ES2575517T3 - Péptidos de unión a FGF2 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un péptido de unión a FGF2 de fórmula I:**Fórmula** R1-Ala-X1-Pro-X2-Ala-R2 (I) donde: X1 es un aminoácido seleccionado entre Arg y Lys; X2 es un aminoácido seleccionado entre Cys y Thr; R1 está ausente o consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3; R2 está ausente o consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, con las siguientes condiciones: cuando R1 está presente, también R2 está ausente; cuando R1 es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, R2 es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; cuando R1 es la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, R2 es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Description

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DESCRIPCION

Peptidos de union a FGF2 y usos de los mismos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a peptidos de union a Factor de Crecimiento de Fibroblasto 2 (FGF2), capaces de unirse a FGF2 para inhibir su actividad pro-angiogenica in vitro e in vivo sin un impacto anticipado en la inmunidad innata.

Antecedentes de la invencion

Las pentraxinas son una superfamilia de protemas que se caracterizan por una estructura pentamerica1. Las clasicas pentraxinas cortas protema C-reactiva (CRP) y componente P amiloide de suero (SAP) son protemas de fase aguda en el hombre y el raton, respectivamente, producidas en el tugado en respuesta a mediadores inflamatorios2,3. Las pentraxinas se unen a diversos ligandos y estan implicadas en la resistencia innata a microbios y la recuperacion de residuos celulares y componentes de la matriz extracelular1,4'6

Las pentraxinas largas se caracterizan por un dominio N-terminal no relacionado acoplado a un domino 7 C-terminal de tipo pentraxina. La pentraxina larga prototfpica PTX38,9 es una protema glicosilada de 45 kD estructurada predominantemente en multimeros de 10-20 unidades10 La PTX3 se produce localmente y es liberada por diferentes tipos de celulas, en particular por fagocitos mononucleares, celulas dendnticas y celulas endoteliales, en respuesta a senales inflamatorias primarias11. Estudios en ratones ptx3-1- han demostrado que esta molecula desempena funciones no redundantes complejas in vivo, que van desde la constitucion de una matriz extracelular rica en acido hialuronica, hasta la fertilidad femenina y la inmunidad innata contra diversos microorganismos12,13 Esto esta relacionado, al menos en parte, con la capacidad de la PTX3 para unirse con una elevada afinidad al componente de complemento C1 q, la protema de matriz extracelular TSG6 y el microorganismo seleccionado, activando la activacion de complemento y facilitando el reconocimiento de patogeno por parte de los macrofagos y de las celulas dendnticas1,14 Por tanto, la PTX3 es un receptor de reconocimiento de patron soluble con funciones no redundantes unicas en varias afecciones patofisiologicas1,14.

El factor de crecimiento de fibroblasto 2 (FGF2) es un factor de crecimiento de union a heparina que induce la proliferacion celular, la quimiotaxis y la produccion de proteasa en celulas endoteliales cultivadas mediante la interaccion con receptores de tirosina-quinasa de alta afinidad (FGFRs)15. El FGF2 induce angiogenesis in vivo y modula la neovascularizacion durante la curacion de heridas, la inflamacion, la aterosclerosis y el crecimiento tumoral16. Varias moleculas secuestran FGF2 en el entorno extracelular, evitando de este modo su interaccion con FGFRs de celula endotelial e inhibiendo su actividad angiogenica (revisado en 16). Muchos de estos inhibidores se producen/liberan local y/o sistemicamente, soportando asf el complejo ajuste del proceso de angiogenesis.

La PTX3 larga se une a FGF2 con una elevada afinidad y especificidad. Por consiguiente, la PTX3 larga inhibe la proliferacion de celulas endoteliales dependientes de FGF2 in vitro y la angiogenesis in vivo17. Asimismo, la PTX3 entera inhibe la activacion de celulas de musculo liso dependientes de FGF2 y el espesamiento mtimo tras lesion arterial18. Por tanto, la PTX3 puede contribuir potencialmente a la modulacion de la actividad de FGF2 en diferentes situaciones patologicas caracterizadas por la co-expresion de las dos protemas, que incluyen inflamacion, curacion de heridas, aterosclerosis y neoplasia. Sin embargo, no se describe ningun uso terapeutico de la protema dada la imposibilidad de utilizar dicha molecula grande y a otras actividades de la protema. De hecho, la PTX3 se une a C1q a traves del dominio de pentraxina C-terminal10.

Actualmente, no se han asignado funciones biologicas al extremo N de la PTX3. En base a esto, los autores han investigado la capacidad del extremo N para interaccionar con FGF2.

Descripcion de la invencion

Se ha descubierto que celulas endoteliales retrovirales transducidas que sobre-expresan el fragmento N-terminal de la PTX3 (1-178) muestran una actividad mitogenica reducida en respuesta a FGF2. La PTX3(1-178) purificada recombinante se une a FGF2 y evita la interaccion PTX3/FGF2. Asimismo, el anticuerpo monoclonal mAb-MNB4, que reconoce el epttopo PTX3(87-99), evita la interaccion FGF2/PTX3 y elimina la actividad de antagonista de FGF2 de la PTX3. Sorprendentemente, los autores han descubierto que los peptidos muy cortos retienen dicha actividad y son utiles como farmacos terapeuticos. Consistentemente, los peptidos sinteticos PTX3(82-110), PTX3(97-110), PTX3(97-107) y PTX3 (100-104) se unen a FGF2 e inhiben la interaccion de FGF2 con PTX3 larga entera inmovilizada en un chip sensor BIAcore, la proliferacion de celulas endoteliales dependientes de FGF2 y la angiogenesis in vivo. Por tanto, los datos permiten identificar un dominio de union a FGF2 muy corto en la extension N-terminal de la PTX3 que se extiende en la region PTX3(97-110). Los peptidos sinteticos relacionados con esta secuencia son capaces de unirse a FGF2 y de inhibir su actividad pro-angiogenica in vitro e in vivo sin ningun impacto anticipado en la inmunidad innata.

El principal objetivo de la presente invencion es, por tanto, un peptido de union a FGF2 de formula I:

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Ri-Ala-Xi-Pro-X2-Ala-R2 (I)

donde:

X1 es un aminoacido seleccionado entre Arg y Lys;

X2 es un aminoacido seleccionado entre Cys y Thr;

R1 esta ausente o consiste en la secuencia de aminoacidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3;

R2 esta ausente o consiste en la secuencia de aminoacidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, con las siguientes condiciones:

cuando R1 esta presente, tambien R2 esta ausente; cuando R1 es la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, R2 es la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2; cuando R1 es la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3, R2 es una secuencia de aminoacidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4; o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.

Preferiblemente, X1 es Arg. Mas preferiblemente X2 es Cys. Incluso mas preferiblemente, el peptido consiste en la secuencia de aminoacidos seleccionada entre la SEQ ID No: 5, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID No: 7 y la SEQ ID NO: 10.

El termino "peptido" se aplica ordinariamente a una cadena polipeptidica que contiene entre 4 y 100 0 mas aminoacidos contiguos, normalmente entre 5 y 20 aminoacidos contiguos. El termino "funcional" define un peptido que presenta propiedades de union a FGF2 capaces de reducir enormemente la actividad biologica de fGf2. La actividad biologica de FGF2 incluye efectos mitogenicos y angiogenicos. En particular, los peptidos de la invencion son capaces de inhibir la proliferacion inducida por FGF2 de celulas endoteliales o celulas de musculo liso.

Los "precursores" son compuestos que pueden convertirse en los compuestos de la presente invencion mediante un procesado metabolico y enzimatico antes o despues de la administracion a las celulas o al cuerpo.

El termino "sales" en la presente memoria se refiere tanto a sales de grupos carboxilo como a sales de adicion acida de los grupos amino de los peptidos, polipeptidos, o analogos de los mismos, de la presente invencion. Las sales de un grupo carboxilo pueden formarse mediante los medios conocidos en la tecnica e incluyen las sales inorganicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, ferricas o de zinc, y otras similares, y las sales con bases organicas como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procama y similares. Las sales de adicion acida incluyen, por ejemplo, sales con acidos minerales tales como, por ejemplo, acido clortudrico o acido sulfurico, y sales con acidos organicos tales como, por ejemplo, acido acetico o acido oxalico. Cualquiera de dichas sales debena tener una actividad sustancialmente similar a la de los peptidos y polipeptidos de la invencion o sus analogos.

El termino "derivados" tal como se usa en la presente memoria se refiere a derivados que pueden prepararse a partir de grupos funcionales presentes en las cadenas laterales de los restos de aminoacido o en los grupos N-/ o C- terminales, segun metodos conocidos. Dichos derivados incluyen por ejemplo esteres o amidas alifaticas de los grupos carboxilo y derivados de N-acilo de grupos amino libre o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres, y estan formados con grupos acilo como por ejemplo grupos alcanoilo o aroilo. La presente invencion tambien incluye peptidomimeticos de los peptidos ya descritos, en los que la naturaleza de los peptidos ha sido modificada qmmicamente al nivel de cadenas laterales de aminoacido, quiralidad de aminoacidos, y/o cadena principal de peptidos. Estas alteraciones estan dirigidas a proporcionar agentes de union a FGF2 que tengan propiedades terapeuticas, diagnosticas y/o farmacocineticas similares (si no mejoradas).

Por ejemplo, cuando el peptido es propenso a ruptura mediante peptidasas tras inyeccion al sujeto, la sustitucion de un enlace peptfdico particularmente sensible con un mimetico de peptido no rompible puede proporcionar un peptido mas estable y, por tanto, mas funcional como agente terapeutico. De forma similar, la sustitucion de un residuo de L- aminoacido es un modo estandar para hacer al peptido menos sensible a la proteolisis, y finalmente mas similar a compuestos organicos diferentes a los peptidos. Tambien son utiles los grupos bloqueantes amino-terminales tales como t-butiloxicarbonilo, acetilo, succinilo, metoxisuccinilo, suberilo, adipilo, azelailo, dansilo, benciloxicarbonilo, fluorenilmetoxicarbonilo, metoxiazelailo, metoxiadipilo, metoxisuberilo y 2,4,-dinitrofenilo. En la tecnica se conocen muchas otras modificaciones que proporcionan una mayor eficacia, una actividad prolongada, facilidad de purificacion y/o una mayor vida media.

Las propiedades de los peptidos de la invencion pueden mantenerse, o incluso potenciarse, en peptidos mutantes. Los peptidos mutantes incluyen secuencias de aminoacidos en donde uno o mas residuos de aminoacido han sido sustituidos de forma conservativa, siempre que presenten la misma actividad biologica que caracteriza a la presente invencion en niveles equivalentes o superiores, segun se determina mediante los medios conocidos en la tecnica o descritos en los Ejemplos incluidos a continuacion.

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De acuerdo con la presente invencion, los cambios preferidos en los peptidos mutantes son conocidos comunmente como sustituciones "conservativas" o "seguras". Las sustituciones de aminoacidos conservativas son aquellas con aminoacidos que tienen propiedades qmmicas suficientemente similares, con el objetivo de preservar la estructura y la funcion biologica de la molecula. La bibliograffa proporciona muchos modelos sobre los cuales se puede realizar la seleccion de sustituciones de aminoacidos conservativas en base a estudios estadfsticos y ffsico-qmmicos sobre la secuencia y/o la estructura de la protema natural.

Los peptidos mutantes pueden resultar de una tecnica de mutagenesis sito-dirigida convencional del ADN codificador, de tecnologfas combinatorias a nivel de secuencia de ADN codificadora (tales como barajado de ADN, presentacion/seleccion de fago) o de aminoacidos, de estudios de diseno asistido por ordenador, o mediante cualquier otra tecnica conocida adecuada, que dan lugar a un conjunto finito de peptidos mutados sustancialmente correspondientes que pueden obtenerse de forma rutinaria y ser evaluados por un especialista en la tecnica usando las ensenanzas presentadas en la tecnica anterior y en los Ejemplos de la presente descripcion.

Los peptidos de union a FGF2 que son peptidos de fusion y/o quimericos comprenden la secuencia de aminoacidos del peptido de Formula (I) o cualquiera de sus mutantes/derivados tal como se han definido anteriormente, y una secuencia de aminoacidos que pertenece a una secuencia protemica diferente a PTX3, proporcionando propiedades adicionales sin perjudicar considerablemente a la actividad de union a FGF2. Se pueden elegir otras secuencias protemicas adicionales que pueden ser comprendidas en protemas de fusion y/o quimericas entre secuencias ligadas a membrana, regiones extracelulares de protemas ligadas a membrana, regiones constantes de inmunoglobulina, dominios de multimerizacion, protemas extracelulares, protemas que contienen peptido senal, protemas que contienen senal de exportacion.

Las propiedades adicionales presentadas por los polipeptidos o peptidos de fusion y/o quimericos son una capacidad de purificacion mas sencilla, una mayor vida media en fluidos corporales, o la localizacion extracelular. Esta ultima caractenstica es de particular importancia para definir un grupo espedfico de protemas de fusion o quimericas incluido en la anterior definicion, ya que permite que los peptidos de la invencion sean localizados en el espacio, donde no solo se facilita el aislamiento y la purificacion de dichos peptidos, sino tambien donde PTX3 y FGF2 interaccionan de forma natural.

La eleccion de una o mas de las secuencias que va a ser fusionada al peptido de union a FGF2 depende del uso espedfico de dicho peptido.

Como procedimiento general, las protemas de fusion pueden producirse generando segmentos de acido nucleico que las codifiquen, usando tecnicas de ingeniena genetica habituales, y clonando en un vector replicable de origen plasmido o vmco que se usa para modificar una celula hospedante Procariotica o Eucariotica, usando vectores episomales o no-/ integrados homologamente, asf como tecnologfas basadas en transformacion, infeccion o transfeccion. Estos vectores debenan permitir la expresion de la protema de fusion que incluye el agente de union a FGF2 en la celula hospedante procariotica o eucariotica bajo el control de sus propias secuencias reguladoras transcripcionales de inicio/terminacion, que se eligen para ser constitutivamente activas o inducibles en dicha celula. A continuacion se puede aislar una lmea celular para proporcionar una lmea celular estable. En particular, siempre que las celulas modificadas para expresar agentes de union a FGF2 de la invencion son usadas o administradas directamente, las celulas preferidas son celulas humanas, que normalmente expresan PTX3. Cuando la secuencia protemica adicional, como en el caso de la secuencia de protemas extracelulares, de exportacion de senal o que contienen peptido senal, permite que el dominio de union a FGF2 sea secretado en el espacio extracelular, el agente puede ser recolectado y purificado mas facilmente a partir de las celulas cultivadas con vistas a un procesamiento adicional o, alternativamente, las celulas se pueden usar o administrar directamente.

Cuando la protema adicional, como en el caso de la secuencia de protemas ligadas a membrana, permite la inmovilizacion del agente de union a FGF2 sobre la superficie de la celula, el agente puede recolectarse y purificarse menos facilmente a partir de las celulas cultivadas con vistas a un procesamiento adicional, pero las celulas pueden usarse o administrarse directamente proporcionando el agente una forma correspondiente a la de la PTX3 natural, posiblemente mejorando sus propiedades.

Los peptidos de union a FGF2 de la invencion se pueden identificar tambien mediante los metodos de diseno de farmacos asistido por ordenador, que hacen uso de la estructura y/o la secuencia de los peptidos de la invencion, o los correspondientes mutantes activos tal como se ha definido anteriormente. Los peptidos de la invencion pueden usarse para estudiar la interaccion entre PTX3 y FGF2 con una mayor eficacia usando tecnologfas de modelado por ordenador. Dicho analisis asistido por ordenador puede aprovecharse para desarrollar farmacos mimeticos de peptidos o no de peptidos en la forma de moleculas organicas o peptidos sinteticos (por ejemplo, de 4-20 aminoacidos de longitud). Una vez que estos compuestos han sido escrutados y se ha observado que son capaces de unirse a FGF2, a continuacion se evaluara su uso en celulas o en modelos de animales.

Los polipeptidos de la invencion pueden estar en la forma de conjugados o complejos activos con un resto heterologo, que puede seleccionarse entre agentes citotoxicos, marcas (p.ej., biotina, etiquetas fluorescentes), farmacos u otros agentes terapeuticos, ligados covalentemente o no, tanto directamente como a traves del uso de agentes de acoplamiento o ligandos. Los conjugados o complejos utiles se pueden generar usando moleculas y

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metodos conocidos en la tecnica (marcas radioactivas o fluorescentes, biotina, agentes citotoxicos, farmacos u otros agentes terapeuticos). Los agentes citotoxicos incluyen agentes quimioterapeuticos, toxinas (p.ej., una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isotopo radioactivo (es decir, un radioconjugado). Las toxinas enzimaticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no de union de la toxina de la difteria, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa- sarcina, protemas de Aleurites fordii, protemas de diantina, protemas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAPS), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Se dispone de una variedad de radionucleidos para la

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produccion de protemas radioconjugadas. Los ejemplos incluyen Bi, I, In, Y y Re.

Tambien se pueden generar conjugados o complejos utiles para mejorar los agentes en terminos de eficacia de administracion. Para este proposito, los peptidos de la invencion pueden estar en la forma de conjugados o complejos activos con moleculas tales como polietilen glicol y otros polfmeros naturales o sinteticos (Harris JM y Chess RB, Nat Rev Drug Discov. (2003), 2(3): 214-21; Greenwald RB et al., Adv Drug Deliv Rev. (2003), 55(2): 21750; Pillai O y Panchagnula R, Curr Opin Chem Biol. (2001), 5(4): 447-51). A este respecto, la presente invencion contempla peptidos modificados qmmicamente como se describe en la presente memoria, en los que el peptido esta ligado a un polfmero. Tfpicamente, el polfmero es soluble en agua de tal modo que el conjugado no precipita en un medio acuoso, tal como un medio fisiologico. Los conjugados usados para terapia pueden comprender restos polimericos solubles en agua farmaceuticamente aceptables. Los polfmeros solubles en agua incluyen polietilen glicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-alcoxi-(C1-C10)-PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinil pirrolidona) PEG, tresil monometoxi PEG, PEG propionaldehndo, bis-succinimidil carbonato PEG, homopolfmeros de propilen glicol, un co- polfmero de polioxido de propileno/oxido de etileno, polioles polioxietilados (p.ej., glicerol), polivinil alcohol, dextrano, celulosa u otros polfmeros basados en carbohidratos. El PEG adecuado puede tener un peso molecular entre aproximadamente 600 y aproximadamente 60.000, que incluye, por ejemplo, 5.000, 12.000, 20.000 y 25.000. Un conjugado tambien puede comprender una mezcla de dichos polfmeros solubles en agua.

Los ejemplos de conjugados comprenden los peptidos de la invencion y un resto de oxido de polialcilo unido al extremo N de dicho resto de polipeptido. El PEG es un oxido de polialquilo adecuado. A modo ilustrativo, los peptidos de la presente invencion pueden ser modificados con PEG, un proceso conocido como "PEGilacion". LA PEGilacion se puede llevar a cabo mediante cualquiera de las reacciones de PEGilacion conocidas en la tecnica. Por ejemplo, la PEGilacion se puede llevar a cabo mediante una reaccion de acilacion o mediante una reaccion de alquilacion con una molecula de polietilen glicol reactiva. En una estrategia alternativa, los conjugados se forman condensando PEG activado, en el que un grupo hidroxi o amino terminal del PEG ha sido reemplazado por un ligando activado.

Otro objetivo de la invencion esta representado por un acido nucleico que codifica los peptidos de union a FGF2 de la invencion, acidos nucleicos que se hibridan con el anterior acido nucleico, o que incluyen una secuencia degenerada del mismo. La invencion tambien incluye vectores de expresion de origen vmco o plasmido que permiten la expresion del acido nucleico de la invencion y de celulas hospedantes procarioticas o eucarioticas transformadas con dichos vectores y lmeas celulares estables derivadas de las mimas, que expresan el agente de union a FGF2, que puede ser secretado o expresado sobre la superficie de la membrana. Los ejemplos son celulas B humanas.

Los peptidos de union a FGF2 de la invencion se pueden producir mediante un metodo en el que las celulas hospedantes descritas anteriormente son cultivadas en un medio de cultivo apropiado y se recolecta el agente de union a FGF2.

La secuencia de ADN que codifica para los peptidos de la invencion puede insertarse y ligarse en un vector adecuado. Una vez formado, el vector de expresion se introduce en una celula hospedante adecuada, que a continuacion expresa el peptido.

La expresion de cualquiera de los peptidos recombinantes de la invencion como se ha mencionado en la presente memoria puede efectuarse en celulas eucarioticas (p.ej., levaduras, celulas de insecto o de marnffero) o en celulas procarioticas, usando los vectores de expresion apropiados. Se puede emplear cualquier metodo conocido en la tecnica.

A fin de ser capaz de expresar la protema deseada, un vector de expresion tambien debena comprender secuencias de nucleotido espedficas que contengan informacion reguladora transcripcional y traduccional ligada al ADN que codifica la protema deseada, de tal modo que permita la expresion genica y la produccion de la protema. En primer lugar, para que el gen sea transcrito, debe estar precedido de un promotor reconocible por ARN polimerasa, al cual se une la polimerasa e inicia asf el proceso de transcripcion.

Existe una variedad de tales promotores en uso, que actuan con diferentes eficacias (promotores fuertes y debiles).

Para los hospedantes eucarioticos, se pueden emplear diferentes secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales, dependiendo de la naturaleza del hospedante. Pueden derivar de fuentes vmcas, tales como

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adenovirus, virus de papiloma bovino, virus de Simio o similares, donde las senales reguladoras estan asociadas a un gen particular que tiene un nivel elevado de expresion. Los ejemplos son el promotor TK del virus del Herpes, el promotor temprano SV40, el promotor de gen gal4 de levadura, etc. Se pueden seleccionar senales reguladoras de inicio transcripcional que permitan la represion y la activacion, de tal modo que se pueda modular la expresion de los genes.

La molecula de ADN que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica para la protema de la invencion se inserta en el(los) vector(es), que tiene(n) senales reguladoras transcripcionales y traduccionales ligadas operativamente, que es(son) capaz(capaces) de integrar las secuencias genicas deseadas en la celula hospedante.

Las celulas que han sido transformadas de forma estable por el ADN introducido pueden seleccionarse tambien introduciendo uno o mas marcadores que permitan la seleccion de celulas hospedantes que contienen el vector de expresion. El marcador tambien puede proporcionar fototrofia a un hospedante auxotropico, resistencia a biocidas, p.ej. inhibidores, o a metales pesados tales como cobre, o similares. El gen marcador seleccionable puede estar ligado directamente a las secuencias genicas de ADN a expresar, o pueden introducirse en la misma celula mediante co-transfeccion.

Elementos adicionales de los vectores tambien pueden ser utiles para obtener una produccion optima de protemas de la invencion, en particular para seleccionar una celula particular que contenga plasmido o vector vmco; la facilidad con la que las celulas receptoras, que contienen el vector, pueden ser reconocidas y seleccionadas entre las celulas receptoras que no contienen el vector; el numero de copias del vector que se desea en un hospedante particular; y si es deseable ser capaz de "transportar" el vector entre celulas hospedantes de especies diferentes.

Una vez que el(los) vector(es) o la secuencia de ADN que contiene la(s) construccion(es) han sido preparados para expresion, la(s) construccion(es) de ADN puede(n) introducirse en una celula hospedante apropiada mediante cualquiera de una serie de medios adecuados: transformacion, transfeccion, conjugacion, fusion de protoplasto, electroporacion, precipitacion de fosfato calcico, microinyeccion directa, etc.

Las celulas hospedantes pueden ser procarioticas o eucarioticas. Se prefieren los hospedantes eucarioticos, p.ej. celulas de mairnfero, tales como celulas humanas, de mono, de raton y de Ovario de Hamster Chino (CHO), debido a que proporcionan modificaciones post-traduccionales a las moleculas protemicas, que incluyen un plegamiento correcto o una glicosilacion en los sitios correctos. Tambien las celulas de levadura pueden llevar a cabo modificaciones post-traduccionales de peptidos que incluyen la glicosilacion. Existe una serie de estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes y un elevado numero de copias de plasmidos que pueden utilizarse para la produccion de las protemas deseadas en levaduras. Las levaduras reconocen secuencias ifder en productos genicos de marnffero clonados y secretan peptidos que portan secuencias lfder (es decir, pre-peptidos).

Tras la introduccion de el(los) vector(es), las celulas hospedantes se cultivan en un medio selectivo, que selecciona para el crecimiento de celulas que contienen vector. La expresion de la(s) secuencia(s) genica(s) clonada(s) da como resultado la produccion de muchas protemas deseadas.

Muchos libros y artmulos de revision proporcionan informacion sobre como clonar y producir protemas recombinantes con vectores y celulas hospedantes Procarioticas o Eucarioticas, tales como algunos tftulos de la serie "A Practical Approach" publicada por Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999;"Protein Purification Techniques", 2001).

Los ejemplos de tecnologfas de smtesis qmmica, que estan mas indicados para producir el agente de union a FGF2 de la invencion cuando se encuentra en la forma de peptido o de mimetico de peptido, son la smtesis en fase solida y la smtesis en fase lfquida. Como smtesis en fase solida, por ejemplo, el aminoacido correspondiente al extremo C del peptido que va a sintetizarse es ligado a un soporte que es insoluble en disolventes organicos, y mediante una repeticion alternativa de reacciones, una en la que los aminoacidos con sus grupos amino y grupos funcionales de cadena lateral protegidos son condensados uno a uno por orden desde el extremo C hasta el extremo N, y una en la que los aminoacidos ligados a la resina o el grupo protector de los grupos amino de los peptidos son liberados, se extiende de esta manera la cadena peptfdica.

Los metodos de smtesis en fase solida se clasifican de forma general en el metodo tBoc y el metodo Fmoc, dependiendo del tipo de grupo protector usado. Los grupos protectores usados tfpicamente incluyen tBoc (t- butoxicarbonilo), Cl-Z (2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z (2-bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc (9- fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo), Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y Cl2-Bzl (2,6-diclorobencilo) para los grupos amino; NO2 (nitro) y Pmc (2,2,5,7,8- pentametilcromano-6-sulfonilo) para los grupos guanidino); y tBu (t-butilo) para los grupos hidroxilo). Tras la smtesis del peptido deseado, este es sometido a la reaccion de desproteccion y separado del soporte solido. Dicha reaccion de separacion del peptido del soporte se puede llevar a cabo con fluoruro de hidrogeno o con acido tri-fluorometano sulfonico para el metodo Boc, y con TFA para el metodo Fmoc.

Los agentes de union a FGF2 obtenidos mediante tecnologfas de ADN recombinante o de smtesis qmmica finalmente son sometidos a una o mas etapas de purificacion. La purificacion se puede llevar a cabo mediante uno cualquiera de los metodos conocidos para este fin, es decir, cualquier procedimiento convencional que implique

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extraccion, precipitacion, cromatograffa, electroforesis o similares. Por ejemplo, se puede usar HPLC (cromatograffa Ifquida de alta resolucion). La elucion se puede llevar a cabo usando un disolvente basado en agua-acetonitrilo empleado comunmente para la purificacion de protemas. La invencion incluye preparaciones purificadas de los agentes de union a FGF2 de la invencion. Las preparaciones purificadas, tal como se usan en la presente memoria, se refieren a las preparaciones que tienen al menos un 1%, preferiblemente al menos un 5%, en peso seco de los compuestos de la invencion.

Los compuestos de la invencion descritos anteriormente (protemas, peptidos) se pueden usar como medicamento. Preferiblemente como un agente anti-enfermedad producida por una angiogenesis alterada. Mas preferiblemente, la angiogenesis alterada es provocada por una activacion alterada del factor de crecimiento FGF2. Incluso mas preferiblemente la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad artntica, metastasis tumoral, retinoparta diabetica, soriasis, inflamacion cronica, arteriosclerosis o tumor. Preferiblemente, el tumor se selecciona del grupo de: sarcoma, carcinoma, carcinoide, tumor oseo o tumor neuroendocrino.

Los compuestos de la invencion descritos anteriormente (protemas, peptidos) pueden usarse como agentes anti- enfermedad asociados a la proliferacion no controlada dependiente de FGF2 de fibroblastos o celulas de musculo liso, cicatrizacion ligada a una respuesta fibroblastica excesiva, y restenosis tras angioplastia.

De hecho, los peptidos de union a FGF2 de la invencion, una vez ligados a FGF2, actuan como inhibidores de FGF2. Efectivamente, los peptidos son capaces de inhibir la proliferacion inducida por FGF2 de celulas endoteliales o de celulas de musculo liso. Por lo tanto, el potencial terapeutico de dicha molecula es la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades en los que la inhibicion de FGF2 es beneficiosa. Este ultimo efecto tambien se puede usar para reducir la poblacion de celulas que expresan FGF2.

Los peptidos de union a FGF2 de la invencion se pueden usar como ingredientes activos en composiciones farmaceuticas para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades producidas por una angiogenesis alterada, en las que la angiogenesis alterada es provocada por una activacion alterada de FGF2. Los ejemplos de dichas enfermedades son: enfermedad artntica, metastasis tumoral, retinoparta diabetica, soriasis, inflamacion cronica, arteriosclerosis o tumor, en donde tumor es, por ejemplo, sarcoma, carcinoma, carcinoide, tumor oseo o tumor neuroendocrino.

Los agentes de union a FGF2 de la invencion tambien pueden usarse como ingredientes activos en composiciones farmaceuticas para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades asociadas a la proliferacion no controlada dependiente de FGF2 de fibroblastos o celulas de musculo liso, tal como cicatrizacion ligada a una respuesta fibroblastica excesiva, y la restenosis tras angioplastia.

La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del peptido de formula I y diluyentes y/o excipientes y/o adyuvantes adecuados. La composicion farmaceutica puede ser util para la profilaxis y/o el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente. Estas composiciones farmaceuticas pueden formularse en combinacion con vetuculos, excipientes, estabilizantes o diluyentes farmaceuticamente aceptables. Dependiendo de las propiedades del agente, la composicion farmaceutica puede ser util para enfermedades relacionadas con celulas T CD4+ tales como enfermedades autoinmunes, inflamaciones o infecciones.

Las composiciones farmaceuticas que comprenden los peptidos de union a FGF2 de la presente invencion incluyen todas las composiciones en las que dicho compuesto esta contenido en una cantidad terapeuticamente efectiva, es decir, una cantidad efectiva para alcanzar el resultado medicamente deseable en el animal tratado. Las composiciones farmaceuticas pueden contener vetuculos farmaceuticamente aceptables adecuados, vetuculos biologicamente compatibles adecuados para administracion a un animal (por ejemplo, salino fisiologico) y que eventualmente comprenden agentes auxiliares (como excipientes, estabilizantes o diluyentes) que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmaceuticamente.

Las composiciones farmaceuticas pueden formularse en cualquier modo aceptable para satisfacer las necesidades del modo de administracion. En bibliograrta se describe el uso de biomateriales y otros polfmeros para administracion de farmacos, asf como las diferentes tecnicas y modelos para validar un modo espedfico de administracion. Tambien senan utiles modificaciones de los compuestos de la invencion para mejorar la penetracion de la barrera hematoencefalica.

Se puede usar cualquier modo de administracion aceptado y puede ser determinado por los especialistas en la tecnica. Por ejemplo, la administracion puede ser a traves de varias rutas parenterales tales como las rutas subcutanea, intravenosa, intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdermica, oral o bucal. La administracion parenteral puede ser mediante inyeccion de bolo o mediante perfusion gradual con el tiempo. Las preparaciones para la administracion parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones esteriles acuosas o no acuosas, que pueden contener agentes auxiliares o excipientes conocidos en la tecnica, y pueden prepararse de acuerdo a metodos rutinarios. Adicionalmente, se puede administrar la suspension de los compuestos activos, en forma de suspensiones de inyeccion oleaginosa apropiadas. Los disolventes o vetuculos lipofflicos adecuados

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incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sesamo, o esteres de acidos grasos sinteticos, por ejemplo, aceite de sesamo, o esteres de acidos grasos sinteticos, por ejemplo, etiloleato o trigliceridos.

Las suspensiones de inyeccion acuosa que pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspension incluyen, por ejemplo, carboximetil celulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizantes. Las composiciones farmaceuticas incluyen disoluciones adecuadas para la administracion por inyeccion, y contienen entre 0,01 y 99 por ciento, preferiblemente entre aproximadamente 20 y 75 por ciento de compuesto activo junto con el excipiente. Las composiciones que pueden administrarse rectalmente incluyen supositorios.

Se entiende que la dosis administrada dependera de la edad, sexo, salud y peso del receptor, del tipo de tratamiento concurrente, si existe, de la frecuencia del tratamiento, y de la naturaleza del efecto deseado. La dosis se ajustara para el sujeto individual, como pueden entender y determinar los especialistas en la tecnica. La dosis total requerida para cada tratamiento puede administrarse como multiples dosis o en una unica dosis. La composicion farmaceutica de la presente invencion puede administrarse sola o en combinacion con otros compuestos terapeuticos dirigidos a la afeccion, o dirigidos a otros smtomas de la afeccion. Normalmente, una dosis diaria de ingrediente activo esta comprendida entre 0,01 y 100 miligramos por kilogramo de peso corporal.

Los compuestos de la presente invencion pueden administrarse al paciente intravenosamente en un vehmulo farmaceutico aceptable tal como salino fisiologico.

Se pueden usar metodos estandar para la administracion intracelular de peptidos, p.ej. administracion con liposomas. Dichos metodos son bien conocidos para los especialistas en la tecnica. Las formulaciones de esta invencion son utiles para la administracion parenteral, tal como intravenosa, subcutanea, intramuscular e intraperitoneal.

Como es bien conocido en las artes medicas, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, que incluyen el tamano del paciente, el area superficial del cuerpo, la edad, el compuesto particular que va a administrarse, el sexo, el tiempo y la ruta de administracion, la salud general, y otros farmacos que esten administrando concurrentemente.

Una vez entendidas las caractensticas de los metodos y productos descritos en la presente memoria, la necesidad y el tipo de etapas adicionales pueden deducirse facilmente revisando la tecnica anterior, asf como las siguientes figuras y ejemplos no limitativos que describen los detalles basicos y algunas aplicaciones de la invencion.

Descripcion de las Figuras

Figura 1. Inhibicion de la actividad mitogenica de FGF2 por Nterm-PTX3 transducida por retrovirus. (A) Analisis de transferencia western blot del medio acondicionado de celulas endoteliales aorticas de raton (MAE) infectadas con retrovirus de EGFP, PTX3 humana de longitud completa, sCterm-PTX3, o Nterm-PTX3. Las dos bandas inmunorreactivas presentes en la calle de la sCterm-PTX3 corresponden a la forma glicosilada y no glicosilada de la protema recombinante10. (B) Las celulas MAE infectadas por retrovirus fueron estimuladas con FGF2 (0,55 nM). Tras 48 h, las celulas fueron tripsinizadas y sometidas a recuento. Los datos se expresan como porcentaje de la proliferacion observada en celulas tratadas con FGF2 infectadas falsas (0,8 duplicados de poblacion celular). (C) Las celulas GM7373 fueron incubadas con el medio acondicionado a partir de celulas MAE infectadas y se trataron inmediatamente con FGF2 0,5 nM. Tras 24 h, las celulas fueron tripsinizadas y sometidas a recuento. Los datos estan expresados como porcentaje de la proliferacion observada en celulas GM7373 incubadas en medio fresco mas FGF2 (1,0 duplicados de poblacion celular). En B y C, los datos son la media ± SD de 3 experimentos independientes por triplicado.

Figura 2. Inhibicion de la interaccion FGF2/PTX3 por Nterm-PTX3 recombinante. (A) Se expresaron Nterm-PTX3 y Cterm-PTX3 marcadas con 6xHis y se purificaron a partir de celulas de E. coli transformadas (la figura interior muestra la tincion con plata de un gel de SDS-PAGE cargado con las protemas purificadas). A continuacion, se incubaron pocillos recubiertos con FGF2 con PTX3 de longitud completa, Nterm-PTX3 o Cterm-PTX3 (todas a 44 nM) durante 30 minutos a 37°C. La cantidad relativa de protema ligada a FGF2 inmovilizado fue inmunodetectada mediante incubacion con un anticuerpo anti-PTX3 policlonal de conejo, como se describe en Materiales y Metodos. (B) Se incubaron pocillos recubiertos de FGF2 con PTX3 biotinilada (bPTX3, 22 nM) en ausencia o en presencia de un exceso molar 10 a 1 de PTX3 de longitud completa, Nterm-PTX3 o Cterm-PTX3. La cantidad de bPTX3 ligada a FGF2 inmovilizada se determino a continuacion y los datos se expresaron como porcentaje respecto a la union medida en ausencia de cualquier competidor. Todos los datos son la media ± SD de 3 experimentos independientes por triplicado.

Figura 3. Mapeado de epftopo de PTX3. (A) PTX3 de longitud completa, Nterm-PTX3 y Cterm-PTX3 (200 ng/calle) fueron analizadas mediante analisis de transferencia western blot usando los anticuerpos monoclonales mAb-MNB4 y mAb-16B5. (B) Se dispusieron 128 peptidos solapantes de 13 unidades que se extienden por toda la secuencia de PTX3 humana sobre membranas de celulosa mediante la tecnica de SPOT-smtesis. A continuacion, las membranas fueron probadas con anticuerpos mAb-MNB4 (barras negras) y mAb-16B5 (barras grises) y se cuantificaron los inmunocomplejos mediante analisis densitometrico de las membranas. Las secuencias de aminoacidos de los

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peptidos PTX3 reconocidos por los dos anticuerpos se muestran en cursiva subrayadas en el codigo de una unica letra.

Figura 4. El mAb-MNB4 dificulta la interaccion FGF2/PTX3. (A) Se incubaron pocillos recubiertos con FGF2 con bPTX3 22 nM en ausencia o en presencia de PTX3 de longitud completa, mAb-MNB4 o mAb-16B5 (todos a 220 nM). La cantidad de bPTX3 ligada a FGF2 inmovilizada se determino a continuacion y los datos se expresaron como porcentaje respecto a la union medida en ausencia de cualquier competidor. (B) Se incubaron celulas GM7373 con FGF2 (0,55 nM) mas PTX3 (220 nM) en ausencia o en presencia de mAb-MNB4 o mAb-16B5 (ambos a 2,2 jM). Tras 24 h, las celulas fueron tripsinizadas y sometidas a recuento. Los datos estan expresados como porcentaje respecto a la proliferacion observada en celulas GM7373 incubadas solo con FGF2. Todos los datos son la media ± SD de 3 experimentos independientes por triplicado.

Figura 5. Inhibicion de la interaccion FGF2/PTX3 por peptidos PTX3 sinteticos. (A) Representacion esquematica de extremo N de PTX3 humana y peptidos PTX3 sinteticos relacionados. (B) Se anadio FGF2 (80 nM) a pocillos recubiertos con los peptidos pTX3 indicados (200 jg/pocillo) y se evaluo la cantidad de FGF2 ligada. Los datos, expresados como el porcentaje de la cantidad de FGF2 ligada a los pocillos recubiertos con PTX3, son la media ± SD de 3 experimentos independientes por triplicado. (C) Panel superior: se inyecto FGF2 (0,8 jM) sobre chips sensores BlAcore recubiertos de gelatina o recubiertos con PTX3. Panel inferior: representacion de sensograma que muestra la union de cantidades crecientes de FGF2 (0,1, 0,5, 0,8 y 1,1 jM) a PTX3 inmovilizada. La respuesta (en UR, Unidades de Resonancia) fue registrada en funcion del tiempo. D) Se inyecto FGF2 (0,8 jM) sobre chip sensor BlAcore recubierto con PTX3 en presencia de concentraciones crecientes de PTX3 de longitud completa (■) o peptidos sinteticos PTX3(82-110) (•), mezcla de PTX3(82-110) (o), o PTX3(57-85) (□). Se registro la respuesta al final de la inyeccion y se represento en funcion de la concentracion de antagonista. Para cada peptido, se obtuvieron resultados similares en 2-3 experimentos independientes. (E) Se incubaron celulas GM7373 con FGF2 (0,55 nM) en ausencia o en presencia de PTX3 (220 nM) o de los peptidos PTX3 indicados (todos a 66 jM). Los datos, expresados como porcentaje respecto a la proliferacion observada en celulas GM7373 incubadas solo con FGF2, son la media ± SD de 3 experimentos independientes por triplicado.

Figura 6. Peptido PTX3(97-110) como antagonista de FGF2. (A) Representacion esquematica de peptidos en expansion pTX3(82-110). (B) Se incubo con FGF2 (80 nM) pocillos recubiertos con los peptidos PTX3 indicados (200 jg/pocillo) y se evaluo la cantidad de FGF2 ligada. Los datos, expresados como el porcentaje de la cantidad de FGF2 ligada a los pocillos recubiertos con PTX3, son la media ± SD de 3 experimentos independientes por triplicado. (C) Se inyecto FGF2 (0,8 jM) sobre un chip sensor BlAcore recubierto con PTX3 en presencia de concentraciones crecientes de PTX3(82-110) (•), PTX3(97-110) (o), PTX3(82-101) (■) o PTX3(82-96) (A). Se registro la respuesta al final de la inyeccion y se represento en funcion de la concentracion de antagonista. Para cada peptido, se obtuvieron resultados similares en 2-3 experimentos independientes. (D) Se incubaron celulas GM7373 con FGF2 (0,55 nM) en ausencia o en presencia de los peptidos PTX3 indicados (todos a 66 jM). Los datos, expresados como porcentaje respecto a la proliferacion observada en celulas GM7373 incubadas solo con FGF2, son la media ± SD de 3 experimentos independientes por triplicado. (E) Se inyecto FGF2 (0,8 jM) sobre un chip sensor BlAcore recubierto de PTX3 en presencia de concentraciones crecientes de PTX3(97-110) (•), PTX3(100-110) (•), PTX3(97-104) (▲) o PTX3(97-107) (▼), PTX3(104-113) (♦), PTX3(100-113) (▲), PTX3(100-104) (□). Se registro la respuesta al final de la inyeccion y se represento en funcion de la concentracion de antagonista. Para cada peptido, se obtuvieron resultados similares en 2-3 experimentos independientes.

Figura 7. Actividad anti-angiogenica del peptido PTX3(82-110). Se fotografiaron en el dfa 14 membranas corioalantoicas de embrion de pollo (CAM) implantadas en el dfa 11 mediante partfculas de alginato que conteman vehuculo (a) o 16 pmoles de FGF2 en ausencia (b) o en presencia (c) de 3 nmoles de PTX3(82-110). Aumentos originales, x 5.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y Metodos

Compuestos qrnmicos

Se expreso FGF2 recombinante humana (numero de acceso 09038) y PTX3 (numero de acceso swiss-prot P26022) en E. coli y en celulas de ovario de hamster chino, respectivamente, y se purificaron como se ha descrito previamente 1019. Los peptidos sinteticos humanos PTX3(31-60), PTX33(57-85) y PTX3(107-132) fueron proporcionados por Primm (Milan, Italia), siendo proporcionados el resto de peptidos por Tecnogen (Piana di Monteverna, Caserta, Italia) (pureza en HPLC > 95%). Para todos los peptidos, se muestra la secuencia en la Tabla 1 en el codigo de letra unica y la numeracion comienza desde el residuo de metionina de la posicion 1 de la secuencia lfder de PTX3.

Tabla 1. Peptidos sinteticos que se expanden desde el extremo N de PTX3.

Peptido

Secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:

PTX3(31-60)

DNEIDNGLHPTEDPTPCDCGQEHSEWDKLF 8

PTX3(57-85)

DKLFIMLENSQMRERMLLQATDDVLRGEL 9

PTX3(82-110)

RGELQRLREELGRLAESLARPCAPGAPAE 10

PTX3(82-110) remezclada

EGLRGELRGSREAELLRQAARAPACPLPE 11

PTX3(107-132)

ARAEARLTSALDELLQATRDAGRRLA 12

PTX33(82-96)

RGELQRLREELGRLA 13

PTX3(82-101)

RGELQRLREELGRLAESLAR 14

PTX3(97-110)

ESLARPCAPGAPAE 5

PTX3(97-104)

ESLARPCA 15

PTX3(97-107)

ESLARPCAPGA 6

PTX3(100-104)

ARPCA 7

PTX3(100-110)

ARPCAPGAPAE 16

PTX3(82-99)

RGELQRLREELGRLAESL 1

PTX3(105-110)

PGAPAE 2

PTX3(97-99)

ESL 3

PTX3(105-107)

PGA 4

Los anticuerpos monoclonales de rata dirigidos contra PTX3 humana purificada se han descrito previamente 10,20 (MNB1 n° de cat. ALX-804-463, n° de cat. MNB4 ALX-804-464, Alexis Biochemicals).

5 Cultivos Celulares

Se cultivaron celulas GM7373 endoteliales aorticas bovinas21 en MEM de Eagle que contiene suero fetal de ternero al 10% (FCS). Se cultivaron celulas de empaquetamiento de rinon embrionario humano (EcoPack2-293) (Clontech, CA, EE.UU.) en DMEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD) que contiene FCS al l0%. Se obtuvieron celulas endoteliales aorticas de raton Balb/c 22106 (celulas MAE) de R. Auerbach (Universidad de Wisconsin, Madison, WI) 10 y se cultivaron en DMEM con FCS al 10%.

Infeccion retroviral

Los ADNcs que codifican para PTX3 humana y para la protema fluorescente verde potenciada (EGFP) fueron obtenidos como se ha descrito previamente 17 Se generaron ADNcs que codifican para el fragmento N-terminal PTX3(1-178) (Nterm-PTX3) y el fragmento C-terminal PTX3(179-381) fusionados a la secuencia lfder para secrecion 15 de PTX3(1-17) (sCterm-PTX3) a partir de pLX-PTX3 17 mediante PCR y tecnicas de clonacion estandar. Todos los ADNcs se clonaron en el vector retroviral pBABE, generando de este modo pBABE-PTX3, pBABE-Nterm-PTX3, pBABE-sCterm-PTX3 y pBABE-EGFP que fueron usadas para transfectar las celulas de empaquetamiento EcoPack2- 293 en presencia de Lipofectamina 17 Se seleccionaron las celulas transducidas con puromicina (1 pg/mL, Sigma) durante 2 semanas. Se usaron los clones con un tttulo viral superior a 106 cfu/mL para continuar con la 20 experimentacion. A continuacion se incubaron cultivos confluentes de celulas MAE durante 24 horas con el medio

acondicionado de celulas de empaquetamiento pBABE-PTX3, pBABE-Nterm-PTX3, pBABE-sCterm-PTX3 o pBABE- EGFP en presencia de polibreno (8 pg/mL, Sigma). Las poblaciones de celulas infectadas fueron seleccionadas durante 7 d^as con puromicina. La observacion de las celulas infectadas con EGFP mediante microscopfa de epifluorescencia (microscopio Axiovert S100, x10/0,25; Zeiss, Gottingen, Alemania) demostro que la eficacia de 5 infeccion retroviral fue superior al 80%. Para determinar los niveles de expresion de protema transgenica y la liberacion por parte de las celulas infectadas, se cultivaron cultivos celulares en condiciones libres de suero durante 2 dfas. A continuacion se recolectaron los medios acondicionados, se clarificaron mediante centrifugacion, se concentraron en una relacion de 10 a 1 usando filtros Centricon YM-10 (Millipore), y se evaluaron almuotas de 100 pL mediante analisis de transferencia Western.

10 Ensayo de proliferacion celular

Se llevo a cabo un ensayo de proliferacion celular con celulas endoteliales como se ha descrito anteriormente 22 Resumidamente, se sembraron celulas GM7373 o MAE en platos de 96 pocillos a una concentracion de 75.000 celulas/cm2 o 25.000 celulas/cm2, respectivamente. Despues de 16 h, las celulas fueron incubadas en medio fresco que contema un 0,4% de FCS mas FGF2 (0,55 nM) en ausencia o en presencia de diferentes antagonistas. 15 Despues de 24 o 48 h, respectivamente, las celulas fueron tripsinizadas y contabilizadas en una camara Burker.

Expresion de E. coli y purificacion de fragmentos recombinantes marcados con 6xHis de PTX3

Se amplificaron ADNcs de Nterm-PTX3 y Cterm-PTX3 a partir de pLX-PTX3 mediante PCR con cebadores que conteman nucleotidos adicionales

PTX3-N:

20 (+) CACCGAGAACTCGGATGATTATGA 8 (SEQ ID 17);

(-) TTAACCTGCCGGCAGCCAGCTCC (SEQ ID 18);

PTX3-C:

(+) CACCTGTGAAACAGCTATTTTA (SEQ ID 19);

(-) TTATGAAACATACTGAGCTCC (SEQ ID 20).

25 Estos ADNcs fueron clonados en el vector pENTR TOPO (Kit de clonacion pENTR Directional TOPO, Invitrogen) y se secuenciaron. Usando la tecnologfa Gateway© (Invitrogen), se clonaron entonces los ADNcs de Nterm-PTX3 y Cterm-PTX3 del vector pENTR TOPO en el vector pDEST17, lo que permite la insercion de una etiqueta de 6xHis en el extremo C de las protemas recombinantes. A continuacion se transformaron celulas BL21 de E. coli (Invitrogen) con los dos plasmidos recombinantes y se cultivaron a 37°C en medio LB que contema 100 pg/mL de ampicilina. Se 30 indujo la expresion de protema recombinante mediante incubacion de una noche a 30°C en presencia de un 0,2% de L-arabinosa. Tras la induccion, las celulas fueron re-suspendidas en tampon de union (fosfato sodico 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM, pH 7,4) y se lisaron mediante ultrasonidos. Los sobrenadantes clarificados fueron filtrados a traves de un filtro de 0,45 pm y se cargaron en una Columna de Afinidad de Metal Inmovilizado (IMAC) HiTrap de 3,0 mL (Amersham Biosciences) con mquel para purificacion. LA columna se lavo con imidazol 100 mM en tampon de 35 union y las protemas ligadas fueron elrndas con imidazol 300 mM segun las instrucciones del fabricante. Las fracciones fueron evaluadas para determinar la presencia de la protema recombinante mediante inmunotincion, y las fracciones positivas fueron recogidas y desaladas mediante cromatograffa de filtracion de gel (columna Sephadex G25 PD10, Amersham) en PBS. La pureza de las protema recombinantes fue superior al 90%, determinado mediante SDS-PAGE seguido de tincion con plata del gel (vease la Figura 2A, panel interior).

40 Ensayo de union en fase solida

Se incubaron microplacas ELISA durante 16 horas a 4°C con 100 pL/pocillo de NaHCO3100 mM, pH 9,6 (tampon de recubrimiento) que contema FGF2 (270 nM). A continuacion, los pocillos fueron cubiertos durante 2 horas a temperatura ambiente con leche en polvo al 5% en tampon de recubrimiento. A continuacion, se incubaron almuotas de 100 pL de PBS que conteman PTX3 de longitud completa, Nterm-PTX3 o Cterm-PTX3 recombinantes (todas a 44 45 nM) durante 30 minutos a 37°C en los pocillos recubiertos con FGF2. A continuacion, los pocillos fueron incubados secuencialmente durante 1 hora a 37°C con un anticuerpo anti-PTX3 policlonal de conejo (dilucion 1:2000) que reconoce ambos fragmentos de PTX3 con eficacia similar en analisis de transferencia Wester y ELISA, un anticuerpo biotinilado anti-conejo (1:2000), y 100 pL de estreptavidina-peroxidasa de rabano (1:5000, Amersham) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuacion, se anadieron 100 pL/pocillo del sustrato cromogeno acido 50 2,29-azinobis(3-etilbenztiazolinasulfonico). Los valores de absorbancia fueron lefdos a 405 nm en un lector ELISA automatico. En algunos experimentos, se incubaron almuotas de 100 pL de PBS que contema PTX3 marcada con biotina (bPTX3) (22 nM) durante 30 minutos a 37°C en pocillos recubiertos de FGF2 con o sin competidores. A continuacion se lavaron los pocillos y se evaluo la cantidad de bPTX3 ligada como se ha descrito previamente17. De forma alternativa, los peptidos PTX3 sinteticos fueron inmovilizados en pocillos de microplaca ELISA (200 pg/pocillo) 55 como se ha descrito anteriormente. A continuacion, se anadio FGF2 (80 nM) y se analizo el FGF2 ligado a peptidos

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inmovilizados mediante 1 hora de incubacion a 37°C con un anticuerpo anti-FGF2 policlonal de conejo (1:7000) seguido de la deteccion del inmunocomplejo como se ha descrito anteriormente.

Mapeado de epitopo de PTX3

Para identificar la secuencia de aminoacidos de los epttopos que se unen a anticuerpos anti-PTX3 monoclonales, se dispusieron 128 peptidos sobre membranas de celulosa mediante tecnologfa de smtesis SPOT 23 Los peptidos teman una longitud de 13 aminoacidos con un desplazamiento de estructura de 3 aminoacidos. Las membranas fueron bloqueadas con un 2% de leche en Tween-TBS (MBS) durante 16 horas a 4°C. Despues de un lavado, las membranas fueron incubadas durante 90 minutos a 37°C con los anticuerpos monoclonales mAb MNB4 o mAb 16B5 (ambos a una dilucion 1:1000 en MBS) y despues se incubaron durante 90 minutos a 37°C con IgG anti-rata conjugada a fosfatasa alcalina de conejo (1:30.000, Sigma) en MBS. Se desarrollo color en la reaccion como ha descrito previamente23 y se evaluo la intensidad de la senal mediante analisis densitometrico de la membrana.

Ensayo de union BIAcore

Se uso un aparato BIAcore X (BIAcore Inc, Piscataway, NJ). Se utilizo resonancia de plasmon superficial para medir cambios en el mdice refractivo producidos por la capacidad del FGF2 para unirse a pTX3 inmovilizada sobre un chip sensor BIAcore. Con este fin, se dejo reaccionar PTX3 (2,2 jM) con una celda de flujo de un chip sensor CM4 que habfa sido activada previamente con 50 jL de una mezcla de hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida 0,2 M e hidroxisuccinimida 0,05 M. Estas condiciones experimentales permitieron la inmovilizacion de 5.000 unidades de resonancia (URs), que corresponden aproximadamente a 0,1 pmoles de PTX3. Se obtuvieron resultados similares para la inmovilizacion de gelatina, usada aqu como control negativo y para sustraccion del blanco. A continuacion se inyectaron concentraciones crecientes de FGF2 con o sin peptidos PTX3 sinteticos en tampon de dilucion (PBS mas 0,005% de tensioactivo P20, 5,0 jg/mL de CaCl2 y MgCh) sobre la superficie del PTX3 durante 4 minutos (para permitir su asociacion con PTX3 inmovilizado) y a continuacion se lavo hasta que se observo disociacion.

Ensayo de membrana corioalantoica de embrion de pollo (CAM)

Se prepararon bolitas de alginato (5 jL) que conteman vehmulo o 16 pmoles de FGF2 con o sin peptidos PTX3 sinteticos como se ha descrito previamente 24 y se colocaron encima de CAM de huevos de pollo White Leghorn fertilizados en el dfa 11 de incubacion (10 huevos por grupo experimental). Despues de 72 horas, se contabilizaron los vasos sangumeos que convergfan de un modo doblemente ciego en un estereomicroscopio (STEMI-SR, x2/0,12; Zeiss).

Resultados

La region N-terminal de PTX3 se une a FGF2

La protema PTX3 se caracteriza por un dominio C-terminal de 203 aminoacidos (Cterm-PTX3) que comparte homologfa con las pentraxinas cortas clasicas CRP y SAP, y por una extension N-terminal de 178 aminoacidos (Nterm-PTX3) que no muestra ninguna homologfa significativa con ninguna otra protema conocida 8 En un intento de identificar el(los) dominio(s) antiangiogenico(s) de union a FGF2 del PTX3, se evaluaron las dos porciones Cterm o Nterm-PTX3 para determinar su capacidad para interaccionar con FGF2.

Observaciones previas habfan mostrado que la sobreexpresion de PTX3 de longitud completa da como resultado la inhibicion de la proliferacion dependiente de FGF2 en celulas endoteliales debido a la union de PTX3 liberada al factor de crecimiento exogeno y su secuestro en el medio extracelular 17 En base a esto, se infectaron celulas endoteliales aorticas de raton (MAE) con retrovirus que albergaban la PTX3 de longitud completa humana, la extension N-terminal de PTX3 Nterm-PTX3, o el extremo C de la PTX3 fusionado a la secuencia lfder de PTX3 para secrecion (sCterm-PTX3). Las celulas de control fueron infectadas con un retrovirus que albergaba EGFP. Las celulas infectadas sobreexpresaron y liberaron las correspondientes protemas en cantidades similares (Figura 1A) y mostraron un velocidad similar de crecimiento en condiciones basales. Sin embargo, la sobreexpresion de Nterm- PTX3 provoco una reduccion significativa de la capacidad de las celulas infectadas para proliferar en respuesta a FGF2 exogeno, similar a la sobreexpresion de PTX3 de longitud completa (Figura 1B). En su lugar no se ejercio ninguna inhibicion por la sobreexpresion de sCterm-PTX3 en comparacion con las celulas de control infectadas con EGFP.

Para determinar mejor la capacidad de Nterm-PTX3 para actuar como antagonista de FGF2, se evaluaron medios condicionados de celulas MAE infectadas para determinar su capacidad para afectar a la proliferacion dependiente de FGF2 de celulas GM7373 endoteliales (Figura 1C). Como se ha adelantado, la incubacion de celulas GM7373 con FGF2 en presencia del medio condicionado de celulas MAE infectadas con Nterm-PTX3 o PTX3 produjo una inhibicion significativa de la actividad mitogenica del factor de crecimiento, mientras que el medio condicionado de celulas MAE infectadas con sCterm-PTX3 y EGFP fue ineficaz (Figura 1C). Ninguno de los medios condicionados produjo una inhibicion significativa de la proliferacion celular de GM7373 activada por FCS al 10%, confirmando de este modo la especificidad del efecto.

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Para confirmar que la actividad antagonista de FGF2 de Nterm-PTX3 era debida a su capacidad para interaccionar directamente con el factor de crecimiento, se expresion Nterm-PTX3 y se purifico a partir de celulas transformadas de E. coli como protema recombinante marcada con 6xHis; se uso la Cterm-PTX3 recombinante marcada con 6xHis purificada como control (Figura 2A, panel interior). Cuando se evaluo para determinar la interaccion con FGF2, la PTX3 de longitud completa y el fragmento Nterm-PTX3 recombinante mostraron la capacidad de unirse a FGF2 inmovilizado sobre plastico de cultivo no tisular. Por otro lado, no se observo interaccion con Cterm-PTX3 recombinante (Figura 2A). Por consiguiente, un exceso molar de 10 a 1 de Nterm-PTX3 recombinante o de PTX3 de longitud completa, pero no de Cterm-PTX3, previno la union de PTX3 biotinilada (bPTX3) al FGF2 inmovilizado (Figura 2B).

Considerados en conjunto, estos resultados implican la region N-terminal de la PTX3 en la interaccion con FGF2.

Inhibicion de la interaccion FGF2/PTX3 mediante un anticuerpo anti-Nterm-PTX3 monoclonal

El escrutinio de un conjunto de anticuerpos monoclonales de rata activados contra PTX3 humana de longitud completa identifico los anticuerpos mAb-MNB420 (MNB4 n° cat. ALX-804-464, Alexis Biochemicals) y mAb-16B510 (MNB1 n° cat. ALX-804-463, Alexis Biochemicals) que se unen selectivamente a Nterm-PTX3 y Cterm-PTX3 recombinantes, respectivamente, en un analisis de transferencia Western (Figura 3A).

Para mapear los epftopos de PTX3 reconocidos por los dos anticuerpos, los autores aprovecharon la tecnica de smtesis SPOT23 mediante la cual 128 peptidos solapantes de 13 unidades que se extienden desde la secuencia de PTX3 humana completa fueron dispuestos sobre una membrana de celulosa. Cuando la membrana fue evaluada con los dos anticuerpos monoclonales, la deteccion de inmunocomplejos revelo que el mAb-MNB4 reconoce el epftopo PTX3(87-99) presente en la extension N-terminal de PTX3, mientras que el mAb-16B5 reconoce el epftopo PTx3(306-312) localizado en la region C-terminal de PTX3 (Figura 3B).

Cuando se evaluo para determinar la capacidad de afectar a la interaccion FGF2/PTX3, el mAb-MNB4, pero no el mAb-16B5, previene la capacidad de la bPTX3 para unirse a FGF2 inmovilizado, de forma similar a un exceso molar de PTX3 no marcada libre (Figura 4A). Por consiguiente, el mAb-MNB4 elimina la capacidad de la PTX3 de longitud completa para inhibir la actividad mitogenica ejercida por el FGF2 en celulas GM7373 endoteliales, mientras que el mAb-16B5 es ineficaz (Figura 4B). Por lo tanto, el mAb-MNB4 que reconoce el epftopo N-terminal PTX3(87-99) neutraliza la interaccion FGF2/PTX3.

Peptidos sinteticos relacionados con Nterm-PTX3 como antagonistas de FGF2

Para definir adicionalmente la region de union a FGF2 de la extension N-terminal de la PTX3, los autores evaluaron la actividad antagonista de FGF2 del peptido sintetico PTX3(82-110), que contiene el epftopo PTX3(87-99) reconocido por el mAb-MNB4 neutralizante (ver arriba), junto con tres peptidos sinteticos distintos PTX3(31-60), PTX3(57-85) y PTX3(107-132) que extienden parcialmente la secuencia de aminoacidos de la Nterm-PTX3 (Figura 5A).

En un primer conjunto de experimentos, se evaluo la capacidad de los cuatros fragmentos de PTX3 sinteticos para interaccionar con FGF2 en un ensayo de union en fase solida. Tal como se muestra en la Figura 5B, el FGF2 libre se une a PTX3(82-110) inmovilizado sobre plastico de cultivo no tisular, pero no a PTX3(31-60) o PTX3(57-85) inmovilizados, presentando solo una interaccion limitada con PTX3(107-132) inmovilizado.

A continuacion, se utilizo resonancia de plasmon superficial para determinar la capacidad de los cuatro peptidos para afectar a la interaccion FGF2/PTX3. Los resultados muestran que el FGF2 (0,8 jM) se une a PTX3 inmovilizada sobre un chip sensor BIAcore con una alta capacidad (350-400 UR al final de la fase de inyeccion) (Figura 5C, panel superior). La especificidad de la interaccion se demuestra por la falta de union a un chip sensor recubierto de gelatina. Asimismo, se inyectaron concentraciones crecientes de FGF2 (de 0,1 a 1,1 jM, Figura 5C, panel inferior) sobre la superficie de PTX3 para evaluar los parametros cineticos de la interaccion FGF2/PTX3. Los datos de union demuestran que la interaccion se produce con una constante cinetica de disociacion (koff) de 6 x 10-5 s-1 y una constante cinetica de asociacion (kon) de 0,2 x 103 s-1 M-1, dando como resultado un valor Kd igual a 0,3 x 10'° M-1. En base a esto, los cuatro peptidos PTX3 sinteticos fueron evaluados para determinar su capacidad para secuestrar FGF2 en la fase movil, previniendo de este modo su interaccion con el chip sensor de PTX3. Tal como se muestra en la Figura 5D, PTX3(82-110) inhibe la union de FGF2 a la superficie de PTX3 de un modo dependiente de la dosis con una potencia 30 veces inferior a la mostrada por la PTX3 de longitud completa (ID50 igual a 1,0 jM y 30 jM para PTX3 libre y peptido PTX3(82-110), respectivamente). En las mismas condiciones experimentales, sin embargo, no se ejercio ningun efecto inhibidor con los peptidos PTX3(31-60), PTX3(57-85) y PTX3(107-132) (Figura 5D y otros datos recogidos). Asimismo, un peptido sintetico mixto con una composicion de aminoacidos igual a PTX3(82-110) [sPTX3(82-110), Tabla 1] mostro un efecto inhibidor limitado (ID50 > 3000 jM) (Figura 5D), indicando de este modo que la secuencia de aminoacidos primaria en el PTX3(82-110) es importante para la interaccion con FGF2.

La capacidad del peptido PTX3(82-110) para unirse a FGF2 animo a los autores a determinar su capacidad para actuar como antagonista de FGF2. Cuando se evaluan sobre celulas GM7373, tanto la PTX3 de longitud completa como el PTX3(82-110) inhiben la actividad mitogenica ejercida por FGF2 exogena, mientras que los peptidos mixtos

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PTX33(82-110), PTX3(31-60), PTX3(57-85) y PTX3(107-132) fueron ineficaces (Figura 5E). Las curvas dosis- respuesta confirmaron que la actividad de antagonista de FGF2 de PTX3(82-110) era dependiente de la dosis (ID50 igual a 30 pM y 30 nM para PTX3(82-110) y PTX3, respectivamente).

Identificacion de una secuencia minima lineal de union a FGF2 en la extension N-terminal de PTX3

Considerados en conjunto, los datos anteriores indican que la secuencia de aminoacidos lineal 82-110 de la extension N-terminal de la PTX3 desempena una funcion importante en la interaccion con FGF2. En un intento por identificar una secuencia de union a FGF2 minima lineal, se evaluaron tres peptidos sinteticos solapantes PTX3(82- 96), PTX3(82-101) y PTX3(97-110) que extienden la secuencia completa de PTX3(82-110) (Figura 6A y Tabla 1) para determinar su capacidad de interaccionar con FGF2 en un ensayo de union en fase solida. En las mismas condiciones experimentales, el FGF2 libre se une a PTX3(97-110) inmovilizado, asf como al PTX3(82-110) progenitor y a la PTX3 de longitud completa, sin interaccionar con PTX3(82-96) o PTX3(82-101) (Figura 6b). Por consiguiente, PTX3(97-110) se une a FGF2 en la fase movil, evitando de este modo su interaccion con PTX3 inmovilizada sobre un chip sensor BIAcore (Figura 6C). La actividad inhibidora de PTX3(97-110) fue similar a la mostrada por el peptido progenitor PTX3(82-110), mientras que el PTX3(82-96) y el PTX3(82-101) fueron ineficaces (Figura 6C). En consonancia con estas observaciones, el pTx3(97-110), aunque no el pTx3(82-96) o el PTX3(82- 101), inhibe la actividad mitogenica ejercida por el FGF2 en celulas GM7373 endoteliales (Figura 6D).

Para investigar adicionalmente la secuencia de union a FGF2 lineal minima que se extiende desde el peptido PTX3(97-110), los autores analizaron la union de los siguientes peptidos cortos a FGF2 midiendo su interaccion con PTX3 inmovilizada sobre un chip sensor BIAcore: PTX3(97-107), PTX3(97-104), PTX3(100-104) y PTX3(100-110), (Figura 6E). Los peptidos PTX3(97-107) y PTX3(100-104) mostraron una union significativa a FGF2. Por el contrario, los peptidos PTX3(97-104) y pTx3(100-110) no evitaron la union de FGF2 libre a PTX3 inmovilizado sobre un chip sensor BIAcore. (Figura 6E). Por tanto, parece que el PTX3(100-104) representa la secuencia de aminoacidos de union a FGF2 lineal minima en la extension N-terminal de la PTX3. Por consiguiente, PTX3(100-104) inhibe la proliferacion de celulas endoteliales inducida por FGF2.

Los peptidos sinteticos relacionados con Nterm-PTX3 inhiben la actividad angiogenica del FGF2

Para determinar la capacidad de los peptidos relacionados con Nterm-PTX3 para afectar a la neovascularizacion inducida por FGF2 in vivo, se implantaron esponjas de gelatina adsorbidas con FGF2 solo o anadido a peptidos PTX3 sobre CAMs de embrion de pollo de ll dfas de edad. Tal como se muestra en la Figura 7, las bolitas de alginato adsorbidas con FGF2 (16 pmoles/embrion) ejercen una potente respuesta angiogenica en comparacion con bolitas adsorbidas con vehfculo (siendo los vasos macroscopicos que convergen hacia el implante iguales a 44 ± 7 y 11 ± 5 vasos/embrion para los dos grupos experimentales, respectivamente). En consonancia con las observaciones in vitro, la respuesta angiogenica in vivo dependiente de FGF2 se vio reducida significativamente (28 ± 5 vasos/embrion, p<0,05 mediante ANOVA) por la adicion de 3,0 nmoles de peptido PTX3(82-110) en los implantes de FGF2 (Figura 7). Por consiguiente, 80 nmoles de PTX3(97-110) produjeron una inhibicion del 50% en la respuesta angiogenica activada por FGF2; por otro lado no se ejercio ningun efecto mediante PTX3(82-96).

Discusion

Los autores demuestran que la interaccion con FGF2 esta mediada por la extension N-terminal sobre la PTX3. Tambien, los experimentos llevados a cabo con anticuerpos monoclonales neutralizantes y peptidos sinteticos relacionados con PTX3 identifican la secuencia de aminoacidos lineal PTX3(97-110) como la responsable de dicha interaccion. Estas conclusiones se basan en las siguientes evidencias experimentales: i) las pentraxinas cortas CRP y SAP son ligandos ineficaces de FGF2 17 a pesar de su homologfa de secuencia con el extremo C de la PTX3 7; ii) la transduccion retroviral del fragmento N-terminal PTX3(1-178) (Nterm-PTX3), aunque no la de sCterm-PTX3, inhibe la actividad mitogenica ejercida por FGF2 exogeno en celulas endoteliales; iii) el Nterm-PTX3 recombinante, aunque no el Cterm-PTX3, se une a FGF2 inmovilizada e inhibe la interaccion PTX3/FGF2; iv) el anticuerpo monoclonal mAb- MNB4, que mapea el epftopo lineal PTX3(87-99), previene la interaccion FGF2/PTX3 y elimina la actividad de antagonista de FGF2 de la PTX3 en celulas endoteliales; v) el peptido sintetico PTX3(82-110) y los peptidos mas cortos PTX3(97-110), PTX3(97-107) y PTX3(100-104), aunque no otros peptidos basados en regiones diferentes del extremo N de la PTX3, previenen la interaccion FGF2/PTX3 mediante la union a FGF2, inhibiendo de este modo la proliferacion de celulas endoteliales dependientes de FGF2 in vitro y la angiogenesis in vivo.

La PTX3 es producida por celulas macrofagos , fibroblastos , mioblastos , microglia y endoteliales , lo que indica que puede ejercer las funciones paracrina y autocrina en el endotelio. De forma similar, diversos estfmulos, que incluyen los mediadores inflamatorios IL-1 y oxido mtrico30,31 inducen la expresion de FGF2 en celulas endoteliales sometidas a un lazo autocrino de estimulacion. Por tanto, las celulas endoteliales y otros tipos celulares pueden expresar tanto PTX3 como FGF2. Asf, la PTX3 producida por celulas inflamatorias o por las propias celulas endoteliales puede afectar a la actividad autocrina y paracrina ejercida por FGF2 sobre el endotelio in vitro e in vivo. Esto debena permitir un ajuste fino de la neovascularizacion a traves de la produccion de inhibidores y estimuladores de la angiogenesis.

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El FGF2 es un factor de crecimiento pleiotropico que estimula varios tipos celulares de origen endodermico y mesodermico32. Por lo tanto, la funcion ejercida por el FGF2 en diversas afecciones patofisiologicas no se limita a su actividad angiogenica. Por ejemplo, el FGF2 estimula la migracion y la proliferacion de fibroblastos durante la curacion de heridas y de celulas de musculo liso durante la aterosclerosis33,34 y la restenosis35. Asimismo, puede favorecer la supervivencia de celulas neuronales y la proliferacion de celulas aliales en el sistema nervioso central lesionado36. En todas estas afecciones, la produccion concomitante de PTX33 , 8 modula la actividad ejercida por el FGF2 en dichas celulas. De hecho, la PTX3 inhibe la activacion in vitro de celulas de musculo liso dependiente de FGF2 y el espesamiento mtimo tras lesion arterial in vivo18.

En conclusion, los autores demuestran por primera vez que el extremo N de la PTX3 esta implicado en la interaccion con FGF2. La PTX3 es un receptor de reconocimiento de patron soluble multifuncional en la encrucijada entre la inmunidad innata, la inflamacion, la deposicion de matriz y la fertilidad femenina. Ejerce su actividad multifuncional a traves de la interaccion con numerosos ligandos con distintas propiedades moleculares.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un peptido de union a FGF2 de formula I:

   Ri-Ala-Xi-Pro-X2-Ala-R2 (I)

   donde:

   Xi es un aminoacido seleccionado entre Arg y Lys;

   X2 es un aminoacido seleccionado entre Cys y Thr;

   Ri esta ausente o consiste en la secuencia de aminoacidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3;

   R2 esta ausente o consiste en la secuencia de aminoacidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, con las siguientes condiciones:

   cuando Ri esta presente, tambien R2 esta ausente; cuando Ri es la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, R2 es la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2; cuando Ri es la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3, R2 es una secuencia de aminoacidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4; o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
2. 2. El peptido segun la reivindicacion 1, en donde Xi es Arg.
3. 3. El peptido segun la reivindicacion i o 2, en donde X2 es Cys.
4. 4. El peptido segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que consiste en la secuencia de aminoacidos seleccionada entre SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: i0.
5. 5. Una molecula de acido nucleico que codifica el peptido segun cualquiera de las reivindicaciones previas, o que se hibrida con el anterior acido nucleico, o que incluye una secuencia degenerada del mismo.
6. 6. Un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 5.
7. 7. Una celula hospedante transformada con el vector de expresion segun la reivindicacion 6.
8. 8. La celula hospedante segun la reivindicacion 7, en donde el peptido es secretado o expresado sobre la superficie de membrana de la celula.
9. 9. Un peptido de las reivindicaciones i a 4 para uso como medicamento.
10. 10. Un peptido de las reivindicaciones i a 4 para uso contra una enfermedad producida por una angiogenesis alterada.
11. 11. El peptido de la reivindicacion i0 en el que la angiogenesis alterada esta provocada por una activacion alterada del factor de crecimiento FGF2.
12. 12. El peptido de la reivindicacion i0 u ii, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad artntica, metastasis tumoral, retinopatfa diabetica, soriasis, inflamacion cronica, arteriosclerosis o tumor.
13. 13. El peptido de la reivindicacion i2, en el que el tumor se selecciona del grupo: sarcoma, carcinoma, carcinoide, tumor oseo o tumor neuroendocrino.
14. 14. Un peptido de las reivindicaciones i a 4 para uso contra una enfermedad asociada a la proliferacion descontrolada dependiente de FGF2 de fibroblastos o celulas de musculo liso, la cicatrizacion ligada a una respuesta fibroblastica excesiva, y la restenosis tras angioplastia.
15. 15. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del peptido segun cualquiera de las reivindicaciones i-4 y diluyentes y/o excipientes y/o adyuvantes adecuados.

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