CN106237347A - 一种体内活细胞示踪试剂盒及其示踪方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种体内活细胞示踪试剂盒及其示踪方法。该试剂盒包括脂质体包被的锰离子，以及与待示踪的细胞对应的特异性表面标志物抗体。本发明利用MEMRI技术可准确示踪体内细胞的存活及分化情况，且减少了锰离子对体内其他器官组织的毒性作用。

Description

一种体内活细胞示踪试剂盒及其示踪方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种体内活细胞示踪试剂盒及其示踪方法。

背景技术

女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中99％发生在女性，男性仅占1％。乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。

乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。自20世纪90年代全球乳腺癌死亡率呈现出下降趋势；究其原因，一是乳腺癌筛查工作的开展，使早期病例的比例增加；二是乳腺癌综合治疗的开展，提高了疗效。乳腺癌已成为疗效最佳的实体肿瘤之一。目前，常见的乳腺癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗及中医药辅助治疗等多种手段。对于手术治疗，乳腺癌患者有可能需要切除乳房，然后再采用整形外科技术重建乳房。乳房重建可采用自体脂肪组织重建，也可采用假体重建。

自体脂肪组织是一种理想软组织填充材料，在癌症乳房手术切除后乳房再造中，以及先天性畸形，口腔颌面的肿瘤切除后软组织缺损修复都是理想的材料。但由于脂肪细胞的耐缺血能力较差，失去了原有微血管结构的肪组织颗粒移植物，在与受区重新建立血运以前，常因局部血浆营养不足而发生脂肪细胞坏死、脂肪组织吸收及硬结、囊肿形成等并发症。针对这一问题，近年来，脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的应用为提高脂肪移植存活率提供了一条新的治疗途径。其临床试验结果证实ADSCs细胞能使脂肪移植物由存活状态得到改善，在超过1年的术后随访中移植的脂肪组织未发生纤维化或粘连，因此ADSCs具有良好的前景。

在脂肪组织与干细胞联合治疗过程中，需要密切追踪ADSCs细胞与脂肪颗粒共移植后的体内存活及分化的动态变化过程，已达到最佳的治疗效果。目前，大多数的干细胞标记工作都是在体外环境下进行，其鉴定与分离的理论基础是建立在对细胞表面特异性标记物的识别的基础上，其中包括绿荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)和5-溴-2′-脱氧尿苷作为待移植干细胞或其DNA的标记物，经标本切片观察进行评估分析。但是这种对以GFP或BrdU标记干细胞的追踪观察仅适用于体外分析或动物实验，而就干细胞活体内的分化及功能评估或未来临床疗效评估而言，探寻能直接评价移植干细胞在宿主体内功能重建的活性示踪方法更加重要。因此，急需提供一种方法能够准确、快速、简便地标记追踪ADSCs细胞与脂肪颗粒共移植后的体内存活及分化的动态变化过程。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种体内活细胞示踪试剂盒及其示踪方法。该示踪试剂盒及示踪方法利用MEMRI技术可准确示踪体内细胞的存活及分化情况，且安全、无毒性作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种体内活细胞示踪试剂盒，包括脂质体包被的锰离子，以及与待示踪的细胞对应的特异性表面标志物抗体。

锰离子增强磁共振功能成像(manganese-enhancement MRI，MEMRI)是近年发展起来的一种新的分子影像技术，该技术可以标记活的细胞，产生明亮的信号，因此可以用来评价移植细胞的存活情况。在体内注射干细胞后，MEMRI技术可以体内示踪干细胞的存活情况，观察干细胞的治疗效果。另外，由于干细胞增殖而生成新的组织会增强MEMRI信号，因此MEMRI示踪技术还可以进一步观察干细胞在体内的增殖和再生情况。然而，锰离子对体内组织具有具有一定的毒副作用。

本发明采用抗体偶联的脂质体，将锰离子输送至所需部位，以减少锰离子对体内其他器官和组织的毒副作用。脂质体是类似于磷脂双分子层形成的微型囊体。利用细胞膜融合的特点，可利用脂质体将药物等物质送入细胞；而将脂质体与抗体偶联成免疫脂质体，可借助抗体与靶细胞表面抗原的结合作用，将其包裹的物质特异性地输送至目的细胞。

本发明应用活性诱导锰离子增强的磁共振功能成像(MEMRI)技术对细胞移植后修复软组织功能评估，并利用带靶头的脂质体将锰离子特异性运送至移植部位，可以实时动态监测细胞在体内的存活以及分化等情况，建立了一套可以应用于临床的、能直接活体评估细胞在宿主体内功能重建的示踪方法。

在本发明提供的实施例中，脂质体包被的锰离子的制备方法为：将卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇和锰离子溶于有机溶剂，进行第一超声处理，去除有机溶剂，加入缓冲液振荡，进行第二超声处理，获得脂质体包被的锰离子。

作为优选，以mg/mg/mL/μmol/mL计，卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇、锰离子与有机溶剂的比例为(50～150)：(40～80)：(0.1～0.5)：(10～100)：(1～10)。例如将50～150mg卵磷脂、40～80mg胆固醇、0.1～0.5mL聚乙二醇、10～100μmol锰离子溶于1～10mL有机溶剂中。

在本发明提供的实施例中，以mg/mg/mL/μmol/mL计，卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇、锰离子与有机溶剂的比例为100：57.2：0.3：50：2。

在本发明提供的实施例中，在脂质体包被的锰离子的制备方法中，所用有机溶剂为氯仿。

作为优选，第一超声处理的时间为2～3min，功率为200～400W。

在本发明提供的实施例中，第一超声处理的时间为2min，功率为200W。

作为优选，第二超声处理的时间为10～20s，功率为300～600W。

在本发明提供的实施例中，第二超声处理的时间为10s，功率为300W。

在本发明提供的实施例中，待示踪的细胞为干细胞，特异性表面标志物抗体为干细胞特异性表面标志物抗体。

在本发明提供的实施例中，待示踪的细胞为脂肪干细胞，特异性表面标志物抗体为HLA-ABC抗体。

在本发明中，试剂盒还包括戊二醛。采用戊二醛可将脂质体与抗体偶联在一起。

在本发明中，体内活细胞示踪试剂盒包括卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇、锰离子、有机溶剂和戊二醛。

本发明还提供了一种体内活细胞的示踪方法，包括：

采用脂质体包被锰离子，获得脂质体包被的锰离子；

将脂质体包被的锰离子与待示踪的细胞对应的特异性表面标志物抗体偶联，获得偶联物；

采用锰离子增强磁共振功能成像技术，利用偶联物检测体内细胞的存活情况。

作为优选，偶联采用戊二醛进行偶联。

作为优选，锰离子与待示踪的细胞的比例为0.001～0.01mg/mL。

作为优选，脂质体包被的锰离子与待示踪的细胞对应的特异性表面标志物抗体的体积比为(1～5)：(2～10)。

在本发明提供的实施例中，脂质体包被的锰离子与待示踪的细胞对应的特异性表面标志物抗体的体积比为1∶2。

作为优选，偶联的温度为0～4℃，偶联的时间为12～24h。

在本发明提供的实施例中，偶联的温度为4℃，偶联的时间为12h。

本发明提供了一种体内活细胞示踪试剂盒及其示踪方法。该试剂盒包括脂质体包被的锰离子，以及与待示踪的细胞对应的特异性表面标志物抗体。本发明至少具有如下优势之一：

1、本发明利用MEMRI技术可准确示踪体内细胞的存活情况；在本发明实施例中，利用MEMRI技术体内示踪脂肪干细胞修复软组织损伤，可检测ADSCs细胞与脂肪颗粒共移植后的体内存活及分化的动态变化过程；

2、本发明方法无需对移植的细胞进行分子生物学的标记，减少了其应用的风险，并且可应用于临床；

3、本发明运用特异性脂质体运送锰离子至移植组织中，减少锰离子对体内其他器官组织的毒性作用。

附图说明

图1示P3代脂肪干细胞，其中1-1为放大40倍的图片；1-2为放大100倍的图片；

图2示脂质体直径；

图3示脂质体电镜图；

图4示Western blot鉴定抗体偶联脂质体情况；在4-1中，泳道1示脂质体，泳道2示anti-HLA-ABC抗体，3示脂质体和anti-HLA-ABC抗体的偶联产物；在4-2中泳道1-3均为Beta-actin(内参)；

图5示锰离子对细胞的毒性作用。

具体实施方式

本发明公开了一种体内活细胞示踪试剂盒及其示踪方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的体内活细胞示踪试剂盒及其示踪方法中所用生物制剂、试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(一)脂肪干细胞原代分离

待脂肪组织与肿胀液自然分层后吸弃下层液体，加入等体积的生理盐水清洗脂肪组织2次，吸弃下方溶液；将脂肪组织分装至50mL离心管中，每管20mL，每管中加入等体积的0.5％Ⅰ型胶原酶(终浓度为0.25％)，充分混匀，封口，转移至恒温空气摇床中，37℃、200R消化50min；消化完成后离心，1500rpm离心10min；弃去离心后的脂肪和脂肪油，每管加入40mL生理盐水重悬细胞，1500rpm离心5min，弃去上清，用适量生理盐水重悬细胞，获得ADSCs。脂肪干细胞形态图片见图1。

(二)脂肪干细胞与移植脂肪混合制剂标准制备体系

按照脂肪组织体积1/20的比例，用生理盐水重悬脂肪干细胞，吹打均匀，形成细胞悬液。将细胞悬液加入到脂肪组织中，搅拌混匀后形成制剂。拔出50mL螺口注射器的活塞，转移制剂至50mL螺口注射器中，插上活塞，并排出注射器内全部的空气；通过三通管将制剂分装至5mL螺口注射器中，5mL/管。

(三)锰离子标记原代脂肪干细胞体外实验研究

由于大剂量锰离子的毒性作用影响了该技术的发展和临床应用，需摸索氯化锰最佳有效剂量。用不同浓度的氯化锰(0.1M、10mM、1mM、0.1mM、10μM、1μM和0.1μM)标记分离得到的脂肪干细胞，培养24小时后，利用CCK8试剂盒检测氯化锰对原代脂肪干细胞的毒性作用。

(四)脂质体制备

脂肪干细胞高表达HLA-ABC，因此通过anti-HLA-ABC抗体标记的脂质体(liposome)特异性运输氯化锰至移植组织。

脂质体的制备和抗体偶联：将100mg卵磷脂、57.2mg胆固醇、0.3mL聚乙二醇、50μmol氯化锰溶于2mL氯仿中，超声波处理2min，形成均匀单相体系，在45℃减压下旋转蒸发除去氯仿，加入缓冲液振荡至脂质从容器壁上脱落，超声波处理10s。取脂质体溶液，加入戊二醛室温放置10min，透析除去多余戊二醛，加入HLA-ABC抗体4℃孵育过夜。20000rpm4℃高速离心15min，PBS洗涤，将沉淀脂质体重悬于PBS中，4℃储存。

(五)MEMRI体内示踪脂肪干细胞修复软组织损伤

1)动物种类：6-8周SCID小鼠；

2)实验分组：

生理盐水组(对照组1)；

脂肪组织移植组(对照组2)；

脂肪干细胞+脂肪组织移植组(实验组1)。

3)移植方式：根据分组，对照组1只是皮下注射生理盐；对照组2植入脂肪组织，实验组1植入脂肪干细胞与移植脂肪混合制剂，并分别在不同时间点利用MEMRI技术监测体内脂肪组织的存活情况。脂肪干细胞+脂肪组织移植组中的脂肪干细胞使用Celltracker试剂盒进行标记。

4)观察方式：脂肪干细胞移植后1周、2周、4周、8周利用MEMRI技术观察实验组脂肪干细胞的存活情况，每次MRI成像前先尾静脉注射脂质体，动态追踪脂肪干细胞在体内的变化；并且在每个观察时间点将移植的脂肪干细胞和脂肪组织取出，进行病理以及脂肪干细胞的分析。

5)分析指标：

a.脂质体直径检测：取适当稀释的脂质体溶液(100倍稀释)滴在载波片上，盖上盖玻片，用目微尺观测5个视野里的脂质体直径，记录，计算直径分配率D。计算公式：D＝[X1(0～0.01)+X2(0.01～0.02)×2+X3(0.02～0.03)×3+...]/N。X为5个视野里相应直径脂质体数的平均值，N为视野数5，0～0.01为视野数里0～0.01μM直径的脂质体。由图2和图3结果显示制备的脂质体直径多为100～200μM，平均直径为121.4μM，表明脂质体制备成功。

b.anti-HLA-ABC抗体偶联的脂质体：用Western blot检测anti-HLA-ABC抗体是否成功偶联到脂质体上。由图4可知，anti-HLA-ABC抗体成功偶联到脂质体上，可以进行体内移植。

c.CCK8检测锰离子对细胞的毒副作用，分析不同浓度锰离子细胞的存活和死亡情况。由图5的试验结果可知，当浓度在0.001～0.01mg/mL范围内，锰离子对脂肪干细胞的毒性较小，因此动物实验采用此浓度范围。

d.采集MEMRI以及活体成像系统的数据进行分析，分析不同的示踪技术所得到的脂肪干细胞在移植的脂肪组织中的分布以及存活情况。观察可知，对照组和实验组的动物生长状态良好，未出现死亡情况；对照组1无移植脂肪，对照组2移植的脂肪主要分布在移植区域，而且有部分脂肪坏死，脂肪体积减小；实验组的脂肪分布区域向四周扩散，无脂肪坏死，脂肪体积变化不显著。说明标记方法是安全的，无任何毒副作用。

e.在1周、2周、4周、6周、8周时分析移植脂肪组织中脂肪干细胞的情况，主要分析移植脂肪组织的体积以及脂肪干细胞的含量。由表1可以看出，随着时间的推移动物体内对照组2的脂肪体积渐渐减少，脂肪吸收较多；实验组的脂肪体积稍微减少，但是无显著性变化；脂肪干细胞可以在体内增值，说明脂肪干细胞辅助脂肪组织在动物体内存活，此干细胞标记方法与预期效果一致，方法可靠。

表1移植脂肪组织中脂肪干细胞的情况

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种体内活细胞示踪试剂盒，其特征在于，包括脂质体包被的锰离子，以及与待示踪的细胞对应的特异性表面标志物抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脂质体包被的锰离子的制备方法为：将卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇和锰离子溶于有机溶剂，进行第一超声处理，去除有机溶剂，加入缓冲液振荡，进行第二超声处理，获得脂质体包被的锰离子。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，以mg/mg/mL/μmol/mL计，所述卵磷脂、所述胆固醇、所述聚乙二醇、所述锰离子与所述有机溶剂的比例为(50～150)：(40～80)：(0.1～0.5)：(10～100)：(1～10)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一超声处理的时间为2～3min，功率为200～400W；所述第二超声处理的时间为10～20s，功率为300～600W。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述待示踪的细胞为干细胞，特异性表面标志物抗体为干细胞特异性表面标志物抗体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括戊二醛。

7.一种体内活细胞的示踪方法，其特征在于，包括：

采用脂质体包被锰离子，获得脂质体包被的锰离子；

将所述脂质体包被的锰离子与待示踪的细胞对应的特异性表面标志物抗体偶联，获得偶联物；

采用锰离子增强磁共振功能成像技术，利用所述偶联物检测体内细胞的存活情况。

8.根据权利要求7所述的示踪方法，其特征在于，所述偶联采用戊二醛进行偶联。

9.根据权利要求7或8所述的示踪方法，其特征在于，所述锰离子与所述待示踪的细胞的比例为0.001～0.01mg/mL。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的示踪方法，其特征在于，所述偶联的温度为0～4℃，偶联的时间为12～24h。