CN113301911A - 用于调节因子viii功能的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

公开了因子VIII变体及其使用方法。

Description

用于调节因子VIII功能的组合物和方法

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2018年10月23日提交的美国临时专利申请号62/749,182的优先权。上述申请通过引用并入本文。

本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权号为R01 HL-137335-01A1的政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定的权利。

技术领域

本发明涉及医学和血液学领域。更具体地，本发明提供了新的因子VIII变体和使用其来调节有需要的患者的凝血级联的方法。

背景技术

在整个说明书中引用了数个出版物和专利文件，以描述与本发明有关的现有技术。这些引用中的每一个都通过全文引用的方式并入本文。

因子VIII(FVIII)中的突变可导致严重的出血性疾病，并与A型血友病有关。FVIII缺陷或缺乏FVIII活性导致无法有效形成凝块。迄今为止，由于费用高昂，全世界只有20％的血友病A患者接受FVIII替代疗法的常规治疗。通常，所述FVIII是血浆来源的或重组产生的。基于AAV载体的血友病A的基因疗法是有前景的，但由于对所述载体的异常免疫应答而存在安全性限制。已经发现这种异常的免疫反应是载体剂量依赖性的。而且，无论使用蛋白质还是基因疗法，所递送或表达的FVIII的免疫原性都可能是有问题的。实际上，血友病A患者中有20％至30％会对于所述治疗形成抑制物(例如抗FVIII中和抗体)(Peyvandi,等人,N.Engl.J.Med.(2016)374:2054-2064；Walsh,等人,Am.J.Hematol.(2015)90:400-405；Eckhardt,等人,J.Thromb.Haemost.(2015)13:1217-1225；Darby,等人,J.Thromb.Haemost.(2004)2:1047-1054；Donfield,等人,Blood(2007)110:3656-3661；Witmer,等人,Br.J.Haematol.(2011)152:211-216；Hoots,W.K.,Semin.Hematol.(2008)45(2Suppl 1):S42-S49；Guh,等人,Haemophilia(2012)18:268-275；Lindvall,等人,Pediatr.Blood Cancer(2014)61:706-711)。因此，产生增强的FVIII分子将通过降低FVIII生产成本，增加AAV基因疗法的安全性和/或降低免疫原性而有益于血友病的治疗。因此，显然需要具有改善的生物学特性的FVIII分子。

发明内容

根据本发明，提供了用于在有此需要的患者中调节凝血的组合物和方法。更具体地，提供了调节(例如，增加)凝血的因子VIII(FVIII)变体。在一个特定的实施方案中，将所述FVIII变体的B结构域替换为与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，将所述FVIII变体的B结构域替换为包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，所述因子VIII变体在位置560、561、712、713和/或659处包含至少一个突变，任选地具有B结构域替换。在一个特定的实施方案中，所述FVIII变体包含将位置659处的Lys用另一个氨基酸取代。在一个具体的实施方案中，所述在位置659处的Lys被Trp、Arg、Ala、His、Tyr、Asp、Thr、Ser、Val、Phe、Gln、或Cys取代，特别是被Ser、Gln或Cys取代。所述FVIII变体可包含B结构域取代和位置659处的取代。还提供了包含至少一种本发明的FVIII变体和至少一种药学上可接受的载体的组合物。还公开了编码本发明的FVIII变体的核酸分子及其使用方法。本发明的另一方面包括表达本文所述的FVIII变体的宿主细胞。还公开了分离和纯化所述FVIII变体的方法。

还提供了药物组合物，其在载体中包含本发明的FVIII变体和/或编码FVIII变体的核酸分子。本发明还包括用于在有此需要的患者中治疗凝血相关病症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述FVIII变体或编码所述FVIII变体的核酸分子，尤其是在药物组合物中。这些方法在需要促凝血剂的病症的治疗中具有功效，所述疾病包括但不限于血友病，特别是血友病A。

附图说明

图1A提供了因子VIII蛋白的示意图。完整蛋白质的长度为2332个氨基酸，并且所述B结构域为908个氨基酸。在所述示意图中还指示了各种切割位点。图1B提供了的加工因子VIII蛋白的示意图。FVIII被翻译为具有A1-α1-A2-α2-B-α3-A3-C1-C2的结构域结构的单肽链(单链)。反面高尔基弗林蛋白酶(protease furin)在R-1313和/或R-1648处(三角形)将FVIII蛋白水解切割导致异二聚体形成。FVIII重链(A1-α1-A2-α2-B)和轻链(α3-A3-C1-C2)通过A1和A3结构域之间存在的非共价金属离子依赖性相互作用(虚线)保持关联。分泌后，B结构域在血浆中进行其他非特异性蛋白水解。在凝血过程中，FVIII单链或异二聚体通过在R-372、R-740和R-1689处(三角形)被凝血酶裂解被活化为其异三聚体辅助因子形式。A2通过非共价相互作用(虚线)与A1-α1保持关联。FVIIIa的失活是通过在R-336和R-562处(三角形)的自发的A2解离和/或蛋白水解裂解而发生的，主要通过活化的蛋白C。

图2提供了各种人类FVIII B结构域变体在血友病A小鼠中的表达图。

图3提供了在位置659处具有氨基酸取代的变体的FVIII比活度的图。

图4提供了FVIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。位置560、561、659、712和/或713处的氨基酸以粗体显示并加下划线。所述B结构域也用斜体和粗体表示。所提供的氨基酸序列在N末端缺少19个氨基酸的信号肽(MQIELSTCFFLCLLRFCFS(SEQ ID NO:2))。

图5提供了在位置560、561、712和713处具有氨基酸取代的变体的FVIII比活度的图。

具体实施方式

血友病A(HA)和血友病B(HB)分别是由于凝血因子VIII(FVIII)或凝血因子IX(FIX)的遗传性缺陷而造成的X连锁出血性疾病(Peyvandi,等人,Lancet(2016)388:187-197；Konkle,等人,Hemophilia A.In GeneReviews,Adam等人编,University ofWashington(1993))。出血表型通常与残余因子活性有关：患有重度疾病(因子活性<正常值的1％)的人经常自发性出血；患有中度疾病(因子活性为正常值的1％-5％)的人很少会自发性出血，但受到轻微的创伤就会出血；以及患有轻度疾病(因子活性为正常值的5％-40％)的人在侵入性手术或创伤期间会出血。鉴于因子活性和出血表型之间这种明确限定的关系，HA和HB是基因疗法的诱人靶标，因为因子水平的小幅提高有望产生有意义的临床影响。尽管数十年来已研究了多种策略，但该领域已聚焦于使用腺相关病毒(AAV)载体递送工程化的FVIII或FIX变体的转基因，所述变体具有野生型(WT)蛋白所不具有的治疗上的优势特性(Hough,等人,J.Thromb.Haemost.(2005)3:1195-1205；Lheriteau,等人,BloodRev.(2015)29:321-328；Rogers,等人,Front.Biosci.(2015)20:556-603；Arruda,等人,Expert Opin.Orphan Drugs(2015)3:997-1010；High,K.A.,HematologyAm.Soc.Hematol.Educ.Program(2012)2012:375-381；Zinn,等人,Curr.Opin.Virol.(2014)8:90-97；Mingozzi,等人,Nat.Rev.Genet.(2011)12:341-355；Colella,等人,Mol.Ther.Methods Clin.Dev.(2017)8:87-104)。值得注意的是，全长FVIII cDNA(7kb)超过了AAV载体的包装容量(约4.7kb)。去除FVIII的B结构域可以使所述cDNA减小至约4.4kb。基于AAV的用于HA的临床试验已报告了使用该方法的积极结果(Rangarajan,等人,N.Engl.J.Med.(2017)377:2519-2530)。

如上所解释的，因子VIII对于凝血活性至关重要，而且FVIII基因的突变会导致血友病A，血友病的最常见形式。在本文中，示出了FVIII的氨基酸序列的特定改变与增强的蛋白质产生和活性相关。因此，本发明提供了合理设计的氨基酸残基修饰，其提供了功能获得性变体。

全长FVIII是一种主要在肝窦内皮细胞(LSEC)和肝外内皮细胞中表达的280kDa大蛋白(Fahs,等人,Blood(2014)123:3706-3713；Everett,等人,Blood(2014)123:3697-3705)。FVIII主要作为通过非共价金属依赖性相互作用结合的重链和轻链的异二聚体循环(Lenting,等人,Blood(1998)92:3983-3996)。因子VIII包含几个结构域。通常，将所述结构域称为A1-A2-B-A3-C1-C2，如图1所示。FVIII的重链包含A1-A2-B，而轻链包含A3-C1-C2。最初，FVIII处于与von Willebrand因子(vWF)结合的非活性形式。FVIII通过被凝血酶(因子IIa)切割而活化并释放B结构域。FVIII(FVIIIa)的活化形式与vWF分离并与凝血因子IXa相互作用——导致通过凝血级联形成血凝块。

所述B结构域包含蛋白质的40％(908个氨基酸)，并且对于蛋白质促凝活性不是必需的(Brinkhous,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1985)82:8752-8756)。最常见的B结构域缺失的(BDD)FVIII包含14个原始氨基酸残基作为接头(Lind,等人(1995)Eur.J.Biochem.,232(1):19-27)。此BDD FVIII通常称为BDD-SQ或hFVIII-SQ(参见表1)。这种BDD FVIII形式通常用于生产重组BDD-FVIII(约4.4Kb)以及用于基因治疗(Berntorp,E.,Semin.Hematol.(2001)38(2Suppl 4):1-3；Gouw,等人,N.Engl.J.Med.(2013)368:231-239；Xi,等人,J.Thromb.Haemost.(2013)11:1655-1662；Recht,等人,Haemophilia(2009)15:869-880；Sabatino,等人,Mol.Ther.(2011)19:442-449；Scallan,等人,Blood(2003)102:2031-2037)。如上所述，由于AAV(4.7Kb)和其他载体系统的包装能力有限，使用AAV载体的基因疗法只能使用缩短的FVIII分子，例如BDD-FVIII(Lind,等人(1995)Eur.J.Biochem.,232(1):19-27)。美国专利8,816,054还提供了具有不同长度和序列的接头的BDD FVIII分子(参见，例如，表1)。然而，表1中的接头包含超过一种新表位，其可以导致FVIII抑制物的产生。

表1：短肽接头取代FVIII变体中的B结构域(Lind,等人(1995)Eur.J.Biochem.,232(1):19-27；Pittman,等人,Blood(1993)81:2925-2935；Toole,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1986)83:5939-5942)。弗林(furin)识别基序以下划线标识。*也称为hFVIII-BDD。缩写：aa，氨基酸；c，犬；cl，细胞系；F，因子；h，人类；NA，不适用；p，猪。所提供的氨基酸序列从上到下是SEQ ID NO：3-12。

本文提供了新的因子VIII变体。本发明包括FVIII变体，所述FVIII变体包括FVIIIa变体和FVIII前肽变体。为了简单，在整个申请中所述变体主要在FVIII的背景下进行描述。然而，本发明考虑并涵盖具有与FVIII中所述相同的氨基酸取代和/或接头的因子FVIIIa和FVIII前肽分子。在一个特定的实施方案中，本发明的FVIII变体表达为单链分子或至少几乎仅表达为单链分子。

本发明的FVIII变体可以来自任意哺乳动物物种。在一个具体实施方案中，所述FVIII变体来自人类。基因ID：2157和GenBank登录号NM_000132.3和NP_000123.1提供了野生型人类FVIII(特别是包含信号肽的前肽)的氨基酸和核苷酸序列的实例。图4提供了SEQID NO:1，其是人类因子FVIII的氨基酸序列的实例。SEQ ID NO:1在其N末端缺少19个氨基酸的信号肽(MQIELSTCFFLCLLRFCFS(SEQ ID NO:2))。从提供的氨基酸序列以及提供的GenBank登录号可以容易地确定编码因子FVIII变体的核酸分子。

根据本发明的一个方面，所述FVIII变体是包含接头的B结构域缺失(BDD)的FVIII分子。在一个特定的实施方案中，所述接头包含表2中列出的序列。如本文所示，用表2中列出的序列替换因子VIII的B结构域产生了具有增强的因子VIII活性的因子VIII变体。这些FVIII变体的表达水平也高于其他BDD FVIII。而且，表2中提供的接头各自仅具有一个新表位，而表1中的接头的每一个具有超过一个的新表位。通过减少或最小化接头区域中新表位的数量，以表2中的接头降低了FVIII变体的不利免疫原性。

表2：具有最少新表位的新型B结构域接头。所提供的氨基酸序列从上到下是SEQID NO：13-18。

在一个特定的实施方案中，本发明涵盖FVIII变体，其中将所述B结构域(例如，SEQID NO:1的氨基酸741-1648)替换为包括SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18或由其组成的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，所述B结构域被长度为至多约50个、至多约45个、至多约40个、至多约35个、至多约30个、至多约25个、至多约20个、至多约15个、至多约10个或至多约5个氨基酸的氨基酸序列所取代。在一个特定的实施方案中，将所述B结构域(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸741-1648)替换为包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18或由其组成的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，将所述B结构域(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸741-1648)替换为包括SEQ ID NO:18或由其组成的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，将所述B结构域(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸741-1648)替换为与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同源性(同一性)，特别是具有少90％、95％、97％、99％或100％同源性(同一性)的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，将所述B结构域(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸741-1648)替换为与SEQ ID NO:18具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同源性(同一性)，特别是具有少90％、95％、97％、99％或100％同源性(同一性)的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，因子VIII变体在位置560、561、712、713和/或659处包含至少一个突变。如本文所述，这些FVIII变体具有比野生型FVIII更高的比活度。在某些实施方案中，因子VIII变体在位置659处包含突变。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys(K)不被Pro(P)、Gly(G)、Met(M)或Leu(L)取代。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys被Trp(W)、Arg(R)、Ala(A)、His(H)、Tyr(Y)、Asp(D)、Thr(T)、Ser(S)、Val(V)、Phe(F)、Gln(Q)或Cys(C)取代。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys被Asp(D)、Thr(T)、Ser(S)、Val(V)、Phe(F)、Gln(Q)或Cys(C)取代。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys被Ser(S)、Val(V)、Phe(F)、Gln(Q)或Cys(C)取代。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys被Ser(S)、Gln(Q)或Cys(C)取代。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys被Gln(Q)或Cys(C)取代。

在某些实施方案中，因子VIII变体在位置560处包含突变。在一个具体的实施方案中，位置560处的Asp(D)被Ala(A)、Val(V)、Ile(I)、Leu(L)、His(H)、Arg(R)或Lys(K)取代。在一个具体的实施方案中，位置560处的Asp(D)被Ala(A)、Val(V)、Ile(I)或Leu(L)取代。在一个具体的实施方案中，位置560处的Asp(D)被His(H)、Arg(R)或Lys(K)取代。在一个具体的实施方案中，位置560处的Asp(D)被Ile(I)或His(H)取代。

在某些实施方案中，因子VIII变体在位置561处包含突变。在一个具体的实施方案中，位置561处的Gln(Q)不被Leu(L)、Arg(R)或Asn(N)取代。在一个具体的实施方案中，位置561处的Gln(Q)被Asp(D)或Glu(E)取代。在一个具体的实施方案中，位置561处的Gln(Q)谷氨酸被Asp(D)取代。

在某些实施方案中，因子VIII变体在位置712处包含突变。在一个具体的实施方案中，位置712处的Asp(D)被Glu(E)以外的氨基酸取代。在一个具体的实施方案中，位置712处的Asp(D)被Ala(A)、Val(V)、Ile(I)或Leu(L)取代。在一个具体的实施方案中，位置712处的Asp(D)被Ile(I)或Leu(L)取代。在一个具体的实施方案中，位置712处的Asp(D)被Leu(L)取代。

在某些实施方案中，因子VIII变体在位置713处包含突变。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Ala(A)、Arg(R)、Met(M)、Tyr(Y)、Asp(D)、Glu(E)、Cys(C)或Gly(G)取代。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Arg(R)、Met(M)、Tyr(Y)、Asp(D)、Cys(C)或Gly(G)取代。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Asp(D)或Glu(E)取代。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Cys(C)取代。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Ala(A)或Gly(G)取代。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Gly(G)取代。

本发明的FVIII变体如本文所述可包含在位置560、561、712、713和/或659处的至少一个突变和/或如本文所述可包含替代所述B结构域的接头。换句话说，本发明涵盖仅具有位置560、561、712、713和/或659处的突变的FVIII变体(例如，FVIII包含完整的B结构域)、仅具有替代所述B结构域的接头的FVIII变体(例如，位置560、561、712、713和659处的氨基酸是野生型)以及包含在位置560、561、712、713和/或659处的突变以及替代所述B结构域的接头的FVIII变体。

在一个具体的实施方案中，所述VIII变体包含在位置560、561、712、713和/或659处的突变以及替代所述B结构域的接头。在一个特定的实施方案中，所述VIII变体包含在位置560、561、712、713和/或659处的突变以及替代所述B结构域的接头，所述B结构域具有与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同源性(同一性)，特别是具有少90％、95％、97％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，所述VIII变体包含在位置560、561、712、713和/或659处的突变以及替代所述B结构域的接头，所述B结构域具有与SEQ ID NO:18具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同源性(同一性)，特别是具有少90％、95％、97％、99％或100％同源性(同一性)的氨基酸序列。在某些实施方案中，因子VIII变体在位置659处包含突变。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys(K)不被Pro(P)、Gly(G)、Met(M)或Leu(L)取代。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys被Trp(W)、Arg(R)、Ala(A)、His(H)、Tyr(Y)、Asp(D)、Thr(T)、Ser(S)、Val(V)、Phe(F)、Gln(Q)或Cys(C)取代。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys被Asp(D)、Thr(T)、Ser(S)、Val(V)、Phe(F)、Gln(Q)或Cys(C)取代。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys被Ser(S)、Val(V)、Phe(F)、Gln(Q)或Cys(C)取代。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys被Ser(S)、Gln(Q)或Cys(C)取代。在一个具体的实施方案中，位置659处的Lys被Gln(Q)或Cys(C)取代。在某些实施方案中，因子VIII变体在位置560处包含突变。在一个具体的实施方案中，位置560处的Asp(D)被Ala(A)、Val(V)、Ile(I)、Leu(L)、His(H)、Arg(R)或Lys(K)取代。在一个具体的实施方案中，位置560处的Asp(D)被Ala(A)、Val(V)、Ile(I)或Leu(L)取代。在一个具体的实施方案中，位置560处的Asp(D)被His(H)、Arg(R)或Lys(K)取代。在一个具体的实施方案中，位置560处的Asp(D)被Ile(I)或His(H)取代。在某些实施方案中，因子VIII变体在位置561处包含突变。在一个具体的实施方案中，位置561处的Gln(Q)不被Leu(L)、Arg(R)或Asn(N)取代。在一个具体的实施方案中，位置561处的Gln(Q)被Asp(D)或Glu(E)取代。在一个具体的实施方案中，位置561处的Gln(Q)谷氨酸被Asp(D)取代。在某些实施方案中，因子VIII变体在位置712处包含突变。在一个具体的实施方案中，位置712处的Asp(D)被Glu(E)以外的氨基酸取代。在一个具体的实施方案中，位置712处的Asp(D)被Ala(A)、Val(V)、Ile(I)或Leu(L)取代。在一个具体的实施方案中，位置712处的Asp(D)被Ile(I)或Leu(L)取代。在一个具体的实施方案中，位置712处的Asp(D)被Leu(L)取代。在某些实施方案中，因子VIII变体在位置713处包含突变。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Ala(A)、Arg(R)、Met(M)、Tyr(Y)、Asp(D)、Glu(E)、Cys(C)或Gly(G)取代。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Arg(R)、Met(M)、Tyr(Y)、Asp(D)、Cys(C)或Gly(G)取代。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Asp(D)或Glu(E)取代。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Cys(C)取代。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Ala(A)或Gly(G)取代。在一个具体的实施方案中，位置713处的Lys(K)被Gly(G)取代。

如上所述，本发明的FVIII变体可以是人类的。在一个具体实施方案中，本发明的FVIII变体与SEQ ID NO：1(或其活化的FVIII片段)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性(同一性)，特别是至少90％、95％、97％或99％的同源性(同一性)。在一个具体实施方案中，所述FVIII变体包含与SEQ ID NO：1的氨基酸1-740(或其活化的FVIII片段)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性(同一性)，特别是至少90％、95％、97％或99％的同源性(同一性)的氨基酸序列，以及包含与SEQID NO：1的氨基酸1649-2332(或其活化的FVIII片段)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性(同一性)，特别是至少90％、95％、97％或99％的同源性(同一性)的氨基酸序列。所述同源性(同一性)百分比不包括置560、561、712、713和/或659处的取代。

本发明的FVIII变体也可以是翻译后修饰的。所述FVIII变体可以在细胞(特别是人类细胞)中或在体外翻译后修饰。

在一个特定的实施方案中，与野生型FVIII或hFVIII-SQ相比，本发明的FVIII变体具有增加的表达。在一个特定的实施方案中，与野生型FVIII相比，本发明的FVIII变体具有增加的FVIII活性或增加的比活度。

编码上述FVIII变体的核酸分子也包括在本发明中。编码所述变体的核酸分子可通过本领域已知的任意方法制备。所述核酸分子可以保持在任意方便的载体，具体地，表达载体中。

包含至少一种FVIII变体和至少一种载体的组合物也包括在本发明中。在一个具体的实施方案中，所述FVIII在组合物中是分离的和/或基本上纯的。包含至少一种FVIII变体核酸分子和至少一种载体的组合物也包括在本发明中。除非任何常规载体与待施用的变体均不相容，否则考虑其在药物组合物中使用。在一个具体实施方案中，所述载体是用于静脉内施用的药学上可接受的载体。

定义

上文和整个说明书以及权利要求书中使用了与本发明的生物分子有关的多种术语。

短语“凝血相关病症”是指出血性病症，例如但不限于血友病A、血友病B、血友病A和B患者、具有抑制性抗体的、至少一种凝血因子(例如，因子VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II和/或von Willebrand因子；具体地，因子VIII)有缺陷的、联合的FV/FVIII缺陷的、维生素K环氧化物还原酶C1缺陷的、γ-羧化酶缺陷的血友病、与创伤或损伤、血栓形成、血小板减少、中风、凝血病(低凝固性)、弥散性血管内凝血(DIC)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林(warfarin)或小分子抗血栓药物(例如FXa抑制剂)相关的过度抗凝；以及血小板病症，如Bernard Soulier综合征、Glanzman血栓形成(Glanzman thromblastemia)和储存池缺陷(storage pool deficiency)。在一个特定的实施方案中，术语“凝血相关病症”是指以过度和/或不受控制的出血为特征的出血性病症(例如可以用促凝剂治疗的病症)。在一个具体实施方案中，所述凝血相关病症是血友病。在一个具体实施方案中，所述凝血相关病症是血友病A。

关于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。该术语，当应用于DNA时，是指从与其起源的生物体的天然存在的基因组中紧接连续(在5'和3'方向上)的序列中分离的DNA分子。例如，“分离的核酸”可包含插入载体(例如质粒或病毒载体)中的，或整合到原核生物或真核生物DNA中的DNA或cDNA分子。关于本发明的RNA分子，术语“分离的核酸”主要是指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语可以指这样的RNA分子，其被从与其在天然状态(即，在细胞或组织中)关联的RNA分子中充分分离，从而其以“基本上纯的”形式存在。

关于蛋白质，本文有时使用术语“分离的蛋白质”。该术语可以指通过表达本发明的分离的核酸分子产生的蛋白质。或者，该术语可以指这样的蛋白质，其与被从其天然关联的其他蛋白质在充分分离(例如，从而以“基本上纯的”形式存在)。“分离的”并不意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或排除不干扰基本活性的杂质的存在(并且杂质是可能存在的，例如，由于不完全的纯化)，或排除添加稳定剂。

术语“载体”是指载体核酸分子(例如RNA或DNA)，其中可以插入用于导入宿主细胞的核酸序列，所述核酸序列将在所述宿主细胞中被复制。“表达载体”是含有基因或核酸序列的特化载体，所述基因或核酸序列具有在宿主细胞中表达所需的必需调节区(例如启动子)。

术语“可操作地连接的”是指将编码序列表达所必需的调节序列置于DNA分子中相对于所述编码序列的适当位置，以实现所述编码序列的表达。有时将该相同定义应用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。该定义有时也适用于第一和第二核酸分子的核酸序列的排列，其中产生杂合核酸分子。

术语“基本上纯的”是指制剂包含至少50-60重量％的目的化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白质等)，具体地，至少75重量％，或至少90-99重量％或更多的目的化合物。纯度可以通过适合于目的化合物的方法(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)测量。

“药学上可接受的”表示经联邦或州政府的监管机构批准，或列在《美国药典》或其他公认药典中，可用于动物，尤其是人类。

“载体”是指，例如，稀释剂、佐剂、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、增溶剂(例如聚山梨醇酯80)、乳化剂、缓冲剂(例如，Tris HCl、乙酸盐、磷酸盐)、抗菌剂、填充物质(例如，乳糖、甘露糖醇)、赋形剂、辅助剂或用于施用本发明活性剂的媒介物。药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。优选将水或盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液用作载体，特别是对于可注射溶液。合适的药物载体描述于E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”(Mack Publishing Co.，Easton，PA)；Gennaro，A.R.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，(Lippincott，Williams andWilkins)；Liberman等人编辑，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.；和Kibbe等人编辑，Handbook of Pharmaceutical Excipients，AmericanPharmaceutical Association，Washington。

编码变体的核酸分子和多肽的制备

编码本发明变体的核酸分子可以通过使用重组DNA技术方法制备。核苷酸序列信息的可用性使得能够通过多种手段制备本发明的分离的核酸分子。例如，可以使用本领域熟知的标准方案从合适的生物来源分离编码变体的核酸序列。

可以将本发明的核酸在任何方便的克隆载体中保持为RNA或DNA。在一个具体实施方案中，将克隆保持在质粒克隆/表达载体(例如pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA))中，所述载体在合适的大肠杆菌宿主细胞中繁殖。或者，可以将所述核酸保持在适于在哺乳动物细胞中表达的载体中。在翻译后修饰影响变体功能的情况下，优选在哺乳动物细胞，特别是人类细胞中表达该分子。

本发明的编码FVIII变体的核酸分子包括可以是单或双链的cDNA、基因组DNA、RNA及其片段。因此，本发明提供了具有能够与本发明的核酸分子的至少一个序列杂交的序列的寡核苷酸(DNA或RNA的正义链或反义链)。此类寡核苷酸可用作检测变体表达的探针。

根据已知方法，可以以多种方式制备本发明的FVIII变体。可以从合适的来源(例如，表达FVIII变体的转化的细菌或动物(例如哺乳动物或人类)培养的细胞或组织)中纯化蛋白质，例如，通过免疫亲和纯化。编码变体的核酸分子的可用性使得能够使用本领域已知的体外表达方法产生变体。例如，可以将cDNA或基因克隆到合适的体外转录载体中，例如用于体外转录的pSP64或pSP65，然后在合适的无细胞翻译系统(例如小麦胚芽或兔网织红细胞裂解液)中进行无细胞翻译。体外转录和翻译系统是可商购的，例如从Promega或LifeTechnologies。

或者，可以通过在合适的原核或真核表达系统中表达来产生更大量的变体。例如，可以将编码FVIII变体的DNA分子的部分或全部插入适于在细菌细胞例如大肠杆菌或在哺乳动物细胞(特别是人类细胞)例如CHO或HeLa细胞中表达的质粒载体中。或者，可以产生包含变体的带标记的融合蛋白。这种变体标记的融合蛋白由部分或全部DNA分子编码，所述DNA分子在正确的密码子阅读框中与编码部分或全部所需多肽标签的核苷酸序列连接，所述多肽标签插入适于在细菌细胞或真核细胞中表达的质粒载体中，所述细菌细胞例如大肠杆菌，所述真核细胞例如但不限于酵母和哺乳动物细胞，特别是人类细胞。如上所述的载体包含在宿主细胞中表达DNA所必需的调节元件，所述调节元件以允许DNA在宿主细胞中表达的方式定位。此类表达所需的调节元件包括但不限于启动子序列、转录起始序列和增强子序列。

通过在重组原核或真核系统(特别是人类)中的基因表达产生的FVIII变体蛋白可以根据本领域已知的方法纯化。在一个具体实施方案中，可以使用市售的表达/分泌系统，由此表达重组蛋白，然后从宿主细胞分泌，以便从周围培养基中容易地纯化。如果不使用表达/分泌载体，另一种方法包括通过亲和分离纯化重组蛋白，例如通过使用与重组蛋白特异性结合的抗体来进行的免疫相互作用或通过镍柱来分离在它们的N-末端或C-末端带有6-8个组氨酸残基标签的重组蛋白。其他的标签可以包括但不限于FLAG表位、GST或血凝素表位。这些方法通常由熟练的从业者使用。

通过上述方法制备的FVIII变体蛋白质可以根据标准程序分析。例如，根据已知方法，可以对这些蛋白质进行氨基酸序列分析。

如上所述，产生本发明的多肽的便利方式是通过在表达系统中使用核酸来表达编码它的核酸。用于本发明方法的各种表达系统是本领域技术人员熟知的。

因此，本发明还包括制备(如所公开的)多肽的方法，该方法包括从编码多肽的核酸(通常是核酸)表达。这可以在引起或允许产生多肽的适当条件下通过培养含有这种载体的宿主细胞来方便地实现。多肽也可以在体外系统中产生，例如在网织红细胞裂解液中。

FVIII变体蛋白和编码变体的核酸的用途

本发明的FVIII变体蛋白和核酸可以例如用作调节凝血级联系统的治疗剂和/或预防剂。本文证明FVIII变体具有优异的性质并且可以提供有效的凝血。

在本发明的一个具体实施方案中，FVIII变体可以通过在生物相容的载体中注入，例如通过静脉内注射，向患者施用。本发明的FVIII变体可任选地包封在脂质体中或与其他磷脂或胶束混合以增加分子的稳定性。FVIII变体可以单独施用或与已知的调节凝血的其他药剂(例如vFW、因子IX、因子IXa等)组合施用。其中递送所述FVIII变体的合适组合物可以由医师在考虑各种生理变量时确定，包括但不限于患者的情况和血液动力学状态。适合于不同应用和施用途径的各种组合物是本领域熟知的并在下文中描述。

含有FVIII变体的制剂可以含有生理学上可接受的基质，并且被配制成药物制剂。可以使用基本上已知的现有技术方法来配制所述制剂，它可以与含有盐(例如NaCl、CaCl₂)和氨基酸(例如甘氨酸和/或赖氨酸)并且pH范围为6至8的缓冲液混合。含有FVIII变体的纯化制剂可以以成品溶液的形式或以冻干或深度冷冻的形式储存备用。在一个具体实施方案中，所述制剂以冻干形式储存，并使用适当的重构溶液溶解在视觉上澄清的溶液中。或者，本发明的制剂也可以作为液体制剂或作为深度冷冻的液体获得。根据本发明的制剂可以是特别稳定的，即，可以在应用前使其以溶解形式静置很长的时间。

本发明的制剂可以作为具有FVIII变体的药物制剂以单组分制剂的形式或与其他因子组合以多组分制剂的形式获得。

在将纯化的蛋白质加工成药物制剂之前，可以将纯化的蛋白质进行常规质量控制并制成治疗形式。具体地，在重组制备期间，可以测试纯化过的制剂中是否存在细胞核酸以及衍生自表达载体的核酸。

本发明的另一个特征涉及允许制备一种制剂，所述制剂含有高稳定性和结构完整性的FVIII变体，并且，具体地，不含无活性的FVIII中间体和/或蛋白水解降解产物，并且通过将其配制成合适的制剂。

作为实例，所述药物制剂可含有约1-1000μg/kg、约10-500μg/kg、约10-250μg/kg或约10-100μg/kg的剂量。在一个具体的实施方案中，所述药物蛋白制剂可以包含30-100IU/kg的剂量(例如，每日一次注射或每日最多3次或更多次)。患者可以在因出血在诊所就诊时立即接受治疗或在切割/伤口造成出血之前接受治疗。或者，患者可以每隔一至三、八或十二小时接受推注注入，或者，如果观察到足够的改善，则每天一次注入本文所述的FVIII变体。

根据本发明，编码FVIII变体的核酸可用于多种目的。在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于调节凝血的核酸递送媒介物(例如表达载体，如病毒载体)，其中所述表达载体包含编码如本文所述的FVIII变体的核酸序列。向患者施用编码FVIII变体的表达载体导致用于改变凝血级联的FVIII变体的表达。根据本发明，编码FVIII变体的核酸序列可以编码如本文所述的变体多肽，所述变体多肽的表达增加凝血作用。在一个具体实施方案中，所述核酸序列编码人类FVIII变体。

包含FVIII变体核酸序列的表达载体可以单独施用，或与用于调节凝血的其他分子组合施用。根据本发明，所述表达载体或治疗剂组合可以单独或在药学上可接受的或生物学相容的组合物中施用于患者。

在本发明的一个具体实施方案中，包含编码FVIII变体的核酸序列的表达载体是病毒载体。可用于本发明的病毒载体包括但不限于：腺病毒载体(有或没有组织特异性启动子/增强子)、多种血清型的腺相关病毒(AAV)载体(例如，AAV-1至AAV-12，特别是AAV-2、AAV-5、AAV-7和AAV-8)和杂交AAV载体、慢病毒载体和假型慢病毒载体(例如埃博拉病毒、水泡性口炎病毒(VSV)和猫科免疫缺陷病毒(FIV))、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体以及逆转录病毒载体。在一个特定的实施方案中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一个特定的实施方案中，所述载体是慢病毒载体。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于施用病毒载体的方法，所述病毒载体包含编码FVIII变体的核酸序列。在本发明的方法中可用的腺病毒载体优选包括至少腺病毒载体DNA的必需部分。如本文所述，施用这种腺病毒载体后FVIII变体的表达用于调节凝血，特别是增强蛋白酶的促凝活性。

已发现重组腺病毒载体可广泛用于多种基因疗法应用。它们在此类应用中的用途很大程度上是由于在各种器官环境中实现的体内基因转移的高效性。

腺病毒颗粒可有利地用作适当基因递送的媒介物。此类病毒体具有用于此类应用的许多期望特征，包括：与作为双链DNA非包膜病毒有关的结构特征以及生物学特征，例如对人呼吸系统和胃肠道的向性。此外，已知腺病毒通过受体介导的内吞作用在体内和体外感染多种细胞类型。关于腺病毒载体的整体安全性的证明，腺病毒感染导致人类出现轻微的疾病状态，包括轻度流感样症状。

由于腺病毒基因组尺寸很大(约36千碱基)，因此非常适合用作基因疗法媒介物，因为它们可以在去除复制所必需的腺病毒基因和非必需区域后容纳外源DNA的插入。这样的取代使得病毒载体在复制功能和感染性方面受损。值得注意的是，腺病毒已被用作用于基因疗法和表达异源基因的载体。

期望引入一种载体，其可以提供例如所需基因的多个拷贝，并因此提供更大量的该基因的产物。改进的腺病毒载体和制备这些载体的方法已在许多参考文献、专利和专利申请中进行了详细描述，包括：Wright(Hum Gen Ther.(2009)20:698-706)；Mitani和Kubo(Curr Gene Ther.(2002)2(2):135-44)；Olmsted-Davis等人(Hum Gene Ther.(2002)13(11):1337-47)；Reynolds等人(Nat Biotechnol.(2001)19(9):838-42)；美国专利号5,998,205(其中提供了包含多个DNA拷贝的肿瘤特异性复制载体)；6,228,646(其中描述了无辅助的、完全有缺陷的腺病毒载体)；6,093,699(其中提供了用于基因疗法的载体和方法)；6,100,242(其中插入转基因的复制缺陷型腺病毒载体有效用于外周血管疾病和心脏病的体内基因疗法)；以及国际专利申请号WO 94/17810和WO 94/23744。

对于某些应用，表达构建体可进一步包含用于驱动特定细胞或组织类型中的表达的调节元件。这样的调节元件是本领域技术人员已知的，并且在Sambrook等人(1989)和Ausubel等人(1992)中进行了深入讨论。在本发明的表达构建体中掺入组织特异性调节元件提供了至少部分的组织向性以用于所述变体或其功能片段的表达。例如，在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的包含编码变体的核酸序列的E1缺失的5型腺病毒载体可用于本发明的方法中。也可以使用造血或肝脏特异性启动子。

在人类胚胎肾细胞系293中已经产生了用于重组基因表达的AAV(Wright,HumGene Ther(2009)20:698-706；Graham等人(1977)J.Gen.Virol.36:59-72)。简而言之，AAV载体通常是从野生型AAV(一种非致病性的单链DNA病毒)改造而成的。所述亲本病毒是非致病性的，所述载体具有广泛的宿主范围，并且可以感染分裂细胞和非分裂细胞两者。通常通过缺失rep和cap基因并在特定启动子的控制下用目的转基因替换它们来从病毒改造载体。对于重组AAV制剂，可以在两个ITR之间插入的序列的大小上限约为4.7kb。在CMV启动子/增强子的控制下表达FVIII变体的质粒和提供腺病毒辅助功能的第二质粒以及含有AAV-2rep和cap基因的第三质粒可用于制备AAV-2载体，而含有AAV-1、AAV-6或AAV-8 cap基因、AAV-2 rep基因和ITR的质粒可用于制备各自的替代血清型载体(例如Gao等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:11854-11859；Xiao等人,(1999)J.Virol.73:3994-4003；Arruda等人,(2004)Blood 103:85-92)。可以通过重复的CsCl密度梯度离心来纯化AAV载体，并且通过定量的斑点杂交来确定纯化的载体的滴度。在一个具体的实施方案中，载体可以由费城儿童医院的Vector Core制备。

本发明还包括调节凝血的方法，所述方法包括向个体的细胞提供编码FVIII变体的核酸递送媒介物并允许细胞在表达FVIII变体的条件下生长。

从前面的讨论可以看出FVIII变体和表达FVIII变体的核酸载体可用于与异常凝血相关的病症的治疗。

可将本发明的表达载体掺入可递送至受试者的药物组合物中，从而允许产生生物活性蛋白(例如FVIII变体)或通过基于基因和/或细胞的疗法在体内诱导FVIII变体的表达或通过对患者或供体细胞的离体修饰/转导来进行表达。在本发明的一个具体实施方案中，包含足够的遗传物质以使受体产生治疗有效量的FVIII变体的药物组合物可以影响受试者的凝血。或者，如上所述，可以将有效量的FVIII变体直接注入到有需要的患者体内。所述组合物可以单独施用或与至少一种其他剂(如稳定化合物)联合施用，所述其他剂可以在任意无菌的、生物相容的药物载体中施用，包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。所述组合物可以单独对患者施用，或与影响凝血的其他剂(例如辅因子)组合施用。

在具体实施方案中，所述药物组合物还含有药学上可接受的赋形剂/载体。这些赋形剂包括任意药剂，所述药剂本身不诱导对接受所述组合物的个体有害的免疫应答，并且可以被施用而无不适当的毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，例如水、盐水、甘油、糖和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，在这种载体中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,第18版,Easton,Pa.[1990])中提供了对药学上可接受的赋形剂的详尽讨论

适用于肠胃外施用的药物制剂可以在水溶液中配制，优选地，在生理上相容的缓冲液中，例如Hank溶液、Ringer溶液或生理缓冲盐水。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)、或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)、或脂质体。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以制备高浓度溶液。

所述药物组合物可以以盐的形式提供，并且所述盐可以是与许多酸形成的，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。与相应的游离碱形式相比，盐倾向于更易溶于水或其他质子溶剂中。在其他情况下，所述制剂可以是冻干粉末，其可以含有以下任意或所有：1-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，pH范围为4.5-5.5，在使用前与缓冲液结合使用。

药物组合物制备后，可将它们置于合适的容器中并标记用于治疗。对于FVIII变体或编码FVIII变体的载体的施用，这种标记应包括施用量、施用频率和施用方法。

适用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以达到预期治疗目的的组合物。使用本发明提供的技术和指导，确定治疗有效剂量完全在熟练医师的能力范围内。治疗剂量将取决于受试者的年龄和总体状况、异常凝血表型的严重程度、以及调节变体多肽表达水平的控制序列的强度，等等。因此，人类中的治疗有效量将落入相对宽的范围，所述范围可由医师基于个体患者对基于载体的变体治疗的响应来确定。

单独或与其他药剂组合的FVIII变体可以如上所述在合适的生物学载体中直接注入到患者体内。包含编码变体或其功能片段的核酸序列的本发明的表达载体可以通过多种方式(见下文)施用于患者，以实现和维持变体多肽的预防和/或治疗上的有效水平。本领域技术人员可以容易地确定使用本发明的编码变体的表达载体用于特定患者的治疗性处理的特定方案。用于产生腺病毒载体以及向患者施用的方案描述于：美国专利号5,998,205；6,228,646；6,093,699；6,100,242；以及国际专利申请号WO 94/17810和WO 94/23744，以上文献通过引用的方式整体并入本文。

本发明的编码FVIII变体的腺病毒载体可以通过任意已知方法施用于患者。所述药物组合物在体内的直接递送通常可以通过使用常规注射器注射来完成，但是可以设想其他递送方法，例如对流增强递送(参见，例如，美国专利号5,720,720)。在这方面，所述组合物可经皮下、表皮、皮内、鞘内、眶内、粘膜内、腹腔内、静脉内、动脉内、口腔内、肝内或肌肉内递送。其他施用方式包括口服和肺部施用、栓剂和经皮应用。专门治疗凝血障碍患者的临床医生可以基于许多标准确定包含变体核酸序列的腺病毒载体的施用的最佳途径，所述标准包括但不限于：患者的状况和治疗的目的(例如，增强或减少凝血)。

本发明还包括包含编码FVIII变体的核酸序列的AAV载体。还提供了包含编码FVIII变体的核酸序列的慢病毒或假型慢病毒载体。还包括包含编码FVIII变体的核酸序列的裸质粒或表达载体。

提供以下实施例以说明本发明的各种实施方案。所述实施例是说明性的且无意于以任何方式限制本发明。

实施例1

将在肝脏特异性启动子控制下表达各种人类FVIII B结构域变体和FVIII-SQ的非病毒载体(裸DNA，5μg/小鼠)在流体动力学条件下通过尾静脉途径注射(5只小鼠/变体)。所测试的变体B结构域是：B1:SFSQNSRHPS(SEQ ID NO:13)；B2:SFSQNSRHPSTRQKQ(SEQ ID NO:14)；B3:SFSQNSRHPSTRQKQFNATT(SEQ ID NO:15)；B4:SFSQN(SEQ ID NO:16)；B5:SFSQNSRH(SEQ ID NO:17)；and B6:SFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTD(SEQ ID NO:18)。24小时后，采集血液并使用Affinity Biologicals Matched Pair Antibody Set Product#F8C-EIA通过ELISA测量FVIII抗原水平。如图2所示，本发明的所有人类FVIII B结构域变体在血友病A小鼠中均表达出较FVIII-SQ更高的水平。

实施例2

野生型FVIII(659K)及其氨基酸取代变体在BHK细胞中瞬时表达。通过在条件表达培养基中进行的一阶段aPTT试验来确定表达的FVIII的比活度。如图3所示，与野生型FVIII相比，大多数FVIII变体显示出增加的比活度。

实施例3

除了在位置659处具有氨基酸取代的FVIII变体之外，还通过在BHK细胞中瞬时表达来测试在560、561、712和713具有取代的FVIII变体。通过在条件表达培养基中进行的一阶段aPTT试验来确定表达的FVIII的比活度。如图5所示，相对于野生型FVIII，在每个位置具有氨基酸取代的变体表现出增强的比活度。这些取代的组合以及实施例2中提供的那些，可以产生具有更高比活度的FVIII变体。

尽管上面已经描述并具体举例说明了本发明的某些优选实施方案，但是这并不意味着本发明限于这些实施方案。如所附权利要求书所述，在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以对其进行多种修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 瓦尔德·R·阿鲁达

本·萨梅尔森-琼斯

<120> 用于调节因子VIII功能的组合物和方法

<130> 3460-P06618WO00

<150> 62/749,182

<151> 2018-10-23

<160> 18

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 2332

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

1 5 10 15

Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val

65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe

355 360 365

Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu

385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr

420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile

435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile

450 455 460

Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile

465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys

500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys

515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

530 535 540

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

545 550 555 560

Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln

580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe

595 600 605

Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser

610 615 620

Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu

625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro

660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp

675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg

740 745 750

Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys

755 760 765

Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn

770 775 780

Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro

785 790 795 800

His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe

805 810 815

Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser

820 825 830

Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val

835 840 845

Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly

850 855 860

Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser

865 870 875 880

Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala

885 890 895

Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His

900 905 910

Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro

915 920 925

Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp

930 935 940

Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp

945 950 955 960

Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys

965 970 975

Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys

980 985 990

Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala

995 1000 1005

Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu Asn

1010 1015 1020

Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys

1025 1030 1035 1040

Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala

1045 1050 1055

Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys

1060 1065 1070

Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp

1075 1080 1085

Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu

1090 1095 1100

Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser

1105 1110 1115 1120

Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys

1125 1130 1135

Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val

1140 1145 1150

Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe

1155 1160 1165

Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu

1170 1175 1180

Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys

1185 1190 1195 1200

Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr

1205 1210 1215

Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr

1220 1225 1230

Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu

1235 1240 1245

Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys His

1250 1255 1260

Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu

1265 1270 1275 1280

Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg

1285 1290 1295

Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys

1300 1305 1310

Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu

1315 1320 1325

Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met

1330 1335 1340

Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys

1345 1350 1355 1360

Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg

1365 1370 1375

Ser His Ser Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys

1380 1385 1390

Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu

1395 1400 1405

Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys

1410 1415 1420

Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys

1425 1430 1435 1440

Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln

1445 1450 1455

Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr

1460 1465 1470

Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr

1475 1480 1485

Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys Asp

1490 1495 1500

Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu Asp Leu

1505 1510 1515 1520

Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn

1525 1530 1535

Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu

1540 1545 1550

Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp

1555 1560 1565

Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu

1570 1575 1580

Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser

1585 1590 1595 1600

Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly

1605 1610 1615

Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr

1620 1625 1630

Glu Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg

1635 1640 1645

Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr

1650 1655 1660

Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr

1665 1670 1675 1680

Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg

1685 1690 1695

His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser

1700 1705 1710

Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro

1715 1720 1725

Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr

1730 1735 1740

Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly

1745 1750 1755 1760

Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg

1765 1770 1775

Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr

1780 1785 1790

Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys

1795 1800 1805

Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala

1810 1815 1820

Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp

1825 1830 1835 1840

Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu

1845 1850 1855

Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr

1860 1865 1870

Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser

1875 1880 1885

Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn

1890 1895 1900

Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala

1905 1910 1915 1920

Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln

1925 1930 1935

Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn

1940 1945 1950

Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys

1955 1960 1965

Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu

1970 1975 1980

Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys

1985 1990 1995 2000

Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val

2005 2010 2015

Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile

2020 2025 2030

Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro

2035 2040 2045

Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr

2050 2055 2060

Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile

2065 2070 2075 2080

Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu

2085 2090 2095

Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp

2100 2105 2110

Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly

2115 2120 2125

Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile

2130 2135 2140

Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser

2145 2150 2155 2160

Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met

2165 2170 2175

Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala

2180 2185 2190

Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala

2195 2200 2205

Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn

2210 2215 2220

Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val

2225 2230 2235 2240

Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr

2245 2250 2255

Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr

2260 2265 2270

Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp

2275 2280 2285

Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg

2290 2295 2300

Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg

2305 2310 2315 2320

Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

2325 2330

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 3

Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 4

Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu

1 5 10 15

Lys Arg His Gln Arg

20

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 5

Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro Ser Ala Ser Ala Pro Lys Pro

1 5 10 15

Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg

20

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 6

Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Gln Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly

1 5 10 15

<210> 7

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 7

Ser Phe Ser Gln Asn Ala Thr Asn Val Ser Asn Asn Ser Asn Thr Ser

1 5 10 15

Asn Asp Ser Asn Val Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg

20 25 30

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 8

Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys His His Gly Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 9

Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 10

Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Ser Lys His His Gln Arg

1 5 10

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 11

Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Ser Lys Arg His Gln Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 12

Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Ser Lys

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 13

Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 14

Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg Gln Lys Gln

1 5 10 15

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 15

Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe

1 5 10 15

Asn Ala Thr Thr

20

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 16

Ser Phe Ser Gln Asn

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 17

Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His

1 5

<210> 18

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 18

Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe

1 5 10 15

Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys Thr Asp

20 25 30

Claims (31)

1.一种因子VIII(FVIII)变体，其中将所述B结构域替换为与SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少90％同一性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的FVIII变体，其中将所述B结构域替换为包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的FVIII变体，其中将所述B结构域替换为包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3的任一项所述的FVIII变体，其中所述B结构域由SEQ ID NO：1的氨基酸741-1648组成。

5.根据权利要求1-4的任一项所述的FVIII变体，其还包含位置659处的Lys、位置560处的Asp、位置561处的Gln、位置712处的Asp和/或位置713处的Lys的取代突变。

6.一种因子VIII(FVIII)变体，其包含位置659处的Lys、位置560处的Asp、位置561处的Gln、位置712处的Asp和/或位置713处的Lys的取代突变。

7.根据权利要求6所述的FVIII变体，其中位置659处的Lys被另一个氨基酸取代。

8.根据权利要求7所述的FVIII变体，其中位置659处的Lys不被Pro、Gly、Met或Leu取代。

9.根据权利要求7所述的FVIII变体，其中位置659处的Lys被Trp、Arg、Ala、His、Tyr、Asp、Thr、Ser、Val、Phe、Gln或Cys取代。

10.根据权利要求7所述的FVIII变体，其中位置659处的Lys被Ser、Gln或Cys取代。

11.根据权利要求7所述的FVIII变体，其中位置659处的Lys被Gln或Cys取代。

12.根据权利要求7所述的FVIII变体，其中位置560处的Asp被Ala、Val、Ile、Leu、His、Arg或Lys取代。

13.根据权利要求12所述的FVIII变体，其中位置560处的Asp被Ile或His取代。

14.根据权利要求7所述的FVIII变体，其中位置561处的Gln被Asp或Glu取代。

15.根据权利要求14所述的FVIII变体，其中位置561处的Gln被Asp取代。

16.根据权利要求7所述的FVIII变体，其中位置712处的Asp被Ala、Val、Ile或Leu取代。

17.根据权利要求16所述的FVIII变体，其中位置712处的Asp被Leu取代。

18.根据权利要求7所述的FVIII变体，其中位置713处的Lys被Arg、Met、Tyr、Asp、Cys或Gly取代。

19.根据权利要求18所述的FVIII变体，其中位置713处的Lys被Gly取代。

20.根据权利要求1所述的FVIII变体，其中所述FVIII包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-740和1649-2332。

21.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求1-20的任一项所述的FVIII变体和至少一种药学上可接受的载体。

22.一种用于在有此需要的患者中治疗凝血相关病症的方法，所述方法包含施用药学上可接受的载体中的治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的FVIII变体。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述凝血相关病症是血友病A。

24.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-20的任一项所述的FVIII变体。

25.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述FVIII变体包含信号肽。

26.一种表达载体，其包含与调节序列可操作地连接的根据权利要求24或25所述的核酸分子。

27.根据权利要求26所述的载体，其选自由腺病毒载体、腺病毒相关载体、逆转录病毒载体、质粒和慢病毒载体组成的组。

28.一种宿主细胞，其包含权利要求27所述的载体。

29.根据权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人类细胞。

30.一种用于在有此需要的患者中治疗凝血相关病症的方法，所述方法包含施用在药学上可接受的载体中的治疗有效量的根据权利要求26所述的载体。

31.权利要求1-20的任一项所述的FVIII变体的活化形式。

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