ES2938890T3 - Proteínas de fusión de VWF glucosiladas con farmacocinética mejorada - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende una proteína principal y uno o más péptidos de extensión, donde la secuencia de aminoácidos de la proteína principal es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de una proteína de mamífero o un fragmento de la misma, y dicho péptido de extensión comprende un grupo de aminoácidos O-glicosilados. El péptido de extensión es idéntico a una secuencia no repetida de la proteína de mamífero y/o idéntico o similar a la SEQ ID NO: 1. La proteína principal es preferiblemente VWF. La proteína de fusión tiene una vida media aumentada en comparación con la proteína principal y puede usarse para aumentar la vida media de una pareja de unión, por ejemplo, FVIII. La invención se refiere además al complejo formado por la proteína de fusión, un polinucleótido que codifica la proteína de fusión así como un vector y una célula huésped que comprende el polinucleótido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión de VWF glucosiladas con farmacocinética mejorada

Campo de la invención

La invención se refiere a la prolongación de la semivida de las proteínas, en particular, de los factores de coagulación humanos tales como el factor de von Willebrand (VWF) y el factor VIII (FVIII).

Antecedentes de la invención

La hemofilia es un grupo de trastornos genéticos hereditarios que afectan a la capacidad del cuerpo para controlar la coagulación de la sangre. En su forma más común, Hemofilia A, el factor de coagulación VIII (FVIII) es deficiente. La hemofilia A se produce en aproximadamente 1 de cada 5.000-10.000 nacimientos de varones. La proteína FVIII es un cofactor esencial en la coagulación sanguínea con propiedades multifuncionales. La deficiencia de FVIII puede tratarse con concentrados de FVIII derivados de plasma o con FVIII producido de forma recombinante. El tratamiento con concentrados de FVIII ha llevado a una vida normalizada de los pacientes con hemofilia.

Los pacientes con hemofilia A se tratan con FVIII a demanda o como terapia profiláctica administrada varias veces a la semana. Para el tratamiento profiláctico, se administran 15-25 UI/kg de peso corporal de FVIII tres veces por semana, que es necesario debido a la necesidad constante de FVIII y su corta semivida en el sistema sanguíneo, que en los seres humanos es de solo aproximadamente 11 horas (Ewenstein et al., 2004).

En la sangre, en condiciones normales, la molécula de FVIII está siempre asociada a su cofactor factor de von Willebrand (VWF), que estabiliza la molécula de FVIII de diferentes formas de degeneración. El complejo no covalente de FVIII y VWF tiene una alta afinidad de unión de 0,2-0,3 nM (Vlot et al., 1996).

Históricamente, la hemofilia A se ha tratado con FVIII procedente de plasma sanguíneo humano. Sin embargo, desde la década de 1990, se comercializaron diferentes proteínas FVIII producidas de forma recombinante. Sin embargo, ni las proteínas de FVIII derivadas de plasma ni las producidas de forma recombinante tienen propiedades farmacocinéticas óptimas. Como muchas otras proteínas terapéuticas, están sujetas al recambio metabólico por peptidasas, lo que limita significativamente su semivida in vivo.

Según lo revisado por Tiede et al. (2015), los intentos de prolongar la semivida de FVIII incluyen la fusión con Fc (Eloctate, Elocta, efmoroctocog alfa), adición de polietilenglicol (turoctocog alfa pegol [N8-GP], BAY 94-9027, BAX 855) y una construcción monocatenaria (CSL627). Todas estas tecnologías cambian la molécula de FVIII y dan como resultado un FVIII con una semivida prolongada aproximadamente 1,5 veces.

La extensión adicional de la semivida del FVIII se limita a la semivida del VWF. Como se muestra por Yee et al., el dominio D'D3 del VWF humano es suficiente para estabilizar el FVIII en plasma. Sin embargo, una proteína de fusión D'D3-Fc es capaz de extender la semivida del FVIII solo en ratones VWF-/-. En ratones con hemofilia A, la construcción D'D3-Fc no da como resultado una prolongación de la semivida del FVIII debido a la competencia ineficaz de los fragmentos de proteína con el VWF endógeno por la unión del FVIII.

El documento WO 2014/011819 A2 describe la prolongación exitosa de la semivida de una construcción de FVIII que contiene el dominio D'D3 de VWF, el dominio Fc de IgG y XTEN. Dado que esta construcción no se une al vW f endógeno, el mismo efecto de prolongación de la semivida se observa tanto en ratones VWF/FVIIl-doble inactivación génica (DKO) como en ratones con hemofilia A. Sin embargo, aunque es completamente funcional in vitro, exhibe una actividad marcadamente reducida in vivo.

Otros enfoques para aumentar la semivida de las proteínas terapéuticas incluyen la fusión genética de la proteína terapéutica con una proteína con una semivida naturalmente larga tales como la transferrina y la albúmina o con dominios proteicos tales como el péptido C-terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica (CG).

La CG pertenece a la familia de hormonas glucoproteicas que incluye la hormona luteinizante (LH), la hormona estimulante del folículo (FSH) y la hormona estimulante de la tiroides (TSH). Estas glucohormonas son heterodiméricas y consisten en una subunidad a común y subunidades p únicas que les confieren sus diferentes actividades. La semivida de la CG humana (hCG) es significativamente más larga que la semivida de sus contrapartes LH, FSH y TSH. Se demostró que el CTP O-glucosilado de hCG-p es responsable de esta prolongación de la semivida. Se describe que el CTP consiste en la secuencia FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*D^t PILPQ, que posee cuatro sitios de O-glucosilación (indicados por S*) (Birken et al., 1977).

Como se revisó en Strohl et al (2015), se han desarrollado diferentes proteínas de fusión de una proteína terapéutica y CTP y actualmente se encuentran en ensayos clínicos. Las proteínas terapéuticas incluyen FSH (Elonva®), FVIIa, FIX, IFN-p y oxintomodulina.

El documento WO 93/15200 A1 es una solicitud de patente internacional que se refiere a polipéptidos antitrombina como antagonistas de la unión del VWF a las plaquetas o al subendotelio. Desvela diferentes proteínas de fusión que comprenden fragmentos de VWF. En particular, las proteínas de fusión del documento WO 93/15200 A1 comprenden una parte adhesiva derivada de la estructura del VWF y una parte que permite su presentación funcional y asegura la estabilidad y la distribución in vivo de la molécula.

El documento WO 93/15199 A1 se basa en el mismo principio básico que el documento WO 93/15200 A1, es decir, proteínas de fusión de VWF y albúmina, en particular "sérumalbumine humaine" (SAH), pero la aplicación se centra en la parte de la albúmina.

Doron Calo et al. 2015 es un artículo científico sobre el péptido C-terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica humana (hCG) para su uso como fusión con proteínas terapéuticas para mejorar la longevidad y la potencia in vivo.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, entre otras cosas, en el descubrimiento de que la adición de un grupo de aminoácidos O-glucosilados (que está presente en el VWF humano de longitud completa) a un fragmento de VWF conduce a un aumento significativo de su semivida. La semivida de la proteína de fusión se prolonga en comparación con el fragmento de VWF sin el grupo de O-glucano adicional.

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión que comprende una proteína principal y al menos un péptido de extensión, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína principal es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de una proteína de mamífero, tal como VWF o un fragmento del mismo, y dichos péptido o péptidos de extensión con una longitud de no más de 100 aminoácidos comprende o comprenden un grupo de aminoácidos O-glucosilados con al menos dos aminoácidos O-glucosilados y tiene o tienen una identidad de secuencia de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 1 y en donde la proteína de fusión tiene una semivida aumentada en comparación con la proteína principal sin péptido o péptidos de extensión.

La conclusión de los descubrimientos de los inventores es que el grupo de aminoácidos O-glucosilados de VWF identificados por SEQ ID NO: 1 es útil como péptido de extensión de la semivida.

De acuerdo con una realización preferida adicional del primer aspecto, el uno o más péptidos de extensión tienen una identidad de secuencia de al menos el 95 %, preferentemente al menos el 98 %, más preferentemente el 100 % con un péptido O-glucosilado de VWF, en particular con SEQ ID NO: 1.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto.

De acuerdo con el tercer aspecto, la invención se refiere a un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con el segundo aspecto.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora que contiene el polinucleótido de acuerdo con el segundo aspecto o el vector de acuerdo con el tercer aspecto, en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero.

Los inventores han descubierto que no solo aumenta la semivida del VWF, sino también la semivida de su compañero de unión FVIII. Por lo tanto, en el complejo o la composición resultante de la proteína de fusión y la segunda proteína, la segunda proteína también tiene una semivida aumentada.

Por lo tanto, en un quinto aspecto, la invención se refiere a una composición de una primera proteína y una segunda proteína, en donde dicha primera proteína es una proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto y es capaz de unirse a dicha segunda proteína y dicha segunda proteína es una proteína terapéutica que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de una segunda proteína de mamífero o fragmento de la misma, en donde la semivida de la segunda proteína unida a la primera proteína aumenta en comparación con la forma libre de dicha segunda proteína.

Figuras

La Figura 1 muestra representaciones esquemáticas de A) un fragmento de VWF OCTA 11 y B) una proteína de fusión de acuerdo con la invención con un fragmento de VWF como proteína principal: OCTA 12; C) una proteína de fusión de acuerdo con la invención con un fragmento de VWF como proteína principal: OCTA14; D) una proteína de fusión de acuerdo con la invención con un fragmento de VWF como proteína principal: OCTA15.

La Figura 2 muestra el transcurso del tiempo de la actividad del FVIII después de la administración intravenosa de FVIII coformulado con diferentes proteínas de VWF o ^vW ^f de longitud completa derivado de plasma en plasma de ratones FVIII/VWF con doble inactivación (DKO). Los puntos de datos y las barras de error representan la media y la desviación estándar (SD) de 5 valores. Debido al pequeño tamaño, varias de las barras de error no son discernibles.

La Figura 3 muestra el transcurso del tiempo de la concentración del antígeno OCTA 12 después de la administración subcutánea de 100 U/kg de FVIII coformulado con OCTA 12 en plasma de cerdo enano.

La Figura 4 muestra la evolución temporal de la concentración del antígeno FVIII tras la inyección subcutánea e intravenosa de 100 U/kg de FVIII o 100 U/kg de FVIII subcutáneo coformulado con la proteína OCTA 12 del VWF en plasma de cerdo enano.

Descripción detallada de la invención

Con el fin de proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones y el alcance que se dará a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

Definiciones

Un "péptido" como se usa en el presente documento puede estar compuesto por cualquier número de aminoácidos de cualquier tipo, preferentemente aminoácidos de origen natural, que, preferentemente, están enlazados por enlaces peptídicos. En particular, un péptido comprende al menos 3 aminoácidos, preferentemente al menos 5, al menos 7, al menos 9, al menos 12 o al menos 15 aminoácidos. Adicionalmente, no hay límite superior para la longitud de un péptido. Sin embargo, preferentemente, un péptido de acuerdo con la invención no excede una longitud de 500 aminoácidos, más preferentemente no excede una longitud de 300 aminoácidos; incluso más preferentemente no es más largo que 250 aminoácidos.

Por lo tanto, el término "péptido" incluye "oligopéptidos", que habitualmente se refieren a péptidos con una longitud de 2 a 10 aminoácidos, y "polipéptidos" que habitualmente se refieren a péptidos con una longitud de más de 10 aminoácidos.

Una "proteína" como se usa en el presente documento puede contener una o más cadenas polipeptídicas. Las proteínas con más de una cadena polipeptídica a menudo se expresan como una cadena polipeptídica de un gen y se escinden postraduccionalmente. Por lo tanto, los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente. Los polipéptidos y proteínas como se usan en el presente documento incluyen proteínas sintetizadas químicamente así como proteínas sintetizadas de forma natural que están codificadas por genes. Los polipéptidos o proteínas pueden obtenerse de una fuente natural, tal como la sangre humana, o se producirán en cultivos celulares como proteínas recombinantes.

La expresión "proteína terapéutica" como se usa en el presente documento se refiere a proteínas o polipéptidos con un efecto terapéutico, es decir, proteínas usadas como principio farmacéutico activo.

De acuerdo con la invención los términos y expresiones "precursor de proteína", "pro-proteína" o "propéptido", se refieren a una proteína (o péptido) inactiva que puede convertirse en una forma activa mediante modificación postraduccional, escisión enzimática de una parte de la secuencia de aminoácidos.

La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia". Para los fines de la presente invención, el grado de la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementó en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et a/., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle marcado como "identidad más larga" (obtenida usando la opción no brief) se usa como porcentaje de identidad y se calcula como sigue:

(Restos idénticos x 100)/(Longitud de alineación - Número total de huecos en la alineación).

Para los fines de la presente invención, el grado de la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, citado anteriormente) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et a/., 2000, citado anteriormente), preferentemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle marcado "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula como sigue: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud de alineación - Número total de huecos en la alineación)

Los términos "similitud" y "similar" como se usan en el presente documento con respecto a la definición de un péptido o polinucleótido se refieren a un grado específico de identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos con una referencia. Se considera que una secuencia de aminoácidos similar incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o incluso el 99 % idéntica a la secuencia objeto. Normalmente, las secuencias similares incluirán los mismos restos en posiciones que son relevantes para la función del péptido o polinucleótido, tales como los restos del sitio activo o los aminoácidos glucosilados, sin embargo, aunque pueden incluir cualquier número de sustituciones de aminoácidos conservativas. Se considera que una secuencia de nucleótidos similar incluye una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o incluso el 99 % idéntica a la secuencia objeto.

"Idéntico" como se usa en el presente documento se refiere a una identidad de secuencia de aminoácidos o nucleótidos con una secuencia de referencia del 100 %.

El término "recombinante" cuando se usa en referencia a una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector, indica que la célula, el ácido nucleico, la proteína o el vector se han modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogo o la alteración de un ácido nucleico o proteína natural, o que la célula se ha derivado de una célula modificada de esta forma. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos en niveles diferentes o en condiciones diferentes a las que se encuentran en la naturaleza.

El término "semivida" como se usa en el presente documento es el tiempo requerido para que la concentración en plasma/sangre disminuya en un 50 % después de alcanzar el pseudo-equilibrio de distribución (de acuerdo con la definición en Toutain et al., 2005). El término "semivida" también se conoce como "semivida circulatoria", "semivida terminal" o "semivida de eliminación".

Como se usa en el presente documento, los términos "transformada", "transformada de forma estable", y "transgénica", usados con referencia a una célula significa que la célula contiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (por ejemplo, heteróloga) integrada en su genoma o transportada como un episoma que se mantiene a lo largo de múltiples generaciones.

El término "fragmento" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción aminoterminal y/o carboxiterminal de uno o más aminoácidos en comparación con la proteína nativa o de tipo silvestre pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las correspondientes posiciones en la secuencia de aminoácidos deducida de un ADNc de longitud completa. Los fragmentos tienen normalmente una longitud de al menos 50 aminoácidos.

El término "glucosilación" como se usa en el presente documento se refiere a la unión de glucanos a moléculas, por ejemplo, a las proteínas. La glucosilación puede ser una reacción enzimática. La unión formada puede ser a través de enlaces covalentes. En consecuencia, un polipéptido glucosilado como se usa en el presente documento es un polipéptido al que se unen uno o múltiples glucanos. La expresión "altamente glucosilada" se refiere a una molécula como una enzima que está glucosilada en todos o casi todos los sitios de glucosilación disponibles, por ejemplo, sitios de glucosilación unidos en O o unidos en N.

El término "glucano" como se usa en el presente documento se refiere a un polisacárido u oligosacárido o a la sección de carbohidrato de una glucoproteína o polipéptido glucosilado. Los glucanos pueden ser homo o heteropolímeros de restos de monosacáridos. Pueden ser moléculas lineales o ramificadas. Los glucanos suelen contener al menos tres azúcares y pueden ser lineales o ramificados. Un glucano puede incluir restos de azúcar natural (por ejemplo, glucosa, N-acetilglucosamina, ácido N-acetil neuramínico, N-acetilgalactosamina, galactosa, manosa, fucosa, arabinosa, ribosa, xilosa, etc.) y/o azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, 2'-desoxirribosa, fosfomanosa, 6'-sulfo-N-acetilglucosamina, etc.).

El término "O-glucanos" como se usa en el presente documento se refiere a glucanos que generalmente se encuentran unidos covalentemente a restos de serina y treonina de glucoproteínas de mamíferos. Los O-glucanos pueden tener un enlace a a través de un resto W-acetilgalactosamina (GalNAc) al -OH de serina o treonina por un enlace O-glucosídico. Otros enlaces incluyen O-fucosa unida en a, O-xilosa unida en p, O-manosa unida en a, O-GlcNAc (W-acetil-glucosamina) unida en p, O-galactosa unida en a o p y glucanos de O-glucosa unida en a o p.

De acuerdo con la invención, las expresiones "grupo de O-glucosilación", "grupo de O-glucanos" y "grupo de aminoácidos O-glucosilados" se usan indistintamente y se refieren a dos o más de los aminoácidos O-glucosilados.

El término "sialilado" como se usa en el presente documento se refiere a moléculas en particular glucanos que han reaccionado con ácido siálico o sus derivados.

La expresión transicional "que comprende", que es sinónima de "que incluye", "que contiene", o "caracterizado por", es inclusiva o abierta y no excluye elementos o etapas de métodos adicionales, no recitados. La expresión transicional "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicación, salvo las habituales impurezas asociadas a los mismos. Cuando aparece la expresión "que consiste en" en una cláusula del cuerpo de una reivindicación, en lugar de seguir inmediatamente al preámbulo, solo limita el elemento expuesto en esa cláusula; otros elementos no se excluyen de la reivindicación en su conjunto. La expresión transicional "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados "y aquellos que no afectan materialmente a la característica o características básicas y novedosas" de la invención reivindicada. "Una reivindicación "consiste esencialmente en" ocupa un terreno medio entre las reivindicaciones cerradas que están escritas en un formato "que consiste en" y las reivindicaciones completamente abiertas que se presentan en un formato "que comprende"".

En el contexto de la invención, por razones prácticas, la expresión "proteína glucosilada" tal como la proteína de fusión se usa en forma singular. En general, en la práctica, las proteínas se producen en una composición de moléculas proteicas del mismo tipo. Sin embargo, en el caso de proteínas glucosiladas, la glucosilación no será idéntica en cada molécula de la composición. Por ejemplo, no todas las moléculas individuales de la composición pueden estar glucosiladas al 100 %. Por otra parte, pueden surgir diferencias en los glucanos unidos en un sitio de O-glucosilación específico. En consecuencia, en la presente solicitud, una referencia a la "proteína de fusión" también se refiere a una composición de moléculas de proteína de fusión con secuencias de aminoácidos idénticas pero variaciones en la estructura de O-glucano.

Los términos y expresiones "afinidad de unión" o "afinidad" como se usan en este documento indican la fuerza de la unión entre dos moléculas, en particular un ligando y una proteína diana. Las afinidades de unión están influenciadas por interacciones intermoleculares no covalentes entre las dos moléculas tales como los enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, interacciones hidrófobas y fuerzas de van der Waals.

Una respuesta inmunitaria como se usa en el presente documento se refiere a una respuesta inmunitaria innata o adaptativa. La respuesta inmunitaria innata se refiere a mecanismos de defensa no específicos que se activan inmediatamente o a las pocas horas de la aparición de un antígeno en el organismo. Estos mecanismos incluyen barreras físicas como la piel, sustancias químicas en la sangre y células del sistema inmunitario que atacan células extrañas en el cuerpo. La respuesta inmunitaria innata se activa por las propiedades químicas del antígeno. La respuesta inmunitaria adaptativa se refiere a la respuesta inmunitaria específica de antígeno. Para ello, el antígeno primero debe procesarse y reconocerse. Una vez que se ha reconocido un antígeno, el sistema inmunitario adaptativo crea una gran cantidad de células inmunitarias diseñadas específicamente para atacar ese antígeno.

Proteína de fusión

De acuerdo con un primer aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína principal y al menos un péptido de extensión, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína principal es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de una proteína de mamífero o un fragmento de la misma y dicho péptido o péptidos de extensión con una longitud de no más de 100 aminoácidos comprende o comprenden un grupo de aminoácidos O-glucosilados con al menos dos aminoácidos O-glucosilados y tiene o tienen una identidad de secuencia de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 1 y en donde la proteína de fusión tiene una semivida aumentada en comparación con la proteína principal sin péptido o péptidos de extensión.

Los inventores han identificado una modificación de las proteínas que conduce a un aumento de la semivida, a saber, la adición de un péptido de extensión que contiene un grupo de aminoácidos O-glucosilados. Como se muestra en los ejemplos, la fusión del grupo 1 de glucosilación O del ^vW ^f humano como péptido de extensión a un fragmento de VWF conduce a una proteína de fusión (OCTA 12) con una semivida aumentada en comparación con el fragmento de VWF (OCTA 11) solo.

La semivida (t-io) puede calcularse mediante un análisis de regresión lineal de la parte logarítmica lineal de las curvas individuales de concentración en plasma-tiempo o mediante una regresión no lineal usando un modelo de decaimiento exponencial de una fase. Los programas ilustrativos de software para cálculo son GraphPad Prism versión 6.07 (La Jolla, CA 92037 EE.UU.) y WinNonlin, versión 6.4 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, EE.UU.).

Los cálculos se basan en las siguientes ecuaciones:

_{t i= —} ln 2 r _h un

2 Ke,

de r1

^— = Kd*c [h]

dt

Kei = constante de velocidad de eliminación

t i ^/2 = semivida de eliminación

c = concentración

t = tiempo

Por lo tanto, de acuerdo con una realización, la proteína de fusión tiene una semivida aumentada en comparación con la proteína principal sin péptido de extensión.

De acuerdo con la presente invención, dos o más aminoácidos O-glucosilados muy próximos a la secuencia de aminoácidos se consideran como un grupo. Por lo tanto, el grupo de aminoácidos O-glucosilados del al menos un péptido de extensión contiene al menos dos aminoácidos O-glucosilados. El grupo puede contener, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos O-glucosilados.

De acuerdo con la teoría, el efecto de extensión de la semivida se basa en la carga negativa de los O-glucanos. Por lo tanto, el efecto de la prolongación de la semivida debería aumentar con el número de aminoácidos O-glucosilados en el grupo. Por lo tanto, el grupo contiene preferentemente al menos tres aminoácidos O-glucosilados. Como se muestra en los Ejemplos, se logró un efecto de propagación de semivida significativo con un péptido de extensión con un grupo de cuatro aminoácidos O-glucosilados. Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferida, el grupo contiene al menos cuatro aminoácidos O-glucosilados.

Además de los aminoácidos O-glucosilados de un grupo, también pueden estar presentes aminoácidos N-glucosilados. Preferentemente, no hay aminoácidos N-glucosilados en el grupo de O-glucosilación.

En caso de que esté presente más de un péptido de extensión, los grupos de péptidos de extensión pueden tener diferentes números de aminoácidos O-glucosilados. Por ejemplo, la proteína de fusión puede contener un grupo con dos y un segundo grupo con cuatro aminoácidos O-glucosilados. Adicionalmente, un grupo puede contener tres sitios de O-glucosilación y el otro cuatro sitios de O-glucosilación.

Los aminoácidos O-glucosilados del péptido de extensión pueden ser los aminoácidos O-glucosilados de tipo mucina serina (Ser) y treonina (Thr). Sin embargo, también la tirosina O-glucosilada (Tyr), la hidroxilisina (Hidroxi-Lys) o la hidroxiprolina (Hidroxi-Pro) se conocen en la técnica. Por lo tanto, el uno o más aminoácidos O-glucosilados en la proteína de fusión, en particular en el péptido de extensión, puede seleccionarse de Ser, Thr, Tyr, Hidroxi-Lys e Hidroxi-Pro.

El péptido de extensión se fusionó con el fragmento VWF en OCTA 12, lo que conduce a una prolongación de la semivida de dicho fragmento, contiene tanto restos de treonina como restos de serina O-glucosilados. Por lo tanto, de acuerdo con una realización del primer aspecto, el grupo de aminoácidos O-glucosilados contiene al menos una treonina O-glucosilada. Preferentemente, dicho grupo contiene tanto una treonina como una serina como aminoácidos O-glucosilados. De forma interesante, el péptido de extensión de OCTA 12 contiene dos restos de treonina vecinales que están O-glucosilados. Por lo tanto, en una realización, el péptido de extensión contiene al menos dos restos de treonina O-glucosilada vecinales.

Como se ha explicado anteriormente, se cree que la carga negativa de la superficie de la proteína generada por los O-glucanos conduce a la prolongación de la semivida. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que para la manifestación del efecto se necesitan dos o más O-glucanos en estrecha proximidad. Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferida, uno o más grupos contienen al menos un sitio de glucosilación en 8 aminoácidos.

La longitud del péptido de extensión se define por dos aspectos diferentes. El péptido de extensión debe ser lo suficientemente largo para contener los sitios de reconocimiento que facilitan la glucosilación de los aminoácidos O-glucosilados. Por otro lado, cuanto más corto es el péptido de extensión, menos probable es que interfiera con la integridad o actividad estructural y, por lo tanto, con el efecto terapéutico de la proteína principal. Por lo tanto, el péptido de extensión no excede los 100 aminoácidos. Para permitir que cuatro aminoácidos estén O-glucosilados dentro del péptido de extensión, la longitud está preferentemente en el intervalo de 22 a 40 aminoácidos. Preferentemente, la longitud del péptido de extensión es aproximadamente la longitud de los péptidos de extensión en OCTA 12, es decir, en el intervalo de 26 a 36 aminoácidos. De acuerdo con una realización, uno o más péptidos de extensión tienen una longitud de aproximadamente 31 aminoácidos.

Los resultados presentados hacen creíble que el péptido de extensión, en analogía con el CTP, puede aumentar la semivida de otras proteínas, es decir, de proteínas en general.

El péptido o péptidos de extensión tienen una identidad de secuencia con el grupo 2 de O-glucosilación de VWF (aminoácidos 1238-1268 de SEQ ID NO: 2): QEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLH (SEQ ID NO: 1) o una variante del mismo de al menos el 90 %. La identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 es preferentemente de al menos el 95 %. Más preferentemente, la identidad de secuencia del péptido de extensión con SEQ ID NO: 1 es de al menos el 98 %. Lo más preferentemente, el uno o más péptidos de extensión tienen una identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 del 100 %.

La proteína principal se basa en una proteína de mamífero, es decir, contiene una secuencia de aminoácidos similar o idéntica a una proteína de mamífero o fragmento de la misma. La proteína de mamífero es en particular una proteína humana.

La proteína de mamífero a la que la secuencia de aminoácidos de la proteína principal es similar o idéntica, puede ser una proteína glucosilada. De acuerdo con una realización de la proteína de fusión, la proteína principal comprende una sección glucosilada de la proteína de mamífero. De acuerdo con otra realización, la proteína principal comprende al menos un grupo de aminoácidos O-glucosilados. Este grupo de aminoácidos O-glucosilados puede ser idéntico al grupo de aminoácidos O-glucosilados en el péptido de extensión.

La proteína de mamífero, en la que se basa la proteína principal, es más preferentemente una proteína de la sangre. De acuerdo con una realización, la proteína de mamífero es una proteína de sangre humana.

La proteína de la sangre de mamífero puede ser un factor de coagulación de la sangre, una proteína transportadora, un inhibidor de proteasas, una inmunoglobulina, una proteína plasmática relacionada con la célula, una apolipoproteína, un factor del complemento, un factor de crecimiento, una proteína antiangiogénica, una proteína altamente glucosilada, un factor sanguíneo u otra proteína sanguínea.

El factor de coagulación de la sangre, en particular, el factor de coagulación de la sangre humana, se selecciona preferentemente del grupo que consiste en fibrinógeno (FI), protrombina (Fll), factor tisular (FiII), FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII, VWF y ADAMTS13.

Se aprecia que los factores de coagulación Fl, Fll, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII pueden estar en una forma no activa o una activada. Por lo tanto, en el contexto de la invención, una referencia a Fl, Fll, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII incluye las formas activadas Fla (fibrina), Flla (trombina), , FVa, FIXa, FVIIa, FVIIIa, FXa, FXIa, FXIIa y FXIIIa, respectivamente, a menos que se indique explícitamente lo contrario o a partir del contexto, la forma activada esté excluida de forma lógica. Por lo tanto, por ejemplo, en este contexto, Fl, Fll, FV, FIX, FVII, FVIII, FX, FXI, FXII y FXIII pueden leerse como Fl/Fla, Fll/Flla, , FV/FVa, FVII/FVIIa, FVIII/FVIIIa, FIX/FXIa, FX/FXa, FXI/FXIa, FXII/FXIIa y FXIII/FXIIIa.

La proteína de transporte, en particular, la proteína de transporte humana, puede seleccionarse de albúmina, transferrina, ceruloplasmina, haptoglobina, hemoglobina y hemopexina.

De acuerdo con una realización la proteína de mamífero es un inhibidor de proteasa, en particular, un inhibidor de la proteasa humana. Son ejemplos de tales inhibidores de la proteasa p-antitrombina, a-antitrombina, antitrombina prelatente, antitrombina oxidada, 2-macroglobulina, inhibidor de C1, inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI), cofactor II de la heparina, inhibidor de la proteína C (PAI-3), Proteína C, Proteína S y Proteína Z.

Son ejemplos de inmunoglobulinas tales como anticuerpos policlonales (IgG), anticuerpos monoclonales, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, lgA1, lgA2, IgM, IgE, IgD y proteína de Bence Jones.

La proteína plasmática relacionada con la célula puede ser, por ejemplo, fibronectina, tromboglobulina o factor plaquetario 4. Son ejemplos de apolipoproteínas apo A-l, apo A-ll y apo E.

Los factores del complemento de acuerdo con la invención son, por ejemplo, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I, Inactivador de C3b, properdina, proteína de unión a C4, etc.

Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), Factor de crecimiento epidérmico (EGF), Factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), Factor de crecimiento transformante p (TGF-p), Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).

Las proteínas antiangiogénicas incluyen antitrombina latente, antitrombina prelatente, antitrombina oxidada y plasminógeno.

Son ejemplos de proteínas altamente glucosiladas alfa-1-glucoproteína ácida, antiquimotripsina, inhibidor de la inter-a-tripsina, glucoproteína a-2-HS, Proteína C-reactiva, Los factores sanguíneos pueden ser, por ejemplo, eritropoyetina, interferón, factores tumorales, tPA o gCSF.

Otras proteínas de la sangre humana incluyen glucoproteína rica en histidina, lectina de unión a manano, proteína de unión a C4, fibronectina, GC-globulina, plasminógeno/plasmina, a-1-microglobulina, proteína C-reactiva.

La proteína de mamífero se selecciona en particular de VWF, fibrinógeno, protrombina, Fill, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII, ADAMTS13, antitrombina, alfa-1 antitripsina, inhibidor de C1, antiquimotripsina, PAI-1, PAI-3, 2-macroglobulina, TFPI, cofactor II de la heparina, Proteína Z, Proteína C y Proteína S humanos.

El factor VIII en humanos está codificado por el gen F8 que comprende 187.000 pares de bases en seis exones. El ARNm transcrito tiene una longitud de 9.029 pares de bases y se traduce a una proteína con 2.351 aminoácidos de la que se extraen 19 aminoácidos. La molécula de FVIII en seres humanos está glucosilada en 31 aminoácidos, con 25 N-glucosilaciones y 6 O-glucosilaciones (véase Kannicht et al., 2013).

Después de la traducción, la cadena de aminoácidos se escinde por proteasas específicas en posiciones que conducen a la formación de una cadena pesada con aproximadamente 200 kDa y una cadena ligera con aproximadamente 80 kDa. La organización del dominio se caracteriza normalmente como A1-A2-B-A3-C1-C2. La cadena ligera está formada por los dominios A3-C1-C2. La cadena pesada está compuesta principalmente por los dominios A1-A2-B. Las cadenas pesadas que se encuentran en el plasma tienen una composición heterogénea con pesos moleculares que varían de 90 a 200 kDa. Las razones de esto son la heterogeneidad en su glucosilación, la existencia de variantes de corte y empalme y la existencia de productos proteolíticos tales como la cadena pesada A1-A2 agotada en el dominio B. La secuencia de aminoácidos del FVIII de longitud completa se identifica por los aminoácidos 20 a 2.351 de P00451 de UniProtKB, secuencia versión 1 del 21 de julio de 1986 (en lo siguiente UniProtKB P00451.1).

De acuerdo con una realización la proteína de mamífero, a la que la proteína principal es similar o idéntica, es FVIII humano de longitud completa identificado por los aminoácidos 20 a 2.351 de UniProtKB P00451.1. De acuerdo con otra realización la proteína principal es FVIII, en el cual que falta al menos parte del dominio B. En este sentido, puede faltar todo el dominio B. La parte que falta del dominio B se reemplaza opcionalmente por un enlazador. La secuencia enlazadora tiene en particular la siguiente secuencia de aminoácidos s Fs QNSRHQa Yr YRRG (SEQ ID NO: 12). Un ejemplo de un FVIII en el que el dominio B se reemplaza por un enlazador, es Simoctocog alfa, el principio activo de Nuwiq® o Vihuma®. Simoctocog alfa tiene la siguiente secuencia:

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGP

TIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMA

SDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDA

ASARAWPKMHTVNGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTA

QTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQ

IRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQH

ESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVE

DGPTKSDPRCLTRYYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQ

RFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYED

TLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR

SFSQNSRHQAYRYRRGEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERL

WDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQAS

RPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGP

LLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDT

LPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLI

GEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLL

APMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIR

LHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQW

NPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVWSLD

PPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY (SEQ ID NO: 13)

VWF es una glucoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma de los mamíferos, que tiene múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasia primaria, el VWF actúa como mediador entre receptores específicos en la superficie plaquetaria y componentes de la matriz extracelular como el colágeno. Por otra parte, VWF sirve como un vehículo y una proteína estabilizadora del factor VIII procoagulante. VWF se sintetiza en células endoteliales y megacariocitos como una molécula precursora de 2813 aminoácidos.

La organización del dominio de VWF se caracteriza normalmente como Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-CK.

El polipéptido precursor, pre-pro-VWF, consiste en un péptido señal de 22 restos, en un pro-péptido de 741 restos (dominios D1-D2) y en el polipéptido de 2050 restos que se encuentra en el Factor de Von Willebrand de plasma maduro (Fischer et al., 1994). El VWF de longitud completa se identifica mediante la entrada P04275 de UniprotKB (versión de entrada 224 del 12 de abril de 2017).

El VWF humano de acuerdo con la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias dichas UniprotKB P04275, en particular SEQ ID NO: 2 (isoforma 1). VWF contiene dos grupos de aminoácidos O-glucosilados. El primer grupo de aminoácidos O-glucosilados se encuentra entre los aminoácidos 1238 a 1268 de SEQ ID NO: 2. El segundo grupo incluye los aminoácidos 1468 a 1487 de SEQ ID NO: 2.

Tras la secreción en plasma, el VWF circula en forma de diversas especies con diferentes tamaños moleculares. Estas moléculas de VWF consisten en oligo y multímeros de la subunidad madura de 2050 restos de aminoácidos. El VWF generalmente puede encontrarse en plasma como multímeros que varían en tamaño de aproximadamente 500 a 20.000 kDa (Furlan et al., 1996).

De acuerdo con una realización, la proteína principal tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica o similar a la secuencia del VWF maduro humano.

De acuerdo con otra realización, la proteína principal tiene una secuencia de aminoácidos que es similar o idéntica a la secuencia de un fragmento de VWF humano.

Por ejemplo, en el fragmento de VWF humano uno o más de los dominios A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, CK puede faltar con respecto al VWF maduro humano (Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-CK). El fragmento del fragmento VWF puede, por ejemplo, tener una organización de dominio seleccionada del siguiente grupo que consiste en Til3-D3-TIL4-A1, Til3-D3-TIL4-A1-A2, Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3, Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4, Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4-C1, Til3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4-C1-C2 y Ti I3-D3-TIL4-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-CK.

A este respecto, el fragmento de VWF humano es en particular un fragmento que comienza con el aminoácido 764 de SEQ ID NO: 2. Los aminoácidos 764 a 1035 de SEQ ID NO: 2 comprenden el dominio de unión a FVIII de VWF.

La proteína principal puede contener, por ejemplo, un fragmento de VWF como se define en el documento WO 2015/185758 A2. Como se muestra en el documento WO 2015/185758 A2, el complejo de FVIII y los fragmentos de VWF tal como se definen en el mismo muestran una unión reducida a las membranas de fosfolípidos en comparación con el FVIII solo, así como una unión reducida al colágeno III y la heparina en comparación con el complejo de FVIII y el VWF de longitud completa.

El fragmento de VWF que preferentemente comienza con el aminoácido 764 de SEQ ID NO: 2 preferentemente termina con un aminoácido de SEQ ID NO: 2 en el intervalo de 1905 a 2153. De acuerdo con una realización el fragmento de VWF termina con un aminoácido de VWF en el intervalo de 2030 a 2153 de SEQ ID NO: 2. De acuerdo con una realización adicional el fragmento de VWF termina con un aminoácido de SEQ ID NO: 2 en el intervalo de 2100 a 2153.

De acuerdo con una realización la proteína principal tiene una secuencia de aminoácidos que es similar o idéntica a los aminoácidos 764 a 1268 de SEQ ID NO: 2. De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la principal tiene una identidad de al menos el 90%, con los aminoácidos 764 a 1268 de SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de la proteína principal también puede tener una identidad de al menos el 95 % con los aminoácidos 764 a 1268 de SEQ ⁱD NO: 2. Adicionalmente, la identidad con los aminoácidos 764 a 1268 de SEQ ID NO: 2 de la secuencia de aminoácidos de la proteína principal puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína principal puede tener una identidad con los aminoácidos 764 a 1268 de SEQ ID NO: 2 del 100 %.

De acuerdo con una realización la proteína principal tiene una secuencia de aminoácidos que es similar o idéntica a los aminoácidos 764 a 1905 de SEQ iD NO: 2. De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la principal tiene una identidad de al menos el 90%, con los aminoácidos 764 a 1905 de SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de la proteína principal también puede tener una identidad de al menos el 95 % con los aminoácidos 764 a 1905 de SEQ iD NO: 2. Adicionalmente, la identidad con los aminoácidos 764 a 1905 de SEQ ID NO: 2 de la secuencia de aminoácidos de la proteína principal puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína principal puede tener una identidad con los aminoácidos 764 a 1905 de SEQ ID NO: 2 del 100 %.

La proteína de fusión puede contener cualquier número de péptidos de extensión, tal como uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez péptidos de extensión. La proteína de fusión OCTA 12 contiene dos copias del péptido de extensión y exhibe un aumento significativo en la semivida en comparación con el fragmento de VWF OCTA 11. Por lo tanto, de acuerdo con una realización la proteína de fusión contiene al menos dos péptidos de extensión.

Actualmente se entiende que el efecto de prolongación de la semivida se basa al menos parcialmente en la carga negativa de los O-glucanos del péptido de extensión. Por lo tanto, un aumento en el número de copias del péptido de extensión conduce a un mayor aumento del efecto de prolongación de la semivida. Esto se confirma mediante OCTA 14, que contiene cuatro copias del péptido de extensión. Por lo tanto, de acuerdo con una realización la proteína de fusión contiene al menos cuatro péptidos de extensión.

Por otro lado, con el número de copia del péptido de extensión, aumenta la posibilidad de que los péptidos de extensión interfieran con la integridad estructural o la actividad y, por lo tanto, el efecto terapéutico de la proteína principal. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, el número de péptidos de extensión está por debajo de 11.

La proteína de fusión puede comprender componentes peptídicos adicionales además de la proteína principal y los péptidos de extensión. En particular, además del péptido de extensión de acuerdo con la invención la proteína de fusión puede contener otros péptidos para la prolongación de la semivida, tales como CTP, XTEN, transferrina o fragmentos de la misma, albúmina o fragmentos de la misma.

También es posible que la proteína principal sea un fragmento de una proteína de mamífero y la proteína de fusión contenga un fragmento adicional de la misma proteína de mamífero. En particular, los dos fragmentos están separados por uno o más péptidos de extensión. Un ejemplo de una proteína tal es OCTA 15, que contiene los aminoácidos 764 a 1268 de VWF, dos péptidos de extensión con la secuencia SEQ ID NO: 1 y el "dominio de nudo de cisteína" de VWF que consiste en los aminoácidos 2721 a 2813 de SEQ ID NO: 2.

En la proteína de fusión, uno o más péptidos de extensión pueden unirse al extremo N o al extremo C de la proteína principal. Específicamente, la proteína de fusión puede contener uno o más péptidos de extensión unidos al extremo N-terminal y uno o más péptidos de extensión unidos al extremo C-terminal de la proteína principal.

Como la proteína de fusión puede contener péptidos adicionales además de la proteína principal y uno o más péptidos de extensión. En consecuencia, los péptidos de extensión pueden estar unidos directa o indirectamente a la proteína principal. En este sentido, "directamente unido" significa que las secuencias de aminoácidos de la proteína principal y un péptido de extensión son directamente adyacentes. "Unido indirectamente" significa que entre la proteína principal y el péptido de extensión se encuentra otro péptido. En particular, un péptido enlazador podría ubicarse entre la proteína principal y el péptido de extensión. El enlazador puede contener un sitio de escisión, haciendo que el péptido de extensión pueda escindirse de la proteína principal.

La proteína principal, el uno o más péptidos de extensión y, opcionalmente, los péptidos adicionales pueden producirse mediante la unión de los genes, ADNc o secuencias que los codifican. En consecuencia, la proteína principal, el uno o más péptidos de extensión y, opcionalmente, los péptidos adicionales están unidos por enlaces peptídicos. De acuerdo con la invención, los péptidos de la proteína de fusión pueden estar en cambio conectados a través de otros enlazadores tales como enlazadores químicos o enlaces glucosídicos. Preferentemente, los péptidos de la proteína de fusión están conectados por enlaces peptídicos.

De acuerdo con una realización, un péptido de extensión se une directamente al extremo C-terminal de la proteína principal. En particular, la proteína de fusión contiene al menos dos péptidos de extensión consecutivos unidos al extremo C de la proteína principal.

La proteína de fusión puede estar unida a dos o más etiquetas de afinidad. Son ejemplos de etiquetas de afinidad polihistidina, proteína A, glutatión S transferasa, sustancia P, FLAG, estreptavidina y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Aunque la etiqueta de afinidad generalmente forma parte de la secuencia de aminoácidos de la construcción completa, la etiqueta de afinidad no se considera parte de la proteína de fusión. La una o más etiquetas de afinidad están preferentemente unidas al extremo C-terminal o al extremo N-terminal de la proteína de fusión. En caso de que la proteína de fusión esté unida a una o más etiquetas de afinidad, la proteína de fusión preferentemente contiene un sitio de escisión entre la etiqueta de afinidad y el resto de la proteína que hace que la etiqueta de afinidad se pueda escindir, por ejemplo por escisión de proteasa.

De acuerdo con una realización, un péptido de extensión forma el extremo N de la proteína de fusión. Como se explicó anteriormente el aminoácido N-terminal de dicho péptido de extensión está opcionalmente unido a una etiqueta de afinidad. De acuerdo con una realización, un péptido de extensión forma el extremo C de la proteína de fusión. Como se explicó anteriormente el aminoácido C-terminal de dicho péptido de extensión está opcionalmente unido a una etiqueta de afinidad.

De acuerdo con una realización, la proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de fusión comprende al menos 4, preferentemente al menos 8, más preferentemente al menos 12 O-glucanos adicionales en comparación con la proteína principal.

De acuerdo con una realización la proteína de fusión comprende un dominio de dimerización; en particular la proteína principal comprende un dominio de dimerización. En VWF, los dímeros se forman por la unión de los dominios CK. Por lo tanto, en caso de que la proteína principal sea un fragmento de VWF, preferentemente comprende el dominio CK.

Una proteína de fusión representativa de acuerdo con la invención es OCTA 12. OCTA 12 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYA

PGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGN KGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDETHFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLK QTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSS CRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEER NLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFA SGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDA PVS PTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVS PTTLYVEDISEPPLH

OCTA 12 es una proteína de fusión del fragmento de VWF de los aminoácidos 764 a 1268 de SEQ ID NO: 2 y dos copias de un péptido de extensión (negrita) unido al extremo C que consiste en los aminoácidos 1238 a 1268 de SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95 % con SEQ ID NO: 3. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID NO: 3 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 3 del 100 %.

La siguiente secuencia (SEQ ID NO: 4) representa OCTA 12 con un péptido señal de 12 aminoácidos adicional (negrita y subrayado). Una expresión de este péptido proporciona una forma monomérica de OCTA 12. El péptido señal se escinde.

MIPARFAGVLLALALILPGTLCSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMV RHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGEC QYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDETHFEWESGRYII LLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKV PLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVC AQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDE LLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYV EDI SEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDI SEPPLH

(SEQ ID NO: 4)

De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95 % con SEQ ID NO: 4. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID NO: 4 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 4 del 100 %.

Una proteína de fusión representativa adicional de acuerdo con la invención es Pro-OCTA 12 que incluye OCTA 12 y un propéptido (negrita) con un péptido señal (negrita y subrayado). Pro-OCTA 12 se identifica por SEQ ID NO: 5:

MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSMYSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIG DFQNGKRVSLSVYLGEFFD1HLFVNGTVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQV LLSDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWCERASPPSSSCNISSGEMQKGLW EQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALCEKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCP AGMEYRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPCVHSGKRYPPGTSLSRDCNTC ICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFDNRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSV TVRLPGLHNSLVKLKHGAGVAMDGQDVQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQMDWDGRGRLLVKLSPVYAG KTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFGNAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTF EACHRAVSPLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCELNCPKGQVYLQCGTPCN LTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGDCVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTM SGVPGSLLPDAVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGM VRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGE CQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEWESGRYI ILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRK VPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHV CAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILD ELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPGGLWPPTDAPVSPTTLY VEDI SEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDI SEPPLH

(SEQ ID NO: 5)

La expresión de Pro-OCTA 12 da como resultado la formación de dímeros. Los dímeros peptídicos permanecen después de la escisión del propéptido.

De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 %, con SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95 % con SEQ ID NO: 5. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID NO: 5 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 5 del 100 %.

Una proteína de fusión representativa adicional de acuerdo con la invención es OCTA 14. OCTA 14 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYA

PGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGN

KGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDETHFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLK

QTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSS

CRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEER

NLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFA

SGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVWLTCEACQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDA

PVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDI

SEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLH (SEQ ID NO: 6)

OCTA 14 es una proteína de fusión del fragmento de VWF de los aminoácidos 764 a 1268 de SEQ ID NO: 2 y cuatro copias de un péptido de extensión (negrita) unido al extremo C que consiste en los aminoácidos 1238 a 1268 de SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 6. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95 % con SEQ ID NO: 6. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID NO: 6 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 6 del 100 %.

La siguiente secuencia (SEQ ID NO: 7) representa OCTA 14 con un péptido señal de 12 aminoácidos adicional (negrita y subrayado). Una expresión de este péptido proporciona una forma monomérica de OCTA 14. El péptido señal se escinde.

MIPARFAGVLLALALILPGTLCSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMV

RHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGEC

QYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDETHFEWESGRYII

LLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKV

PLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVC

AQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDE

LLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYV

EDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEP

GGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLH(SEQ ID NO: 7)

De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 7. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95 % con SEQ ID NO: 7. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID NO: 7 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 7 del 100 %.

Una proteína de fusión representativa adicional de acuerdo con la invención es Pro-OCTA 14 que incluye OCTA 14 y un propéptido (negrita) con un péptido señal (negrita y subrayado). Pro-OCTA 14 se identifica por SEQ ID NO: 8:

LLSDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWCERASPPSSSCNISSGEMQKGLW EQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALCEKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCP AGMEYRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPCVHSGKRYPPGTSLSRDCNTC ICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFDNRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSV TVRLPGLHNSLVKLKHGAGVAMDGQDVQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQMDWDGRGRLLVKLSPVYAG KTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFGNAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTF EACHRAVSPLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCELNCPKGQVYLQCGTPCN LTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGDCVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTM SGVPGSLLPDAVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGM VRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGE CQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDETHFEWESGRYI ILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRK VPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHV CAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILD ELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPGGLWPPTDAPVSPTTLY VEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQE PGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLH (SEQ ID NO:

8⁾

De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 8. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95 % con SEQ ID NO: 8. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID NO: 8 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 8 del 100 %.

Una proteína de fusión representativa adicional de acuerdo con la invención es OCTA 15. OCTA 15 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYA PGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGN KGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLK QTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSS CRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEER NLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFA SGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDA PVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVPTTLYVEDISEPPLHEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEVEV DIHYCQGKCASKAMYSIDINDVQDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSWYHEVLNAMECKCSPRKCSK (SEQ ID NO: 9)

OCTA 15 es una proteína de fusión del fragmento VWF de los aminoácidos 764 a 1268 de SEQ ID NO: 2, dos copias de un péptido de extensión (negrita) unido al extremo C que consiste en los aminoácidos 1238 a 1268 de SEQ ID NO: 2 y el "dominio de nudo de cisterna" de VWF que consiste en los aminoácidos 2721 a 2813 de SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 9. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95 % con SEQ ID NO: 9. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID NO: 9 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 9 del 100 %.

La siguiente secuencia (SEQ ID NO: 10) representa OCTA 15 con un péptido señal de 12 aminoácidos adicional (negrita y subrayado). Una expresión de este péptido proporciona una forma dimérica de OCTA 15. El péptido señal se escinde.

MIPARFAGVLLALALILPGTLCSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMV

RHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGEC

QYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDETHFEWESGRYII

LLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKV

PLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVC

AQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDE

LLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVWLTCEACQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYV

EDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVPTTLYVEDISEPPLHEEPE

CNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYCQGKCASKAMYSIDINDVQDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSWYHE

VLNAMECKCSPRKCSK (SEQ ID NO: 10)

De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 10. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95% con SEQ ID NO: 10. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID NO: 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 10 del 100 %.

Una proteína de fusión representativa adicional de acuerdo con la invención es Pro-OCTA 15 que incluye OCTA 15 y un propéptido (negrita) con un péptido señal (negrita y subrayado). La expresión de esta secuencia dará como resultado la formación de multímeros. Pro-OCTA 15 se identifica por SEQ ID NO: 11:

MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSMYSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIG

DFQNGKRVSLSVYLGEFFD1HLFVNGTVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQV

LLSDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWCERASPPSSSCNISSGEMQKGLW

EQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALCEKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCP

AGMEYRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPCVHSGKRYPPGTSLSRDCNTC

ICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFDNRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSV

TVRLPGLHNSLVKLKHGAGVAMDGQDVQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQMDWDGRGRLLVKLSPVYAG

KTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFGNAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTF

EACHRAVSPLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCELNCPKGQVYLQCGTPCN

LTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGDCVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTM

SGVPGSLLPDAVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGM

VRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGE

CQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEWESGRYI

ILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRK

VPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHV

CAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILD

ELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPGGLWPPTDAPVSPTTLY

VEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVPTTLYVEDISEPPLHEEP

ECNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYCQGKCASKAMYSIDINDVQDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSWYH

EVLNAMECKCSPRKCSK (SEQ ID NO: 11)

De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 11. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95% con SEQ ID NO: 11. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID ⁿ O: 11 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 11 del 100 %.

De acuerdo con una realización de la invención, la proteína de fusión es una proteína de FVIII modificada basada en Simoctocog alfa con dos o más copias del péptido de extensión.

En esta realización, la proteína principal es preferentemente idéntica o similar a la cadena pesada de FVIII, en particular a los aminoácidos 20 a 759 de UniprotKB P00451.1. La proteína de fusión con una proteína principal idéntica o similar a la cadena pesada del FVIII, en particular a los aminoácidos 20 a 759 de UniprotKB P00451.1, preferentemente contiene adicionalmente un enlazador similar o idéntico a SEQ ID NO: 12 y una secuencia de aminoácidos adicional similar o idéntica a la cadena ligera identificada por los aminoácidos 1668 a 2351 de la entrada P0045.1 de UniprotKB.

Los péptidos de extensión pueden fusionarse con el extremo C-terminal de la cadena ligera. Alternativamente, los péptidos de extensión se encuentran entre la cadena pesada y la cadena ligera. A este respecto, los péptidos de extensión pueden conectarse al extremo C o al extremo N del enlazador. Los péptidos de extensión también pueden reemplazar al enlazador. Por otra parte, la secuencia enlazadora puede estar interrumpida por uno o más péptidos de extensión. También es posible que los péptidos de extensión estén ubicados entre la cadena pesada y la ligera y en el extremo C-terminal de la cadena ligera.

Preferentemente, la proteína de fusión basada en Simoctocog alfa contiene, desde el extremo N hasta el extremo C, la cadena pesada de FVIII, una primera parte de un enlazador, dos o más, preferentemente tres péptidos de extensión (negrita), una segunda parte de un enlazador (subrayado y negrita) y la cadena ligera. Un ejemplo de una proteína tal es la proteína identificada por SEQ ID NO: 14:

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGP

TIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMA

SDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDA

ASARAWPKMHTWGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTA

QTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQ

IRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQH

ESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVE

DGPTKSDPRCLTRYYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQ

RFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYED

TLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR

SFSQNSRHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPG

GLWPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHRYRRGEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRS

FQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIR

AEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYF

SDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTF

KENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETV

EMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSIN

AWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSG

IKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKA

RLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKV

FQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY (SEQ ID NO: 14)

De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 14. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95% con SEQ ID NO: 14. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID NO: 14 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 14 del 100 %.

Alternativamente, la proteína de fusión basada en Simoctocog alfa contiene dos o más, preferentemente tres péptidos de extensión (negrita) conectados al extremo C de Simoctocog alfa. Un ejemplo de una proteína tal es la proteína identificada por SEQ ID NO: 21. De acuerdo con una realización la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 21. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión también puede tener una identidad de al menos el 95 % con SEQ ID NO: 21. Adicionalmente, la identidad con SEQ ID NO: 21 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede ser de al menos el 98 %. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión puede tener una identidad con la SEQ ID NO: 21 del 100 %.

Polinucleótido

De acuerdo con un segundo aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

El polinucleótido aislado puede ser una molécula de ADN o una molécula de ARN. El polinucleótido aislado es preferentemente una molécula de ADN, en particular una molécula de ADNc. Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un péptido se conocen en la técnica e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico, preparación a partir de ADNc o una combinación de los mismos. La clonación de los polinucleótidos a partir de dicho ADN genómico puede efectuarse, por ejemplo, mediante el uso de la conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la detección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas (véase, por ejemplo, Innis et al, 1990) PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Pueden usarse otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción activada por ligación (LAT) y la amplificación basada en polinucleótidos (NASBA).

En particular, la secuencia del polinucleótido aislado puede comprender una primera parte que codifica la proteína principal y al menos una segunda parte de secuencia. La primera parte es preferentemente similar o idéntica a la SEQ ID NO: 15. La primera parte tiene preferentemente un grado de identidad de secuencia SEQ ID NO: 15 de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %.

La al menos una segunda parte es preferentemente similar o idéntica a SEQ ID NO: 16. La segunda parte tiene preferentemente un grado de identidad de secuencia SEQ ID NO: 16 de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %.

El polinucleótido aislado puede ser una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión con una secuencia de aminoácidos similar o idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 21.

En particular, el polinucleótido aislado puede ser una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98%, lo más preferentemente el 100% con SEQ ID NO: 4. Alternativamente, el polinucleótido aislado puede ser una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %. Por otra parte, el polinucleótido aislado puede ser una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98 %, lo más preferentemente el 100 % con ^s E^q ID NO: 5. De acuerdo con una realización, el polinucleótido aislado es una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98 %, lo más preferentemente el 100 % con SEQ ID NO: 7. De acuerdo con una realización, el polinucleótido aislado es una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98%, lo más preferentemente el 100% con SEQ ID NO: 8. De acuerdo con una realización, el polinucleótido aislado es una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98%, lo más preferentemente el 100% con SEQ ID NO: 10. De acuerdo con una realización, el polinucleótido aislado es una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98%, lo más preferentemente el 100% con SEQ ID NO: 11. De acuerdo con una realización, el polinucleótido aislado es una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98%, lo más preferentemente el 100% con y SEQ ID NO: 14. De acuerdo con una realización, el polinucleótido aislado es una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98 %, lo más preferentemente el 100 % con y SEQ ID NO: 21.

El polinucleótido aislado puede ser una molécula de ADN con una secuencia similar o idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22.

De acuerdo con una realización, una cadena del polinucleótido aislado tiene una identidad de secuencia con SEQ ID NO: 17 de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %.

De acuerdo con una realización adicional, el polinucleótido aislado tiene una identidad de secuencia con SEQ ID NO: 18 de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %. De acuerdo con otra realización más, el polinucleótido aislado tiene una identidad de secuencia con SEQ ID NO: 19 de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %. De acuerdo con una realización, el polinucleótido aislado tiene una identidad de secuencia con SEQ ID NO: 20 de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %. De acuerdo con una realización, el polinucleótido aislado tiene una identidad de secuencia con SEQ ID NO: 20 de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %.

Lista de las secuencias de polinucleótidos:

ADN que codifica OCTA 11 (AA 1-1268 de SEQ ID NO: 2)

ADN que codifica el péptido de extensión (SEQ ID NO: 1)

ADN que codifica Pro-OCTA 12 (SEQ ID NO: 5)

ADN que codifica Pro-OCTA 14 (SEQ ID NO: 8)

ADN que codifica Pro-OCTA 15 (SEQ ID NO: 11)

ADN que codifica Simoctocog alfa con tres péptidos de extensión en la región enlazadora

(SEQ ID NO 14)

SEQ ID NO: 22 Secuencia de ADN que codifica Simoctocog alfa con tres péptidos de extensión C-terminales (SEQ ID NO: 21)

Vector de expresión

En un tercer aspecto la invención también se refiere a vectores de expresión que comprenden un polinucleótido de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.

El vector de expresión además comprende preferentemente elementos de control tales como un promotor y señales de parada transcripcionales y traduccionales. El polinucleótido de acuerdo con el segundo aspecto y los elementos de control pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido en dichos sitios. El polinucleótido puede insertarse en un vector de expresión apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se ubica en el vector de expresión de manera que la secuencia codificante esté unida operativamente a las secuencias de control adecuadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión del polinucleótido del cuarto aspecto de la invención. La elección del vector de expresión normalmente dependerá de la compatibilidad del vector de expresión con la célula hospedadora en la que ha de introducirse el vector de expresión. El vector de expresión puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.

El vector de expresión se adapta preferentemente a la expresión en células de mamífero. El vector de expresión puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. Para la replicación autónoma, el vector puede comprender adicionalmente un origen de replicación que permita al vector replicarse de manera autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie la replicación autónoma que actúa en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador plasmídico" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

El vector es preferentemente uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado. Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector de expresión puede basarse en cualquier otro elemento del vector de expresión para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una ubicación precisa en el cromosoma.

Los vectores de la presente invención contienen preferentemente uno o más (por ejemplo, varios) marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.

Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos para un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, citado anteriormente).

De acuerdo con una realización, la estructura principal del vector del vector de acuerdo con el tercer aspecto se selecciona de pCDNA3, pCDNA3.1, pCDNA4, pCDNA5, pCDNA6, pCEP4, pCEP-puro, pCET1019, pCMV, pEF1, pEF4, pEF5, pEF6, pExchange, pEXPR, plRES y pSCAS.

Célula hospedadora

De acuerdo con un cuarto aspecto la invención proporciona una célula hospedadora, que comprende el vector de expresión de acuerdo con el tercer aspecto de la invención. El vector de expresión de acuerdo con el tercer aspecto se introduce en una célula hospedadora de manera que el vector de expresión se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se describió anteriormente. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier descendencia de una célula precursora que no sea idéntica a la célula precursora debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula hospedadora en gran parte dependerá del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

De acuerdo con una realización la proteína de fusión se produce por expresión en una línea de células hospedadoras de mamífero. La proteína de fusión se produce preferentemente en una línea celular hospedadora humana. En general, cualquier línea celular hospedadora humana es adecuada para la expresión de la proteína de fusión. Una glucosilación favorable de la proteína de fusión se obtiene particularmente con líneas celulares de riñón humano. Las líneas celulares de riñón humano preferidas son las líneas celulares HEK, en particular líneas celulares HEK 293.

Los ejemplos de líneas celulares HEK para la producción del polipéptido glucosilado son HEK 293 F, Flp-ln™-293 (Invitrogen, R75007), 293 (ATCC® CRL-1573), 293 EBNA, 293 H (ThermoScientific 11631017), 293S, 293T (ATCC® CRL-3216™), 293T/17 (ATCC® CRL11268™), 293T/17 SF (ATCC® ACS4500™), HEK 293 STF (ATCC® CRL 3249™), HEK-293.2sus (ATCC® CRL-1573™). Una línea celular preferida para la producción del polipéptido es la línea celular HEK 293 F.

Otras líneas celulares adecuadas como células hospedadoras para la expresión incluyen líneas celulares derivadas de células de leucemia mieloide humana. Son ejemplos específicos de células hospedadoras K562, NM-F9, NM-D4, NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X, g T-5s y células derivadas de cualquiera de dichas células hospedadoras. K562 es una línea celular de leucemia mieloide humana presente en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC CCL-243). Las líneas celulares restantes se derivan de células K562 y se han seleccionado por características específicas de glucosilación.

Uso de la proteína de fusión

Como se muestra en los ejemplos, los péptidos de extensión de SEQ ID NO: 1 en las proteínas de fusión OCTA 12 y OCTA 14 no solo conducen a un aumento de la semivida de la proteína de fusión, es decir, en comparación con la proteína principal, es decir, el fragmento de VWF. Las proteínas de fusión OCTA 12 y OCTA 14, cuando se administra junto con FVIII, el compañero de unión de VWF, a un paciente también conducen a un aumento en la semivida de FVIII.

Composición y complejo proteico

En consecuencia, el concepto de acuerdo con la invención, es decir, la prolongación de la semivida proporcionada por los péptidos de extensión no se limita a la proteína de fusión, sino además la semivida de una segunda proteína, que se une a la proteína de fusión, puede extenderse.

Por lo tanto, de acuerdo con un quinto aspecto la invención proporciona una composición de una primera proteína y una segunda proteína, en donde dicha primera proteína es una proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto y es capaz de unirse a dicha segunda proteína y dicha segunda proteína es una proteína terapéutica que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de una segunda proteína de mamífero o fragmento de la misma.

La primera proteína puede unirse a la segunda proteína de forma covalente o no covalente para formar un complejo. En consecuencia, la presente invención también se refiere a un complejo de una primera proteína y una segunda proteína, en donde dicha primera proteína es una proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto y dicha segunda proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de una segunda proteína de mamífero o fragmento de la misma. En consecuencia, los complejos se forman por unión no covalente de la primera proteína a la segunda proteína.

De acuerdo con una realización la primera proteína se une a la segunda proteína de forma covalente. El enlazador que facilita la unión de la primera y la segunda proteínas puede seleccionarse de un puente disulfuro, enlace peptídico, un enlazador químico o un enlace glucosídico.

Alternativamente, la primera proteína se une a la segunda proteína de forma no covalente. Para la unión no covalente, la primera proteína puede, en particular, comprender un dominio de unión específico que lo hace capaz de unirse a dicha segunda proteína, es decir, un segundo dominio de unión a proteínas. Dependiendo de la ubicación de uno o más péptidos de extensión en la secuencia de la primera proteína, pueden ubicarse en diferentes posiciones de la primera proteína. Preferentemente, el uno o más péptidos de extensión están ubicados en una posición que está expuesta a la superficie en el estado plegado de la proteína. El uno o más péptidos de extensión pueden ubicarse en cualquier posición con respecto al segundo sitio de unión a la proteína, por ejemplo, el dominio de unión.

De acuerdo con una realización de la composición, el uno o más péptidos de extensión están ubicados en una posición en el estado plegado de la primera proteína que no interfiere con la unión de la primera proteína a la segunda proteína.

De acuerdo con una realización, la semivida de la segunda proteína, por ejemplo, FVIII, unido a la primera proteína, por ejemplo, un fragmento de VWF, se aumenta en comparación con la forma libre de dicha segunda proteína, por ejemplo una proteína FVIII.

Preferentemente, la semivida de la segunda proteína, por ejemplo una proteína FVIII, unido a la primera proteína, por ejemplo, OCTA 12, se aumenta en comparación con dicha segunda proteína unida a la proteína nativa de mamífero, por ejemplo VWF maduro.

Más preferentemente, la segunda proteína, por ejemplo una proteína FVIII, unido a la primera proteína, por ejemplo, OCTA 12, se aumenta en comparación con dicha segunda proteína unida a la proteína principal sin péptido de fusión, por ejemplo, OCTA 11.

La segunda proteína de mamífero puede seleccionarse de la misma lista identificada anteriormente para la proteína de mamífero. Sin embargo, en la composición o complejo, la segunda proteína de mamífero no es la misma que la primera proteína de mamífero.

De acuerdo con una realización, la segunda proteína de mamífero es una proteína de la sangre, en particular una proteína de la sangre humana. Preferentemente la segunda proteína de mamífero es un factor de coagulación, en particular, un factor de coagulación humano.

De acuerdo con una realización la segunda proteína de mamífero, a la que la proteína principal es similar o idéntica, es FVIII humano de longitud completa identificado por los aminoácidos 20 a 2.351 de UniProtKB P00451.1). De acuerdo con otra realización, la proteína principal es FVIII, en el cual que falta al menos parte del dominio B. En este sentido, puede faltar todo el dominio B. La parte que falta del dominio B se reemplaza opcionalmente por un enlazador. La secuencia enlazadora tiene en particular la siguiente secuencia de aminoácidos SFSQNSRHQAYRYRRG (SEQ ID NO: 12). Un ejemplo de un FVIII en el que el dominio B se reemplaza por un enlazador, es Simoctocog alfa (SEQ ID NO: 13), el principio activo de Nuwiq® o Vihuma®.

De acuerdo con una realización, la proteína FVIII es una proteína FVIII humana con una respuesta inmunitaria reducida en los pacientes.

La respuesta inmunitaria reducida de la proteína FVIII se basa preferentemente en la unión a SIGLECs SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que la unión a SIGLECS en las células presentadoras de antígenos (como, por ejemplo, las células dendríticas) conduce a una regulación negativa de la expresión del receptor proinflamatorio y una regulación positiva de la expresión del receptor inmunosupresor en la superficie celular. También, la unión conduce a una mayor producción de citocinas antiinflamatorias, reduce la producción de citocinas proinflamatorias y, en consecuencia, conduce a la inhibición de la proliferación de células T y la producción de anticuerpos. Por lo tanto, la unión de los SIGLECs SIG-5, SIG-7, SIG-8 y SIG-9 conduce a una respuesta inmunitaria reducida o a una mayor tolerancia inmunitaria cuando se administra el polipéptido glucosilado a un paciente.

La unión SIGLEC y, en consecuencia, la respuesta inmunitaria reducida se basa en un número o porcentaje aumentado de O-glucanos sialilados de núcleo 2 y/o núcleo extendido 1 en la proteína glucosilada en comparación con el número de O-glucanos sialilados de núcleo 2 y/o núcleo extendido 1 del FVIII humano de origen natural.

Por lo tanto, de acuerdo con una realización la proteína FVIII exhibe un número o porcentaje aumentado de O-glucanos sialilados de núcleo 2 y/o núcleo extendido 1 en la proteína glucosilada en comparación con el número de O-glucanos sialilados de núcleo 2 y/o núcleo extendido 1 del FVIII humano de origen natural.

Para el caso de que la segunda proteína sea una proteína FVIII, la proteína principal de la primera proteína es preferentemente un fragmento de VWF que comprende el dominio de unión a FVIII para que sea capaz de unirse a la proteína FVIII.

De acuerdo con una realización de la composición, la primera proteína tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 95 %, preferentemente al menos el 98 %, más preferentemente el 100 % con SEQ ID NO: 3 y la segunda proteína tiene un aminoácido con una identidad de al menos el 95 %, preferentemente al menos el 98 %, más preferentemente el 100 % con SEQ ID NO: 13.

De acuerdo con una realización de la composición, la primera proteína tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 95 %, preferentemente al menos el 98 %, más preferentemente el 100 % con SEQ ID NO: 6 y la segunda proteína tiene un aminoácido con una identidad de al menos el 95 %, preferentemente al menos el 98 %, más preferentemente el 100 % con SEQ ID NO: 13.

De acuerdo con una realización de la composición, la primera proteína tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 95 %, preferentemente al menos el 98 %, más preferentemente el 100 % con SEQ ID NO: 9 y la segunda proteína tiene un aminoácido con una identidad de al menos el 95 %, preferentemente al menos el 98 %, más preferentemente el 100 % con SEQ ID NO: 13.

Debido a que en la sangre del paciente la proteína de fusión que contiene el fragmento de VWF, en particular OCTA 12, compite con el VWF endógeno por unirse a la proteína FVIII, se prefiere que la composición comprenda la proteína de fusión que contiene el fragmento de VWF, en particular OCTA 12, en exceso molar en comparación con la proteína FVIII.

Preferentemente, la relación molar de la primera proteína a la segunda proteína está en el intervalo de 0,1 a 250, preferentemente en el intervalo de 0,5 a 50, más preferentemente en el intervalo de 1 a 25, lo más preferentemente en el intervalo de 2 a 10.

Para formar un complejo estable unido no covalentemente y, por lo tanto, permitir la prolongación de la semivida de la segunda proteína, la afinidad de unión de la primera proteína a la segunda proteína definida por la constante de disociación de equilibrio (Kd) debe ser inferior a 10 pM. Preferentemente, la constante de disociación de equilibrio del fragmento de VWF en la primera proteína a la proteína FVIII está en el intervalo de 0,05 a 3 nM.

La primera y la segunda proteínas pueden producirse mediante expresión recombinante separada y unirse en lo sucesivo. Alternativamente, la primera y la segunda proteínas se expresan de forma recombinante en la misma célula. Para ello, la primera y la segunda proteínas pueden estar codificadas por el mismo vector o en dos vectores diferentes.

Las construcciones de VWF usadas en los ejemplos, es decir, OCTA 12, OCTA 14 y OCTA 15 se expresaron en forma de sus proproteínas, dando lugar a la formación de dímeros o, en el caso de OCTA 15, dando lugar a la formación de multímeros. Estos dímeros permanecen intactos incluso después de la escisión del propéptido y, en consecuencia, cada una de las copias de la construcción de VWF en el dímero puede unirse a una proteína FVlII. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, el complejo contiene dos copias de la primera y la segunda proteína, en donde las dos copias de la primera proteína forman un dímero. Este dímero de la primera proteína es preferentemente un dímero unido de forma no covalente.

Composición farmacéutica y uso médico

Como se ha descrito anteriormente, la proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto y la composición de acuerdo con el quinto aspecto de la invención tienen la ventaja de una semivida aumentada en la sangre de los pacientes y, por lo tanto, un efecto terapéutico aumentado en los pacientes. Por lo tanto, la proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto y la composición de acuerdo con el quinto aspecto son particularmente útiles como principios activos para el tratamiento médico. Preferentemente, son útiles para el tratamiento o la prevención de un trastorno hemorrágico. La proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto y la composición de acuerdo con el quinto aspecto descritas en el presente documento pueden administrarse solas o en forma de composiciones farmacéuticas.

De acuerdo con la invención, la composición farmacéutica puede comprender una cantidad eficaz de proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto y la composición de acuerdo con el quinto aspecto formulada con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de las realizaciones pueden prepararse y administrarse a un sujeto mediante cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia. Véase, por ejemplo, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman et al., eds., McGraw— Hill Professional (10a ed., 2001); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Lippincott Williams & Wilkins (20a ed., 2003); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Ansel et al. (eds), Lippincott Williams & Wilkins (7a ed., 1999). Además, las composiciones farmacéuticas de las realizaciones también pueden formularse para incluir otros fármacos o agentes biológicos médicamente útiles. La composición farmacéutica normalmente comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión o del complejo proteico combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede cualquiera conocido o establecido en la técnica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables ilustrativos incluyen agua apirógena estéril y solución salina tamponada con fosfato apirógena estéril. Otras formas de vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse para las presentes realizaciones incluyen aglutinantes, disgregantes, tensioactivos, aceleradores de la absorción, agentes de retención de la humedad, absorbentes, lubricantes, cargas, extensores, agentes que imparten humedad, conservantes, estabilizantes, emulsionantes, agentes solubilizantes, sales que controlan la presión osmótica, agentes diluyentes tales como tampones y excipientes generalmente usados dependiendo de la forma de uso de la formulación. Estos se seleccionan y se usan opcionalmente dependiendo de la dosis unitaria de la formulación resultante.

Como se usa en el presente documento, "trastorno hemorrágico" se refiere a una enfermedad o afección que altera la hemostasia normal. El trastorno hemorrágico puede ser, por ejemplo, Hemofilia A, Hemofilia B, deficiencia en factor VIII, deficiencia en factor XI, enfermedad de Von Willebrand, trombastenia de Glanzmann, Síndrome de Bernard Soulier, púrpura trombocitopénica idiopática, hemorragia intracerebral, traumatismo, lesión cerebral traumática y similares.

Como se usa en el presente documento, "hemofilia" se refiere a un grupo de trastornos hemorrágicos asociados a un tiempo de formación de coágulos sanguíneos aumentado en comparación con el tiempo de formación de coágulos sanguíneos en personas sanas sin hemofilia. La hemofilia incluye Hemofilia A, que es un trastorno que conduce a la producción de Factor VIII defectuoso, Hemofilia B, que es un trastorno que conduce a la producción de Factor IX defectuoso y Hemofilia A adquirida, un trastorno hemorrágico raro provocado por un autoanticuerpo contra el factor de coagulación (F) VIII.

El trastorno hemorrágico es preferentemente Hemofilia A o B. El tratamiento puede ser, por ejemplo, el tratamiento de hemofilia de PUPS (pacientes no tratados previamente, por sus siglas en inglés) o un tratamiento de inducción de inmunotolerancia (ITI) y/u otros tratamientos relacionados de trastornos de hemofilia.

Para aplicaciones in vivo, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse al paciente por cualquier vía de administración habitual, por ejemplo, por vía oral, por vía parenteral o por inhalación. La administración parenteral incluye inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, agentes líquidos, suspensiones, emulsiones y agentes de goteo. Para la administración parenteral, la composición farmacéutica debe ser un agente inyectable tal como un agente líquido o una suspensión.

La composición farmacéutica puede administrarse por vía oral a un paciente. En estas realizaciones, una forma del fármaco incluye formulaciones sólidas tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, agentes en polvo, gránulos, cápsulas y píldoras, formulaciones líquidas tales como agentes líquidos (por ejemplo, gotas para los ojos, gotas para la nariz), suspensión, emulsión y jarabe, inhalados tales como agentes en aerosol, atomizadores y nebulizadores y agentes de inclusión de liposomas. El polipéptido glucosilado, el complejo proteico o la composición farmacéutica pueden administrarse por inhalación en el tracto respiratorio de un paciente para dirigirse a la tráquea y/o al pulmón de un sujeto.

El uso puede comprender una inyección intravenosa o no intravenosa. La inyección no intravenosa es preferentemente una inyección subcutánea.

Ejemplos

Ejemplo 1: Expresión recombinante de proteínas VWF

Las siguientes proteínas de VWF recombinantes se expresaron transitoriamente en la línea celular HEK 293 F con un Strep-Tag C-terminal y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con StrepTactin (IBA GmbH):

- OCTA 11

- O C TA12

OCTA 12 es una proteína de fusión de acuerdo con la invención. OCTA 11 es un fragmento de VWF comparativo. Las proteínas VWF se representan esquemáticamente en la Figura 1. La expresión de Pro-proteínas da como resultado la formación de dímeros. Los dímeros peptídicos también permanecen después de la escisión del propéptido.

Síntesis y clonación de genes

Como una primera etapa, los genes que codifican las proproteínas de las proteínas VWF se sintetizaron por GeneArt (Thermo Fisher Scientific):

- Pro-OCTA 11

- Pro-OCTA 12

Los genes que codifican las proproteínas se clonaron en el vector de expresión pDSG (IBA GmbH), que contiene una etiqueta Twin-Strep. Se transformaron cultivos individuales de TOP10 E. coli (iBa GmbH) con las construcciones de vector y se seleccionaron clones individuales después de una incubación durante la noche a 37 °C en placas de agar LB que contenían ampicilina.

Las preparaciones de ADN plasmídico se realizaron usando el kit QlAamp DNA Mini o Maxi (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Mediante secuenciación, se verificó la integridad de los vectores, en particular, la correcta orientación e integridad de los genes que codifican Pro-OCTA 11, Pro-OCTA 12.

Expresión de proteínas

Para la expresión eucariota de las proteínas VWF, células MEXi-293 (IBA GmbH) cultivadas en medio de transfección MEXi (IBA GmbH), se transfectaron con 1,5 mg/l de las construcciones usando 4,5 mg/ml de polietilenimina lineal de 25 kDa. Después de una incubación de 2-4 horas a 37 °C, CO2 al 5 % y 100-150 rpm, el cultivo se diluyó 1:2 con medio de transfección MEXi y el cultivo continuó hasta que la viabilidad celular alcanzó el 75 %.

Posteriormente, el sobrenadante se separó de las células mediante centrifugación a 4 °C y 300 x g. Para minimizar el efecto inhibitorio de la biotina en el medio de cultivo celular y ajustar el pH, 0,1 volúmenes de tampón (Tris-HCI 1 M, NaCl 1,5 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0) y solución BioLock al 0,09 % (v/v) (IBA GmbH) se añadieron al sobrenadante y se incubó durante 20 min a 4 °C.

Purificación de proteínas

Después de la centrifugación, el sobrenadante se aplicó en la columna Strep-Tactin XT (IBA GmbH), se lavó cinco veces con tampón de lavado (Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y las proteínas que contenían etiquetas Strep unidas se eluyeron con tampón de elución (Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, destiobiotina 10 mM, pH 8,0).

Ejemplo 2: Influencia del VWF de longitud completa o de las proteínas del VWF en la semivida del FVIII cuando se administra junto con FVIII a ratones con doble inactivación génica (DKO) para FVIII/VWF

2.1 Antecedentes

En este experimento, se probó la influencia de las proteínas VWF producidas de acuerdo con el Ejemplo 1 y el VWF completo derivado del plasma (pdVWF) de longitud completa sobre la semivida del FVIII.

Se sabe que el VWF y el FVIII de longitud completa son compañeros de unión que forman un complejo no covalente. La semivida del FVIII en circulación está determinada principalmente por la semivida circulatoria del VWF.

Como en el suero el VWF endógeno compite con las proteínas (fragmentos) del VWF administrado por la unión al FVIII, esta competencia influiría en cualquier efecto de las proteínas de VWF administradas sobre la semivida del FVIII. Por lo tanto, en el presente experimento se usaron ratones C57BI/6 que tienen doble inactivación para FVIII y VWF (FVIII/VWF-DKO) como organismos modelo para evaluar la influencia del VWF en la semivida del FVIII.

2.2 Procedimiento experimental

2.2.1 Productos que contienen FVIII

Se produjeron los siguientes productos que contienen FVIII:

1) FVIII solo

2) FVIII y OCTA 11

3) FVIII y OCTA 12

4) FVIII y pdVWF

Las proteínas VWF OCTA 11 y OCTA 12 se produjeron como se describe en el Ejemplo 1. El pdVWF era concentrado de VWF Wilate (Octapharma). El FVIII era la línea celular humana FVIII con el dominio B eliminado (Nuwiq, Octapharma). El producto Nuwiq contiene la siguiente composición tampón:

Arginina HCI 25,6 mM

Sacarosa 15,8 mM

NaCI 308 mM

Pluronic F68 0,14 mM

Citrato sódico 3,6 mM

Cloruro cálcico 2,0 mM

La relación molar de proteína VWF a FVIII en los productos que contenían FVIII 2)-4) fue de 5:1. Las proteínas VWF se añadieron al producto Nuwiq (FVIII).

2.2.2 Cepa de ratón FVIII/VWF-DKO

Se usaron ratones C57BI/6 que tienen doble inactivación para FVIII y VWF (FVIII/VWF-DKO).

2.2.3 Administración de los productos

Los cuatro productos que contenían FVIII se administraron a 20 ratones FVIII/VWF-DKO mediante infusión en la vena de la cola con una dosis de 240 III FVIII/kg (~6 UI/ratón).

2.2.4 Muestreo y análisis

Se tomaron muestras de sangre de los ratones a los 5 minutos y 1,4, 8, 12, 24, 36 y 48 horas después del tratamiento con los productos que contenían FVIII. Las muestras de sangre se obtuvieron del plexo retroorbitario de los ratones. Para cada punto de tiempo, se obtuvieron muestras de sangre de 5 ratones por producto que contenía FVIII y se analizaron individualmente. Cada ratón se muestreó en un punto de tiempo de 5 minutos y como máximo en dos puntos de tiempo adicionales.

La actividad de FVIII en cada una de las muestras de sangre se analizó usando el ensayo cromogénico (CHROMOGENIX).

2.3. Resultados

Con los valores de actividad de FVIII en las muestras de sangre, se determinó un curso temporal de la actividad de FVIII para cada uno de los productos que contienen FVIII como se muestra en la Figura 2.

En cuanto a cada punto de tiempo y producto que contiene FVIII, se midieron muestras de sangre de cinco animales, cada punto de datos en el diagrama de la Figura 2 representa la media de 5 valores.

Por otra parte, la actividad de FVIII para los puntos de tiempo individuales se da como un porcentaje de actividad de FVIII 5 minutos después del tratamiento, que se definió como una actividad del 100 % para cada uno de los productos que contenían FVIII.

La semivida de FVIII en cinco productos se calculó después del ajuste de la curva usando un análisis de regresión lineal de la porción logarítmica lineal de las curvas individuales de concentración plasmática o por regresión no lineal usando un modelo de decaimiento exponencial de una fase. Los programas de software usados para cálculo fueron GraphPad Prism versión 6.07 (La Jolla, CA 92037 EE.UU.) y WinNonlin, versión 6.4 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, EE.UU.).

Los cálculos se basaron en las siguientes ecuaciones:

ln 2

t i = [h]

Ksi

de

K d • c [h]

dt

Kel = constante de velocidad de eliminación

t-i^/2 = semivida de eliminación

c = concentración

t = tiempo

Los resultados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Semivida terminal de FVIII en los ratones DKO

A partir de estos números, es evidente que la coadministración de FVIII con cualquiera de las proteínas del VWF conduce a un aumento de la semivida. La coadministración de FVIII con pdVWF conduce a un aumento de ~4,6 veces de la semivida del FVIII (0,31).

El FVIII coadministrado con la proteína VWF OCTA 11 muestra una semivida comparable de 0,45 h (aumento de aproximadamente 1,4 veces).

Sorprendentemente, la coadministración con la proteína VWF OCTA 12 da una semivida de FVIII de 1,03 h, lo que representa un aumento de aproximadamente 3,2 veces en comparación con flVWF. El factor es 14,7 veces mayor que el FVIII.

Este resultado muestra que las repeticiones adicionales de O-glucano que están presentes en OCTA 12 conducen a un efecto significativo de prolongación de la semivida en el fragmento de VWF y, a su vez, en el complejo VWF/FVIII. Por otra parte, este resultado muestra que la adición de copias de un grupo de O-glucano intrínseco puede aumentar la semivida de una proteína.

Ejemplo 3; Perfil farmacocinético de FVIII y VWF OCTA 12 tras la administración IV y subcutánea (SQ) en cerdos enanos

3.1 Antecedentes

El suministro SQ de fármacos se está volviendo cada vez más interesante en el campo de los factores de coagulación. Sin embargo, debido a la recuperación muy baja, esta ruta aún no era aplicable para la administración de FVIII. El cerdo enano es el modelo animal más conocido para probar la administración S^q de fármacos debido a su gran similitud con la estructura humana de la epidermis. El objetivo de este experimento fue la evaluación de la semivida de VWF OCTA 12 y de FVIII cuando se administran solos o con un exceso molar de cinco veces de OCTA 12 en cerdos enanos por vía SQ. Adicionalmente, la semivida del FVIII cuando se administró solo por vía IV convencional se comparó con la del FVIII administrado SQ con o sin VWF OCTA 12.

3.2 Procedimiento experimental

Para este estudio se usaron nueve cerdos enanos Aachener hembra con una edad de 10 a 14 meses. El peso corporal estaba entre 13,7 y 19,5 kg. La inyección IV se realizó en la vena lateral de la oreja, la inyección SQ debajo de la piel en la región inguinal. La dosis fue de 100 U FVIII/kg PC, se trataron 3 animales por grupo con cada producto:

- Grupo 1: FVIII solo SQ

- Grupo 2: FVIII con OCTA 12 SQ

- Grupo 3: FVIII solo IV

Para obtener 2 x 200 pl de plasma con citrato Na por animal y tiempo de muestreo, se recogió suficiente sangre de la vena yugular de todos los animales en los siguientes momentos: 0 (antes de la dosis), 0,5, 1,2, 4, 8, 24, 32, 48, 72, 96 y 120 h después de cada administración.

Se tomaron muestras de sangre completa en tubos que contenían citrato sódico (0,15 M) como anticoagulante y se enfriaron inmediatamente utilizando un sistema IsoTherm-Rack (Eppendorf). El plasma se separó por centrifugación en los 30 minutos posteriores a la extracción de sangre. Inmediatamente después de la centrifugación, las muestras de plasma se congelaron y almacenaron a <-20 °C hasta su envío.

Cada muestra se analizó para el antígeno FVIII usando el kit de ensayo Asserachrom (Diagnostica Stago). OCTA 12 se cuantificó usando un ensayo ELISA como sigue; la microplaca recubierta con Strep-Tactin® XT (IBA GmbH) se bloqueó con tampón de bloqueo (BSA al 1 % en PBS) durante 2 h a TA. Las muestras de plasma se diluyeron en tampón de bloqueo 1:15 y se aplicaron en la placa. Después de 2 h de incubación a 37 °C, el fragmento de VWF se detectó con un pAb anti VWF (Dako P0226). Después de cada incubación, la placa se lavó 3 veces con Tween al 0,1 % en PBS.

Se realizó una evaluación farmacocinética de los datos analíticos usando WinNonlin, versión 6.4 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, EE.UU.).

3.3. Resultados

La Figura 3 muestra la evolución temporal de la concentración de VWF OCTA 12 en plasma de cerdos enanos después de la administración subcutánea de la mezcla de FVIII/VWF OCTA 12. Como se resume en la Tabla 2, OCTA 12 circula con una semivida de 219,31 h. La semivida se determinó como se describe en el Ejemplo 2.

Tabla 2. Parámetros farmacocinéticos del antígeno VWF OCTA 12 en cerdos enanos. Los valores representan la media - SD de tres animales.

Cmáx concentración en plasma más alta medida

tmáx tiempo de Cmáx

t-i^/2 semivida terminal

En cerdos con enfermedad de von Willebrand (VWD), la semivida del VWF recombinante humano de longitud completa (rhVWF) es de ~10 a 16 horas y la semivida del VWF porcino derivado de plasma es de entre 10 y 18 horas (Nichols et al.). La semivida de un fragmento de VWF que contiene únicamente los dominios de unión de FVIII es más corta que la semivida de flVWF, como lo muestra Yee. et al. en ratones deficientes en VWF. Por lo tanto, La semivida de OCTA 12 es aproximadamente de 14 a 22 veces más larga que la semivida de rhVWF en cerdos.

Además, también se observó un efecto de prolongación significativo en la semivida del FVIII. Como se muestra en la Figura 4 y se resume en la Tabla 3, FVIII cuando se coadministra con OCTA 12 tiene una semivida de 25,3 h, lo que representa un aumento de 6,7 veces en la semivida cuando se compara con FVIII solo administrado por la misma vía (SQ) y una mejora de 3,9 veces cuando se compara con FVIII administrado solo por la vía IV convencional.

Tabla 3. Parámetros farmacocinéticos del antígeno FVIII en cerdos enanos. Los valores representan la media - SD de tres animales.

Muchas modificaciones y otras realizaciones de la invención expuestas en el presente documento se le ocurrirán a una persona experta en la materia a la que pertenece la invención que tenga el beneficio de las enseñanzas presentadas en la descripción anterior y los dibujos asociados. Por lo tanto, debe entenderse que la invención no debe limitarse a las realizaciones específicas divulgadas y que las modificaciones y otras realizaciones están destinadas a incluirse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque en el presente documento se emplean términos específicos, se usan únicamente en un sentido genérico y descriptivo y no con fines de limitación.

REFERENCIAS

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende una proteína principal y uno o más péptidos de extensión, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína principal es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de una proteína de mamífero o un fragmento de la misma y dicho péptido o péptidos de extensión con una longitud de no más de 100 aminoácidos comprende o comprenden un grupo de aminoácidos O-glucosilados con al menos dos aminoácidos O-glucosilados y tiene o tienen una identidad de secuencia de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 1 y en donde la proteína de fusión tiene una semivida aumentada en comparación con la proteína principal sin péptido o péptidos de extensión.

2. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el uno o más péptidos de extensión tienen una identidad de secuencia de al menos el 95 %, preferentemente al menos el 98 %, más preferentemente el 100 % con SEQ ID NO: 1.

3. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde un péptido de extensión forma el extremo C de la proteína de fusión, en donde el aminoácido C-terminal de dicho péptido de extensión está opcionalmente unido a un péptido de fusión de etiqueta de afinidad.

4. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de mamífero es una proteína de sangre humana, preferentemente un factor de coagulación o un inhibidor de la proteasa, más preferentemente seleccionado del grupo que consiste en VWF, protrombina, fibrinógeno, Fill, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII, ADAMTS13, antitrombina, alfa-1 antitripsina, inhibidor de C1, antiquimotripsina, PAI-1, PAI-3, 2-macroglobulina, TFPI, cofactor de heparina II Proteína Z, Proteína C y Proteína S.

5. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína principal tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98 %, lo más preferentemente el 100 % de identidad con los aminoácidos 764 a 1268 de SEQ ID NO: 2.

6. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de fusión comprende al menos 4, preferentemente al menos 8, más preferentemente al menos 12 O-glucanos adicionales en comparación con la proteína principal.

7. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión tiene una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98 %, lo más preferentemente el 100 % con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

8. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de fusión se produce por expresión en una línea celular de mamífero, preferentemente una línea celular humana, más preferentemente una línea celular de riñón humano, lo más preferentemente una línea celular de riñón embrionario humano, en particular una línea celular HEK293 tal como HEK293F.

9. Una composición de una primera proteína y una segunda proteína, en donde dicha primera proteína es una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y es capaz de unirse a dicha segunda proteína y dicha segunda proteína es una proteína terapéutica que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de una segunda proteína de mamífero o fragmento de la misma, en donde la semivida de la segunda proteína unida a la primera proteína aumenta en comparación con la forma libre de dicha segunda proteína.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la relación molar de la primera proteína a la segunda proteína está en el intervalo de 0,1 a 250, preferentemente en el intervalo de 0,5 a 50, más preferentemente en el intervalo de 1 a 25, lo más preferentemente en el intervalo de 2 a 10.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde la segunda proteína de mamífero es una proteína de la sangre, más preferentemente dicha segunda proteína de mamífero es una proteína plasmática, lo más preferentemente dicha segunda proteína es un factor de coagulación y/o en donde la segunda proteína de mamífero es una proteína humana.

12. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde la segunda proteína es una proteína FVIII, seleccionada de FVIII de longitud completa, una proteína FVIII en la cual falta al menos una parte del dominio B y una proteína FVIII en la cual al menos una parte del dominio B se reemplaza por un péptido de extensión, en donde el péptido de extensión se define de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

13. Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

14. Un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la estructura principal del vector se selecciona preferentemente de pCDNA3, pCDNA3.1, pCDNA4, pCDNA5, pCDNA6, pCEP4, pCEP-puro, pCET1019, pCMV, pEF1, pEF4, pEF5, pEF6, pExchange, pEXPR, plRES y pSCAS.

15. Una célula hospedadora que contiene el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 13 o el vector de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la célula hospedadora es preferentemente una célula de mamífero, preferentemente una célula humana, más preferentemente una célula de riñón humano, lo más preferentemente una línea celular de riñón embrionario humano, en particular una línea celular HEK293 tal como HEK293F.