JP6605593B2 - 第viii因子およびフォン・ヴィルブランド因子ペプチドを含む製剤 - Google Patents
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・フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、フォン・ヴィルブランド因子の断片であり、
・第VIII因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第VIII因子単独と比べて、リン脂質膜への結合の低減を示し、
・第VIII因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第VIII因子と全長フォン・ヴィルブランド因子との複合体と比べて、コラーゲンIIIへの結合の低減を示し、
・第VIII因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第VIII因子と全長フォン・ヴィルブランド因子との複合体と比べて、ヘパリンへの結合の低減を示す、
組成物である。
(i)ヘパリンに対する親和性結合定数が、KD>1nM、好ましくは≧2.43nMである。
(ii)コラーゲンIIIに対する親和性結合定数が、KD>5nM、好ましくは≧17.02nMである。
(iii)第VIII因子に対する親和性結合定数が、KD<100nMまたは<10nM、好ましくは≦6.19nMである。
(iv)第VIII因子のリン脂質結合阻害が、70%以上、好ましくは80%以上、または90%以上である。
(i)フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、第VIII因子を抗体結合から遮蔽して、患者におけるインヒビター形成を最小限に抑える。
(ii)−70℃にて凍結液体形態で12ヶ月保存した後でも90%以上の残留第VIII因子活性を与えるように、第VIII因子を安定化する。
(iii)5℃にて凍結乾燥形態で24ヶ月保存した後でも90%以上の残留第VIII因子活性を与えるように、第VIII因子を安定化する。
(iv)25℃にて凍結乾燥形態で12ヶ月保存した後でも90%以上の残留第VIII因子活性を与えるように、第VIII因子を安定化する。
(v)生体内での第VIII因子の半減期を少なくとも20%延長する。
(vi)以前に処置されていない患者のインヒビター形成を、組成物で6ヶ月間処置した後に20%未満、好ましくは10%未満に低減する。
・フォン・ヴィルブランド因子を黄色ブドウ状球菌(S.aureus)V−8プロテアーゼと2〜16時間、酵素の重量:フォン・ヴィルブランド因子の重量の比を1:5〜1:100としてインキュベートするステップ。
・陰イオン交換体上に結合させて精製し、塩濃度を増量させることにより陰イオン交換体から出てくる画分中の所望の精製vWFペプチドを回収するステップ。
血漿フォン・ヴィルブランド因子に由来する断片の作製および精製
断片III(SPIII、res. 764〜2128)の作製および精製(改変したMarti et al. Identification of disulfide-bridged substructures within human von Willebrand factor. Biochemistry 1987; 26:8099-8109による)(配列番号2)
第VIII因子の結合親和性の決定
改変したMcCormick et al. 2004に従い、機器Biacore 2000(GEヘルスケア社)を用いて分析を行った。簡潔に述べると、rFVIIIをCM5センサーチップに共有結合させて約200RUのコーティングレベルを得た。その後、フォン・ヴィルブランド因子断片および全長フォン・ヴィルブランド因子(flvWF)をセンサーチップ表面にインジェクションした。ランニングバッファーは20mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.02%Tween20であった。flVWFならびに断片IIおよび断片IIIについて、解離親和性定数を決定した。第VIII因子に対する断片Iの有意な結合がなかったので、KDは決定されなかった。結合センサーグラムおよび計算されたKD値を図4に示す。flVWFは、0.67nMのKDでrFVIIIと結合し、断片IIIはより低い親和性(6.18nMのKD)で結合し、断片IIでは親和性はさらに低下した(154.60nMのKD)。
リン脂質単分子膜と結合する第VIII因子ならびにフォン・ヴィルブランド因子およびフォン・ヴィルブランド因子由来断片による阻害の測定
改変したSaenko et al.1999に従い、機器Biacore 2000(GEヘルスケア社)を用いて分析を行った。簡潔に述べると、DOPC(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロール−3−ホスホコリン)およびDOPS(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロール−3−ホスホ−L−セリン)からリン脂質ベシクルを調製した。押出機を用いてMacDonal et al. 1991に従い単層ベシクルを調製し、HPAセンサーチップ上にコーティングした。その後、目的の化合物をPCPS表面にインジェクションし、インジェクション終了120秒後の結合レベルを評価した。
flVWFおよび断片IIIのコラーゲンIII結合親和性の決定
改変したRomjin et al. 2003に従い、機器Biacore 2000(GEヘルスケア社)を用いて分析を行った。簡潔に述べると、ヒトペプシン消化III型コラーゲンをCM5センサーチップの表面に共有結合させた。その後、センサーチップ表面に試料をインジェクションした。ランニングバッファーは10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005%Tween20であった。flVWFはコラーゲンIIIに非常に高い親和性(0.75nM)で結合し、断片IIIの結合は17.02nMまで有意に低下した(図8)。
flVWFおよび断片IIIのヘパリン結合親和性の決定
Sarafanov et al. 2001に従い、機器Biacore T200(GEヘルスケア社)を用いて分析を行った。簡潔に述べると、ブタ腸粘膜由来のヘパリンを、NHS−ビオチン試薬キットを用いてビオチン化し、SAセンサーチップの表面に結合させた。参照フローセルはビオチンでコーティングした。その後、試料をセンサーチップ表面にインジェクションした。ランニングバッファーは150mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.05%Tween20であった。flVWFは0.65nMの親和性でヘパリンに結合し、断片IIIの結合親和性は2.43nMまで有意に低下した(図9)。
血友病Aイヌの循環中におけるFVIIIまたはFVIII/VWF断片III複合体の回復および半減期の測定
2匹の血友病Aイヌに、組換えBドメイン欠失FVIIIを単独でまたは5倍モル過剰量のVWF断片IIIと組み合わせて、s.c.注射およびその後i.v.注射した。イヌ1は、体重(BW)1kg当たり200IUのFVIII単独を投与され、イヌ2は、VWF断片IIIとの複合体で体重(BW)1kg当たり200IUのFVIIIを投与された。各s.c.薬物投与またはi.v.薬物投与の0.5時間後、1時間後、2時間後、4時間後、8時間後、12時間後、24時間後、32時間後、48時間後、72時間後、および96時間後に血液試料を採取した。全血凝固時間(WBCT)およびFVIII活性発色アッセイにおける活性について試料を分析した。FVIIIとの複合体でVWF断片IIIを皮下投与すると、正常なイヌの凝固時間を超えるのに必要な時間が、FVIII単独のs.c.投与と比べて1.4倍延びた(図10)。また、FVIIIと共にVWF断片IIIを投与すると、s.c.投与およびi.v.投与の両方で、FVIII単独の投与と比べて、イヌ血漿中のFVIII活性が時間と共に上昇し、曲線下面積(AUC)の値がほぼ2倍になった(図11)。
組換え断片IIIの単量体および二量体のFVIII結合親和性の決定
組換え断片IIIを、C末端Strep−Tagと共にHEK293細胞株中で一過性に発現させ、Strep−tactinアフィニティークロマトグラフィーで精製した。断片IIIの単量体および二量体をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で分離した。分析は機器Biacore 2000を用いて行った。断片IIIの単量体および二量体をCM5上に固定化し、FVIII濃度系列をセンサーチップ表面にインジェクションした。血漿由来全長VWFを対照として用いた。ランニングバッファーは150mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.05%Tween20であった。FVIIIは、1.9nMの親和性定数で断片III二量体に結合した。単量体断片IIIに対するFVIIIの親和性は有意に低かった(KD=14.3nM)(図12)。
VWF断片IIIによる溶液中でのrFVIIIの安定化
2000IUの組換えFVIII(Nuwiq(登録商標))を、5倍モル過剰量のVWF断片IIIを添加して、または添加せずに、2.5mlの水中に再構成した。両方の調製物を40℃でインキュベートし、48時間、96時間、192時間、384時間、408時間、および672時間目にアリコートを採取した。FVIII活性発色アッセイでFVIII活性について試料を分析した。VWF断片IIIは、40℃で、FVIIIの有意に長い活性に寄与していた(図13)。
組換え断片IIIとNovoSeq21断片との間のヘパリン結合の比較
組換え断片IIIおよびNovoSeq21(国際公開第2013/160005(A1)号の配列番号21)断片を、C末端Strep−Tagと共にHEK293細胞株中で一過性に発現させ、Strep−tactinアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いてヘパリン結合を調べた。両方の組換え断片をヘパリンカラム(HiTrap Heparin HP 1ml、GEヘルスケア社)に結合させ、0〜500mMの範囲のNaClの直線塩勾配で溶出させた。どちらの断片も3連で行った。図14参照。NovoSeq21断片の平均溶出ピークは15.57±0.04分であり、これは285.381mM NaClに相当し、断片IIIの平均溶出ピークは15.47±0.02分であり、これは282.051mM NaClに相当する。このことは、NovoSeq21断片のヘパリン親和性がより高いことを示している。
分析方法の説明
FVIII:C、Coatestに基づくスクリーニング方法
方法は、2段階の原理に基づき、マイクロプレート技術を用いて行われた。第1段階では、FVIII:Cが補因子として働く内因性経路により活性化第X因子(Xa)が生成される。その後、第2段階で、合成発色基質S−2222を用いて、トロンビンによる基質の加水分解を防ぐためのトロンビン阻害剤I−2581の存在下で、第Xa因子を測定する。酸で反応を停止させ、pNA(パラ−ニトロアニリン)の放出に比例するVIII:C活性を測光法により405nmで試薬ブランクに対して測定する。
ブラッドフォード法によるタンパク質測定は、タンパク質への結合が起こる際にクーマシーブリリアントブルーG−250の酸性溶液の吸収極大が465nmから595nmにシフトするという観察結果に基づく。疎水性相互作用およびイオン性相互作用の両方が、色素の陰イオン形態を安定化し、可視色変化を生じさせる。色素−アルブミン複合体溶液の吸光係数が10倍の濃度範囲にわたり一定であるので、このアッセイは有用である。他の情報については、参照文献Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976も参照。
AAAの前に、全タンパク質を6M HClで24時間、110℃で加水分解する。アミノ酸を、スルホン化ポリスチレン樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーで分離し、溶出液中で連続的に検出する。検出は、ポストカラムニンヒドリン誘導体化に基づき、プロリンおよびヒドロキシプロリンについて440nmならびに他の全てのアミノ酸について570nmを同時測定するための二重光度計を用いる。アミノ酸アスパラギンおよびグルタミンはいずれもAAA中に脱アミド化されて、それぞれアスパラギン酸およびグルタミン酸として測定される。そのため、アスパラギン酸およびグルタミン酸の結果はそれぞれ、元の試料中のアスパラギン酸/アスパラギン(Asx)およびグルタミン酸/グルタミン(Glx)の合計を表す。トリプトファンは、この方法で別個の応答を生じないので、AAAによって定量化されない。システインは加水分解中に破壊され、定量化されない。AAAは参照文献にさらに説明されている:Total protein AAA analytical method. Spackman, D. H., Stein, W. H., and Moore, S. (1958) Anal. Biochem. 30: 1190-1206。
試料の純度(または比活性ともいう)は、FVIII:C分析から得られた値を全タンパク質の分析から得られた値で割ることにより計算される。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)では、サイズに基づいてタンパク質が分離される。本方法では、還元条件下で行われるタンパク質のSDS−PAGEについて説明する。変性および還元条件下で試料を加熱することにより、タンパク質の折り畳み構造がほどかれ、アニオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)でコーティングされて、ポリペプチド鎖の長さに比例する高い正味の負電荷を獲得する。負に帯電したタンパク質分子は、ポリアクリルアミドゲルマトリックスにローディングされて電場の中に置かれると、正に帯電した電極に向かって移動し、分子ふるい効果によって、すなわち分子量によって分離される。ポリアクリルアミドゲルは大きな分子が小さな分子と同じ速さで移動することを抑制する。SDS変性ポリペプチド間では質量に対する電荷の比がほぼ同じなので、タンパク質の最終的な分離は、ポリペプチドの相対分子量の差にほぼ完全に依存する。均一な密度のゲル中で、タンパク質の相対移動距離(Rf)は、その質量の対数(log)に負に比例する。質量既知のタンパク質を質量未知のタンパク質と同時に流動した場合、Rfと質量の間の関係をプロットすることができ、未知のタンパク質の質量を推定することができる。電気泳動によって分離されたタンパク質のバンドは銀染色によって可視化される。標準、参照(対照試料)、および分析試料の外観を判定することにより視覚的に評価がなされる。
第VIII因子抗原(FVIII:Ag)の量は、(18)にさらに説明されているように、ELISAキット(ASSERACHROM(登録商標)VIII:Ag、第VIII因子用の酵素イムノアッセイ、キット、Diagnostica Stago社(フランス))を用いて、試料希釈のためのキット添付のバッファーをトリス−NaClバッファー+1%ウシ血清アルブミンに置き換えて、測定される。
未変性バッファー条件(25mM HEPES、0.5M NaCl、0.3Mアルギニン、50mM CaCl2、0.02%ポリソルベート80、pH7.5)下で処理されたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC−HPLC)分析カラム(Superdex 200、10/300GL、GEヘルスケア社)を用いて、単量体、凝集体(aggregate)、および断片を測定する。試料負荷は、サイズ排除カラムの約1%であり、第VIII因子:C濃度は約1000IU/mlである。
FVIIIウェスタンブロットを用いてサイズに基づき第VIII因子変性産物を測定する。第VIII因子調製物中のFVIII分子量分布タンパク質およびペプチドを、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分子量に従って分離する。その後、タンパク質をゲルマトリックスからニトロセルロースメンブレンに電気泳動的に転写し、その後、ブロッキング剤とインキュベートする。その後、全ヒト第VIII因子分子に対する市販のポリクローナルヒツジ抗体を加え、次いで、酵素標識二次抗体をプローブとして加える。第3ステップとして、化学発光基質を加え、酵素と結合すると副生成物として光が生じる。光のアウトプットは、冷却電荷結合素子カメラを用いてリアルタイム画像として取り込まれる。シグナルの強度は、ブロッティングメンブレン上の抗原(FVIII)の存在量に相関する。
第VIII因子タンパク質鎖の電気泳動バンドパターンを調べるために2D電気泳動および銀染色を行った。一次元目の泳動としてpH3〜10の直線pH勾配を用いて等電点電気泳動を行った。トリス酢酸(3〜8%)ゲルを用いて二次元目のSDS−PAGEを行った。二次元目の泳動の後、銀染色を用いてゲルを染色した。
ブラッドフォード法によるタンパク質測定は、タンパク質への結合が起こる際にクーマシーブリリアントブルーG−250の酸性溶液の吸収極大が465nmから595nmにシフトするという観察に基づく。疎水性相互作用およびイオン性相互作用の両方が、色素の陰イオン形態を安定化し、可視色変化を生じさせる。色素−アルブミン複合体溶液の吸光係数が10倍の濃度範囲にわたり一定であるので、このアッセイは有用である。他の情報については、参照文献Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976も参照。
Claims (10)
- 第VIII因子と1または複数のフォン・ヴィルブランド因子ペプチドとの複合体を含み、
前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドは、フォン・ヴィルブランド因子の断片であって、配列番号1の少なくともアミノ酸764〜1905を含むが、配列番号1のアミノ酸2255〜2645は含まず、
前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドのヘパリンに対する親和性結合定数はK D ≧2.43nMであり、
皮下注射によって投与される、
出血性疾患の処置または予防に使用するための組成物。 - 前記フォン・ヴィルブランド因子の断片が、配列番号1のアミノ酸764から始まりアミノ酸1905〜2153の間で終わるアミノ酸配列に10個以下の欠失、挿入、または置換を行ったアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記第VIII因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第VIII因子単独と比べて、リン脂質膜への結合が低減しており、
前記第VIII因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第VIII因子と全長フォン・ヴィルブランド因子との複合体と比べて、コラーゲンIIIへの結合が低減しており、
前記第VIII因子とフォン・ヴィルブランド因子の断片との複合体が、第VIII因子と全長フォン・ヴィルブランド因子との複合体と比べて、ヘパリンへの結合が低減している、
請求項1又は2に記載の組成物。 - 前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドの分子量が、500kD未満である、請求項1〜請求項3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、以下からなる群から選択される少なくとも1つの特性を有する、請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載の組成物。
(i)コラーゲンIIIに対する親和性結合定数が、KD>5nMである。
(ii)第VIII因子に対する親和性結合定数が、KD<100nMである。
(iii)第VIII因子とリン脂質との結合の阻害が、70%以上である。 - 前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、タンパク質切断(proteolytic cleavage)または化学的開裂(chemical cleavage)によりヴィルブランド因子から得られる、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の組成物。
- 第VIII因子が、全長第VIII因子、Bドメイン欠失第VIII因子、または異なるサイズのBドメインを有する第VIII因子である、請求項1〜請求項6のいずれか一項に記載の組成物。
- 第VIII因子が、血漿由来第VIII因子または組換え第VIII因子である、請求項1〜請求項7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、以下からなる群から選択される特性の少なくとも1つを有する、請求項1〜請求項8のいずれか一項に記載の組成物。
(i)前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドが、第VIII因子を抗体結合から遮蔽して、患者におけるインヒビター形成を最小限に抑える。
(ii)−70℃にて凍結液体形態で12ヶ月保存した後でも90%以上の残留第VIII因子活性を与えるように、第VIII因子を安定化する。
(iii)5℃にて凍結乾燥形態で24ヶ月保存した後でも90%以上の残留第VIII因子活性を与えるように、第VIII因子を安定化する。
(iv)25℃にて凍結乾燥形態で12ヶ月保存した後でも90%以上の残留第VIII因子活性を与えるように、第VIII因子を安定化する。
(v)生体内での第VIII因子の半減期を少なくとも20%延長する。
(vi)以前に処置されていない患者におけるインヒビター形成を、前記組成物で6ヶ月間処置した後に20%未満に低減する。 - 請求項1〜請求項9のいずれか一項に記載の組成物中のウイルスの低減方法であって、第VIII因子との複合体形成前または形成後に前記フォン・ヴィルブランド因子ペプチドをナノ濾過するステップを含み、これにより、ブタパルボウイルスが存在する場合には、ブタパルボウイルスが100分の1以下に低減される、前記方法。
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