JP2019533005A - ナノダイヤモンド粒子及び関連する装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
ナノダイヤモンド粒子、及び、検体の検出及び定量のためのナノダイヤモンド粒子といった関連する装置及び方法が、一般的に述べられる。ある実施形態において、該装置は、複数のナノダイヤモンド粒子、及び該ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の化学種を含む。ある実施形態において、該複数のナノダイヤモンド粒子は、検体を含む疑いのあるサンプルに曝露され得る。ある場合において、検体は、該サンプル中における検体の存在が検出され得るように、該化学種と結合し得る。ある実施形態において、この本文で述べられる、装置、システム、及び方法は、例えば、診断目的で被験者より得られたサンプル中における検体の検出に有益である。ある場合において、この本文で述べられる、該システム、装置、及び方法は、病気又は体調の診断、予防、処置、及び/又は管理に有益であり得る。例となる実施形態において、この本文で述べられる、そのようなシステム、装置、及び装置は、被験者及び/又は該被験者から得られるサンプル中におけるウィルス(例えば、エボラ)の存在の検出及び/又は定量に有益であり得る。
Description
検体の検出及び/又は定量のためのナノダイヤモンド粒子といった、ナノダイヤモンド粒子及び関連する装置及び方法が、一般的に述べられる。さらに、本発明は、医学及び獣医学的診断及び処置の分野に関する。より具体的には、本発明は、血小板及び血栓の検出に特有の診断薬、ツール、及びシステムに関する。さらに、本発明は、種々の病気及び外傷性条件における体内の出血部位の検出に関する。
本出願は、米国特許法第119条の下、2016年9月6日に出願された、『ヒト及び動物用薬における血栓の診断及び処置のための蛍光性ナノダイヤモンド粒子(F−NDP)のエンジニアリング及び有用性』という表題の米国特許仮出願第62/383,0657号、及び2017年6月19日に出願された、『ナノダイヤモンド粒子及び関連する装置及び方法』という表題の米国特許仮出願第62/522,036号に対する優先権を主張し、それらはすべての目的に関し、参照によりこの本文にそのまま組み入れられる。
脳卒中及び心臓発作といった心臓血管の病気は、先進国において主たる致死の原因である。脳卒中及び心臓発作に由来する死は、専ら、脳及び心臓血管に形成された血栓(blood clots)(thrombi)又は離れた血管(例えば、末梢静脈システム、心房付随物)中に形成された血栓と関連する血栓塞栓事象(TEE)の結果である。致命的なTEE(例えば、アテローム性動脈硬化血管病)に寄与するいくつかの因子がよく知られているが、TEEの前兆として未だ入念に検査が行われていない因子はもちろんのこと、特定の評価における明確な『診断及び予後診断ギャップ』、及び既知のリスク因子を有する個人に『全血栓負荷』が存在する。相変わらず、脳卒中又は心臓発作につながる血流閉塞の結果の臨床的説明では、TEEの原因を捜索する医学的調査が正確に要求される。そうした調査は大部分、血管造影法、CATスキャン、MRI及び超音波といった、病院ベースのイメージング試験である。現在の技術は、脳卒中及び心臓発作の時宜にかなった、上手な管理にとって重要であるが、いくつかの重要な限定する要因が対処されるべきである。第1に、一般の人々、特に心臓血管のリスクを有している年配の人々は、しばしば血管中の血栓を評価する病院ベースの技術の利用が限られている。第2に、病院においてさえも、これらのイメージング技術の利用は、試験及び専門家による評価と関連した、ある時間的要求を有する。事件の発生から処置ウィンドウが3〜4.5時間に限られている脳卒中の場合において、しばしば処置のための重要なウィンドウを失う程度にまで、多くの時間が、血栓溶解処置に関する患者の適格性を確立するのに費やされる。
他方の端において、心房微細化(慢性、再発性)といった心臓不整脈の診断がなされると、心室において血栓が未知であっても、TEEのリスクにより抗凝固剤での長期的な処置が命じられる。TEEリスクの主要な診断ギャップを提示する例がほとんどなく、それらは早期の診断及び予防的尺度がないためにしばしば致命的な結果となる。容易かつ広く利用でき、手頃な料金の、外来治療での全身の血栓負荷又はTEEリスクの早期の評価が必要とされている。
さらに、ラテラルフローアッセイといった免疫クロマトグラフィーアッセイが、一般的に、サンプル中の抗原といった検体の存在又は非存在を検出するのに使用される。しかしながら、そのような分析法は、一般的に、自動化処理、正確な定量法を欠いており、ある場合においては、主観的解釈が要求される可能性があり、偽陽性及び/又は偽陰性という結果につながる。
したがって、改善された装置及び方法が必要とされている。
ナノダイヤモンド粒子、及び検体の検出及び/又は定量のためのナノダイヤモンド粒子(例えば、蛍光性ナノダイヤモンド粒子)のような関連する装置及び方法が、一般的に述べられる。本発明の主題は、ある場合において、相互に関連する製品、特定の問題に対する代替解決策、及び/又は1つ以上のシステム及び/又は物品の複数の異なる使用を含む。
1つの態様において、診断薬が提供される。ある実施形態において、該診断薬は、ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドと化学的に結合した蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む。
別の態様において、流体装置が提供される。ある実施形態において、該流体装置は、サンプル注入口、該サンプル注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第1の化学種、該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第2の化学種を含む検出領域、及び該検出領域と流体的に連通している制御領域であって、該制御領域と結合した複数の第3の化学種を含む制御領域を含む。
さらに別の態様において、システムが提供される。ある実施形態において、該システムは、サンプル注入口、該注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第1の化学種、該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第2の化学種を含む検出領域、及び該検出領域で蛍光放出を定量するよう配置された検出器を含む。
ある実施形態において、該システムは、サンプル注入口、該注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第1の化学種、該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第2の化学種を含む検出領域、及び該検出領域で赤外シグナルを定量するよう配置されている検出器を含む。
さらに別の態様において、方法が提供される。ある実施形態において、該方法は、流体装置の流体チャネルへ検体を含む疑いのあるサンプルを導入すること、該サンプルを、検体が存在した場合、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種の少なくとも一部と結合するよう、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種に曝露すること、該検体と結合していないいかなる蛍光性ナノダイヤモンド粒子及び化学種を除くこと、及び該検体と結合した複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光放出を定量すること、を含む。
ある実施形態において、該方法は、特定の検体を含む疑いのある被験者(例えば、ヒト、ほ乳類)に、検体が存在した場合、化学種が検体と結合し得るよう、化学種と結合した複数のナノダイヤモンド粒子を投与する工程、及び、存在した場合、検体と結合した化学種を含む複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光放出を検出する工程を含む。
本発明の他の利点及び新規特徴は、添付の図と併せて考慮した際、以降の本発明の種々の限定されない実施形態の詳細な説明より明らかとなる。本明細書及び参照により組み入れられる文書が、競合する及び/又は矛盾する開示を含む場合には、本明細書が支配するものとする。
本発明の限定されない実施形態は、添付の図を参照して、実施例により示されることとなるが、それらは概要的なもので、基準に描かれることは意図していない。図において、示されているのと同一又はほぼ同一の各要素は、典型的には、単独の数字で表される。明確のため、図ごとに要素ごとにラベルしてはおらず、本発明の各実施形態の要素ごとにも、当業者に発明を理解させるために図が必要ない箇所においては、示していない。図において、
図1Aは、実施形態の1つのセットによる、蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの略図である。
図1Bは、実施形態の1つのセットによる、蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの略図である。
図2Aは、実施形態の1つのセットによる、検体の検出のための蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの略図である。
図2Bは、実施形態の1つのセットによる、検体を含む疑いのあるサンプルの導入する上での、検体の検出のための蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの略図である。
図2Cは、実施形態の1つのセットによる、検体を含む疑いのあるサンプルの導入した上後の、検体の検出のための蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの略図である。
図3は、実施形態の1つのセットによる、ヒトIgGのような化学種で機能化された、例となる蛍光性ナノダイヤモンド粒子の略図である。
図4は、実施形態の1つのセットによる、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器を含む、例となるシステムの写真である。
図5は、実施形態の1つのセットによる、種々の濃度での蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合したヒトIgGの検出の、対対照(牛血清アルブミン(BSA))の、半ELISAのプロットである。
図6は、実施形態の1つのセットによる、頸動脈血栓中、ビチスタチンで機能化された蛍光性ナノダイヤモンド粒子の定量の、対ラット中の対照血管の、プロットである。
図7Aは、実施形態の1つのセットによる、蛍光性ナノダイヤモンド粒子が導入された発生した血栓を伴うラット(複数)由来の頸動脈の、走査型共焦点顕微鏡画像を示す。
図7Bは、実施形態の1つのセットによる、蛍光性ナノダイヤモンド粒子が導入された発生した血栓を伴うラット由来の頸動脈の、走査型共焦点顕微鏡画像を示す。
図8は、実施形態の1つのセットによる、頸動脈中に発生した血栓近傍の大腿動脈に組織的に注入した蛍光性ナノダイヤモンド粒子で処置した、又は処置していない、血栓の組織懸濁液の画像を示す。
図9は、例となる実施形態において使用したNDP−Fsの蛍光を最適化する、励起対放出波長の2次元的スクリーニングを示す蛍光スクリーニングの結果である。図は、NDP−Fsのための最大の蛍光の最適化を示す。ヒートマップは、励起対放出波長の全スペクトルにおける蛍光スクリーニングの結果を表す。実験は、Tecanプレートリーダーを使用して行った。NDP−FsをPBS中、懸濁液として96ウェルプレート(0.3mg/0.1ml)上に適用した。ブランク、又は負の対照は、PBS単独で使用して確立した。
図10は、『半ELISAアッセイ』におけるNDP−Fs上でのBtの検出を示す折れ線グラフである。NDPsは、Bt又はBSAと結合しており,X軸に示されているようにNDP−Fs1mgの当たりの濃度で使用した。3つの複製において、0.2mgの各NDPサンプルを半ELISAに使用した。実験は、培養の間の緩やかな回転とともに96ウェルプレート(U型底)上で行った。NDPsは、Btに対して第1抗体を加える前に10%ヤギ血清でブロックした。NDPサンプルは、37°Cで1時間、抗Bt抗体で培養し、プレートは、室温での遠心分離(1,000xg)により、PBSTで3回洗浄した。ヤギ抗ウサギIgGAP複合体(Sigma Inc。)を1:2000に希釈して加え、前記のように1時間、培養した。最終洗浄を前記のように行い、基質(pNPP)をAPに加えた。30分間発色させ、NDPサンプルを遠心分離した。上澄みを96ウェルプレートに移し、405nm波長の下、ELISAプレートリーダーを使用して読み取った。エラーバーは、半ELISA法に適用した、3つの独立したサンプル由来の標準偏差(SD)を表す。
図11は、半ELISAでの、純粋なインテグリンとNDPsとの相互作用を示す、折れ線グラフである。実験は、U型底96ウェルプレートを使用して行った。プレート を5%BSAで一晩ブロックし、一方NDPsは、プレート上で適用する前に、37℃で1時間の培養することにより、3%BSAでブロックした。ブロックしたNDPsをウェルに加え(ウェル当たり0.2mg)、プレートを室温で遠心分離した(10,000xg)。指示濃度で血小板フィブリノゲン受容体(PFR)を0.1mLの、生理学的濃度でCa2+(CaCl2として)及びMg2+(MgCl2として)を含むHanksの平衡塩溶液(HBSS)に各ウェルに対し加え、37℃で1時間培養した。NDPsは、室温でのプレートの遠心分離(1,000xg)により3回洗浄し、フィブリノゲン受容体に対し、第1ポリクローナル抗体を加えた(2μg/ml)。37°Cで1時間、培養を行い、サンプルを前記のように3回洗浄した。ヤギ抗ウサギIgGAP複合体(Sigma Inc。)を1:3000に希釈し、加えて前記同様1時間培養した。最終的な洗浄を前記のように行い、基質(pNPP)をAPに加えた。30分間発色させ、プレート上のNDPサンプルを室温で遠心分離(10,000xg)し、NDPをペレットとして集めた。上澄みを平底96ウェル(0.1ml)プレートに移し、405nm波長でELISAプレートリーダーを使用して読み取った。
図12は、固定したPFRに対する、NDP−F−Bt及びNDP−BSAの接着を示す、折れ線グラフである。PFRは、PBS中、4°Cで一晩培養して96ウェルプレート上に固定した。プレート及びNDPsは、3%BSAでブロックした。1mgのタンパク質(Bt又はBSA)と結合したNDPsを実験に使用した。NDPs(300mg)をウェルに加えた。カルシウム及びマグネシウムを生理学的濃度で含むHBSS緩衝液中で、37°Cで1時間、培養を行った。結合していないNDPsを真空吸引とともに、同一の緩衝液を使用して、6回集中的に洗浄した。最後に、HBSS(100μl)をウェルに加え、485nm(励起)及び530(放出)波長で、蛍光プレートリーダーを使用して蛍光を読み取った。
図13は、固定したフィブリノゲン受容体に対する、NDP−F−Bt及びNDP−BSAの接着の定量を示す、折れ線グラフである。フィブリノゲン受容体は、4°Cで一晩培養し、8ウェルガラスチャンバースライド上に固定した。ウェルを3%BSAでブロックし、前にまた3%BSAでブロックしたNDPsを、カルシウム及びマグネシウムを生理学的濃度で含むHBSSに加えた(200ml当たりウェル当たり50mg)。接着プロシージャを、図12当たりに行った。最終工程において、スライドを据え付けの緩衝液(Vector Lab)で調製した。画像は、油レンズを使用して蛍光顕微鏡(400×)の下、解析した。NDPsの数は、ImageJソフトウェアを使用して計算した。エラーバーは、各濃度のフィブリノゲン受容体に対して撮られた3つの独立した画像に対するSDを表す。
図14は、固定したPFRに接着したNDP−F−Btの代表的な画像を表す。PFR(指示濃度)を8ウェルチャンバースライド上に固定し、図13に示すように実験を行った。凡例において、バーは20μmを表す。
図15は、外頸動脈注入を経由して、FNDPで処置した後の頸動脈血栓のIVIS及び共焦点顕微鏡で撮られた蛍光画像の写真を示す。図15Aは、頸動脈分岐部領域の露光の後、IVISイメージングを経由して、可視処理した後の頸動脈血栓の蛍光を示す、in situでの頸動脈分岐部領域画像を示す。図15B及び15Cは、血栓におけるFNDPの蓄積を示唆する、in vivoでの頸動脈分岐部から発散される蛍光の高拡大画像である。図15Dは、頸動脈分岐部での血栓局所化に相当する蛍光を示す1つの枝を表す、ex vivoでの頸動脈分岐部の蛍光を示す。図15E及び15Fは、Olympus IX83で撮影した共焦点画像であり、FNDP蛍光は、543nmの励起、655−755nmの放出で検出されることを示す。
図16は、FNDPで静脈を処置した後、IVIS及び共焦点顕微鏡で撮影された頸動脈血栓の蛍光画像を示す。図16Aは、生理食塩水で処置した対照由来のex vivoでの蛍光画像を示す。図16Bは、血栓を有する枝に局所化した蛍光を示すIV FNDPで処置した動物由来の頸動脈のex vivoでの蛍光画像を示す。図16C−Fは、Olympus IX83で撮影した共焦点画像を示す。図16Gは、生理食塩水で処置した対照と比較して、外頸動脈を経由して又は静脈に局所的に処置された動物由来の頸動脈血栓溶解物中に存在するFNDPsの数を示す、グラフである。
図17A−17Bは、トロンビン(1U/ml)によるラットの血液血漿由来の血栓の生成に関する、F−NDP−Bt相互作用の特異性の蛍光顕微鏡検査を示す。図17Aは、蛍光顕微鏡Olympus IX81解析により得られる、血漿血栓の100倍拡大の下での画像を示す。図17Bは、IVIS 50 イメージングシステムにおいて得られた血漿血栓の画像を示す。測定に使用された波長:励起 Cy5.5BkG(580−610nm)、放出 Cy5.5(695−770nm)。バックグラウンドの控除について:励起 GFP(445−490nm)、放出 Cy5.5(695−770nm)。露光時間:1分である。矢印は血栓の局所化を指す。
図18A−18Bは、ラット(検死)の皮下に移植された、F−NDP−Btで満たした血管の画像を示す。図18Aは、F−NDP−Bt(4mg/ml)又はPBS(対照)で満たした移植したガラスキャピラリーの画像を示す。露光時間は、5秒間であった。図18Bは、F−NDP−Btで満たしたラットの大動脈の画像を示す。ラットの大動脈は、安楽死させた雌のラットから切断し,PBSで洗浄して凝固した血液の残りを除き、PBS中、300μlのF−NDP−Bt懸濁液(2mg/ml)で満たした。 図18Cは、トロンビン誘起PRP血栓におけるF−NDP−Bt、F−NDP−Bt+ロトラフィバン(lt)、及びF−NDP−BSAに関する平均蛍光強度のプロットを示す。 図18Dは、IVIS由来の図18Cにおける血栓の例となる画像を示す。
図19A−19Cは、プロテナーゼ−活性受容体4(PAR4 AP、図19A)、アデノシン二リン酸(ADP、図19B)、及びアラキドン酸(AA、図19C)についての平均最高血小板凝集+/−標準偏差回帰直線に関する、ビチスタチン(すなわち、プローブ)で機能化された、700nm直径の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を有する及び有さない、用量反応曲線を示す。
図20A−20Cは、種々の濃度での、血小板個数と結びついた700nm及び200nm直径のプローブのボックスプロットを示す。図20Aは、全血小板のパーセンテージを示し、図20Bは、CD62+ve血小板のパーセンテージを示し、及び図20Cは、種々の濃度での700nm及び200nmプローブと結合したGPIIb/IIIa+ve血小板のパーセンテージを示す。示されているデータは、平均(+)であり、ボックス内の線は中間を表し、ボックスの上端及び下端は、75番目の及び25番目のパーセンタイルを表し、及び上部及び下部のひげは95番目の及び5番目のパーセンタイルを表す。
図21は、刺激対刺激なしの血小板個数についての、700nm直径のプローブと結合した血小板のパーセンテージのプロットを示す。示されているデータは、350mcg/mLのプローブの濃度での、刺激対刺激なし血小板における、プローブと結合した全血小板の平均のパーセンテージ(+/−標準偏差)である。
図22は、刺激対刺激なしの血小板個数についての、200nm直径のプローブと結合した血小板のパーセンテージのプロットを示す。示されているデータは、350mcg/mLのプローブ濃度での、刺激対刺激なしの血小板における、プローブと結合した全血小板の平均のパーセンテージ(+/−標準偏差)である。
図23A−23Dは、細胞及び血小板の非シミュレート及びシミュレートの個数についてのフローサイトメトリーの点プロットを示す。
図24A−24Dは、細胞及び血小板の非シミュレート及びシミュレートの個数についてのフローサイトメトリーの点プロットを示す。
図25A−25Bは、殺菌前後のF−NDPsについての体積対サイズ(図25A)及び蛍光強度対サイズ(図25B)のプロットを示す。
図26A−26Cは、懸濁液中のF−NDP(NV)及びF−NDP(NVN)のNIR蛍光強度の比較を示す。(図26A)F−NDP懸濁液は、蛍光のため、励起及び放出の範囲で蛍光プレートリーダーにおいてスキャンした。蛍光は、ブランクのウェルを差し引き、log10処理をすることで標準化されている。(図26B)キャピラリーは、PBS中、指示密度のF−NDPで満たし、5秒の露光を使用して、IVISイメージングにより解析した。挿絵は、キャピラリーの代表画像を示す。平均蛍光はプロットで表されている。(図26C)露光時間の関数として異なるF−NDP(NV)濃度に関する蛍光強度の比較。エラーバーは、3〜5の独立した実験のSDを表す。*F−NDP(NV)及びF−NDP(NVN)間の差(P<0.01)
図27A−27Dは、IVISにおいての異なる露光時間下での、異なるサイズのF−NDP(NV)の蛍光強度の比較を示す。左のペインは、F−NDP(NV)の代表的な画像であり、プロットされた濃度で表される。粒子のサイズは、(上から):各々、100、700、及び10,000nmである。エラーバーは、3つの独立した実験に関してのSDを示す。
図28A−28Hは、異なる生体バリアを通じてのF−NDP NIR蛍光の検出能の、IVISを使用する、比較を示す(図28A)。F−NDP、F−NDP(NVN)(4mg/ml)、又はPBSで満たしたキャピラリー(NV)(4mg/ml)は、安楽死させたラットの腹部の皮膚パッチのもとに置いた。キャピラリーの位置を矢印で示す(図28B)。2mm(側面)から5.9mm(中央)に及ぶラットの大腿四頭筋筋肉覆われたF−NDP(NV)で満たしたキャピラリー。(図28C)F−NDP(4mg/ml)又はPBSで満たしたキャピラリー(4mg/ml)を豚の腋の下の静脈に挿した。(図28D)F−NDP(4mg/ml)又はPBSで満たしたキャピラリーを副真皮がない豚の皮膚(2.5mm)で覆った。(図28E)副真皮がない2.5mmの豚の皮膚を通しての、異なる濃度のF−NDP(NV)の蛍光強度。(図28F)F−NDP(NV)(2mg/ml)又はPBSで満たし及び真皮及び副真皮を含む8mmの豚の皮膚で覆われた豚の腋の下の静脈(図28G)F−NDP(NV)(20mg/ml)、F−NDP(NVN)(20mg/ml)及びPBS(同一体積)で満たされ、厚さが増加した脂肪組織(挿し絵に示されている)を含む豚の皮膚で覆われたキャピラリー。(図28H)表面から11.89mm下の動脈を示す、ヒト頸動脈の代表的な超音波。
図29A−29Nは、外頸動脈を経由してのF−NDP(NV)−Bitの注入を示す。頸動脈血栓はin situで画像化され、さらに直接的なイメージング及び解析のために動物から分離される。(図29A−29F)2秒の露光で、580−610nmの励起及び695−770nmの放出通過域を使用して、全動物イメージングのために設計されたIVISスキャナーで記録された画像。自動蛍光は、445−490nmでの励起に基づき、差し引いた(図29A、図29B)複製動物の処理後の、IVISによる、頸動脈血栓のin situでの蛍光イメージング(切断による首粒子の分離後)スケールバー=1cm。(図29C−29F)F−NDP(NV)−Bit処理(図29C,図29D)又は展色剤対照で処理(図29E,図29F)した後の、分離した頸動脈のEx−vivoでの蛍光。スケールバー=1mm。(図29G−29J)共焦点画像の山はOlympus FV 1000で撮影した。F−NDP(NV)−Bit蛍光が、543nmの励起及び655−755nmの放出で検出された。バックグラウンドの蛍光は、555−625nmの放出を伴う、同一の励起から集め、及びフォアグラウンドから差し引いた。スケールバー=1mm。F−NDP(NV)−Bit処理(図29G、図29H)又は生理食塩水処理(図29I、図29J)した後の頸動脈の蛍光。(図29K)未処理の対側の動脈と比較する、FeCl3で発生させた血栓頸動脈のIn situでの画像。(図29L−29N)RIPA溶解緩衝液で溶解させた血栓及び複製物をともに合わせ、溶解物を形成させる。一定量の溶解物をカバーガラス上に落とし(10μL)、20倍対象物で撮影した。スケールバー=100 m。(図29K)多くのF−NDP(NV)−Bitが視認できる。(図29L)低用量(1mg)でのIV処置の後、F−NDP(NV)−Bitが、血栓形成部分での溶解物中においてが見つかる。(図29N)生理食塩水対照においては、ほとんどまったく蛍光性粒子は検出されない。
図30A−30Sは、F−NDP(NV)−Bitの静脈注入を示す。(図30A−30J)蛍光画像は、2秒の露光で、580−610nm励起及び695−770nm放出通過域を使用して、全動物イメージングのために設計されたIVISスキャンで行った。自動蛍光は445−490nmでの励起に基づき、差し引いた。(図30A−30C)3連の複製動物を処理した後の、頸動脈血栓の蛍光を示す全体画像は、動脈の露光の後、IVISイメージングを経由して見ることができる。スケールバー=1cm。(図30D−30I)F−NDP(NV)−Bit処理(図30D−30F)又は生理食塩水処理(図30G−30I)した後のEx−vivoでの頸動脈の蛍光。スケールバー=1mm。(図30J−30O)Olympus FV 1000で撮影された共焦点画像の山。F−NDP(NV)−Bit蛍光は、543nmの励起及び655−755nmの放出で検出される。スケールバー=1mm。F−NDP(NV)−Bit処理(図30J−30L)又は生理食塩水処理(図30M−30O)した後の頸動脈の蛍光。(図30P)可溶化した頸動脈由来の溶解物を画像化し、F−NDP(NV)−Bitを血球計で計数する。対側の未処理の対照を、挿入図に表す。スケールバー=100μm(図30Q)血球計により計数される、対側の対照と比較する、血栓側の頸動脈分岐部当たり検出される−NDP(NV)−Bitの総数。(図30R、図30S)処理済み及び対側の未処理の頸動脈分岐部のIVIS(図30D−30I)及びLSCM(図30J−30O)イメージングを経由してのバックグラウンドを差し引いた後の明るさ。エラーバーは、標準偏差を表す。*=p<0.05、**=p<0.01対対照(t−testによる)
ナノダイヤモンド粒子、及び検体の検出及び/又は定量のためのナノダイヤモンド粒子といった関連する装置及び方法について、一般的に述べる。ある実施形態において、本発明は、動物血栓塞栓事象(TEE)のリスクという点で、ヒト及びヒト以外の動物のいずれも含む被験者のリスク評価のための診断薬及び方法を提供する。TEEとは、脳卒中及び心臓発作由来の心臓血管の死の主たる要因である。本発明の診断薬及び方法により、非放射線(例えば、X線)、非MRI、及び非超音波技術を使用して、血管内の血栓の全身負荷の評価、及び血栓形成の一般的な好発部位での発生期の血栓の検出が可能となる。本技術は、一般的に、速い及び手頃な料金の外来環境での使用に適した、非侵襲的な遠隔ベースでの蛍光性記録システムを含む。本発明は、複数の革新的科学的及び工学的ブレークスルーを含む。
本発明は、少なくとも一部分においては、化学種(例えば、ディスインテグリンビチスタチン(Bt)といったポリペプチド、IgG及び/又はウシ血清アルブミン(BSA)といった免疫グロブリン)に機能化された蛍光性ナノダイヤモンド粒子(NDP−F)は、活性血小板フィブリノゲン受容体(PFR)に熱心に結合する能力が備わり得るという認識に基づいている。例えば、この本文で示されるデータにより、うまいBtのNDP−Fへの結合、及びBt生物活性の保持が示される。本発明を達成するのに使用された方法、試薬、及びde novoプロトコルは、他の人に前に報告されてきた発明者には知られていない。
ある実施形態において、前記装置は、ナノダイヤモンド粒子と結合した複数のナノダイヤモンド粒子及び化学種(例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド)を含む。ある実施形態において、複数のナノダイヤモンド粒子は、検体を含む疑いのあるサンプルに曝露され得る。ある場合において、サンプル中の検体の存在が検出され得るよう、化学種と結合し得る。ある実施形態において、この本文で述べられる、装置、システム、及び方法は、例えば、診断目的で、被験者より得られるサンプル中の検体の検出に有用である。ある場合において、この本文で述べられるシステム、装置、及び方法は、病気又は体調の診断、予防、処置及び/又は管理に有用であり得る。例となる実施形態において、そのようなこの本文で述べられるシステム、装置、及び方法は、被験者中の及び/又は被験者から得られるサンプル中のウィルス(例えば、エボラ)の存在の検出及び/又は定量に有用であり得る。
好都合なことに、被験者からのサンプル中の検体(例えば、ウィルス、バクテリア、毒、環境汚染物質、など)を定量するための従来のシステムと比較して、この本文で述べられるシステム及び方法は、サンプル中に存在する検体の量の定量を含み得る。
本発明は、脳卒中及び心臓発作を超えて、多くの医療救急及び生命を脅かす条件に適用可能であり得る、広範なスケールのTEEリスクの調査をまた可能とする。本技術は、TEEについてのリスクにあると疑われる個人に使用可能であるだけでなく、プライマリヘルスケアオフィスアセスメントの一部として、年1回のマンモグラフィー、脂肪テスト、又は身体検査で使用することも可能である.例えば、ある実施形態において、本発明は、蛍光放射をモニターし、非常に手頃な料金で、最小限侵襲的(安全な用量のナノ粒子の単独での注入のみ要求)で、及び、外来環境で、ECGモニタリングと同様、訓練された救急医療技術者又はプライマリケア医師によって行われ、解釈され得ることが期待される。
本発明の1つの一般的な態様は、被験者中の血栓の検出のための造影剤である。該薬剤は、例となる実施形態において、3つの要素から成り、次の通りである。:i)a蛍光性ナノダイヤモンド粒子(NDP−F)、ii)−COOH、−OH、−NH2、又は−C=O部位といった、NDP−Fを機能化する配位子、及びiii)配位子に取り付けられたタンパク質。該3要素は、ともに任意の順序で及び任意の化学結合のタイプで結合することが可能であるが、典型的には、述べた順序で共有結合している。造影剤の目的は、該薬剤とヒト又はヒト以外の動物の体内の個別の生物学的ターゲットとを明確に結合することである。
本発明のさらに別の態様は、活性血小板の検出のための診断方法である。ある場合において、該診断方法は、大部分、ポリペプチド(例えば、ビチスタチン、BSA、ヒトIgG)といった化学種の、特定の抗原(例えば、PFR)に高い親和性をもって及び/又は熱心に、結合する能力に基づく。ある実施形態において、該ポリペプチド(例えば、ビチスタチン)は、前記NDP−Fを、例えば、活性血小板及び血栓形成部位に絞るように配置されている。ある実施形態において、NDP−Fの蛍光により、血栓又は多重血栓の位置及びサイズの非侵襲的、及び比較的無害なイメージングが可能となる。ある実施形態において、該診断方法は、定量的であり、他の実施形態においては、半定量的又は定量的である。ある実施形態において、該方法は、i)1つ以上の血栓部位を有する又は潜在的に有する疑いのある被験者に、本発明の診断薬を検出可能な量で投与する工程、ii)該診断薬を血栓の部位(複数有り)に十分な時間局在化させる工程、及びiii)適切な電磁気的刺激での励起の後、蛍光放出(例えば、手持ち式装置由来の放出といった、励起光)を検出することで該診断薬を検出する工程、を含む。ある実施形態において、工程iii)での励起の活動は、蛍光タグが、被験者の体内で、生来蛍光性である場合には、省略することが可能であると解される。投与の工程は、造影剤の被験者の全血流への導入ということになる、何らかの活動であり得る。それゆえ、例えば及び制限なしで、静脈注射又は注入経由であり得る。
さらにさらに、及びすぐ上で述べられている方法に従って、本発明は、被験者中の血栓又は血栓形成の検出方法を含む。前記方法に関し、この方法は、血栓、血栓形成、血小板活性化、又はアテローム性血管硬化班又は炎症といった、血栓形成に関するリスクを形成する病変域を検出又はイメージングする方法とみなされ得る。該方法工程は、前記のとおりである。例えば、ある実施形態において、被験者中の血栓は、少なくとも一部の血栓と結合し得る化学種(例えば、ビチスタチンといったポリペプチド)で機能化された複数のナノダイヤモンド粒子を投与により検出され得る。
当業者であればすぐにわかるように、本発明の診断及びイメージング方法は、非天然生物活性物質を被験者の体内に導入するため、生物学的事象に関するデータの収集にもっぱら関連しないが、その代わりに被験者の体に対しての物理的及び生理学的変化に関連する。例えば、自然発生的でない造影剤を被験者の血流へ物理的に導入することで、血流の性質が変化する。さらに、造影剤が活性血小板に結合することで、活性血小板と相互作用する体の自然の力が変化し、血栓が滝のように流れる。本発明の造影剤を投与する上での他の物理的及び生理学的変化は、熟練した職人にとっては明らかであろう。
本発明は、また本発明の方法を実行するキットを含む。広く言えば、本発明によるキットは、本発明の方法においての使用のための分配、運搬、及び/又は貯蔵に適切な、詰め合わせの形の本発明の造影剤を含む。従来の方式では、該詰め合わせは、段ボール又はプラスチックボックスなど、金属容器など、又はホイルポーチ又は同様のものといった、しかしこれらに限定されない適切な材料から成る。ある実施形態において、該キットは、容器に単独の投与に十分な造影剤を含み、一方、他の実施形態において、該キットは、2つ以上の投与のために十分な造影剤を含む。キットが、2つ以上の投与ために十分な造影剤を含む実施形態において、造影剤は、多重使用のための単一の容器又は2つ以上の容器に提供されることが可能であり、各々は、単一使用のために十分な造影剤を含む。ある場合において、単一使用及び多重使用の容器の組み合わせが、キット内に含まれ得る。ある実施形態において、キット(キットにどれくらい多くの造影剤の容器が提供されるかにかかわらず)は、1つ以上の試薬又は被験者へ造影剤を投与するための装置の詰め合わせの組み合わせで提供され得る。そういうものとして、及び無制限に、本発明のキットは、詰め合わせの形で、消毒剤(例えば、エタノール消毒綿又はパッド、又はヨウ素消毒綿又はパッド)、1つ以上のシリンジ、シリンジと接続するのに適合した1つ以上の針、及び/又は1つ以上のガーゼ片及び/又は縫合及び投与部位の回復を促す接着剤を伴う造影剤を含み得る。
ある実施形態においてポリペプチド又はポリヌクレオチドといった化学種と結合した複数のナノダイヤモンド粒子(例えばNDP−F)は、検体を含む疑いのあるサンプルに導入され得る。ある実施形態において、該ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドは、存在する場合、ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドが検体と結合するように選択され得る。
ある実施形態において、検体がサンプル中に存在する場合、該検体、化学種、及び/又はナノダイヤモンド粒子は、検体の存在が検出され得るよう、結合され得る。ある場合において、該検体の検出は、前記ナノダイヤモンド粒子による放出(例えば、蛍光放出、近赤外放出)の定量を含む。ある実施形態において、放出の定量は、相対強度の定量、及び/又は放出波長の定量を含む。理論に縛られることを望むことなしに、ある場合において、放出の強度は、サンプル中に存在する検体の量に比例的(例えば、直接的に比例的、指数関数的に比例的、対数的に比例的)であり得る。
ある実施形態において、複数の(蛍光性)ナノダイヤモンド粒子を被験者に投与する。ある実施形態において、複数のナノダイヤモンド粒子は、経口的に、直腸に、経膣的に、経鼻的に、又は尿道に、被験者に投与され得る。ある場合において、複数のナノダイヤモンド粒子は、外科的に投与され(例えば、移植)及び/又は注射され得る(例えば、全身循環に、眼球内に、脊柱システムに、例えば、シリンジ経由で)。
他の例となる実施形態において、複数のナノダイヤモンド粒子(例えば、該ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種を含む複数のナノダイヤモンド粒子)が、被験者に投与され得る(例えば、被験者中に存在することが疑われる検体の検出目的で)。例えば、ある場合において、化学種を含む複数のナノダイヤモンド粒子は、被験者に投与され、ナノダイヤモンド粒子の放出(例えば、蛍光放出、近赤外放出)を検出した上で、被験者中の検体の存在を示す。ある場合において、該検体は、ナノダイヤモンド粒子と結合することが可能な、(血液)血栓の少なくとも一部であり得る。ある実施形態において、蛍光放出及び/又は近赤外放出を計測及び/又は検出するよう配置されている検出装置は、検体が存在する場合、放出が検出され、及び/又は定量されるよう、被験者に(例えば、皮膚の上又は皮膚近く、被験者内部の場所で)適用され得る。
すでに述べたように、この本文で述べられる方法、装置、及びシステムは、サンプル中に存在する検体の量の決定及び/又は定量に有用であり得る。ある実施形態において、該サンプルは流体である。ある実施形態において、該サンプルは全血である。ある実施形態において、該サンプルは、全血、血漿、尿、唾液、汗、及び/又は他の生体流体といった題材から得られる。そのようなサンプルを収集するための方法は、公知技術において知られている。ある実施形態において、該サンプルは、流体装置(例えば、複数のナノダイヤモンド粒子を含む容器を含む、流体装置)に導入される。
ある実施形態において、前記サンプルは(例えば、サンプル中に存在する検体の量の決定及び/又は定量に先立ち)希釈され得る。例えば、ある実施形態において、緩衝溶液が、サンプルが希釈されるよう、流体装置へサンプルを導入する前、間、及び/又は後に、複数のナノダイヤモンド粒子を含む流体装置に添加され得る。ある実施形態において、該緩衝溶液は、流体装置の1つ以上の構成要素と流体的に連通している容器に含まれる。サンプルは、複数のナノダイヤモンド粒子のサンプルへの導入に先立ち、又は間に、緩衝溶液に希釈され得る。ある実施形態において、サンプル中の検体は、次のいかなる方法段階なしに、容易に決定することが可能である。ある場合において、該検体は、被験者中に存在し、及びナノダイヤモンド粒子が、すでに述べたように、被験者に投与され得る。
『ナノダイヤモンド粒子』という用語は、一般的に、1マイクロメータより小さい平均断面寸法を有するダイヤモンド粒子を指す(例えば、900ナノメータより小さいか等しい、800ナノメータより小さいか等しい、700ナノメータより小さいか等しい、600ナノメータより小さいか等しい、500ナノメータより小さいか等しい、400ナノメータより小さいか等しい、300ナノメータより小さいか等しい、200ナノメータより小さいか等しい、100ナノメータより小さいか等しい、90ナノメータより小さいか等しい、80ナノメータより小さいか等しい、70ナノメータより小さいか等しい、60ナノメータより小さいか等しい、50ナノメータより小さいか等しい、40ナノメータより小さいか等しい、30ナノメータより小さいか等しい、20ナノメータより小さいか等しい、又は10ナノメータより小さいか等しい)。ある場合において、ナノダイヤモンド粒子は、5ナノメータより大きいか等しい、10ナノメータより大きいか等しい、20ナノメータより大きいか等しい、30ナノメータより大きいか等しい、40ナノメータより大きいか等しい、50ナノメータより大きいか等しい、60ナノメータより大きいか等しい、70ナノメータより大きいか等しい、80ナノメータより大きいか等しい、90ナノメータより大きいか等しい、100ナノメータより大きいか等しい、200ナノメータより大きいか等しい、300ナノメータより大きいか等しい、400ナノメータより大きいか等しい、500ナノメータより大きいか等しい、600ナノメータより大きいか等しい、700ナノメータより大きいか等しい、800ナノメータより大きいか等しい、又は900ナノメータより大きいか等しい、平均断面寸法を有し得る。前記参照した範囲の組み合わせがまた可能である(例えば、1マイクロメータより小さい及び5ナノメータより大きいか等しい、700ナノメータより小さいか等しい及び100ナノメータより大きいか等しい)。他の範囲がまた可能である。当業者は、本明細書の教示に基づくナノダイヤモンドの平均断面寸法を決定するための適切な方法を選択することができよう。
理論に縛られることを望むことなしに、ある場合において、この本文で述べられるナノダイヤモンド粒子は、自動蛍光性であり得る(ナノダイヤモンド粒子は、例えば、電磁気的放射線の吸収の後、蛍光を放出する)。ある場合において、ナノダイヤモンド粒子は、1つ以上の原子型欠陥(例えば、窒素−空孔(NV)中心といった点欠陥、窒素−空孔−窒素(NVN)欠陥といった点欠陥、それらの組み合わせ)を含んでいてよく、それが検出され、及び/又は定量され得る、近赤外蛍光及び/又はフォトルミネッセンスという結果になる。他の欠陥もまた可能である(例えば、Si−空孔欠陥)。ある実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、適用した電磁気的放射線に反応して蛍光を発する。
例えば、ある実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、(例えば、第1の波長を有する電磁気的放射線を適用することで)検出可能な放出(例えば、第1の波長とは異なる、第2の波長を有する電磁気的放射線)を放出するよう、励起され得る。実施形態の具体的なセットにおいて、検体がサンプル中に存在する場合、検体は、ナノダイヤモンド粒子からの放出が、検出及び/又は定量され得るよう、ナノダイヤモンド粒子と結合する(例えば、ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種と結合する)。ある場合において、被験者中のナノダイヤモンド粒子の放出の検出は、ナノダイヤモンド粒子が、疑いある検体と結合していることを示唆し得る。あるそうした場合において、該放出が、定量され得る(例えば、被験者中に存在する検体の相対的な量を決定するために)。
実施形態の別のセットにおいて、検体を含む疑いのあるサンプルは、存在する場合、検体が、ナノダイヤモンド粒子と(例えば、ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種に)結合するよう、流体装置、及び流体装置内の検出領域に添加され得る。あるそうした実施形態において、放出の存在は、サンプル中の検体の存在を示唆する。ある場合において、放出の強度及び/又は波長が、定量され得る。
この本文で述べられているように、ある実施形態において、前記システム、装置、及び方法は、複数のナノダイヤモンド粒子と結合した、複数のナノダイヤモンド粒子及び化学種を含む。好都合なことに、この本文で述べられる装置及び方法は、ある実施形態において、さらなるろ過又は分離工程を必要とすることなく全血から検体を分析することが可能であり得、あるすでに存在する検体の定量方法と比較して、比較的高い感度を有し得る。
図1Aに示すように、ある実施形態において、装置100は、化学種120と結合した複数のナノダイヤモンド粒子110を含む(例えば、存在する場合、検体と結合し得る化学種)。ある実施形態において、該ナノダイヤモンド粒子は、ナノダイヤモンド粒子の機能化を経由して化学種と結合(associated)(例えば、結合(bound))している。例えば、ある実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、イオン結合、共有結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、などといった結合の形成を経由して、化学種と結合している。共有結合は、例えば、炭素−炭素、炭素−酸素、酸素−ケイ素、硫黄−硫黄、リン−窒素、炭素−窒素、金属−酸素、又は他の共有結合であり得る。水素結合は、例えば、ヒドロキシル、アミン、カルボキシル、チオール、及び/又は同様の官能基間であり得る。例えば、化学種は、官能基、チオール、アルデヒド、エステル、カルボン酸、ヒドロキシル、など、といった官能基を含んでいてよく、該官能基はナノダイヤモンド粒子と結合を形成する。ある場合において、化学種は、電子豊富又は電子不足部位であってよく、ナノダイヤモンド粒子及び化学種間の相互作用は、静電相互作用を含み得る。
例えば、機能化されたナノダイヤモンド粒子及び化学種を架橋剤の存在下、反応させることで、前記化学種は、−COOH、−OH、−NH2、−SH、又は−C=O官能基を含む、−COOH、−OH、−NH2、−SH、又は−C=O官能基を含む機能化されたナノダイヤモンド粒子と結合し得る。適切な架橋剤の限定されない例は、1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)といったカルボジイミド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル及びヒドロメチルホスフィンといったアミン反応性化合物、マレイミド、ピリジルジスルフィド、及びヨードアセチルといったスルフヒドリル反応性化合物、ヒドラジド及びアルコキシアミンといったアルデヒド反応性化合物、及びアリールアジド及びジアジリジンといった光反応性架橋剤を含む。他の架橋剤もまた可能である。当業者は、選択した化学種のタイプ及び本明細書の教示に基づき、適切な架橋剤を選択することができよう。
ある実施形態において、前記化学種は、標的の検体と結合し得る。ある場合において、化学種は、サンプル中の他の生体又は非生体(化学)分子(例えば、検体上に存在する生体又は化学分子)と結合することが可能な生体又は非生体(化学)の基を含み得る。例えば、化学種は、チオール、アルデヒド、エステル、カルボン酸、ヒドロキシル、アミン、ポリエチレングリコールなどといった官能基を含んでいてよく、該官能基は検体と結合を形成する。ある場合において、化学種は、検体及び化学種間での相互作用が、静電相互作用を含む、電子豊富な又は電子不足な部位であり得る。
ある実施形態において、前記化学種及び検体は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモン、などを含む生体分子の対間の結合事象を経由して相互作用する。具体的な例は、抗体/ペプチド対、抗体/抗原対、抗体フラグメント/抗原対、抗体/抗原フラグメント対、抗体フラグメント/抗原フラグメント対、抗体/ハプテン対、酵素/基質対、酵素/阻害剤対、酵素/共同因子対、タンパク質/基質対、核酸/核酸対、タンパク質/核酸対、ペプチド/ペプチド対、タンパク質/タンパク質対、タンパク質/受容体対、小分子/タンパク質対、グルタチオン/GST対、抗GFP/GFP融合タンパク質対、Myc/Max対、マルトース/タンパク質対結合しているマルトース、炭水化物/タンパク質対、炭水化物誘導体/タンパク質対、タグ/金属/キレートと結合している金属、ペプチドタグ/金属イオン−金属キレート対、ペプチド/NT対、レクチン/炭水化物対、受容体/ホルモン対、受容体/作動体又は対、相補的核酸/核酸対、配位子/細胞表面受容体対、ウィルス/配位子対、タンパク質A/抗体対、タンパク質G/抗体対、タンパク質L/抗体対、Fc受容体/抗体対、ビオチン/アビジン対、ビオチン/ストレプトアビジン対、ドラッグ/ターゲット対、ジンクフィンガー/核酸対、小分子/ペプチド対、小分子/タンパク質対、小分子/ターゲット対、マルトース/MBP(タンパク質と結合しているマルトース)といった炭水化物/タンパク質対、小分子/ターゲット対、及び金属イオン/キレート剤対を含む。具体的な限定されない化学種の例は、ペプチド、タンパク質、DNA、RNA、及びPNAを含む。他の化学種及び結合対がまた可能である。例となる実施形態において、化学種は、抗体(例えば、標的検体に対する抗体)である。
例となる実施形態において、前記化学種及び検体は、抗体/抗原対結合事象を経由して相互作用する。
他の例となる実施形態において、前記化学種及び検体は、タンパク質/受容体対結合事象経由して相互作用する。例えば、化学種は、ディスインテグリン(例えば、ビチスタチン)といったタンパク質を含んでいてよく、検体は、フィブリノゲン受容体といった受容体分子を含み得る。
ある実施形態において、前記化学種及び検体は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモン、又は同種のものを含む生体分子の対間での結合事象を経由して相互作用する。
ある実施形態において、前記化学種は、(ポリ)ペプチド、(ポリ)ヌクレオチド、及び配位子から成る群から選択される。例となる実施形態において、化学種は、タンパク質、抗体、及び/又は抗原といったポリペプチドである。例えば、ある実施形態において、該抗体は、Ig、IgG、IgM、IgE、又は同種のものといった免疫グロブリンである。他の例となる実施形態において、化学種は、DN又はRNAといった(ポリ)ヌクレオチド(例えば、オリゴヌクレオチド)である。さらに他の例となる実施形態において、化学種は、アルボラブリン、アップラジン、バーブーリン、バトロキソスタチン、ビチスタチン、オブツスタチン、チスタチン(schisttin)、エチスタチン、エレガンチン、エリスチコフィン、フラボリジン、ハリシン、キストリン、モジャスチン、ルビスタチン、テルゲミニン、サルモシン又はトリフラビンといったディスインテグリンである。ある実施形態において、化学種は、血清アルブミン(例えば、牛血清アルブミン)といったタンパク質を含み得る。
化学種(例えば、ビチスタチン)で機能化された適切なナノダイヤモンド粒子の例は、2016年9月6日に出願され、『ヒト及び動物用薬における血栓の診断及び処置のための蛍光性ナノダイヤモンド粒子(F−NDP)の工学及び有用性』という表題の、米国特許仮出願第62/383,0657号においてより詳細に議論されており、参照によりこの本文にそのまま組み入れられる。他の機能化の方法が、また可能である。
検出され及び/又は定量され得る検体の限定されない例は、生体化合物、ドラッグ、超分子、塩、電解質、酵素、核酸(例えば、(ポリ)ヌクレオチド)、炭水化物、(ポリ)ペプチド、タンパク質、脂質、リン酸塩、スルホン酸塩、ウィルス、病原体、細菌、真菌、酸化剤、還元剤、毒、界面活性剤、及びそれらの組み合わせを含む。
例となる実施形態のセットにおいて、前記検体はウィルスである(例えば、エボラ、マールブルグ、ブンディブギョ、スーダン、フニン、ラッサ熱ウイルス、MERS、天然痘、ジカ熱、百日咳、風疹、はしか)。ある実施形態において、検体は細菌毒である(例えば、炭疽菌)。ある実施形態において、検体は、特定の寄生虫及び/又は真菌と関連した生物学的エンティティである。好都合なことに、この本文で述べられるシステム及び方法は、エボラといったウィルスの検出及び/又は定量に有用であり得る。
さらに別の例となる実施形態のセットにおいて、前記検体は、受容体分子である(例えば、フィブリノゲン受容体)。好都合なことに、この本文で述べられるシステム及び方法は、血栓の検出に有用であり得る。
ある場合において、前記検体は、特定の病気又は状態の標識/抗原を含み得る。例えば、ある場合において、検体は、血栓、外傷性脳負傷、骨の病気(例えば、骨粗しょう症、変形性関節症)、炎症及び/又は(自動)免疫病(例えば、クローン病、乾癬)潰瘍、心虚血及び脳卒中、アテローム性動脈硬化、筋肉の病気、アルツハイマー/パーキンソン、腫瘍及び腫瘍転移ガン、又は他のものと関連した標識/抗原であり得る。例えば、この本文で述べられるシステム及び方法は、血栓、外傷性脳負傷、炎症及び/又は(自動)免疫病(例えば、クローン病、乾癬)、潰瘍、心虚血及び脳卒中、アテローム性動脈硬化、筋肉の病気、アルツハイマー/パーキンソン、腫瘍及び腫瘍転移ガン、又は他のものの被験者における検出及び/又は診断に有用であり得る。
ある実施形態において、複数のナノダイヤモンド粒子及び該ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種が存在し(例えば、容器中に)及び/又は流体装置に導入される。例えば、図1Bに示すように、流体装置102は、サンプル注入口130及びサンプル注入口130と流体的に連通している容器140を含む。ある実施形態において、容器140は、複数の(蛍光性)ナノダイヤモンド粒子110(及びナノダイヤモンド粒子110と結合した化学種120)を含む。
ある実施形態において、サンプルは、サンプルが容器に流れ及びサンプルが複数のナノダイヤモンド粒子及び化学種と相互作用するよう、サンプル注入口に導入され得る。ある実施形態において、検体は、サンプル中に存在する場合、化学種と結合する。
ある場合において,検出領域150は、容器140の下流に置かれ、及び/又は、容器140と流体的に連通している。
ある実施形態において、検出器160は、検出領域150の近傍に置かれる。検出器は、ある場合において、検出領域で放出(例えば、放出の強度、放出の波長)を定量するよう、配置され得る。ある場合において、該放出は、蛍光性及び/又は近赤外であり得る。例えば、検体は、存在する場合、化学種と結合し得る。あるそうした場合、検体は、検出領域と結合(associated)(例えば、結合(bound))した、第2の化学種(例えば、抗体)と結合し得る。ある実施形態において、該第2の化学種及び第1の化学種と結合した(ナノダイヤモンド粒子と結合した)検体は、ナノダイヤモンド粒子の放出を測定(例えば、検出器を経由して)することにより、検出及び/又は定量され得る。
ある実施形態において、検出器は、検体及び/又は血栓を含む疑いのある被験者の領域の近傍に置かれ得る。例えば、化学種で機能化された複数の(蛍光性)ナノダイヤモンド粒子は、被験者に投与されてよく、該検出器は、検体及び/又は血栓と結合した任意のナノダイヤモンド粒子が検出(例えば、ナノダイヤモンド粒子の放出を経由して)され得るよう、被験者の近傍に置かれ得る。
任意の適切な検出器が、この本文で述べられている装置及び方法とともに使用され得る。例えば、ある実施形態において、該検出器は光学検出器(例えば、蛍光検出器、可視光及び/又はUV検出器、近赤外検出器、顕微鏡)であり得る。
ある実施形態において、前記放出は、蛍光放出である。ある実施形態において、放出の波長は、250nmより大きいか等しい、300nmより大きいか等しい、350nmより大きいか等しい、400nmより大きいか等しい、450nmより大きいか等しい、500nmより大きいか等しい、550nmより大きいか等しい、600nmより大きいか等しい、又は650nmより大きいか等しい。ある実施形態において、放出の波長は、700nmより小さいか等しい、650nmより小さいか等しい、600nmより小さいか等しい、550nmより小さいか等しい、500nmより小さいか等しい、450nmより小さいか等しい、400nmより小さいか等しい、350nmより小さいか等しい、又は300nmより小さいか等しい。前記参照した範囲の組み合わせが、また可能である(例えば、250nmより大きいか等しい及び700nmより小さいか等しい)。他の範囲がまた可能である。
ある実施形態において、前記放出は、近赤外放出である。ある実施形態において、放出の波長は、700nmより大きいか等しい、750nmより大きいか等しい、800nmより大きいか等しい、850nmより大きいか等しい、900nmより大きいか等しい、又は950nmより大きいか等しい。ある実施形態において、放出の波長は、1000nmより小さいか等しい、950nmより小さいか等しい、900nmより小さいか等しい、850nmより小さいか等しい、800nmより小さいか等しい、又は750nmより小さいか等しい。前記参照した範囲の組み合わせが、また可能である(例えば、700nmより大きい及び1000nmより小さいか等しい)。他の範囲がまた可能である。
ある実施形態において、前記ナノダイヤモンド粒子は、特定の波長を有する電磁気的放射線による励起で蛍光及び/又は近赤外放出を放出し得る。例えば、ある実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、250nmより大きいか等しい、300nmより大きいか等しい、350nmより大きいか等しい、400nmより大きいか等しい、450nmより大きいか等しい、500nmより大きいか等しい、550nmより大きいか等しい、600nmより大きいか等しい、650nmより大きいか等しい、700nmより大きいか等しい、750nmより大きいか等しい、800nmより大きいか等しい、850nmより大きいか等しい、900nmより大きいか等しい、又は950nmより大きいか等しい波長を有する電磁気的放射線に(例えば、ナノダイヤモンド粒子が、前記参照した範囲の1つにおいて、蛍光放出及び/又は近赤外放出を放出するよう)曝露され得る。ある実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、1000nmより小さいか等しい、950nmより小さいか等しい、900nmより小さいか等しい、850nmより小さいか等しい、800nmより小さいか等しい、又は750nmより小さいか等しい、700nmより小さいか等しい、650nmより小さいか等しい、600nmより小さいか等しい、550nmより小さいか等しい、500nmより小さいか等しい、450nmより小さいか等しい、400nmより小さいか等しい、350nmより小さいか等しい、又は300nmより小さいか等しい波長を有する電磁気的放射線に曝露され得る。前記参照した範囲の組み合わせがまた可能である(例えば、250nmより大きいか等しい及び1000nmより小さいか等しい、550nmより大きいか等しい及び650nmより小さいか等しい)。他の範囲がまた可能である。
この本文での記述の多くが、(蛍光性)ナノダイヤモンド粒子の文脈にあるが、当業者は、本明細書の教示に基づき、他の粒子もまた可能であると理解するであろう。例えば、ある実施形態において、前記装置は、前記参照した範囲の1つにおける放出を有する、化学種(例えば、1つ以上の標的となる検体と結合することが可能な化学種)と結合した、ナノ粒子(例えば、シリカナノ粒子、サファイヤナノ粒子、ガーネットナノ粒子、ルビーナノ粒子)といった粒子を含み得る。ある場合において、粒子は、自動蛍光性であり得る。他の場合において、粒子は、蛍光性分子で機能化(例えば、結合)され得る。
ある実施形態において、前記流体装置(例えば、サンプル注入口及び複数のナノダイヤモンド粒子及びナノダイヤモンド粒子と結合した化学種を含む容器を含む)は、ラテラルフローアッセイの構成(例えば、ラテラルフロー装置において)を含む。当業者は、本明細書の教示に基づき、複数のナノダイヤモンド粒子及びナノダイヤモンド粒子に結合(associated)(例えば、結合(bound))した化学種をラテラルフローアッセイ装置に組み込む方法を理解するであろう。例えば、図2Aに概略的に示すように、例となる実施形態において、システム200は、ラテラルフローアッセイの構成を含む。ある実施形態において、システム200は、第1の化学種と結合した複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子220を含む容器210を含む。容器210の下流には、ある実施形態においては、第2の化学種(例えば、標的検体に対する第1の抗体)を含む第2の容器230、及び第3の化学種(例えば、標的検体に対する抗体と結合することが可能な第2の抗体)を含む第3の容器240がある。ある実施形態において、第1の化学種及び第2の化学種は、同一である。
いま図2Bについて述べると、検体250を含む疑いのあるサンプルは、システム200に導入され得る(例えば、サンプルが流れ及び容器210と相互作用するよう)。ある実施形態において、検体250の少なくとも一部は、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子220上で化学種と結合する。図2Cに示すように、検体250を含む疑いのあるサンプルがシステムに沿って流れるにつれ、検体250の少なくとも一部(例えば、今、化学種及び/又は複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子220と結合している)は、容器230中で第2の化学種と結合する。ある場合において、検体と結合していない複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子220の少なくとも一部は容器240(例えば、そこでは第3の化学種が、第1の化学種と結合することが可能である)で捕捉され得る。
ある場合において、この本文での装置及びシステムは、多重式であり得るすなわち、ある実施形態において、該装置は複数のナノダイヤモンド粒子を含む2つ以上の、3つ以上の、4つ以上の、又は5つ以上の流体成分及び/又は容器を含み得る。あるそうした実施形態において、1つより多くの検体が、サンプル中に存在する場合、単一の装置において検出され得る。ある実施形態において、1つ以上の検体が、複数のナノダイヤモンド粒子を含む複数の流体成分及び/又は容器を含む装置において検出され得る。
例となる実施形態において、検体を含む疑いのあるサンプルは、検体が存在する場合、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した少なくとも一部の化学種と結合するよう、サンプルを複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種に曝露しながら、流体装置の流路に導入され得る。ある実施形態において、検体と結合していない任意の蛍光性ナノダイヤモンド粒子及び化学種は除かれ、検体と結合した複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光放出が定量され得る。この本文で述べられているように、ある場合において、サンプル中に存在する検体の量は、蛍光放出の強度に関連し得る。
他の例となる実施形態において、システムは、サンプル注入口、該サンプル注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第1の化学種、及び該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第2の化学種を含む検出領域を含む。ある場合において、該検出器は、検出領域で蛍光放出を定量するよう配置されていてよく、及び/又は検出領域で赤外シグナルを検出するよう配置されていてよい。
さらに他の例となる実施形態において、流体装置は、サンプル注入口、該サンプル注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第1の化学種、及び該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第2の化学種を含む検出領域を含む。ある実施形態において、流体装置は、さらに検出領域と流体的に連通している制御領域であって、該制御領域と結合した複数の第3の化学種を含む制御領域を含む。あるそうした実施形態において、第3の化学種は、第1の化学種及び/又は第2の化学種と同一又は異なるものであり得る。例えば、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した第1の化学種は、第1の抗体(例えば、標的検体と選択的に結合することが可能な)であり得、第2の化学種は、第1の抗体、又は第1の抗体(例えば、標的検体と選択的に結合することが可能な)とは異なる第2の抗体であり得、及び第3の化学種は、第1の抗体に対する抗抗体であり得る。前記制御領域は、放出が存在する場合、前記システムは適切に作動しているという示唆を提供する(例えば、複数のナノダイヤモンド粒子が適切に機能し、サンプル中に導入されている)。
ある実施形態において、前記流体装置は吸収剤を含む。ある実施形態において、吸収材を含む吸収領域は、検出領域及び/又は制御領域の下流に置かれ、及び検出領域及び/又は制御領域と流体的に連通している。ある場合において、吸収材は流体装置の1つ以上の成分(例えば、容器、検出領域)と結合している。ある場合において、吸収材は、少なくとも部分的に流体装置内でサンプルの流れ(例えば、ウィッキング)を駆動する。他の実施形態において、毛細管現象により、少なくとも部分的に流体装置内でサンプルの流れが引き起こされる。
適切な吸収材の限定されない例は、固体材料、孔質材料、粒子、粉末、及びゲルを含む。ある実施形態において、吸収材は、建材、セルロース、コットン、及び/又はポリマーを含み得る。当業者は、本明細書の教示に基づき、適切な吸収材を選択することができるであろう。
他の例となる実施形態において、この本文で述べられる方法は、特定の検体を有する(例えば、血流中に存在する)疑いがある被験者に、化学種が、存在する場合、検体と結合し得るよう、化学種と結合した複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を投与する工程、及び、存在する場合、検体と結合した化学種を含む複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光及び/又は近赤外放出を検出する工程を含む。ある場合において、蛍光放出の検出は、被験者中に血栓が存在することを示唆する。ある実施形態において、蛍光放出の検出は、被験者中にウィルス(例えば、エボラ、マールブルグ、ブンディブギョ、スーダン、フニン、ラッサ熱、MERS、など)が存在することを示唆する。
明らかであるが、ある実施形態において、本発明は、またヒト又はヒト以外の動物における血栓事象の検出又はイメージングのための診断薬を提供し、該薬剤は、ディスインテグリンビチスタチン(Bt)と化学的に結合した蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む。ある実施形態において、蛍光性ナノダイヤモンド粒子及びBtは、共有結合している。診断薬は、ナノダイヤモンド粒子に元来備わった性質の結果として、蛍光性であり得る。ある実施形態において、診断薬は、電磁気的源で励起された際、検出可能な電磁気的シグナルを放出する。
さらなる例となる実施形態は、血栓塞栓事象の診断又は予後診断のための方法に関する。これらの実施形態において、該方法は、血栓塞栓事象を罹患していた、又はそのリスクにある疑いのある被験者に、本発明の診断薬を診断的に十分な量、投与する工程、該診断薬を血栓部位(複数有り)に十分な時間局在化させる工程、及び該診断薬の蛍光放出を検出することで該診断薬を検出する工程を含む。該方法は、活性血小板の検出の方法、及び/又は被験者中の血栓又は血栓形成の検出の方法として実行することが可能である。
本発明の他の例となる実施形態は、キットに関する。該キットは、診断方法(例えば、血栓の検出のための診断方法)における分配、運搬、及び/又は貯蔵に適切な詰め合わせの形で本発明の診断薬を含み得る。詰め合わせの形は、診断薬の分配、運搬、及び/又は貯蔵に適切な材料を含み得る。ある実施形態において、キットは、詰め合わせの組み合わせで、被験者に本発明の診断薬を投与するための1つ以上の試薬又は装置をさらに含む。キットは、診断薬のために励起エネルギーを放出する装置を含むことがまた可能であり、好ましくは診断薬からの放出反応の検出のための検出器をさらに含む。具体的な例となる実施形態において、該装置(例えば、励起エネルギーを放出する装置、放出反応の検出のための検出器)は、手持ち式装置である。
本発明の範囲又は精神から離れることなく、種々の改変及び変形が、本発明の実践においてなすことができることは、当業者にとっては、明らかであろう。本明細書の考慮及び本発明の実践から、本発明の他の実施形態は、当業者にとっては明らかであろう。本明細書及び実施例は、例としてだけみなされることを意図しており、本発明の真の範囲及び精神は、以降の請求項により示される。
『被験者』又は『患者』とは、例えば、病気又は体調を受け得るほ乳類のような任意のほ乳類(例えば、ヒト)を指す。被験者又は患者の例は、ヒト、ヒト以外の霊長類、牛、馬、豚、ヒツジ、ヤギ、イヌ、猫又はネズミ、ラット、ハムスター、又はモルモットといったげっ歯類を含む。一般的に、本発明は、ヒトの使用のためのものである。患者は、ある病気又は体調と診断された被験者であり得、又はそうでなければ病気又は体調を有していると知らされ得る。ある実施形態において、患者は、病気又は体調と診断され、又は病気又は体調を助長しているリスクにあると知らされ得る。他の実施形態において、患者は、例えば、種々の臨床的因要素及び/又は他のデータに基づき、病気又は体調を有している又は助長していると疑われ得る。ある場合において、患者は、患者から得られるサンプル中の検体(例えば、ウィルス、抗原、抗体)の検出及び/又は定量の後に、具体的な病気又は体調を有している又は助長していると診断され得る。ある実施形態において、被験者は、例えば、蛍光性ナノダイヤモンド粒子の投与で、健康的利益を示し得る。
この本文で使用されているように、『流体』は、その通常の意味で与えられ、すなわち液体又は気体である。流体は決まった形を維持することができず、観測可能な時間枠の間、流れて据え置かれる容器を満たすこととなる。それゆえ、流体は、流れを許容する任意の適切な粘度を有し得る。2つ以上の流体が存在す場合には、各流体は、当業者により、原則的に何らかの流体(液体、気体、など)の間で独立して選択され得る。
以降の実施例は、本発明のある実施形態を示すことを意図しているものであるが、本発明のすべての範囲を説明するものではない。
次の実施例は、例となる、化学種(例えば,抗ヒト IgG-APに結合するための)を有する機能化された蛍光性ナノダイヤモンド粒子を示す.
図3は、カルボン酸基で機能化された、及び化学種(例えば、ビチスタチン)と結合した、蛍光性ナノダイヤモンド粒子の複合化を示す。そのような機能化されたF−NDPsは、例えば、外部スキャナー(例えば、UV及び/又はNIR放出のための検出器)を使用して、血栓の存在をイメージ化し及び検出するのに使用することができる。
次の実施例は、ラテラルフローアッセイ構成といった例となるシステムへの蛍光性ナノダイヤモンド粒子の組み込みを示す。
図4は、3つの例となるシステム(システム400、システム410、及びシステム420)を載せたものを示す。各々は、蛍光性ナノダイヤモンド粒子の容器(各システム中、点線として示す)を伴い、ニトロセルロース基材上に置かれている。システム400へ水を導入し、システム410へ1%TWEEN20を伴う水を導入し、及びシステム420へ1%TWEEN20を伴う10mMリン酸ナトリウム塩を導入した上で、各装置の基材に沿って、蛍光性ナノダイヤモンド粒子の流れを観測した(各々システム402、システム412、及びシステム422)。
次の実施例は、検体(例えば、抗ヒトIgG)の検出のための化学種(例えば、ヒトIgG)と複合化した蛍光性ナノダイヤモンド粒子(F−NDP)の使用を示す。
図5は、F−NDPNVと結合したヒトIgGの検出(700nm)についての半ELISAのプロットを示す。F−NDPは、ヒトIgG、又はBSA(対照)と結合しており、1mgのF−NDP当たり、示されている濃度で使用した。0.2mgの各F−NDP−IgG又はF−NDP−BSAサンプルを半ELISAに使用し、U型底96ウェルプレート上で行った。プレートは、PBST中、3%BSAで一晩ブロックした。F−NDP−IgGは、37℃で1時間、培養することで、PBST中、3%BSAでブロックした。ブロッキング剤は室温で遠心分離(1,000xg)することで除き、PBSTで2回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgGAP−複合体(SigmaInc.)を1:5000に希釈して加え、前記のように1時間培養した。最終的な洗浄を前記のように行い、p−ニトロフェニルリン酸塩基質(pNPP)を塩基性ホスファターゼ(AP)に加えた。30分間発色させ、プレート上のNDPサンプルを遠心分離した。上澄みを平底96ウェルプレートに移し、ELISAプレートリーダーを使用して、405nmの波長の下、読み取った。エラーバーは、同一のサンプル由来の半ELISAにおける4つの繰り返しを表す。
次の実施例は、血栓の検出のための、化学種(例えば、ビチスタチン(Bt))で機能化されたF−NDPsの使用を示す。図6は、発生した血栓を伴うラット中での頸動脈におけるF−NDP−Btの蓄積数を示す。発生した血栓を伴う又は伴わない(対照)頸動脈は、実験の最後にラットから切除した。血管は、12N HClで、1ml当たり100mgの比で、60℃で一晩培養することにより可溶化した。得られた溶液を水で10倍に希釈し、室温で14,000rpmを使用して遠心分離し、同一の体積の水に再懸濁させた。F−NDP−Btは、蛍光顕微鏡を備えた血球計を使用して計数した(40x対象物、TRITC波長)。示した数は、全蓄積粒子を示す。エラーバーは、3匹のラット由来の標準偏差を表す(血栓値=2.8±0.38x107、対照値=6.6±4.7x105)
図7Aは、発生した血栓を伴うラット由来の頸動脈の走査型共焦点顕微鏡(SCM)画像である。血栓の発生は、塩化鉄を使用して行った。F−NDP−Bt懸濁液を血栓近傍に局所的に注入した。ラットを安楽死させ、血栓を伴う頸動脈を切除した。イメージングは、SCMを使用して行った。測定に使用した波長:励起Cy5.5BkG(580−610nm)、放出Cy5.5(695−770nm)。バックグラウンドの控除のために:励起GFP(445−490nm)、放出Cy5.5(695−770nm)。F−NDP−BiのNIR検出は、白矢印で示す。
図7Bは、発生した血栓を伴うラット由来の頸動脈の走査型共焦点顕微鏡画像を示す。血栓の発生は、塩化鉄を使用して行った。F−NDP−Bt懸濁液は、全身的に動物の尾に注入した。ラットを安楽死させ、血栓を伴う頸動脈を切除した。イメージングは、SCMを使用して行った。測定に使用した波長:励起Cy5.5BkG(580−610nm)、放出Cy5.5(695−770nm)。バックグラウンドの控除のために:励起GFP(445−490nm)、放出Cy5.5(695−770nm)。NIR検出は、白矢印で示す。
図8は、F−NDP−Btで処理した又は処理していない、頸動脈中に発生した血栓近傍(局所的に)の大腿動脈に全身的に注入した、血栓の組織懸濁液の画像を示す。血栓の組織は、100mlに対し1つの静脈の比で、RIPA緩衝液(Triton X−100ベース)の存在下、手動で均一にした。溶解物の懸濁液をガラススライド上に適用し、直ぐに顕微鏡下で分析した。倍率100倍。
次の実施例は、ポリペプチド(例えば、ビチスタチン(Bt))でのF−NDP(すなわち、NDP−F)の機能化及び1つ以上の検体及び/又は血栓の検出を示す。
カルボキシル機能化されたNDP−Fへタンパク質/ペプチドを結合させる方法論は、この本文で述べられる。結合したタンパク質/ペプチドの生体活動を担う活動領域の保存は、挑戦的なままであり、一般的に試行錯誤努力とみられる。本発明の主な革新は、改変NDP−F−Bt剤の精製したPFRへの濃度依存結合の提示である。Btの選択は、ビトロネクチン(avb3)及びフィブロネクチン(a5b1)についての受容体といった他のRGD依存インテグリンとの無視できる相互作用と併せた、BtのPFRへの高い選択性/特異性に基づいている。血栓イメージングのためにBtを使用する本戦略は、in vivoでの血栓をマップするTc99−ビチスタチンの有用性を示すことを目的とした過去の研究とは著しく異なる。本イメージング戦略は、NDP−Fを励起することで放出される本来備わる近赤外(NIR)蛍光に基づいており、それにより他のイメージング技術に必要とされる高放射活性曝露を除く。Bt(又は他のポリペプチド)のナノ粒子への結合は、その生体標的部位でのBtの寿命の延長に有益であろうことがまた想定される。
カルボキシル基(−COOH)で機能化された蛍光性ナノダイヤモンド粒子(NDP−F又はFNDP)は、Adamas Nanotechnologies,Inc.(Raleigh,NC)から購入した。サイズ分布分析により、NDPの直径のピークは734.5(±223.6、SD)nmであることが明らかとなった。NDPsについての蛍光の最適化は、励起対放出波長の2Dスクリーニングで行った(図9)。NDPsについての2つの最適な蛍光領域を確立したが、それは医療的イメージングでの適用に有用であるはずである。(図9の丸)。詳細なスクリーニングにより、2つの最適な励起対放出波長の相関が明らかとなった:480nm対520nm、及び565nm対700nmである。第1の相関は、典型的な緑色蛍光を示すが、第2のものは、NIR放出を伴う長ストークスシフトと同定される。該NIR放出は、検出in vivoでの検出に非常に有用であり、というのも、それはヒト及びヒト以外の動物の非侵襲的イメージング環境(例えば、水、ヘモグロビン、オキシヘモグロビン、メラニン)に存在する要素の自動蛍光の光学的治療的ウィンドウにあるためである。
前記NDP−Fsは、光退色に対して耐性があることがみつかっている。NDPsを含むスライドを強い蛍光に曝しても5時間の時点において、その蛍光の強度に変化は見られない(データは示していない)。
ビチスタチンは、一般的にヘビ毒に由来し、タンパク質のディスインテグリン属に属する。ビチスタチンは、放射性のタグを使用して、深い静脈血栓(DVT)の潜在的な検出試薬として以前に調査が行われている。このRGD−ディスインテグリンは、キストリン及びバーブーリンといった、他のヘビ毒ディスインテグリンと比較した際、DVTの検出のための所望のパラメータを示した。それゆえ、このフィブリノゲン受容体結合配位子は、静脈循環(静脈血栓)中に存在する血栓中の活性血小板(又はそれら集積体)の目的で、NDP−Fsへ結合させるために選択した。
ビチスタチンは、一般的に83−アミノ酸ポリペプチドであり,元々はBitis arietantsの毒から単離されたものである。この天然のポリペプチドは、他のヘビ毒ディスインテグリンの精製のために研究室で開発された方法論を使用することで、同一のヘビ毒から精製される(Marcinkiewicz, Cezaryら. 『EC3, a novel heterodimeric disintegrin from Echis carinatus venom, inhibits α4及びα5 integrins in an RGD−independent manner.』 Journal of Biological Chemistry 274.18 (1999): 12468−12473.、参照によりこの本文に組み入れられる)。簡潔に言えば、この方法は、C18カラムの適用を伴う逆相HPLC、及びタンパク質溶離剤として、アセトニトリルの線形勾配、の2つの工程を含む。得られたBtの純度は、SDS−PAGEでテストし、Coomassie青色染色による標準タンパク質ゲル上のバンドのデジタル処理により定量した。Btの含有量は、最終的なタンパク質配合において、98%を超えるものと見積もった。この配合をNDPに結合するためにPBS中につり下げた。
Btの活性部位が特定され、RGDモチーフを含むことがみつかった。それは、αIIbβ3、αvβ3、及びα5β1といった、あるインテグリンへ結合している配位子に重要である。Btは、PFR、αIIbβ3インテグリンにのみ結合することが示されたとった点でかなり選択的であり、それはもっぱら循環血小板上で発現される。RGDシーケンス中のアスパラギン酸は、組み替えタンパク質の部位特異的な突然変異生成、及びフィブリノゲン受容体に結合しているディスインテグリンに最も重要なアミノ酸として、短ペプチド合成に認識された。本発明者は、Btを取り付けたアミン基で機能化されたNDPsと結合することは、アスパラギン酸の側鎖中に存在するカルボキシル基の関与により、ディスインテグリンの活性に影響を与え得るとの仮説を立てた。それゆえ、カルボキシル基で機能化されたNDPsを、BtをNDPs表面上に取り付けるのに選択した。
NDPs上に存在するカルボキシル(−COOH)基をBt上に存在するNH2基へ結合することは、以前に開発された(Grabarek及びGergely、1990)標準的な手順を使用して行った。この方法は、クロスリンカーである1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)の適用に基づいており、それはカルボキシル基を活性して、アミノ基と素早く反応し、アミド結合を形成するO−アシルイソウレア中間体を形成させることでカルボキシル基を活性化させる。O−アシルイソウレアは、一般的に、迅速な加水分解を受ける。それゆえ、結合の効率を増加させるために、スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド(スルホ−NHS)を反応混合物に加えて、アミン反応性スルホ−NHSエステルを生成させた。
BSAを同時に対照のNDPと結合した。
例となる適切な結合手順の詳細な説明は、次の通りである:
2つのNDPのサンプル、0.1M MES、0.5M NaCl、pH6.0、1.8ml中、各々2mgを含むもの、を調製した。サンプルAは、1mgNDPs当たり1mgBのBtを含んだ。サンプルBは、1mgNDPs当たり1mgBSAを含み、対照とした。
各サンプルに対し、0.72mgのEDCを加え、該混合物を室温(およそ21°C〜25°C)で、15分間穏やかな回転とともに培養した。培養の後、2.5μlの2−メルカプトエタノールを(20mMの最終濃度を与えるために)加え、EDCを失活させ、カルボキシル基活性化を停止した。
前記活性したNDPsを1.5mL遠心分離管に移し、室温で5分間、10,000xgで遠心分離した。NDPペレットを1mLのPBSで2度線洗浄し、結合緩衝液(PBS)中につり下げた。1mLのPBS中、1ミリグラムのBt又はBSAのいずれかを含むものを各サンプル管に加えた。サンプル管は、穏やか回転ともに室温で2時間培養した。1Mヒドロキシルアミン−HCl(5mLのPBS中、350mg)10μを失活のため、各サンプル管に加えた(ヒドロキシルアミン−HClの最終的な濃度は、およそ10mMであるべきである)。
前記サンプル管を室温で5分間、10,000xgで遠心分離した。上澄みは、結合効率をチェックするタンパク質濃度を決定するためにとっておいた。NDP−F−Bt粒子は、毎回1mLのPBSで3回洗浄した。洗浄した粒子を大量のPBS中につり下げ、1mg/mlの濃度を達成した。
結合効率を、NDPsの表面上のBt(NDP−Bt)の免疫検出を使用して、評価した。本明細書中における参照の簡便のため、該検出方法を、半ELISAと呼ぶ。広く言えば、Btに対するポリクローナル抗体を、精製したそのままのポリペプチドを抗原として使用して、ラビット中で商業的に発現させた(Chemicon/Millipore Inc.)。Btの飽和濃度を1mgNDPs当たり1mgで見積もった。3つの独立した実験に由来する代表的なプロットを、図10に示す。
結合効率を決定するための、例となる適切なアッセイは、次の通りである:
U型底を有する、前にPBS中、5%BSAで4℃で一晩培養してブロックした96ウェルプレートを使用し、200μlのNDP−F−Bt又はNDP−F−BSA溶液(PBS中、1mg/mLのNDP)を、各々、個別のウェルに適用した。該プレートを1,000xgで10分間、遠心分離した。上澄みを除き、プレートをボルテックスで穏やかに振とうし、NDP−Fのペレットを分散、再懸濁させた。
PBST(PBS+0.05%−20)中、200μlの10%ヤギ血清を加え、ピペットの先から熱心に吸引、放出することで、数度混合した。該混合物を37°Cで1時間ゆっくりと撹拌することで培養した。混合物を前記のように遠心分離し、200μlのPBSTで3回洗浄した。各遠心分離の後、ペレットをボルテックスで分散させた。最終的な洗浄の後、100μlの抗ビチスタチン(PBST中、5μg/ml)をウェルに加え、室温で1時間培養した。プレートを前記のようにPBSTで3回洗浄した。各ペレットに対し、100μlの、PBST中、ヤギ抗ウサギIgG AP複合体(Sigmaから)1:2000希釈液をウェルに加え、該混合物を37°Cで1時間培養した。混合物は10分間1,000xgで遠心分離し、ペレットは前記のようにPBSTで3回洗浄した。
150μlのAP基質pNPP(Sigmaから)を加え、室温で穏やかに撹拌して、およそ30分間発色させた(黄色の強度が見えるようになるまで)。反応は、100μlの3M NaOHを加えることでブロックした(この工程は、任意選択的である)。プレートを遠心分離し、100μlの上澄みを96ウェルプレート(平底)に移した。上澄みの吸光度を、ELISAプレートリーダーを使用して、405nmで測定した。
血小板、αIIbβ3インテグリン(Millipore Inc.)から精製したPFRを使用して、NDP−Btの活性をテストした。2つのタイプのアッセイを、溶解性PFRのNDP−F−Btへの結合、及びNDP−F−Btの表面(プラスチック又はガラス)上へ固定されたフィブリノゲン受容体への接着を含む、NDP−Bt上でのディスインテグリンの存在を確認するために、適用した。溶解性PFRの結合は、この本文で機能的半ELISAと称される、機能的『サンドイッチ』ELISAに基づき、決定した。この場合において、αIIβインテグリンサブユニット(SantaCruzInc.より購入)に対するポリクローナル抗体を使用して、NDP−Btと結合したαIIbβ3インテグリンの免疫検出を行った。
フィブリノゲン受容体のNDP−F−Btへの結合を検出するための、機能的半ELISAのための例となる適切な手順は、次の通りである。
U型底を有し、前にPBS中、5%BSAで4℃で一晩培養してブロックした96ウェルプレートを使用し、200μlのNDP−F−Bt又はNDP−F−BSA懸濁液(PBS中、1mg/mLNDP)を、各々、個別のウェルに適用した。プレートは、1,000xgで10分間、遠心分離した。上澄みを除き、プレートをボルテックスで穏やかに振とうさせ、NDP−Fのペレットを分散させた。200μlの3%BSA PBST(PBS+0.05%−20)を加え、組成物をピペットの先から熱心に吸引、及び放出することで、2、3回混合した。該混合物を37°Cで1時間、穏やかに撹拌とともに培養した。代わりに、96ウェルプレート上での適用の前に、ブロッキング工程はサンプル管中で行われ得る。混合物を前記のように遠心分離し、200μlのPBSTで3回洗浄した。各遠心分離の後、ペレットはボルテックスで分散させた。
フィブリノゲン受容体を所望の濃度(すなわち、用量−反応を発生させるのに必要とされる量)で加えた、図11を参照されたい(生理学的濃度のCa2+及びMg2+を含む、200μlのHBSS中、37°Cで1時間培養。プレートを前記のようにPBSTで3回洗浄した。次に、PBST中、100μlの抗フィブリノゲン受容体(Santa Cruz Inc.より2μg/ml)ポリクローナル抗体をウェルに加え、室温で1時間培養した。プレートを前記のようにPBSTで3回洗浄した。ペレットに対し、PBST中、100μlのヤギ抗ウサギIgG AP複合体(Sigmaから)1:3000希釈液をウェルに加え、37°Cで1時間培養した。混合物を1,000xgで10分間、遠心分離した、ペレットを前記のようにPBSTで3回洗浄した。
150μlのAP基質pNPP(Sigmaから)を加え、穏やかな撹拌とともに、およそ30分間発色させた。反応は、100μlの3M NaOHを加えることでブロックした(この工程は、任意選択的である)。プレートを遠心分離し、100μlの上澄みを96ウェルプレート(平底)に移した。上澄みの吸光度を、ELISAプレートリーダーを使用して、405nmで測定した。
図11からわかるように、PFRは、用量依存の方式において、NDP−Btと結合し、一方、対照NDP−BSAは、このアッセイにおいては活性でなかった。
固定したフィブリノゲン受容体に対するNDP−Btの接着を、取り付けたNDPsの蛍光の概算に基づく、2つの形式で行った。初めに、インテグリンを96ウェルプレート上に固定し、接着したNDPsを蛍光プレートリーダーを使用して検出した。得られた結果では、固定した精製した受容体の濃度の増加に対し、NDP−Bの接着が線形的進歩を示した(図12)。NDP−Btの接着を、また蛍光顕微鏡でモニターした。接着したNDPsの数は、コンピュータソフトウェアを使用して定量した(図13)。接着したNDP−Btの代表画像を図14に示す。
FNDPの効果をさらに特定するために、外頸動脈注入を経由してFNDPで処理した後の頸動脈血栓の蛍光画像を、IVIS及び共焦点顕微鏡により撮影した。結果を図15に示す。2つの独立した実験において、FeCl3の適用の3〜5分の後、外頸動脈を経由してFNDPの注入を開始し、15分間を超えて続けた。(FeCl3注入の終了の5分過ぎ)。FNDP溶液は、5mg/mLのFNDPが懸濁した(溶液のボルテックスの後)、1.5mLのPBSから成っていた。この注入経路は、周辺器官による粒子の、起こり得る『ファーストパス』除外を回避するために選択した。FNDP注入の完了に続き、ラットを安楽死させ、IVIS及び/又は蛍光顕微鏡法によるイメージングを行った。図15A−Dは、2秒の露光で580−610nm励起及び695−770nm放出通過域を使用した、全動物イメージングのために設計されたIVISスキャナーで行った蛍光のイメージングを示す。自動蛍光は、445−490nmでの励起に基づき、差し引いた。図15Aは、頸動脈分岐部領域を露光した後の、IVISイメージングを経由して可視可処理した後の、頸動脈血栓の蛍光を示す、in situでの頸動脈分岐部領域画像を示す。図15B及び15Cは、in vivoでの頸動脈分岐部由来の蛍光発散の高拡大画像であり、血栓中のFNDPの蓄積を示唆する。図15Dは、頸動脈分岐部内での血栓の位置に相当する、蛍光を示す1つの枝を表す、ex vivoでの頸動脈分岐部の蛍光の写真である。図15E及び15Fは、Olympus IX83で撮影した、蛍光が543nmの励起、及び655−755nmの放出で検出される、FNDPの共焦点画像である。バックグラウンドの蛍光は、555−625nmの放出を伴う、同一の励起から集め、自動蛍光を軽減するためにフォアグラウンドから差し引いた。図15Eは、4倍に拡大したex vivoでの頸動脈の蛍光を示す。図15Fは、RIPA溶解緩衝液で流した後、FNDPで処理した頸動脈を示し、複製物はともにして溶解物を形成させた。溶解物をカバーガラス上に堆積させ、20倍に拡大してイメージ化した。血小板周りに種々の凝集体サイズで多くのFNDPが視認できる。
図16は、FNDPで静脈を処理した後の、IVIS及び共焦点顕微鏡で撮影した頸動脈血栓の蛍光画像を示す。塩化鉄で血栓を形成させた後、尾の静脈又は大腿動脈を経由した静脈注入による、生理食塩水対照での処理又はFNDPでの処理を3匹のラットに行った。FNDPは、1mg/mLのFNDPを含む1mLの溶液で、PBS中の懸濁液として注入した(10分を超えて)。頸動脈はイメージングのために動物から除き、イメージングまでの保存のため、70%変性エタノール中に置いておいた。FNDPは、血栓形成部位に顕著に確認された。FNDPは、静脈注入に続いて得た3つの各標本中に確認されたが、3つの標本は、溶解物の調査のため、1つのものとして、ともに処理した。図16A及び16Bは、行ったように、2秒の露光で580−610nm励起及び695−770nm放出通過域を使用した、全動物イメージングのために設計されたIVISスキャナーでの蛍光のイメージングを示す。自動蛍光は、445−490nmでの励起に基づき、差し引いた。図8Aは、生理食塩水処理対照由来のex vivoでの頸動脈の蛍光画像を示す。自動蛍光は、完全に除くことはできなかったが、対照標本に沿って均一に分散させた。図16Bは、IV FNDP処理した動物由来のex vivoでの頸動脈の蛍光画像を示し、血栓を伴う枝に局在化した蛍光を示す。図16C−16Fは、Olympus IX83で撮影した共焦点画像を示す。図は、FNDP蛍光が、543nmの励起及び655−755nmの放出で検出されたことを示す。バックグラウンドの蛍光は、555−625nmの放出を伴う、同一の励起から集め、自動蛍光を軽減するために、フォアグラウンドから差し引いた。図16C及び16Dは、各々、生理食塩水処理した及びFNDP処理した動物の4倍拡大した、ex vivoでの頸動脈の蛍光を示す。自動蛍光は、完全には除くことはできなかったが、対照標本に沿って均一に分散しており、一方蛍光は、IV処理した動物において、血栓を伴う枝に局在化していた(パネル16E及び16Fを参照されたい。)。処理した頸動脈をRIPA溶解緩衝液で流し、複製物は、ともにして溶解物を形成させた。溶解物をカバーガラス上に堆積させ、20倍に拡大してイメージ化した。視覚的調査のためのコントラストを増加させるため、画像は、画像J中で不明瞭なマスクとともに処理した。
図16Eは、生理食塩水処理した対照は、検出可能な蛍光を示さなかったことを示す。図16Fは、処理したサンプル中、蛍光スポットとして頻繁に現れることを示す。図16Gは、外頸動脈又は静脈を経由して局所的に処理した動物由来の頸動脈血栓溶解物中に存在するFNDPsの数の、生理食塩水処理した対照との比較を示すグラフを表す。FNDPsは、画像J中での閾値化した後、複製画像において数えた。
図17は、F−NDP−Bt及びF−NDP−BSAで処置した後のラット血液血漿血栓の画像を表す。ラットの血液を心臓穿刺により集め、室温で20分間100xgで遠心分離して、血小板豊富な血漿(PRP)を得た。血栓は、トロンビン(1U/ml)を添加し、37℃で15分間培養することで発生させた。形成させた血栓を、カルシウム及びマグネシウムを含むHBSSでデカンテーションすることで3回洗浄し、スライスした。血栓片はカルシウム及びマグネシウムを含むHBSS中、F−NDP−Bt及びF−NDP−BSA(50μg/ml)の懸濁液で37℃で60分間で培養し、前記のように同一の緩衝液で3回洗浄し、イメージングのためにガラススライド上に適用した。蛍光顕微鏡Olympus IX81解析より得られた、100倍に拡大した、血漿血栓の画像を図17Aに示す。IVIS 50イメージングシステムを使用して得られた血漿血栓の画像を図17Bに示す。測定に使用した波長:励起 Cy5.5BkG(580−610nm)、放出 Cy5.5(695−770nm)。バックグラウンドの控除のために:励起 GFP(445−490nm)、放出 Cy5.5(695−770nm)。露光時間:1分。図17Bの矢印は、血栓の局所化を指す。
図17は、トロンビン(1U/ml)により、ラット血液血漿から発生した血栓を伴うF−NDP−Btの相互作用の特異性を示す。蛍光顕微鏡(図17A)で血栓を解析すると、高程度でF−NDP−Btが血栓表面上に蓄積してはいるものの、この蓄積は均一に分散されていないことが明らかとなった。蛍光顕微鏡イメージングにより、高い緑色蛍光強度を伴う領域が確認されたが(黒色及び白色画像中、明点で表される)、それは活性血小板の濃縮域を示唆し得る。蛍光ライブイメージングシステム(IVIS 50)は、またF−NDP−Btの血漿血栓への結合を示す(図17B)。しかしながら、このシステムにおいて、近赤外(NIR)検出は、図9に示すように行われた最適化に基づき、セットアップした。表面(F−NDP−BSA)に結合したBSAを含む対照ナノ粒子は、両イメージングアッセイにおいて、無視できる程度で血栓と相互作用した。近赤外によるF−NDP−Btの検出により、生きた器官でのイメージングのための、機能的に活性なF−NDP−Btの有用性が示唆された。というのも、放出波長が『光学』的治療的ウィンドウ(600−1300nm)に局在化しているためである。
それゆえ、その仮説の実証のために、F−NDP−Btの検出をラットモデル中で行った。結果を図18に示す。観察野の皮膚領域を、移植のためにカミソリにより準備した。外科用メスで切開し、死んだラットの皮下に血管を挿入した。死んだラットをIVIS 50イメージングシステムに置き、NIRスペクトルの下、蛍光測定を行った。測定に使用した波長:励起 Cy5.5BkG(580−610nm)、放出 Cy5.5(695−770nm)。バックグラウンドの控除のために:励起 GFP(445−490nm)、放出 Cy5.5(695−770nm)。
F−NDP−Bt(4mg/ml)又はPBS(対照)で満たした、移植したガラスキャピラリーの代表画像を図18Aに示す。露光時間は5秒であった。図10Bは、F−NDP−Btで満たしたラットの大動脈の画像を示す。ラットの大動脈は、安楽死させた雌のラットから切除して、PBSで洗浄して凝固血液の残りを除き、PBS中、300μlのF−NDP−Bt懸濁液(2mg/ml)で満たした。大動脈は縫合糸の結び目で両端に固定した。露光時間は1分であった。図18Aは、ラットの皮下に実験的に移植されたF−NDP−BtのNIRイメージングを示す。皮下移植の前に、F−NDP−Btの懸濁液をガラスキャピラリーに注入し、切開したラットの大動脈に注入した(図18B)。明確な画像により、ラットにおける人工(キャピラリー)及び自然(大動脈)血管のいずもの正確な位置確認が示された。
最後に、F−NDP−Bitの、先に形成されたPRP血栓中の活性血小板上に存在するフィブリノゲン受容体との相互作用の特異性を調査した(図18C−18D)。2つの別々の実験において、血栓を、各々、F−NDP−Bitで15又は60分間培養した。血栓は、トロンビン(1U/mL)により、ラットPRPより発生させ、Lt(4.67μmol/mL)の存在下又は非存在下、F−NDP−Bit(250μg/mL)で培養した。(図18C)IVISイメージングをGFPフィルター(励起 445−490nm、放出 515−575nm)を使用して行った。血栓をF−NDP−Bitで15分間(上のパネル)又は60分間(下のパネル)培養した。蛍光強度をIVIS Living Image 4.3.1ソフトウェアを使用して評価した。バー上の挿入は、IVIS由来の血栓の各画像を表す。(図18D)血栓の相コントラスト及び蛍光顕微鏡画像(100倍)。F−NDP−Bitの蓄積領域は、黄色で囲ってある。培養期間にかかわらず、F−NDP−Bitの結合は、常に非特異的対照粒子(F−NDP−BSA)のそれよりも4〜5倍高かった。さらに、ロトラフィバン(lt)での血栓の前培養は、F−NDP−Bitの結合を対照F−NDP−BSAの程度にまで減少させた。
ビチスタチンを2工程の逆相HPLCを使用して、Bitis arientans (Latoxan Serpentarium, Valence, France)の毒から精製した。カルボキシル基(−COOH)で化学的に表面機能化されたF−NDPは、Adamas Nanotechnologies(Raleigh. NC,USA)から購入した。2種類のF−NDPを使用した:700nmでのN−V−N色中心(F−NDP(NVN))に基づく緑色蛍光性F−NDP(2x108粒子/mg)及び100nmでのN−V(F−NDP(NV))色中心に基づく赤色蛍光性(5x1011粒子/mg)、700nm(2x108粒子/mg)、及び10,000nm(5x105粒子/mg)。イソフルランは、Henry Schein(B34C16A Dublin、OH、USA)から購入した。70%変性エチルアルコール及びPE−10管は、Fisher Scientific(Pittsburgh、PA、USA)から購入した。絹の縫合糸は、Roboz SUT−15−1、Roboz Surgical Instrument Co.(Gaithersburg, MD, USA)から購入した。パラフィルム及びFeCl3は、Sigma−Aldrich(St.Louis, MO, USA)から購入した。
ビチスタチンは、EDC(1−エチル−3−[3ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩)を使用して、ヘテロ二官能性クロスリンカーとして、すべての型のF−NDPと結合させた。種々の機能化されたナノダイヤモンド粒子(F−NDP−Bit)上での結合効率及びビチスタチン活性の保存は半ELISA法を使用して検証した。
次の実施例は、血小板及び好ましくはヒト由来の活性血小板と結合する機能化された蛍光性ナノダイヤモンド粒子(例えば、(F−NDP−Bt))の使用を示す。データは、また粒子が、実質的に血小板凝集に関与しないことを示す。
例えば、図19A−19Cは、プローブ(すなわち、F−NDP−Bt)を伴う又は伴わない血小板の凝集についての用量反応曲線を示し、プロテイナーゼ−活性受容体4(PAR4 AP)、アデノシン二リン酸(ADP)、及びアラキドン酸(AA)の濃度の関数として決定される。
図20A−20Cは、700nm又は200nmの平均粒子直径を有するF−NDP−Btプローブの、異なる濃度での種々の血小板個数と結合する能力を示す。図21−222は、刺激あり対刺激なし血小板個数におけるプローブ(直径700nm又は200nm)の結合の差を示す。
F−NDP−Btプローブを使用した、刺激あり及び刺激なし血小板のフローサイトメトリーデータを図23A−23D及び図24A−24Dに示す。
次の実施例は、血液及び/又は生体組織におけるF−NDP−(NV)の抽出、単離、及び/又は定量の例となる方法を示す。
1.この本文で述べる結合手順を、無菌状態(例えば、実施例8を参照されたい)で使用して、F−NDP−BSA NV700nmを調製した。動物投与のために最終濃度5mg/mlをPBS中、調製した。
2.4用量の1mL(PBS中、5mg/mL)のF−NDP−BSAを1被験者(例えば、動物)当たりに注入した。血液(TBD)は、異なる時間間隔で3.8%クエン酸ナトリウム(1:9の比で)に集められ得る。対照グループは、同等の体積の生理食塩水を注入され得る。PBS−注入動物由来の血液は、同一の方法で集められ、処置したサンプルは処理される。手順の最後に、およそ10mLの血液が集められ得る。
3.F−NDP−BSAを含む血液は、SpeedVacシステム(SC110A Plus, Thermo Savant)を4、680xgで使用して凍結乾燥され得る。対照動物は、標準曲線の作成に使用され得る。標準曲線は、既知量のF−NDP−BSAを血液と混合することで作成され得る。8連続希釈法が最も高い、2mg/mL粒子密度から出発して作製され得る。
4.実験途中で集められた乾燥質量の血液を含む粒子は、血液の体積(およそ1ml)と同一の体積で12N HClに溶解され得る。可溶化が60℃で一晩培養することにより行われ得る。
5.上澄みは、遠心分離(室温で5分間、17,000xg)により除かれてよく、ペレットは元の体積(例えば、水1ml)と同一の体積に再懸濁させてよい。遠心分離は、洗浄のため1度繰り返されることとなる。この点で、粒子は少量の水を使用し濃縮され、感度を向上させ得る。例えば、最終的な水の体積は、例えば、F−NDPの検出感度が2倍に増加することとなるよう、凍結乾燥のために使用した血液の体積の2倍より小さいものであり得る。
6.調査したサンプルのF−NDP−BSAの懸濁液及び標準曲線は、96ウェルプレート(ウェル当たり100マイクロリットル)に適用されてよく、プレートは、NIR波長(励起570nm、放出670nm)を使用してTecanに読まれ得る。同時に、ml当たりの粒子の数は、蛍光顕微鏡下、計数しながら、例えば、TRICI波長及び400倍拡大でOlympus IX81を使用しながら、使い捨て血球計(IncytoInc.,Cheonan−si,Korea)により確立され得る。調査したサンプルにおけるF−NDP−BSAの量は、標準曲線から差し引かれ得る。
次の実施例は、F−NDPsの殺菌及び/又は凍結乾燥のための例となる方法を示す。
1.F−NDPsを70%エタノール中につり下げ、『Speci Mix Test TubeRocker』(ThermoScientific Inc.,Waltham, MA USA)上での穏やかな撹拌を使用して、室温で15分間培養した(23+/−20C)。F−NDPsの密度は、およそ0.5mg/mlであった。
2.F−NDPsの懸濁液は遠心分離され得る(例えば、室温で5分、17,000xg)。上澄み(エタノール)真空吸引、水又は緩衝液(例えば、PBS又はMES)につり下げられたペレットで除かれてよく、洗浄目的で同一の速度条件の下、再度遠心分離され得る。
3.F−NDPsを所望の密度(例えば1mg/ml)で水又は作業緩衝液(例えば、MESは、タンパク質と結合している場合、行われることとなる)につり下げた。
4.F−NDPsの凍結乾燥は、SPeedVacシステム(SC110A Plus, Thermo Savant, and Holbrook, NY, USA)を使用して行われ得る。例えば、ポリプロピレン管5mL(Sarstedt Inc., Numbrecht,Germany)又は1.5mL(Fisher Inc. Waltham, MA, USA)を凍結乾燥のために使用した。このシステムは、一般的に、低い乾燥速度を与える外気温度での作動するために、セットアップされた濃縮器とともに作動する。例えば、43oC−65oC温度の範囲での高い乾燥速度及び作業の適用は、F−NDPに取り付けられた、あるポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドに有害であり得る。濃縮器は、4,680xgの最大力を与える8,500rpmの最大速度で使用され得る。真空ポンプ(model VLP120, Thermo Savant)は、最終全圧1.5x10−3Torrを与えるガスバラスト制御『閉鎖』位置のためにセットアップされ得る。冷却蒸気トラップ(model RVT400, Thermo Savant)は、およそ作業温度−50℃を与える4リットルのチャンバー容量とともに使用され得る。
凍結乾燥は、要求される目的に応じて、水又は緩衝液懸濁液から行われ得る(例えば、PBSは、血管系における血栓塞栓事象といった診断的アプローチのためのin vivoでの適用に使用され得る)。F−NDPの再構成は、無菌の純水を使用して所望の体積まで行われ得る。管及びチップといったすべての材料を含むすべての手順が、無菌状態で行われ得る。
4.サイズ分布の上で、エタノール殺菌及び 凍結乾燥の効果の測定が、Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Westborough, MA, USA)を使用して行われ得る。F−NDPsの作業密度は10mg/mlと見積もられた。図25A−25Bは、殺菌前後アッセイされた粒子 サイズ 分布(Malvern, PSD)についての同一のF−NDPsの高いオーバーラップを示す。
次の実施例は、対外近赤外(NIR)イメージングを使用した、in vivoでの血管血栓を検出するビチスタチンと共有結合的に複合した蛍光性ナノダイヤモンド粒子 (F−NDP)(F−NDP−Bit)の能力を示す。具体的には、F−NDPの蛍光特性を色中心(NV対NVN)及びサイズ(100−10,000nm)と比較した。最適なNIR蛍光及び生体組織(ラットの皮膚、豚の腋の下の静脈及び皮膚)にを跨いだ組織透過性が、700nmの平均直径を有するF−NDP(NV)について得られた。in vitroでの生体内イメージング(IVIS)により、F−NDP(NV)を搭載したガラスキャピラリーは、6mmのラット赤色筋肉バリア及び12mmの豚の皮膚を跨いで検出され得ることが明らかとなり、隣接皮膚の表面からのヒト頸動脈分岐部の平均垂直距離(14mm)である。In vivoにおいて、実現可能性がFeCl3生成閉塞性血栓I頸動脈分岐部のラットモデルにおいて示された。外頸動脈(ECA)又は大腿動脈(N=3)を経由して、F−NDP(NV)−Bit(3又は15mg/Kg)を全身的に注入した後、血栓中における粒子の存在が、IVISを経由してin situで、及び、共焦点イメージングを経由して、ex vivoで、いずれにおいても確認された。血管血栓中のF−NDP(NV)の存在を、組織可溶化の後、血栓から抽出された蛍光粒子を直接計えることでさらに確認した。データにより、おそらく血栓内の活性血小板と結合しているF−NDP(NV)−Bitにより、F−NDP(NV)−Bitは、血管血栓と結合していることが示唆された。F−NDP(NV)−Bitは、追加の体外装置によりモニターされるNIRエネルギーを使用する、血管血栓を確認するための非侵襲的基板技術として機能するものと考えられる。
材料
ビチスタチンは、すでに述べたように、2工程の逆相HPLCを使用して、Bitisarientans(Latoxan Serpentarium, Valence, France)の毒から精製した。カルボキシル基(−COOH)で化学的に表面機能化されたF−NDPは、Adamas Nanotechnologies(Raleigh. NC, USA)から購入した。2種類のF−NDPを使用した:700nmでのN−V−N色中心(F−NDP(NVN))に基づく、緑色蛍光F−NDP(2x108粒子/mg)及び100nm(5x1011粒子/mg)、700nm(2x108粒子/mg)、及び10,000nm(5x105粒子/mg)でのN−V(F−NDP(NV))色中心に基づく赤色蛍光。イソフルランは、Henry Schein(B34C16A Dublin, OH, USA)から購入した。70%変性エチルアルコール及びPE−10管は、Fisher Scientific(Pittsburgh, PA, USA)から購入した。5−0絹の縫合糸は、Roboz SUT−15−1、Roboz Surgical Instrument Co.(Gaithersburg, MD, USA)から購入した。パラフィルム及びFeCl3は、Sigma−Aldrich(St.Louis, MO, USA)から購入した。
ビチスタチンは、すでに述べたように、2工程の逆相HPLCを使用して、Bitisarientans(Latoxan Serpentarium, Valence, France)の毒から精製した。カルボキシル基(−COOH)で化学的に表面機能化されたF−NDPは、Adamas Nanotechnologies(Raleigh. NC, USA)から購入した。2種類のF−NDPを使用した:700nmでのN−V−N色中心(F−NDP(NVN))に基づく、緑色蛍光F−NDP(2x108粒子/mg)及び100nm(5x1011粒子/mg)、700nm(2x108粒子/mg)、及び10,000nm(5x105粒子/mg)でのN−V(F−NDP(NV))色中心に基づく赤色蛍光。イソフルランは、Henry Schein(B34C16A Dublin, OH, USA)から購入した。70%変性エチルアルコール及びPE−10管は、Fisher Scientific(Pittsburgh, PA, USA)から購入した。5−0絹の縫合糸は、Roboz SUT−15−1、Roboz Surgical Instrument Co.(Gaithersburg, MD, USA)から購入した。パラフィルム及びFeCl3は、Sigma−Aldrich(St.Louis, MO, USA)から購入した。
ビチスタチンのF−NDPへの結合
ビチスタチンは、EDC(1−エチル−3−[3ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩)を使用して、ヘテロ二官能性クロスリンカーとして、すべての型のF−NDPと結合させた。種々の機能化されたナノダイヤモンド粒子(F−NDP−Bit)上での結合効率及びビチスタチン活性の保存は半ELISA法を使用して検証した。
ビチスタチンは、EDC(1−エチル−3−[3ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩)を使用して、ヘテロ二官能性クロスリンカーとして、すべての型のF−NDPと結合させた。種々の機能化されたナノダイヤモンド粒子(F−NDP−Bit)上での結合効率及びビチスタチン活性の保存は半ELISA法を使用して検証した。
F−NDP(NV)及びF−NDP(NVN)のNIR放出の同定
F−NDPの近赤外蛍光プロフィルを、Tecan Infinite 200 PRO(Tecan AG, Maennedorf, CH)を使用して同定した。純水(DI)中につり下げた100μlの3mg/mLの700nmF−NDP(NV)又はF−NDP(NVN)を96−ウェルポリスチレンに載せた。蛍光を230nmから850nmの励起、及び290nmから850nmからの放出で、20nmの間隔で、すべてのウェルについてスキャンした(図1A)。データは、Matlab 2015b(Mathworks, Natick, MA, USA)で処理した。バックグラウンドの蛍光は、F−NDPを伴わない空のウェルから差し引き、得られた正味の蛍光値は、視覚化のためにLog10変換した。
F−NDPの近赤外蛍光プロフィルを、Tecan Infinite 200 PRO(Tecan AG, Maennedorf, CH)を使用して同定した。純水(DI)中につり下げた100μlの3mg/mLの700nmF−NDP(NV)又はF−NDP(NVN)を96−ウェルポリスチレンに載せた。蛍光を230nmから850nmの励起、及び290nmから850nmからの放出で、20nmの間隔で、すべてのウェルについてスキャンした(図1A)。データは、Matlab 2015b(Mathworks, Natick, MA, USA)で処理した。バックグラウンドの蛍光は、F−NDPを伴わない空のウェルから差し引き、得られた正味の蛍光値は、視覚化のためにLog10変換した。
ガラスキャピラリー(40mm長、1mm内径、(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を0.06から4mg/mlの濃度で(1.8−120μg全粒子質量)、F−NDPの懸濁液と同等の体積(30マイクロリットル)で満たし、各端をplasticine(Hasbro, Pawtucket, RI, USA)で封入した。キャピラリー中の種々の懸濁液のNIR蛍光強度は、前記のように、検出された所望のNIR放出プロフィルと適合されたこれらのフィルターとして、「Cy5.5BkG」(580−610nm)にセットされた励起フィルター、及び「Cy5.5」(695−770nm)にセットされた放射フィルターを使用する、IVIS 50イメージングシステム(PerkinElmer Inc., Akron OH)を使用して、分析した。イメージングは、4にセットされた「ビニング」及び10cm視野で、2から40秒の露光時間で、完遂した。生体バリア(ラット及び豚の皮膚及びラット筋肉)を通してイメージングするために、自動蛍光は、前記のように、ブルーシフトした励起「GFP」(445−490nm)及び同一の放射フィルター「Cy5.5」(695−770nm)で、同様のイメージング環境でイメージ化し、F−NDP(NV)の大きなストークスシフトを補償するIVIS 50プロトコルから修正されるように、フォアグラウンドを差し引いた。12この修正は、単純化されたスペクトル非混合のために使用した:対照チャネル及びブルーシフトした励起チャネル間の自動蛍光の比は、対照組織において定義される。同一の比を、試験標本中のブルーシフトした励起チャネルに基づく対照チャネル由来の自動蛍光を差し引くために使用した。これは、検出されているフルオロフォアはブルーシフトした波長で最小の励起を有するという仮定のもとに作動する。F−NDP由来の近赤外蛍光放出の組織透過性を評価するために、キャピラリーを切除したラットの大腿四頭筋筋肉(2−5.9mm厚)で覆った、又は豚の皮膚(地方の肉屋から得られる豚の肩から離された)で覆った、剃った腹部のラットの皮膚(安楽死させたラットより得られた)の下に置いた。
ラット中での頸動脈血栓の発生及びF−NDP注入
FeCl3誘起血管血栓モデルの技術的手順は、一般的に当該技術分野において既知である。この特有の作業に使用される具体的な改変は、下記に簡潔に要約される。すべての動物は、the US Animal Welfare Actのガイドラインに従って行い、及びSUNY州南部医療センターのthe Institutional Animal Care & Use Committeeに承認されている。要するに:成人した雄のSprague−Dawleyラット(CharlesRiver、 350Gm+/−10%体重)、に4%イソフルランを使用して麻酔し(IF、導入、チャンバーで)、手順を通して、調節された1−2%IF(メンテナンス)が続く。ラットをあおむけのままにし、清潔な道具を使用して外科手術を受けさせ、双眼鏡で助けた。左の頸動脈を切除し、分岐部領域で曝した。5−0外科用の絹の縫合糸を総頸動脈(CCA)、外頸動脈(ECA)、及び内頸動脈(ICA)下でラップした。PE−10のキャニューラを、調査のために、F−NDP(NV)−Bitが局所的に注入されているECAに挿した。キャニューラを、また調査のために、F−NDP(NV)−Bitが静脈に(IV)注入されている左の大腿動脈に挿した。ICA茎を50%FeCl3に浸したパラフィルムにラップし、10分間静置した。ICA上にパラフィルムを2〜3分間置いておいた後、PBS中、F−NDP(NV)−Bit懸濁液の注入を、ECA(1mL中、N=2、15mg/Kg)を経由して、又は大腿動脈(N=6)を経由して、低用量で(1mLPBS中、N=3、3mg/Kg)、又は高用量で(3mLPBS中、N=3、45mg/Kg)を開始した。すべての注入は、10分間を上回ったところで完結した。対照ラットには、比較可能な体積及び期間で、展色剤を注入した。
FeCl3誘起血管血栓モデルの技術的手順は、一般的に当該技術分野において既知である。この特有の作業に使用される具体的な改変は、下記に簡潔に要約される。すべての動物は、the US Animal Welfare Actのガイドラインに従って行い、及びSUNY州南部医療センターのthe Institutional Animal Care & Use Committeeに承認されている。要するに:成人した雄のSprague−Dawleyラット(CharlesRiver、 350Gm+/−10%体重)、に4%イソフルランを使用して麻酔し(IF、導入、チャンバーで)、手順を通して、調節された1−2%IF(メンテナンス)が続く。ラットをあおむけのままにし、清潔な道具を使用して外科手術を受けさせ、双眼鏡で助けた。左の頸動脈を切除し、分岐部領域で曝した。5−0外科用の絹の縫合糸を総頸動脈(CCA)、外頸動脈(ECA)、及び内頸動脈(ICA)下でラップした。PE−10のキャニューラを、調査のために、F−NDP(NV)−Bitが局所的に注入されているECAに挿した。キャニューラを、また調査のために、F−NDP(NV)−Bitが静脈に(IV)注入されている左の大腿動脈に挿した。ICA茎を50%FeCl3に浸したパラフィルムにラップし、10分間静置した。ICA上にパラフィルムを2〜3分間置いておいた後、PBS中、F−NDP(NV)−Bit懸濁液の注入を、ECA(1mL中、N=2、15mg/Kg)を経由して、又は大腿動脈(N=6)を経由して、低用量で(1mLPBS中、N=3、3mg/Kg)、又は高用量で(3mLPBS中、N=3、45mg/Kg)を開始した。すべての注入は、10分間を上回ったところで完結した。対照ラットには、比較可能な体積及び期間で、展色剤を注入した。
F−NDP(NV)−Bit注入後の組織固定
粒子注入の完結に続き、5%IFを使用して、麻酔を増やして、深い眠りにつかせた。低大動脈を速やかに分離し、切って血液を流させた。組織を固定し、70%変性エタノール10mLでかん流することで残りの血液を除いた。両側の頸動脈分岐部領域の切除は、全身イメージング(IVIS)の後に完了した。血管をさらなるex vivoでのNIR蛍光評価のために70%変性エタノールにつり下げた。
粒子注入の完結に続き、5%IFを使用して、麻酔を増やして、深い眠りにつかせた。低大動脈を速やかに分離し、切って血液を流させた。組織を固定し、70%変性エタノール10mLでかん流することで残りの血液を除いた。両側の頸動脈分岐部領域の切除は、全身イメージング(IVIS)の後に完了した。血管をさらなるex vivoでのNIR蛍光評価のために70%変性エタノールにつり下げた。
IVISによるIn situでの及びex vivoでのF−NDP(NV)蛍光のイメージング
簡潔に言えば、NIR蛍光を、前記のように、2秒の露光、4にセットされた「ビニング」、及び7cm視野で、580−610nm励起及び695−770nm放出透過域を使用して、検出した。自動蛍光は、他のものと同様のイメージング条件の下、445−490nmでの励起に基づき、差し引いた。頸動脈は、in situでの画像を明確に視覚化させることが可能となるイメージングの前に、露光した。in situでのイメージングに続き、頸動脈分岐部を動物から除き、in situでのイメージングに使用したものと同じイメージングパラメータを使用する、ex vivoでのイメージングのためにガラスプレート上に置いた。各動脈について、自動蛍光が補償される画像の平均蛍光強度を画像Jを使用して計算した(NIH, Bethesda, MD, USA)。
簡潔に言えば、NIR蛍光を、前記のように、2秒の露光、4にセットされた「ビニング」、及び7cm視野で、580−610nm励起及び695−770nm放出透過域を使用して、検出した。自動蛍光は、他のものと同様のイメージング条件の下、445−490nmでの励起に基づき、差し引いた。頸動脈は、in situでの画像を明確に視覚化させることが可能となるイメージングの前に、露光した。in situでのイメージングに続き、頸動脈分岐部を動物から除き、in situでのイメージングに使用したものと同じイメージングパラメータを使用する、ex vivoでのイメージングのためにガラスプレート上に置いた。各動脈について、自動蛍光が補償される画像の平均蛍光強度を画像Jを使用して計算した(NIH, Bethesda, MD, USA)。
蛍光顕微鏡によるEx vivoでのF−NDP(NV)のイメージング
血栓ベアリング又は対側血管から抽出した、頸動脈分岐部領域全体の全体画像を4倍対象物を使用して、Fluoview FV1000(Olympus, Tokyo, Japan)レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)で評価した。F−NDP(NV)から放出されるNIR蛍光は、543nmの励起及び655−755nmの放出で検出された。共焦点の山は、血管全体が焦点となるよう、最大強度プロジェクションを使用して組み合わせた。各動脈におけるF−NDPの平均蛍光強度は、画像Jを使用して、ローカルバックグラウンドを差し引いた後に計算した。
血栓ベアリング又は対側血管から抽出した、頸動脈分岐部領域全体の全体画像を4倍対象物を使用して、Fluoview FV1000(Olympus, Tokyo, Japan)レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)で評価した。F−NDP(NV)から放出されるNIR蛍光は、543nmの励起及び655−755nmの放出で検出された。共焦点の山は、血管全体が焦点となるよう、最大強度プロジェクションを使用して組み合わせた。各動脈におけるF−NDPの平均蛍光強度は、画像Jを使用して、ローカルバックグラウンドを差し引いた後に計算した。
血管血栓からのF−NDP(NV)の分離
F−NDPをRIPA溶解緩衝液(Teknova Inc. Hollister, CA, USA)中に100mg/mlで均一化することで、抽出した頸動脈から分離した。一定量(10マイクロリットル)の溶解物懸濁液を顕微鏡スライドに適用し、前記のように、20倍対象物の下、LSCMで分析した。
F−NDPをRIPA溶解緩衝液(Teknova Inc. Hollister, CA, USA)中に100mg/mlで均一化することで、抽出した頸動脈から分離した。一定量(10マイクロリットル)の溶解物懸濁液を顕微鏡スライドに適用し、前記のように、20倍対象物の下、LSCMで分析した。
大腿部の動脈を経由して高用量でF−NDP(NV)で処理した動物においては、F−NDP(NV)は、血管断片を有する血栓を12N塩酸(HCl)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)に100mg/mlで、60℃で一晩溶解させることで抽出して、頸動脈から分離した。溶液を遠心分離し(室温で10分間、14,000xg)、ペレットを純水で1度洗浄した。不溶性のF−NDP(NV)−Bitを含むペレットは、最初の質量/体積比を維持する間、DI−水に再懸濁させた。一定量の懸濁液を、40倍対象物での逆蛍光顕微鏡法(Olympus IX81)で計測する粒子のために標準化してある、血球計(IncytoInc., Cheonan−si, Korea)に適用した。F−NDP(NV)−Bitの画像を、TRITCフィルターキューブを使用して、計数のために各観察野から撮影した。可溶化した組織全体について、粒子数を計算した。
統計分析
別段言及しない限り、本実施例における各実験は、3連(triplicate)にて、独立して、3回行った。概略データは排除していない。データは、平均±SDで表す。統計分析は、(SigmaPlot(登録商標) 12 SPSS, Systat Software Inc., San Jose CA, USA)を使用して、スチューデントのt検定により行った。P<0.05は、重要とみなした。
別段言及しない限り、本実施例における各実験は、3連(triplicate)にて、独立して、3回行った。概略データは排除していない。データは、平均±SDで表す。統計分析は、(SigmaPlot(登録商標) 12 SPSS, Systat Software Inc., San Jose CA, USA)を使用して、スチューデントのt検定により行った。P<0.05は、重要とみなした。
結果
F−NDP(NVN)及びF−NDP(NV)蛍光プロフィル測定のNIR蛍光強度の比較により、N−V及びN−V−N粒子、いずれにおいても、NIR蛍光が明らかとなった。しかしながら、NIR領域においての蛍光は、N−V粒子においてのものより20倍強かった(図26A)。この実験により、また570nmでのF−NDP(NV)のピーク励起及び670nmでのピーク放出が、明らかとなった。このピーク励起及び放出プロフィルを使用して、F−NDPsのNIR放出を、用量反応方式で、IVISにおいて比較した(図26B、図26C)。キャピラリー調査により、同一の励起条件下では、F−NDP(NV)のNIR放出は、F−NDP(NVN)のそれよりも、およそ大きさの順でより効果的であることが明らかとなった(図26B)。
F−NDP(NVN)及びF−NDP(NV)蛍光プロフィル測定のNIR蛍光強度の比較により、N−V及びN−V−N粒子、いずれにおいても、NIR蛍光が明らかとなった。しかしながら、NIR領域においての蛍光は、N−V粒子においてのものより20倍強かった(図26A)。この実験により、また570nmでのF−NDP(NV)のピーク励起及び670nmでのピーク放出が、明らかとなった。このピーク励起及び放出プロフィルを使用して、F−NDPsのNIR放出を、用量反応方式で、IVISにおいて比較した(図26B、図26C)。キャピラリー調査により、同一の励起条件下では、F−NDP(NV)のNIR放出は、F−NDP(NVN)のそれよりも、およそ大きさの順でより効果的であることが明らかとなった(図26B)。
F−NDPの蛍光特性は、粒子のサイズで異なり得る。mLのF−NDP(NV)当たり同じ質量のNIR放出を、3つの異なるサイズの粒子について比較した(図27A−27D)。最も小さい蛍光強度は、最も小さい粒子(100nm)に観測され、最も大きい蛍光放出は、700nmF−NDPに観測された。蛍光は、露光時間に伴い、線形に増え、高露光時間でも退色は明らかとならなかった。700nmF−NDP(NV)粒子由来の蛍光は、検出器を20秒未満以内に飽和させたが、F−NDP(NVN)粒子由来の蛍光がはっきりと示されるのには、より長い露光時間を必要とした。同一の獲得時間で、700nm及び10,000nmのNIR放出が増加しなかったことは注目に値する。実際、0.5mg/ml及び1mg/mlでは、10,000nm粒子の放出は、700nm粒子のそれよりも著しく低いものであった(p<0.01、図27A)。われわれは、IVISにおいてイメージ化されるように、生体バリアを透過する、F−NDPのN−V及びN−V−N種の同等のサイズ(700nm)のF−NDP粒子から放射される近赤外蛍光の能力をテストした(図28A−28H)。4mg/mLのF−NDP(NV)粒子で満たしたキャピラリーは、ラットの皮膚(図28A)又は大腿四頭筋筋肉(図28B)並びに豚の腋の下の静脈(図28C)及び2.5mmの脱脂した豚の皮膚(図28D)を通してイメージ化することができた一方、F−NDP(NVN)で満たしたキャピラリー粒子は、これらの状況における任意の、同様のイメージングパラメータでも、視覚化することはできなかった。シグナルが十分な厚さの組織を透過しなかったため、NIR蛍光は、1〜4mg/mL(30−120マイクログラム総量)の濃度で、2.5mmの脱脂した豚の皮膚を通して、モニターした(図28E)。2mg/mLのF−NDP(NV)粒子、1mLを載せた豚の腋の下の静脈は、8mmの豚の皮膚を通して、視覚化することができた(図28F)。透過能の最終試験として、厚さ9〜14mmで異なる、十分な厚さの豚の皮膚の角のある片を、20mg/mL(600μg総量)のF−NDP(NV)を含むキャピラリーの頂部へ横たわらせた。F−NDP(NV)由来の検出可能なシグナルは、厚さ12mmまでの豚の皮膚を通して、記録された。対照的に、F−NDP(NVN)の同等の条件では、光放出は検出されなかった(図28G)。注目に値するのは、ヒト頸動脈の超音波イメージングにより得られたデータであり、そこでは皮膚表面からの頸動脈分岐部の距離は、皮膚表面の下、14mmと見積もられた。これらの発見は、この領域における血栓上に、安全に、比較可能な粒子質量が堆積し得る場合には、この領域における血栓を検出する、F−NDP(NV)の翻訳の見込みを示す(図28H)。
F−NDP(NV)−Bitを使用した、ラットモデルにおける血栓の検出
図26A−28Hの結果は、F−NDP(NV)(700nm)が、試験した粒子のうち最も明るいものであり、in vivoでのイメージングのための有用なF−NDP種であり得ることを示す。それゆえ、すべての次のin vivoでの調査は、ラットの頸動脈分岐部において発生した血栓の検出のためにBitと結合した、F−NDP(NV)で実行した。血栓形成及びECAを経由したF−NDP(NV)−Bitでの処理の後、頸動脈をin situでイメージ化し、イメージング及び解析のために動物から除いた。ECAを経由してのF−NDPの注入により、病変部位への粒子の曝露が最適化され、潜在的に分配、摂取、除外の交絡係数を回避する。IVISスキャナーにおいての蛍光のイメージングにより、曝露した動脈中の血栓の位置に相当する血管枝において、in situでの強い蛍光が示される(図29A、図29B)。処理した及び未処理の動物由来の頸動脈分岐部を除いた後、強い蛍光シグナルが、FeCl3処理した動脈において検出される(図29C、図29D対図29E、図29F)。これをさらに、血栓及び堆積した粒子のコロケーションを確認する、共焦点イメージングにより、正当性を検証した(図29G、図29H対図29I、図29J)。最終的な検証法として、粒子をプールした溶解物(2病変)中においてイメージ化したところ、F−NDP(NV)処理した動物においては、展色剤で処理した動物において、それらがないものと比較して、多くの蛍光性粒子が示された(図29K)。ECAを経由してのF−NDP(NV)−Bitの直接投与の実現可能性の最初の証明に続き、低(3mg/Kg)及び高(15mg/kg)用量のF−NDP(NV)−Bitを大腿動脈を経由して、動物に全身的に注入した。低用量で処理した動物から得られた結果については、結論が出なかった。というのも、シグナルが、展色剤のみで処理した対照動物から分離した頸動脈分岐部から検出される蛍光レベルを一貫して上回らなかったためである。これにもかかわらず、プールした溶解物(3病変)では、F−NDP粒子が血栓中で動かなくなっていることを示し、一方蛍光と関連した粒子は、展色剤で処理した動物からは検出できなかった(図29L)。
図26A−28Hの結果は、F−NDP(NV)(700nm)が、試験した粒子のうち最も明るいものであり、in vivoでのイメージングのための有用なF−NDP種であり得ることを示す。それゆえ、すべての次のin vivoでの調査は、ラットの頸動脈分岐部において発生した血栓の検出のためにBitと結合した、F−NDP(NV)で実行した。血栓形成及びECAを経由したF−NDP(NV)−Bitでの処理の後、頸動脈をin situでイメージ化し、イメージング及び解析のために動物から除いた。ECAを経由してのF−NDPの注入により、病変部位への粒子の曝露が最適化され、潜在的に分配、摂取、除外の交絡係数を回避する。IVISスキャナーにおいての蛍光のイメージングにより、曝露した動脈中の血栓の位置に相当する血管枝において、in situでの強い蛍光が示される(図29A、図29B)。処理した及び未処理の動物由来の頸動脈分岐部を除いた後、強い蛍光シグナルが、FeCl3処理した動脈において検出される(図29C、図29D対図29E、図29F)。これをさらに、血栓及び堆積した粒子のコロケーションを確認する、共焦点イメージングにより、正当性を検証した(図29G、図29H対図29I、図29J)。最終的な検証法として、粒子をプールした溶解物(2病変)中においてイメージ化したところ、F−NDP(NV)処理した動物においては、展色剤で処理した動物において、それらがないものと比較して、多くの蛍光性粒子が示された(図29K)。ECAを経由してのF−NDP(NV)−Bitの直接投与の実現可能性の最初の証明に続き、低(3mg/Kg)及び高(15mg/kg)用量のF−NDP(NV)−Bitを大腿動脈を経由して、動物に全身的に注入した。低用量で処理した動物から得られた結果については、結論が出なかった。というのも、シグナルが、展色剤のみで処理した対照動物から分離した頸動脈分岐部から検出される蛍光レベルを一貫して上回らなかったためである。これにもかかわらず、プールした溶解物(3病変)では、F−NDP粒子が血栓中で動かなくなっていることを示し、一方蛍光と関連した粒子は、展色剤で処理した動物からは検出できなかった(図29L)。
F−NDP(NV)−Bitの高用量のIV注入の後、血栓と関連した蛍光が、すべての処理した動物においてin situで示された(図30A−30C)。FeCl3で発生させた病変を伴う動脈及び対側対照は、切除し、IVIS及び共焦点顕微鏡により独立にイメージ化した。処理した動脈において、強い蛍光シグナルが、IVIS(図30D−30F対図30G−30I)及び共焦点イメージング(図30J−30L対図30M−30O)のいずれにおいても観測された。対照動脈のそれに対する明るさの違いは、p<0.05で統計的に有意であった(図30R、図30S)。頸動脈を溶解することで集められた溶解物は、また病変動脈中に残る多くの蛍光性粒子を示し、対側対照動脈においては、少ないが一定した粒子を示した(図30P)。この差は、p<0.01で、統計的に非常に有意であった(図30Q)。
前記実施例の2つの目的は、1)それらのNIR放出パラメータの点で、2種のF−NDP(F−NDP(NV)及びF−NDP(NVN))の同定、及び2)ヒトNIR血管病理イメージングにおける透過アプリケーションに要求される距離を超えて、生体組織を十中八九透過する十分なエネルギーを放出する、F−NDP種の同定、である。ヒトにおいてのより長いスケール(分間)のイメージング法の見込みを考慮すると、F−NDPの選択において考えなければならない重要なものは、NIR放出の安定性/持続性を含む。ナノ粒子は、一般的に、直径が増加するにつれ、毒性が低下する傾向を有する。具体的には、ナノダイヤモンドは、直径の増加とともに(100nmまで試験済)毒性の低減(例えばナノチューブと比較して)を示し、本調査に使用した700nmのF−NDP(NV)は、安全であり得ることを示す。45mg/kgで700nmF−NDP(NV)での予備調査では、静脈ポートを経由して注入されたラットにおいての致死率又は死亡率は示されておらず、重量及び神経行動学的試験のために、5日間まで評価されている。
第1の目的は、4つの独立した変数に沿って、各F−NDPの放射属性を体系的に調査することであった。すなわち、a)原子操作(N−V、N−V−N)により生じる蛍光スペクトル及び明るさ、b)粒子全質量の放射強度との関係、c)粒子直径の放射強度との関係、及びd)速度及びNIR獲得度合いの速度論である。これらの変数は、IVIS technologyを使用して、N−V及びN−V−N種間に「head to head」で用いられており、その感度及びその非侵襲性のため、NIR光検出能のそのような比較にすべて十分に適しているとみなされる。図26A−27Dに示されるデータにより、F−NDP(NV)種が、in vivoでの生体組織を通してのNIR蛍光透過に有用である見込みが示される。例えば、本実施例において、700nmF−NDP(NV)は、F−NDP(NVN)よりも10−60倍高いNIR放出強度を示す。注意すべきは、F−NDP(NV)由来のNIR放出は、直接粒子サイズとは相関しておらず、700nmF−NDP(NV)で最大化される。一定の粒子質量の搭載では、700nm粒子は、IVISイメージにおいて、4倍明るく、一貫して及びすべてのテストした獲得期間でそうであった、10,000nm粒子由来のNIR蛍光放出は、e700nm粒子よりも弱かった(図2)。10,000nmF−NDP(NV)は、IV注入に有用でありそうにないが、10,000nm粒子は、同等の質量条件粒子の下では、明るさは、直径と相関しないが、固有の直径範囲まで最大化し得ることを示した。
F−NDP(NV)について示した物性(図26A−27D)と等しく、図28A−28Hにおけるデータは、さらにF−NDP(NV)のin vivoでの血管血栓のイメージングを助けるポテンシャルを支持する。図3は、F−NDP(NV)から放出されたNIR蛍光の組織透過性が試験された、いくつかの条件を示す。ヒトの皮膚に類似するものとして使用された、豚の皮膚を通してNIRにより検出可能な最大距離は、12mmであった(図28G)。図28Hは、ICA、ECA及びCCAについて注釈が付けられた、標準的なヒト頸動脈分岐部の超音波記録を表す。図28Hにおける線状の点線のバーは、首表面からの垂直距離からの、ヒト頸動脈分岐部の11.89mmの深さを示す。皮上に直接置かれた同様の手持ち式装置の使用に対して、ヒトの首及びモニターされる検体からのIVISカメラの距離と比較すると、豚の肩の厚い表皮を考えると、血栓容器である頸動脈分岐部のNIR蛍光イメージングは、達成可能な診断機会の内にあると推測される。さらに、図28H中に記録されているNIR蛍光は、およそ670ugの700nmF−NDP(NV)粒子から発生した源を表す。この領域においてヒト血栓にタグ付けされた同一量の粒子により、NIR蛍光イメージングによる血栓検出が可能となる。図30Q中の結果は、最小限の0.7%の注入用量が対象病変中に捕捉され(用量にして、2x108粒子/mg)、ヒトにおいて、同様の放出プロフィルに到達するのに必要とされる用量は、およそ100mg(1.4mg/kg)であることを示唆している。ラットにおける予備調査においては、45mg/kgと同程度の用量は、5日間、何らの有害事象が記録されることもなく、耐性良好であった(データは示していない)。
In vivoでの調査を、ビチスタチンと共有結合的に結合したF−NDP(NV)−Bitで行った。手順は、安定なアミドを結合を与えるDC媒介共有結合性ヘテロ二官能性結合を使用しており、生体システムにおいて回復力のあるものである。これらF−NDP(NV)−Bitを、確立された分岐部部位での頸動脈血栓法を受けた、安楽死させたラットに対して、全身的に投与した。パイロットの翻訳調査においては、F−NDP(NV)−Bitは、初めにECAを経由して(「高用量」、15mg/Kg)又は大腿部の動脈を経由して(「低用量」、3mg/Kg)投与した。この実験デザインは、薬物動態(学)及び粒子分配の動力学が未知のために選択した。それゆえ、起こり得る、第1経路排泄又は組織分配を経由しての粒子量の大量減少を回避するために(潜在的「偽陰性」という結果)、ECAを経由しての注入は、標的とした領域における血栓への、粒子の最大曝露を確める。血液中におけるF−NDP(NV)−Bit固有の共局在化を評価し、確かめるために、3つの独立した方法を配備した。すなわち、a)IVIS全身イメージング(図29A、図29B)、b)血栓を運ぶ抽出血管のLSCM(図29C、図29D)及びc)全有機物質の可溶化の後、血栓を有する血管から抽出した粒子の直接的な計数(図29L)である。ECAを経由しての高用量のF−NDP(NV)−Biの注入によるF−NDP(NV)の凝集は、3つの方法すべてにより容易に検出される。しかしながら、大腿動脈を経由しての低用量(3mg/Kg)のF−NDP(NV)−Bitの注入では、IVIS又はLSCMで放出を検出することに成功しなかった(図4E−F)。少ない量の粒子を血栓抽出物中で数えたが(図29M)、この非常に少量のものが、具体的に凝集血栓であるか、『栄養血管』を経由して、血管壁に載せられたものであるか、又は両方であるかについては定かでない。しかしながら、粒子が実際に血栓を標的としていたとしても、低用量のF−NDP(NV)−Bitでは、IVIS又はLSCMにより検出可能な、信頼できる放出は生み出さなかった。次にF−NDP(NV)−Bitを静脈に高用量で(15mg/Kg、N=3)投与した。図30A−30Cに示すように、試験したすべての3つの動物は、また分離した血管の蛍光(図30D−30I)において、LSCM(図30J−30O)による検閲の下、明確にみえるほど、頸動脈分岐部域から発せられる(IVIS)強い蛍光シグナル放出を示した。粒子は、また可溶化された血栓を有する血管中に大量に存在した(図30P)。図30Q−30Sは、血栓を有する血管対照対側中での固い粒子の沈殿物の定量分析を示す。
本実施例におけるまとめとして、本調査で配備されたF−NDP(NV)が、ラット頸動脈分岐部モデル中に形成された血栓といった、in vivoでの血栓と結合し得る証拠を示した。ここで概念実証は、3つの独立した測定、又は抽出した血栓から分離した蛍光粒子の直接計数を含む、in situでの血栓形成で検出されたNIR蛍光放出に基づく。データにより、血管病変(例えば、頸動脈分岐部における血栓)に存在するに相当する距離を超えて、F−NDP(NV)から放出されるNIR蛍光イメージングを検出する可能性が示される。うまく臨床的実践にまで変換されれば、外来的環境において行われる、この最小限侵襲的な方法により、抗血栓塞栓剤の早期開始といった、予防的測定が強化され得る。
本発明のいくつかの実施形態が、この本文で述べられ、図示されてきた一方で、当業者は、機能の実行、及び/又は結果及び/又はこの本文で述べられている1つ以上の利益を得るために、直ちに種々の他の手段及び/又は構成を想像することとなるが、各そのような変形及び/又は改変は、本発明の範囲内にあるものとみなされる。より一般的には、当業者は、この本文で述べられている、すべてのパラメータ、寸法、物品、及び配置が例となることを意味しており、実際のパラメータ、寸法、物品、及び/又は配置は、具体的な適用又は本発明の教示が使用されるアプリケーションに依存することとなることが、すぐにわかるであろう。当業者は、ただルーティンにすぎない実験を使用して、この本文で述べられている、具体的な実施形態と等価な多くのものを認識することとなり、又は確かめることが可能となる。それゆえ、前記実施形態は、実施例を経由してのみ示され、添付の請求項及びそれらと等価のものの範囲内において、具体的に述べられ、請求されているもの以外に、本発明は実行され得る、と解される。本発明は、この本文で述べられている、各個々の特徴、システム、物品、材料、及び/又は方法に向けられている。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、及び/又は方法の2つ以上の任意の組み合わせが、そのような特徴、システム、物品、材料、及び/又は方法が相互に矛盾していないのであれば、本発明の範囲に含まれる。
ここで明細書及び請求項に使用されているように、不定冠詞『a』及び『an,』は、明確に反対に指示されていない限り、『at least one(少なくとも1つ)』を意味すると解されるべきである。
『and/or(及び/又は)』という表現は、この本文で明細書において及び請求項において使用されているように、非常に共同した、すなわち、ある場合において、共同的に存在しており、他の場合において、選言的に存在している、要素の『either or both(どちらか一方又は両方)』を意味するものと解すべきである。明確に反対に示されていない限り、具体的に特定される要素と関連があろうがなかろうが、『and/or(及び/又は)』節により具体的に特定される要素以外の他の要素が、要すれば、存在し得る。それゆえ、限定されない例として、『comprising(含む)』といった制約のない言語と併せて使用される際、『A and/or B,(A及び/又はB、)』への参照は、1つの実施形態において、Bを伴わない(要すればB以外の要素を含む)A、他の実施形態において、Aを伴わない(要すればA以外の要素を含む)B、さらに他の実施形態においては、A及びBいずれも(要すれば他の要素を含む)、などを参照することが可能である。
この本文で明細書において、請求項において使用されているように、『or(又は)』は、上で定義されているように、『and/or(及び/又は)』と同一の意味を有すると解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分けた際に、『or(又は)』又は『and/or(及び/又は)』は、包含的であると、すなわち、少なくとも1つであるが、また1つより多くの、多くのリストの要素の、及び要すれば、さらなるリスト化されていない項目の包含であると、解釈されるべきである。『only one of(のうちの1つのみ)』又は『exactly one of,(のうちのちょうどひとつ、)』又は、請求項において使用される際、『consisting of,(から成る)』といった、明確に反対に示されている表現のみが、要素の多くのリストのちょうど1つの包含を参照することとなる。一般的には、この本文で使用されているように、『or(又は)』という表現のみを、『either,(どちらか一方、)』『one of,(のうちの1つ、)』『only one of,(のうちの1つのみ、)』又は『exactly one of(のうちのちょうど1つ)』といった排他の表現が先行する際、排他的代替(すなわち、『one or the other but not both(一方又は他方であるが、どちらともではない)』)を示すものとして、解釈するものとする。『Consisting essentially of,(本質的に含む)』は、請求項において使用する際には、特許法の分野で使用されているように、通常の意味を持つものとする。
この本文で明細書において、請求項において使用されているように、1つ以上の要素のリストに関して『at least one,(少なくとも1つ)』という表現は、要素のリスト中の任意の1つ以上から選択されるが、要素のリストに具体的にリスト化された、各及びすべての要素のうちの少なくとも1つを必ずしも含まず、要素のリスト内の要素のいかなる組み合わせも排除しない、少なくとも1つの要素を意味するものと解すべきである。この定義により、具体的に特定される要素と関連があろうがなかろうが、『at least one(少なくとも1つの)』という表現が参照する要素のリスト内に、具体的に特定される要素以外の要素が、要すれば存在し得ることが、また可能となる。それゆえ、限定されない例として、『at least one of A and B(A及びBのうちの少なくとも1つ)』(又は、等価に、『at least one of A or B(A又はBのうちの少なくとも1つ),』又は、等価に『at least one of A and/or B(A及び/又はBのうちの少なくとも1つ)』)は、1つの実施形態において、少なくとも1つ、要すれば1つより多く含む、Bが存在しない(及び要すればB以外の要素を含む)、A、他の実施形態において、少なくとも1つ、要すれば1つより多く含む、Aが存在しない(及び要すればA以外の要素を含む)、B、さらに別の実施形態において、少なくとも1つ、要すれば1つより多く含む、A、及び少なくとも1つ、要すれば1つより多く含む、B(及び要すれば他の要素を含む)など、を指し得る。
請求項において、並びに前記明細書において、『comprising,(含む)』『including,(含む)』『carrying,(運ぶ)』『having,(有する)』『containing,(含む)』『involving,(含む)』『holding,(有する)』など、といった、すべての移行句は、限定されないものと解することが可能で、すなわち、含むがそれらに限定されないことを意味すると解することが可能である。移行句『consisting of(から成る)』及び『consisting essentially of(本質的にから成る)』の移行句のみを、各々、閉じた又は半分閉じた移行句とし、米国特許庁特許審査手順のセクション2111.03に記載されている。
Claims (46)
- 薬剤が、ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドと化学的に結合した蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む、診断薬。
- 前記ポリペプチドが、ディスインテグリンである、請求項1に記載の診断薬。
- 前記薬剤が、前記ナノダイヤモンド粒子本来の性質の結果として、蛍光性である、請求項1に記載の診断薬。
- 前記試薬が、電磁気源により励起された際、検出可能な電磁気的シグナルを放出する、請求項1に記載の診断薬。
- 前記蛍光性ナノダイヤモンド粒子及び前記ポリペプチドが、共有結合している、請求項1に記載の診断薬。
- 血栓塞栓事象の診断又は予後診断の方法であって、該方法が、
血栓塞栓事象を罹患していた又はそのリスクにある疑いがある被験者に、請求項1に記載の診断薬を診断に効的な量、投与する工程、
該診断薬が十分な時間、血栓部位(複数有り)に局在化させる工程、及び
該診断薬の蛍光放出を検出することで該診断薬を検出する工程
を含む方法。 - 活性血小板の検出方法である、請求項6に記載の方法。
- 対象者の血栓又は血栓の形成の検出方法である、請求項6に記載の方法。
- 血栓の検出についての診断方法における使用のための、分配、運搬、及び/又は貯蔵に適した詰め合わせの形の、請求項1に記載の診断薬
を含むキット。 - 前記診断薬の分配、運搬、及び/又は貯蔵に適した材料をさらに含む、請求項9に記載のキット。
- 詰め合わせの組み合わせで、1つ以上の、対象者への前記診断薬の投与のための試薬又は装置をさらに含む、請求項9に記載のキット。
- 前記診断薬へ励起エネルギーを放出する装置をさらに含む、請求項9に記載のキット。
- 前記励起エネルギーを放出する装置が、前記診断薬由来の放出応答を検出するための検出器をさらに含む、請求項12に記載のキット。
- 前記装置が、手持ち式装置である、請求項12又は13に記載のキット。
- サンプル注入口、
該サンプル注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、
該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第1の化学種、及び
該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第2の化学種を含む検出領域
を含む、流体装置。 - 前記検出領域と流体的に連通している制御領域であって、該制御領域が、該制御領域と結合した複数の第3の化学種をさらに含む、請求項15に記載の流体装置。
- 複数の第1の化学種及び複数の第2の化学種が、各々、検体と結合するよう配置されている、請求項15に記載の流体装置。
- 前記第3の化学種が、前記第1の化学種と結合することが可能である、請求項16に記載の流体装置。
- 前記蛍光性ナノダイヤモンド粒子が、250nmより大きい又は等しい及び1000nmより小さい又は等しい波長の放出を有する、先行するいずれかの請求項に記載の流体装置。
- 前記制御領域と流体的に連通している吸収領域をさらに含む、先行するいずれかの請求項に記載の流体装置。
- 請求項15に記載の2つ以上の流体装置を含むシステム。
- 前記流体装置が、ラテラルフローアッセイ装置である、先行するいずれかの請求項に記載の流体装置。
- サンプル注入口、
該注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、
該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第1の化学種、
該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第2の化学種を含む検出領域、及び
該検出領域で蛍光放出を定量するよう配置されている検出器
を含む、システム。 - サンプル注入口、
該注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、
該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第1の化学種、
該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第2の化学種を含む検出領域、及び
該検出領域で赤外シグナルを定量するよう配置されている検出器
を含む、システム。 - 検体を含む疑いのあるサンプルを流体装置の流体チャネルへ導入すること、
該検体が存在する場合、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種の少なくとも一部分と結合するよう、該サンプルを複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種に曝露すること、
該検体と結合していないすべての蛍光性ナノダイヤモンド粒子及び化学種を除くこと、及び
該検体と結合した複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光放出を定量すること、
を含む方法。 - サンプル中に存在する検体の量が、蛍光放出の強度が関係している、請求項10に記載の方法。
- 特定の検体を含む疑いを有する被験者に、化学種が、存在する場合、該検体と結合し得るよう、化学種と結合した複数のナノダイヤモンド粒子を投与する工程、及び
存在する場合、該検体と結合した化学種を含む、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光放出を検出する工程
を含む方法。 - 蛍光放出の強度の定量を含む、請求項27に記載の方法。
- 蛍光放出を検出することが、被験者における血栓の存在を示唆する、請求項27に記載の方法。
- 蛍光放出を検出することが、被験者におけるウイルスの存在を示唆する、請求項27に記載の方法。
- 前記化学種が、エボラウィルスと結合することが可能である、先行する請求項のいずれかに記載の流体装置、システム、又は方法。
- 前記ディスインテグリンが、ビチスタチンである、請求項1に記載の診断薬。
- 前記化学種が、ディスインテグリンである、請求項15に記載の流体装置。
- ヒト又はヒト以外の動物における血栓塞栓事象の検出のための診断薬であって、該薬剤が、ディスインテグリンビチスタチン(Bt)と化学的に結合している、蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む、診断薬。
- 前記薬剤が、前記ダイヤモンド粒子の本来的な性質の結果として蛍光性である、請求項34に記載の診断薬。
- 電磁気源により励起された際、前記薬剤が、検出可能な電磁気的シグナルを放出する、請求項34に記載の診断薬。
- 前記蛍光性ナノダイヤモンド粒子、及び前記Btが共有結合している、請求項34に記載の診断薬。
- 血栓塞栓事象の診断又は予後診断のための方法であって、該方法が、
血栓塞栓事象を罹患していた又はその疑いのある被験者へ請求項34に記載の診断薬を診断的に効果のある量で投与する工程、
該診断薬を十分な時間、血栓の場所(複数有り)に局在化させる工程、及び
該診断薬の蛍光放出を検出することで診断薬を検出する工程
を含む、方法。 - 血小板の検出方法である、請求項38に記載の方法。
- 被験者における血栓又は血栓の形成を検出する方法である、請求項38に記載の方法。
- 血栓の検出のための診断法における使用のための分配、運搬、及び/又は貯蔵に適した詰め合わせの形の請求項34に記載の診断薬を含む、キット。
- 前記診断薬の分配、運搬、及び/又は貯蔵に適した材料をさらに含む、請求項41に記載のキット。
- 詰め合わせの組み合わせで、被験者への前記診断薬の投与のための1つ以上の試薬又は装置をさらに含む、請求項41に記載のキット。
- 前記診断薬に対し、励起エネルギーを放出する装置を含む、請求項41に記載のキット。
- 励起エネルギーを放出する前記装置が、前記診断薬からの放出応答を検出する検出器をさらに含む、請求項41に記載のキット。
- 前記装置が手持ち式装置である、請求項44又は45に記載のキット。
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