JPH08510729A - 細胞接着のインヒビターとしてのシアリルＬｅ▲上ｘ▼類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、セレクチン受容体と、表面にシアリルLe^xを発現する細胞との細胞接着を阻害する、シアリルルイス^xの類似体；この類似体の使用方法とこの類似体を使用する組成物；中間体；ならびに細胞接着阻害化合物およびその中間体の製造方法に関する。目的とする中間体またはインヒビター化合物は、YR¹（但しＹはＣ（Ｏ），SO₂，HNC（Ｏ）またはSC（Ｏ）でありそしてＲ¹はアリール、置換アリールまたはフェニルＣ₁〜Ｃ₃アルキレンの部分である）で置換されたGlcNAcの２−Ｎ−アセチル部分を含有している。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞接着のインヒビターとしてのシアリルLe^x類似体 詳細な説明 技術分野 この発明は細胞接着を阻害する化合物に関し、さらに詳しくはセレクチン依存 性細胞接着を阻害する、シアリルルイス^x（シリアルLe^xまたはSLe^x）の類似化合 物、これら化合物を含有する組成物とこれら類似化合物の使用方法、およびこれ ら類似体の製造方法に関する。背景の技術 血管内皮細胞および血小板は、特定の細胞、例えば血流中の食細胞白血球を選 択的に捕捉することによっていくつかの生体応答に重要な役割を演じている。例 えば、内皮細胞は、単球および顆粒球が血管壁を通過して炎症性反応中の周囲の 組織中に移行する前に、単球と顆粒球を優先的、に捕捉する。 特定の炎症をトリガーする化合物は、血管内皮細胞に直接作用して白血球が血 管壁に接着するのを促進することが知られている。次いで細胞は血管壁を通過し て損傷または感染の領域に移動する。 また血管内皮への細胞接着は、腫瘍の転移に関与していると考えられている。 循環癌細胞は、明らかに身体の通常の炎症機構を利用して、内皮が活性化されて いる血管壁の領域に結合する。 また血小板も同様の反応に関与している。血小板は、止血開始中に活性化され て形態学的、生化学的および機能的な大きな変化（例えば迅速な顆粒の細胞外排 出作用または脱顆粒）を受けることが知 られており、この場合、血小板のα顆粒膜が外部形質膜と融合する。その結果、 活性化された血小板に、新しい機能、例えば他の活性化された血小板と他の細胞 の両者を捕捉する性能を与える新しい細胞表面タンパク質が発現される。活性化 された血小板は、成長中の血栓中に補給されるかまたは血液循環から迅速に除か れる。活性化された血小板は単球および好中球を含む食細胞自血球に結合するこ とが知られている。このプロセスによって仲介されると考えられる病理学的およ び他の生物学的プロセスの例としては、アテローム性動脈硬化症、血液凝固およ び炎症がある。 最近の研究によって、Ｅ−セレクチン（内皮白血球接着分子−１；ELAM−１） およびＰ−セレクチン（顆粒膜タンパク質−140；GMP-140）とそれぞれ命名され た内皮細胞と血小板の特殊細胞表面受容体が、内皮と血小板による各種の循環細 胞の認識に関与していることが明らかになっている。例えばＥ−セレクチンは、 内皮白血球の接着を仲介していることが分かっており、この接着は多くの炎症性 反応の第一ステップである。具体的に述べると、Ｅ−セレクチンは、ヒトの好中 球、単球、好酸球、特定のＴリンパ球（Graberら、J．Immunol.，145巻、819頁 、1990年）、NK細胞および前骨髄球細胞系HL−60を捕捉する。 Ｅセレクチンは、血管内皮細胞上に発現が誘導される（Bevilacquaら、Scienc e，243巻、1160〜1165頁、1989年およびHessionら、Proc．Natl．Acad．Sci.，8 7巻、1673〜1677頁、1990年）。この受容体は、インターロイキンＩβ（IL−Ｉ β）のような炎症性サイトカイン類、腫瘍壊死因子α（TNFα）および細菌内毒 素（リポ多糖）によって誘発されることが実証されている〔Bevilacquaら、Proc .Natl．Acad．Sci.，84巻、9238〜9242頁、1987年）。これらの化合物は、多形 核白血球（好中球）および単球の接着を増大する（Bevi lacquaら、Proc．Natl．Acad．Sci.，84巻、9238〜9242頁、1987年）。 Ｐ−セレクチン（GMP-140およびPADGEMとしても知られている）は、血小板と 内皮細胞の表面上に存在し、そこで血小板−白血球および内皮−白血球の相互作 用を仲介している（Gengら、Nature，343巻、757〜760真、1990年）。したがっ て例えば表面上にＰ−セレクチンを発現する活性化血小板は単球と好中球に結合 することが知られており（Jungiら、BLood，m，67巻、629〜636頁、1986年）、 また単球様細胞系、例えばHL−60とU937にも結合することが知られている（Jung iら、BLood，67巻、629〜636頁、1986年；Silversteinら、J．Clin．Invest.，7 9巻、867〜874頁、1987年）。 Ｐ−セレクチンは、血小板が剌激されて顆粒が分泌されると活性化血小板の表 面上に発現される分子量140,000のα顆粒膜タンパク質である〔Hsu-Linら、J．C lin．Chem.，259巻、9121〜9126頁、1984年；Stenbergら、J．Cell Biol.，101 巻、880〜886頁、1985年；Bermanら、J．Clin．Invest.，78巻、130〜137頁、19 86年）。またＰ−セレクチンは、巨核球中に（Becksteadら、BLood，67巻、285 〜293頁、1986年）、およびヴァイベル−パラ−デ体内（Bonfantiら、BLood，73 巻、1109〜1112頁、1989年）の内皮細胞中（McEverら、BLood，70巻、335a頁、1 987年）にも見出されている。Furieらの米国特許第4,783,330号には、Ｐ−セレ クチンと反応性のモノクローナル抗体が記載されている。 第三の受容体は、リンパ球ホーミング受容体、MEL-14抗原またはそのヒトの同 等物のLAM-１（Ｌ−セレクチン）である（Gallatinら、Nature，304巻、30〜34 頁、1983年；Siegellmanら、Science，243巻、1165〜1172頁、1989年；Rosen，C ell Biology,１巻、913〜 919頁、1989年；およびLaskyら、Cell，56巻、1045〜1055頁、1989年）。リンパ 球のホーミング現象に加えて、MEL-14抗原／LAM-１は、好中球が内皮に結合する 場合、早期に機能すると考えられる。 “セレクチン”という用語は、Ｅ−セレクチン（ELAM−１）、Ｐ−セレクチン （GMP-140）およびＬ−セレクチン（MEL-14）を含む一般クラスの受容体に提案 されているが、これはこれら受容体がレクチン様ドメインを有しかつその接着機 能が選択的性能を有しているからである。セレクチン受容体類の構造と機能は、 これらの各受容体をコードする完全長のcDNAのクローン化と発現によって解明さ れている〔Bevilacquaら、Science，243巻、1160〜1165頁、1989年（ELAM−１） ；Gengら、Nature，343巻、757〜760頁、1990年（GMP-140）；およびLaskyら、C ell，56巻、1045〜1055頁、1989年（MEL-14抗原）〕。 セレクチン類の細胞外部分は、先に述べたタンパク質に対する相同性に基づい て三つのセグメントに分割することができる。そのＮ末端領域（約120個のアミ ノ酸）は、Drickamer，J．Biol．Chem.，263巻、9557〜9560頁、1988年に報告さ れているように、低アフィニティーIgE受容体CD23を誘発するＣ型の哺乳類レク チンタンパク質ファミリーに関連している。上皮成長因子（EGF）モチーフを含 有するタンパク質に関連する配列を有するポリペプチドが続いている。最後に、 上記EGFドメインの後に、補体調節タンパク質のファミリーに見出されるモチー フに関連する。各々約60個のアミノ酸を含有する一つ以上のタンデム反復モチー フがある。 米国特許第5,079,353号とその分割特許第5,296,594号は、癌性組織中に存在し かつ前記セレクチン受容体に対するリガンドであるシアリルLe^xとシアリルLe^aの 抗原の合成と使用を教示している。米国特許第5,143,712号は、ELAM−１（Ｅ− セレクチン）のような 各種の受容体と、シアリルLe^Xのようなリガンドならびに末端シアリル基およびL acNAc単位のGlcNAc部分に結合されている一つ以上のフコシル基とともに複数の Ｎ−アセチルラクトースアミン（Ｎ−acetyllactosamine）（LacNAc）単位を含 有するリガンドとの間の結合作用を教示している。 国際特許願公開第WO91/1951号および同第WO91/19502号は、下記の五量体と六 量体を含有するオリゴ糖が、リガンド（下記）を含有する細胞とセレクチン受容 体を含有する細胞との間の選択的細胞結合を阻害し、そして試験を行った五糖類 と六糖類がSLe^xより優れた阻害作用を示したと開示している。 NeuAcα２→３Gal β１→４（Fucα１→３）GlcNAcβ１，３Galβ−； NeuAcα２→３Gal β１→４（Fucα１→３）GlcNAcβ１，３Galβ１，４lIc− ；および NeuAcα２→３Gal β１→４（Fucα１→３）GlcNAc m SLe^x。発明の簡単な要約 この発明は、その表面上にセレクチン受容体に対するSLe^xを発現する細胞の接 着を阻害するシアリルLe^x（SLe^x）類似化合物、インヒビターを合成する際の中 間化合物、ならびに中間体およびインヒビターを含有する組成物の製造方法に関 する。 目的とする化合物は下記式で表される。 式中、Ｚは水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アシルまたは ＹはＣ（Ｏ），SO₂，HNC（Ｏ），OC（Ｏ）およびSC（Ｏ）からなる群から選択 され； Ｒ¹はアリール基、置換アリール基およびフェニルＣ₁〜Ｃ₃アルキレン基から なる群から選択され、アリール基は一つの五員もしくは六員の芳香環、五員／六 員の縮合芳香環または二つの六員縮合芳香環を有し、これらの環は、ヒドロカル ビル環、モノオキサヒドロカルビル環、モノチアヒドロカルビル環、モノアザヒ ドロカルビル環およびジアザヒドロカルビル環からなる群から選択され、そして 置換アリール基は、ハロ、トリフルオロメチル、ニトロ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキル、 Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ_{1 8} アルキルアミノ、ベンジルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルベンジルアミノ、Ｃ₁〜 Ｃ₁₈チオアルキルおよびＣ₁〜Ｃ₁₈アルキルカルボキサミドの基からなる群から 選択される置換基を有する前記アリール基であり、またはR¹Yがアリルオキシカ ルボニルもしくはクロロコアセチルであり； Ｒ²は水素、Ｃ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒドロカルビル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆アルキルＣ₁〜Ｃ₅アルキレンω−カルボキシレート、ω−トリ（Ｃ₁〜Ｃ₄ アルキル／フェニル）シリルＣ₂〜Ｃ₄アルキレン、単糖および二糖からなる群か ら選択され、またはOR²がともにＣ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒ ドロカルビルカルバメートを形成し； Ｒ³は水素またはＣ₁〜Ｃ₆アシルであり； Ｒ⁴は水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルまたはベンジルであり； Ｒ⁵は水素、ベンジル、メトキシベンジル、ジメトキシベンジルおよびＣ₁〜Ｃ₆ アシルからなる群から選択され； Ｒ⁷はメチル（CH₃）またはヒドロキシメチル（CH₂OH）であり； ならびに ＸはＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシ、Ｃ₂〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ、ヒドロキシ 、ハロおよびアジドからなる群から選択される。 Ｙはカルボニル〔Ｃ（Ｏ）〕が好ましい。 １群のインヒビターの場合、Ｒ²は、好ましくは単糖であり、より好ましくは 単糖のＣ₁〜Ｃ₁₈アルキルグリコシドであり、Ｒ⁷はメチルであり、Ｚは保護され ていないフコ基であり、ＸはヒドロキシルでありそしてR¹Yはアリルオキシカル ボニルまたはクロロアセチル以外の基である。インヒビターの中間体は、例示さ れている“Ｒ”の基のいずれを含有していてもよくＲ³，Ｒ⁴およびＲ⁵は好まし くは水素以外の基である。 特に好ましいインヒビターは下記式で表される。 式中、Ｒ¹は前記定義に同じでありかつR¹Yはアリルオキシカルボニルもしくは クロロアセチル以外の基であり、Ｘは上記定義に同じであり好ましくはＣ₁〜Ｃ₆ アシルオギシおよびＣ₁〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ以外の基であり、ならび にＲ²とＲ⁷は上記定義と同一である。一つの実施態様ではＲ²は好ましくは単糖 もしくは二糖以外の基である。ベンジル基Ｒ²が特に好ましい。 他の群の特に好ましいインヒビターは下記式で表される。 式中、Ｒ¹は上記定義と同一であるが、アリルオキシカルボルおよびクロロア セチルのR¹Y基は除外され、Ｘは上記定義と同一であるが好ましくはＣ₁〜Ｃ₆ア シルオキシおよびＣ₁〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ以外の基の基であり、Ｒ⁷ は上記定義と同一であり、ならびにＲ²は単糖または二糖である。 またこの発明は医薬組成物に関する。その医薬組成物は、下記式で表される化 合物の細胞接着を阻害する量を溶解もしくは分散された医薬として許容される希 釈剤または担体を含有している。 式中、ＹはＣ（Ｏ），SO₂，HNC（Ｏ），OC（Ｏ）およびSC（Ｏ）からなる群か ら選択され； Ｒ¹は前記定義と同一であり、好ましくはアリール、置換アリールおよびフェ ニルＣ₁〜Ｃ₃アルキレン基からなる群から選択され、そのアリール基はフリル、 チエニル、フェニル、ナフチル、ピリジル、ピラジニル、ベンゾフラニル、イソ ベンゾフラニル、ベンゾ （ｂもしくはｃ）チエニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キノリニル、イソキ ノリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、フタラジニルおよびキナゾリニル かならなる群から選択され、そして置換アリール基は、ハロ、トリフルオロメチ ル、ニトロ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ₁〜 Ｃ₁₈アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノ、ベンジルアミノおよびＣ₁ 〜Ｃ₁₈アルキルベンジルアミノからなる群から選択される置換基を有する前記ア リール基であり； Ｒ²は水素、Ｃ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒドロカルビル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆アルキルＣ₁〜Ｃ₅アルキレンω−カルボキシレート、ω−トリ（Ｃ₁〜Ｃ₄ アルキル／フェニル）シリルＣ₂〜Ｃ₄アルキレン、単糖および二糖からなる群か ら選択され、またはOR²がともにＣ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒ ドロカルビルカルバメートを形成し； Ｒ⁷はメチル（CH₃）またはヒドロキシメチル（CH₂OH）であり； ならびに ＸはＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシ、Ｃ₂〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ、ヒドロキシ 、ハロまたはアジドからなる群から選択される。 インヒビターに対する上記の選択は医薬組成物にも保持される。またこの発明 はさらにラクトースアンモニウム塩（lactosammonium salt）の製造方法に関す る。この方法には以下のステップが含まれている。すなわち （ａ）ラクツロースを、窒素原子がベンジルアミンのような還元によって脱離 可能な保護基に結合しているモノ置換アンモニア誘導体である第一級アミンと混 合して反応混合物を生成させる。この第一級アミンは反応物および溶媒もしくは 一次溶媒の両者として働き、ラクツロースのモル量の約２〜約10倍の量で存在し 、好ましくは 約４〜約８倍の過剰モル量で存在している。 （ｂ）上記反応混合物を、約10℃〜約60℃の温度、好ましくは約室温〜約50℃ で、対応するラクツロースＮ−グリコシドが生成するのに充分な期間維持する。 この維持時間は、最高の収率を求めて約２日間から約７日間まで変えることがで きる。 （ｃ）生成したラクツロースＮ−グリコシドを、メタノールのようなＣ₁〜Ｃ₃ アルコール溶媒中、約10〜約30℃の温度でpKa値が約2.5〜5.0のカルボン酸の当 量までの量と反応させて、アミンに結合された還元によって脱離可能な保護基を 有するアミン保護ラクトースアンモニウム塩中にラクツロースＮ−グリコシドを 転位させる。そのラクツロースＮ−グリコシドは約0.1Ｍ〜約飽和レベルで存在 していてもよい。ならびに （ｄ）次に該保護基は、前記アミン保護ラクトースアンモニウム塩から水素添 加分解反応によって還元されて除去され、ラクトースアンモニウム塩が生成する 。この塩は好ましくは回収する。 この発明のオリゴ糖部分を述べるのに用いられる命名法は通常の命名法にした がっている。個々の単糖に対する標準の略語を用いる。例えば２−Ｎ−アセチル グルコサミンはGlcNAcで表され、２−Ｎ−アセチルガラクトサミンはGlcNAcであ り、フコースはFucであり、フルクトースはFruであり、ガラクトースはGalであ り、グルコースはGlcであり、そしてマンノースはManである。特に断わらない限 り、フコース（Ｌ−異性体）以外の糖ははすべて環の立体配置がＤ−異性体（例 えばピラノースまたはフラノース）である。環の形態の二つのアノマーはαとβ で表される。 単糖は一般にグリコシド結合で結合して、オリゴ糖および多糖を生成する。環 の面に対する結合の配向はαとβによって示される。二つの単糖間の結合を生成 する特定の炭素原子も記載される。した がってガラクトースのＣ−１とグルコースのＣ−４との間のβグルコシド結合は Galβ１→４Glcで表される。Ｄ−糖類（例えばＤ−GlcNAc，Ｄ−Gal，Ｄ−NeuAc およびＤ−Man）の場合、呼称のαはＣ−１（NeuAcのＣ−２）に結合しているヒ ドロキシルがその際の面の下方にあることを意味し、βは該ヒドロキシルが環の 面の上方にあることを意味する。Ｌ−フコースの場合、αの呼称は、ヒドロキシ ルが環の上方にあることを意味し、βはヒドロキシルが環の下方にあることを意 味する。発明の詳細な説明 Ａ．化合物類 この発明は下記の構造式Ａで表されるSLe^x類似化合物に関し、この構造式Ａに は、シアリルLe^xの類似体である式Ｉの五糖化合物、ならびに式IIとIIIでそれぞ れ表される該五糖化合物の五糖および四糖の前駆体が含まれている。構造式Ｉで 表される化合物は、セレクチン細胞表面受容体によって仲介される細胞接着を阻 害する。 上記構造式において、 Ｚは、Ｒ³，Ｒ⁴およびＲ⁵（Ｒ^3-5）の種類によって、式IIIの化合物を定義す るときは水素（Ｈ）もしくはＣ₁〜Ｃ₆アシルであり、または式ＩもしくはIIの化 合物を定義する場合は、ヒドロキシル基が遊離しているかまたは保護基（ベンジ ルもしくはＣ₁〜Ｃ₆アシル）で保護されているα−Ｌ−フコシルであり； ＹはＣ（Ｏ），SO₂，HNC（Ｏ），OC（Ｏ）およびSC（Ｏ）からなる群から選択 され； Ｒ¹はアリール、置換アリールおよびフェニルＣ₁〜Ｃ₃アルキレンの基からな る群から選択され、そのアリール基は、一つの五員もしくは六員の芳香環、縮合 五員／六員芳香環または二つの縮合六員芳香環を有し、その環は、ヒドロカルビ ル、モノオキサヒドロカルビル、モノチアヒドロカルビル、モノアザヒドロカル ビルおよびジアザヒドロカルビルの環からなる群から選択され、そしてその置換 アリール基は、ハロ、トリフルオロメチル、ニトロ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキル、Ｃ₁〜 Ｃ₁₈アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アル キルアミノ、ベンジルアミノ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₈アルキルベンジルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈チオアルキルおよびおよびＣ₁〜Ｃ_{1 8} アルキルカルボキサミド基からなる群から選択される置換基を有する前記アリ ール基であり、またはR¹Yがアリルオキシカルボニルもしくはクロロアセチルで あり； Ｒ²は水素、Ｃ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒドロカルビル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆アルキルＣ₁〜Ｃ₅アルキレンω−カルボキシレート、ω−トリ（Ｃ₁〜Ｃ₄ アルキル／フェニル）シリルＣ₂〜Ｃ₄アルキレン、単糖および二糖からなる群か ら選択され、またはOR²がともにＣ₁〜Ｃ₈の直鎖状、分枝鎖状または環式のヒド ロカルビルカルバメートを形成し； Ｒ³は水素またはＣ₁〜Ｃ₆アシルであり； Ｒ⁴は水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルまたはベンジルであり； Ｒ⁵は水素、ベンジル、メトキシベンジル、ジメトキシベンジルおよびＣ₁〜Ｃ₆ アシルからなる群から選択され； Ｒ⁷はメチル（CH₃）またはヒドロキシメチル（CH₂OH）であり； ならびに ＸはＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシ、Ｃ₂〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ、ヒドロキシ 、ハロおよびアジドからなる群から選択される。 上記のようにＹはいくつかの基のうちの一つでもよい。ＹがＣ（Ｏ）の場合、 R¹Yはアシル置換基なので糖アミンの窒素原子とでアミドが形成される。ＹがSO₂ の場合、R¹Yはスルホニル置換基を形成するので糖アミンの窒素原子とでスルホ ンアミドが形成される。ＹがHNC（Ｏ）の場合、R¹Yはアミノカルボニル置換基を 形成するので糖の窒素原子とで尿素置換基が形成される。Ｙがオキシカルボニル 〔OC（Ｏ）〕である場合、糖アミンの窒素とでウレタン置換基が形成され、一方 Ｙがチオカルボニル〔SC（Ｏ）〕である場合チオウレタンが形成される。基Ｙは カルボニル基〔Ｃ（Ｏ）〕が好ましい 。 またR¹Y基はアリルオキシカルボニル基またはクロロアセチル基でもよい。ア リルオキシカルボニル基のR¹Yは容易に置換できるＲ¹基を提供するので式IIIの 化合物にとって特に好ましい。アリルオキシカルボニルまたはクロロアセチル基 のR¹Yは式IIIの化合物にのみ存在し、式Ｉ，II，Ａ，ＢまたはＣ（式ＢとＣは後 で示す）のいずれの化合物にも存在しない。 先に述べたように、Ｒ¹基はアリール基または置換アリール基でもよい。目的 とするアリール基は、一つの五員もしくは６員の芳香環、五員および６員（五／ 六員）の縮合環または二つの縮合６員芳香環を含有するアリール基であり、そし てフェニルおよびナフチルのようなヒドロカルビル基、ならびに環の炭素原子を 置換する一つの酸素もしくは一つの硫黄もしくは一つ以上の窒素の原子を有する ヒドロカルビル基（モノ−またはジ−アザヒドロカルビル基）を含有している。 代表的なアリール基としては、フリル、チエニル、ピリジル、ピラジニル、ベン ゾフラニル（ベンゾ〔ｂ〕フラニル）、イソベンゾフラニル（ベンゾ〔ｃ〕フラ ニル）、ベンゾチエニル（ベンゾ〔ｂ〕チエニル）、イソベンゾチエニル（ベン ゾ〔ｃ〕チエニル）、ピリミジニル、ピリダジニル、キノリニル、イソキノイル 、キノキサリニル、ナフチリジニル、フタラジニルおよびキナゾリニルがある。 これらのアリール基は各々未置換でもよく、または各々、ハロ、トリフルオロメ チル、ニトロ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ₁ 〜Ｃ₁₈アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルベン ジルアミノおよびＣ₁〜Ｃ₁₈アルキルカルボキサミドからなる群から選択される 置換基をもっていてもよい。 上記の置換基および置換のアリール基Ｒ¹は当該技術分野で公知 であり、各々公知の化学反応を用いて糖の窒素原子に結合させることができる。 したがって、以下の考察は、該アリール基の代表例であるアリールヒドロカルビ ル基、フェニルおよびナフチルに集中して行うが、他の列挙したアリール基およ び置換アリール基Ｒ¹は実質的に類似の化学反応で利用できると解される。 Ｒ¹がフェニルの場合、塩化ベンゾイルまたは安息香酸無水物を使用して好ま しいアミド結合を形成することができる。ベンゼンスルホニルクロリドのような ベンゼンスルホニルハロゲン化物は、ＹがSO₂の場合、同様に使用できる。ＹがH NC（Ｏ）の場合、イソシアン酸フェニルが使用される。ＹがOC（Ｏ）の場合はク ロロギ酸フェニルが使用され、一方ＹがSC（Ｏ）の場合はクロロチオギ酸フェニ ルが使用される。 具体的に用いられる置換フェニル基Ｒ¹は、置換基で環のいずれの位置が置換 されていてもよいが、メタおよびパラの位置が好ましいフェニル基である。モノ 置換フェニル基Ｒ¹はジ置換基より好ましい。 用いられるハロ置換基としてはフッ素、塩素、臭素およびヨウ素の基があり、 ｐ−フルオロフェニル、ｍ−クロロフェニル、ｍ−ヨードフェニル、ｐ−ブロモ フェニルおよびｏ−フルオロフェニルが代表例である。例えば３，４−ジクロロ フェニル、３，５−ジクロロフェニル、２−クロロ−４−フルオロフェニルおよ び３−ブロモ−４−フルオロフェニルのようなジハロ置換フェニル基Ｒ¹が用い られる。 Ｒ¹のフェニル上の置換基として存在するＣ₁〜Ｃ₁₈アルキル基の代表例は、直 鎖状および分枝鎖状のアルキル基であり、例えばメチル、エチル、プロピル、イ ソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル 、ノニル、デシル、ドデ シル、テトラデシル、ヘキサデシルおよびオクタデシルがある。Ｃ₁〜Ｃ₁₂アル キル基が好ましく、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル基が特に好ましく、メチルが最も好ましい 。代表的な好ましいＲ¹基としては、ｏ−，ｍ−およびｐ−トリル（メチルフェ ニル）およびｐ−ｔ−ブチルフェニルの基ならびに３，４−ジメチルフェニル基 と３，５−ジメチルフェニル基がある。 代表的なＣ₁〜Ｃ₁₈アルコキシ基はエーテルを含有するＣ₁〜Ｃ₁₈アルキル基ま たは特に好ましくはＣ₁〜Ｃ₆アルキル基である。この場合メトキシが好ましい。 代表的な好ましいＲ¹基としては、ｏ−，ｍ−およびｐ−アニシル（メトキシフ ェニル）ならびに３，４−ジメトキシフェニルおよび３，５−ジメトキシフェニ ルがある。 ニトロフェニル基Ｒ¹は、３−もしくは４−ニトロベンゾイルクロリドを用い てアシル化することによって容易に製造することができる。３，４−および３， ５−ジニトロベンゾイルクロリドによるアシル化によって、対応する３，４−お よび３，５−ジニトロフェニル基Ｒ¹が得られる。３−または４−トリフルオロ メチルベンゾイルクロリドを用いてアミドを生成させることによって、同様に３ −または４−トリフルオロメチルフェニル基Ｒ¹が得られる。 置換フェニル基Ｒ¹も、アミノ；モノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜 Ｃ₁₈アルキルアミノ、ベンジルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルベンジルアミノまた はＣ₁〜Ｃ₁₈アルキルカルボキサアミドの置換基を含有していてもよい。なおＣ₁ 〜Ｃ₁₈アルキル置換基はさきに考察したものと同じである。 アミノフェニル基Ｒ¹は、上記のように、アミド結合を形成させた後、ニトロ 基を接触還元することによって、先に述べた対応するニトロフェニル基Ｒ¹から 最も容易に製造することができる。した がって、例えば、３−または４−ニトロベンゾイルクロリドを用いてアミド結合 を生成させ、パラジウム／炭で還元すると対応する３−または４−アミノフェニ ル基Ｒ¹が形成される。同様に３，４−または３，５−ジニトロベンゾイルクロ リドを用いると、還元後、対応する３，４−または３，５−ジアミノフェニル基 Ｒ¹が得られる。 いくつかのジ−Ｃ₁〜Ｃ₆アルギルアミノ安息香酸類、例えば４−ジエチルアミ ノ安息香酸と、３−および４−ジメチルアミノ安息香酸とは商業的に購入するこ とができ、これらを用いて、Ｒ¹含有アミドを生成させるための適切なハロゲン 化ベンゾイル、ベンゾイル無水物を製造することができる。残りのジ−Ｃ₁〜Ｃ_{1 8} アルキルアミノ安息香酸と、二つのジアルキルアミノ基を含有する化合物とは 、公知のアルキル化法を用いて、やはり市販されている対応するアミノ安息香酸 類またはジアミノ安息香酸類から製造することができる。 モノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノ基Ｒ¹は、その残留窒素原子価が、酸によって 除くことができるｔ−BOC、または所望によりパラジウム／炭を用いて水素化す ることによって除くことができるベンジル基のような容易に脱離可能な保護基で 保護されている、対応するモノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノベンゾイルハライド から製造することができる。したがって、アシル化は、Ｎ−ベンジル−Ｎ−プロ ピルアミノベンゾイルクロリドを用いて行うことができ、そのＮ−ベンジル基は 接触水素化反応によって除去され、モノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノフェニル基 Ｒ¹が得られる。勿論ベンジル基は除く必要がなくその結果Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルベ ンジルアミノ基が得られる。 上記のフェニルもしくは置換フェニルの置換基は各々、公知のア ミド形成反応によって製造することができる。代表的な反応では、適切なベンゾ イルハライドまたはベンゾイル無水物例えばｐ−フルオロベンゾイルクロリドま たは安息香酸無水物と、以下に詳細に述べるように他の部分は保護されている糖 の保護されてないアミン基とが反応する。 １−および２−の両方のナフチル基Ｒ¹が考えられるが２−ナフチルが特に好 ましい。またこれらの化合物は、上記のような標準のアミド形成法を用いて製造 することができる。例えば２−ナフトイルクロリドを上記のような適切な糖のア ミンと反応させて行われる。 類似の置換基がオキサ−、チア−、アザ−およびジアザ−ヒドロカルビルアリ ール基に存在していると解すべきである。例えば、二つのフロ酸クロリド、二つ のチオフエンカルボキシルクロリド、三つのピリジンカルボキシルクロリド、キ ナルジン酸クロリド、３−キノリンカルボン酸クロリド、２−キノキサロイルク ロリドなどを使用してアシル化反応を行うことができる。 同様に、ＹがSO₂の場合、対応するスルホニルハライドが用いられる。例えば 、ベンゼンスルホニルクロリド、トルエンスルホニルクロリド、８−キノリンス ルホニルクロリド、１−もしくは２−ナフタレンスルホニルクロリドなどを使用 してスルホンアミドを生成させることができる。 ＹがHNC（Ｏ）の場合、さきに述べたカルボン酸に対応するイソシアネートが 便利な反応物である。このような誘導体は酸ハライドから容易に製造することが できる。すなわち酸ハライドをアジドと反応させてアシルアジドを生成させ、そ のアシルアジドをクルチウス転位反応に付し、加熱してイソシアネートがえられ る。 ＹがOC（Ｏ）またはSC（Ｏ）の場合、ヒドロキシルもしくはメル カプトで置換されたアリール基Ｒ¹をホスゲンと反応させて、クロロフォーメー トまたはクロロチオフォーメートを形成させ、これを糖アミンと反応させてＲ¹ にウレタンもしくはチオウレタンの結合を生成させることができる。 フェニルＣ₁〜Ｃ₃アルキレンＲ¹基は、好ましくは末端ヒドロカルビル基の炭 素がフェニル基でそれ自体置換されているＣ₁〜Ｃ₃アルキレン基である。したが ってこのR¹C（Ｏ）基は２〜４個の炭素原子を含有する連鎖に連結されたフェニ ル環を含有している。代表的なＣ（Ｏ）Ｒ¹アルキレン基としては、２−フェニ ルアセトイル、３−フェニルプロピオニルおよび４−フェニルブタノイル〔それ ぞれφCH₂C（Ｏ）、φCH₂CHC（Ｏ）およびφ（CH₂）₃Ｃ（Ｏ）であり、但しφ＝ フェニルである〕がある。これらの化合物は、適当な酸ハライドまたは酸無水物 と糖アミンとを上記のように反応させることによって製造することができる。水 素およびパラジウム／炭触媒を用いる接触還元反応を利用して、不飽和のヒドロ カルビル連鎖から飽和のアルキレン基を生成させることができるが、飽和のヒド ロカルビル連鎖が好ましい。 Ｒ²基は糖の環系とでβ−グルコードを形成する。そのグリコシド結合は、単 純なＣ₁〜Ｃ₁₈ヒドロカルビルアルコールから、ω−ヒドロキシカルボン酸エス テルから、ω−ヒドロキシル化シリル化アルキル基、または単糖もしくは二糖か ら形成させることができ、またはOR²がともにＣ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状また は環式のヒドロカルビルカルバメートを形成する。エチル基のようなＣ₁〜Ｃ₆ヒ ドロカルビル基、ベンジル基、または３−ガラクトシルのような単糖が特に好ま しい。またＲ²は水素でもよい。 単純な前駆アルコール基から形成される代表的なＲ²基としては、Ｃ₁〜Ｃ₁₈の 直鎖状、分枝鎖状または環式のヒドロカルビル基が 挙げられる。このような基の例は、好ましくは前記のＣ₁〜Ｃ₆アルキル基であり 、ならびにそれらの不飽和の対応物、例えばアリル、３−ブテニル、３−ブト− ３−エニルおよびブト−３−イニルがあり、そして長いヒドロカルビル基、例え ばベンジル、４−メチルシクロヘキシル、デカヒドロナフチル、ノニル、デシル （カプリル）、ドデシル（ラウリル）、ドデシ−７−エニル、ミリスチル、パル ミチル、ステアリル、オレイル、リノレイル、リノレニルおよびリシノレイルで ある。 Ｃ₁〜Ｃ₁₈ヒドロカルビルカルバメートは、先に述べたＣ₁〜Ｃ₁₈ヒドロカルビ ル基に対応するイソシアネートを、還元性末端糖のヒドロキシル基と反応させる ことによって製造される。例えば、末端グルコシル単位の１−ヒドロキシル基を エチルイソシアネートと反応させて対応するエチルカルバメート（ウレタン）を 生成させることができる。このカルバメートのカルボニル基は、ヒドロカルビル の炭素原子の数には含まれていない。 Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルＣ₁〜Ｃ₅−アルキレンω−カルボキシレート基Ｒ²はＣ₂〜Ｃ₆ ω−カルボン酸のＣ₁〜Ｃ₆アルキルエステルである。このようなエステルは、 そのヒドロキシル基を用いてグリゴシド結合を形成している前駆ω−ヒドロキシ カルボン酸エステルから製造される。代表的なω−ヒドロキシカルボン酸エステ ルとしては、メチル２−ヒドロキシアセテート、エチル３−ヒドロキシプロピオ ネート、ｔ−ブチル４−ヒドロキシブチレート、ヘキシル５−ヒドロキシペンタ ノエートおよびメチル６−ヒドロキシヘキサノエートがある。したがってそのヒ ドロキシル基とカルボキシル基はその連鎖の末端にあるので１〜５個のメチレン 基によって隔てられている。メチル６−ヒドロキシヘキサノエートが好ましい。 ω−トリ（Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル／フェニル）シリルＣ₂〜Ｃ₄ア ルキルＲ²基は、その置換シリル基が、ヒドロキシル基とは反対側の、連鎖の末 端（ω位）にある対応する前駆アルコールから製造される。当該技術分野で公知 のように、置換シリル基としては、Ｃ₁〜Ｃ₄アルキルおよびフェニル基との多く の組合わせがあり、例えばトリ−Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄アルキルフェ ニル、Ｃ₁〜Ｃ₄アルキルジフェニルおよびトリフェニルがある。代表的な置換シ リル基としては、トリメチルシリル、トリフェニルシリル、ジ−ｔ−ブチルメチ ルシリル、ジメチルフェニルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルなどがある。 代表的な単糖および二糖としては、３−および４−グリコシル（３／４Glc） ；３−および４−ガラクトシル（３／４Gla）〔３−ガラクトシル基が特に好ま しい〕；３−および４−Ｎ−アセチルグルコシル（３／４GlcNAc）；２−，３− ，４−および６−マンノシル（２／３／４／６Man）；ならびに３−および６− Ｎ−アセチルガラクトシル（３／６GalNAc）とGalβ１→４GlcNAcがある。単糖 はそれ自体、Ｒ²基の糖以外のすべてを含む基Ｒ⁶とグリコシド結合を形成するこ とができる。したがってＲ⁶は単糖もしくは二糖以外のＲ²である。 還元性末端基３Gal βOR⁶を有する、式Ａの特に好ましい化合物の構造式を、 下記の構造式Ｂ（式中、Ｘ，Ｙ，ＺおよびＲ^1-4，Ｒ⁶およびＲ⁷は前記定義に同 じ）に示す。 式Ｂの特に好ましい化合物は、下記式Ｃで表される構造（式中、Ｘ，Ｙ，Ｒ¹ ，Ｒ⁶およびＲ⁷は前記開示に同じ）を有する、細胞 接着のインヒビターである。 基Ｒ²またはＲ⁶によって形成されるβ−グルコシル結合は、糖類と他のＲ²（ Ｒ⁶）基の前駆体の両者の公知の有機化学反応によって製造することができ、こ の反応は、炭酸銀（Ag₂CO₃）または銀トリフラートの存在下、１−ハロ糖と、所 望のＲ²（Ｒ⁶）基前駆アルコールのヒドロキシルを反応させるか、および糖類に 対するグリコシルトランスフェラーゼのような酵素的手段で行うことによって行 われる。 目的とするＲ³基は、水素またはＣ₁〜Ｃ₆アシルであり、これはＣ₁〜Ｃ₆アシ ルカルボン酸エステルの酸の部分である。Ｃ₁〜Ｃ₆アシル基は式IIの化合物にと って好ましい。代表的なＣ₁〜Ｃ₆アシル基としては、ホルミル、アセチル、プロ ピオニル、ブタノイル、イソブタノイル、ベンタノイルおよびヘキザノイルがあ る。アセチル基が好ましい。糖のヒドロキシル基のアセチル化は公知であり、適 切な酸ハライドまたは酸無水物を用いて行うことができる。 式Ａの目的とするＲ⁴基は水素、そのアルキル基は先に記載したのと同じＣ₁〜 Ｃ₆アルキル基またはベンジル基である。Ｒ⁴基はその結合されている酸素原子と ともにエステルのアルコール部分を形成している。メチル基が好ましい。Ｒ⁴の エステルは、ジアゾメタンのような試薬を用いてシアリル化糖を製造した後、シ アル酸基を付加する前に標準の方法で製造するか、または後記図式２で考察 するようにラクトンと適正なアルコールを反応させることによって製造する。 式IIIの化合物のＲ⁴基はプロトン、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルまたはベンジル基でもよ いがＣ₁〜Ｃ₆アルキルが好ましい。Ｒ⁴がプロトンとして存在している場合、そ のプロトンは医薬として許容されるカチオン（Ｍ）例えばアンモニウム、ナトリ ウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどによって置換できると解すべき である。Ｒ⁴のプロトンもしくは他のカチオンは、式ＩおよびＣのようなこの明 細書の構造式には一般に示していない。というのはシアリルカルボン酸は、式Ｉ またはＣのインヒビターが利用される約7.2〜7.4の生理的pH値では通常イオン化 しているからである。したがってシアリルカルボキシル基はこの明細書ではカル ボキシレートとして示すことが多い。 基Ｒ⁵はさきに述べたように、水素、ベンジル、メトキシベンジル（３−また は４−メトキシベンジルが好ましい）、ジメトキシベンジル例えば３，４−もし くは３，５−ジメトキシベンジル、またはＣ₁〜Ｃ₆アシル基である。フコシル基 が有機化学合成で添加される場合、ベンジル基が一般に使用される。 水素以外の基Ｒ³，Ｒ⁴およびＲ⁵は、上記式Ｂ、IIおよびIIIの化合物のような 中間体の合成中に用いられる保護基である。Ｒ³＝Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｈ（水素）の場合 、式IIの化合物は式Ｉの化合物になり、一方式Ｂの化合物は、Ｚがフコの場合式 Ｃの化合物になる。同様に、ＺがフコでかつＲ³＝Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝水素の場合、式Ａ の化合物は式Ｉの化合物になる。 置換基Ｘは、Ｃ₁〜Ｃ₆アシルオキシ基でもよく、すなわち先に述べたように、 その位置における前駆ヒドロキシル基のＣ₁〜Ｃ₆アシルエステル、Ｃ₂〜Ｃ₆ヒド ロキシルアシルオキシ基、ヒドロ キシル基、ハロ基；またはアジド基である。代表的なＣ₁〜Ｃ₆アシル基はすでに 述べたとおりであり、そしてＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシ基は、アシル基のカルボニル 炭素原子に結合した追加の酸素原子をさらに含有するＣ₁〜Ｃ₆アシル基である。 Ｃ₂〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ基は、置換基のヒドロキシル基をさらに含有 する上記のＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシ基である。代表的なＣ₂〜Ｃ₆ヒドロキシアシル オキシ基としては、ヒドロキシ酢酸、乳酸、３−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキ シイソ吉草酸および２−ヒドロキシカプロン酸の基がある。置換基Ｘは、以下に 述べるように、シアリル化とフコシル化の両者が酵素によって行われない場合は 、一般にＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシまたはＣ₂〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ以外の 基である。 置換基Ｘを含有するシアル酸誘導体の合成については、1992年10月１日に公開 された国際特許願公開第WO92/16640号に開示されている。糖類をシアリル化する のにこれらの化合物を使用することもこの刊行物に開示されている。 基Ｒ⁷はメチルまたはヒドロキシメチルであり、その結果、示されたカルボニ ル基〔Ｃ（Ｏ）〕とともに、Ｒ⁷はＮ−アセチル基またはＮ−ヒドロキシアセチ ル基を形成する。どちらかのＲ⁷基を含有するシアル酸誘導体は、この明細書で 述べるように、酸素によるシアリル化に用いることができる。 構造式ＩとＣで表わされる特に好ましいインヒビターの化合物を、その化合物 番号、すなわち化合物17，30〜38および43〜51と共に以下に示す。 Ｂ．化合物の合成 さきに述べたSLe^x類似体の化合物は多数の方法で製造することができる。した がって、この明細書で例示するように、完全な酵素による合成を実施することが でき、有機化学の方法だけを用いる合成を使用することができ、そして有機合成 および酵素による合成の両者を混合したものを利用できる。 有機合成と酵素による合成の相違を示す点は、水ベースの反応媒体中に一つ以 上の酵素が存在していること（酵素による合成）に対して、実質的に水を含有せ ずに、有機溶媒例えばアセトニトリル、 メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシ ド（DMSO）、ベンゼン、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン（THF ）などを用いる反応媒体と組合わせた酵素が存在しないこと（有機合成）である 。 これらの方法のどちらが利用されるかにかかわらず、ラクトースアミン、ガラ クトースおよびグルコサミンからなる糖糖を、合成のある時点で結合させねばな らない。幾分予想外のことであるが、ラクトースアミンのGalβ１→４GlcN結合 も、目的とする化合物を合成する際に、生成させることが一層難かしい結合の一 つである。 ラクトースアミンは文献に報告されている化合物であるが容易には入手できな い。とはいっても、ラクトースアミンまたはラクトースアミンの誘導体は、所望 の化合物を合成するのに用いる優れた出発原料である。 ラクトースアミンは容易には入手できないが、ラクツロースすなわちアミン基 を含有していないがラクトースおよびラクトースアミンに関連するGalβ１→４F ru結合を含有するケトースは市販されている。ラクツロースは、そのGalβ１→ ４結合が容易に形成されるので、ラクトースアミンの一つの所望の合成を行うの に用いる出発原料を提供する。酸付加塩としてのラクトースアミン（化合物３） の合成を、全般的にそして具体的にそれぞれ下記の図式１と1Aに、ペルアセチル Ｎ−フタルイミドラクトースアミン（化合物５）およびペルアセチルＮ−フタル イミドラクトースアミンβクロリド（化合物６）の合成として示す。両図式に番 号を付けた化合物は同じ化合物である。 したがって、ラクツロースを、還元によって除去可能な保護基が結合している 窒素原子を有するアンモニア誘導体であり、反応物および溶媒としての第一級ア ミン（ベンジルアミン）とそのまま反応させて、対応するＮ−グリコシドすなわ ちラクツロースＮ−ベンジルグリコシド（Ｂ_n＝ベンジル；化合物１）を製造し た。メタノール中の化合物１と、pKa値が約2.5〜約5.0の有機カルボン酸（氷酢 酸）の化学量論的量との反応によって、Ｎ−ベンジルラクトースアンモニウムア セテート（Ｎ−benzyllactosammonium acetate）（化合物２）を50〜55％の収率 で得た。パラジウム／炭（Pd／ｃ）を用いて上記メタノール溶液を水素化分解す ることによってラクトースアンモニウムアセテート（化合物３）を製造した。 その外の還元によって除去できる保護基で保護されたアミン類をベンジルアミ ンの代わりに用いることができることは明らかである。例えばモノ−およびジ− メトキシベンジルアミンは、糖と反応した後、モノ−およびジ−メトキシベンジ ル基が水素化分解反応によって除去できる点で、還元で除去できる保護基で保護 されたアンモニア誘導体とみなすことができる。アリルアミンと同様に使用する ことができ、このアリル保護基は、溶媒としてのTHF中で、ポリメチルヒドロシ ロキサン（PMSH）およびパラジウムテトラキストリフェニルホスフィン〔Pd（PP h₃）₄〕との反応で除去される。 したがって、ベンジル基（図式1A）が図式１ではＲ^Aとして使用されているが 、モノメトキシベンジル、ジメトキシベルまたはアリルの基がＲ^Aとして使用で きると解すべきである。 上記考察および図式１と1Aに示す反応は、ラクツロースからラクトースアミン またはラクトースアンモニウム塩を製造する方法を示している。この方法によっ て、ラクツロースは、還元で除去できる保護基が結合している窒素原子を有する モノ置換アンモニア誘導体 である第一級アミンと混合して反応混合物を生成する。その保護されたアンモニ ア誘導体は、この方法では反応物および溶媒の両方としての働きをする。 その保護されたアンモニア誘導体（すなわち第一級アミン）は、利用されるラ クツロースのモル量の２倍〜約10倍の過剰モル量で存在している。この第一級ア ミンは好ましくは約４〜約８倍の過剰モル量で存在している。 さきに述べたように、還元によって除去できる他の保護基を含有する第一級ア ミンも用いられる。したがって、アリルアミンおよびｐ−メトキシベンジルアミ ンを用いてラクツロースＮ−グリコシドを製造し次に対応するＮ−置換ラクトー スアミンに転位させることに成功した。 上記のようにして調製した反応混合物を、対応するラクツロースＮ−グリコシ ドが生成するのに充分な期間、すなわち該第一級アミンがラクツロースの２−ヒ ドロキル基を置換するのに充分な期間、約10℃〜約60℃の温度に保持した。周囲 の室温（約20℃）〜約50℃の温度が好ましい。 その保持期間は、第一級アミンの過剰モル量、保持温度、および所望のラクツ ロースＮ−グリコシドの量のようないくつかの変数の関数であり、生成物の所望 量が少ない場合、温度を低くしかつ第一級アミンの量を少なくして約８時間〜約 ２週問の範囲内にある。例えば４〜7.5モル過剰の第一級アミン（この場合ベン ジルアミン）を使用した場合、室温で７日間保持した後、反応が完了したが、２ 倍過剰のベンジルアミンを同条件下で使用した場合、同じ時間で、50％未満しか 反応が完了しなかった。保持温度を50℃まで上げると、４倍過剰のアミンを用い た反応は２日（48時間）後に完了したが、反応温度を70℃にしたところ分解が起 こった。 塩化亜鉛、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛またははトリフルオロメタンス ルホン酸マグネシウムのようなルイス酸触媒が反応媒体中に存在すると、反応速 度が増大したため、7.5倍過剰のベンジルアミンを用いた反応が触媒なしで室温 で７日後に完了したのが、２日間（48時間）で完了した。トリフルオロ酢酸を触 媒として用いて同様の結果を得た。この場合の方が好ましい。 ラクツロースはメタノールを含むアルコール溶媒類には不溶性である。ラクツ ロースは熱DMF中に溶解することができかつ冷却後溶解したままである。上記触 媒も存在している場合、メタノールとDMFの両者は、第一級アミンに対して共溶 媒（cosolvent）として使用できる。例えばメタノールを共溶媒として用いた場 合、室温または50℃では反応は起こらなかった。しかし塩化亜鉛触媒を、４倍過 剰のベンジルアミンとともに、メタノールを共溶媒とした用いたとき、反応は室 温で48時間後に完了した。 上記のようにして製造されたラクツロースＮ−グリコシドは吸湿性なので、調 製後すみやかに使用される。そのＮ−グリコシドは、pKa値が約2.5〜5.0のカル ボン酸の約0.1当量から１当量まで（最高の収率を得るため）と、約10℃〜約30 ℃の温度でＣ₁〜Ｃ₃アルコール溶媒中で反応して、アミン基が上記の還元によっ て除去できる保護基で保護されているラクトースアンモニウム塩すなわちアミン の窒素原子に結合されている還元で除去可能な保護基を有するアミンが保護され たラクトースアンモニウム塩に転位する。 利用されるカルボン酸は、当該技術分野で公知のような多数の酸のいずれでも よい。例えば酢酸（pKa＝4.76）、ブロピオン酸（pKa＝4.88）、酪酸（pK₁＝4.8 2）、クロロ酢酸（pKa＝2.80）、メトキシ酢酸（pK₁＝3.52）などがある。氷酢 酸が好ましい。代表的なＣ₁〜Ｃ₃アルコール類としてはメタノール、エタノール 、プロ パノールおよびイソプロパノールがあるがメタノールが好ましい。反応温度は周 囲の室温が好ましい。 ラクツロースＮ−グリコシドの濃度は約0.1Ｍ〜実質的な飽和濃度の範囲でよ い。一般に利用される濃度は溶媒中約0.5〜1.5Ｍである。 次に該還元によって除去可能な保護基を除く。特にベンジルアミンまたはメト キシベンジルアミンが用いられている場合、パラジウム触媒を用いる水素化分解 反応が該保護基を除くのに好ましい方法である。アリルアミンが第一級アミンの 場合は、PMHSとPd（PPh₃）₄が用いられる。 上記の還元は、ラクトースアンモニウム誘導体に対して、任意の適切な溶媒中 で行うことができる。例えば水素化分解反応は酸性水または上記のようなＣ₁〜 Ｃ₃アルコール中で実施できる。PMHSとPd（PPh₃）₄は一般にTHFもしくは類似の 溶媒中で用いられる。 このようにして製造されたラクトースアンモニウム塩は一般に製造後回収され るが、使用される溶媒とその化合物にかされる用途によっては回収は必要でない 。ラクトース−アンモニウム塩を回収したい場合、そのアニオンは還元の場合用 いられる酸のアニオン型なので、クロマトグラフィーまたは沈澱法のような公知 の方法で得ることができる。遊離のラクトースアミンは、イオン交換クロマトグ ラフィーか、または中和してからその遊離塩基を適切な有機溶媒中に抽出するこ とによって、該アンモニウム塩から製造することができる。 上記水素化分解反応から得られた化合物３を含有するメタノール溶液または他 の適切な溶液を、次にNa₂CO₃のような塩基触媒の存在下、無水フタル酸（Phtho ）と反応させて、Ｎ−フタルアミド半酸（Ｎ−phthalamnde half-acid）、化合 物４を製造した。適切なアミド 半酸例えば化合物４が生成した後、メタノールのような反応性溶媒を除いた。次 にこの二糖のヒドロキシルを過アセチル化し、次いでそのフタルイミド環を閉じ て、出発原料から10％を超える収率で過アセチル化（Ａ_c）フタルイミド化合物 ５を得た。 ラクツロースからラクトースアンモニウム塩を得る別の合成法も考えられる。 この場合、ラクツロースは、ステンレス鋼製オートクレーブ中で、溶媒として 液体アンモニアを用い、当モル量の酢酸アンモニウムと反応させる。なおこの液 体アンモニアは−78℃に冷却されたオートクレーブ中に加えられる。得られた反 応混合物の温度を０℃から約80℃まで昇温させ、そして利用される温度および所 望の転化率によって、約５時間〜約５日間保持する。この反応によってラクツロ ースアミノグリコシドが生成する。 アンモニアと酢酸アンモニウムを除いた後（後者は一般に減圧下で除去される ）、得られたアンモニアを含有しない物質を、先に述べたのと同様にカルボン酸 で処理してラクトースアンモニウム塩例えば化合物３を生成させる。またこのラ クトースアンモニウム塩を上記したのと同様に処理して化合物５を製造する。第 一反応ステップで反応温度35℃および反応時間24時間を用いた場合、化合物５の β−アノマーを、第一結晶化で、3.8％の全収率で回収した。 この方法を用いると化合物５の収率は先に述べた方法より小さくなったが、こ の方法は、その方法に用いたアミン保護基を還元除去する必要がない。その還元 に用いられるパラジウム含有触媒は、これらの合成に用いられる最も高価な試薬 である。液体アンモニアではなくてメタノール性アンモニアを溶媒として用いて オートクレーブを使用する必要をなくすことができることも分かっている。 図式１に示す化合物５のアミンはＲ^BとＲ^Bの基に結合され、こ の基は示された窒素原子とともに、化合物５の代表的なフタルイミド（Phth）の ようなＣ₄〜Ｃ₈環式イミドを形成する。無水コハク酸、無水マレイン酸、モノ− およびジ−メチルコハク酸の無水物およびシトラコン酸無水物も類似のイミドを 製造するのに使用することができ、その結果Ｒ^BとＲ^Bは窒素原子とともに対応す るイミドを形成することが分かる。−NR^BＲ^B基によって形成される環式イミドは 、酢酸基のようなｏ−アシル基が除去される条件下では安定であるが、ヒドラジ ンによって容易に除去することができるアミン保護基を提供する。また、酸無水 物を使用する必要はなく、メチルフタロイルクロリドのようなＣ₁〜Ｃ₆アルキル 半エステルハライドで置換できることも分かっている。 化合物５はβ−アノマーとして示してある。そのα−アセテートも生成される が、所望のβ−アセテートの収率は、化合物５が得られた母液を濃縮して泡状物 とし、これをDMFに再溶解し、次にヒドラジニウムアセテートと反応させて、酢 酸基を除きβ−OHアノマーを生成させることによってほとんど２倍にすることが できる。通常の抽出法と乾燥によって反応生成物を単離した後、その乾燥された 材料をピリジンに溶解し、そのピリジン溶液を過剰の無水酢酸で処理し、反応さ せ、さらに抽出して、追加の8.3％の全収率の化合物５を得た。化合物５の出発 材料に対する最終収率は8.7％であった。 室温でジクロロメタン中にて化合物５をAlCl₃と反応させたところ化合物６が 実質的に定量的収率で得られた。 後記の図式２で、化合物６すなわちペルアセチルＮ−フタルイミドラクトース アミンβ−クロリドの、充分に保護されたシアリル化四糖の化合物13への転換を 説明する。すなわち化合物６をステップａで、モレキュラーシーブ、コリジンお よび銀トリフルオロメタン スルホネート（トリフラート）の存在下、溶媒としてジクロロメタンを用いて、 化合物９と、周囲温度で２時間反応させて（これらの合成は実施例で考察する） 対応する三糖を製造する。その充分に保護された三糖を第一にステップｂで、80 ％の酢酸水溶液にて２時間80℃で処理して末端のGal単位の４位と６位のベンジ リデン保護基を除去した。次にステップｃで、ヒドラジン水和物を、回収され部 分的に脱保護された三糖と還流下17時間反応させて、フタルイミド基とアセチル 基を除去して完全に脱保護された三糖を製造した。次にステップｄで、上記の脱 保護された三糖を、メタノール：水（５：１）中でジアリルピロカルボネートと 反応させて化合物10（式中ALはアリルカルバモイル基である）を得た。 Ｒ²が、図式２の合成で記載されているように、グリコシドではなくてベンジ ルのような好ましいＣ₁〜Ｃ₁₈ヒドロカルビル基である場合、グリコシル化のス テップａとｂは省略して、Ｒ²が単糖または二糖ではない式Ａ，ＩまたはIIの四 糖が得られる。 次に化合物10を、水性緩衝液中、α−（２，３）−シアリルトランスフェラー ゼ（EC２．４．99．６）およびいくつかの他の酵素を用いて、ステップｅで酵素 によってシアリル化した。この反応を周囲温度下で10〜12日間TLCで追跡して（ その時間で化合物10の95％以上が消費された）、化合物11を製造した。 化合物11は、濃厚なシロップとして回収し、これをピリジンとともに２回共蒸 発させ次に減圧下で20時間保持した。このようにして脱水した物質を、ピリジン に再び溶解し、無水酢酸を添加しながら触媒量の４−ジメチルアミノピリジン（ DMAP）を添加した。ステップｆにおいて、その後の44時間にわたって無水酢酸を さらに２回添加してアシル化反応を完了して、シアリルカルボキシルと糖ヒドロ キシルを有するラクトンを生成させた。その後ステップｇにおいて 、メタノールを回収された物質に加えてシアリルメチルエステルを生成させ、次 に別の無水酢酸を添加して遊離のヒドロキシルをアセチル化して、完全に保護さ れた化合物12を製造した。 化合物11と12は構造式ＡとIIIの化合物であることは明らかである。化合物12 を例として用いると、ＺはＣ₁〜Ｃ₆アシル（アセチル）であり、ＸはＣ₁〜Ｃ₆ア シルオキシ（アセトキシ）であり、Ｒ²は３Gal β０−エチルであり、Ｒ³はアセ チルであり、Ｒ⁴はメチルであり、そしてＲ¹はアリルオキシである。これら構造 式のいずれかに示す化合物の上記の他の基Ｘは該シアリル化ステップで簡便に導 入されることは等しく明らかである。Ｃ₁〜Ｃ₆アシルオキシまたはＣ₁〜Ｃ₆ヒド ロキシルアシルオキシであるシアリル単位の置換基Ｘが構造式Ｉまたはｃのイン ヒビター中に存在していることが望ましい場合は、化合物10（または３Gal βOR² 基なしの二糖）を過アセチル化し、ステップｈに示すように化合物10のアリル オキシカルバモイル基（AL）を除き、次に、図式３のステップｃに示すようにフ ェニル環含有アシル基Ｒ¹の一つで置換する。次にこの分子を、以下に考察する ように脱保護し、酵素でシアリル化とフコシル化を行った。Ｒ^1-4基が別の基の 場合または構造式Ａ，ＢもしくはIIIの類似の化合物の場合、化合物９の３Gal βグリコシドＲ²、ステップｆとｇのアシル化剤およびステップｆのエステル化 用アルコールを置換することができる。 回収され、乾燥された化合物12を、ステップｈにて、無水THF中、室温でポリ メチルヒドロシロキサン（PMHS）で処理し、続いて、パラジウムテトラキストリ フェニルホスフィン〔Pd（PPh₃）₄〕で18時間処理して、87％の収率で化合物13 を得た。 下記の図式３で、式Ｉとｃで表される実例の化合物17を得る残りの合成を要約 する。すなわち、水性メタノール中50℃で48時間、化合物13を１当量の氷酢酸と 反応させて、Glc３−ヒドロキシルを選 択的に脱アシル化させて、化合物14をステップａにて65％の収率で得た。 次に、化合物14を、ステップｂにおいて、固体の重炭酸ナトリウムを含有する ジクロロメタン中で、塩化ベンゾイルと室温にて24時間反応させ選択的にベンゾ イル化して、83％の収率で化合物15を製造した。構造式Ａ，Ｉ，IIおよびIIIの 化合物の別のＲ¹基は、Ｒ²が糖単位でないこのステップまたは類似のステップで 付加される。 有機化学のフコシル化反応は、化合物15を、トリ−ｏ−ベンジルフコシルフル オリド、モレキュラーシーブおよびジクロロメタン中のテトラメチル尿素と混合 し、次に−20℃まで冷却し、塩化第一スズと過塩素酸銀を添加することによって 、図式３のステップｃで実施した。徐々に室温まで昇温させて24時間撹拌した後 、化合物16を77％の収率で得た。 したがって化合物16は、Ｚが保護されたフコシル基である構造式ＡとＢの化合 物ならびに式IIの化合物である。代わりの基Ｒ⁵を用いいて、前記ＸとＲ^1-4基を 組合せると、これらの構造式で表される残りの化合物が得られる。 フコシル糖単位のｏ−ベンヂル保護基Ｒ⁵は、溶媒のメタノール中の水酸化パ ラジウム／炭〔Pd（OH）₂／ｃ〕を用いて水素化を行うことによりステップｄで 除いた。室温で１時間の反応によって、ｏ−ベンジル基を完全に除いた。その脱 ベンジル化された化合物を濾過し濃縮して油状物を得て、これをメタノール：水 （４：１）中に再溶解し、ステップｅでナトリウムメトキシドの粉末を添加した 。室温で16時間反応させた後、72％の収率でインヒビターの化合物17を得た。 Ｒ⁵がＣ₁〜Ｃ₆アシル基の場合、水素化のステップは用いずに、Ｃ₁〜Ｃ₆アシ ル基のＲ⁵はＲ³とＲ⁵の基とともに除去される 。Ｃ₁〜Ｃ₆アシル基のＲ⁵を用いて水素化のステップを避けると、ニトロ基を含 有するＲ¹基を合成するルートが得られる。 基Ｒ²が単糖または二糖の場合、図式２の化合物９のような適切に保護された 単糖または二糖が用いられる。例えば、ラクトース、ラクトースＣ₁〜Ｃ₁₈グリ コシドまたはメリビオースは、化合物９のそれと類似の保護されたベンジリジン 誘導体にすることができ、次いで図式２のカップリングステップに使用され、得 られた生成物は、図式２と３の次のステップで用いられる。 ラクトースアミンとその誘導体は、当業者にとって公知の他の方法によって製 造することができると解すべきである。さらに三糖の化合物10は、エチル３−Ｏ −（２−Ｎ−アリルオキシカルボニル−２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グ ルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトシドを、ウリジン−５′−ジホスフェート −ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて、UDP-Galと反応させ、そして公知 の方法にしたがって他の適切な酵素によって、酵素的に製造することができると 解すべきである。同様に、化合物11は、フコシルトランスフェラーゼＶのような フコシルトランスフェラーゼ（FT）およびヌクレオチド糖ドナーのGDP-フコース ；ならびにGDP-フコースの再生に有用な他の酵素を、公知の方法を用いて使用す ることによって酵素でフコシル化することができる。勿論、示されている反応図 式がわずかに変化することは、これらの合成が変化することによって必要である が、これらの変化は当業者の技量の範囲内にある。 さらに別の有用な合成法を以下の図式４に示す。この場合、出発 原料は、図式３の化合物14の遊離塩基14ａである。 すなわち、化合物14ａをステップａで、重炭酸ナトリウムの存在下、ジクロロ メタン中のわずかに過剰のカルボベンゾキシクロリド（CBZ-Cl）と反応させ次に 約18時間後、別の用量のCBZ-Clと反応させて、アミンが保護された化合物39を収 率65％で製造した。図式４のステップｂは図式３のステップｃとして示したグリ コシル化ステップと実質に同じであり、化合物40が73％の収率で製造され、それ にプラスして17％の出発化合物39が回収された。 次にステップｃで、エタノール中で、還流しながらギ酸アンモニウム中10％の Pd−ｃを反応させることによってフコシル化された遊離アミンである化合物41を 96％の収率で製造した。遊離アミンの化合物41を、次にステップｄで、重炭酸ナ トリウムの存在下、ジクロロメタン中でアシル（YR¹）クロリドと反応させて、 対応するヒドロキシ保護Ｎ−アシル化化合物、ここでは３，５−ジクロロベンズ アミド誘導体の化合物42を高収率で得た。これらのヒドロキシル基 は、28％ナトリウムメトキシド−メタノール中で反応させて、実質的に定量的な 収率で脱保護を行った。 特に好ましいいくつものインヒビターである化合物17，30〜38および43〜51の 構造はすでに示した。化合物30〜33は、図式３において化合物16の化合物17への 転化について記載したのと同様に、それぞれの前駆化合物26〜29から製造した。 化合物34〜38および51は図式３の方式と類似の方式で製造した。化合物43〜49は 、図式４に示した一般的な方法を用いて同様に製造した。化合物50は、図式４の ステップｃの還元法を用い、図式３にしたがって製造した。これらの化合物は構 造式Ｉおよび式Ａの化合物である。 Ｃ．細胞接着阻害の検定法 リガンド−受容体の相互作用のインヒビターを生体外で選別する多数の直接方 法と間接的方法を利用することができ、これらの方法は当該技術分野の当業者に とって公知である。例えば、SLe^xを有する細胞が特定のセレクチンを発現する細 胞に接着するのを阻害する性能は測定することができる。 先に考察したように、いくつものセレクチン受容体の遺伝子がクローン化され ているので、これら遺伝子は、この発明で利用されるCOS細胞、CHO細胞、アデノ ウイルスで形質転換されたヒト腎細胞などのような多種類の細胞中に挿入し発現 することができ、その結果、rELAM（組換えELAM−１）のような組換えセレクチ ン受容体が、以下に説明するように検定に使用することができる。その上に、通 常SLe^xを発現しない細胞は、形質転換された細胞に、リガンドを合成する性能を 与える一つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換することがで きる（例えばLoweら、Cell，63巻、４75〜484頁、1990年参照）。いくつかの検 定法では、インヒビターの化合物または試薬が、標識をつけたSLe^x含有細胞およ び固体表 面に固定化された、細胞表面セレクチン類もしくは組換えセレクチンを発現する 活性化細胞とともにインキュベートされる。次に、細胞接着の阻害を、適切な洗 浄を行った後、表面に捕捉された標識を検出することによって測定することがで きる。 一般に、試験されるSLe^x類似化合物の生体外検定法は、試験される化合物が、 SLe^x含有細胞へのセレクチンの結合を競合して阻害する性能を検出する競合検定 法である。セレクチン含有細胞は一般に活性化された血小板または活性化された 内皮細胞であり組換えセレクチンが有用である。一方SLe^x含有細胞は通常好中球 またはHL−60細胞である。 他の検定法としては、相互作用からもたらされるSLe^xリガンド含有細胞または セレクチン含有細胞の各種生理学的変化の有無を検出する方法がある。適切な検 定法の例としては、結合によって誘発される転写活性の変化を測定する方法（例 えば国際特許願公開第３712820号参照）、各種の細胞依存性細胞外作用を検出す る方法（例えば国際特許願公開第90/00503号参照）、および個々の細胞の膜の電 位の変化を測定する方法（例えば米国特許第4,343,782号参照）がある。なおこ れらの文献はすべてこの出願に援用するものである。あるいは、単離された受容 体またはリガンドの配座の変化を検出してもよい（例えば米国特許第4,859,609 号参照。この文献はこの出願に援用する）。さらに、SLe^xを発現する細胞を固体 支持体に結合されたセレクチンに結合させ、その結合された細胞を溶解して、そ の結合された細胞中にのみ存在していたタンパク質について検定することができ る。 リガンド、セレクチン受容体、またはSLe^x化合物を含む検定法の成分は固体表 面に結合させることができる。生体分子を固体表面に固定化する多数の方法が当 該技術分野で知られている。例えば、 固体表面は、膜（例えばニトロセルロース）、微量滴定皿（例えばPVCまたはポ リスチレン）またはビーズでもよい。所望の成分は共有結合されていてもよくま たは非特異的な結合を通じて非共有結合で結合されていてもよい。 天然および合成の多種類の有機および無機のポリマーが、固体表面用の材料と して用いることができる。これらポリマーの例としては、ポリエチレン、ポリプ ロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポ リ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート ）、シリコーン類、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニト ロセルロースなどがある。利用できる他の材料としては、紙、ガラス類、セラミ ック類、金属類、メタロイド類、半導体の材料、サーメット類などがある。さら にゼラチン類のようなタンパク質、リポ多糖類、シリケート類、アガロースおよ びポリアクリルアミド類のごときゲルを形成する物質；またはいくつもの水性相 を形成するポリマー例えばデキストラン類、ポリアルキレングリコール類（２〜 ３個の炭素原子を有するアルキレン）；または界面活性剤類例えばリン脂質類の ような両性化合物、長連鎖（12〜24個の炭素原子）のアルキルアンモニウム塩な ども挙げることができる。固体表面が多孔質である場合は、その系の性質によっ て、各種の細孔径を利用できる。 固体表面を調製する場合、種々の特性を得るため、特に積層体のような複数の 異なる材料を利用することができる。例えばゼラチンのようなタンパク質コーテ ィングは、非特異的結合を回避し、共有結合の接合を簡素化し、シグナルの検出 を促進するなどのために利用できる。 化合物と表面との共有結合が所望の場合は、表面は通常多官能性 であるかまたは多官能性にすることができる。表面に存在させて結合に利用でき る官能基としては、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基 、ヒドロキシル基、メルカプト基などがある。多種類の化合物を各種の表面に結 合させる方式は公知であり、文献に充分説明されている（例えばInchiro Chibat a著、“Immobilized Enzymes”，Halsted Press社、ニューヨーク、1978年およ びCautrecasas，J．Biol．Chem.，245巻、3059頁、1970年参照。これらの文献は この出願に援用するものである）。 共有結合に加えて、検定成分を非共有結合で結合させる各種の方法も利用でき る。非共有結合は一般に、化合物の表面に対する非特異的な吸収である。一般に 表面は第二の化合物で封鎖されて、標識をつけた検定成分が非特異的に結合する のを防止される。あるいは、表面は、一つの成分を非特異的に捕捉するが、他の 成分を有意に捕捉しないように設計される。例えばコンカナバリンＡのようなレ クチンを有する表面は、炭水化物を含有する化合物を捕捉するが、グリコシル化 されていない標識タンパク質を捕捉しない。検定成分の非共有結合させるのに用 いる各種固体表面は、米国特許第4,447,576号および同第4,254,082号に概説され ている。なおこれらの文献は本願に援用するものである。 前記の標識は、当該技術分野で公知の方法にしたがって、その検定法の所望の 成分に直接または間接的に結合させるか、または結合され細胞に対し内在性のタ ンパク質でもよい。多種類の標識を使用することができる。成分には、いくつも の方法のいずれか一つの方法で標識をつけることができる。最も普通の検出方法 は、³Ｈ，¹²⁵Ｉ，³⁵Ｓ，¹⁴Ｃ、または³²Ｐで標識を付けた化合物などによるオー トラジオグラフィなどを用いる方法である。放射性同位元素の選択は、合成の容 易さ、変化する安定性および選択された同位元素の 半減期のために、研究の選択によって決まる。他の非放射性標識としては、標識 抗体に結合するリガンド、発蛍光物質、化学発光剤、酵素、および標識リガンド に対して特異的な結合ペアメンバーとして働くことができる抗体が挙げられる。 ラベルの選択は、必要な感度、化合物との接合の容易さ、安定性の要件および利 用できる装置によって決まる。 非放射性標識は間接的な手段によって結合させることが多い。一般にリガンド 分子（例えばビオチン）は分子に共有結合される。次に、リガンドは、本来検出 可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物のよう なシグナル系に共有結合される抗リガンド（例えばストレプタビジン）分子に結 合する。リガンドと抗リガンドは広範囲に変えることができる。例えばビオチン 、チロキシンおよびコルチゾールのようなリガンドが天然の抗リガンドをもって いる場合、そのリガンドは標識をつけた天然産の抗リガンドとともに用いること ができる。あるいは、ハプテン性または抗原性の化合物を、抗体と組合わせて使 用してもよい。 また、上記のラベルは、接着するのを阻害しなければならない細胞内に存在す る酵素などのタンパク質でもよい。この場合、その酵素の量は結合の量を測定す る標識として使用できる。ミエロベルオキシダーゼは、以下に考察する結合阻害 試験を行う場合の標識として有用な、HL−60細胞中に存在するタンパク質である 。 SLe^x分子も、例えば酵素もしくは発蛍光物質と接合させることによって、シグ ナル発生化合物に直接接合させることができる。標識として重要な酵素は、第一 にヒドロラーゼ類であり、特にホスファターゼ類、エステラーゼ類、およびグリ コシダーゼ類、またはオキシドレダクターゼ類特にペルオキシダーゼ類である。 蛍光化合物としては、フルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体 、ダンシル、ウンベリフェロンなどがある。化学発光化合物としては、ルシフェ リンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン類例えばルミノールが挙げられる （使用できる各種のシグナル生成系を調べるには米国特許第4,391,904号を参照 する。なおこの文献は本願に援用するものである）。 Ｄ．医薬組成物 医薬として許容される担体または希釈剤に溶解または分散されて利用されるSL e^x類似化合物を含有する医薬組成物も提供されるこの組成物は、細胞接着阻害量 の前記のSLe^x類似化合物を含有している。 提供される医薬組成物は、いくつもの疾患に関連する細胞接着を遮断または阻 害するのに用いることができる。例えば、いくつかの炎症性障害は、血管内皮細 胞上および血小板上に発現されるヒレクチン類と関連がある。“炎症”という用 語は、この明細書で使用する場合、特異的および非特異的な防御系の両者の反応 を意味する。特異的な防御系の反応は、抗原に対する特異的な免疫系の反応であ る。特異的な防御系の反応の例としては、ウイルスのような抗原に対する抗休の 反応および遅延型過敏性がある。非特異的な防御系の反応は、免疫記憶を一般に 行うことができない白血球によって仲介される炎症性反応である。このような細 胞としては、マクロファージ、好酸球および好中球が挙げられる。非特異的反応 の例としては、蜂に剌された直後の腫脹および細菌感染の部位におけるPMN白血 球の集合（例えば細菌肺炎の肺浸潤および膿瘍中の膿生成）がある。 その外の治療可能な障害としては、例えばリウマチ様関節炎、後虚血性白血球 依存性組織傷害（postischemic leukocyte-mediated tissue damage）〔再灌流 損傷（reperfusion injury）〕、凍傷損傷 または凍傷ショック、急性白血球依存性肺障害（例えば成人の呼吸窮迫症候群） 、喘息、外傷性ショック、敗血症性ショック、腎炎、ならびにアトピー性皮膚炎 、乾せんおよび炎症性腸疾患を含む急性および慢性の炎症がある。アテローム性 動脈硬化症、血餅閉塞のような各種の血小板依存性の疾患も治療できる。その上 に、循環癌細胞の接着を阻害することによって腫瘍の転移を阻害もしくは防止す ることかできる。結腸癌および黒色腫もその例である。 一例として、再觀流損傷は、この発明の医薬組成物によって特に治療し易い損 傷である。ｐ−セレクチン−リガンドの相互作用を阻害する組成物は再觀流損傷 を治療もしくは防止するのに特に有用である。この発明の医薬組成物は、心職外 科手術を行う前に予防的に用いて、手術後の回復を促進することができる。 ｐ−セレクチンは血小板のバイベル−パラーデ体および内皮細胞に貯蔵され、 トロンビンによって活性化されると放出されて好中球および単球の接着を仲介す るので、ｐ−セレクチン−リガンド相互作用のインヒビターは、血栓障害に付随 することが多い組織損傷を最小にするのに特に有用である。例えば、このような インヒビター類は、卒中発作、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺動脈塞栓症などを 最近経験した患者を治療するのに価値がある。これらの化合物は前血栓崩壊療法 （pre-thrombotitic therapy）に特に有用である。 この発明の組成物には、敗血症性ショックまたは播種性血管内凝固（DIC）の 二次作用を治療する特別の用途がある。敗血症性ショック中またはDIC中の白血 球の組織内への遊出は病的な組織壊をもたらすことが多い。さらにこれらの患者 は、大きく広がった微小循環血栓およびびまん性炎症をもっていることが多い。 この発明で提供される治療用組成物は、これらの部位における白血球の遊出を阻 害して組織の損傷を軽減する。 セレクチン−細胞SLe^xリガンド相互作用のインヒビターも、外傷性ショックお よびこれに伴う急性の組織損傷を治療するのに有用である。セレクチン類は、損 傷の部位に白血球を補充する役割を演じており、特にＥ−セレクチンは急性の損 傷および炎症の症例の場合に上記の役割を演じているので、そのインヒビターを 局所または全身に投与してかような損傷に伴う組織の損傷を防除することができ る。さらに、このようなインヒビターは、炎症の部位、例えばELAM−１が発現さ れる部位に対して特異的であるので、これらの組成物は、伝統的な抗炎症薬に比 べてより有効でかつ合併症を起こすことが少ないようである。 したがってこの発明は、上記症状を治療するのに使用できる医薬組成物を提供 するものである。この発明の医薬組成物は、細胞SLe^xリガンドとセレクチン受容 体との間の相互作用を阻害する前記SLe^x類似化合物を含有し、その化合物は医薬 として許容される希釈剤に溶解または分散されている。この発明の医薬組成物は 、各種の医薬送達系で使用するのに適している（現在の医薬送達法の概略を調べ るにはLanger，Science，249巻、1527〜1533頁、1990年を参照する）。 哺乳類の炎症反応が複雑であることから、当業者にとって、この発明の組成物 が、他の細胞接着分子の機能を妨害することが知られている他の化合物を含有し ていてもよいことは、容易に分かるであろう。例えば、接着分子のインデクリン ファミリーのメンバーは、感染の時点で白血球が血管外に滲出することに役割を 果していると考えられている（セレクチン受容体を含む細胞間接着受容体とその 役割の免疫機能を調べるには、Springer，Nature，346巻、425〜434頁、1990年 を参照する）。さらに、この発明の組成物を用いて成功する治療法は、治療すべ 症状の発生状態によって決定すること ができる。異なる接着分子が、疾患または症状の過程で各種の因子に応答して上 下に調節されるので、異なる炎症状態を治療するため異なる医薬組成物が必要で あることもあるということは当業者には分かるであろう。 セレクチン受容体に結合して、SLe^xリガンドを含有する細胞がセレクチン受容 体に結合するのを阻害するSLe^x類似化合物を含有する医薬組成物の場合、その化 合物の投与量は、例えば特定の化合物、投与方法、治療される特定の疾患とその 重症度、患者の全健康状態と症状および担当医師の判断によって変わる。例えば 再觀流の損傷を治療する場合、この発明のSLe^x類似化合物の投与量は、70kg体重 の患者の場合１日当り約50μｇ〜10,000mgの範囲内にある。理想的には、治療投 与は、心筋梗塞などの損傷が起こったときにできるだけ速やか開始しなければな らない。医薬組成物は、予防および／または治療の処置を行うため、エアゾール でまたは経皮的に、非経口、局所、経口もしくは局部に投与される。医薬組成物 は、投与方法によって、各種の単位剤形で投与することかできる。例えば、経口 投与に適している単位剤形は粉末剤、錠剤、丸剤、カプセル剤および糖衣錠であ る。 好ましくは医薬組成物は静脈に投与される。したがって、この発明は、医薬と して許容される希釈剤（担体）好ましくは水性担体中に溶解または分散されたこ の発明のSLe^x類似化合物の溶液を含有する静脈投与用組成物を提供するものであ る。各種の水性担体、例えば水、緩衝水、0.4％食塩水などを使用することがで きる。これらの組成物は、従来の公知の滅菌法で滅菌するかまたは濾過滅菌を行 うことができる。得られた水溶液は、そのままかまたは凍結乾燥して、使用のた めに包装され、凍結乾燥された製剤は投与する前に滅菌水溶液と混合する。組成 物は、適切な生理状態に対して必要な 医薬として許容される補助物質例えばpHを調節する緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤 などを含有していてもよく、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナト リウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノステアレート、トリエ タノールアミンオレエートなどがある。 利用されるSLe^x類似化合物の濃度は通常、選択される特定のモードの投与にし たがって約１重量％から10〜30重量％までであり主として流体の容積、粘度など によって選択される。上記のように、組成物の成分は、リポソーム製剤によって 伝達することができる。 したがって典型的な静脈注入用医薬組成物は、250mlの滅菌リンゲル液と25mg のSLe^x類似化合物を含有するよう調製される。非経口で投与できる化合物を実際 に製造する方法は、当該技術分野の当業者にとって公知かまたは明らかであり、 例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、第17版、Mack Publishing Compa ny（英国、ペンシルベニア州イーストン）1985年には一層詳細に記載されている 。なおこの文献は本願に援用するものである。 固体組成物の場合、通常の非毒性固体希釈剤（担体）が用いられ、例えば、医 薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム 、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸 マグネシウムなどがある。経口投与の場合、医薬として許容される非毒性組成物 が、先に列挙した担体のような通常用いられる賦形剤、および一般に10〜95％好 ましくは約20％の活性成分すなわち前記SLe^x類似化合物を組込むことによって製 造される（前記レミントンの文献参照）。 エアゾール投与の場合、この発明のSLe^x類似化合物は、微細に粉砕された形態 で、界面活性剤および噴射剤とともに供給することが好ましい。SLe^x類似化合物 の一般的な百分率は、約0.5〜約30 重量％であり、好ましくは約１〜約10重量％である。界面活性剤は勿論非毒性で なければならず、そして噴射剤に可溶性であることが好ましい。これらの薬剤の 代表例は、６〜22個の炭素原子を有する脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタン酸 、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレス テリック酸（olestericacid）およびオレイン酸と、脂肪族の多価アルコールま たはその環式無水物例えばエチレングリコール、グリセリン、エリトリトール、 アラビトール、マンニトール、ソルビトール、ソルビトールから誘導されるヘキ シトール無水物とのエステル類もしくは部分エステル類、ならびにこれらエステ ル類のポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンの誘導体である。混合エ ステル類、例えば混合グリセリドすなわち天然グリセリドも利用できる。界面活 性剤は、組成物の約0.1〜約20重量％、好ましくは約0.25〜約５％を占めている 。この組成物の残りの成分は通常噴射剤である。液化噴射剤は周囲の条件下では 一般に気体であり、加圧して凝縮されている。適切な液化噴射剤としては、ブタ ンとプロパンのような５個までの炭素原子を有する低級アルカンがあるが、フッ 素化アルカンまたはフッ素塩素化アルカンが好ましい。上記の噴射剤の混合物も 使用できる。エアゾールを製造する場合、適切なバルブを備えた容器に、前記の 微細に粉砕した化合物と界面活性剤を含有する適正な噴射剤を充填する。すなわ ちこれらの成分は、バルブの作動で放出されるまで高圧に保持される。 SLe^x類似化合物を含有する医薬組成物は、予防処置および／または治療処置の ために投与することができる。治療の用途の場合、組成物は、上記のようにすで に疾患にかかっている患者に、セレクチンを発現する細胞と好中球との結合を阻 害し、すなわちその疾患とその合併症の症状を根治するかまたは少なくとも部分 的に軽減す るのに充分な量で投与される。このことを達成するのに充分な量は、“治療する のに有効な投与量”または“細胞接着を阻害する量”と定義する。この用途に有 効な量は、疾患の重症度および患者の体重と一般状態によって決まるが、70kg体 重の患者に対して一日当り、約0.5mg〜約10,000mgの範囲のSLe^x類似化合物の量 であるが、１日当り約５mg〜約2,000mgの化合物がより普通に用いられる。 予防の用途の場合、この発現の化合物を含有する組成物は、特定の疾患にかか り易いかそうではなくて特定の疾患にかかる危険がある患者に投与される。この ような量は、“予防するのに有効な投与量”と定義し、またSLe^x含有細胞がセレ クチンに接着する（結合する）のを阻害するのに充分な量でもある。この用途で は、正確な量はやはり患者の健康状態と体重によって決まるが、一般に70kg体重 の患者に対して約0.5mg〜約5,000mgの範囲内であり、一層普通に用いられるのは 70kg体重に対して約５mg〜約2,000mgである。 この発明のSLe^x類似化合物の接着阻害量を評価する他の方法は、SLe^x類似化合 物が示す結合阻害性を、SLe^x自体が提供するそれと比較する方法である。その比 較を行うのに一つの便利な方法は、これら二つの比較される物質のIC₅₀（結合を １／２阻害するのに必要な濃度）を用いる方法であり、使用される量が、その化 合物に対するIC₅₀値の倍数値であるSLe^xの量とSLe^x類似化合物の量に基づいてい る。 一般に、IC₅₀値がSLe^x自体のIC₅₀値の約１／10である化合物をSLe^xのモル量の 10倍で用いる場合は、有用な細胞接着阻害量である。その量がSLe^xの量の約４倍 であることが好ましい。またその量がSLe^xの量に等しいことがさらに一層好まし い。この明細書に記載の大部分のSLe^x類似化合物にあてはまることであるが、使 用される量がSLe^xの使用量より少なく例えばSLe^x自体のモル量の 約１／２〜約１／20であることが最も好ましい。 組成物の単回投与または多数回投与は、投与レベルおよび治療医師が選択する パターンによって実施できる。いずれにしろ、この発明の医薬組成物は、患者を 有効に治療するのに充分な量のSLe^x類似化合物を提供しなければならない。 またこの発明の化合物は、診断剤としての用途も見出すことができる。例えば 標識を付けた化合物を用いて、炎症をもっていると推測される患者の炎症もしく は腫瘍転移の領域の位置を決定することができる。この用途の場合、この発明の 化合物は¹²⁵Ｉ，¹⁴Ｃまたはトリチウムで標識を付ける。 実施例１：ラクツロースＮ−べンジルグリコシド（化合物１） 500mL三つ口丸底フラスコを氷浴中につけて、ラクツロース（23.9ｇ，69.8mmo l）とベンジルアミン（109mL，526mmol，7.5当量）を入れた。次にフラスコに栓 をし、磁気撹拌棒を用いて撹拌した。氷浴を融解するにまかせて、反応混合物を 室温まで徐々に昇温させた。固体物質が数時間かかって溶解し、反応混合物が黄 色に着色した。60：50：15のCHCl₃：MeOH：15mM CaCl₂を用いるTLCを用いて反応 の進行を監視した（ラクツロース Ｒ_f＝0.45、生成物 Ｒ_f＝0.75、オルシノー ルによって視覚化）。 この反応は全くゆっくりしており、５〜７日で完了したようであった。反応が 完了したと判断した時点で、撹拌棒を反応混合物から取出し、フラスコにオーバ ーヘッド機械撹拌機を取付け、次いで装置を氷浴中につけた。次いでフラスコに ヘキサン（250mL）を加え、混合物を約60秒間激しく撹拌した。次いで撹拌を中 止し、混合物を二つの別個の層に分離させた（この分離には１５分間〜１時間か かる）。この時点で、上方のヘキサン／ベンジルアミン層をチューブを通じて吸 引によって取出した。ベンジルアミンの抽出をヘキサンを 使用して（250mLづつ）２回以上繰返し、次に250mLづつのジエチルエーテルを用 いて３回以上抽出を繰返した（抽出はすべて氷上で行った）。 これらの抽出を行った後、粘稠な淡黄色の残留物が残った。この物質をエタノ ール（300mL）に溶解して２Ｌの一つ口の丸底フラスコに移した。その黄色溶液 をロータリーエバポレーションで濃縮して、濃厚なシロップを得た。試薬グレー ドのアセトン（1000mL）を０℃で磁気撹拌棒で迅速に撹拌し、次いでその溶液を 徐々に上記エタノール性シロップで処理した。該ジロップをゆっくりと添加した とき、乳白色の沈澱が生成し始めた。添加を完了した後、フラスコに栓をし、− 20℃の冷凍器内で一夜貯蔵した（約18時間）。冷凍器からフラスコを取出した後 、白色固体のケークがフラスコの底に見え上澄み液は透明な黄色であった。その 溶液をデカントし、次いで粗製の固体化合物１を高減圧下で吸引し、残留アセト ンを除いた。生成物（化合物１）は非常に不安定な固体なので直ちに次の反応に 使用した。 実施例２：Ｎ−ベンジルラクトースアミンアセテートロ（化合物２） 上記実施例１由来の粗生成物（化合物１）（30.1，69.8mmol理論量）を1000mL の試薬グレードのメタノールに溶解し、室温で撹拌した。次に氷酢酸（４mL，70 mmol）を添加し、フラスコに栓をした。得られた淡黄色の反応混合物を室温で撹 拌し、先に述べたのと同じ溶媒系を用いるTLCで監視した。生成物の化合物２は Ｒ_f＝0.65の位置に出現した（残留ラクツロースはこの反応の開始時からTLCによ ってみとめられるがその量は反応が進行するにつれて実質的に増大しないようで ある）。化合物１が完全に消費されたことがTLCによって明らかになったとき（2 4〜48時間）、反応混合物から100 μｌを取出し、アルゴン気流下で蒸発させた。黄色残留物をCD₃ODに溶解し、再 び蒸発させて黄色残留物を得た。この物質をD₂Oに溶解し、¹Ｈ−NMRで分析した 。 化合物２のこの粗溶液を次の反応に使用した。収率を算出するため、既知容積 の少量を反応混合物から取出し、濃縮乾固し、水に溶解し、pHを＞10にし、次に 逆相シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを用い最初はH₂Oで溶離し、次にH₂ O：MeOH（２：１）で溶離してクロマトグラフィーに付した。ラクツロースから の一般的な収率は50〜55％であった。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，δ（ppm）HODに対する）7.44（m，5H），5.49（d，J=3 Hz ，1H），5.05（d，J=B Hz，1H），4.39（d，J=7 Hz，1H），4.38（d，J=8 Hz，2 H），4.35（d，J=7 Hz，1H），4.10-3.5（m，11H），3.24（dd，J=3 Hz，J=10 H z 1H），3.00（dd，J=8 Hz，J=10 Hz，1H），2.87（s，3H）。 実施例３：ラクトースアミンアセテート塩（化合物３） 前記反応由来の、化合物２の粗製酸性メタノール溶液が入っている２ｌフラス コに三方ストップコックを取付け、アルゴンのバルーンとハウス真空ラインを用 いてアルゴン／減圧／パージのサイクルを３回実施した。フラスコを開いて10％ Pd／ｃを添加した（7.4ｇ，6.98mmol）。フラスコに再び三方ストップコック を取付け、水素ガスを用いて減圧／パージのサイクルを３回行った。反応混合物 を次に、バルーンを用いて水素雰囲気下に保持した。 反応はTLCによって厳密に監視した（生成物Ｒ_f＝0.2）。出発原料が消費され たとき、100μｌを取出しエペンドルフチューブに入れ、微量遠心分離器にかけ 透明な上澄み液を取出し、これを用いて前記反応の場合と同様にしてNMR用試料 を調製した。化合物２が完全に消費されたことをNMRが示したとき、そのスラリ ーを、メタノ ールを用い中位多孔度の焼結ガラス漏斗上のセライトのプラグを通じて濾過した 。得られた透明な黄色溶液を500mL丸底フラスコ中でロータリーエバポレーショ ンを行って140mLまで濃縮し、粗製のまま次の反応に使用した。 化合物３：¹Ｈ−NMR（300 MHz，δ（ppm）：HODに対する）5.40（d，J=3 Hz， 1H），4.90（d，J=8 Hz，1H），4.41（d，J=8 Hz，1H），4.00-3.5（m，11H）， 3.28（dd，J=3 Hz，J=8 Hz 1H），2.98（dd，J=7 Hz，J=8 Hz，1H）。 実施例４：２−デオキシ−２−（２′−カルボキシ）−ベンズアミド−４−Ｏ− β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド（化合物４）および １，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−４−Ｏ− （２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β −Ｄ−グルコピラノシド（化合物５） 化合物３の粗製酸性メタノール溶液を14mLの水で希釈し、炭酸ナトリウム（29 .7ｇ，280mmol）で処理し次に無水フタル酸（20.7ｇ，140mmol）で処理した。反 応は、最初にいくらか発泡が起こるので注意深く監視した。４時間後に反応は完 了したので、スラリーを燃焼ガラス濾斗によって濾過して、残っている炭酸ナト リウムとフタレートベースの物質を除去した。濾液を、まずロータリーエバポレ ーションによって濃縮してペースト状物にし、次に高真空度下で濃縮して化合物 ４を得た。その物質中に残っている痕跡のメタノールと水を除くことは、次のア セチル化反応での無水酢酸との副反応を避けるため必須である。 材料が充分に乾燥していると判断したとき、ピリジン（212mL）を添加し次に 無水酢酸（106mL，1.12mol）を添加した。混合物を最初手動で振盪して溶解を促 進させたが、最初の発熱が起こり始めると 溶解が進行し、次いで磁気撹拌を利用した。一夜撹拌した後（約18時間）、20： １のCHCl₃：MeOHを用いるTLCは、基準の化合物５と共スポットする（cospot）大 きなUVの活性スポットが優勢であることを示した。その溶液を０℃まで冷却し、 32mLの水で処理し、15分間撹拌して過剰の無水酢酸を加水分解した。得られた溶 液をジクロロメタンで1000mLまで希釈し、次いで２NHCl（３×1000mL）、NaHCO₃ 飽和溶液（３×1000mL）および飽和食塩水（１×1000mL）で洗浄した。有機溶液 を乾燥し（MgSO₄）、濾過し、濃縮して粗製生成物を得た。¹Ｈ−NMRをCDCl₃中で 実施したところ、α−アノマーとβ−アノマーのほぼ１：１の混合物であること を示した。この粗生成物を最少量のメタノール（約30mL）に溶解し、次いで数分 間以内に結晶化が起こった。数時間室温で保持した後、濾過して固体を収集し氷 冷メタノールですすいだ。風乾した後、生成物の純品の化合物５を白色粉末（5. 6ｇ，10.4％）として収集した。 ¹Ｈ−NMR（300 MHz，δ（ppm）：CHCl₃に対する）7.90-7.70（m,4H），6.50（ d，J=8 Hz，1H），5.83（dd，J=10.5 Hz，J=8 Hz，1H），5.36（d，J=3.5 Hz，1 H），5.15（dd，J=8 Hz，J=10.5 Hz 1H），4.97（dd，J=10 Hz，J=3.5 Hz，1H） ，4.56-3.83（m，9H），2.20-1.90（7s，21H）。 実施例５：１，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド −４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノ シル）−β−Ｄ−グルコピラノシドの化合物５への転化 上記化合物５を結晶化して得たα−アセテート含有母液を濃縮して泡状物を得 て、これをDMF（110mL）に溶解した。この溶液をアルゴン雰囲気下55℃で撹拌し た。次に酢酸ヒドラジニウム（9.5ｇ，104mmol）を添加した。15分後、20：１の CHCl₃：MeOHを用いるTLCは 出発原料が完全に消費され、Ｒ_f値がわずかに小さいスポットが出現したことを 示した。その反応混合物を室温まで冷却し、酢酸エチルで1000mlまで希釈した。 その溶液を水（２×1000ml）および飽和NaCl溶液（１×1000ml）で洗浄した。有 機溶液を乾燥し（MgSO₄）、濾過し濃縮した。 得られた粗製濃縮生成物をピリジン50mlに溶解し無水酢酸（25mL）で処理した 。一夜（約18時間）撹拌した後、20：１のCHCl₃：MeOHを用いるTLCは、基準の化 合物５と共スポットした一つの大きなUV活性スポットが優勢であることを示した 。その溶液を０℃まで冷却し、7.5mlの水で処理し次いで15分間撹拌して過剰の 無水酢酸を加水分解した。その溶液をジクロロメタンで250mlまで希釈し、2NHCl （３×250ml）、飽和NaHCO₃溶液（３×250mL）および飽和NaCl溶液（１×250ml ）で洗浄した。有機溶液を乾燥し（MgSO₄）、濾過し、次いで濃縮して粗生成物 を得た。その粗生成物を最少量のメタノールに溶解し、再度結晶化させた。数時 間後、固体の化合物５を先に述べたのと同様にして別の収量の生成物（4.4ｇ，8 .3％）を白色粉末として得た。化合物５の二つの収量の全収率＝18.7％（10ｇ） 。 実施例5A：ラクツロースからの化合物５の別の製造 Ａ．ラクツロースアミノグルコシド（化合物1A） 撹拌棒、ラクツロース（17.1ｇ，50mmol）および酢酸アンモニウム（3.85ｇ， 50mmol）が入っている300mLステンレス鋼オートクレーブを−78℃に冷却し、80m Lの液体アンモニアを入れた。そのオートクレーブを密閉し、撹拌しながら室温 まで昇温させた。オートクレーブが室温に到達したとき、オートクレーブを油浴 中に入れて35℃で24時間加熱した。オートクレーブを室温まで冷却し、次いで注 意深く大気中に通気した。約２時間でアンモニアがすべて消散したとき、オート クレーブ全体と、五酸化リンが入っている滅圧デシケ ータ内に入れ注意深く高真空度下においた。高真空度下に一夜保持した後、オー トクレーブの内容物は淡黄色の泡状物になった。この化合物は極めて吸湿性であ ったのでオートクレーブからすばやく取出し密閉ジャー内に入れた。この物質は 粗製のままで次の反応に使用した。 Ｂ．ラクトースアミンアセテート（化合物2A） ラクツロースアミノグリコシド（化合物10）（3.41ｇ，10mmol）を100mLの無 水メタノールに溶解し、アルゴン雰囲気下室温で撹拌した。氷酢酸（572μＬ，1 0mmol）を添加した。24時間後、黄色溶液を濃縮して泡状物を得たが、これはα アノマーとβアノマーの１：１混合物としてラクトースアミンアセテートを含有 しているようであった。ガラクトピラノシルマンノサミンのａアノマーとｂアノ マーと考えられる二つの他の生成物が出現した。この生成物を粗製のまま以下の 反応に使用した。 上記ステップＢで得た粗製物質を用い、約１／７〜１／10の規模で実施例４の 方法によって、化合物2Aから化合物５を製造した。溶媒の約１／３を占めるアセ トンを用いてフタルアミド半酸を製造した。最終的に生成したペアセチルフタル イミド（化合物５）がラクツロースに対して3.8％の収率で製造された。なお第 二の収量は求めなかった。 実施例６：１−クロロ−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタル イミド−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクト ピラノシル）−β−Ｄ−グリコピピラノシド（化合物６） アノマーのアセテート（化合物５）（3.3ｇ，4.3mmol）を、43mLの乾燥CH₂Cl₂ 中アルゴン雰囲気下室温で撹拌した。三塩化アルミニウム（2.9ｇ，21.5mmol） を固体として添加した。40分後、混合物を分 液漏斗に入れて、１：１のCH₂Cl₂：H₂O中400mLの容積ですすいだ。混合物を振盪 し、水性相を除き、有機溶液を水（２×200mL）および飽和NaHCO₃溶液（３×200 mL）で洗浄した。得られた透明で淡黄色の溶液を乾燥し（MgSO₄）、濾過し濃縮 して淡黄色の粉末（3.2ｇ，10096）を得た。この物質は実施例７の縮合に用いた 。 実施例７：エチレンβ−Ｄガラクトピラノシド（化合物７） ジクロロメタン（４Ｌ）に２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ガラクト シルブロミド（2.5kg）を溶解して得た溶液を、炭酸銀（3.13kg，11.4mmol）、 ４Åモレキュラーシーブ（2.37kg）、ジクロロメタン（16Ｌ）および無水エタノ ール（4.0Ｌ）を入れた反応器に、20〜25mL／minの速度で添加した。撹拌撹拌を 続けて試薬を激しく混合した。上記ブロミドの溶液の添加を完了してから２時間 後、ヘキサン：酢酸エチル１：１で展開するシリカゲルのTLCは、該ブロミドが 存在しないことを示した。その時点で反応混合物をセライトのパッド（１kg）を 通じて濾過し、濾液を減圧下30〜35℃で蒸発させて褐色油状物（1.95kg）を得た 。この油状物を減圧下17時間乾燥した。¹ Ｈ−NMR（CDCl₃）δ：5.36（1H，d，J_3.44=3.7 Hz，H-4），5.17（1H，dd，J_{2. 3} =11.0 Hz，H-2），4.99（1H，dd，H-3），4.46（1H，d，J_1.2=8.3 Hz，H-1）， 2.15，2.05，2.04，1.95（12H，4s，OAc），1.21（3H，t，OCH₂CH₃）。 粗製のエチルテトラアセチルガラクトピラノシド（1.95kg）を無水メタノール （11.7Ｌ）に溶解し、25％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（90mL）を滴 下して加えた。得られた溶液を１時間撹拌したところ、酢酸エチル：メタノール ２：１で展開するシリカゲルのTLCは出発原料が存在しないことを示した。生成 物のＲ_fは0.6であった。その溶液にAmberlite IR-120（Ｈ⁺）樹脂（0.6kg）を 添加し撹拌して中和した。溶液のpHが６〜７になったとき、濾過して樹脂を除き 、次いで濾液を減圧下で蒸発させて淡黄色の固体を得た。この固体を沸騰エタノ ール（11Ｌ）に溶解した。得られた溶液を25℃まで冷却させ、次に０℃まで冷却 した白色の沈澱を得た。この固体を濾過してエチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド （化合物７）（0.851kg）を得た。¹Ｈ−NMR（D₂O）δ：4.38（1H，d，J_1.2=8.0 Hz，H-1），3.89（1H，bd，J_3.4=3.7 Hz，H-4），1.2（3H，t，OCH₂CH₃）。 実施例８：エチル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化 合物８） トルエンスルホン酸（1.5ｇ，7.9mmol）が入っている20Ｌのrotovapフラスコ 中に、エチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物７）（0.851kg，4.09mol）を 入れた。このエバポレーターフラスコをエバポレーターに取り付け、ベンズアル デヒドジメチルアセタール（1.23Ｌ，8.18mol）をアスピレーションで添加した 。得られた混合物を４時間タンブルさせた。アセタールを添加してから30分〜40 分の間にほぼ完全な溶液が得られ、続いて重い沈澱が急速に出現した。回転を４ 時間続けた後、トリエチルアミン（1.5mL）を添加して反応混合物を中和した。 滅圧にして溶媒を除去し固体の塊を得た。ヘキサン（６Ｌ）をフラスコに入れ、 混合物を30分間タンブルさせた。得られた固体を濾過し、フィルター上で、ヘキ サン：エチルエーテル１：１（２Ｌ）を用いて洗浄した。得られた白色固体を減 圧下17時間乾燥して、純品のエチル４，６−Ｏ−べンジリデン−β−Ｄ−ガラク トピラノシド（化合物８）（1.0kg，3.38mol）を83％収率で得た。¹Ｈ−NMR（CD Cl₃）δ：7.53（2H，m、芳香族），7.37（3H，m、芳香族），5.57（1H，s，CHPh ），4.29（1H，d，J_1.2=7.0 Hz，H-1），4.21（1H，d，J_3.4=3.27 Hz，H-4），1 .29（3H，t，OCH₂CH₃）。 実施例９：エチル２−Ｏ−ベンゾイル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−Ｌ ラクトピラノシド（化合物９） エアドライブ（air drive）、気体入口付き圧力均一化添加漏斗、冷却浴およ び気体出口を備えた20Ｌ反応器中にエチル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ− ガラクトピラノシド（化合物８）（0.924kg，3.12mol）を入れた。フラスコを密 閉する前にジクロロメタン（9.3Ｌ）とピリジン（２Ｌ）を添加し、均一な溶液 が得られた。添加漏斗に、クロロアセチルクロリド（0.388kg，3.43mol，273mL ）をジクロロメタンによる60％溶液として入れた。フラスコを密閉し、少流量の 乾燥窒素を流し始めた。冷却浴を−65±５℃まで冷却し、反応混合物を30分間撹 拌した。その時点で、上記アシルクロリド溶液の滴下を、３〜４mL／minの流量 で開始した。この溶液の添加を完了した後、反応混合物を−65±５℃にさらに１ 時間保持した。そのときに、塩化ベンゾイル（0.614kg，4.37mol，0.507Ｌ）を ８〜12mL／minの流量で反応混合物に添加した。その反応混合物を室温まで昇温 させ17時間放置した。反応混合物を濾過して沈澱した塩を除き、次に濾液を減圧 下で濃縮して大部分のジクロロメタンを除いた。少量の試料を¹Ｈ−NMR試験用に 採取した。¹ Ｈ−NMR（CDCl₃）δ：5.75（1H，dd，J_2.3=10.6 Hz，H-2），5.56（1H，s，CHP h），5.25（1H，dd，J_3.4=3.44 Hz，H-3），4.69（1H，d，J_1.2=8.48 Hz，H-1） ，4.48（1H，bd，H-4），1.15（3H，t，OCH₂H₃）。 濃縮液に水（180mL）を添加し、得られた反応混合物を4０℃で２時間撹拌した 。そのとき、反応混合物をさらに濃縮して黄色の残留物を得た。これをジクロロ メタン（11Ｌ）に溶解し、50Ｌの抽出器に移した。この有機溶液を、氷冷0.5Ｎ HCl水溶液（11Ｌ）、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（11Ｌ）、および冷水（11 Ｌ）で続けて抽 出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウム（1.0kg）で乾燥し、濾過し、濾 液を蒸発させて黄色の固体を得て、これを高真空度下で乾燥した。この反応を、 ヘキサン：酢酸エチル１：１で展開するシリカゲルのTLCで監視した。この固体 を熱エタノール（9.5l）に溶解し、冷却して濾過した後、エチル２−Ｏ−ベンゾ イル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物９）（ 0.737kg，1.85mol）を収率59％で得た。¹ Ｈ−NMR（CDCl₃）δ：5.59（1H，s，CHPh），5.36（1H，dd，J_2.3=10.07 Hz，H -2），4.64（1H，d，J_1.2=8.21 Hz，H-1），1.15（3H，t，OCH₂H₃）。 ベンゾエート基がＣ−２にありそしてＣ−３が遊離ヒドロキシル基を有してい ることを確認するため、トリクロロアセチルイソシアネートを１滴NMR用試料に 加えてそのスペクトルを再び得た。このスペクトルには、Ｃ−３位がエステル化 されているガラクトースのＨ−３について典型的なδ＝5.27における、ロウフィ ールド二重線（low field doublet）の二重線が含まれていた。反応混合物から 得た原濾液は追加量の生成物を含有していた。 実施例10：エチル（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−Ｏ−（２−Ｎ −アリルオキシカルボニル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１ −３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物10） エチル２−Ｏ−ベンゾイル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピ ラノシド（化合物９）（0.76ｇ，1.9mmol）、４Åモレキュラーシーブ（２ｇ） 、ジクロロメタン（10mL）、コリジン（0.278mL，2.1mmol）およびトリフルオロ メタンスルホン酸銀（0.522ｇ，２mmol）の混合物を−25℃まで冷却し、４−Ｏ −（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）− ３， ４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グル コピラノシルクロリド（化合物６；1.484ｇ，２mmol）をジクロロメタン（５mL ）に溶解して得た溶液を滴下して加えた。上記クロリドの添加を完了した後、生 成した混合物を撹拌し周囲温度まで昇温させた。２時間後、混合物をジクロロメ タンで希釈し、濾過した。濾液を、重亜硫酸ナトリウム水溶液、塩酸、炭酸水素 ナトリウム水溶液、および最後に水で続けて洗浄した。得られた有機層を無水硫 酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させて固体の塊を得た。これをジクロロメ タン：ヘキサンから再結晶させた。 得られた、充分に保護された三糖（0.66ｇ）を、80％酢酸水溶液（５mL）で、 80℃にて２時間処理し、次いで溶媒を蒸発させて除いた。残留物をトルエン−酢 酸エチルとともに２回共蒸発させ、得られた残留物をエタノール（10mL）に溶解 した。ヒドラジン水和物（0.3mL）を添加し、得られた混合物を17時間還流して 沈澱を得た。この沈澱を濾過し乾燥して固体（0.45ｇ）を得た。この固体をメタ ノール：水（５：１）に溶解し、次いでジアリルピロカーボネート（0.166mL） で１時間処理した。得られた混合物を蒸発させてジクロロメタンと水に分配した 。水性層を分離し濃縮して化合物10を残留物として得て、その残留物を酢酸エチ ル：アセトン（２：１）で研和して固化させた。 上記のようにして標題の三糖（化合物10）を得たが、これを酵素によってシア リル化して、エチル〔ナトリウム（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α −Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノニュロピラノシロネート）〕−（２−３）− Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−Ｏ−（２−Ｎ−アリルオキ シカルボニル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１−３）−Ｏ− β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物11）を得た。これは、下記の 方法で製造した化合物と同一であった。 実施例11：エチル〔ナトリウム（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α− Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノニュロピラノシロネート）〕−（２−３）−Ｏ −（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−Ｏ−（２−Ｎ−アリルオキシ カルボニル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１−３）−Ｏ−β −Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物11） ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼを用い、 二糖（化合物９）を酵素によって転化させて標題の化合物（化合物11）を製造す る方法を以下に説明する。 水（12Ｌ）にＮ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２−エタン スルホン酸〕（0.410kg）を加え、生成した溶液のpHを7.5に調節した。ウシ血清 アルブミン（17ｇ）を添加し、その混合物を、完全な溶液が得られるまで撹拌し た。エチル３−Ｏ−（２−Ｎ−アリルオキシカルボニル−２−アミノ−２−デオ キシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物９） （0.3kg）、グルコース−１−ホスフェート（0.271kg）、ホスホエノールピルベ ート（0.177kg）、塩化カリウム（0.087kg）、アジ化ナトリウム（8.4ｇ）およ びウリジン−５′−ジホスフェート（8.76ｇ）を加え、得られた混合物を、すべ ての固体が溶解するまで撹拌した。次に塩化マンガン（１Ｍ，506mL）および塩 化マグネシウム（１Ｍ，168mL）を添加した。ピルビン酸キナーゼ（42,000Ｕ） 、ウリジン−５′−ジホスフェート−グルコースピロホスホリラーゼ（2,000Ｕ ）、無機ピロホスファターゼ（8,400Ｕ）、ウリジン−５′−ジホスフェート− ガラクトースエピメラーゼ（91,000Ｕ）およびウリジン−５′−ジホスフェート −ガラクトシルトランスフェラーゼ（8,850Ｕ）を次に添加した。反応混合物の 最終容積を水によって17Ｌに調 節した。48時間後に塩化マグネシウム（１Ｍ，340mL）を添加した。この反応は 、イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム（４：１）で展開されるシリカゲル のTLCによって監視した。８〜９日後TLCは反応が95％以上進行したことを示し、 その時点で下記の溶液を調製した。 Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−［２−エタンスルホン酸〕 （0.528kg）の水（15Ｌ）溶液を調製し、得られた溶液のpHを7.5に調節した。ウ シ血清アルブミン（22ｇ）、アジ化ナトリウム（11.5ｇ）、シアル酸（0.242kg ）、ホスホエノールピルベート（0.395kg）、シチジン−５′−モノホスフェー ト（25ｇ）、アデノシン−５′−トリホスフェート（4.7ｇ）、塩化マンガン（ １Ｍ，780mL）を添加した。この溶液にピルビン酸キナーゼ（207,000Ｕ）、ミオ キナーゼ（125,000Ｕ）、シチジン−５′−モノホスフェート−Ｎ−アセチルノ イラミン酸シンテターゼ（3245Ｕ）、無機ピロホスファターゼ（9400Ｕ）および α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（1640Ｕ）を添加した。この混合物の 容積を22Ｌに調節し、この溶液をガラクトシルトランスフェラーゼ反応液に添加 した。この反応はイソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム４：１で展開するシ リカゲルのTLCで監視した。10〜12日後、TLCは反応が進行したことを示し、標題 化合物の化合物11が95％以上得られた。 実施例12：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７， ８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノニュロピ ラノシロネート）〕−（２−３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β −Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−Ｏ−（３，６−ジ−Ｏ−アセチル− ２−Ｎ−アリルオキシカルボニル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル） −（１−３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガ ラクトピラノシド（化合物12） エチル〔ナトリウム（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリ セロ−Ｄ−ガラクト−ノニュロピラノシロネート）〕−（２−３）−Ｏ−（β− Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−Ｏ−（２−Ｎ−アリルオキシカルボニ ル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （化合物11）の溶液（40Ｌ）を紙で濾過した。濾液を50Ｌのロータベーパー（ro tavapor）内で蒸発させて濃厚シロップを得た。このシロップをピリジンととも に２回共蒸発させ（２×２Ｌ）次に減圧下で20時間保持した。該蒸発フラスコに 、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（20ｇ）をピリジン（12Ｌ）に溶解して得た 溶液を入れた。ロータベーパーの浴に氷−水混合物を入れ、無水酢酸（６Ｌ）を １時間かけて添加しながら回転を続けた。添加を完了してから２時間後、さらに 無水酢酸（２Ｌ）を加え、得られた混合物を、室温でゆっくり回転させながら20 時間放置した。完全なアセチル化を保証するため、さらに無水酢酸（１Ｌ）を添 加し、混合物をさらに24時間回転させた。反応はTLC（酢酸エチル：ヘキサン： エタノール、１０：１０：３）によって検査した。 反応が完了したとき、減圧にして、14Ｌの留出物を収集した。得られた残留物 に、メタノール（15Ｌ）を１時間かけて添加し、次いでその混合物を室温で20時 間回転させた。この時点で、シリカゲル（酢酸エチル：ヘキサン：エタノール、 １０：１０：３およびジクロロメタン：アセトン：３：２）のTLCは、メチルエ ステルモノヒドロキシ化合物であるゆっくり移動するスポットに、ラクトンが完 全に転化したことを示した。その混合物を濃縮し（18Ｌ蒸発させた）、混合物を 氷水で冷却し、無水酢酸（３Ｌ）を30分かけて添加した。混合物を20時間放置し た。シリカゲルのTLC（ジクロロメタン：アセ トン、３：２）はアセチル化が完了したことを示し、生成物はわずかに早く移動 していた。 メタノール（１Ｌ）を添加して過剰の無水酢酸を破壊したがその間わずかに発 熱するのがみとめられた。１時間後、混合物を濃縮してシロップを得、このシロ ップを、酢酸エチル−水の混合物（13／13Ｌ）を利用して50Ｌの抽出器に移した 。混合物を激しく撹拌した。相分離させた後、下方の水性層を抜き出し、残って いる有機層を紙で濾過した。濾液を５％塩酸（15Ｌ）で洗浄し（その水性層は洗 浄後、pH紙に対して依然として強い酸性でなければならない）、次に１Ｍ重炭酸 ナトリウム水溶液（15Ｌ）で洗浄した（その水性層は洗浄後、pH紙に対して依然 としてアルカリ性でなければならない）。その有機層を20Ｌの容器に移し、無水 硫酸ナトリウムで乾燥し濾過した。 濾液を濃縮して半固体の残留物を得た。この残留物をジクロロメタン（３Ｌ） に溶解し、次いでジクロロメタン中にパックしたシリカゲルのカラム（10kg）に 加えた。溶離を、第一にジクロロメタン（25Ｌ）で行い、次に３：１ジクロロメ タン：アセトン（25Ｌ）で、最後に１：１ジクロロメタン：アセトン（50Ｌ）で 行い、生成物を含有する画分を得た。ベースラインの分離を二糖の物質から行っ たが、わずかに速く移動する痕跡の物質のためごくわずかしか分離されなかった 。生成物を含有する画分を蒸発させ、ジクロロメタン（1.5Ｌ）に再び溶解した 。この溶液を、激しく撹拌されている、エチルエーテル（7.5Ｌ）とヘキサン（1 0Ｌ）の混合物にゆっくり添加した。生成した沈澱を濾過し、２：１エーテル： ヘキサンで洗浄し、一夜風乾し、次いで高真空度下で48時間乾燥した。この沈澱 は、¹Ｈ−NMRによって標題の化合物12であることが示され、少量の溶媒（１〜５ ％ 重量／重量）が残っていた。¹ Ｈ−NMR（CDCI₃）δ：4.67（d，1H，H-1″），4.49（d，1H，H-1′），4.33（d ，1H，H-1）。 実施例13：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７， ８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノニュロピ ラノシロネート〕−２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ −ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−３， ６−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２，４ ，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物13） エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノニュロピラノ シロネート〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（２−アリルオキシカルボニルアミド −２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（ １，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （化合物12）（5.10ｇ，3.80mmol）を無水THFに溶解し、アルゴン雰囲気下室温 で撹拌し、次いでポリメチルヒドロシロキサン（420μｌ）を添加した。その反 応混合物を、アルゴンを用いて、減圧／パージのサイクルを３回実施して溶液の 脱ガスを行った。フラスコをアルミニウムホイルで包み溶液に光が当らないよう にし、次いでこの溶液を、パラジウムテトラキストリフェニルホスフィン〔Pd（ PPh₃）₄；158mg，0.14mmol〕で処理した。室温で18時間撹拌後、10：１CHCl₃：M eOHで展開されるTLCは、化合物12が完全に消費され、rf値が小さい単一の生成物 が存在することを示した。その反応混合物を600mLのEtOAcで希釈し、次に水（１ ×200mL）お よび飽和NaCl溶液（１×200mL）で洗浄した。有機溶液を乾燥し（MgSO₄）、濾過 し、ロータリーエバポレーションで濃縮し、次に３：１EtOAc：アセトンを溶離 剤として用いるシリカゲルカラム（65mm×10″）のフラッシュクロマトグラフィ ーに付した。生成物を含有する画分（TLCによって判断）を集め濃縮して、化合 物13（4.42ｇ，87％）を黄褐色の固体として得た。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，δ（ppm）：CHCl₃に対する）5.50（m，1H），5.44（dd，J= 6 Hz，J=2 Hz，1H），5.35-5.01（m），4.89（m，2H），4.63（d，J=6 Hz，1H） ，4.59-4.35（m），4.22-3.38（m），3.81（s，3H），2.69（m，1H），2.57（dd ，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.85（12s，36H），1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.21（t，J=5Hz，3H）。 実施例14：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７， ８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノニュ ロピラノシロネ-ト〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル− β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ −６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２，４， ６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物14） 栓をしたフラスコ内で化合物13（4.42ｇ，3.29mmol）を366mLの４：１MeOH：H₂ Oに溶解し次に室温で撹拌し、次いで氷酢酸（188μｌ，3.29mmol）を添加した 。得られた淡黄色の溶液を50℃まで加熱した。48時間後、TLC（10：１CHCl₃：Me OH使用）は、化合物13がほぼ完全に消失し、そしてＲ_f値がわずかに高い優勢な 生成物が出現したことを示した。反応混合物を室温まで冷却させ、ロータリーエ バポレーションで濃縮して油状物を得、次いで10：10：４EtOAc： ヘキサン：MeOHを溶離液として用いるシリカゲルの65mm×10″のカラムのクラッ シュクロマトグラフィーに付した。生成物を含有する画分（TLCで判断）を集め て濃縮し、化合物14（2.78ｇ，65％）を泡状物として得た。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，δ（ppm）：CHCl₃に対する）5.50（m，1H），5.40（d，J=2 Hz，1H），5.25（d，J=7 Hz，1H），5.17（dd，J=6 Hz，J=7 Hz，1H），5.04（ dd，J=6 Hz，J=7 Hz，1H），4.89（d，J=3 Hz，1H），4.63（d，J=6 Hz，1H）， 4.59（dd，J=3 Hz，J=7 Hz，1H），4.42-3.40（m），3.81（s，3H），2.69（m， 1H），2.57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.85（12s，36H），1.77（dd， J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.21（t，J=5 Hz，3H）。 実施例15：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７， ８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノニュ ロピラノシロネート〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル− β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（２−ベンズアミド−２−デ オキシ−６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２ ，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物15） 化合物14（150mg，0.12mmol）を２mLのジクロロメタンに溶解し、これをアル ゴン雰囲気下室温で撹拌し、次いで無水NaHCO₃（40mg，0.48mmol）およびベンゾ イルクロリド（34mg，0.24mmol，28μＬ）を添加した。24時間撹拌した後、TLC （80：20EtOAc：アセトン）は出発原料が完全に消費され、Ｒ_f値がわずかに高い 物質が出現したことを示した。反応混合物を150mLの酢酸エチルで希釈し、水で 洗浄した（１×50mL）。有機溶液を乾燥し（MgSO₄）、濾過し、濃縮し、次に90 ：10EtOAc：アセトンを溶離液として用いるシリカゲルカ ラムのフラッシュクロマトグラフィーに付した。生成物を含有する画分（TLCで 判断）をプールし、ロータリーエバポレーションおよび高真空度で濃縮してクリ ーム色のワックス状固体の化合物15（140mg，83％）を得た。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，δ（ppm）：CHCl₃に対する）7.75（d，J=7 Hz，2H），7.45 （d，J=7 Hz，1H），7.39（dd，J=7 Hz，J=7 Hz，2H），6.45（d，J=5 Hz，1H） ，5.50（m，1H），5.40（d，J=2 Hz，1H），5.37（d，J=2 Hz，1H），5.27（m， 1H），5.09（m，1H），4.82（d，J=3 Hz，1H），4.63（d，J=6 Hz，1H），4.59 （dd，J=3 Hz，J=7 Hz，1H），4.39-3.40（m），3.81（s,3H），3.19（m，1H） ，2.57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.85（12s，36H），1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.15（t，J=5 Hz，3H）。 実施例16：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７， ８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノニュ ロピラノシロネート〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル− β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（２，３，４−トリ−Ｏ− ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３）〕−Ｏ−（２−ベンズアミド −２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（ １，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （化合物16） １mLのジクロロメタンに化合物15（140mg，0.1mmol）を溶解し、これをアルゴ ン雰囲気下室温で撹拌し、次いで粉末にして炎で乾燥した４Åモレキュラーシー ブ（100mg）、テトラメチル尿素（120μＬ，１mmol）およびトリ−Ｏ−ベンジル フコシルフルオリド（218mg，0.5mmol）を添加した。室温で１時間撹拌後、反応 混合物を−20℃まで冷却し、次いでSnCl₂（95mg，0.5mmol）およびAgClO₄（126m g， 0.5mmol）で処理した。次いで反応混合物をゆっくり室温まで昇温させた。24時 間撹拌後TLC（10：１CHCl₃：MeOH）は、出発物質がほぼ完全に消費され、Ｒ_f値 がわずかに小さい物質が出現したことを示した。 反応混合物を、50mLのジクロロメタンを用いてセライトのプラグで濾過し、濾 液を水（２×50mL）で洗浄した。有機溶液を乾燥し（MgSO₄）、濾過し、濃縮し 、次いで10：10：３EtOAc：ヘキサン：MeOHを溶離液として用いるシリカゲルの カラム（20mm×６″）のフラッシュクロマトグラフィーに付した。生成物を含有 する画分（TLCで判断）をプールし、ロータリーエバポレーションおよび高真空 度下で濃縮して白色の膜状物の化合物16（140mg，77％）を得た。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，δ（ppm）：CHCl₃に対する）7.46（d，J=7 Hz，2H），7.35 -7.12（m，18H），6.45（d，J=6 Hz，1H），3.82（s，3H），3.20（m，1H），2. 55（dd，J=4 Hz，J=12 Hz，1H），1.18（d，J=6 Hz，3H），1.10（t，J=6 Hz，3 H）。 実施例17：エチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ −Ｄ−ガラクト−２−ノニュロピラノシロネ−ト）−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ −ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（ １，３）〕−Ｏ−（２−ベンズアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシ ル）−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物17） 化合物16（140mg，77mmol）を４mLのメタノールに溶解して撹拌し次いでこの 溶液に水酸化パラジウム／炭素（140mg，20重量％のパラジウム）を添加した。 得られたスラリーに、水素ガスによる減圧／パージのサイクルを３回行い、次い で室温で一気圧の水素雰囲気下に保持した。１時間後、TLC（５：１EtOAc：MeOH ）は、化合物16が完全に消失し、単一のＲ_f値が低い物質が出現したことを示し た。 得られたスラリーを、50mLのメタノールを用い、セライトのプラグで濾過し、ロ ータリーエバポレーションで濃縮して油状物を得た。 この油状物を、栓付きのフラスコ中で５mLの４：１MeOH：H₂Oに溶解し、室温 で撹拌した。この撹拌溶液に、ナトリウムメトキシドの粉末（140mg，2.6mmol） を添加した。16時間後、TLC（60：50：15，CHCl₃：MeOH：15mM CaCl₂）は出発物 質が完全に消失し、単一のＲ_f値が低い生成物が出現したことを示した。 その混合物を１ｇのDowex 50X8-400カチオン交換樹脂（Ｈ型、新たにメタノー ルで洗浄）で処理し１時間撹拌した。混合物を燃焼ガラス漏斗で濾過し、濾液を ロータリーエバポレーションで濃縮して油状物を得た。この物質を、0.1Ｍ重炭 酸アンモニウムを溶離液として用いる、Bio-Rad Bio-Gel P2ゲル濾過媒体（メッ シュサイズ：fine）のカラム（40mm×８″）のクロマトグラフィーに付した。生 成物を含有する画分（TLCで判断）を集め、凍結乾燥して白色粉末の化合物17（6 0mg，72％）を得た。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，δ（ppm）：HODに対する）7.70（d，J=7 Hz，2H），7.55（ d，J=7 Hz，1H），7.47（dd，J=7 Hz，J=7 Hz，2H），5.O8（d，J=4 Hz，1H）， 4.50（d，J=8 Hz，1H），4.27（d，J=8 Hz，1H），4.10（d，J=3 Hz，1H），4.0 5-3.40（m），2.70（dd，J=4.6 Hz，J=12.4Hz，1H），1.97（s，3H），1.74（dd ，J=12.4 Hz，J=12.4 Hz，1H），1.10（t，J=7 Hz，3H），1.07（d，J=7 Hz，3H ）。 実施例18：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７， ８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノニュ ロピラノシロネート〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル− β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル ）−（１，３）〕−Ｏ−（２−２′−ナフアミド−２−デオキシ−３，６−ジ− Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２，４，６−ト リ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物29） ５mLのメタノールに化合物25（化合物１６と類似の方法で製造した；90mg，48 μmol）を溶解して撹拌し、次いでこの溶液に水酸化パラジウム／炭素（40mg，4 0重量％のパラジウム）を添加した。得られたスラリーを、水素ガスを用いて、 減圧／パージのサイクルを３回行い次いで１気圧の水素雰囲気下室温で保持した 。24時間後、TLC（90：10，CHCl₃：MeOH）は化合物25が完全に消失し、Ｒ_f値が 低い単一の物質が出現したことを示した。得られたスラリーを50mLのメタノール を用いてセライトのプラグで濾過し、ロータリーエバポレーションで濃縮してク リーム色のワックス状固体を得た。生成物を、９：10 CHCl₃：MeOHを溶離剤とし て用いるシリカゲルのカラムのフラッシュカラムクロマトグラフィーで処理した 。生成物を含有する画分（TLCで判断）をプールし、濃縮して、化合物29（55mg ，72％）を白色ワックス状固体として得た。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，δ（ppm）：CHCl₃に対する）8.39（s，1H），7.94（d，J=7 Hz，1H），7.82（m，2H），7.57（m，2H），7.37（m，1H），5.57-5.41（m，3H ），5.22（d，J=7 Hz，1H），5.15（m，1H），4.97-4.39（m），4.35（d，J=4 H z，2H），4.19-3.42（m），3.81（s，3H），3.23（m，1H），2.75（bs，1H），2 .57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.85（12s，36H），1.77（dd，J=10 Hz ，J=10 Hz，1H），1.23（d，J=5 Hz，3H），1.05（t，J=5 Hz，3H）。 上記の方法に実質的に類似の方法にしたがい、化合物14の化合物15，16および 17への転化を示す図式３のようにして、化合物18〜38も製造した。以下の表１， ２および３は、化合物15，16または17に対する化合物の基の一般化した構造を示 し、これらの各化合物の他 の関連するデータを提供する。表１は各Ｒ¹基を製造するのに用いられるアシル 化剤を示す。表１〜３に続いて、上記の化合物のいくつか、およびインヒビター 化合物30〜38の、最終ステップの収率を含むNMRと追加のデータを示す。 実施例19：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７ ，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ −Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４ ，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ− （２−ベンジルオキシカルボニルアミド−２−デオキシ−６−Ｏ−アセチル−β −Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル −β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物39） CH₂Cl₂（2.0ml）に溶解した塩化ベンジルオキシカルボニル（CBZ-Cl）（1.2ml ，8.4mmol）の溶液をCH₂Cl₂（）中の化合物14ａ（10.8ｇ，8.3mmol）及びNaHCO₃ （1.4ｇ，16.6mmol）の混合物に滴下し、反応混合物を一夜（約18時間）攪拌し た。この混合物にNaHCO₃（1.4ｇ，16.6mmol）及びCBZ-Cl（1.2ml，8.4mmol）を 加え、その結果生じた混合物をさらに４時間攪拌した。その結果生じた混合物を AcOEtで希釈し、H₂Oで洗浄して、MgSO₄上で脱水し、濾過して濃縮した。残渣を シリカゲル上でクロマトグラフィー処理して化合物39（7.75ｇ、収率65％）を白 色固体として得た。 実施例20：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７ ，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌ ロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル −β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（２，３，４−トリ−Ｏ −ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３）〕−Ｏ−（２−ベンジルオ キシカルボニルアミド−２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グ ルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ −ガラクトピラノシド（化合物40） 100mlのClCH₂CH₂Clに溶解した化合物39（3.90ｇ，2.72mmol）の攪拌溶液に、 粉末分子ふるい（MS4A）（12ｇ）、テトラメチル尿素（TMU）（3.25ml,，27.2mm ol）及びフッ化２，３，４−トリ−Ｏ− ベンジル−Ｌ−フコシル（CMH-0.48，5.94ｇ，13.6mmol）を加えた。室温で90分 間攪拌後、混合物を遮光し、−20℃に冷却して、SnCl₂（2.59ｇ，13.6mmol）及 びAgClO₄（98％，2.88ｇ，13.6mmol）で処理した。反応混合物を90分間かけて室 温に温めて、24時間攪拌した。反応を完了させるために、TMU（1.95ml，16.3mmo l）、CMH-048（3.56ｇ，8.16mmol）、SnCl₂（1.55ｇ，8.17mmol）及びAgClO₄（1 .73ｇ，8.17mmol）を０℃で再び混合物に加え、その後これを徐々に室温に温め た。48時間後、その結果生じた混合物をセライトCeliteのパッドを通して濾過し 、濾液をH₂Oで洗浄した。有機相をNa₂SO₄上で脱水し、濾過して濃縮し、シリカ ゲル上でクロマトグラフィー処理（ヘキサン／AcOEt／MeOH＝10／10／２）して 、化合物40（3.65ｇ、収率73％）を生成し、出発物質である化合物39（672mg、 収率73％）を回収した。 実施例21：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７ ，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌ ロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル −β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシ ル）−（１，３）〕−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−アセ チル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ− アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物41） EtOH（80ml）中の化合物40（3.06ｇ，1.66mmol）、HCOONH₄（1.05ｇ，16.6mmo l）及び10％ Pd−Ｃ（湿潤、3.0ｇ）の混合物を9.5時間攪拌しながら還流した 。この混合物にさらにHCOONH₄（1.05ｇ，16.6mmol）及び10％ Pd−Ｃ（3.0ｇ） を加え、その結果生じた混合物をセライトのパッドを通して濾過し、濃縮して、 化合物41（2.30ｇ、収率96％）を白色固体として得た。 実施例22：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７ ，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌ ロピラノシロネート）］−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル −β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシ ル）−（１，３）〕−Ｏ−〔２−（３，５−ジクロロベンゾイルアミド）−２− デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−（１，３ ）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合 物42） CH₂Cl₂（8.9ml）に溶解した化合物41（40mg，0.028mmol）の攪拌溶液に、NaHC O₃（46mg，0.54mmol）及び塩化３，５−ジクロロベンゾイル（58.6mg，0.28mmol ）を加えた。室温で12時間後、反応混合物をEtOAcで希釈し、H₂Oで洗浄した。有 機相をMgSO₄上で脱水し、濾過し、蒸発させて、粗製化合物42（98.4mg）を淡黄 色油として得た。 実施例23：エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７ ，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌ ロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル −β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシ ル）−（１，３）〕−Ｏ−〔２−（３，５−ジクロロベンズアミド）−２−デオ キシ−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−（１，３）− Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物43 ） MeOH（8.9ml）に溶解した粗製化合物42（98.4mg）の攪拌溶液に、28％ NaOMe MeOH（300μｌ）を加えた。室温で48時間後、混合物をDOWEX 50W-X8（Ｈ⁺形態） で中和して、濾過した。濾液を濃縮し、 EtOAcで希釈して、H₂Oで抽出した。水性相を蒸発させて対応するエステルを得た 。エステルをH₂O（5.0ml）中で１Ｎ−NaOH（200μｌ）で処理した。混合物を室 温で12時間攪拌し、DOWEX 50W-X8（Ｈ⁺形態）で中和して、濾過した。濾液を濃 縮し、ゲル（D2）濾過（溶離液としてH₂O）により精製し、凍結乾燥して化合物4 3（31.6mg、定量的収率）白色粉末として得た。¹ Ｈ−NMR（270 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.61（s，3H），5.00（d，J=3.96 Hz，1H），4.47（d，J=7.59 Hz，1H），4.26（d，J=7.92 Hz，1H），4.09（d，J =2.97 Hz，1H），4.04-3.30（m），2.67（m，1H），1.94（s，3H），1.72（t，J =11.88 Hz，1H），1.09（m，6H）。 化合物18−28のNMRデータ エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシ ロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（２−ｐ−フルオロベンズアミド−２ −デオキシ−６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−（１，３）−Ｏ −２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物18）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に関するδ（ppm））7.79（m，2H），7.15（m，2H） ，6.41（d，J=5 Hz，1H），5.53（m，1H），5.42（m，1H），5.23（d，J=7 Hz， 1H），5.17（m，2H），4.89（d，J=3 Hz，1H），4.63（d，J=6 Hz，1H），4.59 （dd，J=3 Hz，J=7 Hz，1H），4.42-3．40（m），3.81（s，3H），3.19（m，1H ），2.57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.65（12s，36H），1.77（dd，J= 10 Hz，J=10 Hz，1H），1.15（t，J=5 HZ，3H）。 エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４， ７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノ ヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチ ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（２−ｐ−ニトロベンズ アミド−２−デオキシ−６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−（１ ，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ 化合物19）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に対するδ（ppm））8.22（d，J=8 Hz，2H），7.95（ d，J=8 Hz，2H），6.81（d，J=5 Hz，1H），5.59-5.37（m，2H），5.21（d，J=4 Hz，1H），5.11（m，2H），4.89（d，J=2 Hz，1H），4.63（d，J=5 Hz，1H）， 4.59（dd，J=1 Hz，J=7 Hz，1H），4.42-3.40（m），3.79（s，3H），3.19（m， 1H），2.57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.85（12s，36H），1.77（dd， J=10 Hz，J=10Hz，1H），1.15（t，J=5 Hz，3H）。 エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシ ロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔２−（Ｅ−１−オキソ−３−フェニ ルプロプ−２−エン）アミノ−２−デオキシ−６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グル コピラノシル］−（１，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシド（化合物20）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に関するδ（ppm））7.57（d，J=11 Hz，1H），7.45- 7.25（m，5H），6.39（d，J=11 Hz，1H），5.87（d，J=4 Hz，1H），5.45（m，1 H），5.39（m，2H），5.21（t，J=7 Hz，1H），5.17-4.97（m，2H），4.89（d， J=2 Hz，1H），4.63（d，J=5 Hz，１H），4.59（dd，J=1 Hz，J=7 Hz，１H），4 .42-3.40（m），3.79（s，3 H），3.05（m，1H），2.57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.85（12s，36H ），1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.15（t，J=5 Hz，3H）。 エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシ ロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（２−２′−ナフタミド−２−デオキ シ−６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−（１，３）−Ｏ−２，４ ，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物21）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に関するδ（ppm））8.25（s，1H），7.95-7.42（m， 6H），6.58（d，J=5 Hz，1H），5.53（m，1H），5.44（d，J=2 Hz，1H），5.41- 5.23（m），5.17-5.01（m），4.89（d，J=3 Hz，1H），4.63（d，J=6 Hz，1H） ，4.59（dd，J=3 Hz，J=7 Hz，1H），4.42-3.40（m），3.81（s，3H），3.27（m ，1H），2.57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.85（12s，36H），1.77（dd ，J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.15（t，J=5 Hz，3H）。 エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシ ロネート）］−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル− α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３）〕−Ｏ−（２−ｐ−フルオロベンズアミ ド−２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）− （１，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシ ド（化合物22）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に関するδ（ppm））7.42（m，2H），7.39-7.17（m， 15H），6.95（t，J=7 Hz，2H），6.45（d，J=5 Hz，1H），5.57-5.37（m，3H） ，5.27（d，J=7 Hz，1H），5.17-4.45（m），4.39（d，J=7 Hz，1H），4.25-3.4 1（m），3.81（s，3H），3.21（m，1H），2.57（dd，J=3 Hz，J=10Hz，1H），2. 27-1.85（12s，36H），1.77（dd，J=10Hz，J=10 Hz，1H），1.19（d，J=5 Hz，3 H）1.15（t，J=5 Hz，3H）。 エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシ ロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル −α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３）〕−Ｏ−（２−ｐ−ニトロベンズアミ ド−２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）− （１，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ ド（化合物23）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に関するδ（ppm））8.15（d，J=8 Hz，2H），7.55（ d，J=8 Hz，2H），7.41-7.15（m，15H），6.63（d，J=5 Hz，1H），5.48（m，1H ），5.43（dd，J=6 Hz，J=2 Hz，1H），5.37（d，J=6 Hz，1H），5.19（d，J=8 Hz，1H），5.15-4.45（m）4.42（t，J=4 Hz，1H），4.25（m，2H），4.18-3.40 （m），3.82（s，3H），3.25（m，1H），2.59（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2. 27-1.85（12s，36H），1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.19（d，J=5 Hz， 3H）1.15（t，J=5 Hz，3H）。 エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシ ロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２， ４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ −〔（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３ ）〕−Ｏ−〔２−（Ｅ−１−オキソ−３−フェニルプロプ−２−エン）アミノ− ２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１ ，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ 化合物24）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に関するδ（ppm））7.42（d，J=11 Hz，1H），7.39- 7.15（m，20H），5.94（d，J=11 Hz，1H），5.85（d，J=4 Hz，1H），5.55-5.29 （m，4H），5.17-4.42（m），4.25（m，2H），4.17-3.40（m），3.79（s，3H） ，3.05（m，1H），2.57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.85（12s，36H） ，1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.19（d，J=5 Hz，3H）1.15（t，J=5 Hz ，3H）。 エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシ ロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル −α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３）〕−Ｏ−〔２，２′−ナフタミド−２ −デオキシ−３，６−ジ−０−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１， ３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化 合物25）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に関するδ（ppm））8.13（s，1H），7.84（d，J=7 H z，1H），7.78（d，J=7 Hz，1H），7.57（m，2H），7.37-7.11（m，16H），6.98 （d，J=7 Hz，1H），6.65（d，J=5 Hz，1H），5.57-5.35（m，2H），5.22（d，J =7 Hz，1H），5.15-5.01（m，3H），4.97-4.45（m），4.25（m，2H），4.19-3.4 2（m），3.81（s，3H），3. 23，（m，1H），2.57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.85（12s，36H），1 .77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.19（d，J=5 Hz，3H）1.05（t，J=5 Hz，3 H）。 エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシ ロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１ ，３）〕−Ｏ−〔２−ｐ−フルオロベンズアミド−２−デオキシ−３，６−ジ− Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２，４，６−ト リ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物26）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に関するδ（ppm））7.83（m，2H），7.17（m，2H） ，5.45（m，1H），6.40（m，2H），5.23（d，J=5 Hz，1H），5.17-4.75（m，3H ），4.77-4.45（m，4H），4.36（m，2H），4.19-3.41（m），3.81（s，3H），3. 09（bs，1H），2.62（m，1H），2.57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.27-1.85 （12s，36H），1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.24（d，J=5 Hz，3H）1.1 5（t，J=5 Hz，3H）。 エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシ ロネート）〕−（２，３）−０−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１ ，３）〕−Ｏ−〔２−ｐ−アミノベンズアミド−２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ −アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２，４，６−トリ −Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合 物27）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に関するδ（ppm））7.61（d，J=8 Hz，2H），2H）， 6.75（d，J=5 Hz，1H），6.57（d，J=8 Hz，2H），5.57（m，1H），5.43（dd，J =6 Hz，J=2 Hz，1H），5.27（d，J=2 Hz，1H），5.19（d，J=8 Hz，1H），5.09 （m，1H），4.95（m，2H），4.77-4.63（m），4.55（dd，J=7 Hz，J=1 Hz，1H） ，4.42（t，J=4 Hz，1H），4.35（m，2H），4.21-3.38（m），3.82（s，3H），3 .17（m，1H），2.95（bs，1H），2.59（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.42（bs ，1H），2.27-1.85（12s，36H），1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.22（d ，J=5 Hz，3H）1.15（t，J=5 Hz，3H）。 エチル〔メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシ ロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１ ，３）〕−Ｏ−〔２−（３′−フェニル）−プロピオンアミド−２−デオキシ− ３，６−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２ ，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物28）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，CHCl₃に関するδ（ppm））7.29（m，5H），6.39（d，J=2 H z，1H），5.85（d，J=4 Hz，1H），5.55-5.19（m，5H），5.11（t，J=5 Hz，1H ），4.95（m，4H），4.71-4.35（m），4.17-3.22（m），3.79（s，3H），2.95（ t，J=3H，2H），2.57（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.47（t，J=3 Hz，2H），2 .27-1.85（12s，36H），1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，1H），1.24（d，J=5 Hz ，3H）1.15（t，J=5 Hz，3H）。 化合物30−38に関するデータ エチル〔（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ− ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラ クトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３ ）〕−Ｏ−（２−ｐ−フルオロベンズアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピ ラノシル）−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物30） Ｒ_f−0.62（３：１ ｉ−PrOH：NH₄OAc）、白色固体、41mg，96％。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.83（m，2H，aromatic），7.25（ m，2H，aromatic），5.18（d，J=5 Hz，H-1（fuc），1H），4.95（m），4.56（d ，J=8 Hz，1H），4.37（d，J=8 Hz，1H），4.19（d，J=3.5 Hz，1H），4.15-3.4 2（m），2.77（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，1H），2.05（s，3H，NAc），1.79（dd，J =10 Hz，J=10 Hz，1H），1.19（m，3H）。 エチル〔（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ− ガラクト−２−ノヌロピラノシロネ−ト）〕−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラ クトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３ ）〕−Ｏ−（２−ｐ−アミノベンズアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラ ノシル）−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物31） Ｒ_f−0.52（３：１ ｉ−PrOH：NH₄OAc）、白色固体、26mg，96％。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.65（d，J=9 Hz，２H，aromatic ），6.82（d，J=9 Hz，2H），5.19（d，J=3 Hz，H-1-fuc，1H），4.95（m），4. 59（d，J=8 Hz，1H），4.38（d，J=8 Hz，1H），4.19（d，J=2 Hz，1H），4.15- 3.42（m），3.19（q，J=6 Hz，2H，CH₂CH₃），2.79（dd，J=3 Hz，J=11 Hz，H_eq -3（sialic acid），1H）， 2.05（s，3H，NAc），1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，H_at-3（sialic acid），1H ），1.19（d，J=6 Hz，3H，H-6-fuc），1.17（t，J=6 Hz，3H）。 エチル〔（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ− ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラ クトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３ ）］−Ｏ−〔（２−（３′フェニル）−プロピオンアミド−２−デオキシ−β− Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合 物32） Ｒ_f＝0.62（３：１ ｉ−PrOH：NH₄OAc）、白色固体、47mg，98％。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.42-7.25（m，5H），5.19（d，J= 4 Hz，H-1-fuc，1H），4.95（m），4.57（d，J=8 Hz，1H），4.38（d，J=8 Hz， 1H），4.13（d，J=2 Hz，1H），4.11-3.42（m），2.95（t，J=5 Hz，2H，a-CH₂ ），2.75（dd，J=3 Hz，J=10 Hz，H_eq-3（sialic acid），1H），2.63（t，J=5 Hz，2H，CH₂Ph），2.05（s，3H，NAc），1.80（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，H_at-3（ sialic acid），1H），1.24（t，J=5 Hz，3H），1.18（d，J=5 Hz，3H）。 エチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガ ラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクト ピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３）〕 −Ｏ−（２，２′−ナフタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）− （１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物33） Ｒ_f−0.52（３：１ ｉ−PrOH：NH₄OAc）、白色固体、35mg，96％。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））8.39（s，aromatio，1H），8.02（ m，aromatic，2H），7.82（d，J=7 Hz，aromatic，1H），7.63（m，aromatic，3 H），5.19（d，J=4 Hz，H-1（fuc），1H），4.95（m），4.57（d，J=8 Hz，1H） ，4.35（d，J=8 Hz，1H），4.19（d，J=2 Hz，1H），4.15-3.42（m），2.77（dd ，J=3 Hz，J=11 Hz，H_eq-3（sialic acid），1H），2.05（s，3H，NAc），1.77 （dd，J=10 Hz，J=10 Hz，H_at-3（sialic acid），1H），1.19（d，J=6 Hz，3H ，H−6-fuc），1.05（t，J=6 Hz，3H）。 エチル〔（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ− ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラ クトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）〕−（１， ３）−Ｏ−（２，２′−フェニルアセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコ ピラノシル）−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物34） Ｒ_f−0.62（4.5：１ ｉ−PrOH：NH₄OAc）、白色固体、24mg，68％。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.45-7.27（m，5H），4.85（d，J= 3 Hz，H-1-fuc，1H），4.75（m），4.55（d，J=8 Hz，1H），4.38（d，J=8 Hz， 1H），4.13（d，J=2 Hz，1H），4.09-3.42（m），2.78（dd，J=3 Hz，J=10 Hz， H_eq-3（sialic acid），1H），2.05（2s，5H，NAc，PhCH₂），1.80（dd，J=10 H z，J=10 Hz，H_at-3（sialic acid），1H），1.24（t，J=5 Hz，3H），1.18（d， J=5 Hz，3H）。 エチル〔（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ− ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラ クトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３ ）〕−Ｏ−（２−ｐ−メト キシベンズアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）− Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物35） Ｒ_f−0.52（３：１ ｉ−PrOH：NH₄OAc）、白色固体、46mg，90％。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.75（d，J=9 Hz，2H，aromatic） ，7.05（d，J=9 Hz，2H），5.11（d，J=3 Hz，H-1-fuc，1H），4.95（m），4.52 （d，J=8 Hz，1H），4.25（d，J=8 Hz，1H），4.19（d，J=2 Hz，1H），4.15-3. 39（m），3.82（s，3H，OCH₃），2.75（dd，J=3 Hz，J=11 Hz，H_eq-3（sialic a cid），1H），1.99（s，3H，NAc），1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，H_at-3（sial ic acid），1H），1.17（m，5H，H-6-fuc，CH₂CH₃）。 エチル〔（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ− ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラ クトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３ ）〕−Ｏ−（２−ｐ−テルト−ブチルベンズアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グ ルコピラノシル〕−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物36） Ｒ_f＝0.52（３：１ ｉ−PrOH：NH₄OAc）、白色固体、46mg，90％。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.65（d，J=9 Hz,2H，aromatic） ，7.58（d，J=9 Hz，2H），5.19（d，J=4 Hz，H-1（fuc），1H），4.95（m），4 .57（d，J=8 Hz，1H），4.38（d，J=8 Hz，1H），4.19（d，J=2 Hz，1H），4.15 -3.39（m），2.73（dd，J=3 Hz，J=11 Hz，H_eq-3（sialic acid），1H），2.05 （s，3H，NAc），1.77（dd，J=10 Hz，J=10 Hz，H_at-3（sialic acid），1H）， 1.24（s，9H，-Bu），1.17（m，5H，H-6-fuc，CH₂CH₃）。 （５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ− Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガ ラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１， ３）〕−Ｏ−（２−ベンズアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル） −（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物37）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））1.15（3H，d，J=6.5 Hz，CH₃ of F uc），1.81（1H，t，J=10.4 Hz，H-3″a of NANA），2.02（3H，s，CH₃CONH）， 2.78（1H，dd，J=10.4 Hz，3.2Hz，H-3″e of NANA），3.5-4.2（m），4.4-4.8 （m），5.09，5.16（d，d，H-1 of FUC，α，β），5.2（d，J=3.4 Hz，H-1 α ），7.5-7.8（5H，Aromatic）。 ベンジル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ− ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラク トピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔α−Ｌ−フコピラノシル−（１，３）〕− Ｏ−（２−ベンズアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１， ３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物38）¹ Ｈ−NMR（300 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））1.08（3H，d，J=6.4Hz，CH₃ of Fu c），1.76（1H，t，J=10.4 Hz，H-3″a of NANA），1.97（3H，ｓ，CH₃CONH）， 2.7（1H，dd，J=10.4 Hz，3.2 Hz，H-3″e of NANA），3.4-4.2（m），4.5（1H ，d，J=7.7 Hz），4.6（1H，d，J=8.0 Hz），5.02（d，J=3.8 Hz，H-1 of FUC） ，7.1-7.8（10H，Aromatic）。 化合物44−49のNMRデータ エチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガ ラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクト ピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α −Ｌ−フコピラノシル）−（１，３）〕−Ｏ−〔２−（３，４−ジクロロベンズ アミド）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−（１，３）−Ｏ−β− Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物44）¹ Ｈ−NMR（270 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.82（s，1H），7.56（m，2H），5 .99（d，J=3.96 Hz，1H），4.47（d，J=7.59 Hz，1H），4.25（d，J=7.91 Hz，1 H），4.15-3.22（m），2.66（dd，J=12.54 Hz，J=3.96 Hz，1H），1.94（s，3H ），1.76（t，J=12.54 Hz，1H），1.10（m，6H）。 エチル〔（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ− ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラ クトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）〕−（１， ３）−Ｏ−（２−フラナミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−（ １，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物45）¹ Ｈ−NMR（270 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.59（d，J=1.98 Hz，1H），7.10 （d，J=3.63 Hz，1H），6.54（dd，J=3.36 Hz，J=1.98 Hz，1H），5.05（d，J=4 .29 Hz，1H），4.46（d，J=7.59 Hz，1H），4.23（d，J=7.92 Hz，1H），4.06（ d，J=2.97 Hz，1H），4.02-3.32（m），2.68（dd，J=12.87 Hz，J=3.96 Hz，1H ），1.95（s，3H），1.77（t，J=12.87 Hz，1H），1.08（m，6H）。 エチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガ ラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクト ピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３）〕 −Ｏ−（２−チオフェンアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル〕− （１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物46）¹ Ｈ−NMR（270 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.63（m，2H），7.10 （m，1H），5.06（d，J=3.63 Hz，1H），4.46（d，J=7.92 Hz，1H），4.23（d， J=7.92Hz，1H），4.06（d，J=3.30 Hz，1H），4.04-3.30（m），2.67（dd，J=12 .21 Hz，J=3.96 Hz，1H），1.94（s，3H），1.73（t，J=12.21 Hz，1H），1.07 （m，6H）。 エチル〔（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ− ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラ クトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）〕−（１， ３）−Ｏ−〔２−（２−チオメチル）ニコチンアミド−２−デオキシ−β−Ｄ− グルコピラノシル〕−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物48 ）¹ Ｈ−NMR（270 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.62（m，2H），7.06（m，1H），5 .04（d，J=3.96 Hz，1H），4.43（d，J=7.59 Hz，1H），4.23（d，J=7.92 Hz，1 H），4.10-3.20（m），2.68（m，1H），2.14（s，3H），2.09（s，3H），1.70（ m，1H），1.05（m，6H）。 エチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガ ラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクト ピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）−（１，３）］ −Ｏ−〔２−（６−ドデシルオキシ−２−ナフタミド）−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシル］−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物 47）¹ Ｈ−NMR（270 MHz，CH₃OHに関するδ（ppm））8.32（s，1H），7.90-7.78（m， 3H），7.26-7.16（m，2H），5.17-5.13（m，1H），4.48-4.40（m，1H），4.22-3 .32（m），2.88-2.82（m，1H），2.01（s，3H），1.85-1.19（m），0.91-0.85（ m，3H）。 エチル〔（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グ リセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（ β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル ）〕−（１，３）−Ｏ−（２−ｍ−ブチルオキシベンズアミド−２−デオキシ− β−Ｄ−グルコピラノシル〕−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ 化合物49）¹ Ｈ−NMR（270 MHz，H₂Oに関するδ（ppm））7.39-7.22（m，3H），7.13-7.09（ m，1H），5.03（d，J=3.96 Hz，1H），4.46（d，J=7.92 Hz，1H），4.23（d，J= 7.92 Hz，1H），4.07-3.34（m），2.68-2.64（m，1H），1.93（s，3H），1.74-1 .62（m，3H），1.30-1.44（m，2H），1.07（t，J=7.25 Hz，3H），1.06（d，J=5 .60 Hz，3H），0.84（t，J=7.58 Hz，3H）。 化合物50及び51に関するデータ エチル〔（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ− ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラ クトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔（α−Ｌ−フコピラノシル）〕−（１， ３）−Ｏ−（２−ニコチンアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル〕 −（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物50） Ｒ_f＝0.22（シリカ、イソプロパノール／１Ｍ NH₄OAc）；¹Ｈ−NMR（300 MHz ，D₂O）：δ1.13（d，3H，J=6.6 Hz，CH₃Fuc），1.15（t，3H，J=6.7 Hz，OCH₂C H₃），1.78（t，1H，J=11.9 Hz，H-3a NANA），2.01（s，3H，COCH₃），2.74（d d，1H，J=4.4，11.9，H-3e NANA），3.41-4.33（multiple paeks，34H），4.31 （d，1H，J=8.1 Hz，β−anomer Gal），4.53（d，1H，J=8.0 Hz，β−anomer G al），5.10（d，1H，J=3.7 Hz，α−anomer Fuc），7.56（m，1H，H-5 pyridyl ），8.16（dd，1H，J=1.3，8.1 Hz，H-4 pyridyl），8.68（m，1H，H-6 pyridyl ），8.85（s，1H，H-2 pyridyl）。 エチル〔ナトリウム（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリ セロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）〕−（２，３）−Ｏ−（β −Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−〔α−Ｌ−フコピラノシル−（ １，３）−Ｏ−〕−（２−ベンゼンスルホンアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グ ルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物51） Ｒ_f＝0.28（シリカ、20％ １Ｍ NH₄OAc／イソプロパノール）。¹ Ｈ−NMR（300 MHz，D₂O，H₂Oに関するppm）：δ7.92（d，J=7.4 Hz，2H），7.6 9（d，J=7.2 Hz，1H），7.60（t，J=7.2 Hz，2H），5.47（d，J=4.0 Hz，1H）， 4.62（d，J=8.1 Hz，1H），4.51（d，J=7.6 Hz，1H），4.24（d，J=8.0 Hz，1H ），4.07（dd，J=3.1，9.6 Hz，1H），3.99（d，J=3.1 Hz，1H），3.96-3.46（m ，29H），2.75（dd，J=4.6，12.5 Hz，1H），2.68（dd，J=8.1，8.1 Hz，1H）， 2.02（s，3H），1.78（t，J=12.1 Hz，1H），1.20（t，3H)，1.16（d，J=6.5 Hz ，3H）。 細胞結合検定 修飾組換え体可溶性Ｅセレクチン／HL 60細胞接着検定を開発し、シアリルル イスＸのオリゴ糖類似体のＥセレクチン遮断ポテンシャルを比較するための簡便 且つ高度に再現可能な方法を提供した。本検定では、組換え体可溶性Ｅセレクチ ン（rELAM）を96ウエルELISＡプレートのプラスチック表面に結合させる。検定 されるSLe^x類似化合物の希釈物をウエルに加え、その後Ｅセレクチンのための配 位子を保有するHL−60細胞を加える。細胞をＥセレクチン被覆検定プレートに接 着させ、自動プレート洗浄器でプレートを洗浄して非接着細胞を除去する。細胞 酵素ミエロペルオキシダーゼを測定することにより結合細胞を定量する。対照接 着の50％阻害を達成するの に要する検定オリゴ糖の濃度を用いて、効力に関して類似体を比較する。HL−60 及びELAM−１（Ｅセレクチン）受容体を含有する細胞と結合する他の細胞を結合 するための基質としてのELAM−１の同様の結合組換え体可溶性部分の使用の効能 を、Lobb et al.，J．Immunol.，147；124-129（1991）は立証した。 材料及び方法： 材料 ELISAプレート、イムロン ２Immulon２（Dynatec Laborａtories）（Fisher 14 245 61） 0.2ｍフィルターユニット（Nalgene #150-0020） rELAM（組換え体修飾ELAM−１）親和性（以下のように精製、調製）。rELAMの 各バッチを機能的に試験して、検定に使用するのに適した濃度を確定した。標準 として化合物Ｚ（後述）による阻害を用いて１−５μｇ／mLの範囲でバッチを滴 定した。次に小アリコートを調製し、ドライアイスアセトン浴中で急速凍結して 、−70℃で保存した。各アリコートを１回だけ開いて、取り出すか又は他の種類 の検定に用いるために取っておいた。 ここで用いた可溶性形態のＥセレクチン（rELAM又はsol-Ｅセレクチン）は、c DNAからのトランスメンブランドメインを欠失させて遣伝子工学処理した。この 組換え体cDNAを、キメラサイトメガロウイルス／ヒト免疫不全ウイルスプロモー ターを含有するタ哺乳類発現ベクターpCDNA1〔pCDM８の誘導体；Seed，Nature， 329 ：840（1987）〕中にクローニングした。アデノウイルス形質転換ヒト腎臓細 胞株293中に導入した場合、詳述されていない機序によるEl遺伝子生成物によりC MVプロモーターの発現は効率よく活性化される。pCDNA1-sol−Ｅセレクチン構築 を、リン酸カルシウム介在遺伝子トランスファーを介して293細胞中に導入して 、高レベルのsol-Ｅセレ クチンを発現する安定細胞株を生成した。これらの細胞により生成されたsol-Ｅ セレクチンを、抗Ｅセレクチンモノクローナル抗体プロテインＡセファロースSe pharoseカラム上でのイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製した 。 さらに、アデノウイルス形質転換ヒト腎臓細胞株293をATCCから入手した（CRL -1573）。10％ウシ胎児血清（FBS）（JRH Biochemical（Lenexa，KS）から入手 ）を補充したDMEM（Whittaker Bioproductsから入手）中で付着培養として293細 胞を増殖させた。 pCDM８（Seed，Nature，329：840（1987））の誘導体であるプラスミドpCDNAl をInvitrogen（San Diego，CA）から購入した。プラスミドpBuescripl IIはStr atagene（San Diego，CA）から購入した。プラスミドpSV2〔Suuthern et al.，J ．Mol．Appl．Gen.，１：327（1982）〕は、アミノグリコシド３′−ホスホトラ ンスフェラーゼ遺伝子をコードする大腸菌遣伝子を含有する。pSV2-neoを哺乳類 細胞中に導入すると、トランスフェクト化細胞は抗生物質G418に対する耐性を示 す。 Ｅセレクチンに関する平頭化構造遣伝子をコードする1.67kbp DNA断片を、IL −１活性化ヒト内皮細胞から単離したメッセンジャーRNAに由来するcDNAのポリ メラーゼ連鎮反応（PCR）増幅により単離した。５′−アンプリマーは、Ｅセレ クチン構造遺伝子の開始コドンから上流28ヌクレオチドを非反復Cla1制限部位に 挿入した。３′−アンプリマーは終結コドンTGAをアミノ酸番号527の成熟Ｅセレ クチンの後に挿入し、その後に非反復Xho1制限部位がきた。sol-Ｅセレクチンの カルボキシ末端を、第６共働反復エレメントのカルボキシ末端に位置させ、それ によりトランスメンブランドメインを欠失させた。1.67kbp PCR断片をCla1及びX ho1制限エンドヌクレアーゼで同時消化し、クローニングベクターpBuescripl I IのCla1及び Xhol制限部位にサブクローニングして、ベクターpBSII−sol-Ｅセレクチンを提 供した。可溶性Ｅセレクチンは長さ527アミノ酸で、11個の潜在Ｎグリコシル化 部位を含有する。 sol-ＥセレクチンcDNAを含有する1.67kbp DNA断片をpBSII−sol-Ｅセレクチン から単離し、発現ベクターpCDNAlのEcoRＶ及びXholＶ中にサブクローニングし、 それによりベクターpCDNAl−sol-Ｅセレクチンを提供した。 pCDNA1−sol-Ｅセレクチンを、リン酸カルシウム法〔Kriegier，Gene Transfe r and Bspression：A Laboratory Manual．W．H．Freeman，New York，N．Y．（ 1991）〕により293細胞中にpSV2-ncoで同時トランスフェクトした。トランスフ ェクション後48時間目に、トランスフェクト化293細胞をトリプシン処理し、DME M，10％FBS及び600mg／mlのG418（Geneticin，Sigma）中に平板化した。安定G41 8耐性集団が確立されるまで、選択培地を３日毎に取り替えた。 G418耐性細胞の単一クローンをクローニングシリンダーにより単離した。一次 抗体としてCY1787と呼ばれる抗Ｅセレクチンモノクローナル抗体を用いて酵素結 合イムノソルベント検定（ELISA）によりsol-Ｅセレクチンの合成に関して、単 離クローンをスクリーニングした。陽性クローンを10⁶細胞／100mm 皿でプレー ト化した。それらを、〔³⁵Ｓ〕−メチオニンを５時間用いて24時間後に代謝によ り標識化した。標識化sol-Ｅセレクチンを抗Ｅセレクチンモノクローナル抗体を 用いて培地から免疫沈殿させて、10％ PAGEゲルを通して電気泳動処理し、ゲル を脱水してオートラジオグラフィーにかけた。最大量の110Kd sol-Ｅセレクチン タンパク質／細胞を産生する安定細胞株として、クローン293#3を選択した。 10室Nuc細胞ファクトリー（総表面積 6250cm²，Nunc）に、５％FBSを補充し たDMEM 850ml中の2.78×10⁶細胞（クローン293#3 ）を植え付けて、37℃で72時間インキュベートした。培地を採取し、850mlのDME M，５％FBSと入れ換えた。細胞ファクトリーを37℃で48時間インキュベート後、 培地を再び採取して、850mlのDMEM，５％FBSと入れ換えた。細胞ファクトリーを 37℃で48時間インキュベート後、培地を三たび（これが最後）採取した。 各採取後、0.02％ アジ化ナトリウムを培地に加えた。培地を遠心分離（5000 ×ｇ）で清澄化し、0.2mmフィルターに通して、さらに次の精製まで４℃で保存 した。 本質的にはSchncider et al.，J．Biol．Chem.，257：10766（1982）に記載さ れているのと同様に、モノクローナル抗体CY1787をプロテインＡ Sepharoseと抱 合させた。要するに、PBS中の28mgのモノクローナルCY1787（５mg／ml）を室温 で30分間プロテインＡ Sepharose ５mlと混合した。次いで、25mlの0.2Ｍホウ 酸塩緩衝液、pH8.2を用いて遠心分離により４回ビーズを洗浄し、その後10mlの0 .2Ｍトリエタノールアミン、pH8.2で２回洗浄した。次いで、0.02Ｍジメチルピ メリミデートを含有する40mlの0.2Ｍトリエタノールアミン、pH8.2中に樹脂を懸 濁した。同転装置で室温で45分間反応後、0.02Ｍエタノールアミン、pH8.2で２ 回洗浄し、その後10mlの0.2Ｍのホウ酸緩衝液、pH8.2で３回洗浄した。0.1Ｍ酢 酸ナトリウム緩衝液、pH4.5で溶離して未結合抗体を除去した。用いた抗体のう ち、89％がプロテインＡ Sepharoseと抱合した。 組織培養上清（2550ml）を、1.5cm×３cmのアフィニティーカラムに連続して 連結されたプロテインＡ Sepharoseの0.7cm×1.5cmカラムに流速20ml／時で通し た。次にカラムを切り離して、CY1787含有アフィニティーカラムを溶離物の280n mでの吸光度がゼロになるまで、150mM NaCl及び2mM CaCl₂を含有する20mM Tris 緩衝液、pH7.5で洗浄した。重力流を用いて結合Ｅセレクチンを0.1Ｍ酢 酸ナトリウム緩衝液、pH3.5で溶離した。分画（１mL）を300mlの２ＭTris，pH10 中に収集した。タンパク質含有分画をプールし、DPBSに対して透析した。タンパ ク質濃度が約１mg／mlになるまでAmicon Centriprep 30を濃縮後、精製Ｅセレク チンをアリコートにし、−80℃で保存した。純度はSDS-PAGEにより90％以上であ った。総量10mgのＥセレクチンを細胞培地2550mlから精製した。 DulbeccoのPBS（DPBS）（Whittaker，17-513B） HL−60（ATCC，CCL 240）HL60細胞の大バッチを増殖させて、検定における機 能に関して試験し、マイコプラズマを含有しないことを立証した。10％ DMSO， 10％ウシ胎児血清、80％ RPMI1640（Whittaker）中で、２mlクリオバイアル中 で15×10⁶細胞／バイアルで、−180℃で細胞を凍結させた。凍結は速度制御フリ ーザーを用いて実施した。 化合物Ｚ標準SLe^x五糖−O0Et： NeuAcα２→３Gal β１→４［Fucα１→３］GlcNAcβ１→３Gal βOEｔ DPBS中の10mM溶液として化合物Ｚ標準を調製した。溶液は−20℃で保存した。 好中球洗浄緩衝液（NWB）： 10Ｘ HBSS（Gibco，310-4065） 20mL １Ｍ HEPES（Gibco，380-5630） 2mL Super Q H₂O 178mL Ｄ−グルコース（Sigma，G 7021） 0.4ｇ 200mL 毎日新たに作るか又は４℃で保存した滅菌溶液。 pH 7.2−7.4；フィルター滅菌（0.2μ）。 100mM CaCl₂ストック： 塩化カルシウム（無水）（Baker，1308） 1.11ｇ Super Q H₂O 100mL フィルター滅菌（0.2ｍ） 100mL 好中球洗浄緩衝液 １mM CaCl₂＋0.1％ BAS（NWB/Ca/BSA）： ウシ血清アルブミン（Sigma，A-6918） 10ｇ 100mM CaCl₂ストック： 100mL NWB 全体で1000mLにする pH 7.2−7.4；フィルター滅菌（0.2μ）、４℃でストックを保存する。 阻止緩衝液： DPBS（Whittaker，17-513B） 100mL ウシ血清アルブミン（Sigma，A 6918） １ｇ 100mL pH 7.2−7.4；フィルター滅菌（0.2μ）、４℃でストックを保存する。 クエン酸溶液、0.1Ｍ： クエン酸（無水）、遊離酸（Sigma，C-0759） 10.5ｇ Super Q H₂O 500mLにする量 容積測定又は計量シリンダー中で調製。室温で保存。 リン酸ナトリウム溶液、0.2Ｍ： リン酸ナトリウム（二塩基、無水、Na₂HPO₄）（Sigma，S-0876） 14.2ｇ Super Q H₂O 500mLにする量 容積測定又は計量シリンダー中で調製。室温で保存。 クエン酸塩／リン酸塩緩衝液： クエン酸溶液（0.1Ｍ） 24.3mL リン酸ナトリウム溶液（0.2Ｍ） 25.7mL Super Q H₂O 50mL 100mL 室温で保存。 細胞溶解緩衝液： Nondiet P 40（NP 40）（Sigma，N-6507） 0.1ｇ 0.1 Ｍ クエン酸塩 24.3mL 0.2 Ｍ リン酸ナトリウム、二塩基 25.7mL Super Q H₂O 50.0mL 100.0mL 室温で保存。 OPDA（ｏ−フェニレンジアミン）： クエン酸塩−リン酸塩緩衝液 10mL 二塩酸ｏ−フェニレンジアミン（Sigma，P 8287） 10mg H₂O₂（Sigma，H 1009） 10μＬ 10mL 使用直前に作る。過酸化水素は10℃で暗所で保存した。 H₂SO₄停止緩衝液、４Ｎ 硫酸、18Ｍ（Pisher，A300s-212） 111mL Super Q H₂O 500mLにする量 方法 １．rELAM（sol−Ｅセレクチン）を最新バッチに適した濃度に希釈した。これ らの検定に関しては、DPBS中に2.5μｇ／mlでrELAMを用いた。マルチチャンネル ピペットを用いて、ウエル当たり50μｌをELISAプレートの次のウエルに加えた ：E1 E6，F1-F6及びG1 G6。DPBS（50μｌ）をウエルH1，H2及びH3に加えて、対 照として用いた。このプレートを予備試験プレートと呼ぶ。 別の検定プレートを、検定される３つの未知の標本全てに関して 被覆した。さらにマルチチャンネルピペットを用いて、50μｌの希釈rELA門をプ レートの次のウエルに加えた：B1-B12，C1-C12，D1-D12，E1-E12，F1-F12，G1-G 12。DPBS（50μｌ）をウエルH1，H2及びH3に加えて、対照として用いた。これら のプレートは標本プレートとして公知である。これらのプレートを箔で覆い、室 温で３時間インキュベートした。 ２．プレートを阻止緩衝液200μｌで３回洗浄した。ウエルを阻止緩衝液200μ ｌで再び満たし、箔で覆って、室温で１時間インキュベートした。 ３．凍結HL−60細胞の３つのバイアルを調製された２つの標本プレート全てに 関して解氷した。37℃水浴中でバイアルを迅速解氷した。10mlの氷冷NWB１％BSA を含有する15ml遠心分離管中に細胞をピペット分取した。４℃遠心分離器中で12 00rpmで７分間、細胞を遠心分離し、NWB/BSA中で２回以上洗浄した。血球計を用 いて細胞を計数し、107mlのNWB＋１％BSA＋１mM CaCl₂中に再懸濁した。 ４．細胞を洗浄しながら、標準及び検定化合物溶液を調製した。検定されるオ リゴ糖化合物を1.5mLエッペンドルフ試験管中で計量し、その分子量により、十 分量のDPBSを加えて各標本を10mM溶液とした。各標本の６μｌアリコートを取り 出して、２μｌをpH試験ストリップの各矩形上に滴下した。標本がpH７−7.4で ない場合は、pH値をその範囲に調整するか、又は化合物を検定しなかった。検定 は、使用される各化合物溶液の10mM溶液180μｌ及び試験プレートを含めた実行 される各プレートに対する標準化合物Ｚの10mM溶液１80μｌを要する。 ５．阻止ELISAプレートを逆にして、ぐいと動かして、紙タオル上で激しく叩 いて吸い取ってして、ウエルから液体をすべて除去する。次にマルチチャンネル ピペットを用いて、各ウエルに40μｌの NWB＋１％BSA＋１mM Ca⁺²を加えた。 ６．予備試験プレートのウエルE6及びG6から、液体をすべて除去した。化合物 Ｚの10mMストック40μｌのアリコートを空のウエルの各々、並びにウエルE5及び G5に加えた。ウエルE5中の溶液を、40μｌでp200 pipettemanセットを用いてピ ペットで吸い上げ吐き出しを10回繰り返して混合した。溶液の40μｌアリコート をウエルから取り出して、各々10回ずつ混合しながら、ウエルE4、次いでE3そし て次にE2でプレート全体を連続希釈した。40μｌアリコートを取り出して、最後 のウエルから捨てた。この操作を列G4〜G2間で繰り返した。 ７．マルチチャンネルピペットを用いて、20μｌ中のHL−60細胞（２×10⁵） を各ウエル（HIは除く）に加えた。プレートをプレート振盪器上に５秒間置いて 、室温で15分間放置した。 ８．液体を徐々に供給するよう調整され、洗浄溶液としてNWB＋１％BSA＋１mM CaCl₂を用いてウエル当たり３回洗浄に設定されたMolecular Devices Micropl ate洗浄器を用いて、プレートを洗浄した。 ９．細胞溶解緩衝液（ウエル当たり５０μｌ）を加え、プレートを室温で５分 間プレート振盪器上に置いた。 10．ウエル当たり50μｌのOPDA溶液を加え、プレートを室温で10分間プレート 振盪器上に置いた。 11．ウエル当たり40μｌのH₂SO₄停止緩衝液を付加して発色反応を停止し、プ レートのウエルに関する光学密度（Ｏ．Ｄ．）を492nmで読み取って、ブランク としてウエルH1を減じた。 12．ウエルH2及びH3に関するＯ．Ｄ．値の平均を取って、陰性対照を確定した 。これは、“非Ｅセレクチン陰性結合対照”である。ウエルE1，F1，F2，F3，F4 ，F5，F6及びG1の平均として標準曲線に 関して“陽性結合対照”を算出した。“非Ｅセレクチン陰性結合対照”が平均“ 陽性結合対照”の10％より大きかった場合、検定を継続しなかった。その値が平 均“陽性結合対照”の10％以下であった場合は、標本対合体（E6，G6），（E5， G5），（E4，G4），（E3，G3）及び（E2，G2）を平均した。各対合体平均を平均 “陽性結合対照”値で割って、検定化合物の各濃度に関する陽性結合のパーセン テージを出した。“陽性結合対照”パーセントを阻害剤の対数濃度に対してプロ ットした。50％阻害点をグラフから確定した。この点は0.5−1.5mM間にあるべき で、そうでない場合は、検定を継続しなかった。 13．予備試験プレート標準曲線が許容可能な範囲内であった場合、残りの検定 を進めた。工程６と同様に、標準化合物Ｚを各標本プレート上で希釈した。同様 に検定化合物を希釈した。以下の鋳型により、検定SLe^x類似体化合物をプレート 上に置いた： 14．全検定標本をプレート上で希釈する場合、HL−60を上記の工程７と同様に 付加し、上記のように工程11の間操作をたどった。 15．ウエルB2，C1−６及びD2からの検定#1に関して：ウエルB12，C7 12及びD1 2からの検定#2に関して；並びにウエルE12，E7-12及びG12からの検定#3に関して 、平均“陽性結合対照”を算出した。各検定の各希釈液に関する陽性結合のパー セントをグラフに示し、50％阻害点をグラフから確定した。標準化合物Ｚに関す る50％結合 値を検定SLe^x標本に閏する50％結合値で割った比率として、各々の検定SLe^x類似 体化合物に関する活性を記録した。SLe^xそれ自体に関する値を同様に確定した。 SLe^xそれ自体及びいくつかの意図されたSLe^x類似体化合物に関する比率を以下 の表４に示す。 前記で本発明を説明したが、本発明はこれらに限定されない。本発明の新規の 概念の真の精神及び範囲を逸脱しない限りにおいて、多数の変更及び修正がなさ れ得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＧ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ， ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｋ，ＵＡ (72)発明者 ガウディノ ジョン，ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92075, ソラナ ビーチ，ノース ヘリックス ア ベニュ 212 (72)発明者 ゼン ジョンリ アメリカ合衆国，カリフォルニア 92128, サンディエゴ，スプリングサイド ロード 11634 (72)発明者 ハヤシ マサジ 兵庫県神戸市北区藤原台中６丁目２−17

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式： 〔式中、Ｚは水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アシルまたは ＹはＣ（Ｏ），SO₂，HNC（Ｏ），OC（Ｏ）およびSC（Ｏ）からなる群から選択 され； Ｒ¹はアリール基、置換アリール基およびフェニルＣ₁〜Ｃ₃アルキレン基から なる群から選択され、アリール基は一つの五員もしくは六員の芳香環、五員／六 員の縮合芳香環または二つの六員縮合芳香環を有し、これらの環は、ヒドロカル ビル環、モノオキサヒドロカルビル環、モノチアヒドロカルビル環、モノアザヒ ドロカルビル環およびジアザヒドロカルビル環からなる群から選択され、そして 置換アリール基は、ハロ、トリフルオロメチル、ニトロ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキル、 Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ_{1 8} アルキルアミノ、ベンジルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルベンジルアミノ、Ｃ₁〜 Ｃ₁₈チオアルキルおよびＣ₁〜Ｃ₁₈アルキルカルボキザミドの基からなる群から 選択される置換基を有する前記アリール基であり、またはR¹Yがアリルオキシカ ルボニルもしくはクロロアセチルであり； Ｒ²は水素、Ｃ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒドロカルビル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆アルキルＣ₁〜Ｃ₅アルキレンω−カルボキシレート、ω−トリ（Ｃ₁〜Ｃ₄ アルキル／フェニル）シリルＣ₂〜Ｃ₄アルキレン、単糖および二糖からなる群か ら選択され、またはOR²がともにＣ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒ ドロカルビルカルバメートを形成し； Ｒ³は水素またはＣ₁〜Ｃ₆アシルであり； Ｒ⁴は水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルまたはベンジルであり； Ｒ⁵は水素、ベンジル、メトキシベンジル、ジメトギシベンジルおよびＣ₁〜Ｃ₆ アシルからなる群から選択され； Ｒ⁷はメチルまたはヒドロキシメチルであり；ならびに、 ＸはＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシ、Ｃ₂〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ、ヒドロキシ 、ハロおよびアジドからなる群から選択される〕 で表される化合物。 ２．Ｒ²が単糖である請求の範囲１記載の化合物。 ３．Ｘがヒドロキシである請求の範囲１記載の化合物。 ４．Ｚが水素である請求の範囲１記載の化合物。 ６．式： 〔式中、ＹはＣ（Ｏ），SO₂，HNC（Ｏ），OC（Ｏ）およびSC（Ｏ）からなる群か ら選択され； Ｒ¹はアリール基、置換アリール基およびフェニルＣ₁〜Ｃ₃アルキレン基から なる群から選択され、アリール基は一つの五員芳香環、一つの六員芳香環または 二つの六員縮合芳香環を有し、これらの環は、ヒドロカルビル環、モノオキザヒ ドロカルビル環、モノチアヒドロカルビル環、モノアザヒＦロカルビル環および ジアザヒドロカルビル環からなる群から選択され、そして置換アリール基は、ハ ロ、トリフルオロメチル、ニトロ、Ｃ₁〜Ｃ₂アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₁₂アルコキシ、 アミノ、モノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₂アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₁₂アルキルアミノ、ベン ジルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₂アルキルベンジルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₂チオアルキルおよび Ｃ₁〜Ｃ₁₂アルキルカルボキサミドの基からなる群から選択される置換基を有す る前記アリール基であり、または Ｒ²は水素、Ｃ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒドロカルビル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆アルキルＣ₁〜Ｃ₅アルキレンω−カルボキシレート、ω−トリ（Ｃ₁〜Ｃ₄ アルキル／フェニル）シリルＣ₂〜Ｃ₄アルキレン、単糖および二糖からなる群か ら選択され、またはOR²がともにＣ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環のヒド ロカルビルカルバメートを形成し； Ｒ³は水素またはＣ₁〜Ｃ₆アシルであり； Ｒ⁴は水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルまたはベンジルであり； Ｒ⁵は水素、ベンジル、メトキシベンジル、ジメトキシベンジルおよびＣ₁〜Ｃ₆ アシルからなる群から選択され； Ｒ⁷はメチルまたはヒドロキシメチルであり；ならびに ＸはＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシ、Ｃ₂〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ、ヒドロキシ 、ハロおよびアジドからなる群から選択される〕 で表される化合物。 ７．Ｘがヒドロキシルであり、Ｒ²が単糖または二糖以外の基であり、そして Ｒ²がメチルである請求の範囲６記載の化合物。 ８．Ｒ³＝Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝水素である請求の範囲７記載の化合物。 ９．Ｒ¹がフェニルである請求の範囲８記載の化合物。 10．Ｒ²が単糖である請求の範囲６記載の化合物。 11．式： 〔式中：Ｚは水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アシルまたは ＹはＣ（Ｏ），SO₂，HNC（Ｏ），OC（Ｏ）およびSC（Ｏ）からなる群から選択 され； Ｒ¹はアリール基、置換アリール基およびフェニルＣ₁〜Ｃ₃アルキレン基から なる群から選択され、アリール基は一つの五員もし くは六員の芳香環、五員／六員の縮合芳香環または二つの六員縮合芳香環を有し 、これらの環は、ヒドロカルビル環、モノオキサヒドロカルビル環、モノチアヒ ドロカルビル環、モノアザヒドロカルビル環およびジアザヒドロカルビル環から なる群から選択され、そして置換アリール基は、ハロ、トリフルオロメチル、ニ トロ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈ア ルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノ、ベンジルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アル キルベンジルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈チオアルキルおよびＣ₁〜Ｃ₁₈アルキルカルボキ サアミドの基からなる群から選択される置換基を有する前記アリール基であり、 またはR¹Yがアリルオキシカルボニルもしくはクロロアセチルであり； Ｒ³は水素またはＣ₁〜Ｃ₆アシルであり； Ｒ⁴は水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルまたはベンジルであり； Ｒ⁵は水素、ベンジル、メトキシベンジル、ジメトキシベンジルおよびＣ₁〜Ｃ₆ アシルからなる群から選択され； Ｒ⁶は水素、Ｃ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒドロカルビル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆アルキルＣ₁〜Ｃ₅アルキレンω−カルボキシレートおよびω−トリ（Ｃ₁ 〜Ｃ₄アルキル／フェニル）シリルＣ₂〜Ｃ₄アルキレンからなる群から選択され 、またはOR⁶がともにＣ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒドロカルビ ルカルバメートを形成し； Ｒ⁷はメチルまたはヒドロキシメチルであり；ならびに ＸはＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシ、Ｃ₂〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ、ヒドロキシ 、ハロおよびアジドからなる群から選択される〕 で表される化合物。 12．Ｙがカルボニルである請求の範囲11記載の化合物。 14．式： 〔式中、ＹはＣ（Ｏ），SO₂，HNC（Ｏ），OC（Ｏ）およびSC（Ｏ）からなる群か ら選択され； Ｒ¹はアリール基、置換アリール基およびフェニルＣ₁〜Ｃ₃アルキレン基から なる群から選択され、アリール基は一つの五員もしくは六員の芳香環、五員／六 員の縮合芳香環または二つの六員縮合芳香環を有し、これらの環は、ヒドロカル ビル環、モノオキサヒドロカルビル環、モノチアヒドロカルビル環、モノアザヒ ドロカルビル環およびジアザヒドロカルビル環からなる群から選択され、そして 置換アリール基は、ハロ、トリフルオロメチル、ニトロ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキル、 Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ_{1 8} アルキルアミノ、ベンジルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルベンジルアミノ、Ｃ₁〜 Ｃ₁₈チオアルキルおよびＣ₁〜Ｃ₁₈アルキルカルボキサミドの基からなる群から 選択される置換基を有する前記アリール基であり、 Ｒ²は水素、Ｃ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒドロカルビル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆アルキルＣ₁〜Ｃ₅アルキレンω−カルボキシレート、ω−トリ（Ｃ₁〜Ｃ₄ アルキル／フェニル）シリルＣ₂ 〜Ｃ₄アルキレン、単糖および二糖からなる群から選択され、またはOR²がとも にＣ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒドロカルビルカルバメートを 形成し； Ｒ⁷がメチルまたはヒドロキシメチルであり；ならびに ＸはＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシ、Ｃ₂〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ、ヒドロキシ 、ハロおよびアジドからなる群から選択される〕 で表される化合物。 15．Ｘがヒドロキシルである請求の範囲14記載の化合物。 16．Ｒ²が単糖または二糖以外の基である請求の範囲14記載の化合物。 17．Ｙがカルボニルである請求の範囲16記載の化合物。 18．式： で表される請求の範囲17記載の化合物。 19．式： で表される請求の範囲17記載の化合物。 20．Ｒ²が単糖である請求の範囲14記載の化合物。 21．Ｙがカルボニルである請求の範囲20記載の化合物。 22．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 23．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 24．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 25．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 26．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 27．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 28．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 29．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 30．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 31．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 32．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 33．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 34．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 35．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 36．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 37．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 38．式： で表される請求の範囲21記載の化合物。 39．式： 〔式中、ＹはＣ（Ｏ），SO₂，HNC（Ｏ），OC（Ｏ）およびSC（Ｏ）からなる群か ら選択され； Ｒ¹はアリール基、置換アリール基およびフェニルＣ₁〜Ｃ₃アルキレン基から なる群から選択され、アリール基は一つの五員もしくは六員の芳香環、五員／六 員の縮合芳香環または二つの六員縮合芳香環を有し、これらの環は、ヒドロカル ビル環、モノオキサヒドロカルビル環、モノチアヒドロカルビル環、モノアザヒ ドロカルビル環およびジアザヒドロカルビル環からなる群から選択され、そして 置換アリール基は、ハロ、トリフルオロメチル、ニトロ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキル、 Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルコキシ、アミノ、モノ−Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ_{1 8} アルキルアミノ、ベンジルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₈アルキルベンジルアミノ、Ｃ₁〜 Ｃ₁₈チオアルキルおよびＣ₁〜Ｃ₁₈アルキルカルボキザミドの基からなる群から 選択される置換基を有する前記アリール基であり； Ｒ²は水素、Ｃ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎮状もしくは環式のヒドロカルビル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆アルキルＣ₁〜Ｃ₅アルキレンω−カルボキシレート、ω−トリ（Ｃ₁〜Ｃ₄ アルキル／フェニル）シリルＣ₂〜Ｃ₄アルキレン、単糖および二糖からなる群か ら選択され、またはOR²がともにＣ₁〜Ｃ₁₈の直鎖状、分枝鎖状もしくは環式のヒ ドロカルビルカルバメートを形成し； Ｒ⁷はメチルまたはヒドロキシメチルであり；ならびに ＸはＣ₁〜Ｃ₆アシルオキシ、Ｃ₂〜Ｃ₆ヒドロキシルアシルオキシ、ヒドロキシ 、ハロおよびアジドからなる群から選択される〕 で表される化合物の細胞接着を阻害する量を溶解または分散された医薬として 許容される希釈剤を含有する医薬組成物。 40．Ｙがカルボニルである請求の範囲39記載の医薬組成物。 41．Ｘがヒドロキシルである請求の範囲40記載の医薬組成物。 42．Ｒ²が単糖である請求の範囲41記載の医薬組成物。 43．前記単糖が３Gal βOEtである請求の範囲42記載の医薬組成物。 44．Ｒ²がベンジルである請求の範囲41記載の医薬組成物。 45．下記ステップ： （ａ）ラクツロースを、還元によって脱離可能な保護基が結合している窒素原 子を有するモノ置換アンモニア誘導体である第一級アミンと混合して反応混合物 を調製し、この第一級アミンは溶媒および反応物の両者として働き、ラクツロー スのモル量の約２倍〜約10倍の量で存在し； （ｂ）上記反応混合物を、約10℃〜約60℃の温度で対応するラクツロースＮ− グリコシドが生成するのに充分な期間維持し； （ｃ）生成した前記ラクツロースＮ−グリコシドを、Ｃ₁〜Ｃ₃アルコール溶媒 中、約10℃〜約30℃の温度で、pKa値が、約2.5〜約5.0のカルボン酸の当量まで の量と反応させて、アミンに結合されせた還元によって脱離可能な保護基を有す るアミン保護ラクトースアンモニウム塩中に前記ラクツロースＮ−グリコシドを 転位させ；次いで （ｄ）前記アミン保護ラクトースアンモニウム塩から保護基を還元によって除 去して前記ラクトースアンモニウム塩を製造する； を含んでなるラクトースアンモニウム塩の製造方法。 46．前記ラクトースアンモニウム塩を回収するステップをさらに含んでいる請 求の範囲45記載の方法。 47．前記第一級アミンがベンジルアミンである請求の範囲45記載の方法。 48．ステップ（ａ）の前記反応混合物が、塩化亜鉛、トリフルオロメタンスル ホン酸亜鉛、トリフルオロメタンスルホン酸マグネシウムおよびトリフルオロ酢 酸からなる群から選択される触媒の触媒量をさらに含有している請求の範囲45記 載の方法。 49．ステップ（ｃ）の前記Ｃ₁〜Ｃ₃アルコールの溶媒がメタノールである請求 の範囲45記載の方法。 50．ステップ（ｄ）の前記還元による除去が水素添加分解反応によって行われ る請求の範囲45記載の方法。