KR101724129B1 - Rgd 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 신경염증 예방, 억제 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 신경염증 예방, 억제 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는,(a) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 약제학적 유효량; (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경염증 예방, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물이다. 본 발명은 삭사틸린 및 그 유사체들의 신경염증 완화 효과를 확인함으로써, 혈전용해 효능과 함께 이중 기능을 갖는 뇌졸중 치료제 개발이 가능하게 한다.

Description

RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 신경염증 예방, 억제 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing, Inhibiting or Treating Neuroinflammation comprising Peptide or Protein having RGD motif}
본 발명은 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 신경염증 예방, 억제 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
신경계는 신경세포(neuronal cells)와 신경교세포(glia cells)로 구성되어 있으며, 그중 신경교세포는 수적으로 전체 뇌 세포의 90%를 차지하고 있고, 부피로는 뇌 전체의 50%를 차지하고 있다. 중추신경계의 신경교세포는 성상세포(astrocyte), 희소돌기교세포(oligodemdrocyte) 및 소교세포(microglia)로 구분되며, 이중 소교세포는 전체 뇌세포의 5 내지 10%를 차지하는 신경계의 염증세포로서 정상상태의 뇌에서의 그 역할은 아직 잘 알려져 있지 않으나 외상, 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중 등 여러 가지 원인에 의해 뇌손상이 발생시 활성화되어 대식세포(macrophage)와 유사한 면역작용을 담당한다(Minghetti L, et al., Prog. Neurobio. I. 54(1), pp99-125, 1998). 활성화된 소교세포는 정상상태와 달리 포식작용(phagocytosis)이 활발해지고 세포증식을 하며 각종 사이토카인(cytokine), 유도형 산화질소 생성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 등의 유전자를 발현시켜 각종 염증매개 물질을 생산한다(Dawson VL, et al., J. Neurosci., 13, pp2641-2661, 1993). 이와 같은 경로로 생산된 염증매개 물질이 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중 및 치매 같은 퇴행성 뇌질환이 원인이 된다는 많은 증거가 제시되고 있다(Wood PL, et al., Neurol. Res., 17, pp242-248, 1995).
한국 뱀독으로부터 정제되고 클로닝된 신규한 디스인테그린인 삭사틸린(Saxatilin)은 트리펩타이드 서열인 Arg-Gly-Asp(RGD)를 가지는데, 이 서열은 혈소판 GPIIb/IIIa 수용체에 대한 디스인테그린의 인지 부위(recognition site)이다(Hong, Koh et al., 2002; 및 Hong, Sohn et al., 2002). 삭사틸린은 혈소판 응집(Hong, Koh et al., 2002) 및 혈소판 활성화(Jang, Jeon et al., 2007) 상에 강력한 억제효능을 가져서, 혈전 생성을 방해하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 허혈성 손상에 의해 유도되는 신경염증을 억제할 수 있는 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 혈전용해제로 알려진 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질이 신경염증을 효과적으로 억제하는 활성을 갖는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 신경염증 예방, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, (a) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 약제학적 유효량; (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경염증 예방, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 허혈성 손상에 의해 유도되는 신경염증을 억제할 수 있는 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 혈전용해제로 알려진 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질이 신경염증을 효과적으로 억제하는 활성을 갖는 것을 확인하였다.
본 발명의 상기 “RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질”은 중성구에 존재하는 인테그린 αMβ2 및 αLβ2에 결합하여 신경염증을 억제할 수 있는 아미노산 기반 분자를 포괄하는 개념으로서, 펩타이드의 길이, 변형(modification) 여부, 전기적 특성 등을 불문하고 인테그린 인식 부위인 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함하는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 신경염증 예방, 억제 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 사용되는 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질은 중성구에 존재하는 인테그린 αMβ2 및 αLβ2에 결합하여 내피세포의 ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule 1)과의 상호작용을 저해하여 허혈성 손상에 의해 유도되는 신경염증을 억제한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질은 서열목록 제1서열의 삭사틸린 또는 이의 유사체이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 삭사틸린의 유사체는 삭사틸린의 아미노산 서열(서열목록 제1서열)에 기반한 삭사틸린 유사체[즉, 결실 돌연변이체(deletion mutant)]삭사틸린의 활성, 즉 중성구에 존재하는 인테그린 αMβ2 및 αLβ2에 결합하여 내피세포의 ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule 1)과의 상호작용을 저해하여 허혈성 손상에 의해 유도되는 신경염증에 대한 저해 효과를 효율적으로 나타낼 수 있는 서열을 예측하여 최적화된 아미노산 서열로 제조된다.
본 발명의 상기 삭사틸린은 면역글로불린(immunoglobulin)이 컨쥬게이션(conjugation)된 삭사틸린이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 삭사틸린은 면역글로불린의 Fc 영역이 컨쥬게이션된 삭사틸린이다.
본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 삭사틸린보다 안정성이 우수하지만, 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형될 수 있으며, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.
상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.
상기 면역글로불린 컨쥬게이션은 당업계의 공지된 재조합 기술에 의해 뉴클레오타이드/유전자 수준에서 맞춤(tailor-made)으로 실시될 수 있다. 면역글로불린을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있으며, 예컨대, 게놈 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)로부터 구할 수 있다. 삭사틸린의 뉴클레오타이드 서열 또한 공지되어 있으며, 서열목록 제1서열의 삭사틸린을 코딩하는 아미노산 서열에 근거하여 추정할 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 컨쥬게이션된 삭사틸린을 발현하기 위해 발현벡터(플라스미드)의 컨스트럭트는 이의 천연 및/또는 변형 및/또는 컨쥬게이션 형태의 면역글로불린 경쇄를 위한 발현 카세트, 이의 천연 및/또는 변형 및/또는 컨쥬게이션 형태의 면역글로불린 중쇄를 위한 발현 카세트, 선별 마커 및 대장균 복제 뿐 아니라 선별 유닛의 요소가 요구된다. 이러한 카세트는 프로모터, 구조 유전자, 분비 신호 서열을 코딩하는 DNA 부분 및 터미네이터로 구성된다. 이러한 요소들은 작동적으로 연결되어 면역글로불린 컨쥬게이트의 경쇄 및 중쇄로 어셈블리된다. 발현벡터(플라스미드)에 코딩된 폴리펩타이드를 발현하기 위해 적절한 숙주세포를 선택할 수 있다. 예컨대, CHO 세포, NSO 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, K562 세포, BHK 세포 또는 PER.C6 세포를 선택할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 발현 벡터의 조절 요소는 선택되는 숙주세포에 따라 기능적으로 선택될 수 있다. 면역글로불린 컨쥬게이트의 하나 이상의 쇄를 코딩하는 발현벡터를 포함하는 숙주세포는 면역글로불린의 발현에 적합한 조건 하에 배양될 수 있다. 숙주세포로부터 발현된 면역글로불린은 기능적으로 어셈블리된다. 배지로부터 분비된 면역글로불린 컨쥬게이트를 수득한다.
본 발명의 면역글로불린 컨쥬게이트는 펩타이드의 말단에 최소 하나의 면역글로불린이 컨쥬게이션된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 상기 삭사틸린의 N-말단 또는 C-말단에 컨쥬게이션되어 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 삭사틸린은 면역글로불린의 Fc 영역이 그의 N-말단에 컨쥬게이션된 Fc-삭사틸린이다.
본 발명의 (a) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 약제학적 유효량; (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 신경염증 예방, 억제 또는 치료한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 신경염증은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 뇌색전증 또는 뇌허혈에 수반되는 신경염증이다.
본 발명의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질은 디스인테그린 활성을 갖는다.
상기 디스인테그린은 삭사틸린(saxatilin), 로도스토민(rhodostomin), 알보라브린(albolabrin), 아플라긴(applagin), 바실리신(basilicin), 바트록소스타틴(batroxostatin), 비티스타틴(bitistatin), 바부린(barbourin), 세레베린(cereberin), 세라스틴(cerastin), 크로타트록신(crotatroxin), 두리신(durissin), 에키스타틴(echistatin), 엘레간틴(elegantin), 에리스티코핀(eristicophin), 플라보리딘(flavoridin), 플라보스타틴(flavostatin), 할리신(halysin), 자라라신(jararacin), 자라스타틴(jarastatin), 자라린(jararin), 라체신(lachesin), 루토신(lutosin), 몰로신(molossin), 살모신(salmosin), 테르게미닌(tergeminin), 트리그라민(trigramin), 트리메스타틴(trimestatin), 트리무크린(trimucrin), 트리무타제(trimutase), 우슈리스타틴(ussuristatin) 및 비리딘(viridin)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질은 중성구에 존재하는 인테그린 αMβ2 과 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질은 중성구(neutrophil)에 존재하는 인테그린 αMβ2 에 대하여 1 × 10-8 내지 1 × 10-10 M의 Kd(dissociation constant) 값의 결합력을 갖는다.
본 발명의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질은 중성구에 존재하는 인테그린 αLβ2 과 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질은 중성구(neutrophil)에 존재하는 인테그린 αLβ2 에 대하여 1 × 10-8 내지 1 × 10-10 M의 Kd(dissociation constant) 값의 결합력을 갖는다.
본 발명의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질은 혈소판 및 중성구의 인테그린과 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질은 혈소판의 GPIIb/IIIa, 중성구에 존재하는 integrin αMβ2 및 αLβ2 에 대하여 결합능을 갖는다.
본 발명의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질은 종래에 혈전 용해 효과가 공지되어 있다.
본 발명의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 신경염증과 동시에 혈관이 폐색된 환자에 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경염증 예방, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 삭사틸린 및 그 유사체들의 신경염증 완화 효과를 확인함으로써, 혈전용해 효능과 함께 이중 기능을 갖는 뇌졸중 치료제 개발이 가능하게 한다.
도 1은 각각 pYK603 벡터 및 pYK602 벡터의 멀티클로닝 위치에 클로닝된 삭사틸린 유도체의 구조를 도식적으로 나타내는 도면이다. 구성성분들 간의 거리 또는 제한효소 위치들 간의 거리는 비율에 따라 표시되어 있지 않다. ‘leader’는 리더 서열; 면역글로블린 G2a 감마 체인.
도 2는 본 발명의 삭사틸린 유도체의 발현을 확인한 웨스턴 블랏팅 결과이다. 정제된 단백질의 안정성을 확인하기 위해, 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 침전물의 생성 유무를 조사하였다(레인 2 및 레인 4). 그 결과, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 매우 안정하였다(침전물이 생기지 않았음).
도 3a 및 도 3b는 각각 Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc의 정제 결과를 보여주는 도면으로, 겔-전기영동 이미지(좌측 패널) 및 전기이동그램(electropherogram; 우측 패널)이 제시된다.
도 4는 삭사틸린과 백혈구의 상호작용을 확인한 결과를 보여준다. PMA는 phorbol 12-myristate 13-acetate이고, 상기 fMLP는 N-formyl-Met-Leu-Phe이다.
도 5a 및 5b는 삭사틸린-Fc(a) 및 Fc-삭사틸린(b)의 인테그린 결합을 확인한 결과를 보여준다.
도 6은 Fc-삭사틸린의 뇌경색 완화 효과를 확인한 T2 이미지상의 뇌경색 병변을 보여준다. ‘Fc-Sax’는 Fc-삭사틸린를 의미한다.
도 7은 Fc-삭사틸린의 뇌경색 완화 효과를 모수적(왼쪽 그래프) 및 비모수적(오른쪽 그래프)으로 비교한 결과를 보여준다.
도 8은 T2 star 이미지상의 뇌출혈 병변을 보여준다.
도 9는 대조군 및 Fc-삭사틸린 투여군의 신경학적 장애를 비교한 결과를 보여준다.
도 10은 대조군 및 Fc-삭사틸린 투여군의 뇌조직 내 호중구 침투량을 분석한 결과를 보여준다(outlier 포함).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc의 제조
본 실시예에서 사용한 삭사틸린 및 Fc-삭사틸린을 제조하기 위해, 다음의 방법을 실시하였다:
재조합 삭사틸린 단백질을 발현시키기 위하여, 본 발명자들은 하기 기재된 프라이머쌍(삭사틸린-F 및 삭사틸린-R)을 이용하여 PCR을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 제한효소 sfiI(thermo scientific)으로 절단하여 pYK603 벡터 및 pYK602 벡터(에이앤알쎄라퓨틱스)에 T4 DNA 리가제(thermo scientific)를 이용하여 클로닝하여 각각 Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc 단백질 발현용 재조합 벡터를 제조하였다(도 1).
삭사틸린-F agtaggccgtgggggccgaggccggagaagaatgtgactgt
삭사틸린-R gcatggccgacgcggccaaggcatggaagggatttctgggaca
상술한 Fc-삭사틸린 또는 삭사틸린-Fc를 포함하는 재조합 벡터를 각각 292E 세포에 PEI(polyethylenimine; Polysciences)를 이용하여 트랜스펙션(transfection)시켰다. 트랜스펙션 후 세포 배양 2일 또는 5일 째에 상층액(supernatant)을 수거하여 SDS-PAGE를 실시한 후 NC 막(membrane; Millipore)으로 옮기고 2차 항체인 항-HuFc-HRP(1:2000 희석; thermo scientific)와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 NC 막을 PBS/T로 3번에 걸쳐서 세척한 후 ECL 용액으로 필름을 현상하여 웨스턴 블랏팅을 실시하였다(도 2).
트랜스펙션된 293E 세포의 배양에서 3, 5 또는 7일 째의 배양 상층액을 0.22 ㎛ 탑-필터(top-filter; Millipore)를 사용하여 여과하였다. 여과된 상층액을 500 ㎕ 단백질 A 비드(GE healthcare가 패킹되어 있는 5 ㎖ 컬럼에 로딩하여 비드와 결합시켰다. 펌프(peri-start pump; Bio-rad)를 사용하여 0.9 ㎖/분의 유속으로 4℃에서 하룻밤 동안 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS로 세척하고 0.1 M 글라이신(Glycine)-HCl을 이용하여 6개의 분획(fraction)으로 용출시켰다. 상기 용출액들은 1 M Tris(pH 9.0) 용액으로 중화(neutralization)시켰다. 이후, 단백질의 양을 정량하고 2-3개의 분획에 포함된 단백질들을 아미콘 울트라 원심분리 필터(amicon ultra centrifugal filter; Millipore)를 사용하여 농축시켰다. PBS로 10번 이상 완충액을 교환시켰다.
얻어진 단백질 농축액의 순도(purity)는 Agilent 2100 생체분석기 (Bioanalyzer)를 이용하여 분석하였다(도 3a 및 도 3b). Agilent 2100 생체분석기는 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip) 기술을 기반으로 한 분석 장비로 단백질의 크기와 농도를 동시에 자동으로 분석할 수 있는 시스템으로, 마이크로칩 안에서 샘플 처리, 분리 및 검출 전-과정을 동시에 수행하여 신뢰성 높은 데이터를 두 가지 형태(겔-전기영동 이미지 및 크로마토그래피 같은 전기이동그램(electropherogram))으로 분석결과를 확인할 수 있다.
백혈구와 삭사틸린의 상호작용
삭사틸린(recombinant saxatilin) 및 BSA(Bovine Serum Albumin)에 FITC(Fluorescein isothiocyanate)를 표지하였다. 상기 본 실시예에서 사용한 삭사틸린은 대한민국 공개특허 제2002-0064787호에 기재된 방법에 따라 분리 정제한 재조합 삭사틸린 단백질을 사용하였으며 그 아미노산 서열은 서열목록 제1서열에 나타내었다. 랫트(8주령, 수컷)로부터 채혈하여 구연산나트륨 튜브(sodium citrate tube)에 넣고, 혈액이 응고되지 않도록 혼합하였다.
상기 혈액에 FITC-표지 삭사틸린 또는 FITC-표지 BSA를 넣고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 실험군의 구성은 표 1과 같다.
1 전혈
2 전혈 + 20 ㎍/㎖ FITC-BSA
3 전혈 + 20 ㎍/㎖ FITC-삭사틸린
4 전혈 + 20 ㎍/㎖ FITC-삭사틸린 + 100 ng/㎖ PMA
5 전혈 + 20 ㎍/㎖ FITC-삭사틸린 + 1 μM fMLP
상기 PMA는 phorbol 12-myristate 13-acetate이고, 상기 fMLP는 N-formyl-Met-Leu-Phe이다.
반응 후, RBC(Red Blood Cell) 용해 완충액을 첨가하여 상온에서 15분 동안 반응시켰다. PBS(Phosphate Buffered Saline)로 3차례 세척한 후, 유세포분석기(flow cytometer)로 형광을 측정하여 백혈구와 삭사틸린의 상호작용을 확인하였다.
인테그린과 삭사틸린의 결합
96-웰 플레이트에 각 인테그린(αⅡbβ3, αvβ3, αMβ2 및 αLβ2)을 100 ng/웰씩 첨가하고, 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 후 PBS-T(0.5% Tween 20)로 3차례 세척하였다. 1% BSA(in PBS-T) 용액으로 상온에서 2시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 블로킹 후 PBS-T로 3차례 세척하였다. 삭사틸린-Fc 또는 Fc-삭사틸린을 100 nM 부터 1/4씩 연속 희석하여 8개의 샘플 용액을 제조하였다.
상기 샘플 용액을 100 ㎕씩 3 중으로 각 웰에 로딩하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS-T로 3차례 세척하였다. 항-인간 IgG(Fc) 컨쥬게이티드 HRP 항체를 1:2,000으로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS-T로 4차례 세척하였다. TMB 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, 종결 용액(stop solution, 0.5 M H2SO4)을 첨가하여 반응을 종결시키고 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여, 중성구 및 내피세포의 상호작용에 관여하는 인테그린과 삭사틸린의 결합을 확인하였다.
뇌경색 동물모델 실험
1) 동물모델
웅성의 ICR 마우스(32-34g)를 이용하여 기존에 보고된 나일론사를 이용한 중대뇌동맥 폐색 방법을 일부 변형하여 뇌의 허혈손상을 유발하였다. 실험동물은 수술 전 약 12시간 동안 물만 공급 하고, 수술 후에는 물과 사료를 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다. 마취통 안에서 마취가스[N2O와 O2를 7:3의 비율로 혼합한 가스에 아이소플루레인(isoflurane)을 5%로 함]을 흡입하게 하여 마취를 유도한 마우스의 체중을 측정하고 절개부위를 면도한 후, 안면 마스크를 통해 2% 마취가스로 마취를 유지하며 수술하였다. 수술 중 체온은 직장체온계를 직장 내로 삽입하여 연계된 자동온도조절장치와 가온 패드를 이용하여 37.0±0.5℃로 유지하였다. 마취된 마우스의 경부를 정중 절개하여 좌측 경동맥을 노출시키고 미주신경 등을 분리한 뒤, 5/0 실크봉합사를 이용해서 총경동맥을 결찰하였다. 이어서 외경동맥을 결찰하고, 내경동맥과 외경동맥의 분지들을 결찰하거나 전기소작하였다. 다음으로 혈관용 클램프를 이용하여 내경동맥을 일시적으로 결찰한 뒤, 내경동맥 기시부에 작은 창을 내고 마우스의 체중에 따라 규격화된 나일론사를 삽입하였다. 나일론사가 내경동맥 쪽으로 들어간 것을 확인하면 혈관용 클램프를 풀고 나일론사를 총경동맥 분지점으로부터 저항이 느껴질 때까지 밀어 넣어 중간대뇌동맥 폐색을 시행하였다. 폐색 후의 출혈을 막고 나일론사를 고정시키기 위해 혈관 밖에 남은 나일론사와 내경동맥을 함께 단단히 결찰하고, 실크 봉합사를 이용해서 절개된 피부를 봉합하였다. 1시간이 지나면 막아두었던 나일론사를 저항이 느껴질 때까지 잡아 뺀 후 나머지 끝부분을 가위로 절단함으로써 혈류를 회복시켜주고 23시간 후에 실험동물을 희생하였다.
2) 실험군 및 약물투여
4 ㎎/㎏ 용량의 Fc-삭사틸린을 투여하는 실험군과 매칭되는 위약을 이용한 대조군으로 하며 Fc-삭사틸린 투여군 18마리, 대조군 16마리를 사용하였다. 이는 삭사틸린을 이용한 선행연구에서 얻어진 결과를 바탕으로 통계기법을 이용하여 적절한 표본크기를 도출하고, The Data and Safety Monitoring Board의 권유를 수용하여 결정된 두수이다. 총 투여용량인 4 ㎎/㎏ Fc-삭사틸린을 중대뇌동맥 폐색 직전과 재관류 직전에 두 번으로 나누어(각 2 ㎎/㎏) 좌측 대퇴정맥을 통해 볼루스 주입하였고, 대조군은 동량의 생리식염수를 투여하였다.
3) 약물 준비 및 공급
① 약물의 준비: 실험에 관여하지 않는 연구자(A)가 무작위로 약물의 투여 순서를 정한 코드를 만들어서 실험에 관여하지 않는 다른 연구자(B)에게 제공하였다.
② 약물의 공급: 연구자(B)가 무작위 코드에 맞게 약물을 제조하여 동일한 용기에 담아 실험자에게 공급하였다.
4) 실험동물의 희생 및 조직처리
졸레틸(zoletil)과 럼푼(rompun)을 혼합하여 복강 내로 주사하여 마취한 후, 개흉을 시행하여 심장을 노출시켰다. 우심방을 절개하고 좌심실을 통해 연동펌프로 헤파린이 섞인 차가운 생리식염수를 관류해서 희생시켰다. 관류가 끝나면 단두를 한 뒤, 신속하게 두개골을 제거하고 뇌를 적출하였다. 적출한 뇌를 절단틀을 이용해 전두부에서부터 관상면으로 5개의 절편으로 자르며, 앞쪽부터 첫 번째 절편은 3 ㎜ 두께로 하고 나머지는 2 ㎜ 간격으로 잘랐다. 이렇게 얻어진 1, 3, 5번째 절편은 급속 냉동하여 -80℃ 초저온냉동고에 보관하고, 2, 4번째 절편은 4% 파라포름알데히드에 고정하여 파라핀 블록을 제작했다.
5) 뇌경색 예후 측정항목 및 측정방법
① 뇌경색 크기
중대뇌동맥폐색-재관류 22시간째에 9.4T Bruker 동물용 MRI를 이용하여 0.5 ㎜ 간격으로 촬영한 T2 이미지 상의 뇌경색 병변의 크기를 각 실험동물에 대해 아무런 정보가 없는 연구자가 측정하여 비교하였다(도 6).
② 뇌출혈 여부
중대뇌동맥폐색-재관류 22시간째에 9.4T Bruker 동물용 MRI로 0.5 ㎜ 간격으로 촬영한 T2* 이미지 상에서 각 실험동물에 대해 아무런 정보가 없는 연구자가 뇌출혈 여부를 조사하여 비교하였다(도 8).
③ 신경학적 장애
각 실험동물에 대해 아무런 정보가 없는 연구자가 신경학적 장애를 평가하였다. 뇌경색 동물모델의 신경학적 장애를 평가하는 고전적인 방법인 Longa의 측정방법으로 모든 동물의 수술 및 약물 투여 전후 아래와 같은 항목을 측정하였다.
꼬리를 잡고 거꾸로 들었을 때 우측 앞발로 책상 모서리를 잡을 수 없거나 그 힘이 미약할 때(1점), 우측 앞다리를 완전히 내전 시키는 경우(2점), 한쪽 방향으로만 도는 경우(3점), 및 지면에 내려놓고 몸통을 옆으로 부드럽게 밀 때 버티는 힘이 감소하여 쓰러지는 경우(4점)로 0점에서 4점으로 갈수록 신경학적 장애가 심각함을 나타낸다.
Fc - 삭사틸린의 항염증 기전
1) 뇌조직 내 호중구 침투량 분석
각 개체의 투여 약물에 대한 정보를 전혀 모르는 연구자가 motorized stage가 장착되어 있는 정립 광학현미경(Carl Zeiss, Germany)와 스테레오 인베스티게이터(stereo investigator, MBF bioscience, USA)를 이용하여 동측성 반구(ipsilateral hemisphere)의 뇌경색 부위 및 비-뇌경색 부위의 염색된 세포 수를 측정하고, 대측성 반구(contralateral hemisphere) 상응 부위의 세포 수를 측정하여 Fc-삭사틸린 투여군과 대조군의 뇌조직 내 면역세포 유입량을 비교하였다.
실험결과
백혈구와 삭사틸린의 상호작용
BSA를 처리한 군과 삭사틸린을 처리한 군을 비교한 결과, 삭사틸린을 처리한 군에서 그래프의 이동(shift)이 나타났으며, PMA 또는 fMLP를 함께 처리한 군이 처리하지 않은 군보다 더 많이 이동되었다. 이는 삭사틸린이 백혈구와 상호작용함을 의미한다(도 4).
인테그린과 삭사틸린의 결합
인테그린 αMβ2 및 αLβ2는 중성구에 존재하는 인테그린으로, 내피세포에 존재하는 ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule 1)과 상호작용하여 중성구가 내피세포에 모이도록 한다. ELISA를 이용한 결합 분석 결과, Fc-삭사틸린은 인테그린 αMβ2 및 αLβ2와 강하게 결합하였다(Kd, 6.9×10-9 M 및 9.2×10-9 M). 또한 Fc-삭사틸린 보다는 약하지만 삭사틸린-Fc도 인테그린 αMβ2 및 αLβ2와 결합하였다(Kd, 3.0×10-7 M 및 4.4×10-7 M)(표 2 내지 3 및 도 5).
삭사틸린-Fc αⅡbβ3 αvβ3 αMβ2 αLβ2
Kd 2.5×10-7 5.8×10-10 3.0×10-7 4.4×10-7
R2 0.9999 0.9832 0.9997 0.9982
Fc-삭사틸린 αⅡbβ3 αvβ3 αMβ2 αLβ2
Kd 6.1×10-9 4.1×10-10 6.9×10-9 9.2×10-9
R2 0.9859 0.9707 0.9879 0.9926
뇌경색 동물모델
① 뇌경색 크기
대조군(Placebo)과 비교하여 Fc-삭사틸린 투여군의 뇌경색 크기가 모수적으로 비교했을 때, 약 31%, 비모수적으로 비교했을 때 약 49% 작았다. 이는 Fc-삭사틸린이 뇌경색 크기를 감소시키는 효능이 있음을 의미한다(도 7).
② 뇌출혈 여부
- 대조군 Fc-삭사틸린 P-값
뇌내출혈(ICH) 6/10(60%) 7/11(63%) >0.9999
지주막하출혈(SAH) 2/10(20%) 2/11(18.2%) >0.9999
뇌내출혈(Intracerebral hemorrhage; ICH) 및 지주막하출혈(Subarachnoid hemorrhage; SAH), 모두 Fc-삭사틸린 투여군과 대조군 사이의 차이가 없었다(표 4).
본 실험에서 사용한 4 ㎎/㎏ Fc-삭사틸린 투여는 마우스 뇌경색 모델에서 뇌출혈을 증가시키지 않음을 의미한다.
③ 신경학적 장애
신경학적 장애의 정도는 Fc-삭사틸린 투여군 및 대조군 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다(도 9).
④ 사망률
사망한 개체 수는 Fc-삭사틸린 투여군 18마리 중 6마리, 대조군 16마리 중 4마리였으며, 이 중 Fc-삭사틸린 투여군의 4마리와 대조군의 2마리는 장시간 MRI 촬영에 의한 마취사였다. Fc-삭사틸린 투여군과 대조군의 사망률은 차이가 없었다(표 5).
- 대조군 Fc-삭사틸린 P-값
All-cause 6/16(37.5%) 6/18(33.3%) 0.800
뇌경색 4/16(25.0%) 2/18(11.1%) 0.387
⑤ Fc-삭사틸린의 항염증 기전
Fc-삭사틸린의 뇌경색 감소 효능이 항염증 효과에 기인하는 것인지 여부를 확인하기 위해, 뇌조직 내 호중구(neutrophil) 침투량을 정량 분석하였다(도 10). 대조군에 비해 Fc-삭사틸린 투여군에서 뇌경색 반구 내 호중구 침투량이 유의하게 적었다. 이로써 뇌경색 발병 시 일어나는 면역세포의 뇌조직 내 침투를 Fc-삭사틸린이 억제하여 추가적인 염증반응에 의한 이차적인 뇌손상을 방지하는 역할을 함으로써 궁극적으로 뇌경색의 크기를 감소시키는 기전을 확인하였다.
결론
삭사틸린이 중성구 표면의 인테그린에 결합하여 내피 세포와의 상호작용을 저해하므로 허혈성 손상에 의해 유도되는 신경염증을 억제할 수 있다. 또한, Fc-삭사틸린은 면역세포의 뇌조직 내 침투를 억제하여 염증반응을 억제할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation Yonsei University <120> Composition for Preventing, Inhibiting or Treating Neuroinflammation comprising Peptide or Protein having RGD motif <130> PN140080 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> Agkistrodon saxatilis emelianov <400> 1 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ala Pro Ala Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg 35 40 45 Met Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala 50 55 60 Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala 65 70

Claims (10)

  1. (a) 면역글로불린(immunoglobulin)의 Fc 영역이 컨쥬게이션(conjugation)된 서열목록 제1서열의 삭사틸린(saxatilin)의 약제학적 유효량; (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경염증 예방, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 상기 삭사틸린의 N-말단 또는 C-말단에 컨쥬게이션되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 삭사틸린은 면역글로불린의 Fc 영역이 그의 N-말단에 컨쥬게이션된 Fc-삭사틸린인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 신경염증은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 뇌색전증 또는 뇌허혈에 수반되는 신경염증인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로불린(immunoglobulin)의 Fc 영역이 컨쥬게이션(conjugation)된 서열목록 제1서열의 삭사틸린(saxatilin)은 중성구(neutrophil)에 존재하는 인테그린 αMβ2 에 대하여 1 × 10-8 내지 1 × 10-10 M의 Kd(dissociation constant) 값의 결합력을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로불린(immunoglobulin)의 Fc 영역이 컨쥬게이션(conjugation)된 서열목록 제1서열의 삭사틸린(saxatilin)은 중성구(neutrophil)에 존재하는 인테그린 αLβ2 에 대하여 1 × 10-8 내지 1 × 10-10 M의 Kd(dissociation constant) 값의 결합력을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로불린(immunoglobulin)의 Fc 영역이 컨쥬게이션(conjugation)된 서열목록 제1서열의 삭사틸린(saxatilin)은 혈소판의 GPIIb/IIIa, 중성구에 존재하는 integrin αMβ2 및 αLβ2 에 대하여 결합능을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 혈전에 의해 혈관이 폐색된 환자에 투여되는 용도를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
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