JP2011513327A

JP2011513327A - 結合型第ｖｉｉｉ因子分子

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Publication number: JP2011513327A
Application number: JP2010548875A
Authority: JP
Inventors: ゲルトボルト，; ブリアン，ベルグ，スティドセンヴァンダル，; ラースティム，; ヘニング，ラルフステニッケ，; トーマス，ドックスティーンストルップ，; ショーンデフリーズ，
Original assignee: ノボ・ノルデイスク・エー／エス
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2009-02-26
Publication date: 2011-04-28
Anticipated expiration: 2029-02-26
Also published as: EP2257311B1; KR101582841B1; KR20110008011A; MX2010009154A; DK2257311T3; EP2626079A3; CN101965200B; EP2626080A2; WO2009108806A1; US9150848B2; JP5927237B2; US20130137638A1; PL2257311T3; US20140242057A1; ES2476690T3; IL207188A; RU2573587C2; EP2257311A1; JP2014040440A; RU2010137743A

Abstract

本発明は、変更された循環半減期を有する、Ｂドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子分子に関し、該分子は、親水性ポリマーと共有的に結合している。さらに本発明は、このような分子を得るための方法、並びにこのような分子の使用に関する。

Description

本発明は、結合型（コンジュゲート型）第ＶＩＩＩ凝固因子分子に関する。特に、本発明は、変更された循環半減期を有する結合型第ＶＩＩＩ因子分子に関する。

血友病Ａは、第ＶＩＩＩ凝固因子(ＦＶＩＩＩ)活性の欠乏又は機能障害に起因する遺伝性の出血性疾患である。臨床的徴候は、一次止血ではない（血餅の形成が通常生じる）が、二次的トロンビン形成を欠くために血餅は不安定である。該疾患は、血液から単離されるか又は組換え的に生産される第ＦＶＩＩＩ凝固因子の静脈注射により治療される。

現在の治療上の推奨は、伝統的な応需型治療から予防に移行している。内在性ＦＶＩＩＩの循環半減期は１２−１４時間であり、よって患者が実質的な無症状生活を得るために、予防的処置は週に数回実施される。ＩＶ投与は、多くの、特に子供と若い人々用であり、顕著な不便さ及び／又は痛みを伴う。しかして、好ましくは構造的に均質で、好ましくは安全で、週当たりの第ＶＩＩＩ因子投与回数を低減するために好ましくは有意に長い循環半減期を有する新規第ＶＩＩＩ因子生成物が当該分野で必要とされている。さらに、このような分子を得、製造するための相対的に簡単な方法も当該分野で必要とされている。

循環半減期を長くするために第ＶＩＩＩ因子をペグ化することは当該分野で知られている。しかしながら、均質な構造と、有意に改善された循環半減期を有する安全な生成物を得るには障害がある。結合型第ＶＩＩＩ因子分子を製造する利用可能な方法は、しばしば面倒であり、及び／又は低収率で、及び／又は構造に均質さがない生成物を生じる傾向がある。治療用タンパク質の延長された循環半減期を有する治療用タンパク質を得るために、人工的に操作されたＯ−結合グリコシル化部位を使用することが、国際公開第２００８０１１６３３号において示唆されているが、そこには結合型第ＶＩＩＩ因子分子は開示されていない。

第１の態様では、本発明は、変更された循環半減期を有するＢドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子分子に関し、該分子は、切断されたＢドメイン中のＯ-結合オリゴ糖を介して親水性ポリマーと共有的に結合しており、ここで、第ＶＩＩＩ因子の活性化により、共有的に結合した側鎖基が除去される。

他の態様では、本発明は、このような分子を得るための方法、このような分子の使用、及びこのような分子を含有する薬学的組成物に関する。

このように提供されるものは、変更された循環半減期を有する、結合型第ＶＩＩＩ因子分子であり、コンジュゲートした側鎖基(例えば、親水性ポリマー)は、活性化の際に除去される。本発明の分子は、好ましくは構造が均一であり−少なくとも切断されたＢドメイン中における親水性ポリマーの位置に関して−好ましくは有利な安全性プロファイルを有する。同様に、このような分子を得るための相対的に簡単な方法がさらにここに提供される。好ましくは、本発明の活性化第ＶＩＩＩ因子分子は、内在性の活性化第ＶＩＩＩ因子に類似している。

定義：
第ＶＩＩＩ因子分子：ＦＶＩＩＩ／第ＶＩＩＩ因子は、主として肝細胞で産生される大きい複雑な糖タンパク質である。ＦＶＩＩＩは、シグナルペプチドを含む２３５１のアミノ酸からなり、相同性により定められる、いくつかの特徴的なドメインを含む。３つのＡドメイン、唯一のＢドメイン、及び２つのＣドメインが存在する。該ドメインの順序は、ＮＨ２-Ａ１-Ａ２-Ｂ-Ａ３-Ｃ１-Ｃ２-ＣＯＯＨのように列挙することができる。ＦＶＩＩＩは、Ｂ-Ａ３ボーダーで分離される２つの鎖として血漿中を循環する。該鎖は二価の金属イオン結合により結合している。Ａ１-Ａ２-Ｂ鎖は重鎖(ＨＣ)と称される一方、Ａ３-Ｃ１-Ｃ２は軽鎖(ＬＣ)と称される。

内在性の第ＶＩＩＩ因子分子は、様々なサイズのＢドメインを有する分子のプールとしてインビボで循環する。インビボでおそらく生じているものは、Ｂドメインの漸次的酵素的除去であり、様々なサイズのＢドメインを有する分子のプールが生じる。Ｂドメインの少なくとも一部が除去される７４０位での切断がトロンビン活性化に関連して生じると一般に考えられている。しかし、例えば７４０位の切断部位が損なわれた第ＶＩＩＩ因子変異体が活性でありうる可能性を排除することはできない。

ここで使用される「第ＶＩＩＩ因子」又は「ＦＶＩＩＩ」は、内因性の凝固経路のメンバーで、血液凝固に必須であるヒト血漿糖タンパク質を意味する。「天然ＦＶＩＩＩ」は、配列番号１(アミノ酸１−２３３２）に示されるような完全長ヒトＦＶＩＩＩ分子である。Ｂドメインは、配列番号１中のアミノ酸７４１−１６４８にわたる。

配列番号１：
ＡＴＲＲＹＹＬＧＡＶＥＬＳＷＤＹＭＱＳＤＬＧＥＬＰＶＤＡＲＦＰＰＲＶＰＫＳＦＰＦＮＴＳＶＶＹＫＫＴＬＦＶＥＦＴＤＨＬＦＮＩＡＫＰＲＰＰＷＭＧＬＬＧＰＴＩＱＡＥＶＹＤＴＶＶＩＴＬＫＮＭＡＳＨＰＶＳＬＨＡＶＧＶＳＹＷＫＡＳＥＧＡＥＹＤＤＱＴＳＱＲＥＫＥＤＤＫＶＦＰＧＧＳＨＴＹＶＷＱＶＬＫＥＮＧＰＭＡＳＤＰＬＣＬＴＹＳＹＬＳＨＶＤＬＶＫＤＬＮＳＧＬＩＧＡＬＬＶＣＲＥＧＳＬＡＫＥＫＴＱＴＬＨＫＦＩＬＬＦＡＶＦＤＥＧＫＳＷＨＳＥＴＫＮＳＬＭＱＤＲＤＡＡＳＡＲＡＷＰＫＭＨＴＶＮＧＹＶＮＲＳＬＰＧＬＩＧＣＨＲＫＳＶＹＷＨＶＩＧＭＧＴＴＰＥＶＨＳＩＦＬＥＧＨＴＦＬＶＲＮＨＲＱＡＳＬＥＩＳＰＩＴＦＬＴＡＱＴＬＬＭＤＬＧＱＦＬＬＦＣＨＩＳＳＨＱＨＤＧＭＥＡＹＶＫＶＤＳＣＰＥＥＰＱＬＲＭＫＮＮＥＥＡＥＤＹＤＤＤＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶＡＫＫＨＰＫＴＷＶＨＹＩＡＡＥＥＥＤＷＤＹＡＰＬＶＬＡＰＤＤＲＳＹＫＳＱＹＬＮＮＧＰＱＲＩＧＲＫＹＫＫＶＲＦＭＡＹＴＤＥＴＦＫＴＲＥＡＩＱＨＥＳＧＩＬＧＰＬＬＹＧＥＶＧＤＴＬＬＩＩＦＫＮＱＡＳＲＰＹＮＩＹＰＨＧＩＴＤＶＲＰＬＹＳＲＲＬＰＫＧＶＫＨＬＫＤＦＰＩＬＰＧＥＩＦＫＹＫＷＴＶＴＶＥＤＧＰＴＫＳＤＰＲＣＬＴＲＹＹＳＳＦＶＮＭＥＲＤＬＡＳＧＬＩＧＰＬＬＩＣＹＫＥＳＶＤＱＲＧＮＱＩＭＳＤＫＲＮＶＩＬＦＳＶＦＤＥＮＲＳＷＹＬＴＥＮＩＱＲＦＬＰＮＰＡＧＶＱＬＥＤＰＥＦＱＡＳＮＩＭＨＳＩＮＧＹＶＦＤＳＬＱＬＳＶＣＬＨＥＶＡＹＷＹＩＬＳＩＧＡＱＴＤＦＬＳＶＦＦＳＧＹＴＦＫＨＫＭＶＹＥＤＴＬＴＬＦＰＦＳＧＥＴＶＦＭＳＭＥＮＰＧＬＷＩＬＧＣＨＮＳＤＦＲＮＲＧＭＴＡＬＬＫＶＳＳＣＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳＱＮＳＲＨＰＳＴＲＱＫＱＦＮＡＴＴＩＰＥＮＤＩＥＫＴＤＰＷＦＡＨＲＴＰＭＰＫＩＱＮＶＳＳＳＤＬＬＭＬＬＲＱＳＰＴＰＨＧＬＳＬＳＤＬＱＥＡＫＹＥＴＦＳＤＤＰＳＰＧＡＩＤＳＮＮＳＬＳＥＭＴＨＦＲＰＱＬＨＨＳＧＤＭＶＦＴＰＥＳＧＬＱＬＲＬＮＥＫＬＧＴＴＡＡＴＥＬＫＫＬＤＦＫＶＳＳＴＳＮＮＬＩＳＴＩＰＳＤＮＬＡＡＧＴＤＮＴＳＳＬＧＰＰＳＭＰＶＨＹＤＳＱＬＤＴＴＬＦＧＫＫＳＳＰＬＴＥＳＧＧＰＬＳＬＳＥＥＮＮＤＳＫＬＬＥＳＧＬＭＮＳＱＥＳＳＷＧＫＮＶＳＳＴＥＳＧＲＬＦＫＧＫＲＡＨＧＰＡＬＬＴＫＤＮＡＬＦＫＶＳＩＳＬＬＫＴＮＫＴＳＮＮＳＡＴＮＲＫＴＨＩＤＧＰＳＬＬＩＥＮＳＰＳＶＷＱＮＩＬＥＳＤＴＥＦＫＫＶＴＰＬＩＨＤＲＭＬＭＤＫＮＡＴＡＬＲＬＮＨＭＳＮＫＴＴＳＳＫＮＭＥＭＶＱＱＫＫＥＧＰＩＰＰＤＡＱＮＰＤＭＳＦＦＫＭＬＦＬＰＥＳＡＲＷＩＱＲＴＨＧＫＮＳＬＮＳＧＱＧＰＳＰＫＱＬＶＳＬＧＰＥＫＳＶＥＧＱＮＦＬＳＥＫＮＫＶＶＶＧＫＧＥＦＴＫＤＶＧＬＫＥＭＶＦＰＳＳＲＮＬＦＬＴＮＬＤＮＬＨＥＮＮＴＨＮＱＥＫＫＩＱＥＥＩＥＫＫＥＴＬＩＱＥＮＶＶＬＰＱＩＨＴＶＴＧＴＫＮＦＭＫＮＬＦＬＬＳＴＲＱＮＶＥＧＳＹＤＧＡＹＡＰＶＬＱＤＦＲＳＬＮＤＳＴＮＲＴＫＫＨＴＡＨＦＳＫＫＧＥＥＥＮＬＥＧＬＧＮＱＴＫＱＩＶＥＫＹＡＣＴＴＲＩＳＰＮＴＳＱＱＮＦＶＴＱＲＳＫＲＡＬＫＱＦＲＬＰＬＥＥＴＥＬＥＫＲＩＩＶＤＤＴＳＴＱＷＳＫＮＭＫＨＬＴＰＳＴＬＴＱＩＤＹＮＥＫＥＫＧＡＩＴＱＳＰＬＳＤＣＬＴＲＳＨＳＩＰＱＡＮＲＳＰＬＰＩＡＫＶＳＳＦＰＳＩＲＰＩＹＬＴＲＶＬＦＱＤＮＳＳＨＬＰＡＡＳＹＲＫＫＤＳＧＶＱＥＳＳＨＦＬＱＧＡＫＫＮＮＬＳＬＡＩＬＴＬＥＭＴＧＤＱＲＥＶＧＳＬＧＴＳＡＴＮＳＶＴＹＫＫＶＥＮＴＶＬＰＫＰＤＬＰＫＴＳＧＫＶＥＬＬＰＫＶＨＩＹＱＫＤＬＦＰＴＥＴＳＮＧＳＰＧＨＬＤＬＶＥＧＳＬＬＱＧＴＥＧＡＩＫＷＮＥＡＮＲＰＧＫＶＰＦＬＲＶＡＴＥＳＳＡＫＴＰＳＫＬＬＤＰＬＡＷＤＮＨＹＧＴＱＩＰＫＥＥＷＫＳＱＥＫＳＰＥＫＴＡＦＫＫＫＤＴＩＬＳＬＮＡＣＥＳＮＨＡＩＡＡＩＮＥＧＱＮＫＰＥＩＥＶＴＷＡＫＱＧＲＴＥＲＬＣＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲＥＩＴＲＴＴＬＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲＳＦＱＫＫＴＲＨＹＦＩＡＡＶＥＲＬＷＤＹＧＭＳＳＳＰＨＶＬＲＮＲＡＱＳＧＳＶＰＱＦＫＫＶＶＦＱＥＦＴＤＧＳＦＴＱＰＬＹＲＧＥＬＮＥＨＬＧＬＬＧＰＹＩＲＡＥＶＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦＹＳＳＬＩＳＹＥＥＤＱＲＱＧＡＥＰＲＫＮＦＶＫＰＮＥＴＫＴＹＦＷＫＶＱＨＨＭＡＰＴＫＤＥＦＤＣＫＡＷＡＹＦＳＤＶＤＬＥＫＤＶＨＳＧＬＩＧＰＬＬＶＣＨＴＮＴＬＮＰＡＨＧＲＱＶＴＶＱＥＦＡＬＦＦＴＩＦＤＥＴＫＳＷＹＦＴＥＮＭＥＲＮＣＲＡＰＣＮＩＱＭＥＤＰＴＦＫＥＮＹＲＦＨＡＩＮＧＹＩＭＤＴＬＰＧＬＶＭＡＱＤＱＲＩＲＷＹＬＬＳＭＧＳＮＥＮＩＨＳＩＨＦＳＧＨＶＦＴＶＲＫＫＥＥＹＫＭＡＬＹＮＬＹＰＧＶＦＥＴＶＥＭＬＰＳＫＡＧＩＷＲＶＥＣＬＩＧＥＨＬＨＡＧＭＳＴＬＦＬＶＹＳＮＫＣＱＴＰＬＧＭＡＳＧＨＩＲＤＦＱＩＴＡＳＧＱＹＧＱＷＡＰＫＬＡＲＬＨＹＳＧＳＩＮＡＷＳＴＫＥＰＦＳＷＩＫＶＤＬＬＡＰＭＩＩＨＧＩＫＴＱＧＡＲＱＫＦＳＳＬＹＩＳＱＦＩＩＭＹＳＬＤＧＫＫＷＱＴＹＲＧＮＳＴＧＴＬＭＶＦＦＧＮＶＤＳＳＧＩＫＨＮＩＦＮＰＰＩＩＡＲＹＩＲＬＨＰＴＨＹＳＩＲＳＴＬＲＭＥＬＭＧＣＤＬＮＳＣＳＭＰＬＧＭＥＳＫＡＩＳＤＡＱＩＴＡＳＳＹＦＴＮＭＦＡＴＷＳＰＳＫＡＲＬＨＬＱＧＲＳＮＡＷＲＰＱＶＮＮＰＫＥＷＬＱＶＤＦＱＫＴＭＫＶＴＧＶＴＴＱＧＶＫＳＬＬＴＳＭＹＶＫＥＦＬＩＳＳＳＱＤＧＨＱＷＴＬＦＦＱＮＧＫＶＫＶＦＱＧＮＱＤＳＦＴＰＶＶＮＳＬＤＰＰＬＬＴＲＹＬＲＩＨＰＱＳＷＶＨＱＩＡＬＲＭＥＶＬＧＣＥＡＱＤＬＹ

本発明の第ＶＩＩＩ因子分子は、Ｂドメイン切断型第ＦＶＩＩＩ因子分子であり、残存するドメインは、配列番号１のアミノ酸番号１−７４０及び１６４９−２３３２に記載の配列に対応する。したがって、本発明の分子は、形質転換した宿主細胞、好ましくは哺乳動物由来のものにおいて産生される組換え分子であると言うことになる。しかしながら、残存するドメイン(すなわち、３つのＡドメインと２つのＣドメイン)は、配列番号１(アミノ酸１−７４０及び１６４９−２３３２)に記載のアミノ酸配列と、わずかに、例えば約１％、２％、３％、４％又は５％異なっている場合がある。特に、アミノ酸修飾(置換、欠失等)は、例えば種々の他の成分、特にｖＷ因子、ＬＰＲ、種々のレセプター、他の凝固因子、細胞表面等との第ＶＩＩＩ因子の結合能を改変するために、残存するドメインに導入されることもありうる。さらに、本発明の第ＶＩＩＩ因子分子は、例えば切断Ｂドメイン及び／又は分子の他のドメインの一又は複数に他の翻訳後修飾を含む。これらの他の翻訳後修飾は、例えばポリマー化合物、ペプチド化合物、脂肪酸誘導化合物等、本発明の第ＶＩＩＩ因子分子に結合した種々の分子の形態であってもよい。

本発明の第ＶＩＩＩ因子分子は、それらがＢドメインの外側で修飾されているか否か、他の翻訳後修飾を有しているか否かにかかわらず、全て、ＦＶＩＩＩに機能的に類似又は等価な方式で、凝固カスケードにおいて機能し、活性化血小板にＦＩＸａとの相互作用を介したＦＸａの形成を誘導し、血餅の形成をサポートする能力を意味する、第ＶＩＩＩ因子活性を有する。活性は、当該分野でよく知られている技術、例えば血餅分析、内在性トロンビン電位解析等により、インビトロで評価することができる。本発明の第ＶＩＩＩ因子分子は、天然ヒトＦＶＩＩＩの少なくとも約１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、及び１００％、又は１００％以上のＦＶＩＩＩ活性を有する。

Ｂドメイン: 第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは、配列番号１のアミノ酸７４１−１６４８に及ぶ。Ｂドメインはいくつかの異なる部位で切断され、循環血漿ＦＶＩＩＩ分子に大きな不均一性を生じる。大きくグリコシル化されたＢドメインの正確な機能は未知である。知られているものは、該ドメインが凝固カスケードにおけるＦＶＩＩＩ活性に対して重要ではないことである。このありうる機能の欠如は、Ｂドメイン欠失／切断型ＦＶＩＩＩが、完全長天然ＦＶＩＩＩに対して見られるものと同一のインビボ特性を有していると思われれることによって裏付けられる。それはそれとして、Ｂドメインは、少なくとも無血清条件下で、細胞膜との結合性を低下させうるという指摘がある。

Ｂドメインが切断された／欠失した第ＶＩＩＩ因子分子：内在性の完全長ＦＶＩＩＩは、単鎖前駆体分子として合成される。分泌前、前駆体は重鎖と軽鎖に切断される。組換え型Ｂドメイン欠失型ＦＶＩＩＩは、２つの異なる方法により生産可能である。Ｂドメインを持たない重鎖と軽鎖が２つの異なるポリペプチド鎖として個々に合成されるか(２本鎖法)、又はＢドメイン欠失型ＦＶＩＩＩが、完全長ＦＶＩＩＩ前駆体と同じ方法で重鎖と軽鎖に切断される、単一の前駆体ポリペプチド鎖として合成される(単鎖法)。

Ｂドメイン欠失型ＦＶＩＩＩ前駆体ポリペプチドにおいて、重鎖部分と軽鎖部分は、通常はリンカーにより分離している。Ｂドメイン欠失型ＦＶＩＩＩに免疫原性エピトープが導入される危険性を最小にするため、リンカーの配列は、好ましくはＦＶＩＩＩのＢドメインから誘導される。リンカーは、Ｂドメイン欠失型ＦＶＩＩＩ前駆体ポリペプチドを軽鎖及び重鎖に分離するプロテアーゼに対する認識部位を含んでいなければならない。完全長ＦＶＩＩＩのＢドメインにおいて、アミノ酸１６４４−１６４８がこの認識部位を構成する。Ｂドメイン欠失型ＦＶＩＩＩの活性化の際のリンカーの除去に至るトロンビン部位は重鎖に位置する。よって、リンカーの大きさ及びアミノ酸配列は、トロンビン活性化による、残存ＦＶＩＩＩ分子からのその除去に影響を及ぼすとは思われない。Ｂドメインの欠失は、ＦＶＩＩＩの生産に有利である。それにもかかわらず、Ｂドメインの一部は、生産性を減じることなく、リンカーに含めることができる。生産性に対するＢドメインのネガティブな効果は、Ｂドメインの任意の特定の大きさ又は配列に起因してはいなかった。

切断されたＢドメインは、いくつかのＯ-グリコシル化部位を含んでいてもよい。しかしながら、好ましい実施態様では、分子は、切断されたＢドメイン中における唯一の、又は２、３又は４のＯ-結合オリゴ糖を含む。

好ましい実施態様では、切断されたＢドメインは、唯一の潜在的Ｏ-グリコシル化部位を含有し、親水性ポリマーはこのＯ-グリコシル化部位に共有的に結合される。

本発明のＢドメイン切断型分子中のＯ-結合オリゴ糖は、Ｂドメインの切断により「隠された」Ｏ-グリコシル化部位の暴露により、及び／又は組換え手段により人工的につくり出されたＯ-グリコシル化部位に結合させられうる。双方の場合、このような分子は、Ｂドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を設計し、続いて、切断されたＢドメイン中のＯ-グリコシル化部位の可能性を予測するコンピュータ解析を該アミノ酸配列に施すことによって、作製され得る。このようなグリコシル化部位を有する比較的高い可能性のある分子は、適切な宿主細胞中で合成可能であり、続いてグリコシル化パターンが分析され、切断されたＢドメイン中のＯ-結合グリコシル化を有する分子が選択される。組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を生産するために適した宿主細胞は、分子がグリコシル化されることを確実にするために、好ましくは哺乳動物由来である。本発明の実施においては、細胞は哺乳動物細胞、好ましくは樹立された哺乳動物細胞株であり、限定されるものではないが、ＣＨＯ(例えば、ATCC CCL 61)、ＣＯＳ-１(例えば、ATCC CRL 1650)、ベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)、及びＨＥＫ２９３(例えば、ATCC CRL 1573; Grahamら, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)の細胞株が含まれる。好ましいＢＨＫ細胞株は、ｔｋ-ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株(Waechter及びBaserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110, 1982)であり、以下、ＢＨＫ５７０細胞と称する。ＢＨＫ５７０細胞は、ATCC受入番号CRL 10314として、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852から入手可能である。また、ｔｋ-ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株は、受託番号CRL 1632として、ATCCからも入手可能である。好ましいＣＨＯ細胞株は、受託番号CCl61として、ATCCから入手可能なＣＨＯＫ１細胞株、並びに細胞株ＣＨＯ-ＤＸＢ１１及びＣＨＯ-ＤＧ４４である。

他の適切な細胞株には、限定されるものではないが、ＲａｔＨｅｐＩ(ラット肝細胞腫；ATCC CRL 1600)、ＲａｔＨｅｐＩＩ(ラット肝細胞腫；ATCC CRL 1548)、ＴＣＭＫ(ATCC CCL 139)、ヒト肺(ATCC HB 8065)、ＮＣＴＣ１４６９(ATCC CCL 9.1)；ＤＵＫＸ細胞(ＣＨＯ細胞系)(Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)(ＤＵＫＸ細胞はＤＸＢ１１細胞とも称される)、及びＤＧ４４(ＣＨＯ細胞系)(Cell, 33: 405, 1983, 及びSomatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986)が含まれる。さらに、３Ｔ３細胞、ナマルバ(Namalwa)細胞、ミエローマ、及びミエローマと他の細胞との融合体も有用である。いくつかの実施態様では、細胞は、変異又は組換え細胞、例えばそれらが誘導される細胞腫よりも、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する定性的及び定量的に異なるスペクトルの酵素(例えば、グリコシル化酵素、特にグリコシルトランスフェラーゼ及び／又はグルコシダーゼ、又はプロセシング酵素、特にプロペプチド)を発現する細胞であってもよい。ＤＵＫＸ細胞(ＣＨＯ細胞株)が特に好ましい。

現在好ましい細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)及びミエローマ細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である。

しかして、本発明の発明者は、Ｂドメインを切断することにより、第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン中の「隠された」Ｏ-グリコシル化部位を活性化させることができることを示した。如何なる理論にも縛られることを望むものではないが、この現象は、改変されている切断されたＢドメインにおける分子の三次構造に起因している可能性がある。よって、「隠された」Ｏ-グリコシル化部位が、切断されたＢドメインにおけるグリコシル化に「アクセス可能」にする。このアプローチの一つの利点は、例えばアレルゲン性等に対し、有利な安全性プロファイルを持つ組換え分子が提供されることである。他の利点は、組換えタンパク質において人工的なＯ-グリコシル化部位を操作することが困難であることが以前から分かっているので、Ｂドメイン中のグリコシル化部位の内在的な豊富さのため、Ｂドメイン中のＯ-結合オリゴ糖を有するＢドメイン切断型変異体を得るためのより簡単なアプローチを提供しうることである。

ｗｔＦＶＩＩＩ中のＢドメインの長さは約９０７アミノ酸である。本発明の分子における切断型Ｂドメインの長さは、約１０アミノ酸から約７００酸、例えば約１２−５００アミノ酸、１２−４００アミノ酸、１２−３００アミノ酸、１２−２００アミノ酸、１５−１００アミノ酸、１５−７５アミノ酸、１５−５０アミノ酸、１５−４５アミノ酸、２０−４５アミノ酸、２０−４０アミノ酸、又は２０−３０アミノ酸で変わり得る。切断されたＢドメインは、ｗｔＦＶＩＩＩに見出されない重鎖及び／又は軽鎖及び／又は人工的に導入された配列の断片を含んでいてもよい。「Ｂドメイン切断型」及び「Ｂドメイン欠失型」なる用語は、ここでは交換可能に使用されうる。

変更された循環半減期：本発明の分子は、野生型の第ＶＩＩＩ因子分子と比較して、変更された循環半減期、好ましくは増加した循環半減期を有する。循環半減期は、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも１２５％、より好ましくは少なくとも１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、より好ましくは少なくとも２００％、及び最も好ましくは少なくとも２５０％又は３００％増加する。より好ましくは、このような分子は、野生型ＦＶＩＩＩの循環半減期に対して、少なくとも４００％、５００％、６００％、又は７００％増加した循環半減期を有する。

親水性ポリマー：本発明の修飾基／親水性ポリマーは、好ましくは自然に生じたものではない。一例では、「自然に生じたものではない修飾基」は、少なくとも一のポリマー部分が自然に生じたものではないポリマー修飾基である。他の例では、自然に生じたものではない修飾基は修飾された炭水化物である。修飾基を用いた機能付与の座位は、「修飾された糖」がポリペプチドへ酵素的に付加されることが妨げられないように選択される。また、「修飾された糖」とは、修飾基で機能付与され、天然又は修飾された酵素、例えばグリコシルトランスフェラーゼの基質である任意のグリコシル模倣部分を意味する。

ポリペプチドに付加されるポリマー修飾基は、このようなポリペプチドのある性質、例えばその生物学的利用能、生物活性、又は体内中におけるその半減期を改変することができる。本発明の例示的なポリマーは、直鎖状又は分枝状であってよく、一又は複数の独立して選択されるポリマー部分、例えばポリ(アルキレングリコール)及びその誘導体を含みうる水溶性ポリマーを含む。本発明のポリマー修飾基には、水溶性ポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)及びその誘導体(ＰＥＧ、ｍ-ＰＥＧ)、ポリ(プロピレングリコール)及びその誘導体(ＰＰＧ、ｍ-ＰＰＧ)等が含まれる。

「水溶性」なる用語は、水中においてある検出可能な程度の溶解度を有する部分を意味する。水溶性度を検出及び／又は定量する方法は、当該分野でよく知られている。本発明の例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、糖類、ポリ(エーテル)、ポリ(アミン)、ポリ(カルボン酸)等が含まれる。ペプチドは混合配列を有することも可能で、単一のアミノ酸からなるもの、例えばポリ(リジン)であってもよい。例示的な多糖類はポリ(シアル酸)である。例示的なポリ(エーテル)はポリ(エチレングリコール)、例えばｍ-ＰＥＧである。ポリ(エチレンイミン)は例示的なポリアミンであり、ポリ(アクリル酸)は代表的なポリ(カルボン酸)である。

本発明の水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ(エチレングリコール)(すなわちＰＥＧ)でありうる。本発明に関連してＰＥＧなる用語には、任意の形態のポリ(エチレングリコール)、例えばアルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、多分岐ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ(すなわち、ＰＥＧ又はポリマー骨格にペンダントして一又は複数の官能基を有する関連ポリマー)、又はそこに分解性連鎖を有するＰＥＧが含まれる。

ポリマー骨格は直鎖状又は分枝状であってよい。分枝状のポリマー骨格は、当該分野で一般的に知られている。典型的には、分枝状ポリマーは、中央の分枝コア部分と、中央の分枝コアに結合する複数の直鎖状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、種々のポリオール、例えばグリセロール、ペンタエリトリトール及びソルビトールにエチレンオキシドを添加することにより調製することができる分枝状形態で一般に使用される。また、中央の分枝部分は、いくつかのアミノ酸、例えばリジン又はシステインから誘導可能である。一例では、分枝状ポリ(エチレングリコール)は、Ｒ(-ＰＥＧ-ＯＨ)ｍとして一般式で表すことができ、ここで、Ｒはコア部分、例えばグリセロール又はペンタエリトリトールを表し、ｍはアームの数を表す。多分岐ＰＥＧ分子、例えばその全体が出典明示によりここに援用される米国特許第５９３２４６２号に記載されているものを、ポリマー骨格として使用することもできる。

図８は、ここで「ＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ」と称される、本発明の実施態様で使用される代表的な分枝状ＰＥＧポリマーを示す。図８Ａは、ポリペプチドのアミノ酸又はグリカンに結合するＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ又はＣＭＰ-ＳＡ-グリセロール-ＰＥＧの、例示的なＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ成分を示す。図８Ｂは、Ｇａｌ残基を介してポリペプチド又はグリカンに結合するＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ部分を示す。図８Ｃは、Ｇａｌ-ＧａｌＮＡｃ残基を介してポリペプチド又はグリカンに結合するＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ部分を示す。図８Ｄは、Ｇａｌ-ＧａｌＮＡｃ部分を介してポリペプチドのアミノ酸に結合するＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ部分を示す。種々の実施態様では、ＡＡはスレオニン又はセリンである。例示的な実施態様では、ＡＡは、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＢドメインの欠失により、Ｏ-結合したグリコシル化部分に転換される。以下の段落［００３２］のポリマーの分子量に関する検討は、一般的に、図８に示される分枝状ＰＥＧに当てはまる。図８において、添え字「ｎ」は、段落［００３２］で論議される所望の分子量の直鎖状(及び分枝状)ｍ-ＰＥＧをもたらす任意の整数を表す。種々の実施態様では、「ｎ」は、直鎖状のｍ-ＰＥＧ部分が約２０ＫＤａ〜約４０ＫＤａ、例えば約２０ＫＤａ、約３０ＫＤａ又は約４０ＫＤａであるように選択される。これらのｍ-ＰＥＧの分子量に相当する整数は、約４００(例えば、約４５５)〜約９００(例えば、約９１０)に相当する。従って、「ｎ」は、約４０ＫＤａ〜約８０ＫＤａ、例えば約４０ＫＤａ、約５０ＫＤａ、約６０ＫＤａ、約７０ＫＤａ、又は約８０ＫＤａの分枝状ＰＥＧが提供されるように選択される。

多くの他のポリマーがまた本発明に適している。非ペプチド性で水溶性であるポリマー骨格は、特に本発明で有用である。適切なポリマーの例には、限定されるものではないが、他のポリ(アルキレングリコール)、例えばポリ(プロピレングリコール) (「ＰＰＧ」)、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー等、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィン性アルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ([アルファ]-ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(Ｎ-アクリロイルモルホリン)、例えばその全体が出典明示によりここに援用される米国特許第５６２９３８４号に記載されているもの、並びにコポリマー、ターポリマー、及びその混合物が含まれる。

ポリマー骨格の各鎖の分子量は変わりうるが、典型的には、約１００Ｄａ〜約１６００００Ｄａ、例えば約５０００Ｄａ〜約１０００００Ｄａの範囲である。特に、本発明の各結合した親水性ポリマーの大きさは、約５００Ｄａ〜約８００００Ｄａ、例えば約１０００Ｄａ〜約８００００Ｄａ；約２０００Ｄａ〜約７００００Ｄａ；約５０００〜約７００００Ｄａ；約５０００〜約６００００Ｄａ；約１００００〜約７００００Ｄａ；約２００００〜約６００００Ｄａ；約３００００〜約６００００Ｄａ；約３００００〜約５００００Ｄａ；又は約３００００〜約４００００Ｄａで変化しうる。これらの大きさは、正確な測定値というよりも推定値を表すと理解すべきである。好ましい実施態様では、本発明の分子は、親水性ポリマーの不均一集団、例えば１００００、４００００、又は８００００Ｄａ＋／−約５０００、約４０００、約３０００、約２０００、又は約１０００Ｄａの大きさのＰＥＧと結合される。

Ｏ-結合オリゴ糖：Ｎ-グリカンとＯ-グリカンの双方が、タンパク質を産生する細胞により、タンパク質に結合される。新生タンパク質がリボソームから小胞体に転位置すると、細胞Ｎ-グリコシル化機構がアミノ酸鎖におけるＮ-グリコシル化シグナル(Ｎ-Ｘ-Ｓ／Ｔモチーフ)を認識し、グリコシル化する(Kielyら 1976; Glabeら 1980)。

同様に、Ｏ-グリカン類は、アミノ酸鎖における特定のＯ-グリコシル化部位に結合されるが、Ｏ-グリコシル化を惹起するモチーフは、Ｎ-グリコシル化シグナルよりもさらに不均一であり、アミノ酸配列中のＯ-グリコシル化部位を予測する我々の能力は、未だ不十分である(Juleniusら 2004)。よって、人工的なＯ-グリコシル化部位の構築は、ある程度の不確実さを伴う。一般的な仮定は、天然ＦＶＩＩＩ分子がＯ-グリコシル化部位を何ら含んでいないことであり、よって、当業者は、少なくとも一の人工的なＯ-グリコシル化部位が構成され、本発明の実施に関連してＢドメイン中に挿入されなければならないであろうことを予想するであろう。

よって、切断された第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン中におけるＯ-結合オリゴ糖が、自然に生じたＯ-結合グリコシル化配列、又は組換え技術により人工的に構築されたＯ-結合グリコシル化配列に共有的に結合されうる。

本発明の好ましい実施態様では、Ｏ-結合オリゴ糖は、野生型第ＶＩＩＩ因子分子におけるグリコシル化に暴露されていないが、Ｂドメイン切断の結果としてＯ-グリコシル化にアクセス可能になる自然に生じるＯ-結合グリコシル化配列に結合している。その具体例を実施例及び配列番号２に示す(切断されたＢ-ドメインは、アミノ酸７４２−７６３に対応する)。また、たとえＢドメインが幾分異なる場所で切断されていても、すなわち配列番号２と比較して、切断されたＢドメインが幾分短いか(例えば、配列番号２よりも１、２、３、４、又は５アミノ酸短い)、又は長くても(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸)、配列番号２における「隠された」Ｏ-グリコシル化部位がグリコシル化されるであろうことは、もっともだと思われる。人工的なＯ-グリコシル化部位を生成させるよりもむしろ、Ｂドメインを切断することで「隠された」Ｏ-グリコシル化部位を活性化させることによるこのアプローチは、有利な安全性プロファイル(すなわち、アレルゲン性の低下)を有する分子が生成されるという利点を有する。同様に、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインにおける他のＯ-グリコシル化部位は、異なった方法で分子を切断することにより活性化されるようになりうる。

Ｏ-結合オリゴ糖のグリコ-ペグ化：Ｏ-グリカンの生合成は、生合成の比較的初期に、シアル酸残基を付加することにより、修飾し終結させることができる。ある種のシアリルトランスフェラーゼ酵素は、ＧａｌＮＡｃα-Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、又はコア１ＧａｌＴ作用後の初期のＯ-グリカンコアサブタイプに作用可能である。Ｔ抗原なる用語は、Ｇａｌβ１-３ＧａｌＮＡｃα-Ｓｅｒ／Ｔｈｒ二糖類の存在に関連している。このような構造体の生成は、同じ基質に対するグリコシルトランスフェラーゼ間の競合を含み、よってゴルジ体内のグリコシルトランスフェラーゼの発現レベル及び細胞内分布が、Ｏ-グリカンの生合成及び多様化における構造の結果を決定する。図１に例証するように、Ｇａｌβ１-３ＧａｌＮＡｃα-Ｓｅｒ／Ｔｈｒ二糖類のみが、グリコペグ化の影響を受けやすい。

しかしながら、この構造体の利用可能な量は、シアリダーゼ又はコア１ＧａｌＴ又はその組合せを用いたタンパク質の処理を介して大きく高められうる。グリコペグ化プロセスの結果として、シアル酸ＰＥＧを、標的タンパク質のＧａｌβ１-３ＧａｌＮＡｃα-Ｓｅｒ／Ｔｈｒ二糖類に結合するα３を介して天然構造体に付与する(図１)。

他の親水性ポリマーもまたＯ-結合オリゴ糖類に結合させうる。Ｏ-グリカンを介してＦＶＩＩＩに他の親水性ポリマーを酵素的にコンジュゲートさせるのに基本的な要件は、国際公開第０３０３１４６４号に開示されているような、遊離のアミノ基を介してグリシル-シアル酸誘導体にそれらをカップリングさせる能力である。これは、当業者に知られている非常に多様なカップリングケミストリーを介して達成されうる。活性化された生体適合性ポリマーの例には、ポリアルキレンオキシド類、例えば限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、２-(メタクリロイルオキシ)エチルホスホリルコリン(ｍＰＣ)ポリマー(国際公開第０３０６２２９０号に記載)、デキストラン類、コロミン酸、又は他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸又は特定のペプチド配列のポリマー、ビオチン誘導体、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン-コ-マレイン酸無水物、ポリスチレン-コ-リンゴ酸無水物、ポリオキサゾリン、ポリ-アクリロイルモルホリン、ヘパリン、アルブミン、セルロース、キトサンの加水分解物、デンプン、例えばヒドロキシエチル-デンプン及びヒドロキシプロピル-デンプン、グリコーゲン、アガロース及びその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、アルギニン酸の加水分解物、他のバイオポリマー、及びその任意の等価物が含まれる。

薬学的組成物：薬学的組成物は、ここでは、非経口投与に適した本発明の第ＶＩＩＩＩ因子分子を含有する組成物、例えば使用準備が整った水性の滅菌組成物、又は水又は水性バッファーで再構成可能な乾燥した滅菌組成物を含むことを意味する。本発明の組成物は、種々の製薬的に許容可能な賦形剤、安定剤等を含有しうる。

このような組成物における付加的な成分には、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、張力修正剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質)及び双性イオン(例えばアミノ酸、特にベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジン)を含んでよい。もちろん、このような付加的な成分は、本発明の製薬用製剤の全体的な安定性に悪影響が及ばないようにすべきである。非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射で実施されてよい。また非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。さらなる選択肢は、鼻用又は肺用のスプレーの形態で、ＦＶＩＩＩ化合物を投与するための溶液又は懸濁液であってよい組成物にある。さらなる選択肢としては、本発明のＦＶＩＩＩ化合物を含有する薬学的組成物を、例えば針のない注射、又はパッチ、場合によってはイオン導入パッチによる経皮投与用、又は頬等の経粘膜投与用に適合させてもよい。

よって、本発明の第１の態様は、改変された循環半減期を有するＢドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子分子に関し、該分子は、切断されたＢドメイン中のＯ-結合オリゴ糖を介して、親水性ポリマーと共有的に結合しており、ここで、第ＶＩＩＩ因子の活性化(分子の活性化)により、共有的に結合した親水性ポリマーの除去が生じる。

一実施態様では、親水性ポリマーはＰＥＧである。ＰＥＧポリマーの大きさは、約１００００〜約１６００００Ｄａ；例えば１００００〜８００００Ｄａ、例えば約１００００；１５０００、２００００；２５０００；３００００；３５０００；４００００；４５０００；５００００；５５０００；６００００；６５０００、７００００；７５０００；又は８００００Ｄａで変化し得る。好ましくは、Ｏ-結合オリゴ糖は、ｗｔＦＶＩＩＩ分子に見出されない人工的なＯ-グリコシル化部位を挿入するのではなく、Ｂドメインを切断することにより作製されるＯ-グリコシル化部位に結合される。

特に好ましい実施態様では、本発明の分子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。このような分子は、活性化ＦＶＩＩＩ分子が、天然の活性ＦＶＩＩＩ分子と同一であるという独特の特徴を有する。この特徴は、安全性評価において有利な特性であると思われる。

また本発明は、本発明の分子を含有する薬学的組成物に関する。

さらに本発明は、本発明の分子を得るための方法に関し、該方法は、Ｂドメイン切断型第ＶＩＩＩ分子と親水性ポリマー、例えばＰＥＧ基を、切断されたＢドメイン中のＯ-結合オリゴ糖を介してコンジュゲートさせることを含む。したがって、本発明は、このような方法により得られた又は得られうる分子にもまた関することになる。

他の態様では、本発明は、治療的有効量の本発明の分子を、それを必要とする患者に投与することを含む出血性疾患を治療する方法に関する。

ここで使用される「治療（処置）」なる用語は、それを必要とする任意のヒト又は他の動物被験者の医学療法を意味する。前記被験者は、前記特定の治療の使用が、前記ヒト又は他の動物被験者の健康に有益であることを示す仮の又は最終的な診断を与えた医師により身体検査を受けなければならないことが予期される。前記治療のタイミング及び目的は、被験者の健康状態の現状に応じて、個人によって異なる。よって、前記治療は、予防的、対症的、症候性及び／又は治癒的でありうる。

他の態様では、本発明は、本発明の分子の医薬としての使用、並びに血友病を治療するための医薬の製造のための本発明の分子の使用に関する。

最後の態様では、本発明は、本発明のＢドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子分子を操作する方法に関し、該方法は、（ｉ）Ｂドメインを切断し、場合によっては、この切断型第ＶＩＩＩ因子分子のアミノ酸配列に、潜在的なＯ−グリコシル化部位を同定する解析を施し、（ｉｉ）適切な宿主細胞において分子を産生させ、及び（ｉｉｉ）切断されたＢドメイン中のＯ−結合グリカンを有する分子を選択することを含む。

図中、結合基のサイズは、しばしば、ここではＫＤａ(キロダルトン)に等価であることを意味する「Ｋ」と称される。
Ｏ-結合オリゴ糖のグリコペグ化プロセスの概略図。該図は、実施例で得られる生成物に到達するのに可能な方法の包括的な列挙を表すものではない。ソース１５Ｑ(Ａ)での反応混合物のイオン交換クロマトグラフィー。収集された画分(Ｂ)の分子マーカー(左)を用いたＳＤＳ-ＰＡＧＥ。スーパーデックス(superdex)２００サイズ排除クロマトグラフィーでのキャップ生成物の精製。様々なａＰＴＴ試薬を使用するＯ-グリコペグ化ｒＦＶＩＩＩの凝固活性。(Ａ)は凝固活性と発色活性との間の比率を示す。(Ｂ)は凝固比活性を示す。４０Ｋ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８のＦＶＩＩＩＫＯマウスにおけるインビボ効果(閉塞までの時間)。本発明のグリコペグ化第ＶＩＩＩ因子の製造に関与するプロセス工程を示すフロー図。実施例で生産される本発明の第ＶＩＩＩ因子分子の概略図。

実施例１
組換え型Ｂドメイン切断型Ｏ-グリコシル化第ＶＩＩＩ因子の製造
Ｂドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子分子のアミノ酸配列の例を配列番号２に付与する。このポリペプチドはまた「Ｎ８」と称することができる。この分子は、２１のアミノ酸残基リンカー配列(ＳＦＳＱＮＳＲＨＰＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ−下線が付されたＳは、実施例２でペグ化されたＯ-グリカンを有するセリン残基である)を含む。

本発明の第ＶＩＩＩ因子分子は、実施例において、様々な形で言及される−しかし第ＶＩＩＩ因子分子に対する全ての参照が、本発明の第ＶＩＩＩ因子分子、又は本発明の第ＶＩＩＩ因子分子へ転換されるプロセスにおける第ＶＩＩＩ因子分子を意味する。

配列番号２：
ＡＴＲＲＹＹＬＧＡＶＥＬＳＷＤＹＭＱＳＤＬＧＥＬＰＶＤＡＲＦＰＰＲＶＰＫＳＦＰＦＮＴＳＶＶＹＫＫＴＬＦＶＥＦＴＤＨＬＦＮＩＡＫＰＲＰＰＷＭＧＬＬＧＰＴＩＱＡＥＶＹＤＴＶＶＩＴＬＫＮＭＡＳＨＰＶＳＬＨＡＶＧＶＳＹＷＫＡＳＥＧＡＥＹＤＤＱＴＳＱＲＥＫＥＤＤＫＶＦＰＧＧＳＨＴＹＶＷＱＶＬＫＥＮＧＰＭＡＳＤＰＬＣＬＴＹＳＹＬＳＨＶＤＬＶＫＤＬＮＳＧＬＩＧＡＬＬＶＣＲＥＧＳＬＡＫＥＫＴＱＴＬＨＫＦＩＬＬＦＡＶＦＤＥＧＫＳＷＨＳＥＴＫＮＳＬＭＱＤＲＤＡＡＳＡＲＡＷＰＫＭＨＴＶＮＧＹＶＮＲＳＬＰＧＬＩＧＣＨＲＫＳＶＹＷＨＶＩＧＭＧＴＴＰＥＶＨＳＩＦＬＥＧＨＴＦＬＶＲＮＨＲＱＡＳＬＥＩＳＰＩＴＦＬＴＡＱＴＬＬＭＤＬＧＱＦＬＬＦＣＨＩＳＳＨＱＨＤＧＭＥＡＹＶＫＶＤＳＣＰＥＥＰＱＬＲＭＫＮＮＥＥＡＥＤＹＤＤＤＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶＡＫＫＨＰＫＴＷＶＨＹＩＡＡＥＥＥＤＷＤＹＡＰＬＶＬＡＰＤＤＲＳＹＫＳＱＹＬＮＮＧＰＱＲＩＧＲＫＹＫＫＶＲＦＭＡＹＴＤＥＴＦＫＴＲＥＡＩＱＨＥＳＧＩＬＧＰＬＬＹＧＥＶＧＤＴＬＬＩＩＦＫＮＱＡＳＲＰＹＮＩＹＰＨＧＩＴＤＶＲＰＬＹＳＲＲＬＰＫＧＶＫＨＬＫＤＦＰＩＬＰＧＥＩＦＫＹＫＷＴＶＴＶＥＤＧＰＴＫＳＤＰＲＣＬＴＲＹＹＳＳＦＶＮＭＥＲＤＬＡＳＧＬＩＧＰＬＬＩＣＹＫＥＳＶＤＱＲＧＮＱＩＭＳＤＫＲＮＶＩＬＦＳＶＦＤＥＮＲＳＷＹＬＴＥＮＩＱＲＦＬＰＮＰＡＧＶＱＬＥＤＰＥＦＱＡＳＮＩＭＨＳＩＮＧＹＶＦＤＳＬＱＬＳＶＣＬＨＥＶＡＹＷＹＩＬＳＩＧＡＱＴＤＦＬＳＶＦＦＳＧＹＴＦＫＨＫＭＶＹＥＤＴＬＴＬＦＰＦＳＧＥＴＶＦＭＳＭＥＮＰＧＬＷＩＬＧＣＨＮＳＤＦＲＮＲＧＭＴＡＬＬＫＶＳＳＣＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳＱＮＳＲＨＰＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲＥＩＴＲＴＴＬＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲＳＦＱＫＫＴＲＨＹＦＩＡＡＶＥＲＬＷＤＹＧＭＳＳＳＰＨＶＬＲＮＲＡＱＳＧＳＶＰＱＦＫＫＶＶＦＱＥＦＴＤＧＳＦＴＱＰＬＹＲＧＥＬＮＥＨＬＧＬＬＧＰＹＩＲＡＥＶＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦＹＳＳＬＩＳＹＥＥＤＱＲＱＧＡＥＰＲＫＮＦＶＫＰＮＥＴＫＴＹＦＷＫＶＱＨＨＭＡＰＴＫＤＥＦＤＣＫＡＷＡＹＦＳＤＶＤＬＥＫＤＶＨＳＧＬＩＧＰＬＬＶＣＨＴＮＴＬＮＰＡＨＧＲＱＶＴＶＱＥＦＡＬＦＦＴＩＦＤＥＴＫＳＷＹＦＴＥＮＭＥＲＮＣＲＡＰＣＮＩＱＭＥＤＰＴＦＫＥＮＹＲＦＨＡＩＮＧＹＩＭＤＴＬＰＧＬＶＭＡＱＤＱＲＩＲＷＹＬＬＳＭＧＳＮＥＮＩＨＳＩＨＦＳＧＨＶＦＴＶＲＫＫＥＥＹＫＭＡＬＹＮＬＹＰＧＶＦＥＴＶＥＭＬＰＳＫＡＧＩＷＲＶＥＣＬＩＧＥＨＬＨＡＧＭＳＴＬＦＬＶＹＳＮＫＣＱＴＰＬＧＭＡＳＧＨＩＲＤＦＱＩＴＡＳＧＱＹＧＱＷＡＰＫＬＡＲＬＨＹＳＧＳＩＮＡＷＳＴＫＥＰＦＳＷＩＫＶＤＬＬＡＰＭＩＩＨＧＩＫＴＱＧＡＲＱＫＦＳＳＬＹＩＳＱＦＩＩＭＹＳＬＤＧＫＫＷＱＴＹＲＧＮＳＴＧＴＬＭＶＦＦＧＮＶＤＳＳＧＩＫＨＮＩＦＮＰＰＩＩＡＲＹＩＲＬＨＰＴＨＹＳＩＲＳＴＬＲＭＥＬＭＧＣＤＬＮＳＣＳＭＰＬＧＭＥＳＫＡＩＳＤＡＱＩＴＡＳＳＹＦＴＮＭＦＡＴＷＳＰＳＫＡＲＬＨＬＱＧＲＳＮＡＷＲＰＱＶＮＮＰＫＥＷＬＱＶＤＦＱＫＴＭＫＶＴＧＶＴＴＱＧＶＫＳＬＬＴＳＭＹＶＫＥＦＬＩＳＳＳＱＤＧＨＱＷＴＬＦＦＱＮＧＫＶＫＶＦＱＧＮＱＤＳＦＴＰＶＶＮＳＬＤＰＰＬＬＴＲＹＬＲＩＨＰＱＳＷＶＨＱＩＡＬＲＭＥＶＬＧＣＥＡＱＤＬＹ

細胞株及び培養プロセス：
第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡを使用し、配列番号２に記載したアミノ酸配列を有するＢドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子をコードする哺乳動物の発現プラスミドを構築した。プラスミドは、完全長ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１−７４０を含む第ＶＩＩＩ因子重鎖と、完全長ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１６４９−２３３２を含む第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードする。重鎖及び軽鎖配列は、完全長ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７４１−７５０及び１６３８−１６４８の配列を有する２１のアミノ酸リンカーにより連結している。チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を、ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子をコードするプラスミドで形質移入し、動物成分を含有しない培地で培養されたクローン懸濁産生細胞に最終的に至るジヒドロ葉酸還元酵素システムを用いて選択する。

本方法の第１工程は、作業細胞バンクバイアルから、化学的に定まり動物成分を含有しない増殖培地への、細胞バイアルの播種である。まず、解凍後に細胞をＴ-フラスコ中でインキュベートする。解凍の１又は２日後、細胞を振盪フラスコに移し、０．２−３．０×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度を維持するために、連続希釈により、培養容量を大きくする。次の工程は、振盪フラスコ培養物のシードバイオリアクターへの移動である。ここで、培養容量は、生成用バイオリアクターへの最終移動の前にさらに大きくなっている。同様に化学的に定まり動物成分を含有しない培地を、全ての播種増殖工程に使用する。生産用バイオリアクターへの移動後、産物の濃度を増加させる成分を培地に補填する。生産用バイオリアクター中で、細胞を、３日間のサイクルタイムの繰返しバッチプロセスで培養する。収集時、培養容量の８０−９０％を収集用タンクに移動させる。ついで、最初の細胞密度にするために、残った培養液を新鮮培地で希釈し、新たな増殖期間を開始させる。

収集バッチを、遠心分離及び濾過により浄化し、精製工程を開始する前に、貯蔵タンクに移動させる。貯蔵タンク中の細胞を含有しない収集物にバッファーを添加し、ｐＨを安定化させる。

生産工程の終了までに、生産細胞バンクを終了させるために、細胞を収集し、凍結させる。この細胞バンクを、マイコプラズマ、無菌性、及びウイルス汚染性について試験する。

精製：
細胞培養培地からのＢドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子の単離では、ＣａｐｔｏＭＭＣカラムでの濃縮工程、免疫吸着剤クロマトグラフィー工程、アニオン交換クロマトグラフィー、及び最後にゲル濾過工程を含む４工程の精製手順を使用した。典型的には次の手順を使用した：１１リットルの滅菌濾過培地を、バッファーＡ：２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のトゥイーン(Tween)８０、ｐＨ＝７．５、流量１５ｍｌ／分で平衡にしたＣａｐｔｏＭＭＣカラム(１．６×１２ｃｍ)(GE Healthcare, Sweden)に移送した。カラムを７５ｍｌのバッファーＡで洗浄し、続いて１．５ＭのＮａＣｌを含有する７５ｍｌのバッファーＡで洗浄した。２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．０２％のトゥイーン８０、２．５ＭのＮａＣｌ、８Ｍのエチレングリコール、ｐＨ＝７．５、流量１ｍｌ／分を用い、タンパク質を溶出させた。８ｍｌの画分を収集し、第ＶＩＩＩ因子活性(ＣｏＡ-テスト)についてアッセイした。第ＶＩＩＩ因子含有画分をプールし、通常は約５０ｍｌのプール容量を得た。

第ＶＩＩＩ因子に対するモノクローナル抗体が開発されている(Kjalke Eur J Biochem 234 773)。エピトープマッピングにより(結果は示さず)、この抗体Ｆ２５がアミノ酸残基７２５〜７４０の重鎖の遠くのＣ末端配列を認識することが見出された。Ｆ２５抗体を、本質的に製造者により記載されているようにして、ゲル１ｍｌ当たり２．４ｍｇの密度で、ＮＨＳ-活性化セファロース４ＦＦ(GE Healthcare, Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)にカップリングさせた。先の工程からのプールを、２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．０２％のトゥイーン８０、ｐＨ＝７．３を用いて１０倍に希釈し、２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のトゥイーン８０、１Ｍのグリセロール、ｐＨ＝７．３、流量０．５ｍｌ／分で平衡にしたＦ２５セファロースカラム(１．６×９．５ｃｍ)に充填した。ＵＶシグナルが一定になるまで、カラムを平衡バッファーで洗浄し、ついでＵＶシグナルが再度一定になるまで、２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．６５ＭのＮａＣｌで洗浄した。２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．０２％のトゥイーン８０、２．５ＭのＮａＣｌ、５０％のエチレングリコール、ｐＨ＝７．３、流量１ｍｌ／分を用い、第ＶＩＩＩ因子を溶出させた。１ｍｌの画分を収集し、第ＶＩＩＩ因子活性(ＣｏＡ-テスト)についてアッセイした。第ＶＩＩＩ因子含有画分をプールし、通常は約２５ｍｌのプール容量を得た。

バッファーＡ：２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．０２％のトゥイーン８０、１Ｍのグリセロール、ｐＨ＝７．３、及びバッファーＢ：２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．０２％のトゥイーン８０、１Ｍのグリセロール、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．３を、イオン交換工程用に調製した。Ｍａｃｒｏ-Ｐｒｅｐ２５ＱＳｕｐｐｏｒｔ(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)のカラム(１×１０ｃｍ)を、８５％のバッファーＡ／１５％のバッファーＢ、流量２ｍｌ／分で平衡化した。先の工程からのプールを、バッファーＡを用いて１０倍に希釈し、流量２ｍｌ／分でカラムに移送した。８５％のバッファーＡ／１５％のバッファーＢ、流量２ｍｌ／分でカラムを洗浄し、１５％のバッファーＢ〜７０％のバッファーＢの直線状勾配、１２０ｍｌ超、流量２ｍｌ／分にて、第ＶＩＩＩ因子を溶出させた。２ｍｌの画分を収集し、第ＶＩＩＩ因子活性(ＣｏＡ-テスト)についてアッセイした。第ＶＩＩＩ因子含有画分をプールし、通常は約３６ｍｌのプール容量を得た。

先の工程からのプールを、平衡化されたスーパーデックス２００、ｐｒｅｐグレード(GE Healthcare, Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)カラム(２．６×６０ｃｍ)に充填し、２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．０２％のトゥイーン８０、１Ｍのグリセロール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．３を用い、１ｍｌ／分で溶出させた。３ｍｌの画分を収集し、第ＶＩＩＩ因子活性(ＣｏＡ-テスト)についてアッセイした。第ＶＩＩＩ因子含有画分をプールし、通常は約５７ｍｌのプール容量を得た。第ＶＩＩＩ因子を含有するプールを−８０℃で保存した。

上述の４工程の精製手順を使用して、ＣｏＡ活性及びＥＬＩＳＡ測定により判定して約１５％の総収率が得られた。

Ｎ８の製造に使用される細胞株は、Ｆ８-５００タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む挿入断片を有するｐＴＳＶ７発現ベクターからなるｐＴＳＶ７中の発現プラスミド＃８１４Ｆ８-５００を安定して形質移入した組換えチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞株である。ここで「Ｎ８」は、配列番号２に列挙のアミノ酸配列を有するタンパク質に相当することを意味する。Ｎ末端から出発し、Ｆ８-５００タンパク質(Ｎ８)は、ＦＶＩＩＩシグナルペプチド(アミノ酸−１９〜−１)、続いてＢドメインを有さないＦＶＩＩＩ重鎖(アミノ酸１−７４０)、２１のアミノ酸リンカー(ＳＦＳＱＮＳＲＨＰＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ)、及びＦＶＩＩＩ軽鎖(野生型ヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸１６４９−２３３２）からなる。２１のアミノ酸リンカーの配列は、ＦＶＩＩＩＢドメインから誘導され、全長ＦＶＩＩＩのアミノ酸７４１−７５０及び１６３８−１６４８からなる。

ＣＨＯ細胞を、８１４Ｆ８-５００を用いてｐＴＳＶ７に形質移入し、動物成分を含有しない培地で培養したクローン懸濁産生細胞に最終的に至るジヒドロ葉酸還元酵素システムを用いて選択した。生産工程を、機能している細胞バンクバイアルを解凍することにより開始させ、生産用バイオリアクターに移動させるまでに、細胞を増殖させる。同様に化学的に定まった動物成分を含有しない培地を全ての播種増殖工程に使用する。生産用バイオリアクターへの移動後、生成物の濃度を増加させる成分を、培地に補填する。生産用バイオリアクターにおいて、細胞を、３日間のサイクルタイムの繰り返しバッチプロセスで培養する。収集時、培養用量の８０−９０％を収集用タンクに移動させる。ついで、最初の細胞密度にするために、残った培養液を新鮮培地で希釈し、新たな増殖期間を開始させる。収集バッチを、遠心分離及び濾過により浄化し、精製工程を開始する前に、貯蔵タンクに移動させる。貯蔵タンク中の細胞を含有しない収集物にバッファーを添加し、ｐＨを安定化させる。

実施例２
組換えＢドメイン切断型Ｏ-グリコシル化第ＶＩＩＩ因子のペグ化：
実施例１で得られた組換え第ＶＩＩＩ因子分子を、次の手順を使用し、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)とコンジュゲートさせる。

実施例１で得られた組換え第ＶＩＩＩ因子分子のグリコペグ化を効率的にするには、ＦＶＩＩＩ濃度＞５ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。ＦＶＩＩＩは、通常はその濃度で可溶性ではないために、選択されたバッファー組成物のスクリーニングを実施した(表１におけるこれらの結果のいくつかを参照)。

これらの考慮に基づき、５０ｍＭのＭＥＳ、５０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロール、ｐＨ６．０を含むバッファーが適切な反応バッファーであることが分かった。

上述したように精製された組換えＦＶＩＩＩを、ＳａｒｔｏｒｉｕｓＶｉｖａｓｐｉｎ(ＰＥＳ)フィルター、１０ＫＤａカット-オフ又はＡｍｉｃｏｎ１０ｋＤａＭＷＣＯＰＥＳフィルターで、段階的溶出を使用してのＰｏｒｏｓ５０ＨＱカラムでのイオン交換により、６−１０ｍｇ／ｍＬ濃度まで反応バッファー中で濃縮した。第ＶＩＩＩ因子(ＢＤＤ)(最終的に〜４．７ｍｇ／ｍＬ)を、シアリダーゼ(A. urifaciens)(１５９ｍＵ／ｍＬ)、ＣＭＰ-ＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ-４０ｋＤａ(５ｍｏｌ当量)、及びＭＢＰ-ＳＴ３Ｇａｌ１(５４０ｍＵ)と、反応バッファー（５０ｍＭのＭＥＳ、５０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロール、０．５ｍＭのアンチパイン、ｐＨ６．０)中で混合することにより、ＦＶＩＩＩのグリコペグ化を開始させた。全体的に〜２０−３０％の転換収率になるまで、反応混合物をインキュベートした。

インキュベート後、試料をバッファーＡ(２５ｍＭのトリス、５ｍＭのＣａＣｌ_２、２０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロール、ｐＨ７．５)で希釈し、ソース１５Ｑカラム(内径１ｃｍ×６ｃｍ、４．７ｍＬ、１ｍＬ／分、２８０ｎｍ)に充填した。結合した物質をバッファーＡで洗浄し、バッファーＢ(２５ｍＭのトリス、５ｍＭのＣａＣｌ_２、１ＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロール、ｐＨ７．５)の段階勾配を用いて溶出させた。〜２５％のバッファーＢで、カラムから、グリコペグ化された第ＶＩＩＩ因子-(Ｏ)-ＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ-４０ｋＤａを溶出させた。図２は、ソース１５Ｑでの反応混合物のイオン交換クロマトグラフィーを示す。

シアリダーゼ処理中にＮ-グリカンに暴露された遊離のガラクトース部分をブロックするために、第ＶＩＩＩ因子-ＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ-４０ｋＤａ(最終的に１．０ｍｇ／ｍＬ)のプール化画分を、反応バッファー５０ｍＭのＭＥＳ、２０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、２０％のグリセロール、ｐＨ６．０中において、ＣＭＰ-ＳＡ(２０００ｍｏｌ当量)及びＭＢＰ-ＳＢＤ-ＳＴ３Ｇａｌ３(４００ｍＵ／ｍＬ)と混合し、３２℃で１１時間インキュベートした。

得られたキャッピングされたグリコペグ化第ＶＩＩＩ因子-ＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ-４０ｋＤａを、５０ｍＭのＭＥＳ、５０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．０；流量０．２５ｍＬ／分で平衡化されたスーパーデックス２００カラム(内径１０ｃｍ×３００ｍｍ；２８０ｎｍ)でゲル濾過することにより、ＣＭＰ-ＳＡ及びＳＴ３ＧａｌＩＩＩから分離した。生成物第ＶＩＩＩ因子-ＳＡ-グリセロール-ＰＥＧ-４０ｋＤａを、３８分溶出させる。図３は、スーパーデックス２００サイズ排除クロマトグラフィーを使用するキャップ生成物の精製を示す。ピーク画分を収集し、一定分量に分割し、次の分析を施した。

キャッピング手順の目的は、結合型第ＶＩＩＩ因子分子のインビボクリアランスを低下させることにある。

実施例３
発色性ＦＶＩＩＩ活性アッセイにおけるＯ-グリカンペグ化ｒＦＶＩＩＩの活性
実施例２で得られたＯ-グリコペグ化ｒＦＶＩＩＩの活性を、次のようにして、コアテスト(Coatest)ＳＰ試薬(Chromogenix)を使用する発色性ＦＶＩＩＩアッセイで評価した：ｒＦＶＩＩＩ試料及びキャリブレーター(NIBSCからの第７国際ＦＶＩＩＩ標準品)を、コアテストアッセイ用バッファー(５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、ｐＨ７．３、保存料を含有)に希釈した。５０μｌの試料、標準品、及びバッファーネガティブのコントロールを、２通りの９６-ウェルマイクロタイタープレート(Nunc)に添加した。コアテストＳＰキットからの第ＩＸａ因子／第Ｘ因子試薬、リン脂質試薬、及びＣａＣｌ_２を、５：１：３(容量：容量：容量)で混合し、この７５μｌをウェルに添加した。室温でインキュベートして１５分後、５０μｌの第Ｘａ因子基質Ｓ-２７６５／トロンビンインヒビターＩ-２５８１混合物を添加し、２５μｌの１Ｍクエン酸、ｐＨ３を添加する前に、室温で１０分、反応物をインキュベートした。参照波長として使用される６２０ｎｍでの吸光度と共に、４１５ｎｍでの吸光度を、スペクトラマックス(Spectramax)マイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices)で測定した。ネガティブコントロールについての値を全ての試料から引き、ＦＶＩＩＩ濃度に対してプロットされた吸光度値の直線回帰により、較正曲線を作成した。比活性を、ＨＰＬＣクロマトグラムでの軽鎖ピークを積分し、サイズ排除ＨＰＬＣで定量されたタンパク質濃度で、試料の活性を割ることにより算出した。すなわちＰＥＧ部分は含めなかった。表２のデータは、発色比活性がＯ-グリコペグ化ｒＦＶＩＩＩ化合物に対して維持されていることを証明しており、これは、第ＶＩＩＩ因子の活性がペグ化変異体において保持されていると思われることを意味する。

実施例４
ＦＶＩＩＩ凝固活性アッセイにおけるＯ-グリカンペグ化ｒＦＶＩＩＩの活性
Ｏ-グリコペグ化ｒＦＶＩＩＩの活性をＦＶＩＩＩ凝固アッセイでさらに評価した。ｒＦＶＩＩＩ試料をＨＢＳ／ＢＳＡ(２０ｍＭのヘペス(hepes)、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１％のＢＳＡを含有)において、約１０Ｕ／ｍｌに希釈し、ついで、ＶＷＦを含むＦＶＩＩＩ欠損血漿(Dade Behring)で１０倍希釈した。続いて、試料及び較正された血漿標準品(HemosIL Calibration Plasma from Instrumentation Laboratory)を、ＨＢＳ／ＢＳＡ中で４(試料)又は６(キャリブレーター)の異なる濃度に希釈した。単一ファクタープログラムを使用し、ＡＣＬ９０００機器(Instrumentation laboratory)で凝固時間を測定し、試料／標準品を、ＶＷＦ(Dade Behring)、カルシウム、及びａＰＴＴ試薬と共に、同容量のＦＶＩＩＩ欠失血漿と混合し、凝固時間を測定した。試薬として、以下のものを使用した：シンタシル(Synthasil)(HemosIL, Instrumentation Laboratory)、アクチンＦＳ(活性化ＰＴＴ試薬、Dade Behring)、スタゴ(Stago)(ＳＴＡ(登録商標)ＰＴＴ-Ａ、Stago)、及びｄＡＰＰＴｉｎ(ＤＡＰＰＴＩＮ(登録商標)ＴＣ、Technoclone)。試料の活性を、キャリブレーターの濃度に対する凝固時間の片対数プロットに基づき算出した。

Ｏ-グリコペグ化ｒＦＶＩＩＩ化合物(それぞれ、コントロール、１０、４０、及び８０ｋＤＡのＰＥＧ)の凝固活性(図４)は、使用したＰＥＧサイズ及びａＰＴＴ試薬に応じて、様々な度合いで減少した。ａＰＴＴ試薬として、シンタシル又はｄＡＰＰＴｉｎを使用すると、ＰＥＧサイズに伴い、凝固活性が徐々に低減する結果となった。スタゴのａＰＴＴ試薬を用いると、評価した３つ全てのＯ-グリコペグ化Ｎ８化合物について、凝固比活性の５０％低下が観察された。ａＰＴＴ試薬としてアクチンＦＳを使用した場合、約１００００ＩＵ／ｍｇの凝固比活性が維持された。データは、ＰＥＧ部分の存在により、ａＰＴＴアッセイが影響を受けることを示しているが、選択されたａＰＴＴ試薬、例えばアクチンＦＳを使用すると、ｒＦＶＩＩＩの凝固比活性は、Ｏ-グリコペグ化では損なわれない。

実施例５：
補因子活性及びＦＶＩＩＩ活性化の速度に対するｒＦＶＩＩＩのＯ-結合ペグ化の影響
ＦＩＸａ-ＦＶＩＩＩａ複合体への活性化ＦＶＩＩＩの導入により、ＦＩＸａ触媒されたＦＸ活性化の触媒効率は５桁高められ(van Dieijenら (1981) J Biol Chem 256:3433)、ＦＩＸａ-ＦＶＩＩＩａ複合体アセンブリ及びＦＸ活性化動態の特徴付けは、ＦＶＩＩＩａ分子の機能的統合性の高感度な指標である。トロンビン-活性化ｒＦＶＩＩＩ又はＰＥＧ-ｒＦＶＩＩＩの補因子活性は、リン脂質及びトロンビン-活性化ｒＦＶＩＩＩ又はＰＥＧ-ｒＦＶＩＩＩの存在下、ＦＩＸａ-触媒されたＦＸ活性化の動態パラメータを測定することにより特徴付けられる。ＦＶＩＩＩａ活性アッセイ(ＦＩＸａ-補因子活性アッセイ)を使用して、それぞれ固定濃度(０．１ｎＭ)のｒＦＶＩＩＩａ又はＦＩＸａに対して、ＦＩＸａ及びＦＶＩＩＩａの相互滴定を実施し、ｒＦＶＩＩＩａ(Ｋ_{１／２ＦＩＸａ})の見かけの親和性及び機能的ＦＶＩＩＩａ濃度を得た。ＦＸ活性化のミカエリス定数(ｋ_ｍ)と回転数(ｋ_ｃａｔ)を、固定濃度のＦＩＸａ-ＦＶＩＩＩａ複合体の固定濃度に対して、ＦＸを滴定することから得た。

ＦＩＸａ-補因子活性アッセイは、次のようにして実施した：トロンビン-活性化ｒＦＶＩＩＩ及びＰＥＧ-ｒＦＶＩＩＩ変異体を、ｒＦＶＩＩＩ(通常、０．７ｎＭ、１Ｕ／ｍＬ)と５ｎＭのヒトα-トロンビンを、正確には３７℃で３０秒インキュベートすることにより、各試験毎に新たに調製した。その後、ＦＸ活性化の速度を、ＦＩＸａ、リン脂質小胞(Rossix [Molndal, Sweden]からのリン脂質ＴＧＴ)、ヒルジン、ペファブロック(Pefabloc)Ｘａ及びＣａＣｌ_２の調製混合物に、上述した活性化反応体をサブサンプリングすることにより定量した；ＦＸ活性化を、ＦＸを添加することにより開始させ、放置し、３７℃で３０秒又は６０秒続行させた。ＥＤＴＡを含む氷冷バッファーにＦＸ活性化反応物を希釈することにより、活性化を停止させた。ＦＸａに特異的な発色基質を使用し、ＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎＭの吸光度を読むことにより、ＦＸａの濃度を定量化した。精製されたＦＸａを用いて調製された参照曲線を使用し、吸光度をＦＸａ濃度に転換した。活性化ｒＦＶＩＩＩ又はＰＥＧ-ｒＦＶＩＩＩ変異体から組み立てられたＦＩＸａ-ｒＦＶＩＩＩａ複合体の回転数を使用し、ＦＸ活性化の速度を、ｒＦＶＩＩＩａ濃度に転換した。

トロンビン触媒されたｒＦＶＩＩＩ活性化の速度を、０．７ｎＭのｒＦＶＩＩＩ又はＰＥＧ-ｒＦＶＩＩＩ及び０．１３ｎＭのヒトα-トロンビンを含有する混合物において、ｒＦＶＩＩＩａの初期(０〜３分)形成を定量化することにより測定した。ＦＶＩＩＩａの形成は、時間について線形であった。ＦＶＩＩＩａ活性化の速度は、形成したｒＦＶＩＩＩａのモル／分／最初に存在したｒＦＶＩＩＩのモル(ｖ／[ｒＦＶＩＩＩ]_０)として表した。

ｒＦＶＩＩＩのＯ-結合グリコペグ化は、活性化ｒＦＶＩＩＩの存在下での、ＦＸのＦＩＸａ触媒された活性化のｋ_ｍ又はｋ_ｃａｔ、又はトロンビン触媒されたｒＦＶＩＩＩ活性化の速度に影響を与えなかった(表３を参照)。さらに、Ｏ-結合したグリコペグ化は、ｒＦＶＩＩＩａ-ＦＩＸａ相互作用(Ｋ_{１／２ＦＩＸａ})の見かけＫ_ｄにも影響を与えなかった。

図４は、種々のａＰＴＴ試薬を使用するＯ-グリコペグ化ｒＦＶＩＩＩの凝固活性を表す。データは、凝固活性と発色活性との間の比率(Ａ)として、又は凝固比活性(Ｂ)として示される。３つの独立した実験からの値の平均及び標準偏差を示す。

実施例６
ＦＶＩＩＩＫＯマウスとｖＷＦＫＯマウスにおけるグリコペグ化Ｂドメイン欠失型(ＢＤＤ)-ＦＶＩＩＩの薬物動態
様々なＰＥＧサイズでグリコペグ化されたＢＤＤ-ＦＶＩＩＩの薬物動態を、ＦＶＩＩＩＫＯマウスへの、２８０ＩＵ／ｋｇの静脈投与後に研究した。

次の化合物を研究した：ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ-１０ＫＰＥＧ(Ｏ-グリカン、0129-0000-1005)、ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ-４０ＫＰＥＧ(Ｏ-グリカン、0129-0000-1003)、ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ-２×４０ＫＰＥＧ(Ｏ及びＮ-グリカン、0129-0000-1008-1A)、ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ-８０ＫＰＥＧ(Ｎ-グリカン、0129-0000-1012、Ｏ-グリカン、0129-0000-1009)。

動物研究の設計：
第ＶＩＩＩ因子ノックアウト(ＦＶＩＩＩＫＯ)マウスを、Ｃ５７Ｂ１／６バックグラウンドにおいて、エクソン１６ＫＯに基づき、タコニック(Taconic)Ｍ＆Ｂで飼育した。約２５ｇの体重で、１９−２６週の範囲の年齢のオスとメスの混合体を使用した。マウスは十分な戻し交配はしなかった。ＦＶＩＩＩはこのマウス系統では検出されなかった。

マウスに、上に列挙した化合物を用いて尾部静脈に２８０ＩＵ／ｋｇの単一静脈注射を与えた。マウスに静脈周囲投与がなされた場合は、マウスを他のマウスと交換した。投与後、非被覆キャピラリーガラスチューブを使用し、投与前から投与後６４時間まで、眼窩神経叢の血液試料を収集した。各マウスから３つの試料を取り出し、各時点で、２、３又は４の試料を収集した。クエン酸ナトリウム(９：１)で血液を安定化させ、ＦＶＩＩＩＣＯＡＳＰバッファー(１：４)に希釈し、４０００ｇで５分間遠心分離した。希釈した血液から得られた血漿を−８０℃に維持されたドライアイスで凍結させた後、ＦＶＩＩＩ発色活性及び／又はＦＶＩＩＩ抗原分析により定量分析した。

定量的血漿分析：
ＦＶＩＩＩ発色活性を、コアテストＳＰキット(Chromogenix)からの試薬を使用して測定した。希釈した血漿試料、コアテストＳＰ-バッファーにおけるキャリブレーター(ILS calibration plasma)、及びバッファーネガティブコントロール(５０μｌ)を、２通りの９６-ウェルマイクロタイタープレート(Nunc)に添加した。コアテストＳＰキットからの第ＩＸａ因子／第Ｘ因子試薬、リン脂質試薬、及びＣａＣｌ２を、５：１：３(容量：容量：容量)で混合し、この７５μｌをウェルに添加した。室温でインキュベートして１５分後、５０μｌの第Ｘａ因子基質Ｓ-２７６５／トロンビンインヒビターＩ-２５８１混合物を添加し、２５μｌの２％クエン酸を添加する前に、室温で１０分、反応物をインキュベートした。４０５ｎｍでの吸光度を、スペクトラマックスマイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices)で測定した。血漿試料におけるＦＶＩＩＩ活性を、較正された国際血漿標準品(ＩＬＳ)を希釈することにより作成された較正曲線から算出した。

ＦＶＩＩＩ抗原アッセイは、ヒトＦＶＩＩＩの軽鎖に対する２つのモノクローナル抗体を使用する、Diagnostica Stago (Asserachrom VIII:CAg)から商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットであった。キャリブレーター(化合物の希釈)又は血漿試料をキットにより提供されたコアテストＳＰ希釈バッファーで少なくとも５０倍に希釈し、プレコートされたウェルに適用し、製造者の使用説明書に従ってＥＬＩＳＡを実施した。薬物動態研究を報告するのに使用した値は、化合物自体から作成した標準曲線に基づく。

薬物動態パラメータの推定：
薬物動態分析を、キャリブレーターとしてＩＬＳを使用し(発色活性に基づくデータ)、キャリブレーターとして化合物自体を使用する(ＥＬＩＳＡに基づくデータ)データの非コンパートメント法(ＮＣＡ)により実施した。データから、次のパラメータを推定した：Ｃｍａｘ(静脈投与後の最大濃度、これは最初のサンプリング時点である)、Ｔｍａｘ(静脈投与後の最大濃度の時間、これは最初の時点である)、ＡＵＯ０-∞(時間０から無限大までの曲線下の面積)、Ｔ_１／２(終末半減期)、ＣＬ(クリアランス)、及びＶｓｓ(定常状態での分布容量)。全ての計算は、WinNonlin Pro version 4.1を使用して実施した。

２８０ＩＵ／ＫｇのＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ-１０ＫＤａＰＥＧ、ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ-４０ＫＤａＰＥＧ、ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ-２×４０ＫＤａＰＥＧ、及びＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ-８０ＫＤａＰＥＧを、ＦＶＩＩＩＫＯマウスに静脈注射した後、７．８時間(ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ)〜１５−１６時間、ＰＥＧサイズの増加に伴い、半減期が増加したが(表４)、これは２倍の増加に相当する。同様に、クリアランスは低下し、ＭＲＴはＰＥＧサイズの増加に伴い増加した(表４)。

結論：
２８０ＩＵ／ｋｇをＦＶＩＩＩＫＯマウスに静脈投与した後、ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩと比較して、グリコペグ化ＢＤＤ-ＦＶＩＩＩでは、Ｔ_１／２が１．３−２．１倍増加していた。ＰＥＧ基のサイズが１０ＫＤａから８０ＫＤａＰＥＧまでの範囲で増加する場合、Ｔ_１／２の増加も観察された。

実施例７
血友病ＡマウスにおけるＦｅＣｌ３誘発傷害モデルでのアドベイトと比較した４０Ｋ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８の長期間にわたる止血効果
組換えＦＶＩＩＩ(アドベイト)に対する４０Ｋ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８の作用の持続時間を、血友病Ａ(Ｆ８-ＫＯ)マウスのＦｅＣｌ３誘発傷害モデルで研究した。
マウスに麻酔をかけ、体温を維持するために加熱パッド(３７℃)に配した。頸動脈を暴露させ、超音波で血流を測定するフロープローブ(０．５ＰＳＢ、ナノプローブ)を動脈周囲に配した。１０％のＦｅＣｌ３溶液に軽く浸した濾紙(２×５ｍｍ)を、暴露された頸動脈周囲に適用することにより、傷害(鉄媒介性の化学的酸化)を誘発させた。３分後に濾紙を除去した。ついで、０．９％のＮａＣｌを用いて動脈を３回洗浄し、フロープローブ中の空気を置換し、血流の最適化された測定を担保するために、最後にサーギルーブ(Surgilube)(音響カプラ)を適用した。ＦｅＣｌ３で飽和した濾紙を除去した後、２５分間、血流(ｍｌ／分)を記録し、ＦｅＣｌ３で飽和した濾紙を除去してから、血流が０ｍｌ／分になるまでの時間(分)を測定することにより、閉塞までの時間を決定した。閉塞が２５分後に生じなかった場合、観察期間中に閉塞が生じなくても、閉塞時間は２５分と報告した。Ｆ８-ＫＯマウス(ｎ＝６-１０)をアドベイト(２８０Ｕ／ｋｇ)、４０Ｋ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８(２８０Ｕ／ｋｇ)、又はビヒクルで処置した。投与の５分(急性効果)、又は２４、４８、６０、７２時間後に、ＦｅＣｌ３誘発傷害となった。ＦｅＣｌ３の除去後２５分間、血流(ｍｌ／分)を記録し、続いて、閉塞までの時間を決定した。

ビヒクルで処置されたＦ８-ＫＯマウスには閉塞は生じなかったが、４０ＫＤａ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８及びアドベイトで処置された全てのマウスでは、投与５分後(急性効果)に閉塞が生じ、閉塞時間の平均は、それぞれ４．３±０．４分と５．２±０．７分であった。４０ＫＤａ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８で処置されたＦ８-ＫＯマウスにおいて、平均閉塞時間は、投与７２時間後に、１３．８±３．４分まで増加した。これに対し、アドベイトで処置されたＦ８-ＫＯマウスは、２４及び４８時間後に、それぞれ１３．０±３．４分及び１５．９±２．９分の閉塞時間を有していた。重要なことには、アドベイトの投与後６０及び７２時間では、閉塞は観察されなかった。４０ＫＤａ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８で処置された全てのマウスにおいて、投与の２４時間後に閉塞が観察されたが、アドベイトで処置されたマウスの６７％のみに閉塞が生じた。４０ＫＤａ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８で処置されたマウスの６３％では、７２時間後も閉塞が見られたが、アドベイト投与の６０及び７２時間後には、閉塞は観察されなかった。

Ｆ８-ＫＯマウスにおける４０ＫＤａ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８の長期間にわたる効果
２８０ＩＵ／ｋｇの４０ＫＤａ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８、２８０ＩＵ／ｋｇのアドベイト、又はビヒクル投与の５分(急性効果)、又は２４、４８、６０、７２時間後に、ＦｅＣｌ３誘発傷害となった。ＦｅＣｌ３の除去後２５分間、血流(ｍｌ／分)を記録し、続いて、閉塞までの時間を決定した。投与の６０及び７２時間後、アドベイトが投与されたマウスには、閉塞は生じなかった。グループ当たり６−１０匹のマウスの平均及びＳＥＭを示す。異なるグループ間の閉塞までの時間を、ダンポストテスト(Dunn’s post test)を含むクラスカル-ワリス検定を使用して比較した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１。
結論として、Ｆ８-ＫＯマウスにおけるＦｅＣｌ３誘発性傷害モデルでは、４０ＫＤａ-ＰＥＧ-[Ｏ]-Ｎ８の止血効果は、アドベイトと比較してかなり長い。

Claims

変更された循環半減期を有するＢドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子分子であって、該分子が、切断されたＢドメイン中のＯ-結合オリゴ糖を介して親水性ポリマーと共有的に結合され、第ＶＩＩＩ因子の活性化により、共有的に結合した親水性ポリマーが除去される分子。
Ｏ-結合オリゴ糖が、Ｂドメインの切断により作製されるＯ-グリコシル化部位に結合している請求項１に記載の分子。
親水性ポリマーがＰＥＧである請求項１又は２に記載の分子。
ＰＥＧサイズが約１００００〜約１６００００Ｄａである請求項３に記載の分子。
ＰＥＧサイズが約４００００Ｄａである請求項４に記載の分子。
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなる請求項１から５のいずれか一項に記載の分子。
請求項１から６のいずれか一項に記載の分子を含有する薬学的組成物。
Ｂドメイン切断型第ＶＩＩＩ分子を親水性ポリマーと、切断されたＢドメイン中のＯ-結合オリゴ糖を介してコンジュゲートさせることを含む請求項１から６のいずれか一項に記載の分子の作製方法。
請求項８の方法により得ることができる分子。
請求項１から６のいずれか一項に記載の分子の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、出血性疾患の治療方法。
請求項１から６のいずれか一項に記載の分子の医薬としての使用。
血友病を治療するための医薬の製造のための、請求項１から６のいずれか一項に記載の分子の使用。
請求項１から６のいずれか一項に記載のＢドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子分子を操作する方法であって、（ｉ）Ｂドメインを切断し、場合によっては、この切断された第ＶＩＩＩ因子分子のアミノ酸配列に、潜在的なＯ-結合グリコシル化部位を同定する分析を施し、(ｉｉ)適切な宿主細胞中で分子を産生させ、及び（ｉｉｉ)切断されたＢドメイン中のＯ-結合グリカンを有する分子を選択する、ことを含む方法。