解離素(halystatin)、巴西蝮素(jararacin)、巴西蝮蛇毒解離素(jarastatin)、馬來亞紅口蝮素(kistrin)、亞馬遜巨蝮素(lachesin)、西部亞種響尾蛇素(lutosin)、黑尾響尾蛇素(molossin)、韓國亞種短尾蝮素(salmosin)、白眉蝮素(saxatilin)、北美侏儒響尾蛇素(tergeminin)、黃綠龜殼花蛇毒解離素(trimestatin)、台灣龜殼花素(trimucrin)、台灣龜殼花去整合蛋白(trimutase)、烏蘇里蝮素(ussuristatin)、或草原響尾蛇素(viridin)。
如請求項1所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含馬來亞蝮素之一變異體。
如請求項1所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之一變異體。
如請求項1所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含選自SEQ ID NO：36-40之一胺基酸序列。
如請求項4所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白包含選自SEQ ID NO：63-67之一胺基酸序列。
如請求項1所述之醫藥組成物，其中該單離多胜肽經聚乙二醇化或和白蛋白結合。
如請求項1所述之醫藥組成物，其中該與αvβ3整合蛋白相關疾病為骨質疏鬆症、骨腫瘤或骨癌生長及相關症狀、與血管生成相關之腫瘤生長及癌細胞轉移、骨骼中之腫癌轉移、惡性腫瘤引起之高血鈣症、與血管生成相關之眼部疾病、派傑氏症、風濕性關節炎、或退化性關節炎。
如請求項8所述之醫藥組成物，其中該與血管生成相關之眼部疾病為老年性黃斑病變、糖尿病視網膜病變、角膜神經血管增生病變、局部缺血導致之神經血管增生視網膜病變、高度近視、或早熟性視網膜病變。
如請求項8所述之醫藥組成物，其中該與αvβ3整合蛋白相關之疾病包含骨質疏鬆症。
如請求項10所述之醫藥組成物，其中該骨質疏鬆症可能和選自下列群組中的病理情形相關：更年期後的雌激素缺乏、次級骨質疏鬆症、卵巢切除、派傑氏症、骨癌、骨瘤、退化性關節炎、蝕骨細胞形成過多、及蝕骨細胞活性增加。
如請求項10所述之醫藥組成物，其中該骨質疏鬆症包含更年期後之骨質疏鬆症或骨質流失。
如請求項1所述之醫藥組成物，其中該疾病為一人類疾病。
一種用於治療和/或預防因卵巢切除所引發之生理改變之醫藥組成物，包含一單離多胜肽、或其藥學上可接受的一鹽類，以及一種藥學上可接受的載體，其中該單離多胜肽包含對αvβ3整合蛋白具專一性之一去整合蛋白變異體，該去整合蛋白變異體包含SEQ ID NO：29之一變異體，該去整合蛋白變異體包含在SEQ ID NO：29之第3個位置與第6個位置同時各出現一個胺基酸取代，以及選擇性在第1個位置及第5個位置出現至少一個胺基酸取代，且當該第3個位置取代為Leu、Ile及His時，該第5個位置只取代為Asp及Met。
如請求項14所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白為選自由下列物質組成之群組之任一者的一變異體：馬來亞蝮素、白唇竹葉青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸響尾蛇素、矛頭蝮素、鼓腹巨蛇素、西部亞種響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、麗紋龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、日本蝮素、西伯利亞蝮蛇毒解離素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解離素、，馬來亞紅口蝮素、亞馬遜巨蝮素、西部亞種響尾蛇蛇素、黑尾響尾蛇素、韓國亞種短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、台灣龜殼花素、台灣龜殼花去整合蛋白、烏蘇里蝮素、或草原響尾蛇素。
如請求項14所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含馬來亞蝮素之一變異體。
如請求項14所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之一變異體。
如請求項14所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含選自SEQ ID NO：36-40之一胺基酸序列。
如請求項14所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含選自SEQ ID NO：63-67之一胺基酸序列。
如請求項14所述之醫藥組成物，其中該單離多胜肽經聚乙二醇化或和白蛋白結合。
如請求項14所述之醫藥組成物，其中該生理改變為一人類生理改變。
一種抑制和/或預防骨骼中腫瘤細胞生長及其相關症狀之醫藥組成物，包含一單離多胜肽、或其藥學上可接受的一鹽類，以及一種藥學上可接受的載體，其中該單離多胜肽包含對αvβ3整合蛋白具專一性之一去整合蛋白變異體，該去整合蛋白變異體包含SEQ ID NO：29之一變異體，該去整合蛋白變異體包含在SEQ ID NO：29之第3個位置與第6個位置同時各出現一個胺基酸取代，以及選擇性在第1個位置及第5個位置出現至少一個胺基酸取代，且當該第3個位置取代為Leu、Ile及His時，該第5個位置只取代為Asp及Met。
如請求項22所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白為選自由下列物質組成之群組之任一者的一變異體：馬來亞蝮素、白唇竹葉青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸響尾蛇素、矛頭蝮素、鼓腹巨蛇素、西部亞種響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、麗紋龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、日本蝮蛇素、西伯利亞蝮蛇毒解離素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解離素、馬來亞紅口蝮素、亞馬遜巨蝮素、西部亞種響尾蛇蛇素、黑尾響尾蛇素、韓國亞種短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、台灣龜殼花素、台灣龜殼花去整合蛋白、烏蘇里蝮素、或草原響尾蛇素。
如請求項23所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含一馬來亞蝮素之變異體。
如請求項22所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之一變異體。
如請求項22所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含選自SEQ ID NO：36-40之一胺基酸序列。
如請求項25所述之醫藥組成物，其中該去整合蛋白變異體包含選自SEQ ID NO：63-67之一胺基酸序列。
如請求項22所述之醫藥組成物，其中該單離多胜肽經聚乙二醇化或和白蛋白結合。
如請求項22所述之醫藥組成物，其中該症狀包含選自下列群組之一病理症狀：蝕骨細胞活性增加、骨骼再吸收增加、骨病灶、高血鈣症、體重減輕、及任何與前述相關之情形。
如請求項22所述之醫藥組成物，其中該骨骼中腫瘤細胞生長包含骨癌細胞、及原發於前列腺癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌、腎癌、卵巢癌、胰臟癌、及骨髓瘤癌之一或更多者的轉移性癌細胞。
如請求項22所述之醫藥組成物，其中該症狀為一人類症狀。
一種對αvβ3整合蛋白具專一性之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為一去整合蛋白之一變異體，該去整合蛋白之該變異體包含SEQ ID NO：29之一變異體，該去整合蛋白之該變異體包含在SEQ ID NO：29之第3個位置與第6個位置同時各出現一個胺基酸取代，以及選擇性在第1個位置及第5個位置出現至少一個胺基酸取代，且當該第3 個位置取代為Leu、Ile及His時，該第5個位置只取代為Asp及Met。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中該去整合蛋白為選自由下列物質組成之群組之任一者的一變異體：馬來亞蝮素、白唇竹葉青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸響尾蛇素、矛頭蝮素、鼓腹巨蛇素、西部亞種響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、麗紋龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、日本蝮蛇素、西伯利亞蝮蛇毒解離素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解離素、馬來亞紅口蝮素、亞馬遜巨蝮素、西部亞種響尾蛇蛇素、黑尾響尾蛇素、韓國亞種短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、台灣龜殼花素、台灣龜殼花去整合蛋白、烏蘇里蝮素、或草原響尾蛇素。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中該去整合蛋白包含馬來亞蝮素之一變異體。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中該去整合蛋白變異體包含選自SEQ ID NO：36-40之一胺基酸序列。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中該第3個位置的胺基酸取代包含選自為Lau、Ile及His；以及選擇性取代在第1個位置為Ala，第5個位置為Asp、Met及Asn，第6個位置為Val、Leu及Met。
如請求項36所述之單離多胜肽，其中該胺基酸取代係選自在第1個位置取代為Ala；以及在第6個位置取代為Val、Leu、及Met。
如請求項36所述之單離多胜肽，其中該胺基酸取代出現於第3、5及6個位置。
如請求項36所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽包含在選自SEQ ID NO：29之第1、3、5及6個位置出現四種胺基酸取代。
如請求項39所述之單離多胜肽，其中該胺基酸取代係選自在第1個位置取代為Ala；以及在第6個位置取代為Val、Leu、及Met。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽由一聚核苷酸編碼，該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：50-54之一核苷酸序列。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中相較於馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3和/或α 5β 1之親和力降低至少約5、50、或100倍。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中相較於馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3和/或α 5β 1之親和力降低至少約200倍。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中相較於馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3和/或α 5β 1之親和力降低至少約1000、或2000倍。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中相較於馬來亞蝮素，該單離多胜肽對血小板之親和力降低至少約5、50、100、1000、或2000倍。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中相較於馬來亞蝮素，該單離多胜肽對於延長血液凝結時間之活性降低。
如請求項32所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽經聚乙二醇化或和白蛋白結合。
一種醫藥組合物，包含如請求項32之單離多胜肽以及一種藥學上可接受的載體。
一種醫藥組合物，包含如請求項39之單離多胜肽以及一種藥學上可接受的載體。
一種醫藥組合物，包含如請求項41之單離多胜肽以及一種藥學上可接受的載體。
如請求項48所述之醫藥組合物，其中該單離多胜肽經聚乙二醇化或和白蛋白結合。
一種單離多胜肽，包含選自SEQ ID NO：63-67之一胺基酸序列。
一種製備如請求項32所述之單離多胜肽的方法，該方法包含：(a)以核苷酸編碼該單離多胜肽之一聚核苷轉染至一宿主細胞；(b)在一培養基中培養該宿主細胞；以及(c)分離該單離多胜肽。
如請求項53所述之方法，其中步驟(b)更包含在該培養基中加入甲醇。
如請求項53所述之方法，更包含在一無胺基酸培養基中培養該宿主細胞。
如請求項53所述之方法，其中步驟(c)更包含進行一管柱層析以得到該單離多胜肽。
如請求項53所述之方法，更包含進行一HPLC以得到該單離多胜肽。
如請求項53所述之方法，其中該宿主細胞為一酵母菌細胞。
一種單離聚核苷酸，可編碼對αvβ3整合蛋白具選擇性之一單離多胜肽，其中該單離多胜肽為一去整合蛋白之一變異體，該去整合蛋白之該變異體包含SEQ ID NO：29之一變異體，該去整合蛋白之該變異體包含在SEQ ID NO：29之第3個位置與第6個位置同時各出現一個胺基酸取代，以及選擇性在第1個位置及第5個位置出現至少一個胺基酸取代，且當該第3個位置取代為Leu、Ile及His時，該第5個位置只取代為Asp及Met。
如請求項59所述之單離聚核苷酸，其中該去整合蛋白為選自由下列物質組成之群組之任一者的一變異體：馬來亞蝮素、白唇竹葉青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸響尾蛇素、矛頭蝮素、鼓腹巨蛇素、西部亞種響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、麗紋龜殼花素、黃綠龜殼花蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、日本蝮蛇素、西伯利亞蝮蛇毒解離素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解離素、馬來亞紅口蝮素、亞馬遜巨蝮素、西部亞種響尾蛇素、黑尾響尾蛇素、韓國亞種短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒響尾蛇素、黃綠龜殼花蛇毒解離素、台灣龜殼花素、台灣龜殼花去整合蛋白、烏蘇里蝮素、或草原響尾蛇素。
如請求項59所述之單離聚核苷酸，其中該去整合蛋白包含一馬來亞蝮素之變異體。
如請求項59所述之單離聚核苷酸，其中該去整合蛋白變異體包含選自SEQ ID NO：36-40之一胺基酸序列。
如請求項59所述之單離聚核苷酸，其中該單離多胜肽包含在選自SEQ ID NO：1之第48、50、52及53個位置出現至少三種胺基酸取代。
如請求項63所述之單離聚核苷酸，其中該胺基酸取代係選自在第48個位置取代為Ala；以及在第53個位置取代為Val、Leu、及Met。
如請求項63所述之單離聚核苷酸，其中該胺基酸取代出現於第50、52及53個位置。
如請求項59所述之單離聚核苷酸，其中該單離多胜肽包含在選自SEQ ID NO：1之第48、50、52及53個位置出現四種胺基酸取代。
如請求項66所述之單離聚核苷酸，其中該胺基酸取代係選自在第48個位置取代為Ala；以及在第53個位置取代為Val、Leu、及Met。
如請求項59所述之單離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：50-54及78-135之一序列。
一單離聚核苷酸可編碼對αvβ3整合蛋白具專一性之一單離多胜肽，其中該單離多胜肽為一去整合蛋白之一變異體，且其中該聚核苷酸可編碼如請求項36所述之單離多胜肽。
一單離聚核苷酸可編碼對αvβ3整合蛋白具專一性之一單離多胜肽，其中該單離多胜肽為一去整合蛋白之一變異體，且其中該聚核苷酸可編碼如請求項39所述之單離多胜肽。
一單離聚核苷酸可編碼對αvβ3整合蛋白具專一性之一單離多胜肽，其中該單離多胜肽為一去整合蛋白之一變異體，且其中該聚核苷酸可編碼如請求項41所述之單離多胜肽。
一種包含SEQ ID NO：36之一單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類。
一種包含SEQ ID NO：37之一單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類。
一種包含SEQ ID NO：38之一單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類。
一種包含SEQ ID NO：39之一單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類。
一種包含SEQ ID NO：40之一單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類。
一種包含SEQ ID NO：63之一單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類。
一種包含SEQ ID NO：64之一單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類。
一種包含SEQ ID NO：65之一單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類。
一種包含SEQ ID NO：66之一單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類。
一種包含SEQ ID NO：67之一單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類。
一種單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類，其中該單離多胜肽由一聚核苷酸編碼，且該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：50之一核苷酸序列。
一種單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類，其中該單離多胜肽由一聚核苷酸編碼，且該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：51之一核苷酸序列。
一種單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類，其中該單離多胜肽由一聚核苷酸編碼，且該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：52之一核苷酸序列。
一種單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類，其中該單離多胜肽由一聚核苷酸編碼，且該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：53之一核苷酸序列。
一種單離多胜肽或其藥學上可接受的一鹽類，其中該單離多胜肽由一聚核苷酸編碼，且該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：54之一核苷酸序列。
如請求項72所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項73所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項74所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項75所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項76所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項77所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項78所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項79所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項80所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項81所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項82所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項83所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項84所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項85所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項86所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α IIbβ 3之親和力降低至少約2000倍。
如請求項72所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項73所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項74所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項75所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項76所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項77所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項78所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項79所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項80所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項81所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項82所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項83所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項84所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項85所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項86所述之單離多胜肽，其中相較於野生型馬來亞蝮素，該單離多胜肽對α 5β 1之親和力降低至少約90倍。
如請求項72所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項73所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項74所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項75所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項76所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項77所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項78所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項79所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項80所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項81所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項82所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項83所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項84所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項85所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。
如請求項86所述之單離多胜肽，其中該單離多胜肽為與白蛋白結合或經過聚乙二醇化。