JP6605593B2 - 第ｖｉｉｉ因子およびフォン・ヴィルブランド因子ペプチドを含む製剤 - Google Patents
第ｖｉｉｉ因子およびフォン・ヴィルブランド因子ペプチドを含む製剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6605593B2 JP6605593B2 JP2017516207A JP2017516207A JP6605593B2 JP 6605593 B2 JP6605593 B2 JP 6605593B2 JP 2017516207 A JP2017516207 A JP 2017516207A JP 2017516207 A JP2017516207 A JP 2017516207A JP 6605593 B2 JP6605593 B2 JP 6605593B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- sequence
- factor viii
- von willebrand
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 296
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 title claims description 119
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 title claims description 113
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 title claims description 113
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims description 113
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 title claims description 91
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 title claims description 86
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 31
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 134
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 25
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 21
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 10
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 10
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 claims description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 7
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 108010089996 B-domain-deleted factor VIII Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 claims description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 claims description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 claims 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 76
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 73
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 12
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 11
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 10
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 10
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 8
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 8
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 8
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 6
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Natural products N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 208000026552 Severe hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N (4s)-4-[[(2s,3s)-2-benzamido-3-methylpentanoyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.N([C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N 0.000 description 1
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 1
- 102100035180 Coiled-coil domain-containing protein 62 Human genes 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N D-melezitose Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000737082 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 62 Proteins 0.000 description 1
- 101000782195 Homo sapiens von Willebrand factor Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000033375 Moderate hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710100170 Unknown protein Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012615 aggregate Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000538 analytical sample Substances 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010031969 benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229940003169 factor viii / von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940034998 human von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000006623 intrinsic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N melezitose Chemical compound O([C@@]1(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)CO)CO)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 108010083673 prepro-von Willebrand factor Proteins 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- ILXAOQAXSHVHTM-UHFFFAOYSA-M sodium;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;chloride Chemical group [Na+].[Cl-].OCC(N)(CO)CO ILXAOQAXSHVHTM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- A61K38/37—Factors VIII
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
本発明は、出血性疾患を処置するための医薬製剤に関する。
第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）は、分子量約２８０ｋＤａの血漿糖タンパク質であり、血液凝固を引き起こす凝固反応カスケードに関わる。最も一般的な出血性疾患は、機能的な第ＶＩＩＩ因子の欠損により引き起こされ、血友病Ａと呼ばれる。これは、血漿由来第ＶＩＩＩ因子または組換え第ＶＩＩＩ因子の補充により処置される。第ＶＩＩＩ因子は、血友病Ａ患者の出血の急性処置および予防的処置に用いられる。
第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列は、３３０アミノ酸の三つ組のＡドメイン、９８０アミノ酸の単一のＢドメイン、および１５０アミノ酸の二つ組のＣドメインの３種類の構造的ドメインで構成されている。Ｂドメインは、他のタンパク質に対する相同性を有さず、このタンパク質の２５個の潜在的アスパラギン（Ｎ）結合型糖鎖付加部位のうちの１８個を提供する。Ｂドメインは凝固において何の機能も果たさないようである。Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子の凝固促進活性は、全長第ＶＩＩＩ因子と変わりがない。Ｂドメインを欠失させた組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）製剤もある。
血漿中で、第ＶＩＩＩ因子は、フォン・ヴィルブランド因子タンパク質（「ｖＷＦ」）との結合により安定化され、これは、例えばタンパク質分解またはＬＲＰ受容体を介した受容体媒介クリアランスにより、第ＶＩＩＩ因子のクリアランスを阻害すると考えられている。循環中において、フォン・ヴィルブランド因子は、通常の生理的条件下で、第ＶＩＩＩ因子に対して５０倍のモル過剰量で存在する。
フォン・ヴィルブランド因子は、哺乳動物の血漿中に存在する多量体の粘着性糖タンパク質であり、複数の生理機能を有する。一次止血において、フォン・ヴィルブランド因子は、血小板表面の特異的受容体とコラーゲンなどの細胞外マトリックスの成分との間のメディエータとして作用する。さらに、フォン・ヴィルブランド因子は、凝固促進第ＶＩＩＩ因子のキャリアおよび安定化タンパク質として機能する。フォン・ヴィルブランド因子は、血管内皮細胞および巨核球中において２８１３アミノ酸の前駆体分子として合成される。前駆体ポリペプチドであるプレプロ−フォン・ヴィルブランド因子（ｐｒｅ−ｐｒｏ−Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ）は、２２残基のシグナルペプチド、７４１残基のプロペプチド、および成熟血漿フォン・ヴィルブランド因子中に見い出される２０５０残基のポリペプチドからなる（Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994）。フォン・ヴィルブランド因子は、血漿中に分泌されると、異なる分子サイズを有する種々の分子種の形態で循環する。これらのフォン・ヴィルブランド因子分子は、２０５０アミノ酸残基の成熟サブユニットのオリゴマーおよび多量体からなる。フォン・ヴィルブランド因子は通常、サイズが約５００〜２０，０００ｋＤａの範囲の多量体として血漿中で見い出される（Furlan, Ann Hematol. 1996 Jun;72(6):341-8）。
ヒト循環中でのヒト第ＶＩＩＩ因子の平均生体内半減期は約１２時間である。フォン・ヴィルブランド因子は、第ＶＩＩＩ因子と複合体を形成している場合、重鎖（Ａ２ドメイン）および軽鎖（Ａ３／Ｃ２ドメイン）上の既知の潜在的なインヒビター抗体部位（Ragni, J Thromb. Haemost. 10: 2324-2327, 2012）または第ＶＩＩＩ因子分子上の他の潜在的な抗体インヒビター部位からＦＶＩＩＩを遮蔽することにより、第ＶＩＩＩ因子に対する潜在的な免疫反応を低減し得る。
ヒトにおける別の出血性疾患にフォン・ヴィルブランド病（ｖＷＤ）がある。出血症状の重篤度に応じて、ｖＷＤは、フォン・ヴィルブランド因子を含む濃縮製剤を用いた補充療法によって処置され得る。フォン・ヴィルブランド因子は、一般的に血漿に由来するが、組換えフォン・ヴィルブランド因子も開発中である。フォン・ヴィルブランド因子は、インビボで第ＶＩＩＩ因子を安定化することが知られており、第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルの制御において重要な役割を果たし、そのため、一次止血および二次止血を調節するための中心的因子である。
今日までの血友病ＡおよびｖＷＤの標準的な処置には、第ＶＩＩＩ因子製剤および第ＶＩＩＩ因子／フォン・ヴィルブランド因子濃縮製剤の頻繁な静脈内注入が伴う。これらの補充療法は一般的に効果的であるが、例えば予防的処置を受けている重度の血友病Ａ患者においては、第ＶＩＩＩ因子の血漿半減期が約１２時間と短いため、第ＶＩＩＩ因子は週に約３回静脈内（ｉ．ｖ．）投与される必要がある。すでに、０．０１Ｕ／ｍｌの第ＶＩＩＩ因子レベルの上昇に相当する、正常ヒト血漿の１％を超える第ＶＩＩＩ因子レベルを達成することで、重度の血友病Ａが中等度の血友病Ａに改善されている。予防療法においては、投与計画は、第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが非血友病者の第ＶＩＩＩ因子活性の２〜３％のレベルを下回らないように計画される。
静脈内投与（ｉ．ｖ．）による第ＶＩＩＩ因子の投与は、面倒であり、痛みを伴い、特にこれは主に患者自身によってまたは血友病Ａと診断された子供の親によって在宅治療において行われるので、感染症のリスクを伴う。さらに、頻繁な静脈内注射により、必然的に、瘢痕が形成され、将来の注入が妨げられる。それでも、緊急事態または手術において、すなわち高い第ＶＩＩＩ因子レベルが至急必要とされる場合には、ｉ．ｖ．処置が必要となり得る。
例えば国際公開第９５／０１８０４（Ａ１）号および同第９５／０２６７５０（Ａ１）号において、第ＶＩＩＩ因子の皮下投与（ｓ．ｃ．）が提唱されている。しかし、許容されるバイオアベイラビリティを達成するためには非常に高い用量の第ＶＩＩＩ因子を投与する必要があった。
非静脈内投与時のバイオアベイラビリティを改善するためのもう１つのアプローチが、アルブミン融合第ＶＩＩＩ因子を用いることであった（国際公開第２０１１／０２０８６６（Ａ２）号）。
国際公開第２０１３／０５７１６７（Ａ１）号は、第ＶＩＩＩ因子を硫化グリコサミノグリカンと組み合わせて、必要に応じてフォン・ヴィルブランド因子と共に、非静脈内投与により投与することを提唱している。
国際公開第２００８／１５１８１７（Ａ１）号は、血管外処置用の血漿由来または組換え（全長および欠失変異体）第ＶＩＩＩ因子を安定化するための非切断フォン・ヴィルブランド因子多量体の一般的使用を記載している。
国際公開第２０１３／１６０００５（Ａ１）号は、非常に特異的な第ＶＩＩＩ因子分子のｓ．ｃ．処置後のバイオアベイラビリティを改善するための組換えフォン・ヴィルブランド因子または組換えフォン・ヴィルブランド因子断片の一般的使用を記載しており、この第ＶＩＩＩ因子分子は、サイズが１００〜４００アミノ酸の短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されたＢドメインを含む。国際公開第２０１３／１６０００５（Ａ１）号によれば、１００〜４００アミノ酸の短縮型Ｂドメインを有する第ＶＩＩＩ因子分子は、Ｂドメインの全長を有する第ＩＶＩＩＩ因子、またはアミノ酸を有さないもしくは数個しか有さないＢドメイン短縮型第ＶＩＩＩ因子分子と比較して、高い第ＶＩＩＩ因子バイオアベイラビリティを示す。
バイオアベイラビリティ、安定性が改善され、および／または抗体産生のリスクが低減されたことにより、先行技術の欠点を回避する第ＶＩＩＩ因子製剤に対するニーズが依然として存在する。
本発明の目的は、代替的な第ＶＩＩＩ因子製剤を提供することである。好ましくは、これらの製剤では、安定性が改善され、バイオアベイラビリティが改善され、および／または免疫学的反応のリスクが低減されているであろう。
ある実施形態では、この目的は、第ＶＩＩＩ因子と１または複数のフォン・ヴィルブランド因子ペプチドとの複合体を含む組成物であって、フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、配列番号１の少なくともアミノ酸７６４〜１０３５およびアミノ酸１６９１〜１９０５を含むが、配列番号１のアミノ酸２２５５〜２６４５は含まない、組成物によって達成される。
本発明は、フォン・ヴィルブランド因子ペプチドを含む第ＶＩＩＩ因子製剤を提供する。第ＶＩＩＩ因子は、含まれているフォン・ヴィルブランド因子ペプチドと複合体を形成する。
本明細書において、第ＶＩＩＩ因子には、全長第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、またはＢドメインが人工リンカー、天然Ｂドメインの断片、またはその両方の組合せによって置換されている、すなわちＢドメインのサイズが全長第ＶＩＩＩ因子とは異なる第ＶＩＩＩ因子が包含される。挿入、欠失、または置換を有する限られた数の改変を有する第ＶＩＩＩ因子、特にK.R. Viel, et al. New England J Med 2009; 360:1618-1627に記載されているようなハプロタイプに適応させた第ＶＩＩＩ因子もまた包含される。好ましくは、（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ １９８６年７月２１日のＰ００４５１のアミノ酸２０〜２３５１に定義されているような）第ＶＩＩＩ因子に相同な配列であるが、W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227-258に基づくＦＡＳＴＡバージョン３６で実行されたＦＡＳＴＡによるＢドメイン中の相同性の９９％が無視される。言い換えると、配列相同性を計算する場合、Ｂドメインは両タンパク質の比較に含めない。さらに、改変された第ＶＩＩＩ因子、例えばＨＥＳ−第ＶＩＩＩ因子、もしくはＰＥＧ第ＶＩＩＩ因子、またはOldenburg, Haemophilia (2014), 20 (Suppl. 4), 23-28に記載されているような第ＶＩＩＩ因子Ｆｃ融合タンパク質および第ＶＩＩＩ因子アルブミン融合タンパク質も包含される。
本発明の第ＶＩＩＩ因子は、血漿由来であってもよく、組換え第ＶＩＩＩ因子であってもよい。組換え第ＶＩＩＩ因子を用いる場合、ヒトの糖鎖付加パターン（Casademunt, Eur J Haematol. 2012; 89:165-76）を模倣するためにヒト細胞株中で発現させるか、または国際公開第２０１０／０２０６９０号に記載されているように発現させることが好ましい。
本明細書において、フォン・ヴィルブランド因子ペプチドとは、単一アミノ酸鎖中に配列番号１の少なくともアミノ酸７６４〜１０３５および配列番号１のアミノ酸１６９１〜１９０５を含むペプチドである。これらのアミノ酸は、これらの配列の両方を共に含むさらに長い配列の一部であってもよい。言い換えると、本発明のフォン・ヴィルブランドペプチドは配列番号５および配列番号６の両方を含む。これらは、アミノ酸２２５５〜２６４５（配列番号７）の全てを除く、フォン・ヴィルブランド因子の別の部分を含んでいてもよい。フォン・ヴィルブランドペプチドは、配列番号１の一部である他の配列、または配列番号１の一部でない配列、例えばアミノ酸リンカーなど、を含んでいてもよい。好ましくは、配列番号１の一部でないアミノ酸の総量は５０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、または１０アミノ酸以下である。
本発明の重要な態様の１つは、配列番号１のアミノ酸２２５５〜２６４５がフォン・ヴィルブランド因子ペプチドの一部でないことである。言い換えると、フォン・ヴィルブランド因子ペプチドは、以下に説明されるＦＡＳＴＡで配列番号７に対して９０％以上の相同性を有する配列をいずれも含まない。
配列番号１は、２０１１年１月１１日現在のＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔデータベースの配列Ｐ０４２７５である。
本発明の組成物中の複数のフォン・ヴィルブランド因子ペプチドは、同じ配列を有するペプチドであってもよく、上に定義したような配列を有するペプチドの混合物であってもよい。
通常は、第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィルブランド因子ペプチドの分子比は１：１〜１：２０、好ましくは１：２〜１：１０となる。フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが二量体または多量体の形態である場合、分子比は一本鎖アミノ酸に基づいて計算され、すなわち、第ＶＩＩＩ因子分子とフォン・ヴィルブランド因子ペプチドの二量体との複合体では、比率は１：２となる。
本明細書において、複合体とは、１または複数のフォン・ヴィルブランド因子ペプチドへの第ＶＩＩＩ因子の非共有結合を指す。
本発明の好ましい実施形態では、フォン・ヴィルブランド因子ペプチドは、フォン・ヴィルブランド因子の断片、すなわち、Ｎ末端および／またはＣ末端短縮型のフォン・ヴィルブランド因子である。
ある実施形態では、断片は配列番号１のアミノ酸７６４〜１９０５を含む。
本発明の別の実施形態は、第ＶＩＩＩ因子と１または複数のフォン・ヴィルブランド因子ペプチドとの複合体を含む組成物であり、該フォン・ヴィルブランド因子ペプチドは、フォン・ヴィルブランド因子の断片であって、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、またはアミノ酸置換から選択される修飾が２０個以下または１０個以下である、配列番号１のアミノ酸７６４から始まりアミノ酸１９０５〜２１５３の間で終わるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する。
好ましいフォン・ヴィルブランド因子ペプチドは以下のものである。
配列番号１の配列７６４〜１９０５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９０６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９０７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９０８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９０９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０００を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１００を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１５０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１５１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１５２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１５３を有するペプチド。
配列番号１の配列７６４〜１９０５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９０６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９０７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９０８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９０９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９１９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９２９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９３９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９４９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９５９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９６９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９７９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９８９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜１９９９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０００を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２００９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０１９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０２９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０３９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０４９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０５９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０６９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０７９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０８９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２０９９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１００を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１０９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１１９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１２９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１３９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４３を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４４を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４５を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４６を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４７を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４８を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１４９を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１５０を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１５１を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１５２を有するペプチド
配列番号１の配列７６４〜２１５３を有するペプチド。
本発明の別の実施形態は、第ＶＩＩＩ因子と１または複数のフォン・ヴィルブランド因子ペプチドとの複合体を含む組成物であって、
・フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、フォン・ヴィルブランド因子の断片であり、
・第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第ＶＩＩＩ因子単独と比べて、リン脂質膜への結合の低減を示し、
・第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第ＶＩＩＩ因子と全長フォン・ヴィルブランド因子との複合体と比べて、コラーゲンＩＩＩへの結合の低減を示し、
・第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第ＶＩＩＩ因子と全長フォン・ヴィルブランド因子との複合体と比べて、ヘパリンへの結合の低減を示す、
組成物である。
・フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、フォン・ヴィルブランド因子の断片であり、
・第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第ＶＩＩＩ因子単独と比べて、リン脂質膜への結合の低減を示し、
・第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第ＶＩＩＩ因子と全長フォン・ヴィルブランド因子との複合体と比べて、コラーゲンＩＩＩへの結合の低減を示し、
・第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第ＶＩＩＩ因子と全長フォン・ヴィルブランド因子との複合体と比べて、ヘパリンへの結合の低減を示す、
組成物である。
好ましくは、フォン・ヴィルブランド因子ペプチドの分子量は５００ｋＤ未満、好ましくは４００ｋＤ未満である。フォン・ヴィルブランド因子はしばしばオリゴマーまたは多量体を形成するので、本発明のペプチドも多量体またはオリゴマーの形態であり得る。
好ましい実施形態では、本発明のペプチドは以下からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する。
（ｉ）ヘパリンに対する親和性結合定数が、ＫＤ＞１ｎＭ、好ましくは≧２．４３ｎＭである。
（ｉｉ）コラーゲンＩＩＩに対する親和性結合定数が、ＫＤ＞５ｎＭ、好ましくは≧１７．０２ｎＭである。
（ｉｉｉ）第ＶＩＩＩ因子に対する親和性結合定数が、ＫＤ＜１００ｎＭまたは＜１０ｎＭ、好ましくは≦６．１９ｎＭである。
（ｉｖ）第ＶＩＩＩ因子のリン脂質結合阻害が、７０％以上、好ましくは８０％以上、または９０％以上である。
（ｉ）ヘパリンに対する親和性結合定数が、ＫＤ＞１ｎＭ、好ましくは≧２．４３ｎＭである。
（ｉｉ）コラーゲンＩＩＩに対する親和性結合定数が、ＫＤ＞５ｎＭ、好ましくは≧１７．０２ｎＭである。
（ｉｉｉ）第ＶＩＩＩ因子に対する親和性結合定数が、ＫＤ＜１００ｎＭまたは＜１０ｎＭ、好ましくは≦６．１９ｎＭである。
（ｉｖ）第ＶＩＩＩ因子のリン脂質結合阻害が、７０％以上、好ましくは８０％以上、または９０％以上である。
本発明のフォン・ヴィルブランド因子ペプチドは、好ましくは、ヘパリンへの結合低減、コラーゲン（例えばコラーゲンＩＩＩ）への親和性低下、リン脂質への親和性低下を示すが、第ＶＩＩＩ因子への強い結合を依然として示す。
驚くべきことに、リン脂質およびコラーゲンへの結合低減により、非静脈内投与、特に皮下投与の場合に、放出速度（release rate）が改善される。
各親和性結合定数の測定は実験部分に記載されている。
ある実施形態では、フォン・ヴィルブランド因子ペプチドは、タンパク質切断（proteolytic cleavage）または化学的開裂（chemical cleavage）によりフォン・ヴィルブランド因子から得られる。タンパク質切断を用いる場合、黄色ブドウ状球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＶ−８プロテアーゼが特に好ましい。
好ましくは、本発明の組成物は以下の特性の少なくとも１つを有する。
（ｉ）フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、第ＶＩＩＩ因子を抗体結合から遮蔽して、患者におけるインヒビター形成を最小限に抑える。
（ｉｉ）−７０℃にて凍結液体形態で１２ヶ月保存した後でも９０％以上の残留第ＶＩＩＩ因子活性を与えるように、第ＶＩＩＩ因子を安定化する。
（ｉｉｉ）５℃にて凍結乾燥形態で２４ヶ月保存した後でも９０％以上の残留第ＶＩＩＩ因子活性を与えるように、第ＶＩＩＩ因子を安定化する。
（ｉｖ）２５℃にて凍結乾燥形態で１２ヶ月保存した後でも９０％以上の残留第ＶＩＩＩ因子活性を与えるように、第ＶＩＩＩ因子を安定化する。
（ｖ）生体内での第ＶＩＩＩ因子の半減期を少なくとも２０％延長する。
（ｖｉ）以前に処置されていない患者のインヒビター形成を、組成物で６ヶ月間処置した後に２０％未満、好ましくは１０％未満に低減する。
（ｉ）フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、第ＶＩＩＩ因子を抗体結合から遮蔽して、患者におけるインヒビター形成を最小限に抑える。
（ｉｉ）−７０℃にて凍結液体形態で１２ヶ月保存した後でも９０％以上の残留第ＶＩＩＩ因子活性を与えるように、第ＶＩＩＩ因子を安定化する。
（ｉｉｉ）５℃にて凍結乾燥形態で２４ヶ月保存した後でも９０％以上の残留第ＶＩＩＩ因子活性を与えるように、第ＶＩＩＩ因子を安定化する。
（ｉｖ）２５℃にて凍結乾燥形態で１２ヶ月保存した後でも９０％以上の残留第ＶＩＩＩ因子活性を与えるように、第ＶＩＩＩ因子を安定化する。
（ｖ）生体内での第ＶＩＩＩ因子の半減期を少なくとも２０％延長する。
（ｖｉ）以前に処置されていない患者のインヒビター形成を、組成物で６ヶ月間処置した後に２０％未満、好ましくは１０％未満に低減する。
驚くべきことに、フォン・ヴィルブランド因子ペプチドは、保存中の因子の安定性（有効期間）を向上させ、および／または患者におけるインヒビター形成を低減するようである。インヒビター形成は、慢性出血性疾患の処置における主要な問題の１つである。
本発明の組成物は、出血性疾患の処置または予防において特に有用である。
したがって、本発明の別の実施形態は、有効量の本発明の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、出血性疾患を処置する方法である。
量は、処置される疾患または状態によって決まり、当業者により選択され得る。長期の処置のためには、通常、１回の投与につき、体重１ｋｇ当たり２０〜４０ＩＵの量が好適である。緊急事態には、量は体重１ｋｇ当たり約１０〜５０ＩＵであってもよい。
本発明の組成物は静脈内投与または非静脈内投与によって投与され得る。非静脈内投与は、皮下注射、皮内注射、または筋肉内投与であってもよい。
本発明の方法の利点の１つは、ウイルス除去にナノ濾過を用いることができることである。フォン・ヴィルブランド因子は、そのサイズのため、小さな孔径を有するナノフィルターを用いてナノ濾過してウイルスを除去することができない。フォン・ヴィルブランド因子ペプチドは全長フォン・ヴィルブランド因子分子よりサイズがはるかに小さいため、小さな孔径によるナノ濾過が可能になる。ナノ濾過は、最も小さい既知のウイルスの１つであるブタパルボウイルスの濃度を１００分の１（２ｌｏｇ）以下に低下させる、好ましくは１０００分の１（３ｌｏｇ）以下に低下させる、最も好ましくはパルボウイルスアッセイの検出限界未満の濃度に低下させる孔径および条件で、必要に応じて１または複数のナノフィルターを直列で用いて、行われる。この試験では、ブタパルボウイルスを試料に添加（spike）し、濾過後に分析する。
したがって、本発明の別の実施形態は、第ＶＩＩＩ因子と結合する前または結合後にフォン・ヴィルブランド因子ペプチドをナノ濾過するステップを含み、これによりブタパルボウイルスが１００分の１（２ｌｏｇ）以下に低減される、ウイルスの低減方法である。
本発明の組成物を投与するための好ましい緩衝液は、メレジトースを、好ましくは最大１０００ｍＭ、特に約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、特に約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの量で含む。
本発明の別の実施形態は、以下のステップを含む、フォン・ヴィルブランド因子ペプチドの調製方法である。
・フォン・ヴィルブランド因子を黄色ブドウ状球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ−８プロテアーゼと２〜１６時間、酵素の重量：フォン・ヴィルブランド因子の重量の比を１：５〜１：１００としてインキュベートするステップ。
・陰イオン交換体上に結合させて精製し、塩濃度を増量させることにより陰イオン交換体から出てくる画分中の所望の精製ｖＷＦペプチドを回収するステップ。
・フォン・ヴィルブランド因子を黄色ブドウ状球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ−８プロテアーゼと２〜１６時間、酵素の重量：フォン・ヴィルブランド因子の重量の比を１：５〜１：１００としてインキュベートするステップ。
・陰イオン交換体上に結合させて精製し、塩濃度を増量させることにより陰イオン交換体から出てくる画分中の所望の精製ｖＷＦペプチドを回収するステップ。
非限定的な例を用いて以下に本発明をさらに説明する。
実施例１
血漿フォン・ヴィルブランド因子に由来する断片の作製および精製
断片ＩＩＩ（ＳＰＩＩＩ、ｒｅｓ． ７６４〜２１２８）の作製および精製（改変したMarti et al. Identification of disulfide-bridged substructures within human von Willebrand factor. Biochemistry 1987; 26:8099-8109による）（配列番号２）
血漿フォン・ヴィルブランド因子に由来する断片の作製および精製
断片ＩＩＩ（ＳＰＩＩＩ、ｒｅｓ． ７６４〜２１２８）の作製および精製（改変したMarti et al. Identification of disulfide-bridged substructures within human von Willebrand factor. Biochemistry 1987; 26:8099-8109による）（配列番号２）
血漿由来フォン・ヴィルブランド因子（ｐｄＶＷＦ）を黄色ブドウ状球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ−８プロテアーゼで消化することにより断片ＩＩＩを調製する。消化は、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．８バッファー中で、酵素の重量：タンパク質の重量の比を１：４０として３７℃で３時間行う。
断片の精製は、強陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ）を用いて行う。ランニングバッファーは２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４であり、溶出バッファー（バッファーＢ）は２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４である。黄色ブドウ状球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ−８プロテアーゼは、約２２ｍＳ／ｃｍ（約４０％バッファーＢ）で陰イオン交換カラムから溶出するので、断片を溶出させる前に４２％での長い洗浄ステップがプロテアーゼを洗い流すために必要である。あるいは、プロテアーゼ除去のためにＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬ上でのＳＥＣステップを行ってもよい。
断片ＩＩＩの精製および得られる生成物を図１に示す。Marti et al. 1987に定義される配列がＭＳ分析で確認された。
断片Ｉ（ＩＩＩ−Ｔ４、ｒｅｓ．７６４〜１０３５）の作製および精製（改変したMarti et al. 1987による）（配列番号３）
トリプシン（ウシ由来、ＴＰＣＫ処理済）消化により断片ＩＩＩ（ＳＰＩＩＩ）から断片Ｉを調製する。消化は、１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ ｐＨ８．０バッファー中において、酵素の重量：タンパク質の重量の比を１：１００として１．５時間行う。消化はダイズトリプシン阻害剤の添加により終了させた。
断片Ｉの精製は、強陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ）、次いでＳｕｐｅｒｏｓｅ ６、１０／３００ ＧＬ上でのＳＥＣを用いて行う。陰イオン交換カラムのランニングバッファーは２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４であり、溶出バッファー（バッファーＢ）は２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４である。ＳＥＣのランニングバッファーは、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）ｐＨ７．０である。
断片Ｉの精製および得られる生成物を図２に示す。Marti et al. 1987に定義される配列がＭＳ分析により確認された。
断片ＩＩ（ｒｅｓ．７６４〜１６７３）の作製および精製（配列番号４）
２回目の黄色ブドウ状球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ消化により断片ＩＩＩから断片ＩＩを調製する。消化は、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．８バッファー中において、酵素の重量：タンパク質の重量の比を１：１０として２１時間行う。
断片ＩＩの精製は強陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ）を用いて行う。ランニングバッファーは２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４であり、溶出バッファー（バッファーＢ）は２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４である。４２％Ｂを用いた長い洗浄ステップを含む２回目のＭｏｎｏＱ精製がプロテアーゼを除去するために必要であった。
断片ＩＩの精製および得られる生成物を図３に示す。Ｇｌｕ１６７３−Ｇｌｙ１６７４間の第２のＶ８切断部位は、Fretto et al. 1986によって決定されており、ＭＳ分析によって確認された。
実施例２
第ＶＩＩＩ因子の結合親和性の決定
改変したMcCormick et al. 2004に従い、機器Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（ＧＥヘルスケア社）を用いて分析を行った。簡潔に述べると、ｒＦＶＩＩＩをＣＭ５センサーチップに共有結合させて約２００ＲＵのコーティングレベルを得た。その後、フォン・ヴィルブランド因子断片および全長フォン・ヴィルブランド因子（ｆｌｖＷＦ）をセンサーチップ表面にインジェクションした。ランニングバッファーは２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０であった。ｆｌＶＷＦならびに断片ＩＩおよび断片ＩＩＩについて、解離親和性定数を決定した。第ＶＩＩＩ因子に対する断片Ｉの有意な結合がなかったので、ＫＤは決定されなかった。結合センサーグラムおよび計算されたＫＤ値を図４に示す。ｆｌＶＷＦは、０．６７ｎＭのＫＤでｒＦＶＩＩＩと結合し、断片ＩＩＩはより低い親和性（６．１８ｎＭのＫＤ）で結合し、断片ＩＩでは親和性はさらに低下した（１５４．６０ｎＭのＫＤ）。
第ＶＩＩＩ因子の結合親和性の決定
改変したMcCormick et al. 2004に従い、機器Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（ＧＥヘルスケア社）を用いて分析を行った。簡潔に述べると、ｒＦＶＩＩＩをＣＭ５センサーチップに共有結合させて約２００ＲＵのコーティングレベルを得た。その後、フォン・ヴィルブランド因子断片および全長フォン・ヴィルブランド因子（ｆｌｖＷＦ）をセンサーチップ表面にインジェクションした。ランニングバッファーは２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０であった。ｆｌＶＷＦならびに断片ＩＩおよび断片ＩＩＩについて、解離親和性定数を決定した。第ＶＩＩＩ因子に対する断片Ｉの有意な結合がなかったので、ＫＤは決定されなかった。結合センサーグラムおよび計算されたＫＤ値を図４に示す。ｆｌＶＷＦは、０．６７ｎＭのＫＤでｒＦＶＩＩＩと結合し、断片ＩＩＩはより低い親和性（６．１８ｎＭのＫＤ）で結合し、断片ＩＩでは親和性はさらに低下した（１５４．６０ｎＭのＫＤ）。
実施例３
リン脂質単分子膜と結合する第ＶＩＩＩ因子ならびにフォン・ヴィルブランド因子およびフォン・ヴィルブランド因子由来断片による阻害の測定
改変したSaenko et al.1999に従い、機器Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（ＧＥヘルスケア社）を用いて分析を行った。簡潔に述べると、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン）およびＤＯＰＳ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホ−Ｌ−セリン）からリン脂質ベシクルを調製した。押出機を用いてMacDonal et al. 1991に従い単層ベシクルを調製し、ＨＰＡセンサーチップ上にコーティングした。その後、目的の化合物をＰＣＰＳ表面にインジェクションし、インジェクション終了１２０秒後の結合レベルを評価した。
リン脂質単分子膜と結合する第ＶＩＩＩ因子ならびにフォン・ヴィルブランド因子およびフォン・ヴィルブランド因子由来断片による阻害の測定
改変したSaenko et al.1999に従い、機器Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（ＧＥヘルスケア社）を用いて分析を行った。簡潔に述べると、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン）およびＤＯＰＳ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホ−Ｌ−セリン）からリン脂質ベシクルを調製した。押出機を用いてMacDonal et al. 1991に従い単層ベシクルを調製し、ＨＰＡセンサーチップ上にコーティングした。その後、目的の化合物をＰＣＰＳ表面にインジェクションし、インジェクション終了１２０秒後の結合レベルを評価した。
ネガティブコントロールのフォン・ヴィルブランド因子およびＢＳＡはＰＳＰＣ表面に結合せず（図示せず）、対照的に、ｒＦＶＩＩＩは高い結合レベルを示した。この結合は、フォン・ヴィルブランド因子により完全に阻害可能であり、対照的に、高濃度ＢＳＡの添加は結合に影響を与えなかった（図５）。
限定的な消化によって得られた断片がｆｌＶＷＦ同様にＰＳＰＣ結合を阻害できるかどうかを評価するために、断片Ｉ、断片ＩＩ、および断片ＩＩＩをセンサーチップ表面にインジェクションした。断片ＩＩＩのみが、ｒＦＶＩＩＩとリン脂質単分子膜との間の相互作用を阻害することができた（図６）。この効果は用量依存的であり、ｒＦＶＩＩＩに対して２．５倍過剰料の断片ＩＩＩは、ほぼ完全な阻害を示した（図７）。
実施例４
ｆｌＶＷＦおよび断片ＩＩＩのコラーゲンＩＩＩ結合親和性の決定
改変したRomjin et al. 2003に従い、機器Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（ＧＥヘルスケア社）を用いて分析を行った。簡潔に述べると、ヒトペプシン消化ＩＩＩ型コラーゲンをＣＭ５センサーチップの表面に共有結合させた。その後、センサーチップ表面に試料をインジェクションした。ランニングバッファーは１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０であった。ｆｌＶＷＦはコラーゲンＩＩＩに非常に高い親和性（０．７５ｎＭ）で結合し、断片ＩＩＩの結合は１７．０２ｎＭまで有意に低下した（図８）。
ｆｌＶＷＦおよび断片ＩＩＩのコラーゲンＩＩＩ結合親和性の決定
改変したRomjin et al. 2003に従い、機器Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（ＧＥヘルスケア社）を用いて分析を行った。簡潔に述べると、ヒトペプシン消化ＩＩＩ型コラーゲンをＣＭ５センサーチップの表面に共有結合させた。その後、センサーチップ表面に試料をインジェクションした。ランニングバッファーは１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０であった。ｆｌＶＷＦはコラーゲンＩＩＩに非常に高い親和性（０．７５ｎＭ）で結合し、断片ＩＩＩの結合は１７．０２ｎＭまで有意に低下した（図８）。
実施例５
ｆｌＶＷＦおよび断片ＩＩＩのヘパリン結合親和性の決定
Sarafanov et al. 2001に従い、機器Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケア社）を用いて分析を行った。簡潔に述べると、ブタ腸粘膜由来のヘパリンを、ＮＨＳ−ビオチン試薬キットを用いてビオチン化し、ＳＡセンサーチップの表面に結合させた。参照フローセルはビオチンでコーティングした。その後、試料をセンサーチップ表面にインジェクションした。ランニングバッファーは１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０であった。ｆｌＶＷＦは０．６５ｎＭの親和性でヘパリンに結合し、断片ＩＩＩの結合親和性は２．４３ｎＭまで有意に低下した（図９）。
ｆｌＶＷＦおよび断片ＩＩＩのヘパリン結合親和性の決定
Sarafanov et al. 2001に従い、機器Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケア社）を用いて分析を行った。簡潔に述べると、ブタ腸粘膜由来のヘパリンを、ＮＨＳ−ビオチン試薬キットを用いてビオチン化し、ＳＡセンサーチップの表面に結合させた。参照フローセルはビオチンでコーティングした。その後、試料をセンサーチップ表面にインジェクションした。ランニングバッファーは１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０であった。ｆｌＶＷＦは０．６５ｎＭの親和性でヘパリンに結合し、断片ＩＩＩの結合親和性は２．４３ｎＭまで有意に低下した（図９）。
実施例６
血友病Ａイヌの循環中におけるＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ断片ＩＩＩ複合体の回復および半減期の測定
２匹の血友病Ａイヌに、組換えＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩを単独でまたは５倍モル過剰量のＶＷＦ断片ＩＩＩと組み合わせて、ｓ．ｃ．注射およびその後ｉ．ｖ．注射した。イヌ１は、体重（ＢＷ）１ｋｇ当たり２００ＩＵのＦＶＩＩＩ単独を投与され、イヌ２は、ＶＷＦ断片ＩＩＩとの複合体で体重（ＢＷ）１ｋｇ当たり２００ＩＵのＦＶＩＩＩを投与された。各ｓ．ｃ．薬物投与またはｉ．ｖ．薬物投与の０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３２時間後、４８時間後、７２時間後、および９６時間後に血液試料を採取した。全血凝固時間（ＷＢＣＴ）およびＦＶＩＩＩ活性発色アッセイにおける活性について試料を分析した。ＦＶＩＩＩとの複合体でＶＷＦ断片ＩＩＩを皮下投与すると、正常なイヌの凝固時間を超えるのに必要な時間が、ＦＶＩＩＩ単独のｓ．ｃ．投与と比べて１．４倍延びた（図１０）。また、ＦＶＩＩＩと共にＶＷＦ断片ＩＩＩを投与すると、ｓ．ｃ．投与およびｉ．ｖ．投与の両方で、ＦＶＩＩＩ単独の投与と比べて、イヌ血漿中のＦＶＩＩＩ活性が時間と共に上昇し、曲線下面積（ＡＵＣ）の値がほぼ２倍になった（図１１）。
血友病Ａイヌの循環中におけるＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ断片ＩＩＩ複合体の回復および半減期の測定
２匹の血友病Ａイヌに、組換えＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩを単独でまたは５倍モル過剰量のＶＷＦ断片ＩＩＩと組み合わせて、ｓ．ｃ．注射およびその後ｉ．ｖ．注射した。イヌ１は、体重（ＢＷ）１ｋｇ当たり２００ＩＵのＦＶＩＩＩ単独を投与され、イヌ２は、ＶＷＦ断片ＩＩＩとの複合体で体重（ＢＷ）１ｋｇ当たり２００ＩＵのＦＶＩＩＩを投与された。各ｓ．ｃ．薬物投与またはｉ．ｖ．薬物投与の０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３２時間後、４８時間後、７２時間後、および９６時間後に血液試料を採取した。全血凝固時間（ＷＢＣＴ）およびＦＶＩＩＩ活性発色アッセイにおける活性について試料を分析した。ＦＶＩＩＩとの複合体でＶＷＦ断片ＩＩＩを皮下投与すると、正常なイヌの凝固時間を超えるのに必要な時間が、ＦＶＩＩＩ単独のｓ．ｃ．投与と比べて１．４倍延びた（図１０）。また、ＦＶＩＩＩと共にＶＷＦ断片ＩＩＩを投与すると、ｓ．ｃ．投与およびｉ．ｖ．投与の両方で、ＦＶＩＩＩ単独の投与と比べて、イヌ血漿中のＦＶＩＩＩ活性が時間と共に上昇し、曲線下面積（ＡＵＣ）の値がほぼ２倍になった（図１１）。
実施例７
組換え断片ＩＩＩの単量体および二量体のＦＶＩＩＩ結合親和性の決定
組換え断片ＩＩＩを、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇと共にＨＥＫ２９３細胞株中で一過性に発現させ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィーで精製した。断片ＩＩＩの単量体および二量体をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分離した。分析は機器Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００を用いて行った。断片ＩＩＩの単量体および二量体をＣＭ５上に固定化し、ＦＶＩＩＩ濃度系列をセンサーチップ表面にインジェクションした。血漿由来全長ＶＷＦを対照として用いた。ランニングバッファーは１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０であった。ＦＶＩＩＩは、１．９ｎＭの親和性定数で断片ＩＩＩ二量体に結合した。単量体断片ＩＩＩに対するＦＶＩＩＩの親和性は有意に低かった（ＫＤ＝１４．３ｎＭ）（図１２）。
組換え断片ＩＩＩの単量体および二量体のＦＶＩＩＩ結合親和性の決定
組換え断片ＩＩＩを、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇと共にＨＥＫ２９３細胞株中で一過性に発現させ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィーで精製した。断片ＩＩＩの単量体および二量体をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分離した。分析は機器Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００を用いて行った。断片ＩＩＩの単量体および二量体をＣＭ５上に固定化し、ＦＶＩＩＩ濃度系列をセンサーチップ表面にインジェクションした。血漿由来全長ＶＷＦを対照として用いた。ランニングバッファーは１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０であった。ＦＶＩＩＩは、１．９ｎＭの親和性定数で断片ＩＩＩ二量体に結合した。単量体断片ＩＩＩに対するＦＶＩＩＩの親和性は有意に低かった（ＫＤ＝１４．３ｎＭ）（図１２）。
実施例８
ＶＷＦ断片ＩＩＩによる溶液中でのｒＦＶＩＩＩの安定化
２０００ＩＵの組換えＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（登録商標））を、５倍モル過剰量のＶＷＦ断片ＩＩＩを添加して、または添加せずに、２．５ｍｌの水中に再構成した。両方の調製物を４０℃でインキュベートし、４８時間、９６時間、１９２時間、３８４時間、４０８時間、および６７２時間目にアリコートを採取した。ＦＶＩＩＩ活性発色アッセイでＦＶＩＩＩ活性について試料を分析した。ＶＷＦ断片ＩＩＩは、４０℃で、ＦＶＩＩＩの有意に長い活性に寄与していた（図１３）。
ＶＷＦ断片ＩＩＩによる溶液中でのｒＦＶＩＩＩの安定化
２０００ＩＵの組換えＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（登録商標））を、５倍モル過剰量のＶＷＦ断片ＩＩＩを添加して、または添加せずに、２．５ｍｌの水中に再構成した。両方の調製物を４０℃でインキュベートし、４８時間、９６時間、１９２時間、３８４時間、４０８時間、および６７２時間目にアリコートを採取した。ＦＶＩＩＩ活性発色アッセイでＦＶＩＩＩ活性について試料を分析した。ＶＷＦ断片ＩＩＩは、４０℃で、ＦＶＩＩＩの有意に長い活性に寄与していた（図１３）。
実施例９
組換え断片ＩＩＩとＮｏｖｏＳｅｑ２１断片との間のヘパリン結合の比較
組換え断片ＩＩＩおよびＮｏｖｏＳｅｑ２１（国際公開第２０１３／１６０００５（Ａ１）号の配列番号２１）断片を、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇと共にＨＥＫ２９３細胞株中で一過性に発現させ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いてヘパリン結合を調べた。両方の組換え断片をヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ １ｍｌ、ＧＥヘルスケア社）に結合させ、０〜５００ｍＭの範囲のＮａＣｌの直線塩勾配で溶出させた。どちらの断片も３連で行った。図１４参照。ＮｏｖｏＳｅｑ２１断片の平均溶出ピークは１５．５７±０．０４分であり、これは２８５．３８１ｍＭ ＮａＣｌに相当し、断片ＩＩＩの平均溶出ピークは１５．４７±０．０２分であり、これは２８２．０５１ｍＭ ＮａＣｌに相当する。このことは、ＮｏｖｏＳｅｑ２１断片のヘパリン親和性がより高いことを示している。
組換え断片ＩＩＩとＮｏｖｏＳｅｑ２１断片との間のヘパリン結合の比較
組換え断片ＩＩＩおよびＮｏｖｏＳｅｑ２１（国際公開第２０１３／１６０００５（Ａ１）号の配列番号２１）断片を、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇと共にＨＥＫ２９３細胞株中で一過性に発現させ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いてヘパリン結合を調べた。両方の組換え断片をヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ １ｍｌ、ＧＥヘルスケア社）に結合させ、０〜５００ｍＭの範囲のＮａＣｌの直線塩勾配で溶出させた。どちらの断片も３連で行った。図１４参照。ＮｏｖｏＳｅｑ２１断片の平均溶出ピークは１５．５７±０．０４分であり、これは２８５．３８１ｍＭ ＮａＣｌに相当し、断片ＩＩＩの平均溶出ピークは１５．４７±０．０２分であり、これは２８２．０５１ｍＭ ＮａＣｌに相当する。このことは、ＮｏｖｏＳｅｑ２１断片のヘパリン親和性がより高いことを示している。
分析方法
分析方法の説明
ＦＶＩＩＩ：Ｃ、Ｃｏａｔｅｓｔに基づくスクリーニング方法
方法は、２段階の原理に基づき、マイクロプレート技術を用いて行われた。第１段階では、ＦＶＩＩＩ：Ｃが補因子として働く内因性経路により活性化第Ｘ因子（Ｘａ）が生成される。その後、第２段階で、合成発色基質Ｓ−２２２２を用いて、トロンビンによる基質の加水分解を防ぐためのトロンビン阻害剤Ｉ−２５８１の存在下で、第Ｘａ因子を測定する。酸で反応を停止させ、ｐＮＡ（パラ−ニトロアニリン）の放出に比例するＶＩＩＩ：Ｃ活性を測光法により４０５ｎｍで試薬ブランクに対して測定する。
分析方法の説明
ＦＶＩＩＩ：Ｃ、Ｃｏａｔｅｓｔに基づくスクリーニング方法
方法は、２段階の原理に基づき、マイクロプレート技術を用いて行われた。第１段階では、ＦＶＩＩＩ：Ｃが補因子として働く内因性経路により活性化第Ｘ因子（Ｘａ）が生成される。その後、第２段階で、合成発色基質Ｓ−２２２２を用いて、トロンビンによる基質の加水分解を防ぐためのトロンビン阻害剤Ｉ−２５８１の存在下で、第Ｘａ因子を測定する。酸で反応を停止させ、ｐＮＡ（パラ−ニトロアニリン）の放出に比例するＶＩＩＩ：Ｃ活性を測光法により４０５ｎｍで試薬ブランクに対して測定する。
方法はヨーロッパ薬局方の要件を満たす。ＦＶＩＩＩ：Ｃの単位は、世界保健機関（ＷＨＯ）によって確立された現在のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＩＳ）で定義される国際単位（ＩＵ）で表される。前希釈（ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ）に重度血友病血漿の代わりに１％ＢＳＡを含むバッファーを用いてルーチンを検証した。参照文献も参照（European Pharmacopoeia Supplement 2000, general Methods, 2.7.4. Assay of Blood Coagulation FVIII; Rosen S (1984) Assay of FVIII: C with a Chromogenic Substrate. J, Haematol, Suppl 40, vol 33, 139-145, 1984; Carlebjork G, Oswaldsson U, Rosen S (1987) A simple and accurate micro plate assay for the determination of FVIII activity. Thrombosis Research 47; 5-14, 1987; Mire-Sluis AR, Gerrard T, Gaines das R, Padilla A and Thorpe R. Biological assays: Their Role in the development and quality Control of Recombinant Biological Medicinal Products. Biological, 24, 351-362 (1996)）。
ブラッドフォード法による総タンパク質の測定
ブラッドフォード法によるタンパク質測定は、タンパク質への結合が起こる際にクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０の酸性溶液の吸収極大が４６５ｎｍから５９５ｎｍにシフトするという観察結果に基づく。疎水性相互作用およびイオン性相互作用の両方が、色素の陰イオン形態を安定化し、可視色変化を生じさせる。色素−アルブミン複合体溶液の吸光係数が１０倍の濃度範囲にわたり一定であるので、このアッセイは有用である。他の情報については、参照文献Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976も参照。
ブラッドフォード法によるタンパク質測定は、タンパク質への結合が起こる際にクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０の酸性溶液の吸収極大が４６５ｎｍから５９５ｎｍにシフトするという観察結果に基づく。疎水性相互作用およびイオン性相互作用の両方が、色素の陰イオン形態を安定化し、可視色変化を生じさせる。色素−アルブミン複合体溶液の吸光係数が１０倍の濃度範囲にわたり一定であるので、このアッセイは有用である。他の情報については、参照文献Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976も参照。
アミノ酸分析（ＡＡＡ）による総タンパク質の測定
ＡＡＡの前に、全タンパク質を６Ｍ ＨＣｌで２４時間、１１０℃で加水分解する。アミノ酸を、スルホン化ポリスチレン樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーで分離し、溶出液中で連続的に検出する。検出は、ポストカラムニンヒドリン誘導体化に基づき、プロリンおよびヒドロキシプロリンについて４４０ｎｍならびに他の全てのアミノ酸について５７０ｎｍを同時測定するための二重光度計を用いる。アミノ酸アスパラギンおよびグルタミンはいずれもＡＡＡ中に脱アミド化されて、それぞれアスパラギン酸およびグルタミン酸として測定される。そのため、アスパラギン酸およびグルタミン酸の結果はそれぞれ、元の試料中のアスパラギン酸／アスパラギン（Ａｓｘ）およびグルタミン酸／グルタミン（Ｇｌｘ）の合計を表す。トリプトファンは、この方法で別個の応答を生じないので、ＡＡＡによって定量化されない。システインは加水分解中に破壊され、定量化されない。ＡＡＡは参照文献にさらに説明されている：Total protein AAA analytical method. Spackman, D. H., Stein, W. H., and Moore, S. (1958) Anal. Biochem. 30: 1190-1206。
ＡＡＡの前に、全タンパク質を６Ｍ ＨＣｌで２４時間、１１０℃で加水分解する。アミノ酸を、スルホン化ポリスチレン樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーで分離し、溶出液中で連続的に検出する。検出は、ポストカラムニンヒドリン誘導体化に基づき、プロリンおよびヒドロキシプロリンについて４４０ｎｍならびに他の全てのアミノ酸について５７０ｎｍを同時測定するための二重光度計を用いる。アミノ酸アスパラギンおよびグルタミンはいずれもＡＡＡ中に脱アミド化されて、それぞれアスパラギン酸およびグルタミン酸として測定される。そのため、アスパラギン酸およびグルタミン酸の結果はそれぞれ、元の試料中のアスパラギン酸／アスパラギン（Ａｓｘ）およびグルタミン酸／グルタミン（Ｇｌｘ）の合計を表す。トリプトファンは、この方法で別個の応答を生じないので、ＡＡＡによって定量化されない。システインは加水分解中に破壊され、定量化されない。ＡＡＡは参照文献にさらに説明されている：Total protein AAA analytical method. Spackman, D. H., Stein, W. H., and Moore, S. (1958) Anal. Biochem. 30: 1190-1206。
純度または比活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ／総タンパク質）
試料の純度（または比活性ともいう）は、ＦＶＩＩＩ：Ｃ分析から得られた値を全タンパク質の分析から得られた値で割ることにより計算される。
試料の純度（または比活性ともいう）は、ＦＶＩＩＩ：Ｃ分析から得られた値を全タンパク質の分析から得られた値で割ることにより計算される。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（分子量分布）
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）では、サイズに基づいてタンパク質が分離される。本方法では、還元条件下で行われるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥについて説明する。変性および還元条件下で試料を加熱することにより、タンパク質の折り畳み構造がほどかれ、アニオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）でコーティングされて、ポリペプチド鎖の長さに比例する高い正味の負電荷を獲得する。負に帯電したタンパク質分子は、ポリアクリルアミドゲルマトリックスにローディングされて電場の中に置かれると、正に帯電した電極に向かって移動し、分子ふるい効果によって、すなわち分子量によって分離される。ポリアクリルアミドゲルは大きな分子が小さな分子と同じ速さで移動することを抑制する。ＳＤＳ変性ポリペプチド間では質量に対する電荷の比がほぼ同じなので、タンパク質の最終的な分離は、ポリペプチドの相対分子量の差にほぼ完全に依存する。均一な密度のゲル中で、タンパク質の相対移動距離（Ｒｆ）は、その質量の対数（ｌｏｇ）に負に比例する。質量既知のタンパク質を質量未知のタンパク質と同時に流動した場合、Ｒｆと質量の間の関係をプロットすることができ、未知のタンパク質の質量を推定することができる。電気泳動によって分離されたタンパク質のバンドは銀染色によって可視化される。標準、参照（対照試料）、および分析試料の外観を判定することにより視覚的に評価がなされる。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）では、サイズに基づいてタンパク質が分離される。本方法では、還元条件下で行われるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥについて説明する。変性および還元条件下で試料を加熱することにより、タンパク質の折り畳み構造がほどかれ、アニオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）でコーティングされて、ポリペプチド鎖の長さに比例する高い正味の負電荷を獲得する。負に帯電したタンパク質分子は、ポリアクリルアミドゲルマトリックスにローディングされて電場の中に置かれると、正に帯電した電極に向かって移動し、分子ふるい効果によって、すなわち分子量によって分離される。ポリアクリルアミドゲルは大きな分子が小さな分子と同じ速さで移動することを抑制する。ＳＤＳ変性ポリペプチド間では質量に対する電荷の比がほぼ同じなので、タンパク質の最終的な分離は、ポリペプチドの相対分子量の差にほぼ完全に依存する。均一な密度のゲル中で、タンパク質の相対移動距離（Ｒｆ）は、その質量の対数（ｌｏｇ）に負に比例する。質量既知のタンパク質を質量未知のタンパク質と同時に流動した場合、Ｒｆと質量の間の関係をプロットすることができ、未知のタンパク質の質量を推定することができる。電気泳動によって分離されたタンパク質のバンドは銀染色によって可視化される。標準、参照（対照試料）、および分析試料の外観を判定することにより視覚的に評価がなされる。
第ＶＩＩＩ因子抗原（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）の含有量
第ＶＩＩＩ因子抗原（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）の量は、（１８）にさらに説明されているように、ＥＬＩＳＡキット（ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＶＩＩＩ：Ａｇ、第ＶＩＩＩ因子用の酵素イムノアッセイ、キット、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社（フランス））を用いて、試料希釈のためのキット添付のバッファーをトリス−ＮａＣｌバッファー＋１％ウシ血清アルブミンに置き換えて、測定される。
第ＶＩＩＩ因子抗原（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）の量は、（１８）にさらに説明されているように、ＥＬＩＳＡキット（ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＶＩＩＩ：Ａｇ、第ＶＩＩＩ因子用の酵素イムノアッセイ、キット、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社（フランス））を用いて、試料希釈のためのキット添付のバッファーをトリス−ＮａＣｌバッファー＋１％ウシ血清アルブミンに置き換えて、測定される。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
未変性バッファー条件（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍアルギニン、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．５）下で処理されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）分析カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、１０／３００ＧＬ、ＧＥヘルスケア社）を用いて、単量体、凝集体（aggregate）、および断片を測定する。試料負荷は、サイズ排除カラムの約１％であり、第ＶＩＩＩ因子：Ｃ濃度は約１０００ＩＵ／ｍｌである。
未変性バッファー条件（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍアルギニン、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．５）下で処理されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）分析カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、１０／３００ＧＬ、ＧＥヘルスケア社）を用いて、単量体、凝集体（aggregate）、および断片を測定する。試料負荷は、サイズ排除カラムの約１％であり、第ＶＩＩＩ因子：Ｃ濃度は約１０００ＩＵ／ｍｌである。
第ＶＩＩＩ因子に対するウェスタンブロット
ＦＶＩＩＩウェスタンブロットを用いてサイズに基づき第ＶＩＩＩ因子変性産物を測定する。第ＶＩＩＩ因子調製物中のＦＶＩＩＩ分子量分布タンパク質およびペプチドを、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分子量に従って分離する。その後、タンパク質をゲルマトリックスからニトロセルロースメンブレンに電気泳動的に転写し、その後、ブロッキング剤とインキュベートする。その後、全ヒト第ＶＩＩＩ因子分子に対する市販のポリクローナルヒツジ抗体を加え、次いで、酵素標識二次抗体をプローブとして加える。第３ステップとして、化学発光基質を加え、酵素と結合すると副生成物として光が生じる。光のアウトプットは、冷却電荷結合素子カメラを用いてリアルタイム画像として取り込まれる。シグナルの強度は、ブロッティングメンブレン上の抗原（ＦＶＩＩＩ）の存在量に相関する。
ＦＶＩＩＩウェスタンブロットを用いてサイズに基づき第ＶＩＩＩ因子変性産物を測定する。第ＶＩＩＩ因子調製物中のＦＶＩＩＩ分子量分布タンパク質およびペプチドを、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分子量に従って分離する。その後、タンパク質をゲルマトリックスからニトロセルロースメンブレンに電気泳動的に転写し、その後、ブロッキング剤とインキュベートする。その後、全ヒト第ＶＩＩＩ因子分子に対する市販のポリクローナルヒツジ抗体を加え、次いで、酵素標識二次抗体をプローブとして加える。第３ステップとして、化学発光基質を加え、酵素と結合すると副生成物として光が生じる。光のアウトプットは、冷却電荷結合素子カメラを用いてリアルタイム画像として取り込まれる。シグナルの強度は、ブロッティングメンブレン上の抗原（ＦＶＩＩＩ）の存在量に相関する。
２Ｄ−ＰＡＧＥ
第ＶＩＩＩ因子タンパク質鎖の電気泳動バンドパターンを調べるために２Ｄ電気泳動および銀染色を行った。一次元目の泳動としてｐＨ３〜１０の直線ｐＨ勾配を用いて等電点電気泳動を行った。トリス酢酸（３〜８％）ゲルを用いて二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。二次元目の泳動の後、銀染色を用いてゲルを染色した。
第ＶＩＩＩ因子タンパク質鎖の電気泳動バンドパターンを調べるために２Ｄ電気泳動および銀染色を行った。一次元目の泳動としてｐＨ３〜１０の直線ｐＨ勾配を用いて等電点電気泳動を行った。トリス酢酸（３〜８％）ゲルを用いて二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。二次元目の泳動の後、銀染色を用いてゲルを染色した。
総タンパク質（ブラッドフォード）
ブラッドフォード法によるタンパク質測定は、タンパク質への結合が起こる際にクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０の酸性溶液の吸収極大が４６５ｎｍから５９５ｎｍにシフトするという観察に基づく。疎水性相互作用およびイオン性相互作用の両方が、色素の陰イオン形態を安定化し、可視色変化を生じさせる。色素−アルブミン複合体溶液の吸光係数が１０倍の濃度範囲にわたり一定であるので、このアッセイは有用である。他の情報については、参照文献Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976も参照。
ブラッドフォード法によるタンパク質測定は、タンパク質への結合が起こる際にクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０の酸性溶液の吸収極大が４６５ｎｍから５９５ｎｍにシフトするという観察に基づく。疎水性相互作用およびイオン性相互作用の両方が、色素の陰イオン形態を安定化し、可視色変化を生じさせる。色素−アルブミン複合体溶液の吸光係数が１０倍の濃度範囲にわたり一定であるので、このアッセイは有用である。他の情報については、参照文献Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976も参照。
本明細書に引用された全ての参照文献は、本明細書中の明示的教示と矛盾しない限り、参照により組み入れられるものとする。
Claims (10)
- 第ＶＩＩＩ因子と１または複数のフォン・ヴィルブランド因子ペプチドとの複合体を含み、
前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドは、フォン・ヴィルブランド因子の断片であって、配列番号１の少なくともアミノ酸７６４〜１９０５を含むが、配列番号１のアミノ酸２２５５〜２６４５は含まず、
前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドのヘパリンに対する親和性結合定数はＫ Ｄ ≧２．４３ｎＭであり、
皮下注射によって投与される、
出血性疾患の処置または予防に使用するための組成物。 - 前記フォン・ヴィルブランド因子の断片が、配列番号１のアミノ酸７６４から始まりアミノ酸１９０５〜２１５３の間で終わるアミノ酸配列に１０個以下の欠失、挿入、または置換を行ったアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
- 前記第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第ＶＩＩＩ因子単独と比べて、リン脂質膜への結合が低減しており、
前記第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第ＶＩＩＩ因子と全長フォン・ヴィルブランド因子との複合体と比べて、コラーゲンＩＩＩへの結合が低減しており、
前記第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第ＶＩＩＩ因子と全長フォン・ヴィルブランド因子との複合体と比べて、ヘパリンへの結合が低減している、
請求項１又は２に記載の組成物。 - 前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドの分子量が、５００ｋＤ未満である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、以下からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の組成物。
（ｉ）コラーゲンＩＩＩに対する親和性結合定数が、ＫＤ＞５ｎＭである。
（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子に対する親和性結合定数が、ＫＤ＜１００ｎＭである。
（ｉｉｉ）第ＶＩＩＩ因子とリン脂質との結合の阻害が、７０％以上である。 - 前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、タンパク質切断（proteolytic cleavage）または化学的開裂（chemical cleavage）によりヴィルブランド因子から得られる、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の組成物。
- 第ＶＩＩＩ因子が、全長第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、または異なるサイズのＢドメインを有する第ＶＩＩＩ因子である、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の組成物。
- 第ＶＩＩＩ因子が、血漿由来第ＶＩＩＩ因子または組換え第ＶＩＩＩ因子である、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、以下からなる群から選択される特性の少なくとも１つを有する、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の組成物。
（ｉ）前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、第ＶＩＩＩ因子を抗体結合から遮蔽して、患者におけるインヒビター形成を最小限に抑える。
（ｉｉ）−７０℃にて凍結液体形態で１２ヶ月保存した後でも９０％以上の残留第ＶＩＩＩ因子活性を与えるように、第ＶＩＩＩ因子を安定化する。
（ｉｉｉ）５℃にて凍結乾燥形態で２４ヶ月保存した後でも９０％以上の残留第ＶＩＩＩ因子活性を与えるように、第ＶＩＩＩ因子を安定化する。
（ｉｖ）２５℃にて凍結乾燥形態で１２ヶ月保存した後でも９０％以上の残留第ＶＩＩＩ因子活性を与えるように、第ＶＩＩＩ因子を安定化する。
（ｖ）生体内での第ＶＩＩＩ因子の半減期を少なくとも２０％延長する。
（ｖｉ）以前に処置されていない患者におけるインヒビター形成を、前記組成物で６ヶ月間処置した後に２０％未満に低減する。 - 請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の組成物中のウイルスの低減方法であって、第ＶＩＩＩ因子との複合体形成前または形成後に前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドをナノ濾過するステップを含み、これにより、ブタパルボウイルスが存在する場合には、ブタパルボウイルスが１００分の１以下に低減される、前記方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14171579 | 2014-06-06 | ||
| EP14171579.7 | 2014-06-06 | ||
| PCT/EP2015/062730 WO2015185758A2 (en) | 2014-06-06 | 2015-06-08 | Preparation comprising factor viii and von willebrand factor peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017518376A JP2017518376A (ja) | 2017-07-06 |
| JP6605593B2 true JP6605593B2 (ja) | 2019-11-13 |
Family
ID=50884302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017516207A Active JP6605593B2 (ja) | 2014-06-06 | 2015-06-08 | 第ｖｉｉｉ因子およびフォン・ヴィルブランド因子ペプチドを含む製剤 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10251940B2 (ja) |
| EP (2) | EP3152230B1 (ja) |
| JP (1) | JP6605593B2 (ja) |
| KR (1) | KR20170010895A (ja) |
| CN (1) | CN106414492B (ja) |
| AU (1) | AU2015270394B2 (ja) |
| BR (1) | BR112016026842A2 (ja) |
| CA (1) | CA2949323A1 (ja) |
| DK (2) | DK3152230T3 (ja) |
| ES (2) | ES2747815T3 (ja) |
| IL (1) | IL249294A0 (ja) |
| RU (1) | RU2714154C2 (ja) |
| WO (1) | WO2015185758A2 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3400002B1 (en) | 2016-01-07 | 2022-02-02 | CSL Behring Lengnau AG | Mutated truncated von willebrand factor |
| JP2019522962A (ja) | 2016-05-20 | 2019-08-22 | オクタファルマ アクチェン ゲゼルシャフト | 改善された薬物動態を有する、グリコシル化ｖｗｆ融合タンパク質 |
| TW201828974A (zh) | 2016-11-11 | 2018-08-16 | 瑞士商Ｃｓｌ貝林重組技能公司 | 用於血管外施予以治療或預防凝血疾病之截短型類血友病因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）多肽類 |
| CA3068098A1 (en) | 2017-06-22 | 2018-12-27 | CSL Behring Lengnau AG | Modulation of fviii immunogenicity by truncated vwf |
| JP2021523878A (ja) | 2018-05-18 | 2021-09-09 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | 血友病ａを処置する方法 |
| KR20220029733A (ko) * | 2019-07-04 | 2022-03-08 | 체에스엘 베링 렝나우 아게 | 응고 인자 viii의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (vwf) |
| US20220305089A1 (en) | 2019-08-16 | 2022-09-29 | Octapharma Ag | Stabilizing buffer for factor viii and vwf |
| WO2024200652A1 (en) | 2023-03-31 | 2024-10-03 | Octapharma Ag | Fviii-vwf fusion proteins with improved pharmacokinetics |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE504074C2 (sv) | 1993-07-05 | 1996-11-04 | Pharmacia Ab | Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering |
| IL113010A0 (en) | 1994-03-31 | 1995-10-31 | Pharmacia Ab | Pharmaceutical formulation comprising factor VIII or factor ix with an activity of at least 200 IU/ml and an enhancer for improved subcutaneous intramuscular or intradermal administration |
| JP2010529155A (ja) | 2007-06-13 | 2010-08-26 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 出血性疾患の治療及び予防的処置における血管外投与のためのｖｗｆ安定化ｆｖｉｉｉ製剤及びｆｖｉｉｉなしのｖｗｆ製剤の使用 |
| ES2298096B1 (es) * | 2008-01-08 | 2009-01-01 | Grifols, S.A. | Procedimiento para la obtencion de un concentrado de factor von willebrand o del complejo de factor viii/factor von willebrand y utilizacionde los mismos. |
| MX2011001624A (es) | 2008-08-21 | 2011-03-28 | Octapharma Ag | Factor viii y ix humano producido en forma recombinante. |
| AU2010284116B9 (en) * | 2009-08-20 | 2015-03-26 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Purification of VWF for increased removal of non-lipid enveloped viruses |
| AU2010284977A1 (en) | 2009-08-20 | 2012-03-29 | Csl Behring Gmbh | Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders |
| KR20140083036A (ko) | 2011-10-18 | 2014-07-03 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 인자 ｖｉｉｉ의 생체이용률을 향상시키기 위한 황산화 글리코사미노글리칸의 용도 |
| CN104411323A (zh) | 2012-04-24 | 2015-03-11 | 诺和诺德A/S（股份有限公司） | 适用于治疗血友病的药物组合物 |
| JP2015515482A (ja) * | 2012-04-24 | 2015-05-28 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 血友病の治療に適する化合物 |
-
2015
- 2015-06-08 EP EP15732554.9A patent/EP3152230B1/en active Active
- 2015-06-08 EP EP18159816.0A patent/EP3360895B1/en active Active
- 2015-06-08 RU RU2016152151A patent/RU2714154C2/ru active
- 2015-06-08 KR KR1020177000328A patent/KR20170010895A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-06-08 ES ES15732554T patent/ES2747815T3/es active Active
- 2015-06-08 WO PCT/EP2015/062730 patent/WO2015185758A2/en active Application Filing
- 2015-06-08 US US15/316,711 patent/US10251940B2/en active Active
- 2015-06-08 ES ES18159816T patent/ES2895798T3/es active Active
- 2015-06-08 CA CA2949323A patent/CA2949323A1/en not_active Abandoned
- 2015-06-08 AU AU2015270394A patent/AU2015270394B2/en active Active
- 2015-06-08 JP JP2017516207A patent/JP6605593B2/ja active Active
- 2015-06-08 DK DK15732554T patent/DK3152230T3/da active
- 2015-06-08 BR BR112016026842A patent/BR112016026842A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-06-08 DK DK18159816.0T patent/DK3360895T3/da active
- 2015-06-08 CN CN201580029649.9A patent/CN106414492B/zh active Active
-
2016
- 2016-11-30 IL IL249294A patent/IL249294A0/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20170010895A (ko) | 2017-02-01 |
| BR112016026842A2 (pt) | 2017-12-12 |
| AU2015270394A1 (en) | 2016-11-24 |
| AU2015270394B2 (en) | 2017-12-21 |
| EP3152230A2 (en) | 2017-04-12 |
| RU2714154C2 (ru) | 2020-02-12 |
| WO2015185758A2 (en) | 2015-12-10 |
| EP3360895A3 (en) | 2018-10-17 |
| US20180185455A1 (en) | 2018-07-05 |
| DK3360895T3 (da) | 2021-11-15 |
| US10251940B2 (en) | 2019-04-09 |
| RU2016152151A3 (ja) | 2019-02-06 |
| EP3360895A2 (en) | 2018-08-15 |
| CN106414492B (zh) | 2021-07-06 |
| JP2017518376A (ja) | 2017-07-06 |
| WO2015185758A3 (en) | 2016-02-11 |
| CN106414492A (zh) | 2017-02-15 |
| CA2949323A1 (en) | 2015-12-10 |
| RU2016152151A (ru) | 2018-07-10 |
| EP3152230B1 (en) | 2019-08-07 |
| EP3360895B1 (en) | 2021-08-11 |
| IL249294A0 (en) | 2017-02-28 |
| ES2895798T3 (es) | 2022-02-22 |
| ES2747815T3 (es) | 2020-03-11 |
| DK3152230T3 (da) | 2019-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6605593B2 (ja) | 第ｖｉｉｉ因子およびフォン・ヴィルブランド因子ペプチドを含む製剤 | |
| JP2023134851A (ja) | 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法 | |
| CN104788557A (zh) | 具有减少的细胞摄取的因子viii变体 | |
| JP2009161547A (ja) | 高度に精製された第ｖｉｉｉ因子コンプレックス | |
| US11560436B2 (en) | Anti-VWF D'D3 single-domain antibodies fuse to clotting factors | |
| US6579723B1 (en) | Method of recovering highly purified vWF or factor VIII/vWF-complex | |
| JP2017509593A (ja) | ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの改良された比を有する第ＶＩＩＩ因子を製造するための方法 | |
| Shestopal et al. | Expression and characterization of a codon‐optimized blood coagulation factor VIII | |
| ITFI20090007A1 (it) | Nuovo processo di purificazione altamente selettivo di due proteine plasmatiche: von willebrand factor (vwf) e fibronectina (fn). | |
| US10053500B2 (en) | Variant of antihemophilic factor VIII having increased specific activity | |
| Chavin et al. | The Purification, Structure, and Function of Factor VIII | |
| JP2001506987A (ja) | フォンビルブラント因子誘導体及びタンパク質の単離法 | |
| CN111183151A (zh) | 因子viii亚种的纯化 | |
| CA2251558C (en) | Highly purified factor viii complex | |
| US20230190881A1 (en) | Subcutaneous administration of factor viii | |
| WO2017050820A1 (en) | Fviii fusion proteins | |
| EP3785726A1 (en) | Factor viii protein with increased half-life | |
| CA2890848C (en) | Protein stabilizing factors apolipoprotein a-1 or high density lipoprotein | |
| AU2008202293A1 (en) | Stabilized proteins with engineered disulfide bonds | |
| Ofosu | Functions of von Willebrand Factor in Plasma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180521 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190312 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190611 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190911 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20191001 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20191016 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6605593 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |