ES2895798T3

ES2895798T3 - Preparación que comprende péptidos del factor VIII y del factor Von Willebrand

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Publication number: ES2895798T3
Application number: ES18159816T
Authority: ES
Inventors: Christoph Kannicht; Barbara Solecka-Witulska; Guido Kohla; Stefan Winge
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2015-06-08
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2035-06-08
Also published as: WO2015185758A3; BR112016026842A2; RU2714154C2; US20180185455A1; WO2015185758A2; RU2016152151A3; CN106414492B; EP3360895B1; EP3152230A2; JP6605593B2; IL249294A0; AU2015270394B2; KR20170010895A; CN106414492A; ES2747815T3; EP3360895A2; US10251940B2; RU2016152151A; JP2017518376A; DK3152230T3

Abstract

Una composición que comprende un complejo del Factor VIII y uno o más péptidos del Factor de Von Willebrand, en donde los péptidos del Factor de Von Willebrand son fragmentos del Factor de Von Willebrand y comprenden al menos los aminoácidos 764 a 1905 de la SEQ ID NO: 1 pero no los aminoácidos 2255 a 2645 de la SEQ ID NO: 1 y en donde los péptidos del Factor de Von Willebrand tienen una constante de afinidad de unión KD por la heparina >= 2,43 nM.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación que comprende péptidos del factor VIII y del factor de Von Willebrand

La presente invención se refiere a preparaciones farmacéuticas para el tratamiento de trastornos hemorrágicos.

Antecedentes de la invención

El Factor VIII ("FVIN") es una glucoproteína del plasma sanguíneo con una masa molecular de aproximadamente 280 kDa. Interviene en la cascada de reacciones de coagulación que conducen a la coagulación de la sangre. El trastorno hemorrágico más común se produce por una deficiencia del Factor VIII funcional, denominada hemofilia A. Dicho trastorno se trata sustituyendo el Factor VIII, ya sea derivado de plasma o recombinante. El Factor VIII se utiliza para el tratamiento urgente y profiláctico de hemorragias en pacientes con hemofilia A.

La secuencia de aminoácidos del Factor VIII está organizada en tres dominios estructurales: un dominio A triplicado de 330 aminoácidos, un solo dominio B de 980 aminoácidos y un dominio C duplicado de 150 aminoácidos. El dominio B no tiene homología con otras proteínas y proporciona 18 de los 25 posibles sitios de glucosilación ligados a asparagina (N) de esta proteína. Aparentemente, el dominio B no tiene ninguna función en la coagulación. Las moléculas del Factor VIII con supresión del dominio B, tienen actividad procoagulante invariable en comparación con el Factor VIII de longitud completa. Algunas preparaciones de Factor VIII recombinante (rFVIII) tienen el dominio B suprimido.

En el plasma, el Factor VIII se estabiliza a través de la asociación con la proteína del Factor de Von Willebrand ("vWF"), que parece inhibir el aclaramiento del Factor VIII, por ejemplo, aclaramiento por proteólisis o mediado por el receptor de LRP. En la circulación, el Factor de Von Willebrand está presente en un exceso molar de 50 veces en relación con el Factor VIII en condiciones fisiológicas normales.

El factor de Von Willebrand Factor es una glucoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma de mamíferos, que tiene múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasia primaria, el Factor de Von Willebrand actúa como mediador entre receptores específicos en la superficie plaquetaria y componentes de la matriz extracelular como el colágeno. Asimismo, el Factor de Von Willebrand actúa como una proteína transportadora y estabilizadora del Factor VIII procoagulante. El Factor de Von Willebrand se sintetiza en células endoteliales y megacariocitos como una molécula precursora de 2813 aminoácidos. El polipéptido precursor, pre-pro-Factor de Von Willebrand, consiste en un péptido señal de 22 residuos, en un pro-péptido de 741 residuos y en el polipéptido de 2050 residuos que se encuentra en el Factor de Von Willebrand de plasma maduro (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). Tras la secreción en plasma, el factor de Von Willebrand circula en forma de varias especies con diferentes tamaños moleculares. Estas moléculas de factor de Von Willebrand consisten en oligo y multímeros de la subunidad madura de 2050 residuos de aminoácidos. El Factor de Von Willebrand se puede encontrar generalmente en el plasma como multímeros de un tamaño que varía de aproximadamente 500 a 20000 kDa (Furlan, Ann Hematol. Junio de 1996; 72(6): 341-8).

La semivida promedio in vivo del Factor VIII humano en la circulación humana es de aproximadamente 12 horas. El Factor de Von Willebrand podría disminuir las posibles inmunorreacciones contra el Factor VIII cuando forma un complejo con el Factor VIII al protegerlo de posibles sitios inhibidores de anticuerpos conocidos en la cadena pesada (dominio A2) y en la cadena ligera (dominio A3/C2) (Ragni, J Thromb. Haemost. 10: 2324-2327, 2012) o en otros posibles sitios inhibidores de anticuerpos en la molécula del Factor VIII.

Otro trastorno hemorrágico en seres humanos es la enfermedad de Von Willebrand (EvW). Dependiendo de la gravedad de los síntomas hemorrágicos, la EvW puede tratarse mediante terapia sustitutiva con concentrados que contengan Factor de Von Willebrand, en general derivado del plasma, pero el factor de Von Willebrand recombinante también está en desarrollo. Se sabe que el Factor de Von Willebrand estabiliza el Factor VIII in vivo y, por tanto, juega un papel crucial en la regulación de los niveles plasmáticos del Factor VIII y, como consecuencia, es un factor esencial para controlar la hemostasia primaria y secundaria.

Hasta hoy, el tratamiento estándar de la hemofilia A y de la EvW implica frecuentes infusiones intravenosas de preparaciones de concentrados de Factor VIII y Factor VIII/Factor de Von Willebrand. Estas terapias sustitutivas son generalmente eficaces, sin embargo, por ejemplo, en pacientes con hemofilia A grave sometidos a tratamiento profiláctico, el Factor VIII debe administrarse por vía intravenosa (i.v.) aproximadamente 3 veces por semana debido a la corta semivida plasmática del Factor VIII de aproximadamente 12 horas. Ya alcanzando niveles de Factor VIII por encima del 1 % del plasma humano normal, lo que corresponde a un aumento de los niveles de Factor VIII en 0,01 U/ml, la hemofilia A grave se convierte en hemofilia A moderada. En la terapia profiláctica, el régimen de dosificación se diseña de manera que los niveles de actividad del Factor VIII no caigan por debajo de los niveles del 2-3 % de la actividad del Factor VIII de los no hemofílicos.

La administración de un Factor VIII por vía intravenosa (i.v.) es complicada, asociada a dolor y conlleva el riesgo de una infección, especialmente porque esta se realiza principalmente en tratamiento domiciliario por los propios pacientes o por los padres de los niños con diagnóstico de hemofilia A. Además, las inyecciones intravenosas frecuentes producen inevitablemente la formación de cicatrices, interfiriendo con futuras infusiones. Aun así, podría ser necesario un tratamiento i.v. en una situación de urgencia o cirugía, es decir, cuando se necesita inmediatamente un nivel alto de Factor VIII.

Se ha propuesto la administración subcutánea (s.c.) del Factor VIII, por ejemplo, en los documentos WO 95/01804 A1 y WO 95/026750 A1. Sin embargo, para alcanzar una biodisponibilidad aceptable, se tuvieron que administrar dosis muy altas de Factor VIII.

Otra estrategia para mejorar la biodisponibilidad después de la administración no intravenosa, ha sido utilizar Factor VIII fusionado a albúmina (documento WO 2011/020866 A2).

En el documento WO 2013/057167 A1 se propone administrar Factor VIII en combinación con glucosaminoglucanos sulfatados mediante administración no intravenosa, opcionalmente junto con Factor de Von Willebrand.

En el documento WO 2008/151817 A1 se describe el uso general de multímeros del Factor de Von Willebrand no escindidos para la estabilización del Factor VIII, derivados de plasma o recombinantes (mutantes por supresión y de longitud completa) destinados al tratamiento extravascular.

En los documentos WO 2013/160005 A1 y WO 2013/083858 A1, se describe el uso general del Factor de Von Willebrand recombinante o de fragmentos del Factor de Von Willebrand recombinante, para mejorar la biodisponibilidad, después del tratamiento s.c., de moléculas muy específicas del Factor VIII, en donde dichas moléculas del Factor VIII comprenden un dominio B truncado con un tamaño de 100-400 aminoácidos. Según el documento WO 2013/160005 A1, las moléculas del Factor VIII con dominios B truncados entre 100 y 400 aminoácidos, tienen una mayor biodisponibilidad del Factor VIII en comparación con el Factor VIII que tiene el dominio B completo o con las moléculas de Factor VIII con dominio B truncado que no tienen o tienen pocos aminoácidos.

Todavía existe la necesidad de preparaciones de Factor VIII que muestren mejor biodisponibilidad, estabilidad y/o menor riesgo de generación de anticuerpos, evitando así los inconvenientes de la técnica anterior.

El objeto de la presente invención es proporcionar preparaciones de Factor VIII alternativas. Preferentemente, estas preparaciones deben mostrar estabilidad mejorada, biodisponibilidad mejorada y/o riesgo reducido de que se produzcan reacciones inmunológicas.

Este objeto se logra mediante una composición que comprende un complejo de Factor VIII y uno o más péptidos del Factor de Von Willebrand, en donde los péptidos del Factor de Von Willebrand son fragmentos del Factor de Von Willebrand y comprenden al menos los aminoácidos 764 a 1905 de la SEQ ID NO: 1 pero no los aminoácidos 2255 a 2645 de la SEQ ID NO: 1 y en donde los péptidos del Factor de Von Willebrand tienen una constante de afinidad de unión Kd por la heparina > 2,43 nM.

El Factor VIII, como se usa en el presente documento, incluye el Factor VIII de longitud completa, el Factor VIII con supresión del dominio B o un Factor VIII en donde el dominio B se ha sustituido por un enlazador artificial o por un fragmento del dominio B natural o por una combinación de ambos, es decir, el dominio B tiene un tamaño diferente en comparación con el Factor VIII de longitud completa. También incluye Factor VIII con un número limitado de modificaciones con, inserción, supresión o sustituciones, especialmente Factor VIII adaptado a haplotipos como se describe en K.R. Viel, et al. New England J Med 2009; 360:1618-1627. Preferentemente, la homología de secuencia con el Factor VIII (definida en los aminoácidos 20-2351 de P00451 de la base de datos SwissProt el 21 de julio de 1986) aunque ignorando la homología en el Dominio B del 99 % según FASTA, implementada en la versión 36 de FASTA, se basa en W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227-258. En otras palabras, cuando se calcula una homología de secuencia, el dominio B no se incluye en la comparación de ambas proteínas. También se incluye Factor VIII modificado, como el Factor VIII con h Es (Hydroxyethyl Starch, hidroxietil almidón) o Factor VIII con PEG (polietilenglicol) o Factor VIII con proteínas de fusión Fc y Factor VIII con proteínas de fusión de albumina, como se describe en Oldenburg, Haemophilia (2014), 20 (Suppl. 4), 23-28.

El Factor VIII de la presente invención puede ser Factor VIII derivado de plasma o recombinante. Cuando se usa Factor VIII recombinante, este se expresa preferentemente en una línea celular humana para imitar el patrón de glucosilación humano (Casademunt, Eur J Haematol. 2012; 89:165-76) o como se describe en el documento WO 2010/020690.

Los péptidos del Factor de Von Willebrand son péptidos que comprenden al menos los aminoácidos 764 a 1905 de la SEQ ID NO: 1 en una sola cadena de aminoácidos. Estos aminoácidos pueden formar parte de una secuencia más larga que comprenda ambas secuencias juntas. En otras palabras, los péptidos de Von Willebrand de la invención comprenden tanto la SEQ ID NO: 5 como la SEQ ID NO: 6. Estos pueden comprender partes adicionales del Factor de Von Willebrand, excluyendo todos los aminoácidos de 2255 a 2645 (SEQ ID NO: 7). Los péptidos de Von Willebrand pueden comprender otras secuencias que forman parte de la SEQ ID NO: 1 o secuencias que no forman parte de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, enlazadores de aminoácidos o similares. Preferentemente, la cantidad total de aminoácidos que no forman parte de la SEQ ID NO: 1 no es superior a 50, a 20 o a 10 aminoácidos.

Un aspecto importante de la invención es que los aminoácidos 2255 a 2645 de la SEQ ID NO: 1 no forman parte de los péptidos del Factor de Von Willebrand. En otras palabras, los péptidos del Factor de Von Willebrand, descritos más adelante, no comprenden ninguna secuencia que tenga una homología de al menos 90 % con la SEQ ID NO: 7 según FASTA.

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia P04275 de la base de datos Swiss Prot desde el 11 de enero de 2011.

Los péptidos del Factor de Von Willebrand en la composición de la presente invención pueden ser péptidos que tengan la misma secuencia o pueden ser una mezcla de péptidos que tengan secuencias como se definió anteriormente.

Normalmente, una proporción molecular de péptidos del Factor VIII y del Factor de Von Willebrand estará comprendida entre 1:1 y 1:20, preferentemente, entre 1:2 y 1:10. Si los péptidos del Factor de Von Willebrand están en forma de dímeros o multímeros, la proporción molecular se calcula en una sola cadena de aminoácidos, es decir, un complejo de una molécula de Factor VIII con un dímero de péptidos del Factor de Von Willebrand tendrá una proporción de 1:2.

Un complejo, como se usa en el presente documento, se refiere a una unión no covalente del Factor VIII a uno o más péptidos del Factor de Von Willebrand.

Los péptidos del Factor de Von Willebrand son fragmentos del Factor de Von Willebrand, es decir, formas truncadas del extremo N y/o C del Factor de Von Willebrand.

Los fragmentos comprenden los aminoácidos 764 a 1905 de la SEQ ID NO: 1.

Una realización adicional de la invención es una composición que comprende un complejo de Factor VIII y uno o más péptidos del Factor de Von Willebrand que son fragmentos del Factor de Von Willebrand y tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, comenzando desde el aminoácido 764 y finalizando entre los aminoácidos 1905 y 2153 con hasta 10 modificaciones seleccionadas de supresiones, inserciones o sustituciones de aminoácidos.

Los péptidos preferidos del Factor de Von Willebrand son:

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1905 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1906 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1907 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1908 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1909 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1910 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1911 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1912 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1913 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1914 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1915 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1916 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1917 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1918 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1919 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1920 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1921 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1922 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1923 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1924 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1925 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1926 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1927 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1928 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1929 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1930 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1931 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1932 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1933 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1934 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1935 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1936 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1937 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen a secuencia 764 a 1938 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que t enen la secuencia 764 a 1939 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que t enen la secuencia 764 a 1940 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1941 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1942 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1943 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que t enen la secuencia 764 a 1944 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1945 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1946 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1947 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que t enen la secuencia 764 a 1948 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1949 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1950 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1951 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1952 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1953 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 1954 de SEQ ID NO: 1 Péptidos que tienen la secuencia 764 a 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Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2138 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2139 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2140 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2141 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2142 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2143 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2144 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2145 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2146 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2147 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2148 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2149 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2150 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2151 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2152 de SEQ ID NO: 1

Péptidos que tienen la secuencia 764 a 2153 de SEQ ID NO: 1

Preferentemente, los péptidos del Factor de Von Willebrand tienen un peso molecular <500 kD, preferentemente < 400 kD. Como el Factor de Von Willebrand a menudo forma oligómeros o multímeros, también los péptidos de la presente invención pueden estar en forma de multímeros u oligómeros.

En una realización preferida, los péptidos de la presente invención tienen al menos una propiedad seleccionada del grupo que consiste en

(ii) una constante de afinidad de unión Kd por el colágeno III > 5 nM, preferentemente > 17,02 nM

(iii) una constante de afinidad de unión Kd por el Factor VIII < 100 nM o < 10 nM, preferentemente < 6,19 nM y (iv) una inhibición de la unión a fosfolípidos del Factor VIII de al menos 70 %, preferentemente de al menos 80 % o de al menos 90 %.

Los péptidos del Factor de Von Willebrand de la invención muestran, preferentemente, una unión reducida a la heparina, una afinidad más baja por el colágeno (como el colágeno III), una afinidad más baja por los fosfolípidos aunque sin embargo una unión alta con el Factor VIII.

Sorprendentemente, la baja unión a fosfolípidos y a colágeno mejora la velocidad de liberación en caso de administración no intravenosa, especialmente subcutánea.

En la parte experimental se describe la medición de las respectivas constantes de afinidad de unión.

En una realización, los péptidos del Factor de Von Willebrand derivan del Factor de Von Willebrand mediante escisión proteolítica o química. Si se usa la escisión proteolítica, se prefiere especialmente la proteasa V 8 de S. aureus. La composición de la presente invención tiene al menos una de las siguientes propiedades:

(i) los péptidos del Factor de Von Willebrand protegen al Factor VIII de la unión de anticuerpos minimizando la formación de inhibidores en un paciente

(ii) el Factor VIII se estabiliza proporcionando una actividad residual del Factor VIII de al menos 90 % después de su almacenamiento durante 12 meses en forma líquida congelada a -70 °C

(iii) el Factor VIII se estabiliza proporcionando una actividad residual del Factor VIII de al menos 90 % después de su almacenamiento durante 24 meses en forma liofilizada a 5 °C

(iv) el Factor VIII se estabiliza proporcionando una actividad residual del Factor VIII de al menos 90 % después de su almacenamiento durante 12 meses en forma liofilizada a 25 °C

(v) la semivida del Factor VIII se prolonga in vivo en al menos un 20 % y

(vi) reduce a menos de un 20 % la formación de inhibidores en pacientes no tratados previamente, preferentemente a menos de un 10 % después del tratamiento con la composición durante 6 meses.

Sorprendentemente, los péptidos del Factor de Von Willebrand parecen aumentar la estabilidad del Factor durante el almacenamiento (vida útil) y/o reducir la formación de inhibidores en los pacientes. La formación de inhibidores es uno de los principales problemas en el tratamiento de los trastornos hemorrágicos crónicos.

La composición de la presente invención es especialmente útil en el tratamiento o la prevención de un trastorno hemorrágico.

Por lo tanto, una realización adicional de la invención es la composición para su uso en un método de tratamiento de un trastorno hemorrágico, comprendiendo dicho método administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de la composición de la presente invención.

La cantidad depende de la enfermedad o afección a tratar y puede seleccionarla un experto en la materia. Para tratamientos prolongados, normalmente son adecuadas cantidades de 20 a 40 UI/kg de peso corporal por aplicación. En una situación de urgencia, la cantidad puede ser de aproximadamente 10 a 50 UI/kg de peso corporal.

La composición de la invención puede aplicarse mediante administración intravenosa o no intravenosa. La administración no intravenosa puede ser una inyección subcutánea, una inyección intradérmica o una administración intramuscular.

Una ventaja del método de la presente invención es la posibilidad de utilizar nanofiltración para eliminar virus. Debido a su tamaño, el Factor de Von Willebrand no se puede nanofiltrar con un nanofiltro que tenga un tamaño de poro pequeño para eliminar virus. Dado que los péptidos del Factor de Von Willebrand tienen un tamaño mucho más pequeño que la molécula de longitud completa del Factor de Von Willebrand, es posible la nanofiltración con tamaños de poro pequeños. La nanofiltración se realiza con un tamaño de poro y unas condiciones que reducen la concentración de uno de los virus más pequeños conocidos, el parvovirus porcino, en al menos un factor de 100 (2 log), preferentemente en al menos un factor de 1000 (3 log) y lo más preferentemente a una concentración por debajo del límite de detección del ensayo de parvovirus, opcionalmente utilizando uno o más nanofiltros en serie. En esta prueba, se añade parvovirus porcino a una muestra y se analiza después de la filtración.

Por lo tanto, una realización adicional de la invención es un método para la reducción de virus que comprende la etapa de nanofiltrar los péptidos del Factor de Von Willebrand antes o después de una combinación con el Factor VIII, por lo que el parvovirus porcino se reduciría en al menos 2 log.

Un tampón preferido para la administración de la composición de la invención comprende melicitosa, preferentemente en una cantidad de hasta 1000 mM, particularmente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, por ejemplo, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la purificación del fragmento III (SPIII) de pdVWF (siglas del inglés plasma-derived von Willebrand Factor, Factor de Von Willebrand derivado de plasma) digerido por la proteasa V8 de S. aureus. A Cromatograma MonoQ del perfil de elución del fragmento III (indicado con una flecha). B Gel de SDS-PAGE (por las siglas del inglés sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) del fragmento purificado; rojo.- en condiciones reductoras; n.r.- en condiciones no reductoras.

La Figura 2 muestra la purificación del fragmento I (III-T4) a partir del fragmento III digerido con tripsina. Cromatograma MonoQ del perfil de elución del fragmento I (indicado con una flecha). En la imagen insertada se muestra la SDS-PAGE en condiciones no reductoras del fragmento purificado.

La Figura 3 muestra la purificación del fragmento II a partir del fragmento III, después de una segunda digestión con la proteasa V8 de S. aureus. A Cromatograma MonoQ del perfil de elución del fragmento II (indicado con una flecha), también se indica el segundo producto de escisión así como la proteasa V8. B Cromatograma de la segunda cromatografía MonoQ necesaria para retirar completamente la proteasa. En la imagen insertada se muestra la SDS-PAGE en condiciones reductoras del fragmento purificado.

La Figura 4 muestra la unión al rFVIII del pdVWF y de los fragmentos II y III. A, B, C Sensogramas de unión (curvas de color gris) y alineación de curvas (curvas de color negro) representativos de la interacción entre el rFVIII y el pdVWF/fragmentos II y III purificados, inmovilizados. En el diagrama se muestran las concentraciones y el tipo de muestra. C Constantes de disociación (K^d) expresadas como media y EEM; n=8.

La Figura 5 muestra la unión de rFVIII a la monocapa de fosfolípidos en SPR y la inhibición por pdVWF. A Sensogramas de unión del rFVIII y del rFVIII en presencia de BSA (seroalbúmina bovina) 108 nM o de pdVWF 47,6 nM;

cada muestra por triplicado. B Media y DE de los niveles de unión medidos 120 segundos después del final de la inyección del analito, expresados como porcentaje de unión a rFVIII; n=3.

La Figura 6 muestra la inhibición de la interacción entre rFVIII-fosfolípido por fragmentos derivados del Factor de Von Willebrand medida en SPR. La unión del rFVIII a la monocapa de fosfolípidos se realizó en presencia de tres concentraciones diferentes de los tres fragmentos derivados del Factor de Von Willebrand (en el gráfico se indican las concentraciones y el tipo de fragmento). El gráfico representa la media y la DE de los niveles de unión medidos 120 segundos después del final de la inyección del analito expresados como porcentaje de unión del rFVIII; n=3.

La Figura 7 muestra la inhibición dependiente de la concentración de la unión del rFVIII a la monocapa de fosfolípidos por el fragmento III. A Sensogramas de unión del rFVIII a la monocapa de fosfolípidos en presencia de diferentes concentraciones del fragmento III (las concentraciones se indican en el gráfico), cada muestra por triplicado. B Media y DE de los niveles de unión medidos 120 segundos después del final de la inyección del analito, expresados como porcentaje de unión a rFVIII; n=3.

La Figura 8 muestra la unión del pdVWF y del fragmento III a colágeno de tipo III. A, B Sensogramas de unión (curvas de color gris) y alineación de curvas (curvas de color negro) representativos de la interacción entre el colágeno de tipo III y el pdVWF/fragmento III purificado, inmovilizados. En el diagrama se muestran las concentraciones y el tipo de muestra. C Constantes de disociación (K^d) expresadas como media y EEM; n=9.

La Figura 9 muestra la unión a heparina del pdVWF y del fragmento III. A, B Sensogramas de unión (curvas de color gris) y alineación de curvas (curvas de color negro) representativos de la interacción entre la heparina y el pdVWF/fragmento III purificado, inmovilizados. En el diagrama se muestran las concentraciones y el tipo de muestra. C Constantes de disociación (K^d) expresadas como media y EEM; n=6.

La Figura 10 muestra una comparación de los valores del tiempo de coagulación de sangre entera (TCSE) medidos en muestras de sangre de perros con hemofilia A tratados por vía s.c. con el FVIII solo o en combinación con el fragmento III del VWF. TCSE obtenido después de la aplicación s.c. de FVIII en combinación con un exceso molar de cinco veces del fragmento III del VWF aplicado a 200 UI de FVIII/kg de PC (peso corporal). La línea discontinua horizontal marca el límite superior del tiempo de coagulación en perros normales (12 minutos).

La Figura 11 muestra la actividad de FVIII medida con un ensayo de actividad de FVIII cromogénico en muestras de plasma de perros con hemofilia A obtenidas después de la aplicación del FVIII o FVIII en combinación con el fragmento III del VWF. A El FVIII o FVIII con un exceso molar de cinco veces del fragmento III del VWF se aplicó por vía subcutánea a 200 UI de FVIII/kg de PC; el área bajo la curva (ABC) de la muestra del FVIII sola fue de 2,867 y el del FVIII en combinación con el fragmento III del VWF fue de 4,917. B El FVIII o FVIII con un exceso molar de cinco veces del fragmento III del VWF se aplicó por vía intravenosa a 200 UI de FVIII/kg de PC. El ABC de la muestra del FVIII sola fue de 27,69 y el del FVIII en combinación con el fragmento III del vWF fue de 45,72.

La Figura 12 muestra la unión del monómero del fragmento III recombinante, del dímero del fragmento III recombinante y del VWF derivado de plasma (fIVWF) al rFVIII. A, B, C Sensogramas de unión (curvas de color gris) y alineación de curvas (curvas de color negro) representativos de la interacción entre el FvW o los fragmentos del FvW recombinante y el FVIII, inmovilizados. En el diagrama se muestra el tipo de muestra. La concentración del FVIII aplicado fue de 0, 0,2, 0,6, 1,7, 5, 15, 45 y 135 nM. D Constantes de disociación (K^d) expresadas como media y d E; n=4.

La Figura 13 muestra la estabilización del FVIII por el fragmento III del VWF. La actividad de FVIII del FVIII solo o del FVIII formando complejo con el fragmento III del VWF incubado a 40 °C, se midió a diferentes momentos.

La Figura 14 muestra la unión a Heparina utilizando cromatografía de afinidad con heparina de dos fragmentos del VWF como se describe en el Ejemplo 9.

Ejemplos

La invención se explica con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1

Producción y purificación de fragmentos del Factor de Von Willebrand derivados de plasma.

Producción y purificación del fragmento III (SPIII, res. 764-2128)(Según Marti et al.Identification of disulfide-bridged substructures within human von Willebrand factor. Biochemistry 1987; 26:8099-8109 con modificaciones) (SEQ ID NO: 2):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVA LERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKY LFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNV KRPMKDETHFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQ NNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRIL TSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTA TLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKIL DELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPGGL WPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFWDM MERLRISQKWVRVAWEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKY TLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLK QIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLL GVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEEMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYS YMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNL VYMVTGNPASDEIKRLPGDIQWPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPD LVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANI

GPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNWPEKAHLLSLVDVMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTS EMHGARPGASKAWILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGIGDRYDAAQLRILAGPA GDSNWKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRPGDVWTLPDQCHTVT CQPDGQTLLKSHRVNCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDG QNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQGCMKSIEVKHSALSVELHSDMEVT VNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFT FTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYG LCGICDENGANDEMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILE

El fragmento III se prepara mediante digestión del Factor de Von Willebrand derivado de plasma (pdVWF) con la proteasa V 8 de S. aureus. La digestión se realiza durante 3 horas a 37 °C en un tampón de Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 7,8 a una proporción en peso de enzima con respecto a proteína de 1:40.

La purificación del fragmento se realiza utilizando una columna de intercambio aniónico fuerte (MonoQ). El tampón de ejecución es un tampón de Tris-HCI 20 mM pH 7,4, y el tampón de elución (tampón B) es Tris-HCI 20 mM, NaCl 500 mM pH 7,4. La proteasa V 8 de S. aureus eluye de la columna de intercambio aniónico a aprox. 22 mS/cm (aproximadamente 40 % de tampón B), por lo tanto, para eliminar la proteasa se requiere una etapa prolongada de lavado al 42 % antes de la elución del fragmento. Como alternativa, se puede realizar una etapa de SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) en Superose 610/300 GL para retirar la proteasa. En la figura 1 se representa la purificación del fragmento III y el producto obtenido. La secuencia definida por Marti et al. 1987 se ha confirmado mediante análisis de EM (espectrometría de masas).

Producción y purificación del fragmento I comparativo (III-T4, res. 764-1035) (Según Marti et al. 1987 con modificaciones (SEQ ID NO: 3):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVA

LERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKY

LFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNV

KRPMKDETHFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQ

NNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTR

El fragmento I se prepara a partir del fragmento III (SPIII) mediante digestión con tripsina (tratada con TPCK (N-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona) de bovino). La digestión se realiza durante 1,5 horas en un tampón de NH⁴HCO³100 mM pH 8,0 a una proporción en peso de enzima con respecto a proteína de 1:100. La digestión finalizó añadiendo inhibidor de tripsina de soja.

La purificación del fragmento I se realizó utilizando una columna de intercambio aniónico fuerte (MonoQ) seguido de SEC en Superose 6, 10/300 GL. El tampón de ejecución para la columna de intercambio aniónico es Tris-HCI 20 mM pH 7,4, y el tampón de elución (tampón B) es Tris-HCI 20 mM, NaCl 500 mM pH 7,4. El tampón de ejecución para la SEC es PBS (solución salina tamponada con fosfato) pH 7,0.

En la figura 2 se representa la purificación del fragmento I y el producto obtenido. La secuencia definida por Marti et al. 1987 se ha confirmado mediante análisis de EM (espectrometría de masas).

Producción y purificación del fragmento II comparativo (res. 764-1673) (SEQ ID NO: 4):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVA

LERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKY

LFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNV

KRPMKDETHFEWESGRYI ILLLGKALSWWDRHLS ISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQ

NNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRIL

TSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTA

TLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKIL

DELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPGGL

WPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFWDM

MERLRISQKWVRVAWEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKY

TLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLK

QIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLL

GVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDS1HVTVLQYS

YMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNL

VYMVTGNPASDEIKRLPGDIQWPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPD

LVLQRCCSGE

El fragmento II se preparó a partir del fragmento III mediante una segunda digestión con la proteasa V8 de S. aureus. La digestión se realiza durante 21 horas a un tampón de Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 7,8 a una proporción en peso de enzima con respecto a proteína de 1:10.

La purificación del fragmento II se realizó utilizando una columna de intercambio aniónico fuerte (MonoQ). El tampón de ejecución es un tampón de Tris-HCI 20 mM pH 7,4, y el tampón de elución (tampón B) es Tris-HCI 20 mM, NaCl 500 mM pH 7,4. Se requirió una segunda purificación MonoQ con una etapa prolongada de lavado al 42 % de tampón B para retirar la proteasa.

En la figura 3 se representa la purificación del fragmento II y el producto obtenido. El segundo sitio de escisión de V8 entre Glu1673-Gly1674 fue determinado por Fretto et al. 1986 y confirmado por análisis de EM.

Ejemplo 2

Determinación de la afinidad de unión del Factor VIII.

El análisis se realizó utilizando el instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare) según McCormick et al. 2004 con modificaciones. Resumiendo, el rFVIII se acopló de manera covalente al chip detector CM5 dando como resultado un nivel de recubrimiento de ~ 200 UR. Posteriormente, los fragmentos del Factor de Von Willebrand así como el Factor de Von Willebrand de longitud completa (flvWF, full length Von Willebrand Factor) se inyectaron sobre la superficie del chip detector. El tampón de ejecución consistía en HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCh 5 mM, Tween 20 al 0,02 %. Se determinaron las constantes de afinidad de disociación del fIVWF así como de los fragmentos II y III, no hubo unión significativa del fragmento I al Factor VIII, por lo tanto no se determinó la Kd. En la figura 4 se representan los sensogramas de unión y los valores de Kd. El fIVWF se unió al rFVIII con una Kd de 0,67 nM, el fragmento III se unió con una afinidad más baja (Kd de 6,18 nM), la afinidad disminuyó aún más para el fragmento II (Kd de 154,60 nM) Ejemplo 3

Determinación de la unión del Factor VIII a la monocapa de fosfolípidos e inhibición mediante el Factor de Von Willebrand y fragmentos derivados del Factor de Von Willebrand.

El análisis se realizó utilizando el instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare) según Saenko et al.1999 con modificaciones. Resumiendo, se prepararon vesículas de fosfolípidos a partir de DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina) y DOPS (1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfo-L-serina). Las vesículas unilaminares se prepararon según MacDonal et al. 1991 utilizando una extrusora y se recubrieron sobre un chip detector HPA. Posteriormente, se inyectaron los compuestos de interés sobre la superficie de PCPS y se evaluó el nivel de unión durante 120 s después de finalizar la inyección.

Controles negativos; el factor de Von Willebrand y la BSA no se unieron a la superficie de PSPC (no se muestra), en cambio, se mostró un alto nivel de unión del rFVIII. Esta unión podría inhibirse por completo con el factor de Von Willebrand, por el contrario, la adición de una alta concentración de BSA no tuvo ningún efecto sobre la unión (figura 5).

Para evaluar si los fragmentos obtenidos por digestión limitada podían inhibir la unión de PSPC de forma similar al fIVWF, los fragmentos I, II y III se inyectaron sobre la superficie del chip detector. Solo el fragmento III pudo inhibir la interacción entre el rFVIII y la monocapa de fosfolípidos (figura 6). Este efecto fue dependiente de la dosis con una inhibición casi completa a un exceso de 2,5 x del fragmento III sobre el rFVIII (figura 7).

Ejemplo 4

Determinación de la afinidad de unión por el colágeno III del fIVWF y del fragmento III.

El análisis se realizó utilizando el instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare) según Romjin et al. 2003 con modificaciones. Resumiendo, colágeno de tipo III digerido con pepsina humana, se unió de manera covalente a la superficie de un chip detector CM5. Posteriormente, las muestras se inyectaron sobre la superficie del chip detector. El tampón de ejecución consistía en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Ed Ta 3,4 mM, Tween 20 al 0,005 %. El fIVWF se unió al colágeno III con una afinidad muy alta (0,75 nM), la unión del fragmento III disminuyó significativamente a 17,02 nM (figura 8).

Ejemplo 5

Determinación de la afinidad de unión por la heparina del fIVWF y del fragmento III.

El análisis se realizó utilizando el instrumento Biacore T200 (GE Healthcare) según Sarafanov et al. 2001. Resumiendo, utilizando un kit con reactivo NHS-biotina, heparina de la mucosa intestinal porcina se marcó con biotina y se unió a la superficie de un chip detector SA. La celda de flujo de referencia se recubrió con biotina. Posteriormente, las muestras se inyectaron sobre la superficie del chip detector. El tampón de ejecución consistía en HEPES 150 mM, NaCl 150 mM, CaCh 5 mM, Tween 20 al 0,05 %. El fIVWF se unió a la heparina con una afinidad de 0,65 nM, la afinidad de unión del fragmento III disminuyó significativamente a 2,43 nM (figura 9).

Ejemplo 6

Determinación de la recuperación del complejo del FVIII o del FVIII/Fragmento III del VWF y de la semivida en circulación en perros con hemofilia A.

Dos perros con hemofilia A se sometieron a inyección s.c. y posterior i.v. de FVIII con supresión del dominio B recombinante solo o en combinación con un exceso molar de cinco veces del Fragmento III del VWF. El perro 1 recibió 200 UI/kg PC de FVIII solo y el perro 2 recibió 200 UI/kg PC de FVIII formando complejo con el Fragmento III del VWF. Se recogieron muestras de sangre a las 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 32, 48, 72 y 96 horas después de cada administración del fármaco por vía subcutánea o intravenosa. Las muestras se analizaron para determinar el tiempo de coagulación de sangre entera (TCSE) y la actividad en un ensayo de actividad cromogénica de FVIII. La administración subcutánea del Fragmento III del VWF formando complejo con el FVIII, dio lugar a un aumento de 1,4 veces en cuanto al tiempo necesario para superar el tiempo de coagulación de un perro normal en comparación con la administración s.c. del FVIII solo (figura 10). La administración del Fragmento III del VWF con el FVIII también dio lugar a un aumento de la actividad de FVIII en el plasma del perro a lo largo del tiempo y a valores casi duplicados del área bajo la curva (ABC) para la administración tanto s.c. como i.v. en comparación con la administración del FVIII solo (figura 11).

Ejemplo 7

Determinación de la afinidad de unión al FVIII del monómero y dímero del fragmento III recombinante.

El fragmento III recombinante se expresó de manera transitoria en la línea celular HEK293 con un Strep-Tag carboxiterminal y se purificó mediante cromatografía de afinidad con Strep-Tactin. Los monómeros y dímeros del fragmento III se separaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés). El análisis se realizó utilizando el instrumento Biacore 2000. Los monómeros y dímeros del fragmento III se inmovilizaron en el CM5 y se inyectaron series de concentración de FVIII sobre la superficie del chip detector. Como control se utilizó el VWF de longitud completa derivado de plasma. El tampón de ejecución consistía en HEPES 150 mM, NaCl 150 mM, CaCl²5 mM, Tween 20 al 0,05 %. El FVIII se unió al dímero del fragmento III con una constante de afinidad de 1,9 nM. La afinidad del FVIII por el Fragmento III monomérico fue significativamente más baja (Kd = 14,3 nM) (figura 12).

Ejemplo 8

Estabilización del rFVIII en solución mediante el Fragmento III del VWF.

Se reconstituyeron 2000 UI del FVIII recombinante (Nuwiq®) en 2,5 ml de agua, con o sin adición de un exceso molar de cinco veces del Fragmento III del VWF. Ambas preparaciones se incubaron a 40 °C y se tomaron alícuotas a las 48, 96, 192, 384, 408 y 672 horas. Las muestras se analizaron para determinar la actividad de FVIII en un ensayo de actividad cromogénica de FVIII. El Fragmento III del VWF aportó una actividad significativamente más prolongada del FVIII a 40 °C (figura 13).

Ejemplo 9

Comparación de la unión a heparina entre el fragmento III recombinante y el fragmento NovoSeq21.

El fragmento III recombinante y el fragmento NovoSeq21 (SEQ ID NO: 21 del documento WO2013/160005A1) se expresaron de manera transitoria en la línea celular HEK293 con una Strep-Tag carboxiterminal y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con Strep-Tactin. La unión a heparina se probó utilizando cromatografía de afinidad de heparina. Ambos fragmentos recombinantes se unieron a una columna de heparina (Heparina HP HiTrap 1 ml, GE Healthcare) y se eluyeron con un gradiente salino lineal de NaCl que variaba de 0-500 mM. Ambos fragmentos se desarrollaron por triplicado, véase la figura 14. El pico de elución medio del fragmento NovoSeq21 fue a 15,57 ± 0,04 min, que corresponde a 285,381 mM de NaCl, y el del fragmento III a 15,47 ± 0,02 min, que corresponde a 282,051 mM de NaCl. Esto indica una mayor afinidad de la heparina por el fragmento NovoSeq21.

Métodos analíticos

Descripción de métodos analíticos

FVIII: C, Método de exploración basado en Coatest

El método se basa en el principio de dos fases y se realizó utilizando la técnica de microplacas. En la fase uno, el factor X activado (Xa) se genera a través de la vía intrínseca donde FVIII: C actúa como cofactor. En la fase dos, el factor Xa se determina utilizando un sustrato cromogénico sintético, S-2222 en presencia de un inhibidor de trombina 1-2581 para impedir la hidrólisis del sustrato por trombina. La reacción se detiene con ácido y la actividad VIII: C, que es proporcional a la liberación de pNA (para-nitroanilina), se determina fotométricamente a 405 nm frente a un blanco de reactivo.

El método cumple con los requisitos de la Farmacopea Europea. La unidad de FVIII: C se expresa en unidades internacionales (UI) como se define en la norma internacional (IS) sobre concentrados actual establecida por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Para realizar diluciones previas se ha aprobado el hábito de utilizar tampón que contiene BSA al 1 % en lugar de plasma hemofílico fuerte. Véanse también las referencias bibliográficas (European Pharmacopoeia Supplement 2000, general Methods, 2.7.4. Assay of Blood Coagulation FVIII; Rosen S (1984) Assay of FVIII: C with a Chromogenic Substrate. J, Haematol, Suppl 40, vol 33, 139-145, 1984; Carlebjork G, Oswaldsson U, Rosen S (1987) A simple and accurate micro plate assay for the determination of FVIII activity. Thrombosis Research 47; 5-14, 1987; Mire-Sluis AR, Gerrard T, Gaines das R, Padilla A and Thorpe R. Biological assays: Their Role in the development and quality Control of Recombinant Biological Medicinal Products. Biological, 24, 351-362 (1996)).

Determinación de proteína total según Bradford

La determinación de proteínas según Bradford se basa en la observación de que el máximo de absorbancia para una solución ácida de azul de Coomassie brillante G-250 cambia de 465 nm a 595 nm cuando se produce la unión a la proteína. Las interacciones tanto hidrófobas como iónicas estabilizan la forma aniónica del colorante, provocando un cambio de color visible. El ensayo es útil ya que el coeficiente de extinción de una solución de colorante-albúmina formando complejo es constante en un intervalo de concentración de 10 veces. Véase también la referencia Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976, para obtener más información.

Determinación de proteína total según análisis de aminoácidos (AAA)

Antes del AAA, todas las proteínas se hidrolizan con HCl 6 M durante 24 h a 110 °C. Los aminoácidos se separan mediante cromatografía de intercambio catiónico sobre resinas de poliestireno sulfonadas y se detectan continuamente en el eluyente. La detección se basa en la derivatización postcolumna con ninhidrina utilizando un fotómetro dual para la medición simultánea a 440 nm de prolina e hidroxiprolina y a 570 nm de los restantes aminoácidos. Los aminoácidos asparagina y glutamina se desamidan durante el AAA y se determinan como ácido aspártico y ácido glutámico, respectivamente. Por tanto, los resultados de ácido aspártico y ácido glutámico representan la suma de ácido aspártico/asparagina (Asx) y ácido glutámico/glutamina (Glx), respectivamente, en la muestra original. El triptófano no genera ninguna respuesta distinta con este método y, por tanto, el AAA no lo cuantifica. La cisteína se destruye durante la hidrólisis y no se cuantifica. El AAA se describe con más detalle en la referencia: Total protein AAA analytical method. Spackman, D. H., Stein, W. H., y Moore, S. (1958) Anal. Biochem. 30: 1190-1206.

Pureza o actividad específica (FVIN:C/Proteína total)

La pureza (o también llamada actividad específica) de una muestra, se calcula tomando el valor obtenido en el análisis de FVIII:C y dividiéndolo entre el valor obtenido en el análisis de proteína total.

SDS-PAGE (distribución de peso molecular)

La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) implica la separación de proteínas en función de su tamaño. Este método describe la SDS-PAGE de proteínas, que se desarrolla en condiciones reductoras. Al calentar la muestra en condiciones de desnaturalización y reductoras, las proteínas se despliegan y se recubren con un detergente aniónico, dodecilsulfato de sodio (SDS), adquiriendo una alta carga negativa neta que es proporcional a la longitud de la cadena polipeptídica. Cuando se carga en una matriz de gel de poliacrilamida y se coloca en un campo eléctrico, las moléculas de proteína cargadas negativamente migran hacia el electrodo cargado positivamente y se separan mediante un efecto de tamizado molecular, es decir, por su peso molecular. Los geles de poliacrilamida impiden que las moléculas más grandes migren tan rápido como las moléculas más pequeñas. Dado que la proporción carga con respecto a masa es casi la misma entre los polipéptidos desnaturalizados con SDS, la separación final de proteínas depende casi por completo de las diferencias en la masa molecular relativa de los polipéptidos. En un gel de densidad uniforme, la distancia de migración relativa de una proteína (Rf) es negativamente proporcional al logaritmo de su masa. Si las proteínas de masa conocida se desarrollan simultáneamente con las desconocidas, la relación entre Rf y masa se puede representar gráficamente y calcular las masas de proteínas desconocidas. Las bandas de proteínas separadas por electroforesis se visualizan mediante tinción con plata. La evaluación se realiza visualmente determinando el aspecto de los estándares, referencia (muestra de control) y muestras analizadas.

Contenido antigénico del Factor VIII (FVIII:Ag)

La cantidad de contenido antigénico del Factor VIII (FVIII:Ag) se mide con un kit ELISA (ASSERACHROM® VIII:Ag, enzyme immunoassay for Factor VIII, kit, Diagnostica Stago (Francia), como se describe con más detalle(18) sustituyendo el tampón del kit proporcionado por tampón de Tris-NaCl seroalbúmina bovina al 1 % para diluciones de muestra.

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

El monómero, el agregado y el fragmento, se miden utilizando una columna analítica de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) (Superdex 200, 10/300 GL, GE Healthcare) procesada en condiciones de tampón originarias (HEPES 25 mM, NaCl 0,5 M, arginina 0,3 M, CaCh 50 mM, Polisorbato 80 al 0,02 %, pH 7,5). La carga de la muestra es aproximadamente el 1 % de la columna de exclusión por tamaño y la concentración de Factor VIII:C es de aproximadamente 1000 UI/ml.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un complejo del Factor VIII y uno o más péptidos del Factor de Von Willebrand, en donde los péptidos del Factor de Von Willebrand son fragmentos del Factor de Von Willebrand y comprenden al menos los aminoácidos 764 a 1905 de la SEQ ID NO: 1 pero no los aminoácidos 2255 a 2645 de la SEQ ID NO: 1 y en donde los péptidos del Factor de Von Willebrand tienen una constante de afinidad de unión Kd por la heparina > 2,43 nM.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde los fragmentos del Factor de Von Willebrand tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 comenzando desde el aminoácido 764 y finalizando entre los aminoácidos 1905 y 2153 con hasta 10 supresiones, inserciones o sustituciones.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde el péptido del Factor de Von Willebrand tiene un peso molecular < 500 kD, preferentemente < 400 kD.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde los péptidos del Factor de Von Willebrand tienen al menos una propiedad seleccionada del grupo que consiste en

(i) una constante de afinidad de unión Kd por el colágeno III > 5 nM, preferentemente > 17,02 nM;

(ii) una constante de afinidad de unión Kd por el Factor VIII < 100 nM o < 10 nM, preferentemente < 6,19 nM y (iii) una inhibición de la unión de fosfolípidos al Factor VIII de al menos 70 %, preferentemente de al menos 80 %.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde los péptidos del Factor de Von Willebrand derivan del Factor Willebrand mediante escisión proteolítica o química, preferentemente mediante escisión proteolítica con la proteasa V 8 de S. aureus.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el Factor VIII es un Factor VIII de longitud completa, un Factor VIII con supresión del dominio B o un Factor VIII donde el dominio B se ha sustituido por un enlazador artificial o por un fragmento del dominio B natural o por una combinación de los mismos.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el Factor VIII es Factor VIII derivado de plasma o Factor VIII recombinante, en donde un Factor VIII recombinante se expresa preferentemente en una línea celular humana.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la composición tiene al menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste en

(i) los péptidos del Factor de Von Willebrand protegen al Factor VIII de la unión de anticuerpos minimizando la formación de inhibidores en un paciente;

(ii) estabiliza al Factor VIII proporcionando una actividad residual del Factor VIII de al menos 90 % después de su almacenamiento durante 12 meses en forma líquida congelada a -70 °C;

(iii) estabiliza al Factor VIII proporcionando una actividad residual del Factor VIII de al menos 90 % después de su almacenamiento durante 24 meses en forma liofilizada a 5 °C;

(iv) estabiliza al Factor VIII proporcionando una actividad residual del Factor VIII de al menos 90 % después de su almacenamiento durante 12 meses en forma liofilizada a 25 °C;

(v) prolonga la semivida del Factor VIII in vivo en al menos un 20 % y

(vi) reduce a menos de un 20 % la formación de inhibidores en pacientes no tratados previamente después del tratamiento con la composición durante 6 meses.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno hemorrágico.

10. El uso de la composición según la reivindicación 9, en donde el tratamiento comprende la administración no intravenosa de la composición, preferentemente en donde la administración no intravenosa es una inyección subcutánea.

11. Un método para la reducción de virus en una preparación de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la etapa de nanofiltrar los péptidos del Factor de Von Willebrand antes o después de una combinación con el Factor VIII, por lo cual el parvovirus porcino, si está presente, se reduce en al menos un factor de 100.