KR20220024624A - (나노)다이아몬드 입자를 포함하는 조성물 및 물품 - Google Patents

(나노)다이아몬드 입자를 포함하는 조성물 및 물품 Download PDF

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지오라 제트. 퓨어스타인
마크 이. 스턴버그
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데비나 다이아그노스틱스, 인크.
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Abstract

일반적으로 나노다이아몬드 기재 제약 조성물과 같은 다이아몬드 입자를 포함하는 조성물 및 물품이 제공된다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자를 포함하는 물품 및 방법은 (예컨대 대상체에서) 질환을 모니터링하고/거나 치료하는 데에 유용할 수 있다.

Description

(나노)다이아몬드 입자를 포함하는 조성물 및 물품
[관련 출원]
본 출원은 2019년 6월 18일자 발명의 명칭 "COMPOSITIONS AND ARTICLES COMPRISING NANODIAMOND PARTICLES,"의 U.S. 가출원 제62/862,802호에 대하여 35 U.S.C. § 119(e)하의 우선권을 주장하며, 모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[기술 분야]
일반적으로, 다이아몬드 입자를 포함하는 조성물 및 물품, 예컨대 나노다이아몬드 기재 제약 조성물이 제공된다.
새로운 진단 및 치료 목적으로의 나노재료의 사용은 물리적 재료와의 조합으로서의 생물학적 및 약제학적 존재의 생물공학을 바탕으로 하는, 빠르게 발전하고 있는 과학 학문분야이다. 그러나, 개선된 물품 및 방법들이 요구되고 있다.
[발명의 개요]
대상체에의 치료제의 투여 및/또는 대상체 내에서의 질환 진행의 모니터링을 위한 다이아몬드 입자, 및 관련 장치 및 방법, 예컨대 나노다이아몬드 입자 (예컨대 형광성 나노다이아몬드 입자).
일부 경우에서, 본 발명의 주제는 1종 이상 시스템 및/또는 물품의 서로 관련되어 있는 생성물들, 특정 문제점에 대한 대안적인 해결책들 및/또는 복수의 서로 다른 용도를 포함한다.
일 측면에서는, 물품 (예컨대 대상체에 사용하기 위한 치료제의 투여를 위해 구성됨)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 물품은 복수의 형광성 다이아몬드 입자, 및 형광성 다이아몬드 입자들 중 적어도 일부에 결합된 치료제를 포함하며, 대상체 기관 내부에서의 장기 체류를 위해 구성된다.
일부 실시양태에서, 물품은 대상체에 조성물을 투여하도록 구성되는 주입 구성요소, 및 복수의 형광성 다이아몬드 입자를 포함하는 조성물을 함유하는, 주입 구성요소와 연계되는 저장소를 포함한다.
또 다른 측면에서는, 제약 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 정맥내 캐리어 유체, 및 정맥내 캐리어 유체에 현탁된 복수의 형광성 다이아몬드 입자를 포함한다.
또 다른 측면에서는, 방법 (예컨대 질환을 치료하는 방법, 질환을 가지고 있는 것으로 의심되는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 다이아몬드 입자, 및 다이아몬드 입자들 중 적어도 일부에 결합된 치료제를 대상체에게 정맥내로 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 복수의 다이아몬드 입자는 대상체 기관 내부에서의 장기 체류를 위해 구성된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 다이아몬드 입자를 대상체에게 투여하는 것, 투여 단계 후, 복수의 다이아몬드 입자를 함유하는 것으로 의심되는 대상체 내부 위치의 제1 이미지를 수득하는 것, 예정된 시간 기간 후, 복수의 다이아몬드 입자를 함유하는 것으로 의심되는 대상체 내부 위치의 제2 이미지를 수득하는 것, 및 복수의 다이아몬드 입자와 관련하여 제1 이미지와 제2 이미지 사이에서 상기 대상체 내부 위치의 형태구조적 변화를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 형태구조적 변화는 질환의 진행과 연관된다.
일부 실시양태에서는, 복수의 형광성 다이아몬드 입자의 간 질환 및/또는 간암의 치료를 위한 약제 제조에서의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서는, 복수의 형광성 다이아몬드 입자의 질환 진행의 모니터링을 위한 약제 제조에서의 용도가 제공된다.
본 발명의 기타 장점 및 신규한 특징들은 첨부 도면과 연계하여 생각해보면 본 발명의 다양한 비-제한적 실시양태들에 대한 하기 상세한 설명으로부터 드러나게 될 것이다. 본 명세서와 참조로 포함되는 문서가 상반되고/거나 불일치하는 개시내용을 포함하는 경우, 본 명세서가 우선하게 된다.
개략적인 것으로서 축적에 맞게 작성된 것이 아닌 첨부 도면을 참조하여, 본 발명의 비-제한적인 실시양태들이 예로서 기술될 것이다. 도면에서, 도시되어 있는 각각의 동일하거나 거의 동일한 구성요소는 통상적으로 하나의 숫자로 표시하였다. 명확하게 할 목적으로, 모든 도면에서 모든 구성요소를 표지하지는 않았음은 물론, 관련 기술분야 통상의 기술자가 본 발명을 이해하도록 하는 데에 도시가 필요하지 않은 경우, 본 발명 각 실시양태의 모든 구성요소를 나타내지도 않았다. 도면 중:
도 1a는 일 실시양태 세트에 따른 형광성 나노다이아몬드 입자를 포함하는 시스템의 개략적 도시이다;
도 1b는 일 실시양태 세트에 따른 세포에의 FNDP-(NV) 흡수의 정량에 사용되는 방법의 개략적 표시이다;
도 2a-2b는 일 실시양태 세트에 따른 FNDP-(NV)~700/800 nm (FNDP-(NV))로 처리되거나 또는 처리되지 않은 래트로부터 수득된 간 파라핀 절편 (5 μm)의 형광 현미경 이미지를 나타낸다. 도 2a에는 1.6x 배율로 10x 대물렌즈를 사용하여 분석된 조직 절편의 이미지를 나타내었으며, 도 2b에는 오일 40x 대물렌즈를 사용하여 분석된 조직 절편의 이미지를 나타내었는데, 좌측 이미지는 상이한 회색 음영으로 나타낸 중복되는 3종 색상 적색 (FNDP-(NV)), 청색 (DAPI-핵), 녹색 (팔로이딘-세포골격)을 나타내는 반면, 우측의 이미지는 역시 상이한 회색 음영으로 나타낸 중복되는 2종의 색상 적색 (FNDP-(NV)), 청색 (DAPI-핵)을 나타내고, 각 패널의 상부 이미지는 FNDP-(NV)-처리된 래트를 나타내며, 각 패널의 저부 이미지는 대조군 (PBS-처리된 래트)을 나타내고, 입자에 의해 점유되는 영역은 일부 실시양태에 따라 백색 화살표로 표시하였다;
도 3a-3h는 간 소엽의 "파노라마" 이미지를 나타내는 것으로서, 일 실시양태 세트에 따른 입자 분포의 소엽-내 비균질성을 나타내는데, 도 3a 및 도 3b는 2 마리 동물로부터의 대표적인 간 소엽으로부터의 시상 단면의 전체 파노라마 뷰를 도시하며, 이들 도면은 녹색 채널 (회색 음영으로 나타냄)에서 이미지화된 팔로이딘 염색 절편 (5 μm) 및 적색 (회색으로 나타냄) 채널에서 이미지화된 FNDP-(NV)의 존재를 사용하여 FSX100 현미경을 사용한 4x 이미지들을 '봉합하는 것'에 의해 구성되었으며; 매우 낮은 해상도에서의 가시화를 위하여 임계화 및 반복되는 확장에 의해 이미지 중 입자가 확대되었고; 육각형을 도면에 중복시킴으로써 예시적인 간 소엽을 나타내었으며, 금색으로 표시된 영역은 다른 패널에서는 확대되었고, 도 3c는 '육각형' 소엽 체계 경계에서의 우선적인 입자 분포를 나타내는 4개의 간 소엽을 나타내며, 도 3d는 우선적인 FNDP-(NV) 침착을 보여주는 단일 간 소엽의 10x 이미지를 나타내고; 대형 FNDP-(NV) 응집물은 파선 육각형으로 표시된 간 소엽에 비-균일하게 분포되는 것으로 보이며, 도 3e, 도 3f는 매우 소형인 응집물의 가시성을 개선하여 구역 침착을 나타내기 위한 임계화 및 확장 후 단일 간 소엽의 10x 이미지를 나타내고, 도 3g, 도 3h는 금색 파선 정사각형에 의해 표시되는 패널 (도 3a)로부터의 혈관구조 영역의 확대된 이미지를 제공하며, 도 3i는 일부 실시양태에 따른 다양한 대사 구역들을 구획하는 간 소엽의 개략적 도시이다;
도 4a-4b는 간 소엽에서의 FNDP-(NV) 응집물 크기 분포의 수학적 플롯을 나타내는 것으로서; 2 마리 동물로부터의 하나의 완전한 간 소엽의 도면을 FSX100 현미경에서 10x 이미지들로부터 봉합하였는데; 이미지제이에서 최대 엔트로피 기준을 사용하여 봉합되는 도면들을 임계화하고, 생성되는 검출된 FNDP-(NV) 조립체들을 크기분석 및 계수하였으며; 도 4a는 FNDP-(NV) 조립체 크기의 분포이다. 도 4b는 일부 실시양태에 따라 각 조립체의 면적에 의해 추산된 총 입자 질량의 분포이다;
도 5a-5d는 일 실시양태 세트에 따라 FNDP-(NV)로 처리된 래트로부터 수득된 간 절편 (50 μm)의 레이저 주사 공초점 현미경 이미지를 나타낸다. 도 5a는 황색 원 내에 표시되어 있는 세포가 흡수된 입자를 포함하는, 간의 실질 영역이다. 사진 저부 및 우측의 삽입물은 황색 선에 따라 수행된 이미지의 수직 투영을 나타낸다. 황색 화살표는 입자의 위치를 표시한다. 도 5b는 황색 원이 간 굴모양혈관/정맥 내의 입자의 응집물을 시사하는 간의 실질 영역이다. 저부 및 우측의 삽입물은 황색 선에 따라 수행된 이미지의 수직 투영을 나타낸다. 황색 화살표는 굴모양혈관/정맥에 위치하는 입자를 표시한다. 도 5c는 백색 원 입자가 입자의 내피-하 및 외막 위치를 시사하는 간 소엽의 풍부하게 혈관화된 분절 영역이다. 내재화된 입자의 가능성이 있는 실질 세포를 황색 원으로 표시하였다. 저부 및 우측의 삽입물은 황색 선에 따라 수행된 이미지의 수직 투영을 나타낸다. 황색 화살표는 실질 세포에 내재화된 입자를 표시한다. 도 5d는 백색의 원이 외막 세포 요소와 결합된 입자를 표시하는 간 문의 영역이다. 저부 및 우측의 삽입물은 황색 선에 따라 수행된 이미지의 수직 투영을 나타낸다. 황색 화살표는 혈관 세포에 내재화된 입자를 표시한다;
도 6은 일 실시양태 세트에 따른 상이한 양의 도입된 FNDP-(NV)를 포함하는 간세포의 공초점 3D 재구성을 나타낸다. 이미지 축적물을 사용하여 상이한 회색 음영으로 나타낸 나노다이아몬드 (적색)가 도입되어 있는, DAPI (청색) 및 팔로이딘 (녹색)으로 염색된 50 μm 절편으로부터의 공초점 이미지 축적물을 플루오뷰(Fluoview) F1000 공초점 현미경에서 수득하고, 이미지제이에서 볼륨 뷰어(volume viewer)를 사용하여 재구성하였다. 이러한 세포 내의 입자 포함물 (황색 화살표로 표시)은 세포에 내재화된 성기고 조밀한 FNDP-(NV) 수집 둘 다를 포함한다. 좌측 패널은 비히클 대조군을 나타낸다. 중앙 패널은 저부하 입자를 나타내며, 우측 패널은 2개 별도 세포에서의 고부하 입자를 나타낸다.
도 7a-7d는 일 실시양태 세트에 있어서의 시간 경과에 따른 HepG-2 및 HUVEC 세포에의 상이한 농도의 FNDP-(NV)의 내재화와 관련된 플롯을 나타낸다. 도 7a, 도 7b, 도 7c는 다양한 농도의 FNDP-(NV)에 노출된 HepG-2 세포 및 HUVEC에 의한 FNDP의 투여량 및 시간 의존성 흡수를 도시한다. 입자의 전체 3종 투여량 (고-투여량 0.1 mg/ml; 중간-투여량 0.05 mg/ml, 저-투여량 0.025 mg/ml)에 대하여 지수 곡선를 피팅하였다. 도 7d는 다양한 농도의 FNDP에 노출된 HepG-2 세포 및 HUVEC에 의한 20시간 후의 총 FNDP 흡수이다. 모든 패널의 오차 막대는 4반복 샘플의 SD를 나타낸다. (*) 2-측 스투던트 검정에 의해 0.025 mg/ml에 비교한 P<0.001; (†) 2-측 스투던트 검정에 의해 0.05 mg/ml에 비교한 P<0.001;
도 8a-8b는 일 실시양태 세트에 따른 FNDP-(NV)를 동반한 2 및 20시간 인큐베이션 후 수득된 HepG-2 세포 및 HUVEC의 형광 현미경 이미지를 나타낸다. FNDP-(NV)에의 노출 2 또는 20시간 후 160x 및 400x 배율을 사용하여 형광 현미경 분석으로부터 수득된 HepG-2 세포 (도 8a) 및 HUVEC (도 8b)의 이미지이다. 160x 배율의 이미지는 상이한 회색 음영으로 나타낸 중복된 3종 색상 형광 (녹색 - FITC-팔로이딘, 적색 - FNDP-(NV), 청색 - DAPI)으로 나타내었으며, 400x 배율의 이미지는 중복된 3종 색상 형광 (녹색, 적색, 청색) (좌측 패널), 및 2종 색상 형광 (적색 및 청색) (우측 패널)으로 나타내었다. 백색 화살표는 입자 전이의 세포질 단계의 예를 나타내며; 회색 화살표는 수많은 입자의 핵-주변 조립체를 표시한다;
도 9는 일 실시양태 세트에 따른 FNDP-(NV) 존재하에서의 HUVEC 분할의 다양한 단계를 나타내는 대표적인 이미지를 보여준다. 0.05 mg/ml의 FNDP-(NV)를 사용하여 20시간 동안 HUVEC를 처리하였다. 400x 또는 640x 배율의 이미지를 중복된 3종 색상 형광 (녹색 - FITC-팔로이딘, 적색 - FNDP-(NV), 청색 - DAPI)으로 나타내었다. 나타낸 다양한 단계들의 표제는 예측 세포 복제 메커니즘의 시각적 이미지이다;
도 10a-10b는 카르복실 기에 의해 관능화되어 물, 배양 배지 및 생물학적 완충제에 현탁된 FDP-NV의 응집 및 표면 전위에 대한 BSA의 수동적 흡수의 효과를 나타내는데, 입자는 다양한 분산제에 현탁되어, 모세관 큐벳에 적용된 후, Z-평균, 직경 크기 (도 10a) 및 ζ-전위 (도 10b)의 측정을 위하여 제타사이저(Zetasizer) 기기 (말베른(Malvern) Inc. 사)에 배치되었으며, 여기서 오차 막대는 개별 샘플의 3회 측정으로부터의 SD를 나타낸다. 일 실시양태 세트에 따라 1원 ANOVA를 사용하여 계산된 특정 분산제 중에서의 FDP-NV-BSA와 천연 FDP-NV 사이의 차이에 대하여 (*) P<0.01 및 (**) P<0.001;
도 11a-11d는 직접 세포 수 평가에 의해 결정된 세포 증식에 대한 FDP-NV의 효과를 나타내는데, FDP-NV-BSA 또는 빈크리스틴을 동반하거나 그렇지 않은 인큐베이션 후 수득되는 HepG-2 세포 (도 11a) 및 HUVEC (도 11b) 수의 그래프 표시로서, 여기서 오차 막대는 5개의 개별 웰 및 각 웰의 7개 관찰 영역 적용으로부터의 SD를 나타낸다. 1원 ANOVA를 사용하여 계산된 대조군 및 처리군 사이에서 (*) P<0.001이며, 10x 대물렌즈 및 DAPI (청색) 및 TRITC (적색) 필터 (상이한 회색 음영으로 나타냄)를 적용한 형광 현미경 (올림푸스 IX81)을 사용하여 수득된 이미지를 사용한 이미지제이 소프트웨어에 의한 세포 수 결정에 HepG-2 세포 (도 11c) 또는 HUVEC (도 11d) 관찰 영역의 대표적인 이미지를 적용하였으며, 백색의 화살표는 일부 실시양태에 따른 HepG-2 콜로니 측접 세포에 내재화된 입자를 표시한다;
도 12a-12b는 MTT 검정에서 시험하였을 때의 HepG-2 (도 12a) 및 HUVEC (도 12b) 산화환원 상태에 대한 FNDP-(NV)의 효과를 나타내는 것으로서, 여기서 오차 막대는 대조군과 화합물 처리군 사이에서 계산된 1원 ANOVA를 사용한 3회 개별 실험으로부터의 1 SD를 나타내며, 일부 실시양태에 따라 (*) P<0.01 및 (**) P<0.001이다;
도 13a-13b는 칼세인 AM 검정에서 모니터링된 HepG-2 (도 13a) 및 HUVEC (도 13b) 에스테라제 활성에 대한 FNDP-(NV)의 효과를 나타내는 것으로서, 살아있는 HepG-2 세포 (도 13a) 및 HUVEC (도 13b)에 존재하는 에스테라제에 의한 녹색-형광 칼세인으로의 칼세인 AM의 전환의 그래프 표시를 3회 개별 실험으로부터의 SD를 나타내는 오차 막대와 함께 나타내며, 대조군과 화합물 처리군 사이에서 1원 ANOVA를 계산하였으며, 일부 실시양태에 따라 (*) P<0.01 및 (**) P<0.001이다;
도 14a는 스크래치 검정에서의 2 % FBS에 의해 자극된 HUVEC의 이동에 대한 FNDP-(NV)의 효과를 나타내는 것으로서, 0.1 % FBS를 함유하는 배지로 처리된 비-자극 세포 (음성 대조군)와 함께 FNDP-NV-BSA의 존재 또는 부재하에서 2 % FBS에 의해 자극된 "스크래치 폐쇄"를 보여주며, 오차 막대는 3회 개별 실험으로부터의 SD를 나타내고, 일부 실시양태 세트에 따른 1원 ANOVA에서의 대조군 (2 % FBS 처리)과의 비교에서 (*) P<0.001이다;
도 14b는 형광 현미경 (올림푸스 IX81)을 사용하여 수득된 스크래치 이미지들을 사용한 스크래치 검정에서의 2 % FBS에 의해 자극된 HUVEC의 이동에 대한 FNDP-(NV)의 효과를 나타내며, 일 실시양태 세트에 따라 20x 배율 및 DAPI (청색) 및 TRITC (적색) 필터의 적용을 상이한 회색 음영으로 나타내었다;
도 15a-15b는 10 및 20분까지의 2 % FBS로 자극된 24시간 혈청-공복 HepG-2 세포 (도 15a) 또는 HUVEC (도 15b)에서 FBS에 의해 유도된 MAPK Erk1/2의 인산화, 및 항-포스포 항체를 스트리핑한 후 PVDF 멤브레인에서 리-프로빙된 총 MAPK Erk1/2에 대한 FDP-NV의 효과를 나타내며, 우측 플롯 막대는 총 단백질 밴드 대 인산화된 단백질 밴드의 강도 비를 나타내며, 녹색 막대는 대조군 (비-처리 세포)에 대한 비를 나타내는 반면, FDP-NV 처리된 세포에 대한 적색 막대 및 좌측 패널은 3회 개별 실험의 SD를 나타내는 오차 막대를 동반한 각 세포 유형의 대표적인 블럿 이미지를 나타내고, 일 실시양태 세트에 따른 '1원 ANOVA'에 의한 FDP-NV-BSA 0.1 mg/ml를 사용하여 처리되거나 또는 처리되지 않은 세포들 사이의 비교에 대하여 (*) P<0.01이다;
도 16a-16b는 FDP-NV 및 TPA 존재 및 부재하에서의 HepG-2 세포 및 HUVEC의 세포질 및 핵에서의 포스포- 및 총-MAPK Erk1/2의 확인을 나타내는 것으로서, HepG-2 세포 (도 16a) 또는 HUVEC (도 16b)을 FDP-NV-BSA (0.1 mg/ml)로 처리하거나 처리하지 않았으며, 24시간 혈청-공복 후, TPA로 자극하거나 자극하지 않고, 세포를 용해시켜, 세포질 및 핵 분획, 그리고 지시된 항체를 사용하여 WB에 적용되는 분획으로 분별하였으며; 세포질 분획용 마커로는 Mek-1을 사용한 반면, 핵 분획으로는 HDAC1을 사용하였다.
도 16c-16d는 FDP-NV 및 TPA 존재 및 부재하에서의 HepG-2 세포 및 HUVEC의 세포질 및 핵에서의 포스포- 및 총-MAPK Erk1/2의 확인을 나타내는 것으로서, HepG-2 세포 (c) 또는 HUVEC (d)를 챔버 슬라이드상에서 성장시키고, FDP-NV-BSA에 노출시킨 후, 24시간 동안 혈청-고갈시켰다. TPA로 처리하거나 처리하지 않은 후, 항-포스포-MAPK Erk 1/2 후 이어서 FITC로 태그부착된 염소 항-토끼를 사용하여 세포를 면역-염색하였다. 형광 현미경 (올림푸스 IX81)하에서 오일 대물렌즈, 및 FITC (녹색) 및 TRITC (적색) 필터를 사용하여 400x의 배율로 슬라이드를 분석하였는데, 황색 중 녹색 및 적색의 중복 영역은 다양한 회색 음영으로 나타내었으며, 백색 화살표는 비-처리 세포와 비교하였을 때의 TPA-처리된 세포에서의 고도의 입자 축적을 표시하고, 청색 화살표는 TPA로 처리되지 않은 세포의 핵을 표시하며, 적색 화살표는 일 실시양태 세트에 따라 TPA로 처리된 세포의 핵을 표시한다;
도 17a는 HepG-2 및 HUVEC에서의 FDP-NV (0.1 mg/ml)의 존재 또는 부재하에서의 카스파제 3 절단의 웨스턴 블럿 분석을 사용한 HepG-2 세포 및 HUVEC에서의 세포자멸사 및 ER 스트레스의 유도에 대한 FDP-NV의 효과를 나타낸다. 빈크리스틴을 세포자멸사의 양성 대조군으로 사용하였다. 일부 실시양태에 따라, 분자량 마커의 위치지정은 이미지 좌측의 화살표로 표시하였다;
도 17b는 HepG-2 세포 및 HUVEC에서의 FDP-NV (0.1 mg/ml)의 존재 또는 부재하에서의 ER에서의 샤프롱 발현의 웨스턴 블럿 분석을 사용한 HepG-2 세포 및 HUVEC에서의 세포자멸사 및 ER 스트레스의 유도에 대한 FDP-NV의 효과를 나타낸다. 일부 실시양태에 따라, 투니카마이신을 ER-스트레스의 양성 대조군으로 사용하였다.
일반적으로, 다이아몬드 입자를 포함하는 조성물 및 물품, 예컨대 다이아몬드 기재 제약 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 다이아몬드 입자를 포함하는 물품 및 방법은 (예컨대 대상체에서) 질환을 모티터링하고/거나 치료하는 데에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 물품은 (나노)다이아몬드 입자에 결합된 치료제를 전달하는 데에 사용될 수 있는 복수의 다이아몬드 입자 (예컨대 형광성 (나노)다이아몬드 입자)를 투여하도록 구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 복수의 (나노)다이아몬드 입자는 복수의 (나노)다이아몬드 입자들 중 적어도 일부가 대상체 내부의 일정 위치 (예컨대 간과 같은 기관 내)에 체류하도록 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 진단 기구로 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 (나노)다이아몬드 입자는 (예컨대 정맥내 주입을 통하여) 대상체에게 투여될 수 있다. 그와 같은 일부 실시양태에서는, 복수의 (나노)다이아몬드 입자를 함유하는 것으로 의심되는 위치의 이미지가 수득될 수 있으며, 진단상 적격인 시간 기간 후, 복수의 (나노)다이아몬드 입자를 함유하는 것으로 의심되는 대상체 내부 동일 위치의 제2 이미지가 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 이미지 및/또는 제2 이미지는 근적외선 및/또는 형광 방출 (예컨대 (나노)다이아몬드 입자에 의함)을 바탕으로 한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 이미지와 제2 이미지의 비교는 예를 들면 질환 상태 (예컨대 암)의 진행을 포함한 진단 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서, 복수의 (나노)다이아몬드 입자가 없는 새로운 조직을 포함하는 제2 이미지 중 영역은 악성 성장을 나타낼 수 있다. 이와 같이, 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 질환의 진행을 모니터링하는 데에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 이미지 및 제2 이미지는 유사한 (예컨대 동일한) 조건 (예컨대 동일한 여기 및/또는 방출 파장)하에서 수득된다.
본원에서 사용될 때, "대상체"는 임의의 동물 예컨대 포유동물 (예컨대 인간)을 지칭한다. 대상체의 비-제한적인 예에는 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 조류, 어류 또는 기니 피그가 포함된다. 일부 경우에서, 본원에서 기술되는 실시양태는 인간에서의 사용에 관한 것일 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 기술되는 실시양태는 수의 용도에 관한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 예컨대 (나노)다이아몬드 입자 투여시 건강상의 이점을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 (나노)다이아몬드 입자는 대상체의 1종 이상 기관 (예컨대 간) 내에서의 장기간의 체류 시간을 위해 구성될 수 있다. 예를 들면, 복수의 (나노)다이아몬드 입자를 대상체에게 투여하는 것, 및 상기한 바와 같이 종양 성장이 의심되는 기관을 이미지화하는 것에 의해, 종양 성장의 진행이 모니터링될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 (나노)다이아몬드 입자는 (예컨대 대상체 내부의 기관에) 치료제를 전달하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 복수의 (나노)다이아몬드 입자에 적어도 부분적으로 결합될 수 있다. 일부 경우에서, 치료제에 결합된 상기 (나노)다이아몬드 입자는 (예컨대 치료 효과를 제공하기 위하여) 대상체에게 투여될 수 있다.
(나노)다이아몬드 입자가 대상체 내부의 일정 위치 (예컨대 기관)에 대하여 상대적으로 장기간의 체류 특색을 가지도록 구성될 수 있기 때문에, (나노)다이아몬드 입자를 사용하여 전달되는 치료제는 유리하게도 장기간의 시간 기간에 걸쳐 치료제를 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 대상체 또는 대상체 기관 내부에서의 장기간 체류를 위해 구성된다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 체류를 위해 구성된다 (예컨대 체류를 촉진하는 크기 및/또는 형상을 가짐). 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 1일 이상, 3일 이상, 5일 이상, 7일 이상, 10일 이상, 2주 이상, 4주 이상, 6주 이상, 12주 이상, 26주 이상, 또는 52주 이상 동안의 기관에서의 체류를 위해 구성된다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 100주 이하, 52주 이하, 26주 이하, 12주 이하, 6주 이하, 4주 이하, 2주 이하, 10일 이하, 7일 이하, 5일 이하, 또는 3일 이하 동안의 대상체 기관에서의 체류를 위해 구성된다. 상기-언급된 범위의 조합 역시 가능하다 (예컨대 1일 초과 내지 100주 미만, 5일 초과 내지 26주 미만, 6주 초과 내지 52주 미만). 다른 범위도 가능하다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 대상체의 일생 동안 대상체의 기관에서 체류하도록 구성될 수 있다. 유리하게도, 본원에서 기술되는 (나노)다이아몬드 입자는 독성이거나 유해한 생리학적 효과 없이 대상체의 기관에서 체류할 수 있다.
특정 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 대상체 내부 기관에 의해 포획될 수 있다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 대상체 내 또는 대상체 내부 기관 내에서 추가적으로 조직화되거나 응집될 수 있다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 예컨대 간과 같은 기관 내에서 응집물을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다이아몬드 나노입자 (예컨대 (나노)다이아몬드 입자)는 예컨대 췌장 및/또는 췌장 세포 내에서 응집물을 형성할 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 응집물은 유리하게도 대상체 내에서의 이상 또는 질환의 진행을 모니터링하는 것, 및/또는 치료제의 장기간 전달을 제공하는 것을 도울 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이, (나노)다이아몬드 입자는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 복수의 (나노)다이아몬드 입자는 수술적으로 투여 (예컨대 이식)되고/거나, 주입된다 (예컨대 전신 혈류로, 안구내로, 척수 시스템 또는 척수액으로, 예컨대 주사기를 통함). 특정 실시양태에서, 복수의 (나노)다이아몬드 입자는 경구로, 직장으로, 질로, 비로 또는 요관으로 대상체에게 (예컨대 캡슐내로) 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자의 투여는 정맥내 주입과 같은 주입을 통한다. 예를 들면, (나노)다이아몬드 입자를 포함하는 저장소와 연계된 주입 구성요소가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 주입 구성요소는 바늘이며, 연계되는 저장소는 주사기이다. 상기 바늘은 대상체에게 조성물을 투여하는 데에 적절한 임의의 크기 또는 게이지의 것일 수 있다. 상기 주사기는 대상체에게 투여될 특정 양의 조성물을 포함하는 데에 적절한 임의의 크기 또는 부피의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 주입 구성요소는 피펫이다. 본 개시내용이 그와 같이 제한되는 것은 아니기 때문에, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 데에 적합한 다른 주입 구성요소들에 대해 알고 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 저장소는 정맥내 캐리어 유체, 및 정맥내 캐리어 유체 내에 현탁된 복수의 (나노)다이아몬드 입자를 포함한다. 적합한 정맥내 캐리어 유체의 비-제한적인 예에는 식염수 (예컨대 9 % 생리 식염수, 45 % 생리 식염수), 락테이트화 링거 및 수성 덱스트로스 (예컨대 수중 5 % 덱스트로스)가 포함된다.
일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자 (예컨대 (나노)다이아몬드 입자에 결합된 치료제를 포함하는 복수의 (나노)다이아몬드 입자)는 (예를 들면 대상체 내에 존재하는 것으로 의심되는 피분석물 (예컨대 생리학적 또는 병리학적 동일성을 갖는 생물학적 요소)의 검출을 위하여) 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서는, 치료제를 포함하는 복수의 (나노)다이아몬드 입자가 대상체에게 투여된 후, (나노)다이아몬드 입자의 방출 (예컨대 형광 방출, 근적외선 방출 등)의 검출시, 대상체에서의 치료제의 존재를 확인해 줄 수 있다.
일부 실시양태에서는, 소정의 종(species) (예컨대 치료제)이 (나노)다이아몬드 입자 또는 복수의 (나노)다이아몬드 입자에 결합된다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 (나노)다이아몬드 입자의 관능화를 통하여 상기 종과 연계 (예컨대 상기 종에 결합)된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 이온 결합, 공유 결합, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용 등과 같은 결합의 형성을 통하여 종과 연계된다. 공유 결합은 예를 들면 탄소-탄소, 탄소-산소, 산소-규소, 황-황, 인-질소, 탄소-질소, 금속-산소 또는 기타 공유 결합일 수 있다. 수소 결합은 예를 들면 히드록실, 아민, 카르복실, 티올 및/또는 유사 관능기들 사이의 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 종에는 추가적으로 티올, 알데히드, 에스테르, 카르복실산, 히드록실 등과 같은 관능기가 포함될 수 있으며, 여기서 상기 관능기는 (나노)다이아몬드 입자와 결합을 형성한다. 일부 실시양태에서, 관능기는 (예컨대 치료제에 결합할 수 있는) (나노)다이아몬드 입자에 결합된다. 일부 경우에서, 상기 종은 전자-풍부 또는 전자-부족 잔기일 수 있으며, 여기서 (나노)다이아몬드 입자와 종 사이의 상호작용은 정전기적 상호작용을 포함한다.
일부 실시양태에서는, 소정의 종 (예컨대 치료제)이 가교-연결제의 존재하에 관능화된 (나노)다이아몬드 입자와 상기 종을 반응시키는 것에 의해 -COOH, -OH, -NH2, -SH 또는 -C=O 관능기를 포함하는 관능화된 (나노)다이아몬드 입자와 연계된다. 적합한 가교-연결제의 비-제한적인 예에는 카르보디이미드 예컨대 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC); 아민-반응성 화합물 예컨대 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 이미도에스테르 및 히드로메틸포스파인; 술피드릴-반응성 화합물 예컨대 말레이미드, 피리딜 디술피드 및 아이오도아세틸; 알데히드-반응성 화합물 예컨대 히드라지드 및 알콕시아민; 및 광반응성 가교-연결제 예컨대 아릴 아지드 및 디아지린이 포함된다. 다른 가교-연결제 역시 가능하다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 선택된 종의 유형 및 본 명세서의 교시를 바탕으로 적합한 가교-연결제를 선택할 수 있을 것이다.
적합한 (나노)다이아몬드 입자의 예는 발명의 명칭이 "(NANO)DIAMOND PARTICLES AND RELATED DEVICES AND METHODS"인 2017년 9월 6일자 동일-소유 국제 특허 출원 제PCT/US2017/050257호에 더욱 상세하게 기술되어 있으며, 모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
상기 및 본원에서 기술되는 바와 같이, 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 이미지화에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 검출기에 의해 검출될 수 있는 특징적인 방출을 방출할 수 있다 (즉 형광). 일부 실시양태에서, 검출기는 (나노)다이아몬드 입자를 함유하는 것으로 의심되는 대상체의 영역에 근접하여 배치될 수 있다. 예를 들면, 종에 의해 관능화된 복수의 (형광성) (나노)다이아몬드 입자가 대상체에게 투여될 수 있으며, 검출기는 (예컨대 (나노)다이아몬드 입자의 방출을 통하여) 임의의 (나노)다이아몬드 입자가 검출될 수 있도록 대상체에 근접하여 배치될 수 있다.
어떠한 적합한 검출기도 본원에서 기술되는 장치 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 검출기는 광학 검출기 (예컨대 형광 검출기, 가시광 및/또는 UV 검출기, 근적외선 검출기, 현미경, MRI, CT 스캐너, x-선 검출기)일 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이, (나노)다이아몬드 입자는 코어에 주로 탄소 원자로 구성되는 다이아몬드 케이지(diamond cage)가 존재하는 탄소 원자의 응집물이다. (나노)다이아몬드 입자가 다이아몬드를 포함하기는 하지만, 흑연, 그래핀, 풀러린 등과 같은 탄소의 다른 상 또는 동소체도 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 (나노)다이아몬드 입자는 단일 형태의 탄소를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서는, 1종을 초과하는 형태의 탄소가 (나노)다이아몬드 입자를 구성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 복수의 다이아몬드 입자는 2 μm 이하의 평균 최대 단면 치수 (예컨대 직경)을 가질 수 있다. 나노다이아몬드 입자 (즉 1000 nm 미만의 최대 단면 치수를 갖는 다이아몬드 입자)와 관련하여 일반적으로 많은 설명이 존재하기는 하지만, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본 명세서의 교시를 바탕으로, (예컨대 1000 nm 이상의) 최대 단면 치수를 갖는 다이아몬드 입자 역시 가능하다는 것을 이해하고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 다이아몬드 입자는 2 μm 미만 (예컨대 1800 nm 이하, 1600 nm 이하, 1400 nm 이하, 1200 nm 이하, 1000 nm 이하, 900 nm 이하, 800 nm 이하, 700 nm 이하, 600 nm 이하, 400 nm 이하, 200 nm 이하, 180 nm 이하, 160 nm 이하, 140 nm 이하, 120 nm 이하, 100 nm 이하, 80 nm 이하, 60 nm 이하, 40 nm 이하, 또는 20 nm 이하)의 평균 최대 단면 치수를 가질 수 있다. 일부 경우에서, 복수의 다이아몬드 입자는 10 nm 이상, 20 nm 이상, 40 nm 이상, 60 nm 이상, 80 nm 이상, 100 nm 이상, 120 nm 이상, 140 nm 이상, 160 nm 이상, 180 nm 이상, 200 nm 이상, 400 nm 이상, 600 nm 이상, 700 nm 이상, 800 nm 이상, 900 nm 이상, 1000 nm 이상, 1200 nm 이상, 1400 nm 이상, 1600 nm 이상, 또는 1800 nm 이상의 평균 최대 단면 치수를 가질 수 있다. 상기-언급된 범위들의 조합 역시 가능하다 (예컨대 2 μm 미만 내지 10 nm 이상, 1400 nm 이하 내지 1000 nm 이상). 다른 범위들도 가능하다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본 명세서의 교시를 바탕으로 복수의 다이아몬드의 평균 단면 치수를 결정하기 위한 적합한 방법을 선택할 수 있다. 예시적인 실시양태 세트에서, 복수의 다이아몬드 입자는 900 nm 이하 내지 700 nm 이상의 평균 최대 단면 치수를 가진다. 일부 실시양태에서, 다이아몬드 입자는 (예컨대 대상체 내부의 일정 위치에서) 다른 다이아몬드 입자와 응집물 구조를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다이아몬드 입자의 응집물은 1 um 이상 (예컨대 1 μm 이상, 5 μm 이상, 10 μm 이상, 20 μm 이상, 30 μm 이상, 40 μm 이상, 50 μm 이상, 60 μm 이상, 70 μm 이상, 80 μm 이상, 90 μm 이상) 내지 100 μm 이하 (예컨대 100 μm 이하, 90 μm 이하, 80 μm 이하, 70 μm 이하, 60 μm 이하, 50 μm 이하, 40 μm 이하, 30 μm 이하, 20 μm 이하, 10 μm 이하, 5 μm 이하, 1 μm 이하)의 최대 단면 치수를 가질 수 있다. 상기-언급된 범위들의 조합 역시 가능하다 (예컨대 1 마이크로미터 이상 내지 50 마이크로미터 이하, 1 마이크로미터 이상 내지 100 마이크로미터 이하). 다른 범위들도 가능하다.
일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 (예컨대 대상체 내부의 일정 위치에서) 다른 (나노)다이아몬드 입자와 상대적으로 대형인 응집물 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자의 응집물은 100 마이크로미터 이상, 200 마이크로미터 이상, 500 마이크로미터 이상, 1000 마이크로미터 이상, 2000 마이크로미터 이상, 5000 마이크로미터 이상, 또는 7500 마이크로미터 이상의 최대 단면 치수를 가진다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자의 응집물은 10000 마이크로미터 이하, 7500 마이크로미터 이하, 5000 마이크로미터 이하, 2000 마이크로미터 이하, 1000 마이크로미터 이하, 500 마이크로미터 이하, 또는 200 마이크로미터 이하의 최대 단면 치수를 가진다. 상기-언급된 범위들의 조합 역시 가능하다 (예컨대 1 마이크로미터 이상 내지 10000 마이크로미터 이하, 100 마이크로미터 이상 내지 10000 마이크로미터 이하, 500 마이크로미터 이상 내지 5000 마이크로미터 이하, 1000 마이크로미터 이상 내지 10000 마이크로미터 이하). 다른 범위들도 가능하다.
일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 전자기 방사선을 방출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방출은 형광 방출이다. 특정 실시양태에서, 상기 방출의 파장은 250 nm 이상, 300 nm 이상, 350 nm 이상, 400 nm 이상, 450 nm 이상, 500 nm 이상, 550 nm 이상, 600 nm 이상, 또는 650 nm 이상이다. 특정 실시양태에서, 상기 방출의 파장은 700 nm 이하, 650 nm 이하, 600 nm 이하, 550 nm 이하, 500 nm 이하, 450 nm 이하, 400 nm 이하, 350 nm 이하, 또는 300 nm 이하이다. 상기-언급된 범위들의 조합 역시 가능하다 (예컨대 250 nm 이상 내지 700 nm 이하). 다른 범위들도 가능하다.
특정 실시양태에서, 상기 방출은 근적외선 방출이다. 일부 실시양태에서, 상기 방출의 파장은 700 nm 초과, 750 nm 이상, 800 nm 이상, 850 nm 이상, 900 nm 이상, 또는 950 nm 이상이다. 특정 실시양태에서, 상기 방출의 파장은 1000 nm 이하, 950 nm 이하, 900 nm 이하, 850 nm 이하, 800 nm 이하, 또는 750 nm 이하이다. 상기-언급된 범위들의 조합 역시 가능하다 (예컨대 700 nm 초과 내지 1000 nm 이하). 다른 범위들도 가능하다.
예시적인 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 근적외선 방출 (예컨대 650 nm 이상 내지 750 nm 이하)을 나타내며, 약 700-900 nm의 평균 최대 단면 치수를 가진다. 방출과 단면 치수의 다른 조합도 가능하다. 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 특정 파장을 갖는 전자기 방사선에 의한 여기시 형광 및/또는 근적외선 방출을 방출할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 250 nm 이상, 300 nm 이상, 350 nm 이상, 400 nm 이상, 450 nm 이상, 500 nm 이상, 550 nm 이상, 600 nm 이상, 650 nm 이상, 700 nm 이상, 750 nm 이상, 800 nm 이상, 850 nm 이상, 900 nm 이상, 또는 950 nm 이상의 파장을 갖는 전자기 방사선에 노출될 수 있다 (예를 들면 (나노)다이아몬드 입자가 상기-언급된 범위들 중 하나의 형광 방출 및/또는 근적외선 방출을 방출하도록 함). 특정 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 1000 nm 이하, 950 nm 이하, 900 nm 이하, 850 nm 이하, 800 nm 이하, 750 nm 이하, 700 nm 이하, 650 nm 이하, 600 nm 이하, 550 nm 이하, 500 nm 이하, 450 nm 이하, 400 nm 이하, 350 nm 이하, 또는 300 nm 이하의 파장을 갖는 전자기 방사선에 노출될 수 있다. 상기-언급된 범위들의 조합 역시 가능하다 (예컨대 250 nm 이상 내지 1000 nm 이하, 550 nm 이상 내지 650 nm 이하). 다른 범위들도 가능하다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 일부 경우에서, 본원에서 기술되는 (나노)다이아몬드 입자는 자가-형광성일 수 있다 (예를 들면 (나노)다이아몬드 입자가 예컨대 전자기 방사선의 흡수 후 형광을 방출함). 일부 경우에서, (나노)다이아몬드 입자는 검출 및/또는 정량될 수 있는 근-적외선 형광 및/또는 광발광을 초래하는 1종 이상의 원자-유형 결함 (예컨대 질소-공백(vacancy) (NV) 센터와 같은 점 결함, 질소-공백-질소 (NVN) 결함과 같은 점 결함, 이들의 조합)을 포함할 수 있다. 다른 결함 역시 가능하다 (예컨대 가돌리늄, 유로퓸, 철, Si-공백 결함). 특정 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 적용되는 전자기 방사선에 반응하여 형광을 발한다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, (나노)다이아몬드 입자는 (나노)다이아몬드 입자가 검출가능한 방출 (예컨대 제1 파장과는 다른 제2 파장을 갖는 전자기 방사선)을 방출하도록, (예컨대 제1 파장을 갖는 전자기 방사선을 적용하는 것에 의해) 여기될 수 있다. 특정 실시양태 세트에서, 피분석물이 샘플 중에 존재하는 경우, 피분석물은 (나노)다이아몬드 입자로부터의 방출이 검출 및/또는 정량될 수 있도록 (나노)다이아몬드 입자에 결합된다 (예컨대 (나노)다이아몬드 입자에 결합된 종에 결합됨). 일부 경우에서, 대상체에서의 (나노)다이아몬드 입자 방출의 검출은 (나노)다이아몬드 입자가 의심되는 피분석물에 결합되어 있다는 것을 나타낼 수 있다. 그와 같은 일부 경우에서, 방출은 (예컨대 대상체에 존재하는 피분석물의 상대적인 양을 측정하기 위하여) 정량될 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 특정 실시양태는 (나노)다이아몬드 입자에 결합된 치료제를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 상기 치료제는 치료, 진단 및/또는 강화 작용제, 예컨대 약물, 영양소, 미생물, 생체내 센서 및 추적자 중 1종 또는 조합일 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 치료제는 기능식품, 예방 또는 진단 작용제이다. 명세서 중 많은 부분이 치료제의 사용에 대해 기술하고 있기는 하지만, 본원에서 열거되는 다른 작용제들 역시 가능하다.
작용제에는 대상체 (예컨대 인간 또는 비인간 동물)에게 투여되었을 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 원하는 약학적, 면역원적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 임의의 합성이거나 천연-발생인 생물학적 활성 화합물 또는 물질 조성물이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 특정 실시양태의 맥락에서 유용하거나 잠재적으로 유용한 것은 통상적으로 약물, 백신 및 생물약제(biopharmaceutical)로 간주되는 화합물 또는 화학물질이다. 그와 같은 특정 작용제에는 비제한적으로 질환 또는 병의 의학적 또는 수의학적 치료, 예방, 진단 및/또는 완화 (예컨대 HMG co-A 리덕타제 억제제 (스타틴류) 예컨대 로수바스타틴, 비스테로이드성 항-염증 약물 예컨대 멜록시캄, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 예컨대 에씨탈로프람, 혈액 희석제 예컨대 클로피도그렐, 스테로이드 예컨대 프레드니손, 항정신병제 예컨대 아리피프라졸 및 리스페리돈, 진통제 예컨대 부프레노르핀, 길항제 예컨대 날록손, 몬텔루카스트 및 메만틴, 심장 글리코시드 예컨대 디곡신, 알파 차단제 예컨대 탐술로신, 콜레스테롤 흡수 억제제 예컨데 에제티미브, 대사물 예컨대 콜히친, 항히스타민제 예컨대 로라타딘 및 세티리진, 아편유사제 예컨대 로페라미드, 양성자-펌프 억제제 예컨대 오메프라졸, 항(레트로)바이러스 작용제 예컨대 엔테카비르, 돌루테그라비르, 릴피비린 및 카보테그라비르, 항생제 예컨대 독시사이클린, 시프로플록사신 및 아지트로마이신, 항-말라리아 작용제, 및 신트로이드/레보티록신); 물질 남용 치료 (예컨대 메타돈 및 바레니클린); 가족 계획 (예컨대 호르몬 피임); 수행능력 강화 (예컨대 자극제 예컨대 카페인); 및 영양분 및 보충제 (예컨대 단백질, 엽산, 칼슘, 아이오딘, 철, 아연, 티아민, 니아신, 비타민 C, 비타민 D, 및 기타 비타민 또는 무기질 보충제)를 포함하여, 치료, 진단 및/또는 강화 영역에서 사용하기 위한 단백질, 펩티드, 호르몬, 핵산, 유전자 구성체 등과 같은 분자가 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료제는 1종 이상의 특이적 치료제이다. 본원에서 사용될 때, "치료제" 또는 "약물"로도 지칭되는 용어는 질환, 장애 또는 기타 임상적으로 인식되는 이상을 치료하거나 예방적 목적으로 대상체에게 투여되며 질환, 장애 또는 이상을 개선, 치료 및/또는 예방하는 데에 있어서 대상체의 신체에 임상적으로 유의한 효과를 갖는 작용제를 지칭한다. 알려져 있는 치료제 예의 목록은 예를 들면 미국 약전 (USP), 문헌 [Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Ed., McGraw Hill, 2001]; [Katzung, B. (ed.) Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill/Appleton & Lange; 8th edition (September 21, 2000)]; [Physician's Desk Reference (Thomson Publishing)], 및/또는 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th ed. (1999)], 또는 그의 공개 후의 18판 (2006), [Mark H. Beers and Robert Berkow (eds.), Merck Publishing Group], 또는 동물의 경우 [The Merck Veterinary Manual, 9th ed., Kahn, C.A. (ed.), Merck Publishing Group, 2005]; 및 미국 식품 의약국 (F.D.A.)에 의해 공개된 ["Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence and Evaluations,"] ("오렌지 북(Orange Book)")]에서 찾아볼 수 있다. 인간 용도로 승인되어 있는 약물들의 예는 본원에 참조로 포함되는 21 C.F.R. §§ 330.5, 331 내지 361, 및 440 내지 460하에 FDA에 의해 열거되어 있으며; 수의 용도의 약물들은 본원에 참조로 포함되는 21 C.F.R. §§ 500 내지 589하에 FDA에 의해 열거되어 있다. 특정 실시양태에서, 치료제는 소형 분자이다. 치료제의 대표적인 클래스에는 진통제, 항-진통제, 항-염증 약물, 해열제, 항우울제, 항간질제, 항정신병 작용제, 신경보호제, 항-증식제, 예컨대 항-암제, 항히스타민제, 항편두통 약물, 호르몬, 프로스타글란딘, 항미생물제 (항생제, 항진균제, 항바이러스제, 항-기생충제 포함), 항무스카린제, 항불안제, 정균제, 면역억제제, 진정제, 수면제, 항정신병제, 기관지확장제, 항-천식 약물, 심혈관 약물, 마취제, 항-응고제, 효소의 억제제, 스테로이드성 작용제, 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 항-염증 작용제, 코르티코스테로이드, 도파민제, 전해질, 위장관 약물, 근육 이완제, 영양제, 비타민, 부교감신경흥분제, 자극제, 식욕억제제 및 항수면발작제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 기능식품 역시 약물 전달 장치에 도입될 수 있다. 그것은 비타민, 보충제 예컨대 칼슘 또는 바이오틴, 또는 천연 성분 예컨대 식물 추출물 또는 식물호르몬일 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료제는 1종 이상의 항암 약물 (예컨대 화학치료법 약물)이다.
적합한 항암 치료제의 비-제한적인 예에는 알킬화제 (예컨대 시클로포스프, 부술판, 시스플라틴), 항대사 화합물 (예컨대 엽산 유사체 - 메토트렉세이트, 퓨린 유사체 (예컨대 메르캅토퓨린, 펜토스타틴), 피리미딘 유사체 (예컨대 5-플루오르 우라실), 빈카 알칼로이드, 캄프토테신, 프로테아옴 억제제 (예컨대 제피티닙), 호르몬 (예컨대 스테로이드), 생물학적 아주반트 치료제 (예컨대 항체, 헤르셉틴), 아주반트 치료제 (예컨대 브라프(BRAF), 흑색종), 다브라페닙/타핀라르; 트라메티닙/메키니스트), 생물특이적 항체, 블리나투모맙/블린사이토, 화학표지된 항체 및 브렌툭시맙이 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 치료제는 면역억제제이다. 대표적인 면역억제제에는 글루코코르티코이드, 세포증식억제제 (예컨대 알킬화제, 항대사물질 및 세포독성 항체), 항체 (예컨대 T-세포 수용체 또는 Il-2 수용체에 대하여 유도된 것들), 이뮤노필린에 작용하는 약물 (예컨대 시클로스포린, 타크롤리무스 및 시롤리무스) 및 기타 약물 (예컨대 인터페론, 아편유사제, TNF 결합 단백질, 마이코페콜레이트, 및 기타 소형 분자 예컨대 핀골리모드)이 포함된다.
특정 실시양태에서, 치료제는 호르몬 또는 그의 유도체이다. 호르몬의 비-제한적인 예에는 인슐린, 성장 호르몬 (예컨대 인간 성장 호르몬), 바소프레신, 멜라토닌, 티록신, 티로트로핀-방출 호르몬, 당단백질 호르몬 (예컨대 황체형성 호르몬, 난포 자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, TSH), 에이코사노이드, 에스트로겐, 프로게스틴, 테스토스테론, 에스트라디올, 코르티솔, 아드레날린 및 기타 스테로이드가 포함된다.
일부 실시양태에서, 치료제는 약 2500 달톤 미만, 약 2000 달톤 미만, 약 1500 달톤 미만, 약 1000 달톤 미만, 약 750 달톤 미만, 약 500 달톤 미만, 약 400 달톤 미만의 분자량을 갖는 소형 분자 약물이다. 일부 경우에서, 치료제는 200 달톤 내지 400 달톤 사이, 400 달톤 내지 1000 달톤 사이, 또는 500 달톤 내지 2500 달톤 사이의 분자량을 갖는 소형 분자 약물이다.
일부 실시양태에서, 치료제는 활성 약제 작용제 예컨대 핵산, 펩티드, 박테리오파지, DNA, mRNA, 압타머, 인간 성장 호르몬, 단일클론 항체, 아달리무맙, 에피네프린, GLP-1 수용체 작용제, 세마글루티드, 리라글루티드, 둘라글리티드, 엑세나티드, 인자 VIII, 소형 분자 약물, 프로게스틴, 백신, 서브유닛 백신, 재조합 백신, 다당류 백신, 및 접합체 백신, 톡소이드 백신, 인플루엔자 백신, 대상포진 백신, 프레브나르 폐렴 백신, mmr 백신, 파상풍 백신, 간염 백신, HIV 백신 Ad4-env 클레이드 C, HIV 백신 Ad4-mGag, DNA 백신, RNA 백신, 에타너셉트, 인플릭시맙, 필가스트림, 글라티라머 아세테이트, 리툭시맙, 베바시주맙, 나노입자에 봉입된 임의의 분자, 에피네프린, 라이소자임, 글루코스-6-포스페이트 데히드로제나제, 기타 효소, 세르톨리주맙 페골, 우스테키누맙, 익세키주맙, 골리무맙, 브로달루맙, 구셀쿠맙, 세시키누맙, 오말리주맙, tnf-알파 억제제, 인터류킨 억제제, 베돌리주맙, 옥트레오티드, 테리페라티드, 크리스퍼(CRISPR) cas9, 올리고뉴클레오티드 및 온단세트론으로 이루어진 군에서 선택된다.
본원의 상세한 설명 중 많은 부분이 (형광성) (나노)다이아몬드 입자의 맥락이기는 하지만, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본 명세서의 교시를 바탕으로, 다른 입자도 가능하다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 장치는 소정의 종 (예컨대 1종 이상의 표적 피분석물에 결합할 수 있는 종)과 연계되어 상기 언급된 범위들 중 하나에서 방출을 나타내는 나노입자 (예컨대 실리카 나노입자, 사파이어 나노입자, 석류석 나노입자, 루비 나노입자, 양자점(quantum dot), 양자점-중합체 복합체)와 같은 입자를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 입자는 자가-형광성일 수 있다. 다른 경우에서, 입자는 형광성 분자로 (예컨대 그와 결합되어) 관능화될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 대상체에게 투여된 형광성 (나노)다이아몬드 입자는 간 세포 (예컨대 간세포, 쿠퍼 세포)는 물론 다른 세포 (예컨대 내피)에 대한 접근권을 수득하는데, 이 경우 간에서의 (나노)다이아몬드 입자의 침착은 ((나노)다이아몬드 입자 주입시) 실질적으로 즉각적이다. 그와 같은 일부 실시양태에서, 간에서의 (나노)다이아몬드 입자의 존재는 연장되는데, 예를 들면 단일 주입이 적어도 12주에 걸친 지속적인 입자의 존재를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 간에 존재하는 (나노)다이아몬드 입자는 정상적인 간 세포에는 부정적인 효과를 전달하지 않는다 (예컨대 적어도 3개월 후 측정되었을 때). 일부 경우에서, (나노)다이아몬드 입자 및/또는 결합되는 종 (예컨대 (나노)다이아몬드 입자상에 관능화되는 화학물질 및/또는 유기 첨가제)은 (정상적인 간 세포에 비해) 암 세포 내에의 진입 촉진 및 거기에서의 증가된 축적을 모색할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 항-암 특성을 갖는 치료제가 형광성 (나노)다이아몬드 입자상에 태그부착될 경우, 암 세포 성장을 중지시킬 수 있다 (예컨대 전이 규모 및 그의 진행을 감쇠시킴). 그와 같은 일부 실시양태에서, (예컨대 치료제에 결합된) (나노)다이아몬드 입자는 유리하게도 더 긴 "무진행 질환" 기간 및 감소된 사망률을 제공할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 일부 실시양태에서, 간에서의 전이 부담을 감쇠시키는 것은 유리하게도 간 기능 (그 자체로서 사망률의 중요한 원인)의 개선에 기여할 수 있다.
[ 실시예 ]
하기 실시예는 본 발명의 특정 실시양태들을 예시하고자 하는 것으로서, 본 발명의 완전한 영역을 예시하는 것은 아니다.
실시예 1
설치류 POC (효능) 연구는 중요한 주의사항을 제기하였는데, 다시 말하자면 해부학적 고찰은 신체 내 위치로부터의 NIR을 기록하는 것이 기관- 및 조직-의존성인 방식으로 불투명 및 자가-형광과 연관된 과제를 부과한다는 것을 시사한다. 경동맥 (인간에서는, 피부 표면으로부터 15-20 mm)과 같은 위치에서의 신체 내로부터 포착되는 NIR 신호를 최적화하기 위하여, 하기의 대형 나노다이아몬드 입자를 선택하였다: 동일한 계통의 더 작은 입자에 비해서는 물론 NVN "색상 센터" 계통에 비해서도 탁월한 NIR 방출 (650~720 nm)을 보유하는 입자 계통인 FNDP-(NV)-Z-평균~800 nm (질소-공백을 나타내며, 약 800 nm의 평균 최대 단면 치수를 갖는 형광성 나노다이아몬드 입자). 상기 입자는 (표적화된 임상 시술을 생각해보면) 주입 직후 표적 (혈관-내 혈액 응고물)에 '안착'되므로, 표적 이미지화를 제공하기 위하여, 예컨대 간의 망상내피 시스템에 의한 빠른 흡수를 통한 혈류로부터의 FNDP-(NV)의 빠른 청소를 고려하여 (4분 이내에 혈청으로부터 50 % 청소), FDNP-(NV)의 적재 투여량을 조사하였다.
직접적인 전신 혈류로의 선택된 크기 (Z-평균~800 nm) 입자의 투여는 생각지 않은 배설 경로 (비뇨기 시스템 또는 간담도 시스템)로 인하여 기관 내에서의 무한대는 아니라 할지라도, 장기간인 입자 체류로 이어질 수 있다. 그와 같은 우려는 (배양물 중) 세포에서의 다른 유사한 크기 입자의 연장된 체류가 생물학적 기능 및 생존력의 방해를 시사하였던 시험관내 연구에 의해 지지되고 있다.
단기 및 장기 노출 둘 다시의 래트 기관에서의 FDNP-(NV) 분포를 조사하도록 설계된 본원의 실시예들은 다른 기관은 미미한 분율만을 공유하는 반면, 비장에의 이차 침착을 동반한 간에서의 입자의 기본적인 침착을 입증하였다. 흥미롭게도, 노출 5일 후 간에서의 FDNP-(NV)의 최대 침착은 노출 연구 14일 및 12-주 후에도 변화없이 유지되었다.
FNDP-(NV)의 간-내 국소해부학적 분포에 대한 본 조사는 일반적으로 간 슬라이스 (5-50 μm)의 통상적인 형광 현미경법 (FM) 및 공초점 형광 현미경법 (CFM)에 의해 수행하였다. 또한, 각각 간세포 및 혈관 내피의 대용물로 통상적으로 사용되는 인간 간 암종 세포 (HepG2) 및 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)와 같은 세포에의 FNDP-(NV) 흡수의 동역학에 대한 시험관내 조사를 수행하였다. 시험관내 결과는 FDNP-(NV)를 도입하는 간 세포의 용량은 물론 포식된 입자의 세포이하 분포도 입증하였다.
재료 및 방법
FNDP-(NV)-Z-평균~800 nm: 공급원 및 관능화
카르복실 잔기에 의해 관능화된 FNDP-(NV)-Z-평균~800 nm를 아다마스 나노테크놀로지스(ADAMAS Nanotechnologies) 사 (미국 노스캐롤라이나 랄레이 소재)로부터 구매하였다. 제타사이저 나노(Zetasizer Nano) (말베른(Malvern) 사)에서의 동적 광 산란에 의해, 이전에 보고된 바와 같은 858±47 nm의 평균 직경 및 -56 mV의 Z-전위를 갖는 것으로 FNDP-(NV)의 물리적 특성을 결정하였다. 멸균되고 BSA 차단된 FNDP-(NV)를 세포 기반 연구에 사용하였다.
간 시편은 하기와 같이 수득하였다: 간단하게 말하자면, 스프래그-도울리(Sprague-Dawley) 래트의 대퇴 정맥에 2 mL PBS 중 60 mg/Kg의 FNDP-(NV) 현탁액을 2-3분에 걸쳐 주입하였다. 12주 후, 깊은 (5 % 이소플루란) 마취하에, 기관 혈관구조의 잔류 혈액을 최소화하기 위하여 10 mL의 멸균 식염수로 관류하고 추가적으로 기관 보존을 위해 식염수 중 4 % 파라포름알데히드를 관류하면서, 사혈(exsanguination)에 의해 동물을 희생시켰다. 기관들을 조심스럽게 절제하여, 과량의 10 % 중성 완충된 포름알데히드 (10 % NBF)에 현탁하였다. 다음에, 각각 형광 현미경법 (FM) 또는 공초점 형광 현미경법 (SCM)에 의한 분석을 위한 5 또는 50 μm 슬라이스로의 절편화용으로 파라핀 중에 간 시편을 처리 및 매립하였다. 본 연구에서 평가된 간 시편들은 IVIS에 의한 전체 기관 이미지화 후 절제된 별도 및 전체 엽(lobe)이었다. 조직병리학 조사를 위하여, 간 시편의 5 μm 절편을 독립적인 조직병리학 평가에 의해 헤마톡실린 및 에오신 (H&E 사) 및 매슨(Masson's) 트리크롬으로 염색하였다.
래트 간 시편을 파라핀에 매립하고, 이전에 기술된 바와 같이 5 또는 50 μm 두께로 절편화하였다. 간단하게 말하자면, 크실렌을 사용한 3회의 연속 세정 (각 5분) 후 이어지는 100 %, 95 %, 70 % 및 50 % 에탄올의 2회 연속 세정 (각 10분) 및 탈이온수를 사용한 2회의 최종 세척에 의해, 슬라이드를 탈-파리핀화하였다. FITC-팔로이딘을 사용하여 세포 액틴 필라멘트를 염색하였다. 간단하게 말하자면, 10분 동안의 얼음상에서의 PBS 중 0.4 % 트리톤(Triton) X-100을 사용한 인큐베이션에 의해, 슬라이드를 투과화하였다. 다음에, 실온에서 PBS를 사용하여 슬라이드를 3회 세척하고, 1시간 동안 FITC-팔로이딘 (PBS 중 6 μM)에 침지하였다. 슬라이드를 PBS를 사용하여 3회 세척하고, 핵을 염색하기 위해 DAPI를 함유하는 봉입 완충제(mounting buffer)를 사용하여 봉입하였다. 10x 및 40x (오일 침지) 대물렌즈를 사용하는 형광 현미경에서 5 μm 두께의 슬라이스를 분석하였다. 녹색 형광 필터 세트를 사용하여 FITC-팔로이딘 염색된 마이크로필라멘트를 검출하였으며, 적색 형광 필터를 사용하여 FNDP-(NV)를 검출하였고, 청색 형광 필터를 사용하여 DAPI 염색된 세포 핵을 검출하였다.
FSX100 현미경을 사용한 '봉합(stitching)' 4x 이미지에 의해, 간 시상 단면(sagittal section)의 전체 파노라마 뷰를 구성하였다. 녹색 채널에서 이미지화된 액틴 필라멘트의 가시화를 위하여 50 μm 절편을 FITC-팔로이딘으로 염색하고, FNDP-(NV)의가시화를 위하여 적색 채널에서 절편을 이미지화하였다. 디지털로 이미지들을 수집하고, 이미지제이(ImageJ) 1.51e (NIH, 미국 매릴랜드 베데스다 소재)를 사용하여 추가 처리하였다. 초-저 배율에서 크기가 겨우 수 픽셀이었던 FNDP-(NV)의 가시화를 개선하기 위하여, 최대 엔트로피법(Maximum Entropy method)을 사용하여 적색 채널을 임계화하는 것 및 결과를 3회 확장하는 것에 의해, 입자를 확대하였다.
이미지제이의 애널라이즈 파티클스(Analyze Particles) 기능을 사용하여, 이미지 임계화 후 확장되지는 않은 세포에서의 FNDP-(NV)의 존재도 정량하였다. 4x에서 단일 연속물 (응집물)로 검출된 FNDP-(NV)의 군을 계수하고, 크기분석하였다. 선 높이가 직경에 의한 검출되는 입자의 비율에 해당하는 현미경사진 내에서 검출된 FNDP-(NV) 응집물 크기의 분포를 확인하기 위하여, 수 도표에 의한 크기 분포를 구성하였다. 많은 소형 응집 수는 적은 총 입자 물질 수에 상당할 수 있기 때문에, 수에 의한 크기 분포는 소형 입자 크기의 분포를 확대하도록 치우쳐 간주될 수 있다. 이러한 편향을 감소시키기 위하여, 선 높이가 총 NIR 형광 영역의 비율과 상관되는 단면적에 의한 두 번째 크기 분포 도표도 구성하였다.
FV1000 주사 공초점 현미경을 사용하여 간 슬라이스 (10-50 μm)의 공초점 이미지를 취하고, 플루오뷰(Fluoview) 소프트웨어 (v4.2.2.9 올림푸스(Olympus) 사)에서 60x 오일 침지 대물렌즈를 사용하여 이미지화하였다. 3D 재구성을 위하여, 조직 두께 전체에 걸친 0.5 μm 마다의 이미지를 사용하여 공초점 적층물을 취하였다. 405 nm 여기 및 425-460 nm 방출을 사용한 DAPI 염색에 의해 핵을 가시화하고; 488 nm 여기 및 400-500 nm 방출을 사용한 FITC-팔로이딘에 의해 액틴 세포골격을 가시화하였다. FNDP-(NV)로부터 방출되는 NIR 형광은 543 nm의 여기 및 655-755 nm의 방출을 사용하여 가시화하였다. 플루오뷰에서 2D 최대 강도 투영도 및 단면도를 준비하였다. 이미지제이에서 볼륨 뷰어(Volume Viewer) 플러그인을 통하여 3차원도를 재구성하였다.
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATTC) (미국 버지니아 마나사스 소재)으로부터 HepG-2 (인간 간 간세포 암종) 세포주를 구매하여, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 이글 최소 필수 배지 (EMEM, 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific) 사)에서 배양하였다. 론자(Lonza) 사 (스위스 바젤 소재)로부터 일차 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 구매하여, EGM-2 MV 배지에서 배양하였다. HUVEC는 계대 5-8에서 실험에 사용하였다. 도 1에 예시한 바와 같이, 약간의 변형을 가하여 이전에 공개된 프로토콜에 따라 어느 한 세포주에 의한 FNDP-(NV)의 흡수를 수행하였다. 간단하게 말하자면, 2개의 96-웰 플레이트에 세포를 시딩하고 (웰 당 2 x 104개 세포), 90 % 전면성장까지 성장시켰다. 하나의 플레이트로부터는 배지를 제거하고 (배경 대조군), 100 μL의 PBS 중 4 % 파라포름알데히드 (PFA)를 첨가하여 세포를 고정하였다. 다음에, 대조군 플레이트를 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지를 사용하여 3회 세척하였다. 이어서, 두 플레이트 (고정된 대조군 및 살아있는 샘플)의 각 웰로부터 배지를 제거하고, 나타낸 바와 같이 0.025, 0.05 및 0.1 mg/ mL의 FNDP-(NV)를 함유하는 배지 100 μL로 대체한 후, 0.5-20시간 동안 인큐베이션시켰다. 두 플레이트를 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 행크 평형 염 용액(Hanks' balanced salt solution) (HBSS, 미국 매사추세츠 왈탐 소재 써모피셔 사)으로 3회 세척하여, 과량의 입자를 제거하였다. 다음에, 100 μL의 0.5 % 트리톤 X-100의 첨가 및 궤도 진탕기에서 실온으로의 밤샘 인큐베이션에 의해 세포를 용해시켰다. 분광광도계 (인피니트(Infinite) M200 프로(Pro), 스위스 만네도르프 소재 테칸(Tecan) AG 사)를 사용하여, FNDP-(NV) 연관 NIR 신호 (여기 570 nm, 방출 670 nm)에 대하여 플레이트를 판독하였다. PFA 고정 세포를 포함하는 대조군 플레이트에 부착된 FNDP-(NV)로부터 수득되는 형광을 살아있는 (활성) 세포로부터 측정된 형광으로부터 차감하였다.
세포를 70 % 전면성장시까지 8-웰 챔버 슬라이드 (써모피셔 사)에서 성장시켰다. 0.05 mg/mL의 FNDP-(NV)로 세포를 처리하고, 2 또는 20시간 동안 인큐베이션한 후, 상기한 바와 같이 4 % PFA 중에 고정시켰다. 세포 고정 및 투과화 후, 상기한 바와 같이 FITC-팔로이딘을 사용하여 세포를 염색하였다. 슬라이드로부터 챔버를 제거하고, DAPI (벡타쉴드(Vectashield) 사)를 함유하는 완충제 및 매니큐어액에 의해 고정되는 커버 글라스를 사용하여 봉입을 완료하였다. 다음에, 보존된 간 슬라이스의 형광 현미경법에 기술되어 있는 바와 같이 녹색, 적색 및 청색 필터 큐브를 사용하여 10x 또는 40x의 FM 올림푸스 IX81에서 슬라이드를 분석하였다.
데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. 통계 분석은 시그마플롯(SigmaPlot) 소프트웨어 (시그마플롯® 12 SPSS; 미국 캘리포니아 산호세 소재 시스타트 소프트웨어(Systat Software) Inc. 사)를 사용하여 아노바(ANOVA) (해당될 경우) 및 스투던트 t-검정에 의해 수행하였다. 통계적 유의성은 수행된 독립적 연구의 수에 대하여 P<0.05로 설정하였다.
결과
보존된 간 슬라이스의 형광 현미경 (FM) 및 파노라마 분석.
도 2a는 160x 및 400x 배율로 이미지화된 5 μm 간 조직 슬라이스 내에서의 FNDP-(NV) 분포를 도시한다. 하기 2개의 대표적인 영역을 선택하였다: 혈관 요소가 존재하는 하나 (도 2a), 실질 세포만의 영역인 두 번째의 것 (도 2b). 상부 패널은 FNDP-(NV) 정맥내 (i.v.) 투여 12주 후에 동물로부터 수득된 조직을 나타내며, 하부 패널은 비히클 (PBS) 대조군 동물로부터의 것을 나타낸다. FNDP-(NV) (적색으로 이미지화, 회색 음영 내에 나타냄)는 우측 패널에서 백색 화살표로 식별되는 바와 같이 DAPI 상대 염색에 대비하여 가시화될 수 있다. 5-10 μm의 대형 응집물은 물론, 매우 소형인 크기의 입자도 분명하게 표시된다. 세포 내 또는 세포들 사이의 분포를 평가하기 위하여, 좌측 패널에 나타낸 바와 같이 FITC-팔로이딘을 사용하여 절편을 염색하였다. 대형 응집물에 대해서는 상응하는 황색 (녹색-상-적색)이 가시화됨으로써, 가능한 입자 세포내이입 (좌측 패널 (도 2a 및 2b))을 나타낼 수 있다. 도 2a에서, 매우 소형인 응집물의 적색 형광은 간문맥 (PV) 내피를 나타낼 가능성이 있는 핵에 근접하여 발견될 수 있으나, 대부분은 실질 세포 위치로부터 정맥 공간을 구별하는 것이 상당히 어려운 실질에 분포한다.
도 3a-3h는 2 마리의 서로 다른 FNDP-(NV) 처리 래트로부터의 완전한 시상 단면의 여러 배율에서의 분석을 나타낸다. '봉합된' 이미지의 매우 낮은 유효 배율로 인하여, FNDP-(NV)의 NIR 형광에 민감성인 적색 채널은 방법에서 나타낸 바와 같이 이원 임계화 및 확장에 의해 확대되었다. 이는 단일 픽셀 FNDP-(NV)의 정량 가시화도 가능하게 한다. 도 3a 및 3b는 코어 간 소엽 단위 내에서의 그의 분포에 있어서의 분명한 차등 밀도와도 함께 완전한 "파노라마 경광" 전체에 걸쳐 산란된 입자들을 도시한다. 가시화의 용이성을 위하여, 간 소엽의 선택 수는 "육각형"으로 표시된다. 입자는 정맥 시스템 (황색 박스)에서도 용이하게 발견될 수 있다. 강화 없는 가시화에 적합한 4개 간 소엽 세트 (도 3b에 청색 파선 직사각형으로 표시된 영역)의 확대도를 도 3c에 나타내었는데, 간 소엽 내에서의 입자 분포의 분명한 비균질성을 도시하고 있다. 더 높은 배율의 단일 소엽 (도 3a의 황색 육각형)을 도 3d에 나타내었다. 가시화를 강화하기 위하여, 더 높은 배율의 각 동물로부터의 하나의 대표적인 소엽 (도 3a 및 b에 황색 육각형으로 표시된 바와 같음)을 도 3e 및 f에 나타내었다. 임계화 및 확장 후에는, 간 소엽의 "육각형" 형성에 걸친 비균일한 입자 분포 도시의 더 우수한 예시가 용이하게 드러난다. 일부 입자가 분명하게 중심 정맥을 벗어나서도 존재하기는 하지만, 입자 존재는 "육각형" 주변부 (표지물로서 적색 화살표가 중심 정맥을 표시함)에서 풍부하게 출현한다. 도 3g 및 h는 벽에 부착되어 있으나 혈관 내강 (황색-적색 전이로 가시화)으로 상당히 돌출되어 각각 2개의 예에서 혈관 단면적의 35 % 및 48 %를 차지하는 대형 입자 응집물 (백색 화살표)을 포함하는 정맥 시스템 (도 3a의 황색 정사각형)을 도시한다. 도 3i는 일차 대사 구역을 포함하는 간 소엽 구조의 일반적인 배향 체계를 제공한다.
간 "파노라마" 도면에서의 FNDP-NV 양성 영역의 크기는 상기에서 나타낸 바와 같이 고도로 가변적이다. 이와 같은 분포를 정량하기 위하여, FNDP-NV 양성 영역의 도표를 도 4에 나타내었다. 도 4a에서의 수에 의한 영역의 분포는 단일 픽셀에서 직경 20 μm 영역까지의 많은 수의 FNDP-NV 양성 영역을 나타낸다. 몇 개이기는 하지만, 도 4a에서는 거의 보기 힘든 대형 응집물 (도 3g 및 h)이 간 절편에서 검출되는 총 입자 중 불균형인 물질을 나타내게 된다. 총 입자 물질 중 %를 나타내기 위하여, 총 FNDP-(NV) 양성 영역의 분포를 도 4b에 나타내었다. 면적에 의하면, 입자 응집의 최빈 직경은 대략 14 μm이다. 해당 크기의 응집물이 두번째 동물에서는 발견되지 않기는 하였지만, 한 마리의 동물에서는, FNDP-(NV) 양성 영역의 많게는 20 %를 차지하는 정맥 시스템에서 직경 40-100 μm의 대형 응집을 찾아볼 수 있다.
보존된 간 슬라이스의 공초점 형광 현미경법 ( CFM )
도 5a-5d는 간 절편 (10-50 μm)에서 CFM에 의해 연구된 4개의 서로 다른 구조형태 분절을 나타낸다. 도 5a에서는, 약 5-10 μm인 몇 개의 핵-주변 입자 응집물을 볼 수 있는데 (황색 원 및 화살표), 명확한 세포-내 위치는 아직 확립할 수 없다. 도 5b는 일부가 10-30 μm의 대형 FNDP-(NV) 응집물 (황색 원 및 화살표)을 함유하는 굴모양 문맥을 나타낼 가능성이 있는 세포간 공간을 나타낸다. 적어도 부분적인 내재화의 잠재성을 나타내는 일부 황색 역시 존재하기는 하지만, 강한 적색 착색은 실질 세포 (녹색으로 염색)의 내부 환경으로부터 충분히 먼 위치를 시사한다. 도 5c 및 5d는 정맥, 동맥, 간문맥 및 아마도 담관과 같은 몇 개의 비-실질 구조 (실질 세포에 의해 둘러싸임)를 나타낸다. 도 5c 및 5d에서는, 몇 개의 소형 입자 응집물 (백색 원)이 혈관 내막의 내피-하 구역에 위치하는 반면, 실질 세포 내부에 위치하는 일부 응집물 (황색 원)도 보인다.
도 6은 상이한 양의 도입된 FNDP-(NV)를 포함하는 간세포의 공초점 3D 재구성을 도시한다. 입자의 양이 서로 다른 2개의 영역이 존재하는데; 중앙 패널의 세포는 몇 개를 획득한 반면, 우측 패널의 세포는 매우 대형인 입자 응집물을 축적한 것으로 보인다. 좌측 패널은 비히클 처리된 래트를 나타내는데; 여기에서는 입자가 식별되지 않는다. 제공된 모든 예에서, 해당 세포들의 핵 및 핵소체는 동일한 정상적 표현형을 나타낸다.
배양된 HUVEC 및 HepG -2 세포에의 FNDP -(NV) 흡수의 동역학
도 7a-7d는 다양한 농도 및 시간 과정 조건하에서의 HUVEC 및 HEPG-2 세포에의 FNDP-(NV) 흡수의 동역학을 도시한다. 도 7a-7c는 3종의 서로 다른 FNDP-(NV) 노출 수준에서의 시간 과정을 나타낸다. 각 노출 투여량은 세포체로의 입자의 빠른 흡수라는 동일한 패턴을 나타내었다. 빠른 흡수 단계는 1-2시간 이내에 FNDP-(NV) 노출 양에 비례하여 정점지속상태에 도달하면서 감쇠된다. 도 7d는 3종 FNDP-(NV) 농도에서 각 세포주에 대하여 NIR 형광에 의해 모니터링되는 FNDP-(NV)의 양적 축적을 나타낸다. 총 축적 FNDP-(NV)에 있어서의 차이는 노출 수준 사이에서는 통계적으로 유의성이 있으나, 세포주들 사이에서는 유사하다.
도 8a 및 8b는 시험관내 실험 초기 및 후기 단계에서의 FNDP-(NV) 축적의 FM 현미경사진이다. 초기 단계 (2시간 이하)는 대부분 세포질에서 입자가 나타나는 반면, 종결 시점 (20시간)은 핵-주변 코로나(corona) 형태의 심한 응집을 나타낸다. 도 6c에 나타난 바와 같이, 그와 같은 패턴은 보존된 간 슬라이스 (노출 12주 후)에서도 기록되었었다.
초기 유사분열에서 세포질분열 종료까지의 HUVEC의 이미지를 20시간 동안 FNDP-(NV)로 처리된 세포에 대하여 도 9a에, 그리고 비처리 대조군 세포에 대하여 도 9b에 나타내었다. 후기 단계 세포질분열 및 세포 분리에서의 것을 포함하여, 모든 처리된 세포는 심한 핵-주변 FNDP-(NV) 축적을 나타내었다. 대조군에서도 유사한 관찰이 이루어졌다.
논의
무손상 래트에 주입된 고투여량 (60 mg/Kg) FNDP-(NV)의 육안 분포를 특성화하고, FNDP-(NV) 노출 후 급성 (90분), 준-급성 (5 또는 14일) 및 장기 (12주)로 그의 배치를 추적하였다. 6개 기관 (간, 비장, 폐, 신장, 심장 및 뇌)에 걸친 입자 분포의 분석은 이러한 입자의 일차적인 저장 기관으로서의 간을 확인해 주었다. 기관 조직학 평가에서는 어떠한 FNDP-(NV) 관련 육안 또는 조직학적 부정적 효과도 밝혀지지 않았다. FNDP-(NV)와 관련한 부정적인 효과의 결핍은 보고되어 있는 정상적인 간 기능 시험과 일치한다.
상기한 바와 같이, 간에서의 많은 수의 FNDP-(NV) 입자의 지속은 일반적으로 특히 장기 체류, 어쩌면 무한 존재 맥락에서의 잠재적인 부정적 영향에 관한 우려를 야기하게 된다. 그와 같은 전망은 조절상의 장애를 야기하여 인간 용도의 GLP (우수 실험실 관리기준(Good Laboratory Practice)) 전-임상 개발에 잠재적으로 영향을 줄 수 있다. 상기언급된 확인된 병리학 보고가 조직병리학적 발견의 결핍을 확인해 주기는 하였지만, 본 조사는 하기 세 가지 일차적 목적의 해소를 목표로 하였다: 1. 간세포에서의 세포-내 위치를 포함한 다양한 간 세포에서의 FNDP-(NV) 분포의 포괄적인 조사. 2. 간 소엽 미세혈관 시스템에서의 FNDP-(NV)의 위치지정. 3. HUVEC (내피) 및 HepG-2 (인간 간 암종) 세포와 같은 대용 (대리) 세포 배양물을 사용한 배양된 간 세포에의 FNDP-(NV) 입자 흡수의 동역학 및 그의 세포내 분포 탐구.
이와 같은 연구의 일차적인 결과에는 하기가 포함된다: 1. 실질 세포 (간세포), 비-실질 세포 (혈관 내피 및 외막 세포), 및 정맥 공급 (간문맥) 및 배액 (중심 정맥) 시스템을 포함한 간 소엽에서의 FNDP-(NV) 공간 분포의 고유 패턴을 밝히는 것. 2. 생체내 및 시험관내에서의 간 세포의 FNDP-(NV) 세포내 흡수 및 구획화의 확인. 3. 핵-주변 공간에서의 대형 입자 코로나를 포함하는 세포를 포함한 간 세포의 정상적인 거대 및 미세 형태구조 표현형의 보존 확증. 4. 광범위한 핵-주변 코로나를 포함하는 세포를 포함한 세포 복제에 있어서의 후기 유사분열로부터 세포질분열 완료까지의 생존가능한 세포질분열 과정의 보존.
완전한 "파노라마" 디스플레이("panoramic" display) (도 3a-3b)에 걸친 FNDP-(NV)의 분포는 전반적으로 간 "육각형" 소엽에 흔한 반복적인 패턴을 밝혔다 (도 3d, 3e 및 3f 참조). 입자 응집물은 '간세동이(portal triad)' (PT)를 둘러싸고 있는 간 소엽 주변부에는 더 흔하였으나, CV 주변에 더 근접한 영역에서는 상당히 드물었다. 그와 같은 분포의 메커니즘(들)이 현재 분명하지 않기는 하지만, 간 소엽에 걸친 FNDP-(NV)의 이와 같은 종류의 공간 분포는 몇 가지 수렴되는 인자들의 결과일 수 있다는 가설이 성립된다.
첫 번째로, PV를 통한 FNDP-(NV) 전달은 종종 굴모양혈관 직경에 거의 맞지 않을 수 있거나 심지어는 그것을 초과하는 크기의 응집된 입자를 나타내었다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 검출되는 FNDP-(NV) 응집물 중 30-40 %가 7 μm를 초과함으로써 그것을 굴모양혈관의 더 근접한 부분에서 기계적 포착의 경향이 있게 하였다. 이것이 수 기준 FNDP-(NV) 양성 영역의 대부분을 차지하는 것은 아니지만, 총 FNDP-(NV) 양성 영역의 75-85 %를 이러한 입자가 차지하는데 (도 4b), 이는 굴모양혈관 아래로 더 이동하고, 굴모양혈관을 횡단하여, 전신 혈류로 재순환될 수 있는 상당수의 더 소형인 응집물 (개별적이거나 제한된 반복)에도 불구하고, 소엽 내에서의 강한 형광 편향을 설명할 수 있다. 중심 정맥 (CV)으로의 굴모양혈관 진입 포트에서의 소형 입자의 존재가 이와 같은 가능성을 지지한다 (도 3d 및 3g 참조).
두 번째로, 간의 스캐빈징 기능을 수행하는 쿠퍼 세포 (망상-내피 시스템, RES)는 일반적으로 굴모양혈관에 풍부하며, PV로부터 유출되는 굴모양혈관의 근접 구역에서는 더 그러하다. 이러한 대식세포-유사 세포는 더 소형인 입자에 비해 더 큰 것에 대하여 우선적인 동역학을 갖는 입자들을 빠르게 스캐빈징하는데, 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, FNDP-(NV)의 경우 이는 CV 구역에 비해 PV에 더 근접하여 그의 침착을 증대시키게 된다.
세 번째로, 굴모양혈관/세정맥의 말단 구역은 일반적으로 PV로부터의 굴모양혈관 유출 포트에 비해 더 '넓다(spacious)'. 그와 같은 해부구조는 CV로의, 그리고 더 하류 전신 혈류로의 입자의 청소를 촉진함으로써 CV 부근에서의 입자의 상대적 결핍에 기여하는 혈류역학적 상태를 지지할 수 있다.
네 번째로, 정맥 미세순환 시스템은 간 소엽의 가장 정교한 생화학적 기능을 보장하는 데에 있어서 중요한 요소이다. 본원에서 기술되는 데이터는 간 소엽 외주 (주변 PT)에서의 강화된 존재 및 소엽 전체에 걸친 부족하지만 눈에 띄는 소형 입자 (도 3e 참조)와 함께, PV 및 어쩌면 CV에서의 대형 입자 응집물들의 존재를 분명하게 나타내고 있다. 이러한 공간의 입자들은 굴모양혈관의 혈류 중 정교한 균형을 방해하여 유동을 막는 혈류역학적 교란 (예컨대 난류 유동) 및 울혈을 야기할 수 있다. 유동의 붕괴는 실질 세포에의 산소 전달은 물론 영양소 분배와 관련됨으로써, 간의 합성 및 이화 기능에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 굴모양혈관에서의 미세-혈류역학적 교란이 직접적으로 배제될 수 없기는 하지만, 상세한 조직학적 분석 (보충 자료)은 현미경 수준에서 혈액 울혈 (부분적인 혈류 차단으로 인함), 혈전 (정체로 인함) 또는 허혈 예후 영역을 관찰하는 데에 실패하였다.
그럼에도 불구하고, FNDP-(NV) 분포의 국소형태적 비균질성은 여전히 입자 질량 또는 크기, 세포-내 위치의 위치지정, 그리고 전반적으로 간 단위의 해부구조 및 생리에 대하여 이상 예후를 드러내는 (연구 종결시점에는) 아직 성숙되지 않은 미세-혈류역학적 인자들로 인하여, 생리학적 의미를 가질 수 있다. 더 큰 입자 응집물이 가장 흔한 간 소엽 주변 구역 (도 3h의 구역 1 참조)은 간에서의 많은 중요하고 결정적인 생화학적 및 세포 생존성인 기능들 (예컨대 지방산 산화, 글루코스신합성, 담즙 생성, 외인성물질 대사 및 재생성 세포 재공급)의 장소이다.
미세-환경에서의 간 형태구조의 보존 가능성에 대한 지지사항을 도 6a 및 6b에 나타내었다. 전체 간 표면의 파노라마 영역에 걸친 국소해부학적 조사는 입자 및 그것이 점유하는 면적의 %가 전체 중 작은 (또는 중간인) 분율일 뿐이라는 것을 시사한다. 이와 같은 문서에서 나타낸 데이터는 12주 이전에 생성된 상황을 평가하고 있기 때문에, 급성인 차후의 FNDP-(NV) 노출은 제외될 수 없다.
마지막으로, 입자 내재화의 동역학, 구획화 및 입자 존재하에서의 세포질분열 능력의 생존력을 탐구하기 위하여 단리된 시스템에서의 간 세포의 FNDP-(NV)와의 직접적인 상호작용에 대한 이해를 확보하기 위하여, 세포 배양 연구를 수행하였다. 각 인간 간세포 및 내피 세포의 대용물로 사용된 2종의 서로 다른 세포 유형은 시간- 및 농도-의존성인 방식으로의 세포에의 FNDP-(NV)의 빠른 최초 흡수를 나타내었다. 이와 같은 시험관내 연구는 비-스캐빈징 간 세포 (간세포)에의 FNDP-(NV)의 세포내 흡수에 대한 생체내에서의 관찰을 지지한다.
요약
이와 같은 연구에서는 시험관내 및 생체내에서의 FNDP-(NV)-Z-800 nm의 간 세포와의 상호작용을 연구하였다. 이러한 연구는 해당 세포 및 세포-이하 해상도, 실질 및 비-실질 세포에서의 그의 존재 면에서는 물론, 미세-혈류에서의 FNDP-(NV) 침착의 규모 및 정도에 초점을 맞추었다. 생체내 데이터는 시험관내에서 수행된 연구 (HUVEC, HepG-2 세포)에 의해 보완되었는데, 거기에서의 해당 대용물 간 세포에서의 입자 흡수 및 조립의 직접적인 동역학 연구는 전체 동물 노출 연구로부터 수득된 결과를 지지하였다. 합쳐보면, 상기한 데이터는 FNDP-(NV)의 간 생체-적합성을 강하게 시사하는데, 세포 표현형, 세포골격, 핵 구조의 보존은 물론, 비감쇠 세포질분열 및 세포 복제 면에서 이상 예후를 확인할 수 없었기 때문이다. 이에 따라, FNDP-(NV)는 잠재적으로 정맥내 노출 경로에 의해 FNDP-(NV)에 노출된 인간에 의하여 충분히 허용성일 수 있다.
실시예 2
하기 실시예는 시험관내에서 생체내에서 보고된 약동학 (Cmax 및 최하점) 이내 노출 수준으로 FDP-(NV)~800에 노출된 배양된 인간 제대 내피 세포 (HUVEC) 및 인간 간암 세포주 (HepG-2)에서의 세포 및 생화학적 기능들을 기술한다.
지난 10년에 걸쳐 퍼브메드(PubMed)에 게재된 25,000건이 넘는 논문에 의해 입증되는 바와 같이, 나노의약은 집중적인 전-임상 연구 및 부상하는 임상 탐구 연구를 특징으로 하는 빠르게 성장하는 의학 분야이다. 나노의약은 합성 유기 분자 및 조작된 생물제제들을 뛰어넘는 제약 기술의 '제3의 다리(third leg)'를 제공한다. 나노의약은 생물학적 활성인 나노입자를 특정 세포, 기관 또는 병리학적 과정을 겨냥하는 첨가제에 대한 다양한 재료의 공동-연접을 바탕으로 한다.
현행 주요 관심사로는 고유 특성 (예컨대 "색상 센터(Color Center)") 또는 유기 형광 첨가제에 의한 코팅 중 어느 하나로 인하여 형광을 생성시키는 전자기 자극 (여기 광)에 반응하여 근적외선 (NIR) 광을 방출하도록 조작된 입자가 있다. NIR을 방출하는 능력은 치료제의 표적화된 전달과 함께 있는 그대로의 신체 구조의 이미지화 또는 현행-기술 이미지화 기술 (예컨대 MRI/자기 공명 이미지화, 초음파)의 보조물로서의 가능성을 열었다.
특히 중요한 것으로는 580-620 nm에서의 여기시 입자가 형광이 되도록 함으로써 720-740 nm 피크 범위에서 근적외선 (NIR) 방출을 초래하는 것을 가능하게 하는 질소-공백 (FDP-NV-)을 보유하는 다이아몬드 입자, 예컨대 나노다이아몬드 입자 또는 형광성 다이아몬드 입자가 있다. 그와 같은 입자의 NIR 광 방출은 뛰어난 안정성, 물 및 옥시헤모글로빈과 같은 생물학적 요소에 의한 무시할만한 방해를 나타낸다. 또한, 이러한 입자의 표면은 소형 유기 분자로부터 중합체, 단백질 및 핵산까지 다양한 연결 기회를 제공하는 다양한 화학 기 (카르복실, 아민 등)에 의해 관능화될 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 생물조작된 형광성 다이아몬드 입자-NV-Z~800 nm (FDP-NV)가 뱀독인 디스인테그린, 비티스타틴 (Bit)과 접합된다는 것이 발견되었으며, FDP-NV~800 nm/Bit는 혈소판 피브리노겐 수용체 αIIbβ3 인테그린에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다 (시험관내 및 생체외). 이어서, 생체내 연구는 래트 경동맥에서의 급성으로 생성된 (의인성) 혈액 응고물에의 FDP-NV-Bit의 결합을 입증하였다. 합쳐보면, FDP-NV~800 nm/Bit는 생체내에서의 표적화된 수용이 입증되었으며, 그에 따라 고-위험 혈관 혈액 응고물을 위한 진단 도구로서의 사용 잠재성을 나타내었다.
연구는 3개의 안전성 및 생체적합성 연구로 이어졌는데, 이는 BSA에 의해 차단된 고투여량 (60 mg/Kg, 단일 정맥내 일시주사로 전달)의 FDP-NV~800 nm (FDP-NV)를 무손상 래트에 주입하여, 약동학 프로파일, 기관 분포를 확립하고, 혈액학, 대사 및 생화학적 안전성 바이오마커의 포괄적인 패널을 평가하기 위한 것이었다. 이러한 연구에서는, 5일 내지 12주의 추적 기간 이내에, FDP-NV가 주로 간 및 비장에 분포한다는 것, 그리고 폐, 심장 및 신장에서는 사실상 아무것도 발견되지 않는다는 것이 밝혀졌다. 또한, FDP-NV 입자와 관련된 구체적인 조직병리학적 관찰은 관찰되지 않았다. 그러나, 지금까지의 어떠한 연구도 FDP-NV-800 nm에 노출된 내피 또는 간 실질 세포에서의 가능한 급성 안전성 또는 독성학적 예후를 해소하지는 않았었다.
본 실시예에서는, 2종의 서로 다른 세포-유형 HUVEC 및 HepG-2를 사용하여, 가능한 직접적인 FDP-NV-800 nm 관련 독성학적 효과에 대한 탐색을 연구하였다. 전신 혈류로 주입되었을 때 (예정 임상 징후에 따름) 내피 세포는 FDP-NV에의 첫 번째 노출 라인인 반면, 간세포는 혈류 FDP-NV의 일차적인 저장소이기 때문에, 이들 세포가 선택되었다. FDP-NV 노출 수준은 최대 혈중 수준 및 노출 90분 후의 그의 최하점을 포함한 생체내에서 관찰되는 급성 약동학 수준에 따라 선택되었다. FDP-NV-800 nm를 사용한 급성 생체적합성 연구가 아직 공개된 문헌에 보고되어 있지 않은 것을 고려해보면, 여기에서 제공되는 연구는 인간에서의 원하는 임상 개발의 지지사항으로서의 FDP-NV의 급성 생체적합성에 대한 새로운 정보 및 이해를 제공한다.
전체적인 데이터는 배양된 HUVEC에서의 Cmax 노출로의 단기 증식과 관련한 FDP-NV-800 nm의 합리적인 생체적합성을 지지한다. HepG-2는 동일한 노출 및 시간에서 영향을 받지 않았다.
방법
총괄적으로 세포의 완전성 및 필수 기능들에 대한 이해를 제공하는 다양한 세포 및 생화학적 기능들을 모니터링하였다. 정량 현미경법에 의해, 세포 증식, 이동 및 재생을 평가하였다. MTT 산화환원 반응에 의해 미토콘드리아 (산화) 기능을 시험하였으며, 칼세인 AM 검정에 의해 세포질액 에스테라제 활성을 연구하였다. 샤프롱 CHOP 및 BiP에 의해 ER-스트레스 바이오마커를 조사하였으며, 웨스턴 블럿 (WB)을 사용하여 카스파제-3 활성화에 의한 세포자멸사를 조사하였다. 단백질 (P-Erk 1/2)의 인산화된 형태 및 그의 세포 핵으로의 전위의 검출에 의해, MAPK Erk1/2 신호전달을 평가하였다.
결과
100 μg/mL의 FDP-NV (Cmax)에 대한 HUVEC 세포의 노출은 세포 증식, 세포질액 에스테라제 활성 및 산화 기능에 대한 잠재적인 부정적 효과를 시사하였다. 전-세포자멸사 경로의 활성화 (카스파제 3 활성화)가 그러하였던 바와 마찬가지로, 세포 신호전달 (MAPK Erk1/2) 및 ER-스트레스 바이오마커들은 무손상으로 유지되었다. 유사한 노출 및 시간 프레임에서, 어떠한 이상 시험도 HepG-2 세포에서는 관찰되지 않았는데, 이는 일부 연구에서의 소정 노출 수준에서의 탄력을 입증하고 있다.
재료 및 방법
나노입자의 제조
카르복실-관능화 FDP-NV~800 nm (FDP-NV)를 아다마스 나노테크놀로지스 사 (미국 노스캐롤라이나 랄레이 소재)로부터 구매하였다. 실온 (RT)에서의 15분 동안의 70 % 에탄올 중 현탁 후 이어지는 입자를 단리하기 위한 RT로의 2900xg에서의 7분 동안의 원심분리에 의해, FDP-NV를 살균하였다. 37 ℃에서의 1시간 동안의 3 % BSA (소 혈청 알부민, 미국 미주리 세인트루이스 소재 시그마(Sigma) 사)를 함유하는 PBS (포스페이트 완충 식염수, pH=7.4, 미국 매사추세츠 왈탐 소재 써모피셔 Sci. 사)를 사용한 인큐베이션에 의해, 입자상의 잠재적인 비-특이적 단백질 결합 부위의 수동적 차단을 수행하였다. 상기한 바와 같은 원심분리에 의해 FDP-NV-BSA를 단리하고, 4 ℃에서 1 mg/mL PBS 중 모용액으로서 입자를 저장하였다.17
서로 다른 분산제 중 FDP -NV-800 nm의 Z-평균 및 ζ-전위 분석
세포 실험 (하기 참조)에서 사용되는 다양한 프로토콜에 따라 탈이온수 (DI수), PBS 또는 배양 배지에 BSA (FDP-NV-BSA) 또는 '미접촉' (FDP-NV-COOH, 사전-BSA 차단)으로 차단된 입자를 현탁하였다. HepG-2 (인간 간 간세포 암종) 세포는 10 % 소 태아 혈청 (FBS) (써모피셔 Sci. 사) 및 페니실린/스트렙토마이신 (써모피셔 Sci. 사)이 보충된 이글 최소 필수 배지 (EMEM, 써모피셔 Sci. 사) 중에서 배양하였으며, HUVEC는 EGM-2MV 배지 (론자 사, 스위스 바젤 소재) 중에서 배양하였다. 입자를 0.5 mg/mL 밀도로 분산제로서의 각 배양 배지에 현탁하고, 이중-목적 모세관 큐벳에 적용하였다 (1 mL 총 부피). 샘플을 제타사이저(Zetasizer) 버전 7.11 (말베른 패널리티칼(Malvern Panalytical) Ltd. 사, 영국 말베른 소재)에서 시험하였다.
세포 계수 검정
세포 계수를 수행하였다. 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATTC) (미국 버지니아 마나사스 소재)으로부터 HepG-2 세포주를 구매하였다. 론자 사로부터 일차 HUVEC를 구매하여, 제5-제8 계대 사이에 실험에 사용하였다. 상기한 바와 같은 해당 각 배양 배지에서 세포를 유지하였다 (5 % CO2 분위기하에 37 ℃). HepG-2 및 HUVEC를 96-웰 플레이트 (100 μL의 배지 중 웰 당 2 x 103개)에 '시딩'하고, 24시간 동안 FDP-NV-BSA로 처리하거나 처리하지 않았다. 각 실험에서, 세포-주기 증식 억제제인 빈크리스틴 (50 μg/mL)을 양성 대조군으로 추가하였다. 24시간에, 배지를 제거하고, 4 % 파라포름알데히드 (PFA, 써모피셔 Sci. 사)를 사용하여 세포를 고정한 후, DAPI (4',6-디아미노-2-페닐인돌, 디히드로클로라이드, 써모피셔 Sci. 사)를 사용하여 핵을 염색하였다. 형광 현미경 (올림푸스 IX81, 일본 도쿄 소재 올림푸스 사)에서 100x 배율 및 핵 가시화용 DAPI (청색 필터), 및 FNDP-NV-BSA 가시화용 TRITC (적색 필터)를 사용하여 각 웰 당 7개의 관찰 영역을 이미지화하는 것에 의해, 플레이트를 분석하였다. 디지탈로 설정된 세포 계수기가 구비된 이미지제이 소프트웨어 (국립 보건원, 미국 매릴랜드 베데스다 소재)를 사용한 DAPI 염색된 핵의 분석에 의해, 각 영역에서의 생존가능 세포의 수를 측정하였다.
MTT 검정에 의해 모니터링되는 세포 대사 활성.
구성요소 A (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT)) 및 구성요소 B (SDS (소듐 도데실 술페이트))로 구성되는 세포 증식 검정 키트 (써모피셔 Sci. 사)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 열량측정 검정으로서 MTT 검정을 수행하였다. 간단하게 말하자면, HepG-2 세포 및 HUVEC를 각 세포 유형에 대하여 상기한 배지 중에 웰 당 1 x 104개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간 동안 FDP-NV-BSA 또는 빈크리스틴 (50 μg/mL)으로 세포를 처리하거나 처리하지 않았다. MTT 구성요소 A를 함유하는 페놀 무-적색 DMEM (둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)) (써모피셔 Sci. 사)로 배지 (100 μL)를 교체하였다. 4시간 동안 플레이트를 인큐베이션하고, 동일 부피의 10 % SDS (키트 구성요소 B)를 첨가하는 것에 의해 세포를 용해시켰다. 플레이트를 밤새 인큐베이션하고, 562 nm 파장에서 엘리사 플레이트 판독기 ELx800 (바이오테크(BioTek) 사, 미국 버몬트 위누스키 소재)을 사용하여 판독하였다.
칼세인 AM 세포 세포질액 에스테라제 검정
MTT 검정에 대하여 상기한 바와 같이 HepG-2 세포 및 HUVEC의 시딩 및 처리를 수행하였다. 무-혈청 배지 중에서 5 μg/mL 칼세인 AM (써모피셔 Sci. 사)을 사용하여 세포를 처리한 후, 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 형광 마이크로플레이트 판독기 FLx800 (바이오테크 사)을 사용하여 485 nm 여기 및 530 방출 파장으로 플레이트를 판독하였다.
"상처 치유" ( WH ) 시험관내 검정
HUVEC를 12-웰 플레이트에 시딩하고, 80-90 % 전면성장까지 1-2일 동안 유지한 후, 24시간 동안 FDP-NV-BSA로 처리하거나 처리하지 않았다. 전면성장 HUVEC 세포 (단층)를 플라스틱 주걱 단부를 사용한 플레이트 전체에 걸친 '약한 찰과(gentle scrape)'에 적용함으로써, 대략 1 mm 너비의 간극 영역 (세포가 없음)을 초래하였다. 2 % FBS를 함유하는 것으로 배지를 교체하는 것에 의해 24시간 이동 시간 동안 FNDP-NV-BSA로 처리된 세포를 자극하였다. 대조군 세포 (FNDP-NV-BSA에 비-노출)는 2 % FBS에 의해 자극되는 양성용, 그리고 이동 자극제가 0.1 % FBS로 최소화된 (HUVEC는 FBS의 완전한 제거에 민감하여 표면으로부터 탈착됨) 음성용으로 분할하였다. 상기한 바와 같이, 4 % PFA를 사용하여 세포를 고정하고, DAPI를 사용하여 염색하였다. 형광 현미경 (올림푸스 IX81)에서 20x 배율, 그리고 핵 가시화용 DAPI (청색 필터) 및 FNBDP-NV 가시화용 TRITC (적색 필터)로 스크래치의 이미지화를 수행하였다. 대조군 플레이트는 PFA 노출 직전에 동일한 스크래치에 적용된 전면성장 세포들을 포함하였다. 이미지제이 소프트웨어를 사용한 이미지 중 총 표면적 무-세포 영역의 측정에 의해, 이동 지수를 산정하였다.
MAPK Erk1 /2의 인산화로 나타내어지는 세포 신호전달 검정
상기한 바와 같이, HepG-2 세포 및 HUVEC를 6 cm 직경 페트리 접시에서 90 % 전면성장시까지 배양하고, FDP-NV-BSA (밀도 0.1 mg/mL)로 처리하거나 처리하지 않았다. 세포를 24시간 동안 혈청-고갈시킨 다음, 2 % FBS를 사용하여 0, 10 및 20분 동안 자극하였다. 프로테아제 억제제 '칵테일' (시그마 Inc. 사) 및 '홀트(Halt)" 포스파타제 억제제 칵테일 (써모피셔 Sci. 사)을 함유하는 빙-냉 RIPA (방사성면역침전 검정) 완충제 (테크노바(Teknova) Inc. 사, 미국 캘리포니아 홀리스터 소재) 중에서 세포를 용해시켰다.
미니-프로테안(Mini-PROTEAN) 사전캐스팅 구배 (4-20 %) 젤 (바이오-래드(Bio-Rad) Inc. 사, 미국 캘리포니아 허큘리스 소재)을 사용하여 단백질 용해물 (20 μg)을 SDS-PAGE (소듐 도데실 술페이트, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동)상에 적용하고, 반-건조 블러팅 시스템 (바이오-래드 Inc. 사)을 사용하여 PVDF (폴리비닐리덴 디플루오라이드) 멤브레인 (시그마 Inc. 사)으로 옮겼다. 다클론 항체 (셀 시그널링(Cell Signaling) Techn. 사, 미국 매사추세츠 댄버스 소재)를 사용하여, 포스포- 및 총-Erk1/2의 존재 (멤브레인 '스트리핑' 후의 것)를 검출하였다. C-디지트 블럿 스캐너(DiGit Blot Scanner) (LI-COR Biosci. 사, 미국 네브래스카 링컨 소재)를 사용하여, 멤브레인상 단백질 밴드의 가시화를 수행하였다. 밴드의 강도는 포스포르-Erk1/2 대 총-Erk1/2의 비 계산을 위한 UN-스캔-잇(Scan-It) 소프트웨어 (실크 사이언티픽(Silk Scientific) Corp. 사, 미국 유타 오렘 소재)를 사용하여 정량하였다.
포스포 - Erk1 /2의 핵 전위
세포 용해물의 분별. HepG-2 세포 및 HUVEC를 6 cm 직경 접시에서 성장시키고, FDP-NV (0.1 mg/mL)로 처리하거나 처리하지 않은 후, MAPK Erk1/2 세포 신호전달에 대하여 상기한 바와 동일한 조건하에 '고갈'시켰다. 15분 동안의 250 nM TPA (테트라데카노일 포르볼 아세테이트, 시그마 Inc. 사)에의 노출에 의해, 세포를 자극하였다. 배양 세포용 세포이하 단백질 분별 키트 (써모피셔 Sci. 사)를 사용하여 제조자에 의해 제공되는 프로토콜에 따라 세포의 분별을 수행하였다. 상기한 바와 같은 포스포- 및 총-MAPK Erk1/2를 사용한 WB에 의해 분획들의 세포질 및 핵 추출물을 분석하였다. 세포질 및 핵 분획들의 검증은 각각 항-Mek 다클론 항체 및 항-HDAC1 다클론 항체 (셀 시그널링 Techn. 사)를 사용한 WB 분석에 의해 수행하였다.
세포질 및 핵에서의 포스포 - MAPK Erk1 /2의 검출을 위한 면역세포화학
8-웰 유리 챔버 슬라이드에서 배양된 세포의 면역염색을 전기한 바와 같이 수행하였다. 24종의 세포를 TPA (상기 참조)의 존재 또는 부재하에서 0.1 mg/mL의 FDP-NV-BSA로 처리하거나 처리하지 않았다. FITC-태그부착된 염소 항-토끼 IgG (벡터 랩스(Vector Labs) Inc. 사, 미국 캘리포니아 벌링검 소재)와 연계하여, 다클론 항-포스포-Erk1/2 항체 (셀 시그널링 Techn. 사)를 사용하였다. 형광 현미경 (올림푸스 IX81)에서 오일 대물렌즈를 사용한 400x 배율, 그리고 포스포-MAPK Erk 1/2을 검출하기 위한 FITC (녹색 필터) 및 FNDP-NV를 검출하기 위한 TRITC (적색 필터)를 사용하여 슬라이드를 분석하였다.
세포 세포자멸사 검정 ( 카스파제 -3) 및 내형질 세망 (ER)-스트레스 바이오마커
HepG-2 세포 및 HUVEC를 상기한 바와 같이 0.1 mg/mL FDP-NV-BSA로 처리하였다 (또는 처리하지 않았음). 빈크리스틴 (200 μg/mL)을 사용한 처리를 세포자멸사에 대한 양성 대조군으로, 그리고 투니카마이신 (25 μg/mL)을 사용한 처리를 ER-스트레스에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 절단 및 비-절단 단백질 모두를 인식하는 카스파제 3에 대한 토끼 다클론 항체 (셀 시그널링 Techn. 사)를 세포자멸사 검출에 사용하였다. BiP에 대한 토끼 mAb (클론 C50B12) 및 Chop에 대한 마우스 mAb (클론 L63F7) (모두 셀 시그널링 Techn. 사의 것)을 ER-스트레스의 검출에 사용하였다. 멤브레인 스트리핑, 및 항-액틴 마우스 단일클론 항체 (시그마 Inc. 사)를 사용한 리-프로빙에 의해, 동일한 단백질 적재량을 검증하였다.
결과
다양한 배지에 현탁된 FDP -NV~ 800 nm의 물리적 특성들의 특징
입자 직경 (Z-평균) 및 표면 ζ-전위를 변형시키는 것으로 알려져 있는 다양한 분산제에 FDP-NV~800 nm를 현탁하였다. 도 10은 DI수, PBS (pH = 7.4), 또는 각 세포 배양에 사용된 배지에 현탁된 FDP-NV-COOH (BSA의 수동적인 흡수가 없는 천연 입자) 또는 FDP-NV-BSA의 직경 (Z-평균) 변화를 나타낸다. FDP-NV-COOH가 PBS 중에 현탁되었을 때, 지속적이며 통계적으로 유의한 Z-평균의 증가가 관찰되었다. 입자 크기는 778 nm (DI수 현탁액)로부터 각각 1488 nm (PBS), 1215 nm (HUVEC 배지) 및 1403 nm (HepG-2 세포 배지)로 증가되었다. 입자 (FDP-NV-BSA) 표면에서의 BSA의 수동적인 흡수는 각 용액에서 관찰된 증가를 중화시켰다. ζ-전위는 더 양성인 전하 내지 등전으로의 경향으로 실질적으로 영향을 받았다 (예컨대 도 10b). DI수에 분산된 FDP-NV~800 nm-COOH의 ζ-전위는 -47.9 mV이었는데, 각각 입자가 PBS 중에 침지되었을 때 -21.9 mV, HUVEC 배지의 경우 -9.9 mV, HepG-2 세포 배지의 경우 -10.9 mV로 그것이 증가되었다. 그러나, Z-평균에 대한 영향과 달리, BSA에 의한 FDP-NV의 수동적인 코팅은 FDP-NV-COOH의 ζ-전위에 대하여 최소한의 영향을 나타내었다. HUVEC 또는 HepG-2에 사용되는 배지가 Z 평균 또는 ζ-전위 중 어느 하나에 대한 그의 영향에 있어서 서로 다르지 않았다는 것은 주목할만하다.
HUVEC 또는 HepG -2 세포 증식에 대한 FDP -NV의 효과
24시간에 걸친 세포 수의 증가로부터 추론되는 바와 같이, HepG-2 세포주는 FDP-NV-BSA (0.1 mg/mL까지)의 존재에 의해 영향을 받지 않았다 (도 11a). 반면, 고농도의 FDP-NV (0.1 mg/mL FDP-NV-BSA)에 노출된 HUVEC는 대략 60 %까지의 세포 수에 있어서의 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. HUVEC의 노출 후 영향은 더 낮은 농도 (1/10)의 입자까지 관찰되지 않았다 (도 11). 예상대로, 빈크리스틴은 각각 HepG-2 및 HUVEC에서 대조군의 50 % 및 80 %까지 증식을 억제하였다. 0.1 mg/mL FDP-NV-BSA로 24시간 동안 처리된 세포의 대표적인 이미지는 세포에의 입자 축적 흡수, 및 특히 HUVEC에서의 그의 핵-주변 응집을 확인해 주었다 (도 11d). 덜 두드러지기는 하지만 유사하게, HepG-2 세포 역시 세포질에서의 FDP-NV-BSA의 축적 및 핵주변 코로나의 형성을 나타내었다 (예컨대 도 11c). 이와 같은 관찰은 두 세포 유형에서의 최근에 보고된 연구와 일치하였다.20
배양된 HUVEC 또는 HepG -2 세포에서의 산화환원 강도에 대한 FDP -NV-BSA의 효과
MTT에 의해 평가되었을 때의 배양된 HepG-2 세포의 산화환원 상태는 Cmax (0.1 mg/mL, 도 12a)를 포함한 일부 농도에서 FDP-NV-BSA의 존재에 대하여 탄력적이었다. 반면, HUVEC는 약동학적 혈중 농도의 Cmax 및 최하점 (0.01 mg/mL) 이내의 노출 수준에서 감소되는 산화 능력을 나타내었다. 그러나, 더 낮은 FDP-NV-BSA 시험 농도 (0.001 mg/mL)에서는, MTT 활성이 비처리 대조군의 것과 구별불가능하였다 (도 12b). 양성 대조군인 빈크리스틴은 두 세포 유형에서 정상 대조군의 ~ 25-30 %까지 산화환원 활성을 감소시켰다.
HUVEC 또는 HepG -2 세포 세포질액 에스테라제 활성에 대한 FDP -NV-BSA의 효과
칼세인 AM 검정은 세포질액에서의 비-특이적 에스테라제 활성에 대한 정보를 제공하였다. 도 13은 HepG-2 세포에서의 이와 같은 시험의 편차 없음을 나타내는 반면 (도 13a), HUVEC (도 13a)는 0.1 mg/mL FDP-NV 농도에서의 ~ 30 %의 감소, 및 최하점 수준의 노출 (0.01 mg/mL)에서의 방해 없음을 나타내었다.
시험관내 " 스크래치 " 손상 모델에서의 FBS에 의해 자극된 HUVEC 이동에 대한 FDP -NV-BSA의 효과
'상처 치유'의 시험관내 모델에서 세포 이동에 대한 FDP-NV-BSA의 효과를 조사하였다 ("스크래치 검정", 도 14). 이와 같은 검정은 HUVEC에 대해서만 적용되었는데, HepG-2의 성장 패턴 (콜로니의 클러스터 형성)이 이와 같은 시험에는 적합하지 않았기 때문이다. 인공적으로 생성된 무-세포 영역 (스크래치 영역)에 걸친 세포 이동의 정량은 대조군, 비처리 세포, 및 FDP-NV-BSA에 노출된 세포 사이에서 차이를 밝히지 못하였다. 2 % FBS로 처리된 HUVEC는 높은 입자 농도 (0.1 mg/mL, 도 14a)에 노출된 경우에도 용이하게 이동하였다. 흥미롭게도, 형광 현미경 이미지들은 활성 세포 ("스크래치 구역"으로 이동) 및 스크래치 구역 외부에 위치하는 "고정(stationary)" 세포에서 내재화된 FDP-NV-BSA (중복되는 청색 및 적색 색상, 상이한 회색 음영으로 나타냄)의 시각적으로 유사한 입자 부하를 나타내었다 (도 14b).
HUVEC 및 HepG -2 세포에서의 MAPK Erk1 /2의 활성화에 대한 FDP -NV-BSA의 효과
도 15는 자극 후 2개 시점 (10- 및 20-분)에 0.1 mg/μL FDP-NV-BSA에 노출되거나 노출되지 않은 HUVEC 및 HepG-2 세포 사이에서 MAPK Erk1/2의 FBS-유도 활성화에 있어서의 유의한 차이는 없음을 나타낸다. 흥미롭게도, HepG-2 세포는 10분에 FBS 자극의 정점지속상태에 도달한 반면 (도 15a), HUVEC는 20분에 MAPK Erk 1/2의 최대 인산화에 도달하였다 (도 15b).
세포질액으로부터 핵으로의 단백질의 전위는 FNDP-NV의 집중적인 핵-주변 축적에 의해 영향을 받을 수 있는 패러다임들 중 하나이다. 이에 따라, 이와 같은 과정의 적용 자극제인 TPA를 사용하여, 핵으로의 포스포-MAPK Erk 1/2의 전위를 시험하였다. 이를 위하여, 세포를 분별하고, WB (도 16a-16b) 및 형광 현미경법 (도 16c-16d)에 의해 세포질 및 핵 분획에서 포스포- 및 총-MAPK Erk1/2를 평가하였다. HepG-2 세포 (도 16a) 및 HUVEC (도 16b)은 해당 각 핵 또는 세포질에서의 포스포/총 MAPK Erk1/2의 양에 있어서 FND-NV-BSA 노출 및 대조군 (노출 없음) 세포 사이에 차이를 나타내지 않았다. TPA에의 노출이 FDP-NV-BSA의 내재화 및 핵주변 축적을 강화하며, 이는 형광 현미경 이미지에서 강한 황색 색상 (적색과 녹색의 중복)으로 관찰될 수 있다는 것을 알아야 한다 (도 16c-16d).
세포자멸사 및 ER-스트레스의 유도에 대한 FDP -NV-BSA의 효과
세포 세포질로의 FDP-NV-BSA의 내재화 및 핵주변 축적은 세포자멸사 또는 ER-스트레스의 활성화에 의해 발현되는 바와 같은 스트레스 조건으로 이어지는 핵과 세포질액 사이에서의 필수 교류에 있어서의 가능한 방해를 시사할 수 있다. 이에 따라, WB를 사용하여, 카스파제 3 활성화 및 발현 샤프롱 단백질, CHOP 및 BiP와 같은 스트레스 조건에 대하여 HepG-2 세포 및 HUVEC 둘 다의 바이오마커들을 평가하였다 (도 17). 빈크리스틴 (양성 대조군, 도 17a)과 달리, FDP-NV-BSA (0.1 mg/mL)에의 노출은 세포들 중 어느 하나에서 카스파제 3의 활성화를 산출하지 않았다. FDP-NV의 강한 핵주변 축적은 실험 시간 이내에는 예후 없이 지속하는 것으로 보인다. 2종 샤프롱 단백질인 CHOP 및 BiP의 발현 역시 FDP-NV의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 또한, HepG-2와 HUVEC 사이에 눈에 띄는 차이는 존재하지 않았다 (도 17b). 두 유형의 세포는 ER-스트레스 단백질 활성화의 표준 대조군으로 사용되는 투니카마이신에 대하여 민감성이었다.
논의
본 실험 세트는 FDP-NV (800 nm)의 안전성을 탐구하는 것을 목표로 하는 것으로서, 단계 I 임상 연구를 위한 우수 실험실 관리기준 (GLP) 및 우수 제조 관리기준 (GMP)을 개시하기 전의 해당 입자의 전-임상 평가의 일부를 구성한다. 노출 5일, 14일 또는 12주 후에 걸쳐 모니터링되는 이환율 및 사망률의 결핍으로부터 추론되는 바와 같이, 무손상 래트에게 비교적 고투여량으로 정맥내 투여되는 FDP-NV-800 nm의 안전성 및 허용성에서 높은 생체적합성이 나타났다. 이들 연구 모두에서, 간, 신장 및 폐에서의 혈액 세포 수 및 차이, 또는 조직병리학적 관찰을 포함하여, 혈액학적 및 생화학적 기능 이상은 검출되지 않았다. 또한, 고투여량 FDP-NV-800 nm의 급성 주사 후 약동학 범위는 전신 혈류로부터의 빠른 청소, 및 간 및 비장에의 빠른 업-로드(up-load)를 나타내었다. 간 및 비장에 침착된 입자가 12주 추적에 걸쳐 유지되었다는 것을 아는 것이 중요하다.
본 실험은 급성 시험관내 환경에서의 FDP-NV-800 nm의 잠재적인 부정적 효과를 해소함으로써, 생체내에서는 조직학적 및 조직화학적 바이오마커에 의해 구별될 수 없는 잠재적인 생화학적 결과에 대한 더 깊은 이해를 얻도록 설계되었다. 동일한 FDP-NV 크기 (~800 nm)를 조사한 공공 데이터 기록을 찾아볼 수 없기 때문에, 이와 같은 연구는 당위성을 가진다. 또한, 노출 후 상쇄 메커니즘으로 인하여, 준급성 또는 만성 투여 연구에서는 급성 안전성 바이오마커가 나타나지 않을 수 있다.
다른 입자 크기, 형상 및 아주반트를 사용하여서이기는 하지만, 세포 기능과의 나노다이아몬드 입자의 부정적인 상호작용에 대해서는 이미 보고되어 있다. 해당 보고서들은 특히 입자의 주입 동안 및 그 직후에 최대 혈중 농도 (Cmax)에 노출되게 되는 세포의 세포 기능에 대한 FDP-NV~800 nm의 효과를 조사하는 것의 중요성을 강조하고 있다. 당연히, 내피 세포 및 혈중 혈액 세포가 급성 고투여량 노출의 가장 중요한 표적이며, FDP-NV-800 nm의 즉각적인 저장소 역할을 하는 간 세포가 그러하다. 실제로, HUVEC 및 HepG-2 세포를 사용한 FDP-NV~800 nm의 예비 연구는 노출 20-24시간 후에 걸쳐 "코로나화"를 형성하는 궁극적인 핵-주변 구역 조립을 동반하는 이러한 세포 각각의 세포질로의 (1-2시간에 걸친) 입자의 흡수를 밝혔다. 그러나, 이러한 표적 세포들의 세포발생 및 세포 분할은 보존됨으로써, 핵 내외의 세포 주기 및 트래피킹(trafficking)은 무손상으로 유지된다는 것을 시사하였다.
본 연구는 세포 증식, 이동 및 신호 전달 ER-스트레스, 그리고 세포 완전성에 중요한 세포자멸사를 포함한 추가적인 핵심 세포 기능 및 생화학적 과정들을 조사하는 것으로 관찰을 확장한다. 본 연구는 생체내 (래트)실험에서의 고투여량 (60 mg/Kg) 주입 후 수득된 약동학 데이터에 따랐다. 본고에서 기술되는 연구에서, 배양된 세포는 24시간에 걸쳐 Cmax 수준 (주입 직후, 0.1 mg/mL) 또는 최하점 (0.01 ug/mL, 주입 90분 후)에 노출되었다.
전해질, 단백질 및 다양한 유기 첨가제를 함유하는 용액에의 현탁시의 FDP-NV-COOH의 크기 변화와 관련된 잘-알려져 있는 문제가 해소되었다. 실제로, DI수 (제조자에 의해 제공되는 천연 생성물)에서의 FDP-NV~800 nm-COOH의 Z-평균 및 ζ-전위를 모니터링하는 것은 제조자의 정보 (Z-평균의 경우 778 nm 및 ζ-전위의 경우 -48 mV)와의 밀접한 유사성을 밝혔다. PBS 또는 배양 배지에 입자를 분산시키는 것에 의해 생성되는 Z-평균의 지시된 이동은 3 % BSA의 존재하에서는 무산되었으나, ζ-전위 이동에 대해서는 약간의 (또는 무시할만한) 영향을 나타내었다 (도 10a-10b). 실험 결과상에서의 지속되는 ζ-전위 변화의 가능한 영향은 상세하게 탐구될 여지가 있다.
나노다이아몬드 입자 (NDP)의 세포 효과는 MTT 검정에 의해 보고되는 바와 같이 주로 세포 생존력 면에서 다양한 배양 세포 유형들을 사용하여 시험관내에서 집중적으로 조사되어 왔다. 일반적으로, NDP는 완전 배지에서 인큐베이션되는 경우, 대부분의 세포 유형에 의해 충분히 허용성이다. 미토콘드리아-의존성 호흡 연쇄는 상대적으로 극히 높은 농도인 1 mg/mL에서도 NDP에 의해 영향을 받지 않는다. 0.1 mg/mL인 Cmax 농도에서의 캡핑(capping) 노출은 HepG-2 세포주의 산화환원 상태에 방해가 없음을 시사함으로써 (도 11), 다른 암 세포주에 대한 선행 보고서들과 일치하였다. 반면, HUVEC에서는 상당한 억제 효과가 적시됨으로써 (도 11b), 무한증식 HUVEC-ST 세포주를 사용한 이전의 데이터와 일치하였다. 직접 세포 계수 및 칼세인 AM 검정은 0.1 mg/mL에서는 HUVEC의 세포질액 에스테라제 활성에 대한 입자의 방해도 시사하였지만, MTT와 달리, 0.01 mg/mL의 더 낮은 (최하점) 수준에서는 효과가 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 세포주와 달리 일차 세포는 중요한 생화학적 과정 및 전체적인 세포 기능 면에서 FDP-NV에 더 민감성일 수 있다는 것을 시사한다.
전-증식 세포 신호전달 경로인 MAPK Erk 1/2은 어느 한 세포 유형에서의 Cmax 투여량 FDP-NV에의 노출에 의해 영향을 받지 않았다 (도 15). 입자의 집중적인 핵-주변 축적은 세포질액-핵 교차 트래피킹에 있어서의 이와 같은 "코로나화"에 의한 잠재적인 방해를 시사하였다. 이와 같은 가능성은 핵에의 포스포 Erk 1/2의 전위를 트래피킹하는 것에 의해 조사되었다. 도 16은 강한 작용제인 TPA에 의한 이와 같은 신호전달 경로의 활성화 후 핵에서의 P~ 포스포-Erk 1/2의 존재를 나타낸다. 마찬가지로, FDP-NV는 어떠한 FDP-NV 농도에서도 세포자멸사의 중심 경로 (카스파제-3)를 활성화하지 않았다 (도 17). 합쳐보면, 데이터는 FDP-NV-BSA의 물리적 존재가 Cmax에서는 HUVEC를 소정의 스트레스 조건에 처하게 하지만 최하점 노출 수준에서는 그렇지 않는 것으로 보인다는 것을 시사한다. 그러나, 최고 FDP-NV 노출에서도 완전히 이동하는 HUVEC의 능력 (도 14 참조)은 세포-내 입자 부하에 대한 기능적 민감성의 불균형을 시사한다.
HepG-2 세포는 일반적으로 HUVEC과 비교하였을 때 일부 시험에 대하여 탄력적인 것으로 보인다. 일부 경우에서는, HUVEC '상처 치유' 모델 ("스크래치 검정")에서 사용된 것과 동일한 노출 수준에서의 HepG-2 세포 이동에 대한 NDP의 부정적인 효과가 관찰되었다. 예를 들어, 50-100 μg/mL FND에의 HepG-2 세포의 노출은 이동의 25-50 % 억제를 초래하였으며, 이것이 200 μg/mL에서는 동일한 시간 프레임 (24시간)에 걸쳐 더 억제되었다 (90 %). 이러한 노출 수준이 본원에서 보고된 데이터에 부합하여 (도 10) HepG-2 세포 증식을 방해하지 않는다는 것을 아는 것이 중요하다. 2개 데이터 세트 사이의 차이는 일부 기존 시스템 대 본 개시내용에서 사용된 카르복시-관능화 FDP-NV의 입자 크기 (100 nm 대 800 nm) 및 비-관능화 NDP의 물리적 특성에 있어서의 격차를 나타낼 수 있다.
시험관내에서, 연구는 어느 한 세포 유형이 24시간에 걸쳐 입자에 노출되었음을 나타내었으나; 일부 기존 시스템의 약동학 데이터는 생체내에서 내피 세포가 15-30분 이하 동안 Cmax 수준의 FDP-NV에 노출된다는 것을 나타내는데, 간으로의 빠른 청소가 입자 주입 90분 후 이내에 혈중 수준을 <10 μg/mL로 고갈시키기 때문이다. 이렇게 볼 때, 이는 FNDP-NV~800 nm가 세포 노출 1-2시간 후 이내에 간세포의 세포질액에서 관찰된다는 것을 나타낸다. 그러나, 적격인 생체내의 짧은 노출 시간 이내에, 입자의 세포내 수준은 연장된 (24시간) 시험관내 고정 FDP-NV 농도에 비해 수배 더 낮아진다. 모든 스트레스 조건에 걸친 HepG-2 주의 탄력은 12주 추적에 걸친 래트에의 고투여량 FDP-NV-800 nm 주입 후 생체내에서의 간세포 건강의 관찰에 신뢰성을 부여한다.
합쳐보면, FDP-NV-800 nm는 무손상 래트에 생체내로 주입되었을 때 부정적인 효과를 나타내지 않음은 물론18-20, 해당 세포가 시험관내에서 적용된 7종의 '스트레스 시험' 전체에 걸쳐 배양된 HepG-2 세포주에서 어떠한 부정적인 예후도 존재하지 않았다. 일부 경우에서의 면역-염증 세포 또는 다른 세포/기관과 관련된 이상 예후, 특히 고용량 포식작용, 또는 이면의 병리학적 상태를 악화시킬 수 있는 시동 효과가 있는 것들을 배제할 수는 없다. 이와 같은 연구에서 수득된 결과는 생체내 이미지화를 위해, 그리고 약물 및 치료제의 전달을 위한 비히클로서의 FDP-NV~800 nm의 추가적인 개발이 정당화될 수 있다는 것을 나타낸다.
요약
본 실시예는 시험관내에서 내피 (HUVEC) 및 간 (HepG-2) 세포와 관련하여 FDP-NV~800 nm의 생체적합성을 입증하고 있다. 이와 같은 연구는 그것이 (래트 모델의) 생체내에서의 입자 약동학의 범주 내에서 생체적합성을 조사한다는 점에서 기존의 시스템과 구별되는 것으로 보인다. HUVEC는 FDP-NV~800 nm 축적에 대하여 HepG-2 세포에 비해 더 민감성이며; 이와 같은 관찰은 상위 노출 수준 (Cmax)에서 어떠한 부정적인 반응으로도 기술되지 않았다고 결론을 내릴 수 있다. HUVEC에서의 특정 생화학적 기능에 있어서의 약한 내지 중간 정도의 방해를 고려하고 생체내에서 입자가 나타내는 약동학 프로파일에 비추어 보면, 내피에 대한 제한된 이상 예후를 예측하는 것이 그럴듯하다. FDP-NV~800 nm 상위 투여량하의 생화학 시험들 각각 및 모두에 있어서의 HepG-2 세포의 탄력은 해당 기관에서의 입자의 연장된 체류에도 불구하고 정상적인 간 기능에 대한 생체내 데이터를 지지한다. 전체적으로, 이와 같은 실시예에서 수득된 결과는 FDP-NV-800 nm가 생체내 이미지화에, 및/또는 약물 및 치료제의 전달을 위한 비히클로서 유용할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 몇 가지 실시양태가 본원에서 기술 및 예시되기는 하였지만, 관련 기술분야 통상의 기술자라면 본원에서 기술되는 기능을 수행하고/거나 본원에서 기술되는 결과 및/또는 장점들 중 하나 이상을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조들을 용이하게 떠올리게 될 것이며, 그와 같은 변이 및/또는 변형들 각각은 본 발명의 영역에 속하는 것으로 간주된다. 더 일반적으로, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본원에서 기술되는 모든 파라미터, 치수, 재료 및 구성들이 대표적인 것을 의미한다는 것, 그리고 실제 파라미터, 치수, 재료 및/또는 구성들은 본 발명의 교시가 사용되는 구체적인 적용분야 또는 적용분야들에 따라 달라지게 된다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 일상적인 것 이하의 실험을 사용하여 본원에서 기술되는 본 발명의 특정 실시양태들의 많은 등가물들을 인식하거나 찾아낼 수 있게 될 것이다. 이에 따라, 전기한 실시양태들이 단지 예로서 제시되었다는 것, 그리고 첨부된 청구범위 및 그의 등가물의 영역 내에서 본 발명이 구체적으로 기술 및 청구된 것과 다르게 실시될 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 본원에서 기술된 각 개별 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 해당 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법이 상호 불일치하지 않는 경우, 2종 이상의 그와 같은 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법의 어떠한 조합도 본 발명의 영역 내에 포함된다.
본원의 명세서 및 청구범위에서 사용될 때의 단수형 "하나"는 분명하게 반대로 나타내지 않는 한 "적어도 1종"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원의 명세서 및 청구범위에서 사용될 때의 "및/또는"이라는 어구는 그렇게 연결되는 요소들 중 "어느 하나 또는 둘 다", 즉 어떤 경우에는 함께 존재하며 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소들을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 분명하게 반대로 나타내지 않는 한, 구체적으로 밝힌 요소들과 관련되는지 또는 관련되지 않는지에 관계없이, "및/또는"이라는 문구에 의해 구체적으로 밝힌 요소들이 아닌 다른 요소가 임의적으로 존재할 수도 있다. 이에 따라, 비-제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방-종료형 언어와 함께 사용되는 경우의 "A 및/또는 B"라는 언급은 일 실시양태에서는 B 없는 A를 (임의적으로 B가 아닌 다른 요소 포함); 또 다른 실시양태에서는 A 없는 B를 (임의적으로 A가 아닌 다른 요소 포함); 또 다른 실시양태에서는 A 및 B 둘 다를 (임의적으로 다른 요소 포함) 지칭할 수 있는 등이다.
본원의 명세서 및 청구범위에서 사용될 때, "또는"은 상기에서 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록 중 항목들을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것, 즉 수많은 요소들 또는 목록상 요소들 및 임의적으로 추가적인 목록화되지 않은 항목들 중 적어도 1종을 포함하는 것, 그러나 또한 1종을 초과하는 요소를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. "~ 중 오직 1종" 또는 "~ 중 정확히 1종", 또는 청구범위에서 사용될 경우 "~로 이루어진"과 같이 분명하게 반대로 나타내는 용어들 만이 수많은 요소들 또는 목록상 요소들 중 정확히 1종 요소의 포함을 지칭하게 된다. 일반적으로, "어느 하나", "~ 중 1종", "~ 중 오직 1종" 또는 "~ 중 정확히 1종"과 같은 배제성의 용어에 선행하는 경우, 본원에서 사용될 때의 "또는"이라는 용어는 배제적인 대안들 (즉 "둘 다가 아닌 1종 또는 다른 것")을 나타내는 것으로만 해석될 수 있다. 청구범위에서 사용될 때의 "본질적으로 ~로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용될 때의 그의 통상적인 의미를 가질 수 있다.
본원의 명세서 및 청구범위에서 사용될 때, 1종 이상 요소들의 목록에 대한 언급에서의 "적어도 1종"이라는 어구는 요소 목록의 요소들 중 임의의 1종 이상에서 선택되나 반드시 요소 목록 내에서 구체적으로 열거된 각각의 모든 요소 중 적어도 1종을 포함하지는 않으며 요소 목록 중 요소들의 임의의 조합을 배제하지는 않는 적어도 1종의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이와 같은 정의는 임의적으로는 구체적으로 밝힌 요소들과 관련되는지 또는 관련되지 않는지에 관계없이, "적어도 1종"이라는 어구가 언급하는 요소 목록 내에서 구체적으로 밝힌 요소가 아닌 다른 요소가 존재할 수 있다는 것도 가능하게 한다. 이에 따라, 비-제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 1종" (또는 등가물로서 "A 또는 B 중 적어도 1종" 또는 등가물로서 "A 및/또는 B 중 적어도 1종")은 일 실시양태에서는 B가 존재하지 않고 임의적으로 1종 초과를 포함한 적어도 1종의 A를 (및 임의적으로 B가 아닌 다른 요소 포함); 또 다른 실시양태에서는 A가 존재하지 않고 임의적으로 1종 초과를 포함한 적어도 1종의 B를 (및 임의적으로 A가 아닌 다른 요소 포함); 또 다른 실시양태에서는 임의적으로 1종 초과를 포함한 적어도 1종의 A 및 임의적으로 1종 초과를 포함한 적어도 1종의 B를 (및 임의적으로 다른 요소 포함) 지칭할 수 있는 등이다.
일부 실시양태는 방법으로서 구현될 수 있으며, 그의 다양한 예들이 기술되어 있다. 방법의 일부로서 수행되는 행위들은 어떠한 적합한 방식으로도 순서화될 수 있다. 이에 따라, 상기에서 구체적으로 기술된 실시양태에서 행위들이 순차적으로 수행되는 것으로 나타나 있다 할지라도, 기술된 것과 (예컨대 다소) 다른 행위를 포함할 수 있고/거나, 동시에 일부 행위들을 수행하는 것을 포함할 수 있는, 예시된 것과 다른 순서로 행위들이 수행되는 실시양태들이 구성될 수 있다.
청구 요소를 수식하기 위한 청구범위에서의 "첫 번째", "두 번째", "세 번째" 등과 같은 서수 용어의 사용은 그 자체로는 또 다른 것에 대비한 일 청구 요소의 임의의 우선, 선행 또는 순서, 또는 방법의 행위가 수행되는 시간 순서를 암시하지 않으며, 오히려 단순히 청구 요소들을 구별하기 위하여 특정 명칭을 갖는 일 청구 요소를 (서수 용어의 사용을 제외하면) 동일한 명칭을 갖는 또 다른 요소로부터 구별하는 표지로 사용된다.
청구범위는 물론 상기 명세서에서, "포함하는", "포함한", "보유하는", "가지는", "함유하는", "~과 연관된", "유지하는" 등과 같은 모든 전환 구는 개방-종료형인 것으로, 즉 포함하나 그것으로 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허국 특허 특허 심사 절차 매뉴얼(Patent Office Manual of Patent Examining Procedures) 섹션 2111.03에 제시되어 있는 바와 같이, 전환 구 "~로 이루어진" 및 "본질적으로 ~로 이루어진"만이 각각 폐쇄 또는 반-폐쇄 전환 구일 수 있다.

Claims (27)

  1. 복수의 형광성 다이아몬드 입자; 및
    형광성 다이아몬드 입자들 중 적어도 일부에 결합된 치료제
    를 포함하며, 대상체 기관 내부에서의 장기 체류를 위해 구성되는,
    치료제 투여를 위해 구성되는 물품.
  2. 대상체에 조성물을 투여하도록 구성되는 주입 구성요소; 및
    복수의 형광성 다이아몬드 입자를 포함하는 조성물을 함유하는, 주입 구성요소와 연계되는 저장소
    를 포함하는, 대상체에서 사용하기 위한 물품.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 복수의 다이아몬드 입자가 100 nm 이상 내지 2000 nm 이하의 평균 입자 직경을 갖는 것인 물품.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 다이아몬드 입자가 대상체의 기관 내에서 응집되도록 구성되는 것인 물품.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 다이아몬드 입자가 대상체의 기관에 의해 포획되도록 구성되는 것인 물품.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 다이아몬드 입자의 응집물이 1 마이크로미터 이상 내지 100 마이크로미터 이하의 평균 직경을 갖는 것인 물품.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 다이아몬드 입자가 특징적인 근적외선 방출을 갖는 것인 물품.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 기관이 대상체의 간인 물품.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 체류가 5일 이상인 물품.
  10. 정맥내 캐리어 유체; 및
    정맥내 캐리어 유체에 현탁된 복수의 형광성 다이아몬드 입자
    를 포함하는 제약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 형광성 다이아몬드 입자의 적어도 일부에 결합된 치료제를 포함하는 제약 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 형광성 다이아몬드 입자의 적어도 일부에 결합된 진단제를 포함하는 제약 조성물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 다이아몬드 입자가 100 nm 이상 내지 2000 nm 이하의 평균 입자 직경을 갖는 것인 제약 조성물.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 다이아몬드 입자가 대상체의 기관 내에서 응집되도록 구성되는 것인 제약 조성물.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 다이아몬드 입자가 대상체의 기관에 의해 포획되도록 구성되는 것인 제약 조성물.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 다이아몬드 입자의 응집물이 1 마이크로미터 이상 내지 10000 마이크로미터 이하의 평균 직경을 갖는 것인 제약 조성물.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 다이아몬드 입자가 특징적인 근적외선 방출을 갖는 것인 제약 조성물.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 기관이 대상체의 간인 제약 조성물.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 체류가 5일 이상인 제약 조성물.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 체류 시간이 적어도 12주까지인 제약 조성물.
  21. 복수의 다이아몬드 입자, 및 다이아몬드 입자들 중 적어도 일부에 결합된 치료제를 대상체에게 정맥내로 투여하는 것을 포함하며, 여기서 복수의 다이아몬드 입자는 대상체 기관 내부에서의 장기 체류를 위해 구성되는 것인, 질환을 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 복수의 다이아몬드 입자가 대상체의 간에 존재하는 것인 방법.
  23. 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 복수의 다이아몬드 입자를 투여하는 것;
    투여 단계 후, 복수의 다이아몬드 입자를 함유하는 것으로 의심되는 대상체 내부 위치의 제1 이미지를 수득하는 것;
    예정된 시간 기간 후, 복수의 다이아몬드 입자를 함유하는 것으로 의심되는 대상체 내부 위치의 제2 이미지를 수득하는 것;
    복수의 다이아몬드 입자와 관련하여 제1 이미지와 제2 이미지 사이에서 대상체 내부 위치의 형태구조적 변화를 측정하는 것
    을 포함하며, 여기서 형태구조적 변화는 질환의 진행과 연관되는 것인, 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 형태구조적 변화가 제1 이미지에 대비하여 제2 이미지에서 복수의 다이아몬드 입자를 함유하는 내부 기관의 부분에 관해 대상체 내부 기관 면적의 증가를 측정하는 것에 의해 결정되는 것인 방법.
  25. 복수의 형광성 다이아몬드 입자의 간 질환 및/또는 간암의 치료를 위한 약제 제조에서의 용도.
  26. 제25항에 있어서, 복수의 형광성 다이아몬드 입자에 결합된 치료제를 포함하는 용도.
  27. 복수의 형광성 다이아몬드 입자의 질환 진행의 모니터링을 위한 약제 제조에서의 용도.
KR1020227001582A 2019-06-18 2020-06-18 (나노)다이아몬드 입자를 포함하는 조성물 및 물품 KR20220024624A (ko)

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