JP2022536972A - （ナノ）ダイヤモンド粒子を含む組成物および物品 - Google Patents

Abstract

【要約】概略、ナノダイヤモンドベースの医薬組成物のような、ダイヤモンド粒子を含む組成物および物品が提供される。いくつかの実施形態において、（ナノ）ダイヤモンド粒子を含む物品および方法は、例えば、対象における疾患のモニターおよび／または治療に有用である。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
この出願は、35U.S.C第119（e）項の下、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、2019年6月18日に出願され、「ナノダイヤモンド粒子を含む組成物および物品」と題された米国仮出願第62/862,802号に対して優先権を主張する。

技術分野
概略、ナノダイヤモンドベースの医薬組成物などのダイヤモンド粒子を含む組成物および物品が提供される。

背景
新規の診断および治療目的でのナノ材料の使用は、物理的材料と組み合わせた生物学的および製薬的実体の生物工学に基づいた、急速に進歩している科学分野である。しかしながら、改善された記事と方法が必要である。

対象への治療薬の投与および／または対象内の疾患の進行をモニターするための、ダイヤモンド粒子および関連するデバイスおよび方法、例えば、ナノダイヤモンド粒子（例えば、蛍光ナノダイヤモンド粒子）
本発明の主題は、場合によっては、相互に関連する製品、特定の課題に対する代替の解決策、および／または１以上のシステムおよび／または物品の複数の異なる使用を含む。

一態様では、物品（例えば、対象と共に使用するための治療薬の投与用に構成された）が提供される。いくつかの実施形態では、物品は、複数の蛍光ダイヤモンド粒子と、蛍光ダイヤモンド粒子の少なくとも一部に結合した治療薬とを含み、物品は、対象の器官の内部に長期間滞留するように構成される。

いくつかの実施形態では、物品は、組成物を対象に投与するように構成された注射成分と、組成物を含む注射成分に関連するリザーバーとを含み、組成物は、複数の蛍光ダイヤモンド粒子を含む。

別の態様では、医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈内担体流体および静脈内担体流体中に懸濁された複数の蛍光ダイヤモンド粒子を含む。

さらに別の態様では、方法（例えば、疾患を治療する方法、疾患を有すると疑われる対象における疾患の進行をモニターする方法）が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、複数のダイヤモンド粒子およびダイヤモンド粒子の少なくとも一部に結合した治療薬を対象に静脈内投与することを含み、前記複数のダイヤモンド粒子は、対象の臓器の内部に長期間滞留するように構成されている。

いくつかの実施形態では、この方法は、対象に複数のダイヤモンド粒子を投与し、投与のステップ後、複数のダイヤモンド粒子を含有すると疑われる対象の内部の位置の第１の画像を取得し、所定の期間後、複数のダイヤモンド粒子を含有すると疑われる対象の内部の位置の第２の画像を取得し、次いで、複数のダイヤモンド粒子に対する第１の画像と第２の画像との間の対象の内部の位置の形態学的変化を測定することを含み、ここで、形態学的変化は、疾患の進行に関連している。

いくつかの実施形態では、肝疾患および／または肝ガンの治療のための薬剤の製造における複数の蛍光ダイヤモンド粒子の使用が提供される。いくつかの実施形態では、疾患の進行をモニターするための薬剤の製造における複数の蛍光ダイヤモンド粒子の使用が提供される。

本発明の他の利点および新規の特徴は、添付の図と併せて検討した場合、本発明の様々な非限定的な実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本明細書および参照により組み込まれる文書に矛盾するおよび／または一貫性のない開示が含まれる場合、本明細書が優先するものとする。

図面の簡単な説明
本発明の非限定的な実施形態は、例示として、概略的であり、縮尺通りに描かれることを意図されていない添付の図を参照して説明される。図面では、図示されている同一またはほぼ同一の構成要素の各々は、通常、単一の数字で表されている。明確にするために、すべての構成要素がすべての図でラベル付けされているわけではなく、また、当業者が本発明を理解できるようにするために図解が必要でない場合、本発明の各実施形態のすべての構成要素が示されているわけではない。
図１Ａは、一組の実施形態による、蛍光ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの概略図である。 図１Ｂは、一組の実施形態による、細胞へのＦＮＤＰ－（ＮＶ）取り込みの定量化に使用される方法の概略図である。 図２Ａ～２Ｂは、一組の実施形態による、ＦＮＤＰ-（ＮＶ）～７００／８００ｎｍ（ＦＮＤＰ-（ＮＶ））で処理されたまたはされていないラットから得られた肝臓のパラフィン切片（５μｍ）の蛍光顕微鏡画像を示す。図２Ａには、１．６倍の伸びを有する１０倍の対物レンズで分析された組織切片の画像が示される。図２Ｂでは、オイル40x対物レンズで分析された組織切片の画像が示され、左側の画像は、灰色の異なる色合いで示された、赤（FNDP-（NV））、青（DAPI-核）、緑（ファロイジン-細胞骨格）の3色の重なりを示す。一方、右の図は、灰色の異なる色合いで示された、赤（FNDP-（NV））、青（DAPI-核）の2色の重なりを示し、各パネルの上の画像はFNDP-（NV）で処理されたラットを表し、下の画像は各パネルコントロール（PBS処理ラット）を表し、粒子が占める領域は、いくつかの実施形態によれば、白い矢印で示されている。 図２Ａ～２Ｂは、一組の実施形態による、ＦＮＤＰ-（ＮＶ）～７００／８００ｎｍ（ＦＮＤＰ-（ＮＶ））で処理されたまたはされていないラットから得られた肝臓のパラフィン切片（５μｍ）の蛍光顕微鏡画像を示す。図２Ａには、１．６倍の伸びを有する１０倍の対物レンズで分析された組織切片の画像が示される。図２Ｂでは、オイル40x対物レンズで分析された組織切片の画像が示され、左側の画像は、灰色の異なる色合いで示された、赤（FNDP-（NV））、青（DAPI-核）、緑（ファロイジン-細胞骨格）の3色の重なりを示す。一方、右の図は、灰色の異なる色合いで示された、赤（FNDP-（NV））、青（DAPI-核）の2色の重なりを示し、各パネルの上の画像はFNDP-（NV）で処理されたラットを表し、下の画像は各パネルコントロール（PBS処理ラット）を表し、粒子が占める領域は、いくつかの実施形態によれば、白い矢印で示されている。 図３Ａ～３Ｈは、一組の実施形態による、肝葉の「パノラマ」画像が粒子分布の小葉内不均一性を実証することを示す。図３Ａおよび（図３Ｂは、２匹の動物からの代表的な肝小葉からの矢状断面の全パノラマビューを示し、これらの図は、緑のチャネル（灰色の陰影で表示）および赤（灰色で表示）チャネルで画像化されたFNDP-（NV）の存在で画像化されたファロイジン染色切片（５μｍ）を用いてＦＳＸ１００顕微鏡を使用して４倍画像を「ステッチ」することによって構築され；画像内の粒子は、非常に低い解像度で視覚化するためのしきい値と繰り返しの拡張によって拡大され；図面では六角形が重なって肝小葉の例を示し、金で示された領域は他のパネルで拡大され、（図3C）は「六角形」小葉フォーマットの境界での優先的な粒子分布を実証する4つの肝小葉を示し、（図３Ｄ）は優先的なFNDP-（NV）沈着を示す単一の肝小葉の10倍の画像を示し；大きなFNDP-（NV）凝集体が、破線の六角形で示される肝小葉と不均一に分布しているのが見られ（図３Ｅ）、（図３Ｆ）は、閾値処理および拡張後の単一肝小葉の１０倍の画像を提示して、非常に小さな凝集体の視認性を改善し、帯状沈着を実証し、（図３Ｇ）、（図３Ｈ）は、金の破線の四角で示されるパネル（図３Ａ）からの血管系の領域の拡大画像を提供し、（図３Ｉ）は、いくつかの実施形態によると、様々な代謝ゾーンを区切る肝小葉の概略図として提供する。 図４Ａ～４Ｂは、肝小葉におけるＦＮＤＰ-（ＮＶ）凝集体のサイズ分布の数学的プロットを示し；２匹の動物からの1つの完全な肝小葉の図は、FSX１００顕微鏡の10倍の画像からステッチされ；最大エントロピー基準を使用して、ImageJでステッチされた数字を閾値設定し、結果として検出されたFNDP-（NV）アセンブリのサイズとカウントを行った；（図４Ａ）FNDP-（NV）アセンブリサイズの分布。（図４Ｂ）いくつかの実施形態による、各アセンブリの面積によって推定される総粒子質量の分布。 図５Ａ～５Ｄは、一組の実施形態による、ＦＮＤＰ-（ＮＶ）で処理されたラットから得られた肝臓切片（５０μｍ）のレーザー走査型共焦点顕微鏡画像を示す。（図５Ａ）取り込まれた粒子を伴う黄色の円内に示された細胞を伴う肝臓の実質領域。写真の下部と右側の挿入図は、黄色い線に沿って実行された画像の垂直投影を表す。黄色の矢印は粒子の位置を示す。（図５Ｂ）黄色の円が肝類洞/静脈内の粒子の凝集体を示唆する肝臓の実質領域。下部と右側の挿入図は、黄色の線に沿って実行された画像の垂直投影を表す。黄色の矢印は、正弦波／細静脈に局在する粒子を示す。（図５Ｃ）白い円の粒子が粒子の内皮下および外膜の位置を示唆する、肝小葉の豊富に血管新生されたセグメントの領域。おそらく内在化された粒子を有する実質細胞は、黄色の円で示されている。下部と右側の挿入図は、黄色の線に沿って実行された画像の垂直投影を表す。黄色の矢印は、実質細胞に内在化した粒子を示す。（図５Ｄ）白い円が外膜細胞要素に関連する粒子を示す肝臓門の領域。下部と右側の挿入図は、黄色の線に沿って実行された画像の垂直投影を表す。黄色の矢印は、血管細胞に内在化した粒子を示す。 図６は、一組の実施形態による、異なる量のＦＮＤＰ－（ＮＶ）が組み込まれた肝細胞の共焦点３Ｄ再構成を示す。DAPI（青）とファロイジン（緑）で染色され、ナノダイヤモンド（赤）が組み込まれた５０μｍの切片からの共焦点画像スタックが、Fluoview F１０００共焦点顕微鏡で撮影され、ImageJのボリュームビューアーを使用して再構成された これらの細胞内の粒子の包含（黄色の矢印で示されている）には、細胞内に内部化された疎および密のFNDP-（NV）コレクションの両方が含まれる。左のパネルは車両制御を表す。中央のパネルは低負荷粒子を表し、右パネルは2つの別々の細胞の高負荷粒子を表す。 図７Ａ～７Ｄは、一組の実施形態による、経時的なＨｅｐＧ-２およびＨＵＶＥＣ細胞への異なる濃度のＦＮＤＰ-（ＮＶ）の内在化に関連するプロットを示す。（図７Ａ）、（図７Ｂ）、（図７Ｃ）は、様々な濃度のＦＮＤＰ-（ＮＶ）に曝露されたＨｅｐＧ-２細胞およびＨＵＶＥＣによるＦＮＤＰの用量および時間依存性取り込みを示す。指数曲線は、粒子の3つの用量すべて（高用量０．１ｍｇ／ｍＬ;中用量0.05 ｍｇ／ｍＬ、低用量０．０２５ｍｇ／ｍＬ）に適合した。（図７Ｄ）様々な濃度のＦＮＤＰに曝露されたＨｅｐＧ-２細胞およびＨＵＶＥＣによる２０時間後のＦＮＤＰの総取り込み。すべてのパネルのエラーバーは、４倍のサンプルのSDを表す。（＊）両側スチューデントテストによる０．０２５ｍｇ／ｍＬとの対比でＰ＜０．００１; （＋）両側スチューデントテストによる０．０５ｍｇ／ｍＬとの対比でＰ＜０．００１である。 図８Ａ～８Ｂは、一組の実施形態による、ＦＮＤＰ-（ＮＶ）との２時間および２０時間のインキュベーション後に得られたＨｅｐＧ-２細胞およびＨＵＶＥＣの蛍光顕微鏡像を示す。FNDP-（NV）への2時間または20時間の曝露後に160倍および400倍の倍率を使用した蛍光顕微鏡分析から得られたHepG-2細胞（図8A）およびHUVEC（図8B）の画像。160倍の倍率の画像は、重なり合った3色の蛍光（緑- FITC-ファロイジン、赤-FNDP-（NV）、青-DAPI）で表示され、４００倍の倍率の画像は、重なり合った3色の蛍光（緑、赤、青）（左のパネル）、および2色の蛍光（赤と青）（右のパネル）で表示される。白い矢印は、粒子遷移の細胞質相の例を示す。灰色の矢印は、多数の粒子の核周囲の集合を示す。 図９は、一組の実施形態による、ＦＮＤＰ-（ＮＶ）の存在下でのＨＵＶＥＣ分裂の様々な段階を示す代表的な画像を示す。HUVECを０．０５ｍｇ／ｍＬのFNDP-（NV）で20時間処理した。４００倍または６４０倍の倍率の画像は、重なり合った3色の蛍光（緑- FITC-ファロイジン、赤- FNDP-（NV）、青- DAPI）で表示される。記載されているさまざまなフェーズのタイトルは、予測される細胞複製メカニズムの視覚的画像である。 図１０Ａ～１０Ｂは、カルボキシル基で官能化され、粒子が様々な分散剤に懸濁され、毛細管キュベットに適用された水、培地および生物学的緩衝液に懸濁されたＦＤＰ-ＮＶの凝集および表面電位に対するＢＳＡの受動吸着の効果を示すＺ－平均、直径サイズ（図１０Ａ）およびゼータ電位（図１０Ｂ）を測定するためにゼータサイザー機器（Malvern Inc.）に配置され、エラーバーは独立したサンプルの３回の測定からのSDを表す。（＊）Ｐ＜０．０１および（＊＊）一元配置分散分析を使用して計算されたFDP-NV-BSAとネイティブFDP-NV、特に分散剤の差については、Ｐ＜０．００１である。 図１１Ａ～１１Ｄは、直接細胞数の評価によって決定された細胞増殖に対するＦＤＰ-ＮＶの効果を示し、ここで、ＨｅｐＧ-２細胞（図１１Ａ）およびＨＵＶＥＣ（図１１Ｂ）の数のグラフ表示は、ＦＤＰ-NV-BSAもしくはビンクリスチン (vincristine)とのインキュベーションまたは非インキュベーション後に得られ、エラーバーは、各ウェルにつき7つの観測フィールドに適用された5つの独立したウェルからのSDを表す。（＊）一元配置分散分析を使用して計算された対照群と治療群の間のP <0.001、およびHepG-2細胞（図11C）またはHUVEC（図11D）の観察場の代表的な画像が、アプリケーション10x対物レンズとDAPI（青）およびTRITC（赤）フィルター（灰色のさまざまな色合いで表示）を備えた蛍光顕微鏡（Olympus IX81）を使用して取得した画像でImageJソフトウェアを使用した細胞数の決定に適用され、いくつかの実施形態によれば、白い矢印はHepG-2コロニーの隣接細胞への内在化粒子を示す。 図１１Ａ～１１Ｄは、直接細胞数の評価によって決定された細胞増殖に対するＦＤＰ-ＮＶの効果を示し、ここで、ＨｅｐＧ-２細胞（図１１Ａ）およびＨＵＶＥＣ（図１１Ｂ）の数のグラフ表示は、ＦＤＰ-NV-BSAもしくはビンクリスチン (vincristine)とのインキュベーションまたは非インキュベーション後に得られ、エラーバーは、各ウェルにつき7つの観測フィールドに適用された5つの独立したウェルからのSDを表す。（＊）一元配置分散分析を使用して計算された対照群と治療群の間のP <0.001、およびHepG-2細胞（図11C）またはHUVEC（図11D）の観察場の代表的な画像が、アプリケーション10x対物レンズとDAPI（青）およびTRITC（赤）フィルター（灰色のさまざまな色合いで表示）を備えた蛍光顕微鏡（Olympus IX81）を使用して取得した画像でImageJソフトウェアを使用した細胞数の決定に適用され、いくつかの実施形態によれば、白い矢印はHepG-2コロニーの隣接細胞への内在化粒子を示す。 図１１Ａ～１１Ｄは、直接細胞数の評価によって決定された細胞増殖に対するＦＤＰ-ＮＶの効果を示し、ここで、ＨｅｐＧ-２細胞（図１１Ａ）およびＨＵＶＥＣ（図１１Ｂ）の数のグラフ表示は、ＦＤＰ-NV-BSAもしくはビンクリスチン (vincristine)とのインキュベーションまたは非インキュベーション後に得られ、エラーバーは、各ウェルにつき7つの観測フィールドに適用された5つの独立したウェルからのSDを表す。（＊）一元配置分散分析を使用して計算された対照群と治療群の間のP <0.001、およびHepG-2細胞（図11C）またはHUVEC（図11D）の観察場の代表的な画像が、アプリケーション10x対物レンズとDAPI（青）およびTRITC（赤）フィルター（灰色のさまざまな色合いで表示）を備えた蛍光顕微鏡（Olympus IX81）を使用して取得した画像でImageJソフトウェアを使用した細胞数の決定に適用され、いくつかの実施形態によれば、白い矢印はHepG-2コロニーの隣接細胞への内在化粒子を示す。 図１１Ａ～１１Ｄは、直接細胞数の評価によって決定された細胞増殖に対するＦＤＰ-ＮＶの効果を示し、ここで、ＨｅｐＧ-２細胞（図１１Ａ）およびＨＵＶＥＣ（図１１Ｂ）の数のグラフ表示は、ＦＤＰ-NV-BSAもしくはビンクリスチン (vincristine)とのインキュベーションまたは非インキュベーション後に得られ、エラーバーは、各ウェルにつき7つの観測フィールドに適用された5つの独立したウェルからのSDを表す。（＊）一元配置分散分析を使用して計算された対照群と治療群の間のP <0.001、およびHepG-2細胞（図11C）またはHUVEC（図11D）の観察場の代表的な画像が、アプリケーション10x対物レンズとDAPI（青）およびTRITC（赤）フィルター（灰色のさまざまな色合いで表示）を備えた蛍光顕微鏡（Olympus IX81）を使用して取得した画像でImageJソフトウェアを使用した細胞数の決定に適用され、いくつかの実施形態によれば、白い矢印はHepG-2コロニーの隣接細胞への内在化粒子を示す。 図１２Ａ～１２Ｂは、ＨｅｐＧ-２（図１２Ａ）およびＨＵＶＥＣ（図１２Ｂ）に対するＦＮＤＰ-（ＮＶ）の効果を示す。いくつかの実施形態によれば、対照群と化合物処理群との間で、（＊）Ｐ＜０．０１および（＊＊）Ｐ＜０．００１である。 図１３Ａ～１３Ｂは、ＨｅｐＧ-２（図１３Ａ）およびＨＵＶＥＣ（図１３Ｂ）エステラーゼ活性モニターカルセインＡＭアッセイに対するＦＮＤＰ-（ＮＶ）の効果を示し、ここで、生きているHepG-2細胞（図13A）およびHUVEC（図13B）に存在するエステラーゼによる、カルセインＡＭの緑色蛍光カルセインへの変換のグラフ表示が、3つの独立した実験からのSDを表すエラーバーで示され、ここで、一元配置分散分析が、対照群と化合物処理群の間で計算され、いくつかの実施形態によれば、（＊）Ｐ＜０．０１および（＊＊）Ｐ＜０．００１である。 図１４Ａは、スクラッチアッセイにおいて２％ＦＢＳによって刺激されたＨＵＶＥＣの移動に対するＦＮＤＰ－（ＮＶ）の効果を示し、0.1％FBSを含む培地で処理した非刺激細胞（陰性対照）を伴うＦＮＤＰ－ＮＶ－ＢＳＡの存在下または非存在下、２％FBSで刺激したスクラッチクロージャーを示し、エラーバーは、3つの独立した実験からのSDを表し、一組の実施形態によれば、一元配置分散分析での対照（2％FBS処理）との対比で、(＊) Ｐ＜０．００１である。 図１４Ｂは、スクラッチアッセイにおいて２％ＦＢＳによって刺激されたＨＵＶＥＣの移動に対するＦＮＤＰ－（ＮＶ）の効果を示し、２０倍の倍率およびＤＡＰＩ（青）およびＴＲＩＴＣ（赤）フィルターを示す蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ８１）を使用して得られたスクラッチの画像を示し、一組の実施形態によれば、異なる灰色の色合いで表示される； 図１５Ａ～１５Ｂは、２４時間の血清飢餓ＨｅｐＧ-２細胞（図１５Ａ）または２％ＦＢＳで１０および２０分間刺激されたＨＵＶＥＣ（図１５Ｂ）を有するＦＢＳによって誘導されたＭＡＰＫ Ｅｒｋ１／２のリン酸化および抗リン酸化抗体をストリッピングした後、PVDFメンブレンで再プローブされた総MAPKErk1/2に対するＦＤＰ-ＮＶの効果を示し、右側のプロットバーはリン酸化タンパク質バンドに対する総タンパク質バンドの強度の比率を示し、緑色のバーは対照（未処理細胞）の比率を示し、一方、FDP-NV処理細胞の赤いバーはFDP-NV処理細胞および左側のペインは各細胞タイプの代表的なブロット画像を示し、エラーバーは3つの独立した実験のSDを表し、一組の実施形態によれば、一元配置分散分析により、FDP-NV-BSA ０．１ｍｇ／ｍＬでの処理または非処理細胞の間の対比で（＊）Ｐ＜０．０１および（＊＊）Ｐ＜０．０１である。 図１５Ａ～１５Ｂは、２４時間の血清飢餓ＨｅｐＧ-２細胞（図１５Ａ）または２％ＦＢＳで１０および２０分間刺激されたＨＵＶＥＣ（図１５Ｂ）を有するＦＢＳによって誘導されたＭＡＰＫ Ｅｒｋ１／２のリン酸化および抗リン酸化抗体をストリッピングした後、PVDFメンブレンで再プローブされた総MAPKErk1/2に対するＦＤＰ-ＮＶの効果を示し、右側のプロットバーはリン酸化タンパク質バンドに対する総タンパク質バンドの強度の比率を示し、緑色のバーは対照（未処理細胞）の比率を示し、一方、FDP-NV処理細胞の赤いバーはFDP-NV処理細胞および左側のペインは各細胞タイプの代表的なブロット画像を示し、エラーバーは3つの独立した実験のSDを表し、一組の実施形態によれば、一元配置分散分析により、FDP-NV-BSA ０．１ｍｇ／ｍＬでの処理または非処理細胞の間の対比で（＊）Ｐ＜０．０１および（＊＊）Ｐ＜０．０１である。 図１６Ａ～１６Ｂは、ＦＤＰ-ＮＶおよびＴＰＡの存在下および非存在下での、ＨｅｐＧ-２細胞およびＨＵＶＥＣの細胞質および核におけるホスホおよび総ＭＡＰＫ Ｅｒｋ１／２の同定を示し、ＨｅｐＧ-２細胞（図１６Ａ）またはＨＵＶＥＣ（図１６Ｂ）は、ＦＤＰ－ＮＶ－ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）で処理されたか、または処理されず、２４時間の血清飢餓後、ＴＰＡで刺激または非刺激され、細胞は溶解され、細胞質および核画分、ならびに指示される抗体を使用してWBに付された画分に分画され；Mek-1を細胞質画分のマーカーとして使用し、HDAC1を核画分として使用した。 図１６Ａ～１６Ｂは、ＦＤＰ-ＮＶおよびＴＰＡの存在下および非存在下での、ＨｅｐＧ-２細胞およびＨＵＶＥＣの細胞質および核におけるホスホおよび総ＭＡＰＫ Ｅｒｋ１／２の同定を示し、ＨｅｐＧ-２細胞（図１６Ａ）またはＨＵＶＥＣ（図１６Ｂ）は、ＦＤＰ－ＮＶ－ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）で処理されたか、または処理されず、２４時間の血清飢餓後、ＴＰＡで刺激または非刺激され、細胞は溶解され、細胞質および核画分、ならびに指示される抗体を使用してWBに付された画分に分画され；Mek-1を細胞質画分のマーカーとして使用し、HDAC1を核画分として使用した。 図１６Ｃ～１６Ｄは、ＦＤＰ-ＮＶおよびＴＰＡの存在下および非存在下での、ＨｅｐＧ-２細胞およびＨＵＶＥＣの細胞質および核におけるホスホおよび総ＭＡＰＫ Ｅｒｋ１／２の同定を示し、ＨｅｐＧ－２細胞（Ｃ）またはＨＵＶＥＣ（Ｄ）はFDP-NV-BSAに曝露した後、チャンバースライド上で増殖させ、２４時間血清飢餓状態にした。TPAで処理または非処理の後、細胞を抗リン酸化MAPK Erk 1/2で、続いてFITCでタグ付けしたヤギ抗ウサギで免疫染色した。スライドを油性対物レンズ付きの蛍光顕微鏡（Olympus IX81）で４００倍の倍率で分析し、FITC（緑）およびTRITC（赤）フィルターを使用し、一組の実施形態によれば、緑と赤の重なり合った領域を黄色で、さまざまな色合いの灰色で表示し、白い矢印は、非処理細胞と対比してTPA処理細胞において粒子の蓄積が多いことを示し、青い矢印は、TPAで処理されていない細胞の核を示し、赤い矢印はTPAで処理された細胞の核を示す。 図１６Ｃ～１６Ｄは、ＦＤＰ-ＮＶおよびＴＰＡの存在下および非存在下での、ＨｅｐＧ-２細胞およびＨＵＶＥＣの細胞質および核におけるホスホおよび総ＭＡＰＫ Ｅｒｋ１／２の同定を示し、ＨｅｐＧ－２細胞（Ｃ）またはＨＵＶＥＣ（Ｄ）はFDP-NV-BSAに曝露した後、チャンバースライド上で増殖させ、２４時間血清飢餓状態にした。TPAで処理または非処理の後、細胞を抗リン酸化MAPK Erk 1/2で、続いてFITCでタグ付けしたヤギ抗ウサギで免疫染色した。スライドを油性対物レンズ付きの蛍光顕微鏡（Olympus IX81）で４００倍の倍率で分析し、FITC（緑）およびTRITC（赤）フィルターを使用し、一組の実施形態によれば、緑と赤の重なり合った領域を黄色で、さまざまな色合いの灰色で表示し、白い矢印は、非処理細胞と対比してTPA処理細胞において粒子の蓄積が多いことを示し、青い矢印は、TPAで処理されていない細胞の核を示し、赤い矢印はTPAで処理された細胞の核を示す。 図１７Ａは、ＨｅｐＧ-２およびHUVECにおけるＦＤＰ-ＮＶ（０．１ｍｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下でのカスパーゼ３の切断のウエスタンブロット分析で、ＨｅｐＧ-２細胞およびHUVECにおけるアポトーシスおよびＥＲストレスの誘導に対するＦＤＰ-ＮＶの効果を示す。ビンクリスチンをアポトーシスの陽性対照として使用した。いくつかの実施形態によれば、分子量マーカーの局在化は、画像の左側の矢印によって示される。 図１７Ｂは、ＨｅｐＧ-２およびHUVECにおけるＦＤＰ-ＮＶ（０．１ｍｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下でのＥＲにおけるシャペロンの発現のウエスタンブロット分析で、ＨｅｐＧ-２細胞およびＨＵＶＥＣにおけるアポトーシスおよびＥＲストレスの誘導に対するＦＤＰ-ＮＶの効果を示す。いくつかの実施形態によれば、ツニカマイシンを小胞体ストレスの陽性対照として使用した。

概略、ダイヤモンドベースの医薬組成物などのダイヤモンド粒子を含む組成物および物品が提供される。いくつかの実施形態では、ダイヤモンド粒子を含む物品および方法は、疾患をモニターおよび／または治療するために有用であり得る（例えば、対象において）。いくつかの実施形態において、物品は、（ナノ）ダイヤモンド粒子に結合した治療薬を送達するために使用することができる複数のダイヤモンド粒子（例えば、蛍光（ナノ）ダイヤモンド粒子）を投与するように構成され得る。例えば、複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子は、複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子の少なくとも一部が対象の内部の位置（例えば、肝臓などの器官内）に滞留するように、対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子を診断ツールとして使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子を対象に（例えば、静脈内注射を介して）投与することができる。いくつかのそのような実施形態では、複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子を含むと疑われる場所の画像を取得することができ、診断的に適切な期間の後、複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子を含むと疑われる対象の同じ場所の第２の画像を取得することができる。いくつかの実施形態では、第１の画像および／または第２の画像は、近赤外線および／または蛍光発光に基づく（例えば、（ナノ）ダイヤモンド粒子による）。いくつかの実施形態では、第１の画像と第２の画像との対比は、例えば、病状（例えば、ガン）の進行を含む診断情報を提供し得る。例えば、複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子のない新しい組織を含む第２の画像の領域は、場合によっては、悪性の成長を示している可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、疾患の進行をモニターするために有用であり得る。いくつかの実施形態では、第１の画像および第２の画像は、同様の（例えば、同一の）条件下（例えば、同じ波長の励起および／または発光）で得られる。

本明細書で使用される「対象」は、哺乳動物（例えば、ヒト）などの任意の動物を指す。対象の非限定的な例には、ヒト、非ヒト霊長類、牛、馬、豚、羊、山羊、犬、猫、またはマウス、ラット、ハムスターなどの齧歯動物、鳥、魚、またはモルモットが含まれる。本明細書に記載の実施形態は、場合によっては、ヒトでの使用に向けられ得る。本明細書に記載の実施形態は、場合によっては、獣医の使用に向けられ得る。いくつかの実施形態において、対象は、例えば、（ナノ）ダイヤモンド粒子の投与時に、健康上の利益を示し得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の（ナノ）ダイヤモンド粒子は、対象の１つまたは複数の器官（例えば、肝臓）内での滞留時間が延長されるように構成され得る。例えば、腫瘍成長の進行は、複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子を対象に投与し、上記のように腫瘍成長が疑われる臓器を画像化することによってモニターすることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の（ナノ）ダイヤモンド粒子は、治療薬を（例えば、対象の内部の器官に）送達するように構成され得る。いくつかの実施形態において、治療薬は、少なくとも部分的に、複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子に結合され得る。場合によっては、（例えば、治療効果を提供するために）治療薬に結合した（ナノ）ダイヤモンド粒子を対象に投与することができる。

（ナノ）ダイヤモンド粒子は、対象（例えば、器官）の内部の場所の内部に比較的長い滞留を有するように構成され得るので、（ナノ）ダイヤモンド粒子を使用して送達される治療薬は、長期間にわたって治療薬を有利に送達し得る。いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、対象内または対象の器官の内部に長期間滞留するように構成される。
いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、滞留するように構成される（例えば、滞留を容易にするサイズおよび／または形状を有する）。いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、１日間以上、３日間以上、５日間以上、７日間以上、１０日間以上、２週間以上、４週間以上、６週間以上、１２週間以上、２６週間以上、または52週間以上、器官内に滞留するように構成される。いくつかの実施形態において、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、１００週間以下、５２週間以下、２６週間以下、１２週間以下、６週間以下、４週間以下、２週間以下、１０日間以下、７日間以下、５日間以下、または３日間以下、対象の器官に滞留するように構成される。上記の範囲の組み合わせも可能である（例えば、1日間を超え１００週間未満、5日間を超え２６週間未満、６週間を超え５２週間未満）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態において、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、対象の寿命の間、対象の器官に滞留するように構成され得る。有利には、本明細書に記載の（ナノ）ダイヤモンド粒子は、毒性または有害な生理学的効果なしに対象の器官に滞留し得る。

特定の実施形態において、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、対象の内部の器官によって捕捉され得る。いくつかの実施形態において、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、対象内または対象内部の器官内でさらに組織化または凝集し得る。いくつかの実施形態において、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、例えば、肝臓などの器官内で凝集体を形成し得る。いくつかの実施形態において、ダイヤモンドナノ粒子（例えば、（ナノ）ダイヤモンド粒子）は、例えば、膵臓および／または膵臓細胞内で凝集体を形成し得る。場合によっては、これらの凝集体は、対象内の状態または疾患の進行をモニターするのに有利に役立つ可能性があり、および／または治療薬の長期送達を提供するのに役立つ可能性がある。

本明細書に記載されるように、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、対象に投与され得る。 場合によっては、複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子が外科的に投与され（例えば、移植される）、および／または注射される（例えば、体循環に、眼内に、脊髄または体液に、例えば、注射器を介して）。特定の実施形態において、複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子は、経口、直腸、膣、鼻、または尿管で（例えば、カプセル内で）投与され得る。

いくつかの実施形態において、（ナノ）ダイヤモンド粒子の投与は、静脈内注射などの注射を介して行われる。例えば、（ナノ）ダイヤモンド粒子を含むリザーバーに関連する注入成分を使用することができる。いくつかの実施形態では、注射構成要素は針であり、関連するリザーバーは注射器である。針は、対象に組成物を投与するのに適切な任意のサイズまたはゲージのものであり得る。注射器は、対象に投与される特定の量の組成物を含むのに適切な任意のサイズまたは容量のものであり得る。いくつかの実施形態では、注射成分はピペットである。当業者は、本明細書に記載の組成物を対象に投与するのに適した他の注射成分を認識するであろう。なぜなら、本開示はそのように限定されないからである。

いくつかの実施形態では、リザーバーは、静脈内担体流体と、静脈内担体流体内に懸濁された複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子とを含む。適切な静脈内担体液の非限定的な例には、生理食塩水（例えば、９％生理食塩水、４５％生理食塩水）、乳酸化リンガー、および水性デキストロース（例えば、水中の５％デキストロース）が含まれる。

いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子（例えば、（ナノ）ダイヤモンド粒子に結合した治療薬を含む複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子）を対象に投与することができる（例えば、対象に存在する疑いがある分析物（例えば、病理学的同一性の生理学的要素）の検出のために）。例えば、場合によっては、治療薬を構成する複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子を対象に投与し、（ナノ）ダイヤモンド粒子の発光（例えば、蛍光発光、近赤外発光など）検出で、対象における治療薬の存在を確認する。

いくつかの実施形態では、化学種（例えば、治療薬）は、（ナノ）ダイヤモンド粒子または複数の（ナノ）ダイヤモンド粒子に結合する。いくつかの実施形態において、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、（ナノ）ダイヤモンド粒子の官能化を介して化学種と関連（例えば、結合）する。例えば、いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、イオン結合、共有結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用などの結合の形成を介して化学種と関連する。共有結合は、例えば、炭素－炭素、炭素－酸素、酸素－ケイ素、硫黄－硫黄、リン－窒素、炭素－窒素、金属－酸素、または他の共有結合であり得る。水素結合は、例えば、ヒドロキシル、アミン、カルボキシル、チオール、および／または同様の官能基の間にあり得る。例えば、化学種は、チオール、アルデヒド、エステル、カルボン酸、ヒドロキシルなどのような官能基をさらに含み得、ここで、官能基は、（ナノ）ダイヤモンド粒子と結合を形成する。いくつかの実施形態では、官能基は、（ナノ）ダイヤモンド粒子に結合している（例えば、治療薬に結合することができる）。場合によっては、化学種は、（ナノ）ダイヤモンド粒子と化学種との間の相互作用が静電相互作用を含む、電子が豊富な部分または電子が少ない部分であり得る。

いくつかの実施形態において、化学種（例えば、治療薬）は、架橋剤の存在下、官能化（ナノ）ダイヤモンド粒子と化学種とを反応させることにより、－ＣＯＯＨ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＳＨ、または－Ｃ＝Ｏ官能基を含む官能化（ナノ）ダイヤモンド粒子と関連している。適切な架橋剤の非限定的な例には、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）などのカルボジイミド；N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドロメチルホスフィンなどのアミン反応性化合物；マレイミド、ピリジルジスルフィド、ヨードアセチルなどのスルフヒドリル反応性化合物；ヒドラジドやアルコキシアミンなどのアルデヒド反応性化合物；ならびにアリールアジドやジアジリンなどの光反応性架橋剤が含まれる。他の架橋剤も可能である。当業者は、選択された化学種のタイプおよび本明細書の教示に基づいて、適切な架橋剤を選択することができるであろう。

適切な（ナノ）ダイヤモンド粒子の例は、本明細書では、すべての目的のためにその全体を参照する、２０１７年９月６日に出願された「（ナノ）ダイヤモンド粒子および関連するデバイスおよび方法」と題された共同所有の国際特許出願第PCT/US2017/050257にさらに詳細に記載されている。

上記および本明細書で説明したように、いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子を画像化に使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、検出器によって検出され得る特徴的な発光（すなわち、蛍光）を放出し得る。いくつかの実施形態では、検出器は、（ナノ）ダイヤモンド粒子を含むことが疑われる対象の領域の近くに配置され得る。例えば、化学種で機能化された複数の（蛍光性）（ナノ）ダイヤモンド粒子を対象に投与することができ、検出器を（ナノ）ダイヤモンド粒子を含むことが疑われる対象の領域の近くに配置して、任意の（ナノ）ダイヤモンド粒子を（例えば、（ナノ）ダイヤモンド粒子の発光で）検出することができる。

本明細書に記載の装置および方法では、任意の適切な検出器を使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、検出器は、光学検出器（例えば、蛍光検出器、可視光および／またはＵＶ検出器、近赤外線検出器、顕微鏡、ＭＲＩ、ＣＴスキャナー、Ｘ線検出器）であり得る。

本明細書に記載されるように、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、炭素原子の集合体であり、コアには、主に炭素原子から構成されるダイヤモンドケージが存在する。（ナノ）ダイヤモンド粒子はダイヤモンドを含むが、グラファイト、グラフェン、フラーレンなどの他の炭素相または同素体が存在し得る。単一の（ナノ）ダイヤモンド粒子は、いくつかの実施形態において単一形態の炭素を含み得る。他の実施形態では、２つ以上の形態の炭素が（ナノ）ダイヤモンド粒子を含み得る。

いくつかの実施形態では、複数のダイヤモンド粒子は、２μｍ以下の平均最大断面寸法（例えば、直径）を有し得る。明細書の記載の多くは一般にナノダイヤモンド粒子（すなわち、１０００ｎｍ未満の最大断面寸法を有するダイヤモンド粒子）に関連しているが、当業者は、本明細書の教示に基づいて、そのダイヤモンド粒子を理解するであろう。より大きな断面寸法（例えば、１０００ｎｍ以上）を有することも可能である。例えば、いくつかの実施形態では、複数のダイヤモンド粒子は、２μｍ未満（例えば、１８００ｎｍ以下、１６００ｎｍ以下、1４００ｎｍ以下、１２００ｎｍ以下、１０００ｎｍ以下、９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、１６０ｎｍ以下、１４０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、または２０ｎｍ以下）の平均最大断面寸法を有し得る場合によっては、複数のダイヤモンド粒子は、１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１２０ｎｍ以上、１４０ｎｍ以上、１６０ｎｍ以上、1８０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、７００ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、９００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以上、1２００ｎｍ以上、1４００ｎｍ以上、1６００ｎｍ以上、または1８００ｎｍ以上の平均最大断面寸法を有し得る。上記の範囲の組み合わせも可能である（例えば、２μｍ未満１０ｎｍ以上、１４００ｎｍ以下１０００ｎｍ以上）。他の範囲も可能である。当業者は、本明細書の教示に基づいて、複数のダイヤモンドの平均断面寸法を決定するための適切な方法を選択することができる。例示的な一組の実施形態では、複数のダイヤモンド粒子は、９００ｎｍ以下および７００ｎｍ以上の平均最大断面寸法を有する。いくつかの実施形態では、ダイヤモンド粒子は、他のダイヤモンド粒子と（例えば、対象の内部の位置で）凝集構造を形成し得る。いくつかの実施形態では、ダイヤモンド粒子の集合体は、１μｍ以上（例えば、１μｍ以上、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上、３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以下、９０μｍ以上）、かつ、１００μｍ以下（例えば、１００μｍ以下、９０μｍ以下、８０μｍ以下、７０μｍ以下、６０μｍ以下５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、１０μｍに等しい、５μｍ以下、１μｍ以下）の最大断面寸法を有し得る。上記の範囲の組み合わせも可能である（例えば、１ミクロン以上５０ミクロン以下、１ミクロン以上１００ミクロン以下）。他の範囲も可能である。

いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、他の（ナノ）ダイヤモンド粒子と（例えば、対象の内部の位置で）比較的大きな凝集体構造を形成し得る。例えば、いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子の凝集体は、１００ミクロン以上、２００ミクロン以上、５００ミクロン以上、１０００ミクロン以上、２０００ミクロン以上、５０００ミクロン以上、または７５００ミクロン以上の最大断面寸法を有する。いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子の凝集体は、１０００ミクロン以下、７５００ミクロン以下、５０００ミクロン以下、２０００ミクロン以下、１０００ミクロン以下、５００ミクロン以下、または２００ミクロン以下の最大断面寸法を有する。上記の範囲の組み合わせも可能である（例えば、1ミクロン以上１０００0ミクロン以下、１００ミクロン以上１０００0ミクロン以下、以上５００ミクロン以下５０００ミクロン以下、１０００ミクロン以上１０００0ミクロン以下）。他の範囲も可能である。

いくつかの実施形態において、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、電磁放射を放出し得る。いくつかの実施形態では、発光は蛍光発光である。特定の実施形態では、発光の波長は、２５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、５５０ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、または６５０ｎｍ以上である。特定の実施形態では、発光の波長は、７００ｎｍ以下、６５０ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５５０ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４５０ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３５０ｎｍ以下、または３００ｎｍ以下である。上記の範囲の組み合わせも可能である（例えば、２５０ｎｍ以上７００ｎｍ以下）。他の範囲も可能である。

特定の実施形態では、放射は近赤外線放射である。いくつかの実施形態では、発光の波長は、７００ｎｍ以上、７５０ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、８５０ｎｍ以上、９００ｎｍ以上、９５０ｎｍ以上である。特定の実施形態では、発光の波長は、１０００ｎｍ以下、９５０ｎｍ以下、９００ｎｍ以下、８５０ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、または７５０ｎｍ以下である。上記の範囲の組み合わせも可能である（例えば、７００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下）。他の範囲も可能である。

例示的な実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、近赤外線発光（例えば、６５０ｎｍ以上７５０ｎｍ以下）および約７００～９００ｎｍの平均最大断面寸法を有する。発光と断面寸法の他の組み合わせも可能である。

いくつかの実施形態において、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、特定の波長を有する電磁放射による励起時に、蛍光および／または近赤外発光を放出し得る。例えば、いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、２５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、５５０ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、６５０ｎｍ以上、７００ｎｍ、７５０ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、８５０ｎｍ以上、９００ｎｍ以上、または９５０ｎｍ以上の波長を有する電磁放射に曝露され得る（例えば、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、上記の範囲の１つで蛍光発光および／または近赤外発光を放出する）。特定の実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、１０００ｎｍ以下、９５０ｎｍ以下、９００ｎｍ以下、８５０ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、または７５０ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６５０ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５５０ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４５０ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３５０ｎｍ以下、または３００ｎｍ以下の波長を有する電磁放射に曝露され得る。上記の範囲の組み合わせも可能である（例えば、２５０ｎｍ以上および１０００ｎｍ以下、５５０ｎｍ以上および６５０ｎｍ以下）。他の範囲も可能である。

理論に拘束されることを望まないが、場合によっては、本明細書に記載の（ナノ）ダイヤモンド粒子は、自己蛍光性であり得る（例えば、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、例えば、電磁放射の吸収後に蛍光を発する）。場合によっては、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、1つまたは複数の原子型欠陥（例えば、窒素－空孔（NV）中心などの点欠陥、窒素－空孔－窒素（NVN）などの点欠陥、それらの組み合わせ）を含み得、それらは、検出および／または定量化され得る近赤外蛍光および／またはフォトルミネッセンスをもたらす。他の欠陥も考えられる（例えば、ガドリニウム、ユーロピウム、鉄、Si空孔欠陥）。特定の実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、印加された電磁放射に応答して蛍光を発する。

例えば、いくつかの実施形態では、（ナノ）ダイヤモンド粒子は、（ナノ）ダイヤモンド粒子が検出可能な発光（例えば、第１の波長とは異なり、第２の波長を有する電磁放射）を放出するように、（例えば、第１の波長を有する電磁放射を印加することによって）励起され得る。特定の組の実施形態において、分析物がサンプル中に存在する場合、分析物は、（ナノ）ダイヤモンド粒子に結合し（例えば、（ナノ）ダイヤモンド粒子に結合した化学種に結合し）、（ナノ）ダイヤモンド粒子からの放出を検出および／または定量化することができる。場合によっては、対象における（ナノ）ダイヤモンド粒子の放出の検出は、（ナノ）ダイヤモンド粒子が疑わしい分析物に結合していることを示している可能性がある。いくつかのそのような場合において、放出は定量化され得る（例えば、対象に存在する分析物の相対量を決定するために）。

本明細書に記載されるように、特定の実施形態は、（ナノ）ダイヤモンド粒子に結合した治療薬を含む。いくつかの実施形態によれば、治療薬は、薬物、栄養素、微生物、イン・ビボセンサー、およびトレーサーなどの治療薬、診断薬、および／または増強剤の１つまたは組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、治療薬は、栄養補助食品、予防薬、または診断薬である。明細書の多くは治療薬の使用を説明しているが、本明細書に記載されている他の薬剤も可能である。

薬剤は、限定されないが、対象（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に投与されたときに、所望の薬理学的、免疫原性、および／または局所的および／または全身的作用による生理学的効果を発揮する、任意の合成または天然産出する生物学的活性な化合物または組成物を含む。例えば、特定の実施形態の文脈において有用または潜在的に有用であるのは、薬物、ワクチン、および生物医薬品と伝統的に見なされている化合物または化学物質である。特定のそのような薬剤は、タンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸、遺伝子構築物などの分子が含み得、それらは、限定されないが、医学的または獣医学的治療、予防、診断、および／または疾患または病気の緩和（例えば、ロスバスタチン (rosuvastatin)のようなHMG co-Aレダクターゼ阻害剤（スタチン）、メロキシカム(meloxicam)のような非ステロイド性抗炎症薬、エシタロプラム(escitalopram)のような選択的セロトニン再取り込み阻害剤、クロピドグレル(clopidogrel)のような血液希釈剤、プレドニゾン(prednisone)のようなステロイド、アリピプラゾール(aripiprazole)やリスペリドン(risperidone)のような抗精神病薬、ブプレノルフィン(buprenorphine)のような鎮痛薬、ナロキソン(naloxone)、モンテルカスト(montelukast)およびメマンチン(memantine)のような拮抗薬、ジゴキシン(digoxin)のような強心配糖体、タムスロシン(tamsulosin)のようなアルファ遮断薬、エゼチミベ(ezetimibe)のようなコレステロール吸収阻害薬、コルチシン(colchicine)のような代謝物、ロラタジン(loratadine)およびセチリジン(cetirizine)のような抗ヒスタミン薬、ロペラミド(loperamide)のようなオピオイド、オメプラゾール(omeprazole)のようなプロトンポンプ阻害剤、エンテカビル(entecavir)、ドルテグラビル(dolutegravir)、リルピビリン(rilpivirine)、カボテグラビル(cabotegravir)のような抗（レトロ）ウイルス薬、ドキシサイクリン(doxycycline)、シプロフロキサシン(ciprofloxacin)、およびアジスロマイシン(azithromycin)のような抗生物質、抗マラリア薬、シントロイド(synthroid)/レボチロキシン(levothyroxine)）；薬物乱用治療（例、メタドン (methadone)およびバレニクリン(varenicline)）；家族計画（例：ホルモン避妊薬）；パフォーマンス向上（例えば、カフェイン(caffeine)のような覚醒剤；栄養とサプリメント（例：タンパク質、葉酸、カルシウム、ヨウ素、鉄、亜鉛、チアミン、ナイアシン、ビタミンC、ビタミンD、およびその他のビタミンまたはミネラルサプリメント）。を含む、治療、診断、および／または強化の分野で使用するためである。

特定の実施形態では、治療薬は、１つまたは複数の特定の治療薬である。本明細書で使用される場合、「治療薬」という用語または「薬物」とも呼ばれる用語は、疾患、障害、または他の臨床的に認識される状態を治療するために、または予防目的で対象に投与される薬剤を指し、疾患、障害、または状態を改善、治療および／または予防するための対象の身体に対する臨床的に有意な効果を有する。公知の治療薬の例のリストは、例えば、United States Pharmacopeia (USP), Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Ed., McGraw Hill, 2001; Katzung, B. (ed.) Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill/Appleton & Lange; 8th edition (September 21, 2000)；Physician’s Desk Reference (Thomson Publishing), および／または The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th ed. (1999), または the 18th ed (2006) その公開後, Mark H. Beers and Robert Berkow (eds.), Merck Publishing Group, または, 動物の場合 The Merck Veterinary Manual, 9th ed., Kahn, C.A. (ed.), Merck Publishing Group, 2005; および the United States Food and Drug Administration (F.D.A.) によって公開された“Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence and Evaluations,” (the “Orange Book”)を含む。人間への使用が承認された医薬品の例は、21C.F.R.第330.5、331から361、および440から460項の下、FDAによってリストされ、参照により本明細書に組み込まれ；獣医用医薬品は、21C.F.R.第500から589項の下、FDAによってリストされ、参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、治療薬は小分子である。治療薬の例示的なクラスには、鎮痛薬、抗鎮痛薬、抗炎症薬、抗発熱薬、抗うつ薬、抗てんかん薬、抗精神病薬、神経保護薬、抗ガン剤などの抗増殖剤、抗ヒスタミン剤が含まれるが、これらに限定されない。抗片頭痛薬、ホルモン、プロスタグランジン、抗菌薬（抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗寄生虫薬を含む）、抗ムスカリン薬、抗うつ薬、静菌薬、免疫抑制薬、鎮静薬、催眠薬、抗精神病薬、気管支拡張薬、抗喘息薬、心臓-凝固剤、酵素阻害剤、ステロイド剤、ステロイド性または非ステロイド性抗炎症剤、コルチコステロイド、ドーパミン作動薬、電解質、胃腸薬、筋弛緩剤、栄養剤、ビタミン、副交感神経刺激薬、刺激剤、食欲不振剤および鎮痛剤。栄養補助食品も、ドラッグデリバリーデバイスに組み込むことができる。これらは、ビタミン、カルシウムやビオチンなどのサプリメント、または植物抽出物や植物ホルモンなどの天然成分であり得る。

いくつかの実施形態では、治療薬は、１つまたは複数の抗ガン剤（例えば、化学療法薬）である。

適切な抗ガン治療薬の非限定的な例には、アルキル化剤（例えば、シクロホスフ(Cyclophosph)、ブスルファン(Busulfan)、シスプラチン(cisplatin)）、代謝抑制化合物（例えば、葉酸類似体-メトトレキサート(methotrexate)）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリン(mercaptopurine)、ペントスタチン(Pentostatin)）、ピリミジン類似体（例えば、5 -フルオロウラシル）、ビンカアルカロイド、カンプトテシン(camptothecins)、プロテアーム阻害剤（例、ゲフィチニブ(Gefitinib)）、ホルモン（例、ステロイド）、生物学的補助療法（例、抗体、ハーセプチン(Herceptin)）、補助療法（例、BRAF、メラノーマ(Melanoma)）、ダブラフェニブ(dabrafenib)/タフィンラー(Tafinlar); トラメチニブ(Trametinib)/メカニスト(Mekinist)）、生体特異的抗体、ブリナツモマブ(blinatumomab)/ブリンサイト(Blincyto)、化学標識抗体、およびブレンツキシマブ(Brentuximab)が含まれる。

別の実施形態では、治療薬は免疫抑制剤である。例示的な免疫抑制剤には、グルココルチコイド、細胞静止剤（アルキル化剤、抗代謝物、および細胞毒性抗体など）、抗体（T細胞受容体またはIl-2受容体に対するものなど）、イムノフィリンに作用する薬物（シクロスポリン(cyclosporine)、タクロリムス(tacrolimus)、およびシロリムス(sirolimus)）および他の薬剤（インターフェロン、オピオイド、TNF結合タンパク質、マイコフェノラート(mycophenolate)、およびフィンゴリモド(fingolimod)などの他の小分子など）。

特定の実施形態において、治療薬は、ホルモンまたはその誘導体である。ホルモンの非限定的な例には、インスリン、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、バソプレシン(vasopressin)、メラトニン(melatonin)、チロキシン(thyroxine)、チロトロピン放出ホルモン、糖タンパク質ホルモン（例えば、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、TSH）、エイコサノイド、エストロゲン、プロゲスチン、テストステロン、エストラジオール、コルチゾール、アドレナリン、およびその他のステロイドが含まれる。

いくつかの実施形態において、治療薬は、分子重量が約２５００ダルトン未満、約２０００ダルトン未満、約１５００ダルトン未満、約１０００ダルトン未満、約７５０ダルトン未満、約５００ダルトン未満、約４００ダルトン未満の小分子薬物である。場合によっては、治療薬は、分子量が２００ダルトンから４００ダルトンの間、４００ダルトンから１０００ダルトンの間、または５００ダルトンから２５００ダルトンの間の小分子薬である。

いくつかの実施形態において、治療薬は、核酸、ペプチド、バクテリオファージ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アプタマー、ヒト成長ホルモン、モノクローナル抗体、アダリムマブ、エピネフリン、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、セマグルチドなどの活性薬剤、リラグルチド、デュラグリチド、エクセナチド、第VIII因子、小分子薬、プロゲスチン、ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチン、多糖類ワクチン、抱合型ワクチン、トキソイドワクチン、インフルエンザワクチン、シングルワクチン、前肺炎ワクチン、mmrワクチン、破傷風ワクチン、肝炎ワクチン、HIVワクチンAd4-envクレードC、HIVワクチンAd4-mGag、DNAワクチン、RNAワクチン、エタネルセプト(etanercept)、インフリキシマブ(infliximab)、フィルガストリム(filgastrim)、酢酸グラチラマー(glatiramer acetate)、リツキシマブ(rituximab)、ベバシズマブ(bevacizumab)、ナノ粒子にカプセル化された任意の分子、エピネフリン(epinephrine)、リゾチーム、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、その他の酵素、セルトリズマブペゴル(certolizumab pegol)、ウステキヌマブ(ustekinumab)、イケキズマブ(ixekizumab)、ゴリムマブ(golimumab)、ブロダルマブ(brodalumab)、グセル(gusellu)、ab、セシキヌマブ(secikinumab)、オマリズマブ(omalizumab)、tnf-アルファ阻害剤、インターロイキン阻害剤、ベドリズマブ(vedolizumab)、オクトレオチド(octreotide)、テリペラチド(teriperatide)、CRISPR cas9、オリゴヌクレオチド、およびオンダンセトロン(ondansetron)からなる群から選択される。

本明細書の説明の多くは、（蛍光）（ナノ）ダイヤモンド粒子の文脈であるが、当業者は、本明細書の教示に基づいて、他の粒子も可能であることを理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、デバイスは、化学種（例えば、1つまたは複数の標的分析物に結合することができる化学種）に関連する上記の参照範囲の1つにおいて、放出を有するナノ粒子（例えば、シリカナノ粒子、サファイアナノ粒子、ガーネットナノ粒子、ルビーナノ粒子、量子ドット、量子ドット－ポリマー複合体）などの粒子を含み得る。場合によっては、粒子は自己蛍光性である可能性がある。他の場合において、粒子は、蛍光分子で官能化され得る（例えば、関連し得る）可能性がある。

例示的な実施形態において、対象に投与された蛍光性（ナノ）ダイヤモンド粒子は、肝臓細胞（例えば、肝細胞、クッパー細胞）、ならびに他の細胞（例えば、内皮）に接近し、そこで、肝臓における（ナノ）ダイヤモンド粒子の沈着は実質的に即時である（（ナノ）ダイヤモンド粒子の注射時）。いくつかのそのような実施形態において、肝臓における（ナノ）ダイヤモンド粒子の存在は延長され、例えば、単回注射は、少なくとも１２週間にわたって粒子の持続的な存在を提供し得る。いくつかの実施形態では、肝臓に存在する（ナノ）ダイヤモンド粒子は、正常な肝臓細胞に悪影響を及ぼさない（例えば、少なくとも３ヶ月後に測定された）。（ナノ）ダイヤモンド粒子および／または関連化学種（例えば、（ナノ）ダイヤモンド粒子で機能化された化学的および／または有機添加物）は、場合によっては、ガン細胞内（正常な肝臓上）への侵入の促進および蓄積の増加を見つける可能性がある。いくつかの実施形態において、抗ガン特性を有する治療薬は、蛍光（ナノ）ダイヤモンド粒子にタグ付けされると、ガン細胞の成長を阻止し得る（例えば、転移スケールおよびその進行を減少させる）。いくつかのそのような実施形態において、（例えば、治療薬に結合された）（ナノ）ダイヤモンド粒子は、より長い「無増悪生存」期間および減少した死亡率を有利に提供し得る。いくつかの実施形態では、理論に拘束されることを望まないが、肝臓における転移性負荷を減少させることは、肝機能の改善（それ自体が罹患の深刻な原因）に有利に寄与する可能性がある。

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明することを意図しているが、本発明の全範囲を例示するものではない。

実施例1
げっ歯類のPOC（有効性）研究は重要な警告を提起した。つまり、解剖学的考察は、体内の場所からNIRを記録すると、臓器や組織に依存する方法で不透明度と自家蛍光に関連する課題が生じることを示唆している。頸動脈などの場所（人間の場合、皮膚表面から１５～２０ｍｍ）で体内から捕捉されたNIR信号を最適化するために、大きなナノダイヤモンド粒 子が選択された：FNDP-（NV）-Ｚ－平均～８００ｎｍ（窒素－空孔および約８００ｎｍの平均最大断面積を有する蛍光ナノダイヤモンド粒子）、同一株のより小さな粒子ならびにNVN「カラーセンター」株よりも優れたNIR放出（６５０～７２０ｎｍ）を持つ粒子の株注入直後（標的の臨床手順を想定）、循環からのFNDP-（NV）の急速なクリアランス（４分以内の血清からの５０％のクリアランス）を考慮して、粒子は標的（血管内血餅）に「帰巣」した。おそらく肝臓の細網内皮系による急速な取り込みを介して、FDNP-（NV）の負荷量が調査され、標的イメージングが可能となった。

選択したサイズ（Ｚ－平均～８００ｎｍ）の粒子を体循環に直接投与すると、排泄経路（尿路系または肝胆道系）が起こりそうにないため、粒子が臓器内にとどまる可能性がある。このような懸念は、（培養中の）細胞内の他の同様のサイズの粒子の長期滞留が生物学的機能および生存能力への干渉を示唆したイン・ビトロ研究によって裏付けられている。

短期および長期暴露の両方でラット臓器におけるFDNP-（NV）分布を調査するために設計された本明細書の例は、肝臓への粒子の主な沈着と脾臓への二次沈着を示したが、他の臓器はごく一部しか共有しなかった。興味深いことに、暴露５日間後の肝臓におけるFDNP-（NV）の大量の沈着は、暴露後１４日および１２週間の研究で変化しなかった。

FNDP-（NV）の肝内トポロジー分布に関する現在の調査は、概略、肝臓スライス（5-50μｍ）の従来の蛍光顕微鏡（FM）および共焦点蛍光顕微鏡（CFM）によって実施された。さらに、それぞれ肝細胞および血管内皮のプロキシとして一般的に使用されるヒト肝ガン細胞（HepG2）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）などの細胞へのFNDP-（NV）取り込みの動態に関するイン・ビトロ調査が行われた。イン・ビトロの結果は、肝臓細胞がFDNP-（NV）を取り込む能力、および飲み込まれた粒子の細胞内分布を示した。

材料と方法
FNDP-（NV）-Ｚ－平均～８００ｎｍ：起源と機能化
カルボキシル部分で官能化されたFNDP-（NV）-Ｚ－平均～８００ｎｍは、ADAMAS Nanotechnologies (Raleigh, NC, USA)から購入した。FNDP-（NV）の物理的特性は、以前に報告されたように、８５８±４７ｎｍの平均直径および－５６ｍＶのZ-電位を有するZetasizerNano（Malvern）での動的光散乱によって決定された。滅菌およびBSAでブロックされたFNDP-（NV）は、細胞ベースの研究で使用された。

肝臓標本は以下のように得られた：簡単に言えば、Sprague-Dawleyラットを２ｍＬのPBS中の６０ｍｇ／ＫｇのFNDP-（NV）懸濁液で２～３分かけて大腿静脈に注射した。１２週間後、深部（5％イソフルラン）麻酔下で放血し、１０ｍＬの滅菌生理食塩水で灌流して臓器血管系の残留血液を最小限に抑え、さらに臓器保存のために生理食塩水中の4％パラホルムアルデヒドを灌流して動物を犠牲にした。臓器を注意深く解剖し、過剰な10％中性緩衝ホルムアルデヒド（10％NBF）中に懸濁した。次に、肝臓標本を処理し、パラフィンに包埋して、蛍光顕微鏡（FM）または共焦点蛍光顕微鏡（SCM）による分析のために、それぞれ５または５０μｍのスライスに切断した。この研究で評価された肝臓標本は、IVISによる臓器全体のイメージング後に解剖された離散的で全体的な葉であった。組織病理学的検査では、肝臓標本の5μｍ切片を、独立した組織病理学的評価により、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）およびマッソントリクロームで染色した。

ラット肝臓標本をパラフィンに包埋し、前述のように５または５０μｍの厚さに切片化した。簡単に説明すると、スライドはキシレンで3回連続すすぎ（各５分）、続いて１００％、９５％、７０％、５０％エタノールで2回連続すすぎ（各１０分）、最後に脱イオン水で２回洗浄することで脱パラフィンした。細胞アクチンフィラメントはFITC-ファロイジンで染色された。簡単に説明すると、スライドを、氷上でPBS中の０．４％TritonX-１００と１０分間インキュベートすることによって透過性にした。次に、スライドを室温にてPBSで３回洗浄し、FITC-ファロイジン（PBS中６μｍ）に1時間浸漬した。スライドをPBSで３回洗浄し、核を染色するためにDAPIを含むマウンティングバッファーでマウントした。５μｍの厚さのスライスは、１０倍および４０倍（油浸）の対物レンズを使用して蛍光顕微鏡で分析された。緑の蛍光フィルターセットを使用してFITC-ファロイジン染色マイクロフィラメントを検出し、赤の蛍光フィルターを使用してFNDP-（NV）を検出し、青の蛍光フィルターを使用してDAPI染色細胞核を検出した。

肝臓の矢状断面の全体的なパノラマビューは、FSX１００顕微鏡を使用して4倍の画像を「ステッチ」することによって構築された。５０μｍの切片をFITC-ファロイジンで染色して、緑のチャネルで画像化されたアクチンフィラメントを可視化し、切片を赤のチャネルで画像化してFNDP-（NV）を可視化した。画像はデジタルで収集され、ImageJ 1.51e（NIH、Bethesda MD、USA）でさらに処理された。超低倍率でわずか数ピクセルのサイズであったFNDP-（NV）の視覚化を改善するために、最大エントロピー法を使用して赤チャネルをしきい値処理し、結果を3倍に拡大することによって粒子を拡大した。

ImageJのAnalyzeParticles機能を使用して、画像のしきい値処理後の細胞内のFNDP-（NV）の存在も定量化されたが、拡張はされていない。４倍で単一の連続質量（凝集体）として検出されたFNDP-（NV）のグループをカウントし、サイズを決定した。数ヒストグラムによるサイズ分布は、顕微鏡写真内で検出されたFNDP-（NV）凝集サイズの分布を示すために作成された。ここで、線の高さは、直径によって検出された粒子の部分に対応する。多数の小さな凝集体が少数の総粒子質量を占める可能性があるため、数によるサイズ分布は、小さな粒子サイズの普及を拡大するために偏っていると見なすことができる。このバイアスを減らすために、断面積によるサイズ分布の2番目のヒストグラムも作成された。ここで、線の高さはNIR蛍光領域全体の一部と相関する。

肝臓スライス（１０～５０μｍ）の共焦点画像は、FV１０００走査型共焦点顕微鏡を使用して撮影し、Fluoviewソフトウェア（v4.2.2.9 Olympus）で６０倍の油浸対物レンズを使用して画像化した。3D再構成では、組織の厚さ全体にわたって０．５μｍごとに画像を使用して共焦点スタックを撮影した。核は、４０５ｎｍの励起と４２５～４６０ｎｍの発光によるDAPI染色によって視覚化された。アクチン細胞骨格は、488ｎｍの励起と４００～５００ｎｍの発光でFITC-ファロイジンによって視覚化された。FNDP-（NV）から放出されたNIR蛍光は、５４３ｎｍの励起と６５５～７５５ｎｍの放出で可視化された。Fluoviewでは、2D最大強度投影と断面図が作成された。３次元ビューは、VolumeViewerプラグインを介してImageJで再構築された。

HepG-2（ヒト肝肝細胞ガン）細胞株は、American Type Culture Collection (ATTC) (Manassas, VA, USA)から購入し、１０％ウシ胎児血清（FBS）を含むイーグル最小必須培地 (EMEM, ThermoFisher Scientific)で培養した。初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、Lonza (Basel, Switzerland)から購入し、EGM-2MV培地で培養した。HUVECは、５～８継代の実験に使用した。いずれかの細胞株によるFNDP-（NV）の取り込みは、図1に示すように、いくつかの変更を加えた以前に公開されたプロトコルに従って実行された。簡単に説明すると、細胞を２枚の96ウェルプレートに播種し（ウェルあたり2 x 10⁴細胞）、９０％コンフルエンスまで増殖させた。１枚のプレート（バックグラウンド対照）から培地を除去し、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）１００μＬを添加して細胞を固定した。次に、対照プレートを室温にて２０分間インキュベートし、細胞培養培地で3回洗浄した。続いて、両方のプレート（固定対照およびライブサンプル）の各ウェルから培地を除去し、示されているように０．０２５、０．０５、および０．１ｍｇ／ｍＬのFNDP-（NV）を含む１００μＬの培地と交換し、０．５～２０時間インキュベートした。両方のプレートを、カルシウムとマグネシウムを含むハンクスの平衡塩類溶液 (HBSS, ThermoFisher, and Waltham, MA, USA)で3回洗浄して、余分な粒子を除去した。次に、１００μＬの0.5％Triton X-１００を添加し、オービタルシェーカー上で室温にて一晩インキュベートすることにより、細胞を溶解した。プレートは、分光光度計 (Infinite M２００ Pro, Tecan AG, Mannedorf, Switzerland)を使用して、FNDP-（NV）関連のNIR信号（励起５７０ｎｍ、発光６７０ｎｍ）について読み取られた。PFA固定細胞で対照プレートに取り付けられたFNDP-（NV）から得られた蛍光は、生（活性）細胞から測定された蛍光から差し引かれた。

細胞は、8ウェルチャンバースライド（ThermoFisher）で最大70％のコンフルエンスまで増殖させた。細胞を０．０５ｍｇ／ｍＬのFNDP-（NV）で処理し、２時間または２０時間インキュベートし、上記のように４％PFAで固定した。細胞の固定と透過処理に続いて、細胞を上記のようにFITC-ファロイジンで染色した。スライドからチャンバーを取り外し、DAPI（Vectashield）を含むバッファーとマニキュアで固定されたカバーガラスを使用して取り付けを完了した。次に、保存された肝臓スライスの蛍光顕微鏡で説明されているように、緑、赤、および青のフィルターキューブを使用して、スライドをFMオリンパスIX81で１０倍または４０倍で分析した。

データは平均±SDとして表示する。統計分析は、ANOVA（適切な場合）およびSigmaPlotソフトウェア (SigmaPlot^(R)12 SPSS; Systat Software Inc., San Jose CA, USA)を使用したスチューデントのt検定によって行われた。統計的有意性は、実施された独立した研究の数についてP <0.05で確立された。

結果
保存された肝臓スライスの蛍光顕微鏡（FM）およびパノラマ分析
図２Ａは、１６０倍および４００倍の倍率で画像化された肝臓組織の５μｍスライス内のＦＮＤＰ－（ＮＶ）の分布を示す。2つの代表的な地域が選択されている；１つ目（図2A）は血管要素が存在し、2つ目（図2B）は実質細胞のみの領域である。上のパネルは、FNDP-（NV）の静脈内（i.v.）投与の12週間後に動物から得られた組織を表し、下のパネルは、ビヒクル（PBS）対照動物から得られた組織を表す。FNDP-（NV）（赤で画像化、灰色の陰影で表示）は、白い矢印で識別されるように、右側のパネルのDAPI対比染色で視覚化できる。５～１０μｍの大きな凝集体と、非常に小さなサイズの粒子がはっきりと示されている。細胞内または細胞間の分布を評価するために、左のパネルに示すように、切片をFITC-ファロイジンで染色した。対応する黄色（赤-オーバー-緑）は、粒子のエンドサイトーシスの可能性を示す、より大きな凝集体について視覚化できる（左のパネル（図2Aおよび2B））。図2Aでは、非常に小さな凝集体の赤色の蛍光は、おそらく門脈（PV）内皮を表す可能性のある核の近くに見られるが、ほとんどが実質細胞の位置から静脈空間を識別することがかなり難しい実質に分布している。

図３Ａ～３Ｈは、２つの異なるＦＮＤＰ-（ＮＶ）処置ラットからの完全な矢状断面の複数の倍率での分析を提示する。「ステッチされた」画像の有効倍率が非常に低いため、FNDP-（NV）のNIR蛍光に敏感な赤チャンネルは、メソッドに示されているように、二値化しきい値処理と拡張によって拡大されている。これにより、単一ピクセルのFNDP-（NV）でも定性的な視覚化が可能になる。図３Ａおよび３Ｂは、完全な「パノラマ景観」全体に散在しているが、コア肝小葉ユニット内のそれらの分布に明らかな異なる密度を有する粒子を示している。視覚化を容易にするために、選択した数の肝小葉が「六角形」で示されている。粒子は、静脈系（黄色のボックス）でも簡単に見つけることができる。４つの肝小葉のセット（図３Ｂの青い点線の長方形によって示される領域）の、強調なしの視覚化に適した拡大図が図３Cに提示され、肝小葉内の粒子分布の明らかな不均一性が示されている。単一の小葉（図３Ａからの黄色の六角形）のより高い倍率が図３Dに示されている。視覚化を強化するために、各動物からの１つの代表的な小葉のより高い倍率（図３ＡおよびＢの黄色の六角形によって示される）が図３EおよびFに示されている。しきい値処理および拡張後、肝小葉の「六角形」形成全体での粒子の不均一な分布のより良い図が容易に分かる。粒子の存在は「六角形」の周辺で濃縮されているように見えるが（ランドマークの場合、赤い矢印は中心静脈を示す）、中心静脈の横にもいくつかの粒子がはっきりと存在する。図３ＧおよびＨは、壁に付着しているが、2つの例で、それぞれ、血管断面積の３５％および４８％を占める血管内腔（黄赤遷移によって視覚化される）に著しく突出する粒子（白い矢印）の大きな凝集を伴う静脈系（図３Ａの黄色の四角）を示す。図３Ｉは、一次代謝ゾーンを含む肝小葉の構造の一般的な配向のスキームを提供する。

肝臓の「パノラマ」ビューのFNDP-NV陽性領域のサイズは、上記のように大きく変動する。この分布を定量化するために、FNDP-NV陽性領域のヒストグラムを図４に示す。図４Ａにおいて、個数による領域の分布は、単一ピクセルから直径２０μｍの領域までの多数のＦＮＤＰ－ＮＶ陽性領域を示している。少数であり、図４Ａではほとんど見えないが、大きな凝集体（図３ＧおよびＨ）は、肝臓切片で検出された全粒子の不均衡な塊を表すであろう。総粒子質量のパーセントを表すために、総ＦＮＤＰ－（ＮＶ）陽性面積の分布が図4Bに示されている。面積で見ると、粒子凝集の最頻径は約１４μｍである。1匹の動物では、直径４０～１００μｍの大きな凝集体が静脈系に見られ、FNDP-（NV）陽性領域の２０％を占めているが、２匹目の動物ではこのサイズの凝集体は見つからなかった。

保存された肝臓スライスの共焦点蛍光顕微鏡（CFM）
図5A-5Dは、肝臓切片（１０～５０μｍ）でCFMによって研究された4つの異なる地形セグメントを示している。図5Aにおいて、約５～１０μｍの核周囲粒子の凝集体がいくつか見られるが（黄色の円と矢印）、明確な細胞内位置を確立することはできない。図５Ｂは、門脈正弦波を表す可能性が高い細胞間空間を示し、そのうちのいくつかは、１０～３０μｍでＦＮＤＰ－（ＮＶ）の大きな凝集体を含む（黄色の円および矢印）。濃い赤色は、実質細胞の内部環境から十分に離れた場所（緑色に染色）を示唆しているが、少なくとも部分的な内部移行の可能性を示す黄色も存在する。図5Cおよび5Dは、静脈、動脈、門脈、およびおそらく胆管などのいくつかの非実質構造（実質細胞に囲まれている）を示す。図５Ｃおよび５Ｄでは、いくつかの小粒子凝集体（白い円）が血管内膜の内皮下ゾーンに位置し、一方、実質細胞内に存在するいくつかの凝集体（黄色の円）も注目される。

図６は、組み込まれたＦＮＤＰ－（ＮＶ）の量が異なる肝細胞の共焦点３Ｄ再構成を示している。粒子の質量が異なる2つの領域が示されている。中央のパネルの細胞はほとんど獲得されなかったが、右側のパネルの細胞は非常に大きな粒子が凝集しているように見える。左のパネルは、ビヒクルで処理されたラットを表す。そこでは粒子は確認されない。提供されたすべての例において、これらの細胞の核および核小体は、同じ正常な表現型を示す。

培養HUVECおよびHepG-2細胞へのFNDP-（NV）取り込みの動態
図７Ａ～７Ｄは、様々な濃度および時間経過条件下でのＨＵＶＥＣおよびＨＥＰＧ-２細胞へのＦＮＤＰ-（ＮＶ）取り込みの動態を示す。図７Ａ～７Ｃは、ＦＮＤＰ-（ＮＶ）の３つの異なる曝露レベルでの時間経過を表す。曝露された線量のそれぞれは、細胞体への粒子の急速な取り込みの同じパターンを示した。急速な取り込み段階は１～２時間以内に減衰し、FNDP-（NV）曝露量に比例したプラトーに達する。図７Ｄは、ＦＮＤＰ－（ＮＶ）の３つの濃度での各細胞株について、ＮＩＲ蛍光によってモニターされたＦＮＤＰ－（ＮＶ）の定量的蓄積を表す。蓄積されたFNDP-（NV）の合計の差は、曝露レベル間で統計的に有意ですが、細胞株間で類似している。

図８Ａおよび８Ｂは、イン・ビトロ実験の初期および後期段階でのＦＮＤＰ－（ＮＶ）蓄積のＦＭ顕微鏡写真である。初期段階（最大2時間）は主に細胞質に粒子を示し、最終時点（２０時間）は核周囲コロナの形で重い凝集を示す。このようなパターンは、図6Cに示すように、保存された肝臓スライス（曝露後１２週間）でも記録された。

細胞質分裂の終わりまでの初期の有糸分裂におけるＨＵＶＥＣの画像が、ＦＮＤＰ-（ＮＶ）で２０時間処理された細胞については図９Ａに示され、未処理の対照細胞については図９Ｂに示されている。すべての処理された細胞は、後期細胞質分裂および細胞分離を含む、重い核周囲FNDP-（NV）蓄積を示す。対照群でも同様の観察がなされた。

考察
無傷のラットに注入された高用量（６０ｍｇ／Ｋｇ）のFNDP-（NV）の総分布が特徴づけられ、それらの傾向が、FNDP-（NV）曝露後、急性（９０分間）、亜急性（５または１４日間）、および長期（１２週間）にわたって追跡された。６つの臓器（肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、脳）にわたる粒子分布の分析により、肝臓がこれらの粒子の主要な貯蔵臓器であることが確認された。臓器組織学の評価では、FNDP-（NV）に関連する肉眼的または組織病理学的な悪影響は明らかにならなかった。FNDP-（NV）に関連する悪影響の欠如は、報告されている正常な肝機能検査と一致する。

上記のように、肝臓に多数のFNDP-（NV）粒子が持続すると、概略、特に長期滞在、場合によっては無期限の存在という状況において、潜在的な悪影響について懸念が生じる。このような見通しは、規制上のハードルを高め、人間が使用するためのGLP（優良試験所規範；Good Laboratory Practice）前臨床開発に影響を与える可能性がある。前述の認定病理報告は組織病理学的所見の欠如を確認したが、本調査は3つの主要な目的に取り組むことを目的とした：１．肝細胞の細胞内位置を含むさまざまな肝細胞におけるFNDP-（NV）分布の包括的な調査。２．肝小葉の微小血管系におけるFNDP-（NV）の局在化。３．HUVEC（内皮）およびHepG-2（ヒト肝ガン）細胞などの代理（プロキシ）細胞培養を使用する、培養肝細胞へのFNDP-（NV）粒子の取り込みの動態とそれらの細胞内分布の探求。

この研究の主な成果は次のとおりである：１．実質細胞（肝細胞）、非実質細胞（血管内皮細胞および外膜細胞）ならびに静脈供給（門脈）および排液（中心静脈）系を含む肝小葉におけるFNDP-（NV）の空間分布の独特なパターンの明確化。２．イン・ビボおよびイン・ビトロでの肝細胞におけるFNDP-（NV）の細胞内取り込みおよび区画化の実証。３．核周辺空間に粒子の大きなコロナを有する細胞を含む肝細胞の正常なマクロおよびミクロの形態学的表現型の保存の確認。４．有糸分裂後期から細胞質分裂の完了、広範な核周囲コロナを有する細胞を含む細胞複製までの、生存可能な細胞質分裂プロセスの保存。

完全な「パノラマ」ディスプレイ（図３Ａ～３Ｂ）全体にわたるFNDP-（NV）の分布は、肝臓の「六角形」小葉全体に見られる反復パターンを明らかにした（図3Ｄ、３Ｅ、および３Ｆを参照）。粒子凝集体は、「ポータルトライアド」（PT）を取り巻く肝小葉の周辺でより多く見られたが、CVの近くのより近位の領域ではかなり不足していた。このような分布のメカニズムは現在明確でないが、肝小葉全体でのFNDP-（NV）のこの種の空間分布は、いくつかの収束要因の結果である可能性があると仮定されている。

第１に、PVを介したFNDP-（NV）の送達では、類洞の直径にかろうじて収まるか、それを超えるサイズの凝集粒子を頻繁に提示した。図４Ａに示すように、検出されたFNDP-（NV）凝集体の３０～４０％が７μｍを超えていたため、理論に拘束されることを望まないが、類洞のより近位の部分で機械的に捕捉される傾向があった。これは個数でFNDP-（NV）陽性領域の大部分を占めてはいないが、これらの粒子は全FNDP-（NV）陽性領域の７５～８５％を占め（図４Ｂ）、それは、小葉内の強い蛍光バイアスを説明している可能性があり、相当数の小さな凝集体（個々のまたは限定された複製）は、さらに類洞を下って移動し、類洞を横切り、体循環で再循環するにも関わらず、中心静脈（CV）への類洞の入口に小さな粒子が存在することは、この可能性を支持する（図３Ｄおよび３Ｇを参照）。

第２に、肝臓のスカベンジング機能（細網内皮系、RES）を提供するクッパー細胞は、一般に正弦波に豊富に存在し、PVから出る類洞の近位ゾーンにさらに豊富に存在する。これらのマクロファージ様細胞は、データによって示されるように、FNDP-（NV）の場合、CVゾーン上のPVのより近位でそれらの沈着を増強する、小さい粒子よりも大きい粒子に対して優先的な動力学で粒子を急速に除去する。

第三に、類洞／細静脈の末端ゾーンは、一般に、PVからの正弦波の出口よりも「広々」している。このような解剖学的構造は、血行力学的状態をサポートし、CVへの粒子のクリアランスを促進し、さらに体循環へと移行し、それによってCV付近の粒子の相対的な不足に寄与する。

第４に、静脈微小循環系は、肝小葉の最も繊細な生化学的機能を確保する上で重要な要素である。本明細書に記載のデータは、肝小葉（ペリPT）の外周における増強された存在、および小葉全体のわずかであるが注目に値する小さな粒子とともに、PVおよびおそらくCVにおける大きな粒子凝集体の存在を明確に示している（図３Ｅを参照）。これらの空間内の粒子は、類洞の血流の微妙なバランスを妨げ、血行力学的障害（乱流など）や流れを妨げる鬱血を引き起こす可能性がある。流れの中断は、酸素の供給と実質細胞への栄養素の分配に影響を及ぼし、それによって肝臓の合成および異化機能に悪影響を与える可能性がある。類洞の微小血行力学的障害を直接除外することはできないが、詳細な組織学的分析（補足資料）では、血液のうっ血（部分的な血流の遮断による）、血栓症（停滞による）、または微視的レベルでの虚血性の結果の領域を観察できなかった。

それにもかかわらず、FNDP-（NV）分布の地形的不均一性は、依然として生理学的影響をもたらす可能性がある。粒子の質量またはサイズ、細胞内位置の局在化、および未成熟の微小血行動態因子（研究終了時）の御陰で、肝ユニット全体の解剖学および生理学への異常な結果を示す。粒子のより大きな凝集体が最も一般的であった（図３Ｈのゾーン１を参照）、肝小葉の周辺ゾーンは、肝臓における多くの重要な生化学的および細胞生存機能（例えば、脂肪酸酸化、糖新生、胆汁産生、生体異物代謝および再生細胞補充）の場所である。

微小環境での肝臓形態の可能性のある保存のサポートは、図６Ａおよび６Ｂに示されている。肝臓表面全体のパノラマ野にわたる位相幾何学的調査は、粒子のパーセントとそれらが占める領域が全体のごく一部（または中程度）にすぎないことを示唆している。この原稿に示されているデータは１２週間前に発生した状況を評価したものであるため、FNDP-（NV）後の急性曝露を拒否することはできない。

最後に、細胞培養研究を実施して、単離された系における肝臓細胞とFNDP-（NV）との直接相互作用に関する洞察を得て、粒子の内在化、区画化、および粒子の存在下での細胞質分裂能力の生存率の動態を調査した。それぞれのヒト肝細胞および内皮細胞の代理として使用される２つの異なる細胞型は、時間および濃度に依存して、細胞へのFNDP-（NV）の急速な初期取り込みを示した。このイン・ビトロ研究は、非スカベンジング肝細胞（肝細胞）へのFNDP-（NV）の細胞内取り込みのイン・ビボ観察をサポートしている。

まとめ
この作業では、FNDP-（NV）-Z-８００ｎｍと肝臓細胞とのイン・ビトロおよびイン・ビボでの相互作用を調べた。これらの研究は、細胞および細胞内の解像度、実質細胞および非実質細胞、ならびに微小循環におけるそれらの存在の観点から、FNDP-（NV）沈着の規模および程度に取り組んだ。 イン・ビボデータは、イン・ビトロで実施された研究（HUVEC、HepG-2細胞）によって補完され、これらの代理肝細胞における粒子の取り込みと集合の直接的な速度論的研究は、動物全体の曝露研究から得られた結果を裏付けた。まとめると、上記のデータは、FNDP-（NV）の肝臓の生体適合性を強く示唆している。これは、細胞の表現型、細胞骨格、核構造の保存、および細胞質分裂と細胞複製の低下に関して異常な結果を特定できなかったためである。このように、FNDP-（NV）は、静脈内曝露経路によってFNDP-（NV）に曝露されたヒトによって十分に許容される可能性がある。

実施例２
次の例では、イン・ビボで報告されている薬物動態（Cmaxおよび最下点）内の曝露レベルでFDP-NV～800にイン・ビトロ曝露された、培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト肝がん細胞株（HepG-2）における
細胞および生化学的機能について記載する。

ナノ医薬は、過去10年間にPubMedにリストされた25,000以上の記事から明らかなように、強力な前臨床研究と新たな臨床探索研究を特徴とする急成長中の医療分野である。ナノ医薬は、合成有機分子や人工生物を超えた製薬技術の「第3の足」を提供する。ナノ医薬は、生物学的に活性なナノ粒子を特定の細胞、臓器、または病理学的プロセスに向けることを目的とした添加剤と結合した多様な材料に基づいて構築されている。

現代の主な関心事は、固有の特性（例えば、「カラーセンター」など）または有機蛍光添加剤によるコーティングのいずれかによって蛍光を生成する電磁刺激（励起光）に応答して近赤外光を放出するように加工された粒子である。NIRで放出する機能は、身体構造自体のイメージング、または最先端のイメージング技術（例えば、MRI/磁気共鳴イメージング、超音波など）の補助として、治療薬の標的送達の可能性を開く。

特に興味深いのは、窒素－空孔(FDP-NV-)を保持する、ナノダイヤモンド粒子や蛍光性ダイヤモンド粒子のようなダイヤモンド粒子であり、当該粒子を、５８０～６２０ｎｍでの励起時に蛍光性とし、７２０～７４０ｎｍのピーク範囲の近赤外（NIR）放出を生じさせることができる。そのような粒子のNIR光放出は、水やオキシヘモグロビンなどの生物学的要素によって並外れた安定性と無視できる程度の干渉を示す。さらに、これらの粒子の表面は、有機小分子からポリマー、タンパク質、核酸に至るまで、さまざまな結合の機会を提供するさまざまな化学基（カルボキシル、アミンなど）で官能化することができる。

この開示の文脈の中で、ヘビ毒ディスインテグリン、ビチスタチン（Bit）と結合したバイオエンジニアリングされた蛍光性ダイヤモンド粒子-NV-Z～８００ｎｍ（FDP-NV）が発見され、FDP-NV～８００ｎｍ/Bitは、血小板フィブリノーゲン受容体αＩＩｂβ３インテグリンに特異的に結合することが、（イン・ビトロおよびエクス・ビボで）で示された。
その後、イン・ビボ研究により、ラット頸動脈で急性的に生成された（医原性）血餅へのFDP-NV-Bitの結合が実証された。まとめると、FDP-NV～８００ｎｍ/Bitは、イン・ビボでの標的ホーミングを示し、したがって、高リスクの血管血栓の診断ツールとして役立つ可能性を示した。

研究の後に3つの安全性および生体適合性研究が続き、BSAによってブロックされたFDP-NV～８００ｎｍ（FDP-NV）の高用量（60 mg/Kg、単回静脈内ボーラスとして送達）が無傷のラットに注入されて、薬物動態プロファイル、臓器分布が確立され、血液学的、代謝的、生化学的安全性バイオマーカーの包括的なパネルを評価した。これらの研究では、5日から１２週間の追跡期間内に、FDP-NVは主に肝臓と脾臓に分布し、肺、心臓、腎臓にはほとんど見られなかったことが分かった。さらに、FDP-NV粒子に関連する特定の組織病理学的観察は観察されなかった。しかしながら、これまでのところ、FDP-NV-８００ｎｍに曝露された内皮細胞または肝実質細胞における急性の安全性または毒性学的影響の可能性を扱った研究はない。

この例では、2つの異なる細胞型、HUVECとHepG-2を使用して、FDP-NV-８００ｎｍに関連する可能性のある直接的な毒性効果の検索を検討した。これらの細胞が選択されたのは、内皮細胞が体循環に注入されたときのFDP-NVへの最初の曝露であり、肝細胞が循環FDP-NVの主要な貯蔵所であるためである。FDP-NV曝露レベルは、曝露後９０分での最大血中レベルとその最下点を含むイン・ビボで観察された急性薬物動態レベルに従って選択された。FDP-NV-８００ｎｍを使用した急性生体適合性研究は、公開された文献でまだ報告されていないことを考慮すると、ここで紹介する研究が、ヒトでの意図された臨床開発をサポートするFDP-NVの急性生体適合性に関する新しい情報と洞察を提供する。

データは全体として、培養HUVECでのC_max曝露での短期間の増殖に関してFDP-NV-８００ｎｍの妥当な生体適合性を裏付けている。HepG-2は、同じ曝露と時間で影響を受けていない。

方法
多様な細胞および生化学的機能がモニターされ、要約すると、細胞の完全性と重要な機能に関する洞察が得られる。細胞増殖、遊走、および再生は、定量的顕微鏡検査によって評価された。ミトコンドリア（酸化）機能はMTTレドックス反応によって試験され、サイトゾルエステラーゼ活性はカルセインAMアッセイによって研究された。ER-ストレスバイオマーカーは、シャペロンCHOPとBiPによって調べられ、アポトーシスは、ウエスタンブロット（WB）を使用したカスパーゼ-3活性化によって調べられた。MAPK Erk1/2シグナル伝達は、タンパク質のリン酸化（P-Erk 1/2）の検出と、細胞核への移行によって評価された。

結果
HUVEC細胞を１００μｇ／ｍＬのFDP-NV（Cmax）に曝露すると、細胞増殖、細胞質ゾルのエステラーゼ活性、および酸化機能に対する潜在的な悪影響が示唆された。細胞シグナル伝達（MAPK Erk1/2）およびER-ストレスバイオマーカーは、アポトーシス促進経路の活性化（カスパーゼ3活性化）と同様に無傷のままであった。同様の曝露と時間枠で、HepG-2細胞で異常なテストは観察されていない。これは、いくつかの曝露レベルでのいくつかの研究で回復力を示した。

材料と方法
ナノ粒子の調製
カルボキシル官能化FDP-NV～８００ｎｍ（FDP-NV）はADAMAS Nanotechnologies (Raleigh, NC, USA)から購入した。FDP-NVは、70％エタノールに懸濁して室温（RT）で15分間消毒した後、RTで2900 x gで7分間遠心分離して、粒子を分離した。粒子上の潜在的な非特異的タンパク質結合部位の受動的遮断は、３％BSA（ウシ血清アルブミン、Sigma, St Louis, MO, USA）を含有するPBS（リン酸バッファードサリン、pH=7.4, ThermoFisher Sci., Waltham, MA, USA）で、３７℃にて１時間インキュベーションすることによって実行した。FDP-NV-BSAは、上記のように遠心分離によって単離され、粒子はPBS中の１ｍｇ／ｍＬのストック溶液として、４０℃にて保存された。

さまざまな分散剤におけるFDP-NV-８００ｎｍのZ平均およびゼータ電位の分析
BSA（FDP-NV-BSA）または「ナイーブ」（FDP-NV-COOH、pre-BSAブロッキング）でブロックされた粒子は、細胞実験（下記参照）で使用される種々のプロトコルに従って、
脱イオン（DI）水、PBS、または培地に懸濁された。HepG-2（ヒト肝肝細胞ガン）細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）(ThermoFisher Sci.)およびペニシリン/ストレプトマイシン(ThermoFisher Sci.)）を懸濁したイーグル最小必須培地(EMEM, ThermoFisher Sci.)で培養し、HUVECは、EGM-2MV培地(Lonza, Basel, Switzerland)で培養した。粒子を分散剤として各培地に０．５ｍｇ／ｍＬの密度で懸濁し、デュアルパーパスキャピラリーキュベット（総量1 mL）に入れた。サンプルはZetasizer Ver. 7.11 (Malvern Panalytical Ltd., Malvern, UK)で試験した。

細胞計数アッセイ
細胞計数を実行した。HepG-2細胞株は、American Type Culture Collection (ATTC) (Manassas, VA, USA)から購入した。一次HUVECはLonzaから購入し、5～8継代の間で実験に使用した。上記のように、細胞はそれぞれの培地で維持された（5％CO₂雰囲気で３７℃）。HepG-2およびHUVECを９６ウェルプレートに「播種」し（１００μＬ培地でウェルあたり2 x 10³）、FDP-NV-BSAで２４時間処理し、または未処理とした。各実験では、細胞周期増殖阻害剤であるビンクリスチン（５０μｇ／ｍＬ）を陽性対照として添加した。24時間後、培地を除去し、細胞を4％パラホルムアルデヒド(PFA, ThermoFisher Sci.)で固定し、DAPI（4’,6-ジアミノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩、ThermoFisher Sci.）を使用して核を染色した。核の可視化に１００倍の倍率とDAPI（青いフィルター）を使用し、FNDP-NV-BSAの可視化にTRITC（赤いフィルター）を使用する、蛍光顕微鏡 (Olympus IX81, Olympus, Tokyo, Japan)で、各ウェルにつき７つの観察野をイメージングすることによって、プレートを分析した。各野の生細胞数は、デジタル設定のセルカウンターを備えたImageJソフトウェア(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)を使用したDAPI染色核の分析によって決定した。

MTTアッセイによってモニターされた細胞代謝活性
MTTアッセイは、製造元のプロトコルに準拠して、成分A（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT））および成分B（SDS（ドデシル硫酸ナトリウム））で構成される細胞増殖アッセイキット(ThermoFisher Sci.)を使用した比色アッセイとして実施した。簡単に説明すると、HepG-2細胞およびHUVECを96ウェルプレートに、各細胞タイプについて上記の培地中ウェルあたり1x10⁴細胞の密度で播種した。細胞をFDP-NV-BSAまたはビンクリスチン（50μｇ／ｍＬ）で24時間処理し、または未処理とした。培地（１００μＬ）を、MTT成分Aを含むフェノールレッドフリーDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）(ThermoFisher Sci.)に変更した。プレートを４時間インキュベートし、等量の10％SDS（キット成分Ｂ）を添加して細胞を溶解した。プレートを一晩インキュベートし、ELISAプレートリーダーELx800(BioTek, Winooski, VT, USA)を使用して５６２ｎｍの波長で読み取った。

カルセインAM細胞サイトゾルエステラーゼアッセイ
HepG-2細胞およびHUVECの播種および処理は、MTTアッセイについて上記したように実施した。細胞を無血清培地で５μｇ／ｍＬのカルセインAM (ThermoFisher Sci.)で処理し、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートは、４８５ｎｍの励起および５３０ｎｍの発光波長を備えた蛍光マイクロプレートリーダーFLx800（BioTek）を使用して読み取られた。

「創傷治癒」（WH）イン・ビトロアッセイ
HUVECを１２ウェルプレートに播種し、８０～９０％のコンフルエンシーになるまで１～２日間維持し、FDP-NV-BSAで２４時間処理し、または、未処理とした。コンフルエントなHUVEC細胞（単層）は、プラスチック製のスパチュラチップを使用してプレート全体に「穏やかな擦過」をかけ、約１ｍｍ幅のギャップ領域（細胞がない）をもたらした。FNDP-NV-BSAで処理された細胞は、培地を2％FBSを含むものに交換することによって、２４時間の遊走時間で刺激した。対照細胞（FNDP-NV-BSAに曝露されていない）は、２％FBSによって刺激された陽性と、遊走の刺激因子が０．１％FBSに最小化された陰性（HUVECはFBSの完全な除去に敏感で、表面から分離する）に分けた。上記のように、細胞を４％PFAで固定し、DAPIで染色した。スクラッチの画像化は、蛍光顕微鏡（Olympus IX81）で20倍の倍率で、核の可視化にはDAPI（青色のフィルター）、FNBDP-NVの可視化にはTRITC（赤色のフィルター）で行った。対照プレートには、PFA曝露の直前に同じスクラッチを受けたコンフルエントな細胞が含まれていた。移動指数は、ImageJソフトウェアを使用して、画像の無細胞領域の総表面積を測定することによって推定した。

MAPK Erk1/2のリン酸化によって表される細胞シグナル伝達アッセイ
MAPK Erk1/2 HepG-2細胞およびHUVECを直径６ｃｍのペトリ皿で９０％のコンフルエントまで培養し、上記のようにFDP-NV-BSA（密度０．１ｍｇ／ｍＬ）で処理し、または、未処理とした。細胞を２４時間血清飢餓状態にした後、２％FBSで０、１０、および２０分間刺激した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤(Sigma Inc.)の「カクテル」および「Halt」ホスファターゼ阻害剤カクテル(ThermoFisher Sci.)を含む氷冷RIPA（放射免疫沈降アッセイ）バッファー(Teknova Inc., Hollister, CA, USA)で溶解した。

タンパク質溶解物（20μｇ）を、Mini-PROTEANプレキャストグラジエント（4-20％）ゲル(Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)を使用してSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に塗布し、セミドライブロッティングシステム(Bio-Rad Inc.)を使用してPVDF（ポリビニリデンジフルオリド）膜(Sigma Inc.)に転写した。ホスホおよびトータルErk1/2（膜の「ストリッピング」後）の存在は、ポリクローナル抗体(Cell Signaling Techn., Danvers, MA, USA)を使用して検出した。膜上のタンパク質バンドの可視化は、C-DiGit Blot Scanner (LI-COR Biosci., Lincoln, NE, USA)を使用して実行した。バンドの強度は、UN-Scan-Itソフトウェア(Silk Scientific Corp., Orem, UT, USA)を使用して定量化し、リン光物質-Erk1/2と総Erk1/2の比率を計算した。

ホスホ-Erk1/2の核転座
細胞溶解物の分画
HepG-2細胞およびHUVECは、直径６ｃｍの皿で増殖し、FDP-NV（0.1 ｍｇ／ｍＬ）で処理し、または、未処理とし、MAPK Erk1/2細胞シグナル伝達についての上記と同じ条件下で「飢餓状態」にした。２５０ｎｍ TPA（テトラデカノイルホルボールアセテート、Sigma Inc.）に15分間曝露することにより、細胞を刺激した。細胞の分画は、培養細胞用細胞内タンパク質分画キット(ThermoFisher Sci.)を使用して、製造元が提供するプロトコルに従って実行した。画分の細胞質および核抽出物を、上記のようにホスホおよびトータルMAPK Erk1/2を使用するWBによって分析した。細胞質画分と核画分の検証は、それぞれ抗Mekポリクローナル抗体と抗HDAC1ポリクローナル抗体(Cell Signaling Techn.),を使用したWB分析によって行った。

細胞質および核におけるリン酸化MAPKErk1/2の検出のための免疫細胞化学
８ウェルスライドガラスで培養した細胞の免疫染色は、前述のように実施した。細胞は、TPAの存在下または非存在下で０．１ｍｇ／ｍＬのFDP-NV-BSAで処理し、または、未処理とした。ポリクローナル抗リン酸化Erk1/2抗体(Cell Sign. Techn.)を、FITCタグ付きヤギ抗ウサギIgG (Vector Labs Inc., Burlingame CA, USA)と組み合わせて使用した。400倍の倍率でオイル対物レンズならびにリン酸化MAPK Erk 1/2の検出にFITC（緑色のフィルター）およびFNDP-NVの検出にTRITC（赤色のフィルター）を使用する蛍光顕微鏡（Olympus IX81）を使用して、スライドを分析した。

細胞アポトーシスアッセイ（カスパーゼ-3）および小胞体（ER）-ストレスバイオマーカー
HepG-2細胞およびHUVECは、上記のように０．１ｍｇ／ｍＬ FDP-NV-BSAで処理した（または未処理とした）。ビンクリスチン(vincristine)（２００μｇ／ｍＬ）による治療をアポトーシスの陽性対照として使用し、ツニカマイシン(tunicamycin)（２５μｇ／ｍＬ）による治療を小胞体ストレスの陽性対照として使用した。アポトーシスの検出には、切断されたタンパク質と切断されていないタンパク質の両方を認識するカスパーゼ3 (Cell Sign. Techn.)に対するウサギポリクローナル抗体を使用した。小胞体ストレスの検出には、BiPに対するウサギmAb（クローンC50B12）およびChopに対するマウスmAb（クローンL63F7）（両方ともCell Sign. Techn.から）を使用した。タンパク質の均等なローディングは、膜ストリッピングおよび抗アクチンマウスモノクローナル抗体(Sigma Inc.)による再プロービングによって検証した。

結果
種々の種媒体に懸濁したFDP-NV～８００ｎｍの物性特性
FDP-NV～８００ｎｍは、粒子径（Z平均）および表面ゼータ電位を変更することが知られているさまざまな分散剤に懸濁した。図１０は、ＤＩ水、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）、または、細胞培養のそれぞれに使用される培地に懸濁された、ＦＤＰ－ＮＶ－ＣＯＯＨ（ＢＳＡの受動吸収のない天然粒子）またはＦＤＰ－ＮＶ－ＢＳＡの直径（Ｚ平均）の変化を示す。FDP-NV-COOHをPBSに懸濁するとＺ－平均の実質的かつ統計的に有意な増加が観察され；粒子サイズは、７７８ｎｍ（DI水懸濁液）から１４８８ｎｍ（PBS）、１２１５ｎｍ（HUVECメディア）、および１４０３ｎｍ（HepG-2セルメディア）にそれぞれ増加した。粒子の表面でのBSAの受動吸収（FDP-NV-BSA）は、それぞれの溶液で観察された増加を中和した。ゼータ電位は、等電点へのより正の電荷に向かう傾向で、実質的に影響を受けた（例えば、図１０Ｂ）。DI水に分散したFDP-NV～８００ｎｍ-COOHのゼータ電位は-47.9 mVであったが、粒子をPBSに浸漬すると-21.9 mV、HUVEC培地では-9.9 mV、HepG-2細胞培地では-10.9mVに増加した。しかしながら、Z平均への影響とは異なり、BSAによるFDP-NVの受動コーティングは、FDP-NV-COOHのゼータ電位に最小限の影響しか与えなかった。HUVECまたはHepG-2に使用された培地はＺ－平均またはゼータ電位のいずれかへの影響に違いがなかったことは注目に値する。

HUVECまたはHepG-2細胞増殖に対するFDP-NVの効果
HepG-2細胞株は、24時間にわたる細胞数の増加から推測されるように、FDP-NV-BSA（最大０．１ｍｇ／ｍＬ）の存在による影響を受けなかった（図１１Ａ）。対照的に、高濃度のFDP-NV（0.1 ｍｇ／ｍＬ FDP-NV-BSA）に曝露されたHUVECは、細胞数が約60％に統計的に有意に減少したことを示した。HUVECの曝露後の影響は、より低い濃度（1/10）の粒子には観察されませんでした（図１１）。予想通り、ビンクリスチンは、HepG-2およびHUVECにおいて、それぞれ、対照の５０％および８０％に増殖を抑制した。０．１ｍｇ／ｍＬ FDP-NV-BSAで２４時間処理した細胞の代表的な画像により、細胞への粒子の蓄積および、特にHUVECでの核周囲の凝集が確認された（図１１Ｄ）。同様に、それほど目立たないが、ＨｅｐＧ-２細胞も、細胞質におけるＦＤＰ-ＮＶ-ＢＳＡの蓄積および核周囲コロナの形成を示した（例えば、図１１Ｃ）。この観察結果は、両方の細胞タイプで最近報告された研究と一致する。

培養HUVECまたはHepG-2細胞の酸化還元強度に対するFDP-NV-BSAの効果
MTTによって評価された培養HepG-2細胞の酸化還元状態は、Cmax（０．１ｍｇ／ｍＬ、図１２Ａ）を含むいくつかの濃度でFDP-NV-BSAの存在に対して回復力があった。対照的に、HUVECは、薬物動態学的血中濃度のCmaxおよび最下点（０．０１ｍｇ／ｍＬ）内の曝露レベルで酸化能力の低下を示した。しかしながら、より低い試験濃度のＦＤＰ－ＮＶ－ＢＳＡ（０．００１ｍｇ／ｍＬ）では、ＭＴＴ活性は、未処理の対照のそれと区別がつかない（図１２Ｂ）。陽性対照であるビンクリスチンは、両方の細胞型について、酸化還元活性を正常対照の約２５～３０％に減少させた。

HUVECまたはHepG-2細胞の細胞質ゾルエステラーゼ活性に対するFDP-NV-BSAの効果
カルセインAMアッセイは、細胞質ゾルの非特異的エステラーゼ活性に関する情報を提供した。図１３は、ＨｅｐＧ-２細胞（図１３Ａ）におけるこの試験の逸脱を示さないが、ＨＵＶＥＣ（図１３Ａ）は、０．１ｍｇ／ｍＬのＦＤＰ-ＮＶの濃度で約３０％の減少を示し、最下点レベルの暴露（０．０１ｍｇ／ｍＬ）で干渉を示さなかった。

イン・ビトロでの「スクラッチ」損傷モデルにおいてFBSによって刺激されたHUVEC遊走に対するFDP-NV-BSAの効果
細胞遊走に対するFDP-NV-BSAの効果を、「創傷治癒」のイン・ビトロモデルで調査した（「スクラッチアッセイ」、図１４）。（コロニーのクラスターを形成する）HepG-2の成長パターンがこの試験に適していなかったので、このアッセイはHUVECにのみ適用した。人工的に生成された無細胞領域（スクラッチの領域）を横切る細胞移動の定量化は、対照、未処理の細胞、およびFDP-NV-BSAに曝露された細胞の間に差がないことを明らかにした。２％FBSで処理されたHUVECは、高濃度の粒子（０．１ｍｇ／ｍＬ、図１４Ａ）にさらされた場合でも容易に移動した。興味深いことに、蛍光顕微鏡画像は、（「スクラッチゾーン」に移動する）活性細胞および、スクラッチゾーン外部に位置する「静止」細胞において、（青と赤の色が重なり、灰色の異なる色合いで示される）内在化されたFDP-NV-BSAの視覚的に類似した粒子負荷を明らかにした（図１４Ｂ）。

HUVECおよびHepG-2細胞におけるMAPKErk1/2の活性化に対するFDP-NV-BSAの効果
図１５は、刺激後の２つの時点（１０分および２０分）で、０．１ｍｇ／μＬのＦＤＰ－ＮＶ－ＢＳＡに曝露されたまたはされなかったＨＵＶＥＣ細胞とＨｅｐＧ－２細胞との間のＭＡＰＫ Erk1/2のＦＢＳ誘導活性化に有意差を示さない。興味深いことに、HepG-2細胞は１０分でFBS刺激のプラトーに達したが（図１５Ａ）、HUVECは２０分でMAPK Erk 1/2の最大リン酸化に達した（図１５Ｂ）。

細胞質ゾルから核へのタンパク質の転座は、FNDP-NVの核周囲への強い蓄積によって影響を受ける可能性のあるパラダイムの1つである。したがって、リン酸化MAPK Erk 1/2の核への転座は、このプロセスの適用された刺激因子であるTPAを使用して試験した。このために、細胞を分画し、細胞質および核画分中のリン酸化および総MAPK Erk1/2をWB（図１６Ａ～１６Ｂ）および蛍光顕微鏡（図１６Ｃ～１６Ｄ）によって評価した。HepG-2細胞（図１６Ａ）およびHUVEC（図１６Ｂ）は、それぞれの核または細胞質におけるホスホ/総MAPK Erk1/2の量において、FND-NV-BSA曝露細胞と対照（曝露なし）細胞の間に差を示さなかった。ＴＰＡへの曝露は、ＦＤＰ－ＮＶ－ＢＳＡの内在化および核周囲蓄積を増強し、これは、蛍光顕微鏡画像において、強い黄色（赤と緑の重複（図１６Ｃ～１６Ｄ））として観察され得ることに留意されたい。

アポトーシスと小胞体ストレスの誘導に対するFDP-NV-BSAの効果
FDP-NV-BSAの細胞質への内在化および核周囲の蓄積は、アポトーシスまたは小胞体ストレスの活性化によって現れるストレス状態につながる、核と細胞質ゾルの間の必須のトラフィックへの干渉の可能性を示唆している可能性がある。したがって、ＷＢを使用して、HepG-2細胞およびHUVECバイオマーカーの両方を、カスパーゼ3の活性化や発現シャペロンタンパク質であるCHOPやBiPなどのストレス条件について評価した（図１７）。FDP-NV-BSA（０．１ｍｇ／ｍＬ）への曝露は、ビンクリスチン（陽性対照、図１７Ａ）とは対照的に、どちらの細胞でもカスパーゼ3の活性化をもたらさなかった。FDP-NVの強力な核周囲蓄積は、実験時間内に影響を与えることなく持続するようである。2つのシャペロンタンパク質であるCHOPとBiPの発現も、FDP-NVの存在による影響を受けなかった。さらに、HepG-2とHUVECとの間に明らかな違いはなかった（図１７Ｂ）。どちらのタイプの細胞もツニカマイシンに感受性があり、ツニカマイシンは小胞体ストレスタンパク質の活性化の標準的な対照として機能しました。

考察
現在の一連の実験は、FDP-NV（８００ｎｍ）の安全性を調査することを目的としており、第Ｉ期臨床試験についての優良試験所規範（GLP）および適正製造規範（Good Manufacturing Practice; GMP）を開始する前に、これらの粒子の前臨床評価の一部を構成する。無傷のラットに比較的高用量で静脈内投与されたFDP-NV-８００ｎｍの安全性と忍容性、高い生体適合性は、曝露後５日間、１４日間、または１２週間にわたってモニターされた罹患率と死亡率の欠如から推測されると見られた。これらの研究のすべてで、肝臓、腎臓および肺における血球数および差異や組織病理学的観察を含む異常な血液学的および生化学的機能は検出されなかった。さらに、高用量のFDP-NV-８００ｎｍの急性注入後の薬物動態範囲は、体循環からの急速なクリアランスと肝臓および脾臓への急速な上昇を示した。肝臓と脾臓に沈着した粒子は、12週間の追跡期間にわたって保持されたことに注意することが重要である。

現在の実験は、イン・ビボでの組織学的および組織化学的バイオマーカーでは識別できなかった潜在的な生化学的結果へのより深い洞察を得るために急性イン・ビトロ設定でFDP-NV-８００ｎｍの潜在的な悪影響に対処するように設計された。同じFDP-NVサイズ（～８００ｎｍ）を調査している公開データの記録が見つからないため、このような研究は正当化される。
さらに、急性安全性バイオマーカーは、曝露後の代償メカニズムのために、亜急性または慢性投与試験で表示されない場合がある。

ナノダイヤモンド粒子と細胞機能との有害な相互作用は、さまざまな粒子サイズ、形状、およびアジュバントを使用しているにもかかわらず、すでに報告されている。これらの報告は、細胞機能、特に粒子の注入中およびその直後に最大血中濃度（Cmax）にさらされる細胞の機能に対するFDP-NV～８００ｎｍの影響を調査することの重要性を強調している。当然のことながら、内皮細胞と循環血液細胞は、急性の高線量被ばくの主要な標的であり、肝臓細胞も同様であり、FDP-NV-８００ｎｍの即時リポジトリとして機能する。実際、HUVECおよびHepG-2細胞を使用したFDP-NV～８００ｎｍでのパイロット研究では、これらの細胞の各細胞質への粒子の取り込み（１～２時間以上）と、最終的な核周辺ゾーンの集合により、暴露後２０～２４時間にわたって「コロナ」が形成されることが明らかになった。しかし、これらの標的細胞の細胞形成と細胞分裂は維持されており、細胞周期と核内外への輸送は無傷のままであったことを示唆している。

本研究は、細胞増殖、遊走、シグナル伝達小胞体ストレス、細胞の完全性の要であるアポトーシスなど、追加の重要な細胞機能と生化学的プロセスを精査するために観察を拡張する。本研究は、イン・ビボ（ラット）実験における高用量（６０ｍｇ／Ｋｇ）注入後に得られた薬物動態データに従った。この明細書に記載されている研究では、培養細胞は２４時間にわたってCmaxレベル（注入直後、０．１ｍｇ／ｍＬ）または最下点（０．０１μｇ／ｍＬ、注入後90分）に曝露された。

電解質、タンパク質、およびさまざまな有機添加剤を含む溶液に懸濁したときのFDP-NV-COOHのサイズ変化に関するよく知られた問題に対処した。実際、DI水（メーカーが提供するネイティブ製品）でFDP-NV～８００ｎｍ-COOHのZ平均およびゼータ電位をモニターすると、メーカーの情報（Z平均について７７８ｎｍおよびゼータ電位について-48mV）との密接な類似性が明らかになった。粒子をPBSまたは培地に分散させることによって生成されたＺ－平均の顕著なシフトは、3％BSAの存在下で無効になったが、ゼータ電位シフトにはわずかな（または無視できる）影響しかなかった（図１０Ａ～１０Ｂ）。実験結果に対する持続的なゼータ電位の変化の潜在的な影響については、詳細に調査する必要がある。

ナノダイヤモンド粒子（NDP）の細胞効果は、MTTアッセイで報告されているように、主に細胞生存率の観点から、さまざまな培養細胞タイプを使用してイン・ビトロで集中的に調査されている。一般に、NDPは、完全培地で培養した場合、ほとんどの細胞タイプで十分に許容される。ミトコンドリア依存性呼吸鎖は、１ｍｇ／ｍＬという非常に比較的高い濃度でも、NDPの影響を受けない。０．１ｍｇ／ｍＬのCmax濃度でのキャッピング曝露は、他のガン細胞株に関する以前の報告と一致して、HepG-2細胞株の酸化還元状態に干渉がないことを示唆した（図１１）。対照的に、不死化ＨＵＶＥＣ－ＳＴ細胞株を使用した以前のデータと一致して、ＨＵＶＥＣにおいて有意な阻害効果が認められた（図１１Ｂ）。直接細胞計数およびカルセインAMアッセイも、０．１ｍｇ／ｍＬのHUVECにおけるサイトゾルエステラーゼ活性に対する粒子の干渉を示唆したが、MTTとは対照的に、０．０１ｍｇ／ｍＬのより低い（最下点）レベルでは効果は観察されなかった。これらのデータは、細胞株とは対照的に、一次細胞が重要な生化学的プロセスおよび全体的な細胞機能の観点からFDP-NVに対してより感受性が高い可能性があることを示唆している。

増殖促進細胞シグナル伝達経路MAPKErk 1/2は、どちらの細胞タイプでもCmax用量のFDP-NVへの曝露による影響を受けなかった（図１５）。粒子の広範な核周囲の蓄積は、細胞質ゾル-核の交差輸送におけるこの「コロナ」による潜在的な干渉を示唆した。この可能性は、ホスホErk1/2の核への転座を追跡することによって調査された。図１６は、強力なアゴニストTPAによるこのシグナル伝達経路の活性化に続く核内のP～ホスホ-Erk1/2の存在を示す。同様に、FDP-NVはどちらのFDP-NV濃度でもアポトーシスの中枢経路（カスパーゼ-3）を活性化しなかった（図１７）。まとめると、データは、FDP-NV-BSAの物理的存在が、HUVECをCmaxでいくつかのストレス条件にさらすように見えるが、最下点暴露レベルではそうではないことを示唆している。しかしながら、最高のFDP-NV曝露においてさえ完全に移動するHUVECの能力（図１４を参照）は、細胞内粒子負荷に対する機能的感受性の不一致を示唆している。

HepG-2細胞は、HUVECと比較して、いくつかのテストで一般的に回復力があるようである。場合によっては、HUVECの「創傷治癒」モデル（「スクラッチアッセイ」）で使用されたのと同じ曝露レベルで、HepG-2細胞の遊走に対するNDPの悪影響が観察された。例えば、HepG-2細胞を５０～１００μｇ／ｍＬのFNDに曝露すると、２５～５０％の遊走阻害が生じ、同じ時間枠（２４時間）にわたって２００μｇ／ｍＬでさらに阻害（９０％）された。本明細書で報告されたデータ（図１０）と一致して、これらの曝露レベルがＨｅｐＧ-２細胞増殖を妨害しなかったことに留意することは興味深い。２つのデータセット間の差異は、粒子サイズ（１００ｎｍ対８００ｎｍ）およびいくつかの既存のシステムの非官能化ＮＤＰ対本開示で使用されるカルボキシ官能化ＦＤＰ－ＮＶの物理的特性の差異を表すことができる。

イン・ビトロ研究は、いずれかの細胞型が２４時間にわたって粒子に曝露されたことを示した。しかしながら、一部の既存システムの薬物動態データは、肝臓への急速なクリアランスにより血中レベルが粒子の注入後９０分以内に＜１０μｇ／ｍＬに減少するため、イン・ビボ内皮細胞がCmaxレベルのFDP-NVに１５～３０分以内で曝露されることを示す。この観点から、これは、FNDP-NV～８００ｎｍが細胞曝露後１～２時間以内に肝細胞のサイトゾルで観察されることを示した。しかしながら、関連するイン・ビボの短い曝露時間内では、粒子の細胞内レベルは、長時間（２４時間）のイン・ビトロ固定FDP-NV濃度と比較して数倍低くなる。ストレスのすべての条件にわたるHepG-2株の回復性は、１２週間にわたるラットへの高用量FDP-NV-８００ｎｍ注入後の肝細胞の健康のイン・ビボ観察に信頼性を与える。

まとめると、FDP-NV-８００ｎｍは、無傷のラット１８～２０にイン・ビボで注入しても悪影響はなく、これらの細胞がイン・ビトロで受けた7つの「ストレステスト」全体で培養HepG-2細胞株にも悪影響はなかった。場合によっては、免疫炎症性細胞または他の細胞／臓器に関連する異常な結果、特に病的状態を強調することを悪化させる可能性のある高容量の食作用またはプライミング効果を伴うものを排除できなかった。この研究で得られた結果は、イン・ビボイメージングのための、そして薬物および治療薬の送達のための媒体としてのFDP-NV～８００ｎｍのさらなる開発が正当化される可能性があることを示している。

まとめ
この実施例は、イン・ビトロでの内皮（HUVEC）および肝（HepG-2）細胞に関するFDP-NV～８００ｎｍの生体適合性を示しています。この研究は、イン・ビボ（ラットモデル）での粒子の薬物動態の領域内で生体適合性を調査するという点で、既存のシステムとは異なるようである。HUVECはHepG-2細胞よりもFDP-NV～８００ｎｍの蓄積に対して感受性が高いと結論付けることができ；この観察結果は、最高曝露レベル（Cmax）での負の応答については記載されていない。HUVECの特定の生化学的機能における軽度から中程度の干渉を考慮すると、粒子がイン・ビボで示す薬物動態プロファイルに照らして、内皮への限定的な異常な結果を予測することはもっともらしい。FDP-NV～８００ｎｍの最高用量での生化学的試験のすべてにおけるHepG-2細胞の回復性は、この臓器での粒子の長期保持にもかかわらず、正常な肝機能に関するイン・ビボデータをサポートする。全体として、この例で得られた結果は、FDP-NV-８００ｎｍがイン・ビボイメージングに、および／または薬物および治療薬の送達のためのビヒクルとして有用である可能性があることを示す。

本発明のいくつかの実施形態が本明細書に記載および図示されてきたが、当業者は、機能を実行するために、および／または、ここに記載される結果およびまたは１以上の利点を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想定し、そのような変形および／または修正のそれぞれは、本発明の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であること、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が特定の用途または本発明の教示が用いられる用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、規定の実験を超えず、ここに記載される本発明の特定の具体例の多くの同等物を用いることを認識するであろう。本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に相当する多くの同等物を認識し、または通常の実験のみを使用して確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は単なる例として提示されており、添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、本発明は、具体的に記載および特許請求される以外の方法で実施できることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載される個々の特徴、システム、物品、材料、および／または方法のそれぞれを対象とする。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法が相互に矛盾しない場合、そのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせが、本発明の範囲内に含まれる。

本明細書および特許請求の範囲において、本明細書で使用される不定冠詞「a」および「an」は、明確に反対に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

本明細書および特許請求の範囲において、本明細書で使用される「および／または」という語句は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」節によって具体的に識別される要素以外の他の要素が、明確に反対に示されない限り、具体的に識別される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などの制限のない言語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、ＢなしのＡ（任意に他の要素を含む）；別の実施形態では、ＡなしのＢ（任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む）；等を指すことができる。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は包括的であると解釈されるものとする。つまり、要素の数またはリストの少なくとも1つを含むが、複数および任意にさらにリストされていない項目も含むと解釈される。「の１つのみ」または「正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合は「からなる」など、反対に明確に示される用語のみが、多数の要素または要素のリストからの正確に1つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「どちらか」、「一方」、「の1つだけ」、または「正確に1つ」などの排他的的用語が先行するとき、排他的な代替案（すなわち、「１つまたは一方であってどちらもではない」）ことを指す。「本質的にからなる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を持つものとする。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１以上の元素のリストに関連する語句「少なくとも１つ」は、前記要素のリストにおけるいずれか１以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、前記要素のリストに具体的にリストされる各々の少なくとも１つおよび全ての要素を必ずしも含まなくてもよく、前記要素のリストの要素のいずれかの組合せを排除するものでもない。この定義はまた、語句「少なくとも１つ」が参照する要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定された要素に関連するかどうかにかかわらず、任意に存在し得ることを許容する。かくして、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、任意に１を超えるＡを含み、Ｂが存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、少なくとも１つ、任意に１を超えるＢを含み、Ａが存在しない（および任意にＡ以外の元素を含む）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、任意に１を超えるＡを含み、少なくとも１つ、任意に１を超えるＢを含む（および任意に他の要素を含む）；等をいう。

いくつかの実施形態は、方法として具体化することができ、その様々な例が記載されている。方法の一部として実行される行為は、任意の適切な方法で順序付けることができる。よって、図示とは異なる順序で行為が行われる実施形態を構築することができ、これは、記載されているものとは異なる（例えば、多かれ少なかれ）行為を含み得、および／または、行為が上記の実施形態において連続して実施されるように示されているとしても、いくつかの行為を同時に実施することを含み得る。

特許請求された要素を変更するための特許請求の範囲での「第１」、「第２」、「第３」などの序数用語の使用は、それ自体では、方法の行為が実行される、優先性、先行性、または、１つの特許請求された要素のその他に対する順序もしくは時間的順序を暗示するものでなく、特定の名前を持つ1つの特許請求された要素を同じ名前（ただし、通常の用語を使用するため）を持つ別の要素から識別して、特許請求された要素を区別するための標識としてのみ使用される。

特許請求の範囲および上記の明細書において、「含む “comprising”」、「包含する “including”」、「保有する “carrying”」、「有する “having”」、「含有する “containing”」、「要件とする “involving”」、「保持する “holding”」などのすべての移行句は、オープンエンドである、つまり、これに限定されないが、含まれることを意味と理解される。米国特許庁特許審査手続マニュアルの節2111.03に記載されているように、「からなる “consisting of”」および「本質的にからなる “consisting essentially of”」移行フレーズのみが、それぞれクローズドまたはセミクローズド移行フレーズであるものとする。

Claims (27)

1. 治療薬の投与用に構成された物品であって、
   複数の蛍光ダイヤモンド粒子；および
   前記蛍光ダイヤモンド粒子の少なくとも一部に結合した治療薬
   を含み、対象の器官の内部に長期間滞留するように構成されている、物品。
2. 対象と共に使用するための物品であって、
   組成物を前記対象に投与するように構成された注射成分；および
   前記組成物を含有する注射成分に関連するリザーバー
   を含み、前記組成物は複数の蛍光ダイヤモンド粒子を含む、物品。
3. 前記複数のダイヤモンド粒子が１００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の平均粒子径を有する、前記請求項いずれかに記載の物品。
4. 前記複数のダイヤモンド粒子が前記対象の器官内部で凝集するように構成されている、前記請求項いずれかに記載の物品。
5. 前記複数のダイヤモンド粒子が前記対象の器官によって補足されるように構成されている、前記請求項いずれかに記載の物品。
6. 前記複数のダイヤモンド粒子の凝集体が１ミクロン以上１００ミクロン以下の平均径を有する、前記請求項いずれかに記載の物品。
7. 前記複数のダイヤモンド粒子が特徴的な近赤外発光を有する、前記請求項いずれかに記載の物品。
8. 前記器官が前記対象の肝臓である、前記請求項いずれかに記載の物品。
9. 延長された滞留が５日間以上である、前記請求項いずれかに記載の物品。
10. 医薬組成物であって、
    静脈内担体流体；および
    前記静脈内担体流体に懸濁する複数の蛍光性ダイヤモンド粒子
    を含む、医薬組成物。
11. 前記蛍光性ダイヤモンド粒子の少なくとも一部に結合する治療薬を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記蛍光性ダイヤモンド粒子の少なくとも一部に結合する診断薬を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
13. 前記複数のダイヤモンド粒子が１００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の平均粒子径を有する、前記請求項いずれかに記載の医薬組成物。
14. 前記複数のダイヤモンド粒子が前記対象の器官内部で凝集するように構成されている、前記請求項いずれかに記載の医薬組成物。
15. 前記複数のダイヤモンド粒子が前記対象の器官によって補足されるように構成されている、前記請求項いずれかに記載の医薬組成物。
16. 前記複数のダイヤモンド粒子の凝集体が１ミクロン以上１００００ミクロン以下の平均径を有する、前記請求項いずれかに記載の医薬組成物。
17. 前記複数のダイヤモンド粒子が特徴的な近赤外発光を有する、前記請求項いずれかに記載の医薬組成物。
18. 前記器官が前記対象の肝臓である、前記請求項いずれかに記載の医薬組成物。
19. 延長された滞留が５日間以上である、前記請求項いずれかに記載の医薬組成物。
20. 延長された滞留時間が少なくとも１２日間までである、前記請求項いずれかに記載の医薬組成物。
21. 疾患を治療する方法であって、
    複数のダイヤモンド粒子および、前記複数のダイヤモンドの少なくとも一部に結合した治療薬を、対象に、静脈内投与することを含み、ここで、前記複数のダイヤモンド粒子は対象の器官の内部に滞留するように構成されている、方法。
22. 前記複数のダイヤモンド粒子が前記対象の肝臓に存在する、請求項２１に記載の方法。
23. 疾患を有すると疑われる対象において疾患の進行をモニターする方法であって、
    前記対象に複数のダイヤモンド粒子を投与する工程；
    投与の工程後、前記複数のダイヤモンド粒子を含有すると疑われる対象の内部の位置の第１の画像を取得する工程；
    所定の期間後、前記複数のダイヤモンド粒子を含有すると疑われる対象の内部の位置の第２の画像を取得する工程；
    複数のダイヤモンド粒子に対する第１の画像と第２の画像との間の対象の内部の位置の形態学的変化を測定する工程
    を含み、ここで、形態学的変化は、弛緩の進行に関連している、方法。
24. 前記形態学的変化は、第２の画像対第１の画像における、前記複数のダイヤモンド粒子を含有する内部機関の部分に対する、前記対象の内部器官の面積の増加を測定することによって決定される、請求項２３に記載の方法。
25. 肝疾患および／または肝ガンの治療のための薬剤の製造における複数の蛍光ダイヤモンド粒子の使用。
26. 前記複数の蛍光性ダイヤモンドに結合した治療薬を含む、請求項２５に記載の使用。
27. 疾患の進行をモニターするための薬剤の製造における複数の蛍光ダイヤモンド粒子の使用。

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