JP2015519313A - 血友病の治療に適する医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血友病の治療のためのFVIII分子を含む医薬組成物の使用に関し、前記FVIII分子は、100〜700個のアミノ酸サイズの切断型Bドメインを含み、前記切断型Bドメインのアミノ酸配列は、wt VIII Bドメインのアミノ酸配列に由来し、血管外投与に関連する前記FVIII分子の生物学的利用率は、少なくとも20%である。
発明者らは、本発明によるFVIII分子が、例えば、完全な状態の全Bドメインを有するFVIII並びにアミノ酸を全く有さない又は少数のアミノ酸(例えば、15〜30個のアミノ酸)を有するBドメイン切断型/欠失FVIII分子と比較して、皮下投与に関連する驚くほどに高いFVIIIの生物学的利用率を有するという驚くべき観察を行った。
「治療」という用語は、本明細書で用いているように、それを必要とするヒト又は他の脊椎動物対象の医学療法を意味する。前記対象は、前記特定の治療が前記ヒト又は他の脊椎動物における疾患の治療に有益であることを示しうる暫定又は確定診断を下した医師又は獣医師による身体的検査を受けたと予想される。前記治療の時期及び目的は、対象の健康状態によって、個々の個体で異なりうる。したがって、前記治療は、予防的、待機的、対症及び/又は根治的でありうる。
FVIIIにおけるBドメインは、配列番号1のアミノ酸741〜1648に及ぶ。Bドメインは、いくつかの異なる部位において開裂し、循環血漿FVIII分子の大きな不均一性を生じさせる。高度グリコシル化Bドメインの正確な機能は不明である。公知であることは、Bドメインが凝固カスケードにおけるFVIII活性に非必須であることである。したがって、組換えFVIIIは、Bドメイン欠失/切断型変異体の形態でしばしば製造される。例えば、FVIII分子は、次の配列:配列番号2:SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR(O-グリカンが下線を引いたSに結合している)を有する21アミノ酸残基L(リンカー)配列をコードする発現ベクターにより産生されうる。本発明による好ましいFVIII分子は、配列番号1に示されているSer750残基に結合したO-グリカンを含むBドメイン欠失/切断型変異体(このO-グリカンを介してポリマー(半減期延長)部分に場合によってコンジュゲートされている)である。
配列番号5:アミノ酸764〜865 (TIL'/E'):
配列番号6:アミノ酸764〜1035 (TIL'/E'/VWD3 I):
配列番号7:アミノ酸764〜1041 (TIL'/E'/VWD3 II):
配列番号8:アミノ酸764〜1045 (TIL'/E'/VWD3 III):
配列番号9:アミノ酸764〜1128(TIL'/E'/VWD3/C8-3)-システイン1099を太字で示す。このシステインは、別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号10:アミノ酸764〜1198(TIL'/E'/VWD3/C8-3/TIL-3)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号11:アミノ酸764〜1250(TIL'/E'/D3 I)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号12:アミノ酸864〜1250(D3 I)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号13:アミノ酸864〜1268(D3 II)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号14:アミノ酸764〜1261(TIL'/E'/D3 II)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号15:アミノ酸764〜1264(TIL'/E'/D3 III)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号16:アミノ酸764〜1268(TIL'/E'/D3 IV)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号17:アミノ酸764〜1459(TIL'/E'/D3/A1 I)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号18:アミノ酸764〜1463(TIL'/E'/D3/A1 II)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号19:アミノ酸764〜1464(TIL'/E'/D3/A1 III)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号20:アミノ酸764〜1683(TIL'/E'/D3/A1/A2)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号21:アミノ酸764〜1873(TIL'/E'/D3/A1/A2/A3)-システイン1099及び1142を太字で示す。これらのシステインの1つ又は両方を別のアミノ酸、例えば、Serに置換することができる。
配列番号22:UniProtKB/Swiss-Protデータベース(エントリP04275)による野生型ヒトVWF-システイン1099及び1142位における残基を太字で示す。
/ml、4000〜10,000lU/ml、5000〜10,000lU/ml、50〜5000lU/ml、100〜5000lU/ml、250〜5000lU/ml、500〜5000lU/ml、及び1000〜5000lU/mlなどの40IU/ml〜25000 IU/mlの濃度のFVIIIを含みうる。本発明による医薬組成物はさらに、例えば、緩衝液系、保存剤、等張剤、キレート化剤、安定化剤又は界面活性剤並びにそれらの様々な組合せなどの1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含みうる。医薬組成物における保存剤、等張剤、キレート化剤、安定化剤及び界面活性剤の使用は、当業者に周知である。Remington:The Science and Practice of Pharmacy、19版、1995年を参照することができる。
1. 血友病の治療のためのFVIII分子を含む医薬組成物の使用であって、前記FVIII分子が100〜400個のアミノ酸サイズの切断型Bドメインを含み、前記切断型Bドメインのアミノ酸配列がwt FVIII Bドメインアミノ酸配列に由来し、血管外投与(例えば、s.c.投与)に関連する前記FVIII分子の生物学的利用率が少なくとも3、5又は10%である、FVIII分子を含む医薬組成物の使用。
2. 前記FVIII分子は、切断型BドメインにおけるO結合グリカンを含み、前記O結合グリカンが配列番号1に示されているSer750残基に結合している、本発明によるFVIII分子。
3. FVIII変異体のアミノ酸配列が配列番号3に示されている、本発明によるFVIII分子。
4. FVIII Bドメインのアミノ酸配列が配列番号1に示されているアミノ酸配列によるアミノ酸741〜857+1637〜1648、アミノ酸741〜914+1637〜1648、アミノ酸741〜954+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648、アミノ酸741〜1003+1637〜1648、アミノ酸741〜1003+1637〜1648、アミノ酸741〜1020+1637〜1648、アミノ酸741〜1079+1637〜1648、アミノ酸741〜1206+1637〜1648、アミノ酸741〜1261+1637〜1648、アミノ酸741〜1309+1637〜1648、アミノ酸741〜914+1637〜1648、アミノ酸741〜954+1637〜1648、アミノ酸741〜968+1637〜1648、アミノ酸741〜1003+1637〜1648、アミノ酸741〜1018+1637〜1648、アミノ酸741〜1070+1637〜1648、アミノ酸741〜1230+1637〜1648、アミノ酸741〜1301+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648からなる群から選択される、本発明によるFVIII分子。
5. 少なくとも1つの半減期延長部分が前記FVIII分子に共有結合している、本発明によるFVIII分子。
6. 少なくとも1つの水溶性ポリマーがBドメインに存在するグリカンに共有結合している、本発明によるFVIII分子。好ましくは、前記水溶性ポリマーは、多糖及び/又はPEGである。
7. 前記水溶性ポリマーがPEG、PSA及びHSAからなる群から選択される、本発明によるFVIII分子。
8. 前記組成物は、VWF又はVWF断片をさらに含む、本発明による医薬組成物。
9. 前記VWF断片が最大1200個のアミノ酸を含み、前記VWF断片がTIL'ドメイン又はTIL'/E'ドメインを含む、本発明による医薬組成物。
10. 前記VWF断片が1099及び/又はC1142システインを含まない、本発明による医薬組成物。
11. 本発明による医薬組成物であって、前記VWF断片は、配列番号4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21のいずれか1つによるアミノ酸配列を含む。
12. 本発明による医薬組成物であって、前記VWF断片は、配列番号22の1099及び/又は1142位におけるシステイン残基を含まない。これらのシステイン残基は、アミノ酸置換及び/又は欠失によって削除することができる。
13. 本発明による医薬組成物であって、前記VWF断片は、配列番号9を含み、1099システイン残基が例えば、ヒスチジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、タウリン及びチロシンなどの別のアミノ酸で置換されている。好ましくは、1099システイン残基がセリンで置換されている。
14. 本発明による医薬組成物であって、前記VWF断片は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20及び配列番号21からなるリストから選択されるアミノ酸配列を含み、1099及び1142システイン残基が例えば、ヒスチジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、タウリン及び/又はチロシンなどの別のアミノ酸で置換されている。好ましくは、1099及び1142システイン残基がセリンで置換されている。
15. 本発明による医薬組成物であって、前記VWF断片の10%未満、好ましくは9%未満、好ましくは8%未満、好ましくは7%未満、好ましくは6%未満、好ましくは5%未満、好ましくは4%未満、好ましくは3%未満、好ましくは2%未満、好ましくは1%未満がオリゴマー及び/又は多量体の形態である。
16. 本発明による医薬組成物であって、前記VWF断片は、二量体である。二量体形成の百分率は、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも35%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも45%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%でありうる。
17. FVIIIとVWFとの比が0.5:1〜1:50である、本発明による医薬組成物。好ましくは、前記比は、約0.5:1、1:1又は1:2である。
18. 組成物は、本発明による1つ、2つ、3つ、4つ、5つ若しくはそれ以上の異なるVWF断片及び/又は1つ、2つ、3つ、4つ若しくは5つの異なるFVIII分子を含む、本発明による医薬組成物。
19. 本発明による医薬製剤であって、前記FVIII分子の濃度が少なくとも約100、150、200、250、300、350、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000、又は30,000lU/mlである。
20. 本発明による医薬製剤であって、VWF断片に結合しているFVIIIの量が前記製剤中のFVIII総量の少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90又は95%である。
21. 血管外(例えば、皮下)投与による血友病の治療のための本発明による医薬組成物の使用。本発明による医薬組成物は、皮内投与により投与することもできる。本発明による医薬組成物は、さらに静脈内投与により投与することができる。
22. 血友病の治療の方法であって、前記方法は、それを必要とする患者への治療上有効量の本発明による医薬組成物の皮下投与を含む。
23. フォン-ウィルブランド病の治療の方法であって、前記方法は、それを必要とする患者への治療上有効量の本発明による医薬組成物の皮下投与を含む。
24. 組成物は、TIL'配列764〜778の15個のN末端アミノ酸、又はそれ以上を含むVWF断片又はVWF様ポリペプチドを含む、本発明による医薬組成物。前記VWF断片又はポリペプチドは、1つ又は複数の半減期延長部分に、場合によってN及び/又はO結合グリカンを介して場合によってコンジュゲートさせることができる。
25. 組成物は、FVIIIへの結合に関連して、配列番号1に示されているFVIIIアミノ酸配列の残基C1858〜Q1874、S2063〜D2074及びV2125〜A2146と少なくとも相互作用する1つ又は複数のVWF断片を含む、本発明による医薬組成物。
FVIIIノックアウトマウスにおける皮下投与(1):
以下の2つの試験化合物を調製した。
a)グリコPEG化FVIII、すなわち、「N8-GP」(本質的に国際公開第2009108806号における実施例1+2に開示されているように調製)、タンパク質含量に基づく1.2μMに相当するクロモジェニック活性により決定された2000U FVIII/ml
b)グリコPEG化FVIII、すなわち、N8-GP(2000U FVIII又は1.2μM、0.74mg/ml VWF断片TIL'/E'/D3/A1(9.3μMに相当する)と共製剤化)
両試験化合物は、18mg/ml NaCl、3mg/mlサッカロース、1.5mg/ml L-ヒスチジン、0.1mg/mlポリソルベート80、0.25mg/ml CaCl2、pH7.3に加えて製剤化した。
FVIIIノックアウトマウスにおける皮下投与(2):
以下の2つの試験化合物を調製した。
a)グリコPEG化FVIII(0.3μMに相当するクロモジェニック活性により決定された500IU FVIII/ml)
b)グリコPEG化FVIII(500IU FVIII/ml又は0.3μM、0.185mg/ml VWF断片TIL'/E'/D3/A1(2.3μMに相当する)と共製剤化)
FVIIIへのVWF断片の1.5nMの測定IC50に基づき、また測定IC50がKdに等しいと仮定すると、FVIIIの99%がこの組成物中のVWFに結合しているはずである。
両試験化合物は、18mg/ml NaCl、3mg/mlサッカロース、1.5mg/ml L-ヒスチジン、0.1mg/mlポリソルベート80、0.25mg/ml CaCl2、pH約7.3に加えて製剤化した。
s.c.投与したFVIII化合物とVWF化合物との共製剤の止血有効性
試験概要:
動物:FVIII k/oマウス、8〜18週齡、雄及び雌
尾部出血: 1時点/群当たりn=6〜12
トロンボエラストグラフィー:1時点/群当たりn=2〜4
投与経路:頸部及び側腹部にs.c.(対照群については尾静脈にi.v.)
投与容量1〜10ml/kg
群:
媒体対照を損傷の24時間前に投与
i.v.対照を損傷の5分前に投与
VWF化合物と共製剤化したFVIII化合物を損傷の5分、1、3、5、12、24、48、72、96、120、144又は168時間前にs.c.投与
対象の化合物を緩衝液(10mM L-ヒスチジン、8.8mMスクロース、0.01%ポリソルベート80、308mM NaCl、1.7mM CaCl2(二水和物)、0.37mM L-メチオニン、pH6.9)中で40〜10000U/mlの濃度に調製し、使用するまで-80℃で保存した。
尾切断の前に、マウスをイソフルランにより麻酔し、加熱パッド上にのせる。
尾を37℃の予熱生理食塩水中に10分間入れる。
i.v.対照を損傷の5分、24又は48時間前に注射する。
尾を先端から4mm切断する。
尾切断の直前にFVIIIの決定のために20μlの血液試料を眼窩周囲静脈叢から採取する。
血液を30分にわたり採取し、ヘモグロビン濃度を分光光度法により550nmで決定する。
並行動物を血液試料の採取及びその後のそれらの凝固パラメーター(ex vivo有効性)の解析のために用いる。
s.c.投与後の特定の時間(168時間まで5分)における30分の試験期間中の失血を1、媒体対照及び2、FVIII又はグリコPEG化FVIIIを用いるi.v.対照群のそれと比較することにより、共製剤の予防効果を決定する。図10は、失血の減少及びex vivoでの凝固時間の短縮によって示されたように、グリコPEG化FVIIIが2500U/kgのs.c.投与後24時間止血効果があることを示している。同様の効果がVWF断片と共製剤化したFVIIIについて認められる。
FVIIIの生物学的利用率の評価
本発明によるFVIII及びVWF/VWF断片の共組成物の生物学的利用率は、実施例1及び2で述べたPK実験における生物学的利用率に対する効果の評価並びに実施例3で述べた予防効果の評価から決定することができる。
FVIII:VWF共組成物の用量の滴定
用量の滴定は、実施例1〜3で開示したように行うことができる。手短に述べると、FVIIIの血漿中濃度は、FVIII k/oマウスにおける70、100、150、280、500、1000及び2500IU/kg(FVIII単位)単独の用量又はVWF断片との併用のs.c.投与後に評価する。
FVIII化合物とVWF化合物との間の比の滴定
FVIIIとVWFとの間の比の滴定は、実施例1及び2におけるもの並びに実施例3で述べたものと同様な実験において開示したように行うことができる。
FVIIIの免疫原性に対するVWFの効果
FVIII化合物と共製剤化したVWFの免疫調節効果を野生型FVIII及びFVIII化合物単独と比較して評価する。
FVIIIノックアウトマウスにおける皮下投与(3)
以下の2つの試験化合物を調製した。
a)Bドメイン切断型FVIII(「ツロクトコグアルファ」/「N8」-国際公開2009108806号における実施例1に開示されているのと本質的に同様に製造)(クロモジェニック活性アッセイにより決定され、2.4μMに相当する4000IU FVIII/ml)
b) 0.37mg/ml VWF断片TIL'/E'/D3/A1(4.6μMに相当する)と共製剤化したBドメイン切断型FVIII(ツロクトコグアルファ)(クロモジェニック活性アッセイにより決定され、0.6μMに相当する1000IU FVIII/ml)
FVIIIへのVWF断片の1.5nMの測定結合親和力に基づいて、FVIIIの99%がこの組成物中のVWFに結合しているはずである。
両試験化合物は、18mg/ml NaCl、3mg/mlサッカロース、1.5mg/ml L-ヒスチジン、0.1mg/mlポリソルベート80、0.25mg/ml CaCl2、pH約7.3に加えて製剤化した。
FVIIIノックアウトマウスにおける皮下投与(4)
以下の2つの試験化合物を調製した。
a)226アミノ酸Bドメイン分子(クロモジェニック活性アッセイにより決定され、2.4μMに相当する1000IU FVIII/ml)
b) 0.37mg/ml VWF断片TIL'/E'/D3/A1(4.6μMに相当する)と共製剤化した226アミノ酸Bドメイン分子(クロモジェニック活性アッセイにより決定され、0.6μMに相当する1000IU FVIII/ml)
FVIIIへのVWF断片の1.5nMの測定結合親和力に基づいて、FVIIIの99%がこの組成物中のVWFに結合しているはずである。
両試験化合物は、18mg/ml NaCl、3mg/mlサッカロース、1.5mg/ml L-ヒスチジン、0.1mg/mlポリソルベート80、0.25mg/ml CaCl2、pH約7.3に加えて製剤化した。
FVIII分子をコードするベクターの構築
F8-500 FVIII分子(F8-500はツロクトコグアルファ/N8コード配列に相当する)をコードする挿入断片を有するプラスミドをFVIIIの産生に用いた。N末端から始めて、F8-500ベクターは、Bドメインを含まないFVIII重鎖(アミノ酸1〜740)、21アミノ酸リンカー(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR-配列番号2)及びFVIII軽鎖(全長野生型ヒトFVIIIのアミノ酸1649〜2332)をコードする。21アミノ酸リンカーの配列は、FVIII Bドメインに由来し、全長野生型ヒトFVIIIのアミノ酸741〜750及び1638〜1648からなる。FVIII cDNAの断片を全長FVIII cDNAから増幅し、F8-500コーディングプラスミドに挿入して、BDD FVIIIをコードするDNA構築物を生じさせた。
FVIIIの一過性発現
0.9〜1.1×106の密度のHKB11細胞にプラスミド(0.7mg/l又は1.0mg/l)及びトランスフェクション剤293Fectin(Invitrogen)(1.0ml/l又は1.4ml/l)の複合体をトランスフェクトした。トランスフェクション複合体は、プラスミド及びトランスフェクションを別個に希釈し、2つの溶液を混合し、混合物を室温で20分間インキュベートすることにより調製した。複合体混合物を細胞懸濁液に加え、懸濁液を振とうインキュベーター中で36.5℃又は37℃及び5%又は8%CO2で4又は5日間インキュベートした。細胞培養採取物を実施例14で述べるようにクロモジェニックFVIIIアッセイにより分析し、及び/又は0.22μm膜によりろ過し、実施例13で述べるようにFVIIIの精製のために用いた。
FVIIIを発現する安定細胞系
無血清適応CHO-DUKX-B11細胞に、実施例10で述べ、FVIII F8-500D-Hisをコードする発現プラスミド構築物#1917をトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をジヒドロ葉酸還元酵素系により選択し、限界希釈法によりクローニングした。クローンをELISA及びクロモジェニックFVIIIアッセイによりFVIII産生についてスクリーニングした。クローンGedT019Aをグレードアップのために選択した。細胞をバイオリアクターに移した。実施例13で述べるように細胞培養採取物からF8-500D-Hisタンパク質を精製した。
FVIIIの精製
カラムに樹脂VIIISelect(GE Healthcare)を寸法が直径1.6cm、層高4cmで8mLとして充填し、20mMイミダゾール+10mM CaCl2+0.01%Tween80+250mM NaCl、pH7.3で500cm/時間で平衡化した。実施例3で述べたように調製した培養ろ液をカラムに加え、その後、カラムを最初の平衡化緩衝液で、次いで、20mMイミダゾール+10mM CaCl2+0.01%Tween80+1.5M NaCl、pH7.3で洗浄した。20mMイミダゾール+10mM CaCl2+0.01%Tween80+1M酢酸アンモニウム+6.5Mプロピレングリコール、pH7.3を用いて90cm/時間で結合FVIIIを無勾配溶出した。FVIIIを含む画分をプールし、20mMイミダゾール+10mM CaCl2+0.01%Tween80、pH7.3で1:10に希釈し、F25-セファロースを充填したカラムに加えた(Thimら、Haemophilia、2009)。カラムの寸法は、直径1.6cm、層高2cmで、カラム体積が4mLとなるものであった。加える前にカラムを20mMイミダゾール+10mM CaCl2+0.01%Tween80+150mM NaCl+1Mグリセロール、pH7.3で180cm/時間で平衡化した。加えた後、カラムを最初に平衡化緩衝液で、次いで、20mMイミダゾール+10mM CaCl2+0.01%Tween80+650mM NaCl、pH7.3で洗浄した。20mMイミダゾール+10mM CaCl2+0.01%Tween80+2.5M NaCl+50%(容積/容積)エチレングリコール、pH7.3を用いて30cm/時間で結合FVIIIを無勾配溶出した。同じ緩衝液で1:45に希釈したa3ドメインの欠失を有するFVIII分子を除いて、FVIIIを含む画分をプールし、20mMイミダゾール+10mM CaCl2+0.01%Tween80、pH7.3で1:15に希釈した。希釈したプールを、Poros 50HQ(PerSeptive Biosystem)をカラムの寸法が直径0.5cm、層高5cmでカラム体積が1mLとなるように充填したカラムに加えた。加える前にカラムを20mMイミダゾール+10mM CaCl2+0.01%Tween80+50mM NaCl+1Mグリセロール、pH7.3で300cm/時間で平衡化した。平衡化緩衝液から20mMイミダゾール+10mM CaCl2+0.01%Tween80+1M NaCl+1Mグリセロール、pH7.3までの5カラム体積にわたる直線勾配を用いた溶出の前にカラムを平衡化緩衝液で洗浄した。FVIIIを含む画分をプールし、プールを使用するまで-80℃で保存した。
クロモジェニックアッセイにより測定される細胞培養採取物中のFVIII活性
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)を次のようにCoatest SP試薬(Chromogenix)を用いてクロモジェニックFVIIIアッセイで評価した。rFVIII試料及びFVIII標準(凝固参照、Technoclone)をCoatestアッセイ緩衝液(50mMトリス、150mM NaCl、1%BSA、pH7.3、保存剤を含む)で希釈した。50μlの試料、標準及び緩衝液陰性対照を96ウエルマイクロタイタープレート(Spectraplates MB、Perkin Elmer)に加えた。すべての試料を1:100、1:400、1:1600及び1:6400に希釈して試験した。Coatest SPキットからの第IXa因子/第X因子試薬、リン脂質試薬及びCaCl2を5:1:3(体積:体積:体積)で混合し、これの75μlをウエルに加えた。室温で15分間のインキュベーションの後、50μlの第Xa因子基質S-2765/トロンビン抑制物質I-2581ミックスを加え、25μlの1Mクエン酸、pH3を加える前に反応物を室温で5分間インキュベートした。405nmにおける吸光度を、参照波長として用いた620nmでの吸光度とともにEnvisionマイクロタイタープレートリーダー(Perkin Elmer)で測定した。陰性対照の値をすべての試料から差し引き、FVIII濃度に対してプロットした吸光度値の線型回帰により検量線を作成した。F8-500タンパク質のそれと比べた本FVIIIの収率をTable 1(表2)に示す。
クロモジェニックアッセイにより測定される精製試料におけるFVIII活性
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)を次のようにCoatest SP試薬(Chromogenix)を用いてクロモジェニックFVIIIアッセイで評価した。rFVIII試料及びFVIII標準(例えば、NIBSCからの第7次国際FVIII標準と対照して検定した精製野生型rFVIII)をCoatestアッセイ緩衝液(50mMトリス、150mMNaCl、1%BSA、pH7.3、保存剤を含む)で希釈した。50μlの試料、標準及び緩衝液陰性対照を96ウエルマイクロタイタープレート(Nunc)に2連で加えた。Coatest SPキットからの第IXa因子/第X因子試薬、リン脂質試薬及びCaCl2を5:1:3(体積:体積:体積)で混合し、これの75μlをウエルに加えた。室温で15分間のインキュベーションの後、50μlの第Xa因子基質S-2765/トロンビン抑制物質I-2581ミックスを加え、25μlの1Mクエン酸、pH3を加える前に反応物を室温で10分間インキュベートした。415nmにおける吸光度を、参照波長として用いた620nmでの吸光度とともにSpectramaxマイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices)で測定した。陰性対照の値をすべての試料から差し引き、FVIII濃度に対してプロットした吸光度値の線型回帰により検量線を作成した。比活性は、試料の活性をHPLCにより決定したタンパク質濃度で割ることによって計算した。HPLCについては、軽鎖に対応するクロマトグラムにおけるピーク下面積を積分し、アミノ酸分析によって濃度が決定された、野生型rFVIIIの並行分析における同じピークの面積と比較することによって試料の濃度を決定した。結果をTable 1(表2)に示す。
一段凝固アッセイにより測定される精製試料中のFVIII活性
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)を次のように一段FVIII凝固アッセイでさらに評価した。rFVIII試料及びFVIII標準(例えば、NIBSCからの第7次国際FVIII標準と対照して検定した精製野生型rFVIII)をHBS/BSA緩衝液(20mMヘペス、150mM NaCl、pH7.4、1%BSAを含む)で約10U/mlに希釈した後、VWFを含むFVIII欠乏血漿(Dade Behring又はSiemens)で10倍希釈した。その後、試料をHBS/BSA緩衝液で希釈した。APTT凝固時間は、1因子プログラム(single factor program)を用いてACL300R又はACL9000機器(Instrumentation Laboratory)で測定した。VWFを含むFVIII欠乏血漿(Dade Behring又はSiemens)をアッセイ血漿として、SynthASil(HemosIL(商標)、Instrumentation Laboratory)をaPTT試薬として用いた。凝固機器において、希釈した試料又は標準をFVIII欠乏血漿、aPTT試薬と37℃で混合した。塩化カルシウムを加え(assed)、凝血塊形成までの時間を濁度により決定した。試料中のFVIII活性は、FVIII標準の希釈物の凝血塊形成時間の標準曲線に基づいて計算する。結果をTable 1(表2)に示す。
VWF断片をコードする発現ベクターの構築
VWFシグナルペプチドとそれに続く種々のC末端切断型、VWF D'ドメイン及びVWF D3ドメイン、Ala-Leu-Alaスペーサー及びHPC4タグをコードするDNA断片をプラスミドpLC095を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により生成させた(プラスミドpLLC095は実施例26で述べる)。プライマーJP1000は、フォワードプライマーとしてTable 2(表3)に示すリバースプライマーJP1001〜JP1008と組み合わせてすべてのPCR反応に用いた。
VWF断片をコードする発現ベクターの構築(2)
pJSV348(実施例17参照)を鋳型として用いてライゲーション独立クローニング(LIC)により、VWFの3つのさらなるHPC4タグ付き切断型分子を生成させた。Table 4(表5)に示すプライマーを用いてpJSV438上で3つの独立したPCR反応を始動させた。
VWF断片の一過性発現
0.9〜1.1×106細胞/mlの密度のヒト胚腎293 6E懸濁細胞にVWF断片コーディングプラスミド(0.7mg/l又は1.0mg/l)及びトランスフェクション剤293 Fectin(Invitrogen)(1.0ml/l又は1.4ml/l)の複合体をトランスフェクトした。トランスフェクション複合体は、プラスミド及びトランスフェクションを別個に希釈し、2つの溶液を混合し、混合物を室温で20分間インキュベートすることによって調製した。複合体混合物を細胞懸濁液に加え、懸濁液を振とうインキュベーター中で36.5℃又は37℃及び5%又は8%CO2で5日間インキュベートした。細胞培養採取物を0.22μm膜によりろ過し、実施例22で述べるようにVWF断片の精製のために用いた。
VWF断片の二量体の調製
天然全長VWF分子(配列番号22)において、分子のN末端部における2つのシステイン残基、すなわち、Cys1099及びCys1142がVWFの二量体化及び/又は多量体化に関与していると推測される。
Cys1099-Cys1099/Cys1142-Cys1142(2つのジスルフィド結合-上記と同様)
Cys1099-Cys1142/Cys1099-Cys1142(2つのジスルフィド結合)
Cys1099-Cys1099(1つのジスルフィド結合)
Cys1142-Cys1142(1つのジスルフィド結合)
Cys1099-Cys1142(1つのジスルフィド結合)
競合ELISAを用いるFVIIIへのVWF及びVWF断片の結合の評価
FVIIIへの異なるVWF断片の結合を調べるために、以下の方法を用いる。手短に述べると、ヒトVWFをマイクロタイタープレートに被覆し、4℃で一夜インキュベートする。ブロッキング後、プレインキュベート済みFVIII(1nM)及びVWF/VWF断片を含む溶液をプレートに加え、その後、ビオチニル化抗FVIII抗体及びストレプトアビジンペルオキシダーゼS-POD(1:20000)により検出する。吸光度を450/620nmで測定する。IC50値をTable 6(表7)に示す。
HPC4タグ付きVWF断片の精製及び特徴付け
いくつかのVWFをクローニングし、C末端HPC4タグ:EDQVDPRLIDGK(配列番号37)を用いて発現させる。時にはALAの配列を有する追加のリンカーをVWF断片とHPC4タグとの間に導入する。クローニング、発現及び細胞培養の後、細胞培地にCaCl2を1mMの最終濃度に加える。培地を抗HPC4カラムに通す。カラムを20mMへペス、100mM NaCl、1mM CaCl2、pH=7.5で平衡化する。細胞培地を加えた後、カラムを20mMへペス、1M NaCl、1mM CaCl2、pH=7.5で洗浄し、その後、HPC4タグ付きVWF断片を20mMへペス、100mM NaCl、5mM EDTA、pH=7.5により溶出する。抗HPC4カラムからのプールに3倍の体積の水を加えて、伝導度を低下させ、Mono Qカラム上に加える。加える前にMono Qカラムを20mMへペス、100mM NaCl、5mM EDTA、pH=7.5で平衡化する。Mono Qカラムを20mMへペス、100mM NaCl、pH=7.5で洗浄し、20mMへペス、10mM CaCl2、pH=7.5中100mM NaClから2M NaClまでの勾配でVWF断片を溶出する。
クローニング、発現及び細胞培養の後、細胞培地を抗VWFカラムに通す。抗VWF抗体は、VWFのアミノ酸残基番号764〜865(配列番号5)を認識する。カラムを20mMへペス、100mM NaCl、pH=7.5で平衡化する。細胞培地を加えた後、カラムを20mMへペス、1M NaCl、pH=7.5で洗浄し、その後、VWF断片を50mM酢酸、100mM NaCl、pH=4.0により溶出する。抗VWFカラムからのプールをpH=7.5に調整し、Mono Qカラム上に加える。加える前にMono Qカラムを20mMへペス、100mM NaCl、pH=7.5で平衡化する。Mono Qカラムを20mMへペス、100mM NaCl、pH=7.5で洗浄し、VWF断片を20mMへペス、pH=7.5中100mM NaClから2M NaClまでの勾配で溶出する。
等温滴定熱量測定を用いることによるFVIIIへのVWF断片の結合の評価
すべてのタンパク質試料を50mMへペスpH7.4、150mM NaCl、10mM CaCl2緩衝液で透析する。各iTC実験においてiTCセルにFVIII(約250μL)を、注射器にVWF分子(約40μL)を満たすことを必要とする。温度を要求に応じて設定し、タンパク質試料を所定の実験条件下で(約10分)平衡化する。一般的にFVIIIを含むセルへのVWF分子の(2〜2.5μL)の17〜20回の注入を行う。最初の注入は、常に0.2μLであり、平衡化工程中の拡散を予期するために最終データ解析から除去する。撹拌速度は、700〜1000rpmに設定する。データ収集のフィルター期間は、高フィードバックモード設定で5秒である。各滴定は、120秒間隔とする。適切な対照実験を行う。生データを処理してベースラインを定め、積分して最終等温線を得る。この結合等温線は、単一部位モデルに適合して、Kd、化学量論(n)、ΔH及びΔS値をFVIIIへのVWF分子の結合の完全な特徴付けにもたらす。一例の結合等温線を図9に示す。これらのデータは、皮下投与を目的とする共製剤中のFVIII及びVWF断片の最適濃度を決定するために用いる。
FVIIIノックアウトマウスにおける皮下投与
試験化合物を次のように調製した。試験化合物を18mg/ml NaCl、3mg/mlサッカロース、1.5mg/ml L-ヒスチジン、0.1mg/mlポリソルベート80、0.25mg/ml CaCl2、pH約7.3に加えて製剤化した。VWF又はVWF断片を含む試験製剤について、共製剤中のVWFにより結合されたFVIII%は、Ki=Kdと仮定して実施例21で上述した利用可能なIC50(Ki)値(Table 6(表7))又は実施例23で述べたように得られたKd値を用いて計算した。
ニュージーランドホワイトウサギにおける皮下投与
試験化合物を18mg/ml NaCl、3mg/mlサッカロース、1.5mg/ml L-ヒスチジン、0.1mg/mlポリソルベート80、0.25mg/ml CaCl2、pH約7.3に加えて製剤化した。VWF又はVWF断片を含む試験製剤について、VWFにより結合されたFVIII%は、IC50=Ki=Kdと仮定して利用可能なIC50値(Table6(表7))を用いて計算した。
VWF断片をコードする発現ベクターの構築
野生型ヒトVWF cDNAからなる挿入断片を含むpZEMHygroベクターからなるプラスミド#796を切断型ヒトVWFタンパク質の発現のためのDNA構築物を生成するための出発点として用いた。
VWF断片を発現する安定細胞系
10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ修正イーグル培地中で増殖させたベビーハムスター腎臓(BHK)細胞にGenejuiceトランスフェクション試薬(Merck)を用いてpLL095をトランスフェクトした。VWF(TIL'/E'/D3/A1)C1099/1142S-HPC4を産生する非クローン性BHK細胞系を生じさせるトランスフェクト細胞のプールは、1.5□Mメトトレキセートを用いた選択によって生成させた。細胞をバイオファーメンター中に播種し、実施例22で述べたように細胞培養上清からVWF(TIL'/E'/D3/A1)C1099/1142S-HPC4タンパク質を精製した。
VWF断片はFVIIIを細胞取込みから保護する
FVIIIの細胞取込みに対する血漿由来(pd) VWF及びVWFの断片の効果を、両方が抗原提示細胞である、ヒト単球由来マクロファージ若しくは樹状細胞、又はU87 MG細胞において評価する。U87 MG細胞は、ATCC(HTB-14)から得る。細胞は、フィブロネクチン被覆24ウエルプレートで10%熱不活性化FCS添加EMEM中で5%CO2雰囲気中37℃で48時間培養する。細胞を緩衝液A(10mMヘペス、150mM NaCl、4KCl、11mMグルコース、pH7.4)で注意深く洗浄し、緩衝液B(5mM CaCl2及び1mg/ml BSAを添加した緩衝液A)とともに15分間インキュベートする。放射性標識FVIII(125I-FVIII、最終濃度1nM)を単独で又は種々の濃度のpdVWF(American Diagnostica、単量体含量に基づく最終濃度0.001nM〜50nM)又はTIL'/E'/D3/A1(最終濃度0.25nM〜500nM又は1000nM)と前混合してU87 MG細胞への添加前に10分間インキュベートし、結合及びインターナリゼーションを可能にするために細胞とともに37℃で1時間インキュベートする。その後、細胞を氷冷緩衝液Bで3回洗浄した。100μg/mlトリプシン、50μg/mlプロテイナーゼK、5mM EDTAを含むPBS(pH7.4)中の細胞を氷上で1時間インキュベートすることにより、表面結合タンパク質を除去する。分離した細胞を管に移し、遠心分離して細胞をペレットにする。細胞結合FVIIIに相当する上清を新たな管に移す。上清(結合FVIII)及び細胞ペレット(インターナライズしたFVIII)を含む管内の放射能をガンマ線計数装置で定量し、125I-FVIIIに基づく標準曲線を用いることによってFVIII濃度の値を計算する。FVIIIが存在しない状態での結合125I-FVIIIを100%とする。
皮下投与後のVWF分子との共製剤化FVIII化合物の有効性
FVIII欠乏性のFVIII KOマウスの12〜16週齡の雄及び雌を12匹の動物の3群に分ける。各群において、8匹の動物を尾出血に供し、4匹の動物を並行してROTEM解析を用いるex vivo有効性試験に用いる。
s.c.投与FVIIIの予防効果は、s.c.投与後24時間目における30分の試験期間中の失血を1)媒体対照群及び2)グリコPEG化FVIIIを用いるi.v.対照群のそれと比較することによって決定する。グリコPEG化FVIIIをs.c.投与した群における失血は、i.v.投与した群における失血と同等である(図10、左パネル)。失血データは、検査済み凝固パラメーター、例えば、凝固時間のex vivo有効性並行試験に裏付けられている(図10、右パネル)。
FVIII欠乏マウスにおけるs.c.投与FVIII±VWF断片の影響
試験化合物:試験化合物は、10mM L-ヒスチジン(1.55mg/ml)、8.8mMスクロース(3.0mg/ml)、308mM NaCl(18mg/ml)、1.7mM CaCl2二水和物(0.25mg/ml)、0.01%ポリソルベート80(0.1mg/ml)、pH7.3に加えて調製する。
他のFVIII欠乏種におけるs.c. FVIII±VWF断片の効果
血友病Aの非マウスモデル、例えば、ラット及びイヌにおける皮下投与後の効果を確認するために他の種における追加の薬力学的実験を行う。ex vivo効果を評価する前に、出血チャレンジを誘導する前に、又は自然出血を治療若しくは予防する手段としてFVIII又はFVIII/VWFを皮下注射する。
VWF断片をコードする発現ベクターの構築
実施例17で述べたpJSV348によりコードされるVWF(764〜1250)-C1099/1142S-ALA-HPC4タンパク質におけるアミノ酸置換S1142Cをもたらすヌクレオチド置換は、VWF 1099C S及びVWF 1099C ASプライマー(Table P)を用いてPCRベースの部位特異的突然変異誘発により導入した。これにより、VWF(764〜1250)-C1099S-ALA-HPC4(配列番号11)をコードする挿入断片を含むpTT5からなるpGB237ベクターが生じる。1142位におけるシステインは、実施例20で述べたようにタンパク質の二量体化を可能にする。
VWF断片はヒト樹状細胞によるFVIIIの取込みを阻害する
ヒト単球由来の樹状細胞を実施例28で述べたように作製した。樹状細胞マーカーCD209及びCD86の発現をLRS Fortessa機器(BD)を用いたフローサイトメトリーにより制御した。樹状細胞とともに37℃で1時間インキュベートする前に、蛍光標識FVIII(オレゴングリーン-VIII、最終濃度30 nM)を種々の濃度の血漿由来VWF又はVWF断片と前混合した。生/死細胞キット(Invitrogen#L10119、APC-Cy7)を、生存樹状細胞をゲートオンする(gating on)ために用い、この細胞集団内のFVIIIの取込みを定量した。データは、個々の実験ごとに標準化した。VWFを含まない試料におけるシグナルを100% FVIII取込みと定義し、最高濃度の血漿由来VWF(単量体に基づいて240nM)を含む試料におけるシグナルを0%と定義した。3〜5回の実験から得られた値を合わせ、Prismソフトウエアで非線型回帰を用いてIC50値を計算した(log(阻害剤)対反応-可変勾配(4パラメーター))。得られたIC50値をTable 12(表13)に示す。データは、十分に高い濃度を用いる場合にすべての供試VWF断片が樹状細胞によるFVIIIの取込みを阻害することができたことを示している。抗原提示細胞によるFVIIIの取込みがFVIIIを免疫系に提示する最初の段階であるので、十分に高い濃度のVWF断片とFVIIIとの共製剤がFVIIIの免疫原性を減少させる可能性を有しうることがデータから示唆される。
FVIIIに対する阻害抗体を有する動物におけるs.c. FVIII±VWF断片の効果
目的は、FVIIIに対するインヒビターを有する血友病A患者を治療する医薬組成物の可能性を評価することである。我々は、FVIII単独又はVWF断片との共製剤を、組成物による治療の前のFVIIIの反復皮下若しくは静脈内投与により、又はポリクローナル若しくはモノクローナル抗FVIII抗体を注射することにより、インヒビターが誘導されるナイーブFVIII-KOマウス又はFVIII-KOマウスに皮下投与する。治療の効果は、外側尾静脈の切断の後の麻酔マウスにおいて評価する。尾をあらかじめ加温した37℃の生理食塩水に入れ、出血を60分間観察した。実験中の失血は、組成物の効果の尺度である。
VWFノックアウトマウスへのVWF断片の投与
試験化合物:
マウスVWF断片TIL'/E'/D3/A1 1.829nmol/ml、0.015mg/ml
試験化合物を20mMイミダゾール、150mM NaCl、0.02%Tween 80、1.1Mグリセロール、10mM CaCl2、pH7.3に加えて製剤化した。
ツロクトコグアルファ(FVIII)に対するvWF断片TIL'/E'/D3/A1、TIL'/E'/D3、TIL'E及びTIL'/E'/VWD3並びにvWF断片TIL'/E'/D3/A1に対するツロクトコグアルファ(FVIII)のHX-MSによる相互作用マッピング
HX-MSの概説
HX-MS技術は、タンパク質の水素交換(HX)を質量分析(MS)によって容易に追跡することができることを利用する。水素を含む水性溶媒を重水素を含む水性溶媒で置換することにより、タンパク質における所定の部位における重水素原子の取込みが1Daの質量の増加を生じさせる。この質量の増加は、交換反応の反応停止試料において質量分析により時間の関数としてモニターすることができる。重水素標識情報は、反応停止条件下でのペプシン消化及び得られたペプチドの質量の増加の追跡によってタンパク質における領域に亜局在化することができる。
用いたタンパク質のバッチは、以下の通りであった:
用いたFVIIIタンパク質のバッチは、以下の通りであった:
FVIII(N8、ツロクトコグアルファ、配列番号2)バッチ0155-0000-0004-37A
vWF断片
D'D3A1(配列番号19;Cys1099Ser;Cys1142Ser)バッチ0129-0000-0170-6B;
2304(配列番号5)バッチ0129-0000-2304-1B;2307(配列番号8)バッチ0129-0000-2307-1B;2308(配列番号11)バッチ0129-0000-2308 2B
機器及びデータ記録
HX実験は、Synapt G2質量分析計(Waters Inc.)に連結したHDX Technologyを用いるnanoAQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)を用いて実施した。Waters HDXシステムは、重水素交換反応の開始、反応時間制御、反応停止反応、UPLCシステム上への注入及び消化時間制御を実施した、LeapShellソフトウエア(Leap Technologies Inc/Waters Inc.)により操作されるLeapロボット(H/D-x PAL; Waters Inc.)を含んでいた。Leapロボットには、それぞれ緩衝液の保存及びHX反応のために20℃に維持され、タンパク質及び反応停止溶液の保存のために2℃に維持された2つの温度制御スタックが装着されていた。Waters HDXシステムは、前置及び分析カラム並びにLCチューブ及び切替え弁を収容する1℃の温度制御チャンバーをさらに含んでいた。別個に温度制御されたチャンバーが25℃のペプシンカラムを収容している。インラインペプシン消化のために、100pmolのhIL-21を含む100μlの反応停止試料を加え、100μL/分の無勾配流量(0.1%ギ酸:CH3CN 95:5)を用いて25℃の配置されたPoroszyme(登録商標)固定化ペプシンカートリッジ(2.1×30mm(Applied Biosystems))上に通した。得られたペプチドを捕集し、VanGuard前置カラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm(Waters Inc.))で脱塩した。その後、前置カラムを分析カラムUPLC-BEH C18 1.7μm(1×100mm(Waters Inc.))と直列に配置するように弁を切替え、nanoAQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から120μl/分で送出された8〜45%Bの8分間の勾配を用いてペプチドを分離した。移動相は、A:0.1%ギ酸及びB:CH3CN中0.1%ギ酸からなっていた。ESI MSデータ及び別個の高エネルギー(MSE)実験がSynapt G2質量分析計(Waters Inc.)を用いてポジティブイオンモードで得られた。ロイシン-エンケファリンをロック質量(m/z 556.2771における[M+H]+イオン)として用い、データを連続モードで収集した(さらなる説明については、Andersen及びFaber、Int. J. Mass Spec.、302、139〜148頁(2011)を参照)。
ペプシンペプチドは、Synapt G2 (Waters Inc.)のイオン移動特性を用いてペプチド及び断片をさらにアライメントする、標準MSE法を用いた別個の実験で同定された。MSEデータは、ProteinLynx Global Server version 2.5(Waters Inc.)を用いて処理した。HX-MS生データファイルは、DynamXソフトウエア(Waters Inc.)で処理した。DynamXは、ロック質量補正及び重水素取込み決定、すなわち、重水素化ペプチドの重心決定を自動的に行う。さらに、すべてのペプチドは、ソフトウエアによる正しいピーク及び重水素化の帰属・指定を保証するために手動で検査した。
アミド水素/重水素交換(HX)は、時間0においてvWF断片、すなわち、D'D3A1、2308、2307又は2304の存在下又は非存在下で、20mMイミダゾール、150mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.3(非補正値)に入れてFVIIIの10倍希釈により開始し、後の時点には対応する重水素化緩衝液(すなわち、D2Oに溶解して調製した20mMイミダゾール、150mM NaCl、10mM CaCl2、最終98% D2O、pH7.3(非補正値))に入れた。すべてのHX反応は、20℃で行わせ、4.5μMのvWF断片の非存在下又は存在下で3μMのFVIIIを含み、したがって、vWF断片結合相手が1.5倍のモル過剰量となっていた。10秒から240秒までの範囲における適切な時期に、HX反応物の50μlのアリコートを50μlの氷冷反応停止緩衝液(1.36M TCEP、2M尿素)により反応停止させ、最終pHが2.5(非補正値)となった。
FVIIIに対する2304及び2307の相互作用マッピング
FVIIIの主要配列の83%に及ぶ191ペプチドのHXの時間経過をvWF断片2304又は2307の非存在下又は存在下で10、20、30、40、60、120及び240秒間モニターした。
FVIIIの主要配列の79%に及ぶ185ペプチドのHXの時間経過をvWF断片D'D3A1又は2308の非存在下又は存在下で10、20、30、40、60、120及び240秒間モニターした。
vWF断片D'D3A1の主要配列の58%に及ぶ82ペプチドのHXの時間経過をFVIIIの非存在下又は存在下で10、20、40、60、120及び240秒間モニターした。
2304及び2307の結合により、FVIIIのすべての領域が同様の反応を示した。ペプチドの同じ基が初期の時点にvWF断片の結合による影響を受けた。
vWF断片D'D3A1、2308、2304又は2307への結合による保護を示すFVIIIの同定された領域は、結晶構造PDB:2R7Eに対してマッピングするときに構造的に遠隔距離に位置している。これによって、FVIIIとvWF断片D'D3A1、2308、2304又は2307との間の結合面によって誘導される保護にそれらをすべて割り当てることができることは非常にありそうもない。HX-MS分析は、結合面によって誘導される交換保護と速やかな立体配座の変化によって誘導される交換保護とを区別することができない。
SEC-UVにより分析したFVIII(配列番号2)とTIL'/E'/D3/A1 III(配列番号19;Cys1099Ser;Cys1142Ser)との及びFVIII(配列番号2)とTIL'/E'/D3 II(配列番号14;Cys1099Ser;Cys1142Ser)との複合体形成
材料
用いたタンパク質のバッチは、以下の通りであった:
用いたFVIIIタンパク質のバッチは、以下の通りであった:
FVIII(N8、ツロクトコグアルファ、配列番号2)バッチ0155-0000-0004-37A;TIL'/E'/D3/A1 III(配列番号19;Cys1099Ser;Cys1142Ser)バッチ0129-0000-0170-6B; TIL'/E'/D3 II(配列番号14;Cys1099Ser;Cys1142Ser)バッチ0129-0000-2309-1B
0.3ml/分の流量及び25℃の155mM NaCl、10mM酢酸カルシウム、10%イソプロパノールの分離緩衝液を用いてサイズ排除クロマトグラフィーをWaters Biosuite 4.6×300mmカラムで実施した。溶出物の吸光度をUV検出器により280nmでモニターした。FVIII、TIL'/E'/D3/A1 III、TIL'/E'/D3 II及びFVIII- TIL'/E'/D3/A1 III及びFVIII-TIL'/E'/D3 IIの1:2複合体のSEC-UV特徴付けを行った。FVIII 10μM、TIL'/E'/D3/A1 III 20μM、TIL'/E'/D3 II 20μM及び複合体の試料を調製し、15μLをカラム上に加えた。
FVIII- TIL'/E'/D3/A1 III及びFVIII-TIL'/E'/D3 IIの混合物のSEC-UVは、カラムから完全な状態で溶出する複合体の重要な画分を示した。複合体は、FVIIIよりわずかに早く溶出すると予想される。これは、両方の場合にも認められた。
Claims (18)
- 血友病の治療のためのFVIII分子を含む医薬組成物の使用であって、前記FVIII分子が100〜400個のアミノ酸サイズの切断型Bドメインを含み、前記切断型Bドメインのアミノ酸配列がwt FVIII Bドメインアミノ酸配列に由来し、s.c.投与に関連する前記FVIII分子の生物学的利用率が少なくとも10%である、FVIII分子を含む医薬組成物の使用。
- 前記Bドメインが配列番号1に示されているSer750アミノ酸残基に結合しているO-グリカンを含む、請求項1に記載のFVIII分子。
- FVIII分子のアミノ酸配列が配列番号3に示されている、請求項1又は2に記載のFVIII分子。
- FVIII Bドメインのアミノ酸配列がアミノ酸741〜857+1637〜1648、アミノ酸741〜914+1637〜1648、アミノ酸741〜954+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648、アミノ酸741〜1003+1637〜1648、アミノ酸741〜1003+1637〜1648、アミノ酸741〜1020+1637〜1648、アミノ酸741〜1079+1637〜1648、アミノ酸741〜1206+1637〜1648、アミノ酸741〜1261+1637〜1648、アミノ酸741〜1309+1637〜1648、アミノ酸741〜914+1637〜1648、アミノ酸741〜954+1637〜1648、アミノ酸741〜968+1637〜1648、アミノ酸741〜1003+1637〜1648、アミノ酸741〜1018+1637〜1648、アミノ酸741〜1070+1637〜1648、アミノ酸741〜1230+1637〜1648、アミノ酸741〜1301+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648、アミノ酸741〜965+1637〜1648、及びアミノ酸741〜965+1637〜1648からなる群から選択される、請求項1に記載のFVIII分子。
- 少なくとも1つの半減期延長部分が前記FVIII分子に共有結合している、請求項1から4のいずれか一項に記載のFVIII分子。
- 少なくとも1つの水溶性ポリマーがBドメインに存在するグリカンに共有結合している、請求項1から5のいずれか一項に記載のFVIII分子。
- 前記水溶性ポリマーがPEG及び多糖からなる群から選択される、請求項5から6のいずれか一項に記載のFVIII分子。
- VWF又はVWF断片をさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記VWF断片が最大1200個のアミノ酸を含み、前記VWF断片がTIL'ドメインを含む、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記VWF断片が1099及び/又はC1142システインを含まない、請求項8から9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記VWF断片の5%未満がオリゴマー及び/又は多量体の形態である、請求項8から10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記VWF断片が二量体である、請求項8から10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記VWF断片のアミノ酸配列が配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、及び配列番号21からなるリストから選択される、請求項8から12のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- FVIIIとVWFとの間の比が1:1である、請求項8から13のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- FVIIIの濃度が少なくとも500IU/mlである、請求項1から14のいずれか一項に規定の医薬製剤。
- VWF断片に結合したFVIIIの量が製剤中のFVIII総量の少なくとも70%である、請求項1から15のいずれか一項に規定の医薬製剤。
- 皮下投与による血友病の治療のための請求項1から16のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
- 血管外投与によるフォン-ウィルブランド病の治療のための請求項17に記載の医薬組成物の使用。
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