RO117533B1 - DERIVATI DE ANALOGI SIALIL LeX INHIBITORI AI ADEZIUNII CELULARE SI COMPOZITIE FARMACEUTICA CU ACESTIA - Google Patents

Abstract

Inventia se refera la derivati de analogi sialil Lex inhibitori ai adeziunii celulare, care inhiba adeziunea celulara selectiv-mediata, la procedeul de preparare a acestora si la o compozitie farmaceutica in care compusul activ il constituie acesti derivati.

Description

Invenția de față se referă la derivați de analogi sialil Le* inhibitori ai adeziunii celulare, care inhibă adeziunea celulară selectiv-mediată, la procedeul de preparare al acestora și la compoziția farmaceutică în care compusul activ îl constituie acești analogi.

Celulele endoteliale vasculare și trombocitele sangvine joacă roluri cheie într-un număr de răspunsuri biologice prin legarea selectivă a anumitor celule, de exemplu, leucocite fagocitice, în sânge. Celulele endoteliale leagă preferențial monocite și granulocite înaintea migrării lor în peretele vasului de sânge și în țesutul înconjurător într-un răspuns inflamator.

Anumiți compuși, ce declanșează promt inflamarea, sunt cunoscuți ca acționând direct asupra endoteliului vascular pentru a promova adeziunea leucocitelor la pereții vaselor. Celulele apoi se deplasează prin pereți în zonele de infecție sau rană.

Adeziunea celulară la endoteliul vascular este, de asemenea, presupusă ca fiind implicată în metastaza tumorală.

Celulele canceroase, care circulă, profită aparent de mecanismele inflamatorii ale corpului normal și se leagă de zonele pereților vaselor de sânge unde endoteliul este activat.

Trombocitele sangvine sunt, de asemenea, implicate în răspunsuri similare. Trombocitele sunt cunoscute ca devenind activate în timpul inițierii hemostazei și suferă transformări orfologice, biochimice și funcționale majore (de exemplu, exocitoxa rapidă a granulelor sau degranularea) în care membrana α-granulei trombocitei fuzionează cu membrana plasmatică externă. Ca rezultat, noi proteine ale suprafeței celulare devin exprimate astfel că ele conferă trombocitei noi funcții, cum ar fi abilitatea de a lega și alte trombocite activate precum și alte celule. Trombocitele activate se adună în cheagurile de sânge în creștere sau sunt scoase rapid din circulația sângelui. Trombocitele activate sunt cunoscute ca legându-se de leucocitele fagocitice, incluzând monocite și neutrofile. Exemple de alte procese biologice și patologice despre care se crede că sunt mediate de acest proces includ ateroscleroza, coagularea sângelui și inflamarea.

Cercetări recente au relevat că receptorii celulari de suprafață specializați în celule endoteliale și trombocite, desemnând E-selectin (molecula-1 de adeziune endotelială a leucocitelor, EI_AM 1) și respectiv P-selectin (proteină-140 de membrană granulară; GMP140) sunt implicați în recunoașterea de către endoteliu și trombocite a numeroase celule de circulație. De exemplu, E-selectin s-a demonstrat că mediază adeziunea endotelială a leucocitelor care reprezintă o primă etapă în multe răspunsuri inflamatorii. în mod specific, Eselectin leagă neutrofile umane, monocite, eozinofile, anumite T-limfocite (Graber et al., J.lmmunol. 145: 819 (1990)), celule NK și linia celulară promielocitică HL-60.

E-selectin este exprimat pe celule endoteliale vasculare [Bevilacqua et al., Science, 234:1160-1165 (1989) și Hession et a\.,Proc.Natl.Acad.Sci. 87:1673-1677 (1990)]. Acest receptor, s-a demonstrat că este indus de citocinele inflamatorii, cum ar fi interleukin Ιβ (ΙΙ-Ιβ) și factorul a de necroză tumorală (TNF a), precum și endotoxin bacterial (lipopolizaharidă) [Bevilacqua et al., ‘Proc.Natl.Acad.Sci. 84:9238-9242 (1987)]. Acești compuși cresc adeziunea leucocitelor polimorfonucleare (neutrofil) și a monocitelor [Bevilacqua et al., Proc.natl.Acad.Sci. 84:9238-9242 (1987)].

P-selectin (cunoscut și ca GMP-140 și PADGEM) este prezent pe suprafața trombocitelor și a celulelor endoteliale unde mediază interacțiunile trombocit-leucocite și endoteliuleucocite [Geng et al., Nature, 343:757-760 (1990)]. De aceea, de exemplu, trombocitele activate care exprimă P-selectin pe suprafața lor sunt cunoscute ca legându-se de monocite și neutrofile [Jungi et al., Blood, m 67:629-636 (1986)], și, de asemenea, legând liniile de celule de tipul monocitelor, de exemplu HL-60 și U937 [Jungi et al., Blood, 67:629-636 (1986); Silverstein etal., J.CIin.Invest., 79:867-874 (1987)].

RO 117533 Β1

P-selectin este o alfa proteină de membrană granulară cu masa moleculară 140000 care este exprimată pe suprafața trombocitelor activate prin stimularea trombocitelor și 50 secreția de granule [Hsu-Lin et al., J.CIin.Chem., 259:9121-9126 (1984); Stenberg et al., J.Cell Biol., 101:880-886 (1985); Berman et al., J.CIin.Invest., 78:130-137 (1986)]. Se mai găsește și în megacariocite [Beckstead et al., Blood, 67:285-293 (1986)] și în celulele endoteliale [Mc.Ever et al., Blood, 70:335a (1987)] în anticorpii Weibel-Palade [Bonfanti et al., Blood, 73:1109-1112 (1989)]. Furie et al., brevet US 4783330 descriu anticorpi monoclonali 55 reactivi cu P-selectin.

Un al treilea receptor este receptorul de ghidare a limfocitelor, antigen MEL-14 sau echivalentul său uman LAM-1 (L-selectin) [Gallatin et al., Nature, 304:30-34 (1983); Siegelman et al., Science, 243:1165-1172 (1989); Rosen, Cell Biology, 1.:913-919 (1989); și Lasky et al., Cell, 56:1045-1055 (1989)]. în plus față de orientarea sau ghidarea limfo- 60 citelor, antigen MEL-14/LAM-1 se crede că funcționează de la început în legarea neurofilului la endotelium.

Termenul “Selectin” a fost sugerat pentru o clasă generală de receptori, care include E-selectin (ELAM-1), P-selectin (GMP-140) și L-selectin (MEL-14) din cauza domeniului asemănător cu lectin și a naturii selectin a funcțiilor lor adezive. Structura și funcția receptorilor 65 selectin au fost elucidate prin clonarea și exprimarea în întreaga lungime a cADN ce codifică fiecare din receptorii de mai sus.

[Bevilacqua et al., Science, 234:1160-1165 (1989), (ELAM-1); Geng et al., Nature, 343:757-760 (1990), (GMP-140); și Lasky et al., Cell, 56:1045-1055 (1989), (MEL-14 antigen)]. 70

Porțiunea extracelulară a selectinilor poate fi împărțită în trei segmente pe omologia cu proteinele descrise anterior. Regiunea N-terminală (circa 120 aminoacizi) se înrudește cu familia de proteine lectin de tipul C din mamifer așa cum a fost descris de Drickamer, J.Biol.Chem., 263:9557-9560 (1988) care induce receptorul CD23 de afinitate scăzută IgE. Urmează un segment de polipeptidă care are o secvență ce este în legătură cu proteine 75 conținând motivul factorului epidermal de creștere (EGF). în sfârșit, după domeniul EGF există unul sau mai multe motive repetitive în cascadă de circa 60 aminoacizi fiecare, în legătură cu acelea găsite în familia proteinelor de reglare complete.

Brevetul US 5079353 și brevetul său divizionar 5296594 prezintă sinteza și folosirea antigenului sialil Le^x și a antigenului sialil Le^a care sunt prezenți în țesuturile canceroase și 80 care sunt liganzi pentru receptorii selectin descriși anterior. Brevetul US 5143712 prezintă legarea reperată între receptorii variați cum ar fi ELAM-1 (E-selectin) și liganzi cum ar fi sialil Le^x, precum și liganzi conținând o multitudine de unități de N-acetillactozamină (LacNAc) împreună cu o grupă sialil terminală și una sau mai multe grupe fucozil care sunt legate de regiunea G/cNAC a unei unități LacNAc. 85

Publicația cererii internaționale WO 91/19501 și WO 91/19502 relevă faptul că oligozaharide conținând structurile pentamerice și hexamerice prezentate mai jos inhibă legarea celulară selectivă între celule conținând ligandul (mai jos) și celule conținând un receptor selectin și faptul că penta- și hexazaharidele analizate au dovedit o mai bună inhibiție decât SLe^x. 90

NeuAca2 — 3GalȘI -^(Fucal —3)GlcNAcpl, 3GalȘ-;

NeuAca2 3Gap ^4(Fuca1 _3)GlcNAcpl, 3GalȘI, 4Glc-; și NeuAca2 _ 3Galpl ^4(Fuca1 ^3)GlcNAcȘI = Sle^x.

RO 117533 Β1

Invenția de față are ca obiect derivați de analogi sialil Le^x ca inhibitori ai adeziunii celulare care au formula generală structurală următoare:

în care Z este un atom de hidrogen, o grupă acil C^Cg,

y este selectat din grupa care constă din C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O);

R¹ este selectat din grupa care constă dintr-un radical arii, arii substituit, o grupă fenil C^Cj alchen, în care o grupă arii are un ciclu aromatic cu 5 sau cu 6 membri, un ciclu aromatic cu 5 membri condensat cu un ciclu aromatic cu 6 membri, sau două cicluri aromatice cu 6 membri condensate, cicluri care sunt selectate din grupa care constă din hidrocarbil, monooxahidrocarbil, monotiahidro-carbonil, monoazahidrocarbil și diazahidrocarbil și o grupă arii substituită este grupa arii menționată care are un substituent selectat dintre halo, trifluorometil, nitro, alchil C^C^, alcoxi 0,-C^, amino, mono θΓθ18 alchilamino, alchil-amino, benzilamino, alchilbenzil amino, 0,-C^ tioalchil și alchil carboxamido, sau R¹Y este aliloxicarbonil sau cloracetil;

R² este selectat din grupa care constă din hidrogen, hidrocarbil Oi-C18 cu catenă lineară sau ramificată sau ciclic, C^-Cg alchil Ο,-Cg alchilen-m-carboxilat, ω-tri (ΟΓΟ4 alchil/fenil) silii C2-C4 alchilen, monozaharide și dizaharide, sau împreună cu OR² formează un hidrocarbil ΟΓΟ₁₈ carbamat cu catenă lineară, ramificată sau ciclică;

R³ este un atom de hidrogen sau un radical acil 0,-Cg;

R⁴ este un atom de hidrogen, un radical alchil Ο_ΓΟ₆ sau benzii;

R⁵ este selectat din grupa care constă din hidrogen, benzii, metoxibenzil, dimetoxibenzil și acil

R⁷ este un radical metil sau hidroximetil; și

X este selectat din grupa care constă din aciloxi Ο,-Cg, hidroxilaciloxi C₂-C₆, hidroxi, halo, azido.

Alți derivați de analogi sialil Le^x preferați sunt acei derivați care au formulă generală structurală următoare:

RO 117533 Β1

145 în care Y este selectat din grupele constând din C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O);

R¹ este selectat din grupa care constă dintr-un radical arii, arii substituit și o grupă fenil C^Cj alchilen, în care o grupă arii are un ciclu aromatic cu 5 membri, un ciclu aromatic cu 6 membri sau două cicluri aromatice cu 6 membri condensate, cicluri care sunt selectate din grupa care constă din ciclu hidrocarbil, monooxahidrocarbil, monotiahidrocarbil, monoazahidrocarbil și diazahidrocarbil și o grupă arii substituită este grupa arii menționată având un substituent selectat dun grupa care constă din halo, trifluorometil, nitro, 0,-C^ alchil, alcoxi CȚ-C^, amino, mono-C^-C^ alchil-amino, di-C^-C^ alchilamino, benzilamino, alchil C, C12 benzilamino, tioalchil Ct-C12 și alchil (Ț-C^ carboxamido, R² este selectat din grupa care constă din hidrogen, hidrocarbil θΓθιβ linear, ramificat sau ciclic, CȚ-Cg alchil (Ț-Cg alchilenω-carboxilat, w-tri(C1-C₄ alchil/fenil) silii alchilen C₂-C₄, monoazaharidă și dizaharidă, sau împreună cu OR² formează hidrocarbil (Τ-0₁₈ carbamat cu catenă lineară, ramificată sau ciclică;

R³ este un atom de hidrogen sau un radical acil Ο,Όθ;

R⁴ este una tom de hidrogen, un radical alchil 0<0₆ sau benzii;

R⁵ este selectat din grupa care constă din hidrogen, benzii, metoxibenzil, dimetoxibenzil și acil (Τ-Ο₆;

R⁷ este metil sau hidroximetil; și

X este selectat din grupa care constă din aciloxi CȚ-Cg, hidroxilaciloxi C₂-C₆, hidroxi, halo și azido.

De asemenea, mai sunt importanți și următorii derivați de analogi sialil Le^x care au formula generală structurală:

150

155

160

165

un radical acil (Ț-Cg sau

170 în care Z este un atom de hidrogen,

175

Y este selectat din grupa care constă din C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O);

R¹ este selectat din grupa care constă din arii, arii substituit și fenil (Ț-C, alchilen, în care o grupă arii are un ciclu aromatic cu 5 membri sau cu 6 membri, un ciclu aromatic cu 5 membri condensat cu un ciclu aromatic cu 6 membri, sau două cicluri aromatice cu 6 membri condensate, cicluri care sunt selectate din grupa care constă din ciclu hidrocarbil, monooxahidrocarbil, monotiahidrocarbil, mono-azahidrocarbil și diazahidrocarbil și o grupă arii substituită este grupa arii menționată având un substituent selectat din grupa care constă dintr-o grupă halo, trifluorometil, nitro, alchil CȚ-C^, alcoxi (Τ-Ο₁₈, amino, mono C_rCi₈ alchilamino, di-alchil Ο,-C^ amino, benzilamino, alchil benzilamino, tioalchil (Ț-C^ și alchil C.|-C_1B carboxamido, sau

R¹Y este aliloxicarbonil sau cloracetil;

R³ este hidrogen sau acil CȚ-Cg;

R⁴ este hidrogen, alchil Ο_ΓΟ₆ sau benzii;

180

185

190

RO 117533 Β1

R⁵ este selectat din grupa care constă din hidrogen, benzii, metoxibenzil, dimetoxibenzil și (Τ-Οθ acil;

R⁶ este selectat din grupa care constă din hidrogen, hidrocarbil θΓθ18 cu catenă lineară, ramificată sau ciclică, C^Cg alchil CȚ-Cg alchilen-u)-carboxilat și oj-trifCȚ-C^ alchil/fenil) silii alchilen C₂-C₄, sau împreună cu OR⁶ formează hidrocarbil θΓθ18 carbamat cu catenă lineară, ramificată sau ciclică;

R⁷ este metil sau hidroximetil; și X este selectat din grupa care constă din aciloxi Ο_Γ C₆, hidroxil aciloxi C₂-C₆; hidroxi, halo și azido.

Derivați conform invenției mai sunt și acei derivați reprezentați prin următoarea formulă generală structurală:

în care Y este selectat din grupa care cosntă din C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O);

R¹ este selectat din grupa care cosntă dintr-o grupă arii, arii substituită și fenil CȚ-C/ alchilen, în care o grupă arii are un ciclu aromatic cu 5 membri sau 6 membri, un ciclu cu 5 membri condensat cu un ciclu cu 6 membri, sau două cicluri aroamtice cu 6 membri condensate, cicluri care sunt selectate din grupa care constă din cicluri hidrocarbil, monooxahidrocarbil, monotiahidrocarbil, monoazahidro-carbil și diazahidrocarbil, și o grupă arii substituită este grupa arii menționată având un substituent selectat din grupa care constă din halo, trifluorometil, nitro, alchil C^C^, alcoxi CȚ-C^, amino, mono-C^C^-alchilamino, di-C^C^alchilamino, benzilamino, alchil benzilamino, tioalchil și alchil carboxamido;

R² este selectat din grupa care constă din hidrogen, hidrocarbil θΓθ18 cu catenă lineară, ramificată sau ciclică, C^Cg alchil Ο_ΓΟ₅ alchilen ω-carboxilat; oo-trițC, -C₄-alchil/ fenil) silii alchilen C₂-C₄, monozaharidă și dizaharidă, sau împreună cu OR² formează un hidrocarbil Ci-C-18 carbamat cu catenă lineară, ramificată sau ciclică;

R⁷ este metil sau hidroximetil; și

X este selectat din grupa care constă din aciloxi CȚ-Cg, hidroxilaciloxi C₂-C₆, hidroxi, halo și azido, sau derivați care au formulele structurale următoare:

RO 117533 Β1

245

250

255

260

265

270

275

RO 117533 Β1

Următorii derivați având formulele structurale de mai jos fac parte de asemenea din derivații conform invenției:

,o(ch₂)₃ch_?

RO 117533 Β1

315

320

325

330

RO 117533 Β1 sau derivații a căror formule structurale sunt date mai jos:

OMe

RO 117533 Β1

395

Un alt obiect al prezentei invenții constă într-un procedeu de preparare a sării de amoniu a lactozei prin supunerea

a) amestecării lactulozei cu o amină primară care este un derivat de amoniu mono substituit în care atomul de azot este legat la o grupă de blocare ce se îndepărtează prin reducere, pentru a forma un amestec de reacție, amina primară menționată servind atât ca solvent, cât și ca reactant și fiind prezentă într-o cantitate care este de la 2 ori la 10 ori cantitatea molară a lactulazei; apoi

b) se menține amestecul de reacție menționat la o temperatură de la 10°C la 60°C o perioadă de timp suficientă pentru a forma N-glicozida corespunzătoare lactulozei; având loc după aceea,

c) reacția N-glicozidei lactulozei formate cu până la o cantitate echivalentă dintr-un acid carboxilic având o valoare pK_a de aproximativ 2,5 la 5,0, într-un solvent de tip alcool C^ C₃ la o temperatură de aproximativ 1O...3O°C pentru a se transforma N-glicozida lactuloza într-o sare de amoniu a lactulozei amino-blocată care are o grupă de blocare, ce se îndepărtează prin reducere, legată la amină; și în final are loc

d) îndepărtarea reductivă a grupei de blocare din sarea de amoniu a lactulozei amino-blocate menționată.

Un ultim obiect al invenției constă într-o compoziție farmaceutică constituită dintr-un diluant acceptabil farmaceutic în care este dizolvată sau dispersată o cantitate de derivați de analogi sialil Le^x care inhibă legarea celulară, având următoarea formulă generală structurală:

400

405

410

420 în care Y este selectat dintr-o grupă care constă din C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O);

R¹ este selectat din grupa care constă dintr-o grupă arii, un arii substituit și un fenil C^Ca alchilen, în care grupa arii are un ciclu aromatic de 5 membri sau de 6 membri, un ciclu de 5 membri condensat cu un ciclu de 6 membri, sau două cicluri aromatice cu 6 membri condensate, cicluri care sunt selectate din grupa care cosntă din cicluri hidrocarbil, 425 monooxahidrocarbil, monotiahidrocarbil, monoazahidrocarbil și diazahidrocarbil, și o grupă arii substituită este grupa arii menționată, care are un substituent selectat din grupa care constă din halo, trifluorometil, nitro, alchil Ο,-C^, alcoxi Ο,-C^, amino, mono-C^C^alchilamino, di-C^C^alchilamino, benzilamino, alchilbenzilamino, tioalchil și alchil carboxamido; 430

R² este selectat din grupa care cosntă din hidrogen, hidrocarbil cu catenă lineară, ramificată sau ciclică, C^Cg alchil C_rC₅ alchilen-u-carboxilat, ω-tri (Ο_ΓΟ₄ alchil/fenil)silil C₂-C₄ alchilen, monozaharidă și diazaharidă, sau împreună cu OR² formează hidrocarbil carbamat cu catenă lineară, ramificată sau ciclică; 435

R⁷ este metil și hidroximetil; și

X este selectat din grupa care constă din aciloxi C^Cg, hidroxilaciloxi C₂-C₆, hidroxi, halo și azido.

Invenția de față prezintă avantajul obținerii unor compuși care inhibă legarea celulară selectin-mediată. 440

RO 117533 Β1

Prezenta invenție descrie un compus analog sialil Le^x (SLe^x) care inhibă adeziunea celulelor care exprimă SLe^x pe suprafața lor la un receptor selectin. De asemenea, invenția mai tratează un compus intermediar folosit în sinteza unui inhibitor, precum și un procedeu de preparare a intermediarului și o compoziție conținând un inhibitor.

Un derivat analog conform invenției corespunde formulei generale structurale următoare:

unde Z este hidrogen, C^Cg acil sau:

Y este selectat dintr-un grup constând în C(O), SO₂, HNC(O), și SC(O);

R¹ este selectat din grupul constând dintr-un arii, un arii substituit și o grupare fenil C^Cj alchilen în care o grupare arii are un inel aromatic cu 5 sau 6 atomi, inele aromatice condensate cu 5/6 atomi, inele care sunt selectate din grupul constând în inele hidrocarbil, monooxahidrocarbil, monotiahidrocarbil, monoazahidrocarbil și diazahidrocarbil, și o grupare arii substituită este o grupă arii deja menționată având un substituent selectat dintr-un grup constând în grupe halo, trifluorometil, nitro, alchil, θΓθ18 alcoxi, amino, mono-C^C^ alchilamino, di-C^C^ alchil amino, benzilamino, alchilbenzilamino, tioalchil și alchil carboxamido sau

R¹Y este aliloxicarbonil sau acloracetil; R² este selectat din grupul constând din hidrogen, hidrocarbil cu catenă lineară θΓθ18 ramificată sau ciclică, C^CgalchilC^Cg alchilen-(O-carboxi1at, ω-tri (C,-^ alchil/fenil) silii C₂-C₄ alchilen, monozaharidă și diazaharidă sau împreună cu OR² formează hidrocarbil θ1θ18 carbamat cu catenă lineară, ramificată sau ciclică; R³ este hidrogen sau acil C^Cg; R⁴ este hidrogen, alchil C^Cg sau benzii; R⁵ este selectat din grupa care constă din hidrogen, benzii, metoxibenzil, dimetoxibenzil și C^Cg acil; R⁷ este metil și hidroximetil; și Y este de preferat carbonil [C(O)].

Pentru un grup de inhibitori, R² este de preferat o monozaharidă sau, mai preferabil o Ο,-C^ alchil glicozidă a unei monozaharide; R⁷ este metil, Z este o grupă fuco neprotejată, X este o grupă hidroxil și R¹Y este altceva decât aliloxicarbonil sau cloracetil. Un intermediar pentru un inhibitor poate avea oricare din grupele “R” ilustrate, R³, R⁴ și R⁵ fiind de preferat altceva decât hidrogen.

Un inhibitor preferat în mod special corespunde următoarei formule generale structurale:

RO 117533 Β1 unde R¹ este ca mai sus și R¹Y este altceva decât aliloxicarbonil sau cloracetil, X are semnificațiile de mai sus și de preferat altceva decât C_rC₆ alcoxi și C,-C₆ hidroxilaciloxi și R² și R⁷ sunt așa cum s-a discutat mai sus. în una din varinate, R² este de preferat altceva decât mono- sau dizaharidă. O grupă R² benzii este preferată în mod special.

O altă grupă de inhibitori preferați corespunde formulei generale structurale următoare:

495

500

505 unde R¹ este ca mai sus cu excepția aliloxicarbonil și cloracetil, grupările R¹Y sunt excluse, X este ca mai sus și de preferat altceva decât Ο,-Ο₆ alcoxi și C,-C₆ hidroxilaciloxi, R⁷ are semnificațiile de mai sus și R² este o mono- sau dizaharidă.

Compoziția farmaceutică conform invenției conține un diluent sau purtător acceptabil farmaceutic având dizolvată sau disperată în el o cantitate de derivat ce determină inhibiția adeziunii celulare având formula generală structurală următoare:

510

515

520 unde Y este selectat dintr-o grupă constând în C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O);

R¹ este așa cum s-a dfefinit mai sus și este de preferință selectat din grupul constând dintr-o grupă arii, arii substituit și o grupă fenil C,-C₃ alchilen, în care o grupă arii este selectată din grupul constând din furii, tienil, naftil, piridil, pirazinil, benzofuranil, izobenzofuranil, benzo [b sau c] tienil, pirimidinil, piridazinil, chinolinil, izochinolinil, chinoxalinil, nafthidrinil, ftalazinil, și chinazolinil și o grupă arii substituită este o grupă arii menționată mai sus având un substituent selectat din grupul constând din halo, trifluorometil, nitro, C,-C,₈ alchil, 0,-0,8 alcoxi, amino, mono-C,-C,₈ alchilamino, di-C,-C,₈ alchilamino, benzilamino și C,-C,₈ alchilbenzilamino;

R² este selectat din grupul constând din hidrogen, hidrocarbil cu catenă C,-C,8 liniară, ramificată sau ciclică, C,-C6 alchil C,-C5 alchilen ω-carboxilat; u)-tri(C,-C4-alchil/fenil)silil C2-C4 alchiden, monozaharide și dizaharide sau împreună cu OR² formează un hidrocarbil carbamat cu o catenă C,-C,8 liniară, ramificată sau ciclică;

R⁷ este metil (CH₃) sau hidroximetil (CH₂OH); și

X este selectat din grupul constând în C,-C₆ aciloxi, C₂-C₆ hidroxilaciloxi, hidroxi, halo și azido.

525

530

535

RO 117533 Β1

Preferințele menționate mai sus pentru un inhibitor se mențin pentru o compoziție farmaceutică.

Procedeul de preparare a unei sări de lactozamoniu constă din:

a) amestecarea lactulozei cu o amină primară care este un derivat de amoniu monosubstituit al cărui atom de azot este legat de o grupă de blocare ce se îndepărtează prin reducere, cum ar fi benzilamina, pentru a forma un amestec de reacție. Amina primară servește atât ca reactant cât și ca solvent sau solvent primar și este prezentă într-o cantitate care este de aproximativ 2 la 10 ori cantitatea molară de lactuloză, de preferat aproximativ de la 4 la 8 ori exces molar, după care

b) amestecul de reacție se menține la o temperatură de aproximativ 10°C până la 60°C și de preferință la temperatura camerei până la circa 50°C, pe o perioadă de timp suficientă pentru formarea N-glicozid lactulozei corespunzătoare. Acest timp de menținere poate varia de la circa 2 la 7 zile atunci când se doresc randamente maxime, după care

c) N-glicozid lactuloza formată reacționează cu o cantitate echivalentă de acid carboxilic având o valoare pK_a-ului între circa 2,5 și 5,0 într-un solvent alcoolic C^Cj cum ar fi metanolul la o temperatură de circa 10°C până la 30°C pentru a rearanja N-glicozid lactuloza într-o sare amino-blocată de lactozamoniu având o grupă de blocare care se îndepărtează prin reducere, legată la amină. N-glicozid lactuloza poate fi prezentă de la circa 0,1 M până la saturație; și în final

d) grupa de blocare este îndepărtată prin reducere de exemplu prin hidrogenoliza din așa-zisa sare amino-blocată de amoniu pentru a forma sarea de lactozamoniu. Această sare este, de preferință recuperată.

Nomenclatura folosită pentru a descrie radicalii de oligozaharide ale prezentei invenții urmărește nomenclatura convențională. Sunt folosite abrevierile standard pentru monozaharidele individuale. De exemplu, 2-N-acetilglucozamina este reprezentată de GIcNAc, 2-Nacetilgalactozamino este GalNAc, fucoza este Fuc, fructoza este Fru, galactoza este Gal, glucoza este Glc și manoza este Man. Dacă nu se indică altfel, toate zaharurile cu excepția fucozei (L-izomer) sunt D-izomeri în configurația ciclică (de exemplu, piranoză sau furanoză). Cei doi anomeri ai formelor ciclice sunt reprezentați prin a și β.

Monozaharidele sunt în general legate prin legături glicozidice pentru a forma oligoși polizaharide. Orientarea legăturii ținându-se seamă de planul inelelor este indicată de a sau β. Atomii de carbon particulari care formează legătura între două monozaharide sunt de asemenea notați. De aceea, o legătură β glicozidică între C-j al galactozei și C₄ al glucozei este reprezentată de Ga^_^4 Glc. Pentru D-zaharuri (de exemplu, D-GIcNAc, D-Gal, DNeuAc și D-Man), semnul a reprezintă hidroxilul atașat la C-1(C-2 în NeuAc și D-Man) ce se găsește dedesubtul planului inelului și β se găsește deasupra inelului, în cazul L-fucozei, semnul a reprezintă hidroxilul care se găsește deasupra inelului și β reprezintă pe cel care este dedesubt.

Prezenta invenție mai descrie un derivat analog SLe^x cu formula structurală A, mai jos, formulă structurală care cuprinde un compus pentazaharidic cu formula I care este analogul sialil Le^x, precum și precursorii săi penta și tatrazaharidici cu formula II și respectiv, III. Un compus având formula structurală I inhibă adeziunea celulară mediată de un receptor selectin celular de suprafață.

RO 117533 Β1

585

590

595

600

605

610

615 (III) în formulele generale structurale de mai sus,

Z este hidrogen (H) sau C,-C₆ acil, în care caz un compus cu formula III se definește, sau un α-L-fucosil ale cărui grupe hidroxil sunt libere sau blocate cu o grupă protectoare (benzii sau C,-C₆ acil), definind astfel un compus cu formula I sau II, depinzând de identitățile grupelor R³, R⁴ și R⁵(R³‘⁵);

Y este selectat din grupul constând în C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O);

R¹ este selectat din grupul constând dintr-un arii, un arii substituit, și o grupă fenil C,-C₃ alchilen, în care o grupă arii are un inel aromatic cu cinci sau șase atomi, inele aromatice condensate cu cinci/șase atomi, inele care sunt selectate din grupul constând din hidrocarbil, monooxahidro-carbil, monotiahidrocarbil, monoazahidrocarbil și diazahidro-carbil, și o grupă arii substituită este o grupă arii menționată mai sus având un substituent selectat dintr-o grupă constând din halo, trifluorometil, nitro, C,-C₁₈ alchil, C,-C,₈ alcoxi, amino, mono0.,-0,8 alchilamino, di-0,-0^ alchil-amino, benzilamino, C,-C,₈ alchilbenzilamino, 0,-0,8 tioalchil și C,-C,₈ alchil carboxamido sau

620

625

630

RO 117533 Β1

R¹Y este aliloxicarbonil sau acloracetil;

R² este selectat din grupul constând din hidrogen, hidrocarbil cu catenă liniară, ramificată sau ciclică, C^Cg alchil C.,-C₅ alchilen-uj-carboxilat, ω-tri (C,-^ alchil/ fenil)silil

C₂-C₄ alchilen, monozaharide sau diazaharide, sau împreună cu OR² formează hidrocarbil carbamat cu catenă liniară, ramificată sau ciclică; R³ este hidrogen sau Ο,-Οθ acil; R⁴ este hidrogen, (Ț-Cg alchil sau benzii; R⁵ este selectat dintr-un grup constând din hidrogen, benzii, metoxibenzil, dimetoxibenzil și Ο,-Οθ acil; R⁷ este metil (CH₃) sau hidroximetil (CH₂OH); și X este selectat din grupul constând în C^Cg aciloxi, C₂-C₆ hidroxilaciloxi, hidroxi, halo și azido.

Așa cum s-a arătat mai sus, Y poate fi una dintre aceste grupe. Când Y este C(O), R¹Y este o grupă acil substituentă astfel formându-se o amidă cu atomul de azot aminic al zaharidei. Când Y este SO₂, R¹Y formează o grupă sulfonil substituentă, formându-se o sulfonamidă cu atomul de azot aminic al zaharidei. Când Y este HNC(O), R¹Y este o grupă aminocarbonil substituentă astfel că un substituent ureic se formează cu atomul de azot al zaharidei. Un substiutent uretanic se formează cu atomul de azot aminic al zaharidei când

Y este oxicarbonil, OC(O), iartiouretan se formează când Y este tiocarbonil, SC(O). O grupă

Y este de preferință o grupă carbonil [C(O)j.

O grupă R¹Y poate, de asemenea fi o grupă aliloxicarbonil sau cloracetil. O grupă aliloxicarbonil R¹Y este preferată în mod special pentru un compus cu formula III, întrucât grupa R¹ poate fi rapid înlocuită. O grupă R¹Y aliloxicarbonil sau cloracetil este prezentă numai într-un compus cu formula III și nu este prezentă într-un compus cu oricare dintre formulele I, II, A, B sau C (formulele B și C sunt prezentate în cele ce urmează).

Așa cum s-a discutat mai sus, o grupă R¹ poate fi arii sau arii substituită. Grupele arii studiate sunt cele ce conțin un inel aromatic cu cinci sau șase atomi, inele condensate cu cinci și șase (cinci/șase) atomi sau două inele aromatice condensate cu șase atomi și care includ grupe hidroxicarbonil cum ar fi fenil sau naftil, precum și grupe hidrocarbil ce au și oxigen sau sulf, sau unul sau doi atomi de azot care înlocuiesc atomii de carbon ai inelului (mono sau diazahidrocarbil). Grupe arii model includ furii, tienil, piridil, pirazinil, benzofuranil, (benzo[b]furil), izobenzo-furanil(benzo[c]furil), benzotienil(benzo[b]tienil), izobenzo-tienil (benzo[c]tienil), pirimidinil, piridazinil, chinolinil, izochinoil, chinoxalinil, naftiridinil, ftalazinil, și chinazolinil. Fiecare din aceste grupe arii poate fi nesubstituită sau fiecare poate avea un substituent selectat din grupul constând din halo, trifluorometil, nitro, alchil, alcoxi, amino, mono-C^C^ alchilamino, di-C^C^ alchilamino, alchilbenzilamino și alchil carboxamido.

Grupele arii R¹ substituite sau nesubstituite sunt bine cunoscute în domeniu și fiecare poate fi legată la un atom de azot al zaharidei folosind reacții chimice bine cunoscute. Discuția care urmează se va concentra din acest motiv asupra grupelor arii, hidroxicarbil, fenil și naftil, ca fiind model pentru grupă, fiind înțeles faptul că celelelte grupe R¹ arii și arii substituite enumerate pot fi utilizate în același mod substanțial analog din punct de vdere chimic.

Când R¹ este fenil, poate fi utilizată clorură de benzoil sau anhidridă benzoică pentru a forma o legătură amidică preferată. O halogenură de benzensulfonil cum ar fi clorura de benzensulfonil poate fi utilizată în mod similar când Y este SO₂. Fenil izocianatul poate fi folosit când Y este HNC(O). Fenil cloroformiatul este folosit când Y este OC(O), în timp ce fenil tiocloroformiatul este folosit când Y este SC(O).

Grupe R¹ fenil substituite studiate în mod specific le includ pe acelea în care substituentul poate fi substiutit în orice poziție a inelului aromatic, pozițiile meta și para fiind preferate. Grupele R¹ fenil mono-substituite sunt preferate grupelor di-substituite.

RO 117533 Β1

Substituenții halogenați studiați includ grupele fluoro, cloro, bromo și iodo, cu βfluorofenil, m-clorofenil, m-iodofenil, p-bromofenil și p-fluorofenil fiind ca model. Grupările R¹ fenil dihalo-substituite sunt de asemenea studiate ca 3,4-diclorifenil, 3,5-diclorofenil, 2-cloro4-fluorofenil și 3-bromo-4-fluorofenil.

Grupele model θ1^-θ18 alchil prezente ca grupe substituente pe un radical fenil al R¹ includ grupăe alchil cu catenă liniară sau ramificată cum ar fi metil, etil, propil, izopropil, butii, izobutil, f-butil, pentil, hexil, octil, nonil, decil, dodecil, tetradecil, hexadecil și octadecil. Grupele alchil sunt preferate, în timp ce grupele alchil C_rC₆ sunt preferate în mod special, metil fiind grupa cea mai preferată. Ca model, grupele R¹ preferate includ grupele o, m și p -tolil(metilfenil) și p-t-butilfenil, precum și grupele 3,4-dimetilfenil și 3,5-dimetilfenil.

Grupele alcoxi Ο_ΓΟ₁₈ model sunt esteri conținând o grupă alchil sau o grupă alchil C^Cg preferată în mod special. Aici este preferată o grupă metoxi. Ca model, grupele R¹ preferate includ o, m și p -anisil(metoxifenil), precum și 3,4-demetoxfenil și 3,5dimetoxifenil.

O grupă R¹ nitrofenil este preparată rapid prin acilare folosind clorură de 3- sau 4nitrobenzoil. Acilarea cu clorură de 3,4- și 3,5-dinitrobenzil conduce la grupele R¹ 3,4- și 3,5dinitrofenil corespunzătoare. Formarea amidelor utilizând clorura de 3- sau 4-trifluorometilbenzoil conduce în mod similar la grupele R¹, 3 sau 4-trifluorometilfenil.

O grupă R¹ fenil substituită poate conține de asemenea amino, mono-C^C^ alchilamino, di-C^C^ alchilamino, benzil-amino, C_rC₁₈ alchilbenzilamino sau substituent C^C^ alchil carboxamido, în care substituenții alchil Ο,-C^ sunt așa cum s-a discutat mai sus.

Grupele R¹ aminofenil se prepară cel mai rapid din grupele R¹ nitrofenil corespunzătoare discutate mai sus, prin reducerea catalitică a grupei nitro după formarea legăturii amidice, așa cum s-a discutat mai sus. De aceea, de exemplu, utilizarea clorurii de 3- sau 4-nitrobenzoil pentru a forma legătura amidică după reducerea cu paladiu pe cărbune formează grupele R¹ 3- sau 4-aminofenil corespunzătoare. O utilizare similară a clorurii de 3,4 sau 3,5-dinitrobenzoil conduce la grupele R¹ 3,4- sau 3,5-diaminofenil corespunzătoare, după reducere.

Câțiva acizi di-C^Cg alchilaminobenzoici cum ar fi acidul 4-dietilaminobenzoic și acizii 3- și 4-dimetilaminobenzoic pot fi procurați comercial și folosiți pentru a forma o halogenură de benzoil sau o anhidridă adecvată pentru formarea unei amide ce conține R¹. Acizii diΟ,-C^ alchilaminobenzoici care rămân și acei compuși având două grupe dialchilamino pot fi preparați folosind tehnici de alchilare cunoscute, din acizi aminobenzoici corespunzători sau din acizii diamino-benzoici care sunt de asemenea disponibili din punct de vedere comercial.

O grupă R¹ mono-C^C^ alchilaminofenil poate fi preparată din halogenura de monoalchilbenzil corespunzătoare, a cărei valență liberă a azotului este blocată de o grupă de blocare care se poate înlocui rapid cum ar fi t-Boc care poate fi îndepărtată cu acid sau o grupă benzii care poate fi îndepărtată prin hidrogenare, dacă se dorește, utilizând paladiu pe cărbune. De aceea, acilarea poate avea loc utilizând clorură de N-benzil-N-propilaminobenzoil, grupa N-benzil fiind îndepărtată prin hidrogenare catalitică pentru a forma grupa R¹ mono-C^-C^ alchilbenzilamino.

Fiecare dintre substituenții fenil sau fenil substituit discutați mai sus pot fi preparați printr-o reacție bine cunoscută de formare a amidelor.

O reacție model este cea în care reacționează o halogenură de benzoil adecvată sau o anhidridă, cum ar fi clorura de β-fluorobenzoil sau anhidrida benzoică, o grupă aminică neprotejată a unui zahar astfel protejat așa cum este ilustrat în detaliu în cele ce urmează.

680

685

690

695

700

705

710

715

720

725

RO 117533 Β1

Sunt studiate ambele grupe R¹ 1- și 2-naftil, grupa 2-naftil fiind preferată în mod special. Acești compuși pot fi de asemenea preparați folosind tehnologia standard de formare a amidelor ca mai sus, cim ar fi prin reacția dintre clorură de 2-naftoil cu amina unei zaharide adecvate așa cum s-a discutat mai sus.

Trebuie înțeles faptul că substituenți similari sunt prezenți la grupările oxa-, tia-, azași diaza hidrocarbil arii. De exemplu, se pot utiliza oricare din cele două cloruri ale acidului furoic, cele două cloruri de tiofencarboxil, cele trei cloruri de piridincarboxil, clorură acidului chinaldic, clorură acidului 3-chinolincarboxilic, clorură de 2-chinoxa-loil și altele asemenea care participă la reacția de acilare.

în mod similar, când Y este SO₂, este folosită o halogenură sulfonil corespunzătoare. De exemplu, se pot utiliza clorură de benzensulfonil, clorură de toluensulfonil, clorură de 8chinolinsulfonil, clorură de 1- sau 2-naftalen-sulfonil și altele asemenea pentru a forma sulfonamida.

Când Y este HNC(O), izocianatul corespunzând unui acid carboxilic descris mai sus, este un reactant convenabil. Astfel de derivați pot fi preparați rapid din halogenura acidă prin reacția cu azida pentru a forma acil azida care suferă o rearanjare Curtius pentru a forma izocianatul prin încălzire.

Când Y este OC(O) sau SC(O), o grupă arii R¹ hidroxil sau mercapto substituită reacționează cu fosgen pentru a da cloroformiat sau clorotioformiat care poate reacționa cu amina zaharidei pentru a forma uretan sau tiouretan legat la un R¹.

O grupă R¹ fenil CrC3 alchilen este o grupă C^Cj alchilen care ea însăși este substituită cu o grupă fenil, de preferat la carbonul terminal al grupei hidrocarbil. Această grupă R¹C(O) conține din acest motiv un inel fenil legat de o catenă cu 2-4 atomi de carbon. Grupele C(O)R¹ alchilen model includ 2-fenil-acetoil, 3-fenilpropionil și 4-fenilbutanoil [0CH2C(O), 0CH₂CH₂C(O) și respectiv 0(CH₂)₃C(O), unde 0=fenil]. Acești compuși pot fi preparați prin reacția unei halogenuri acide adecvate sau a unei anhidride cu o amină a zaharidei. Reducerea catalitică folosind hidrogen și un catalizator de paladiu pe cărbune poate fi utilizată pentru a forma grupe alchiden saturate din catene hidrocarbil nesaturate; cafenele hidrocarbil saturate sunt cele preferate.

O grupă R² formează un β-glicozid cu sistemul inelului zaharidei. Această legătură glicozidică poate fi formată dintr-un alcool Ο,-C^ hidrocarbil simplu, dintr-un ester al acidului ω-hidrocarboxilic, dintr-o grupă alchil ω-hidroxilată sialilată sau dintr-o mono- sau dizaharidă sau împreună cu OR² formează un carbamat hidrocarbil cu catenă θΓθ18 liniară, ramificată sau ciclică. O grupă C^Cg hidrocarbil cum ar fi etil, o grupă benzii sau o monozaharidă cum ar fi 3-galactozil sunt preferate în mod special. R² poate fi de asemenea hidrogen.

Grupe R² model formate din grupe simple precursoare ale alcoolului includ grupe hidrocarbil cu catenă liniară, ramificată sau ciclică.

Astfel de grupe sunt grupele C^-Cg alchil descrise anterior care sunt preferate, precum și omologii lor nesaturați, cum ar fi alil, 3-butenil, 2-but-3-enil și but-3-inil, precum și grupele hidrocarbil mai lungi cum ar fi benzii, 4-metilciclohexil, decahidronaftil, nonil, decil (capril), dodecil (laurii), dodec-7-enil, ministil, palmitil, stearil, oleil, linoleil, linolenil și ricinoleil.

Un carbamat hidrocarbil se prepară prin reacția dintre un izocianat corespunzând unei grupe θΓθ18 hidrocarbil discutate anterior, cu o grupă hidroxil zahărului reducător din capăt. De exemplu, grupa 1-hidroxil a unității glicozil terminale poate reacționa cu etilizocianat pentru a forma etil carbamatul (uretan) corespunzător. Grupa carbonil a carbamatului nu este inclusă în numărul atomilor de carbon din hidrocarbil.

O grupă R²,0,-Οθ alchil Ο_ΓΟ₅ alchilen ω-carboxilat este un ester Ο,-Cg alchil al unui acid C₂-C₆ ω-carboxilic. Astfel de esteri sunt preparați din esteri precursori ai acidului ωhidrocarboxilic ale căror grupe hidroxil sunt folosite pentru a forma legătura glicozidică.

RO 117533 Β1

Esterii ω-hidroxicarboxilați model includ metil 2-hidroxiacetat, etil 3-hidroxipropionat, t-butil

4-hidroxibutirat, hexil 5-hidroxi-pentanoat și metil 6-hidroxihexanoat. De aceea, grupele hidroxil și carboxil sunt la capetele catenei și sunt separate de 1-5 grupe metilen. Acidul metil

6-hidroxihexanoat este preferat. 780

O grupă R², oj-trifCȚ-C^ alchil/fenil)silil C₂-C₄ alchil se formează dintr-un alcool precursor corespunzător a cărui grupă silii substituită este la capătul (poziția ω) catenei, opusă grupei hidroxil.

Așa cum este binecunoscut în domeniu, grupele silii substituite pot include multe combinații ale grupelor CȚ-C^ alchil și fenil cum ar fi tri-C^Cg alchil, di-C^Q, alchilfenil, C, -C₄ 785 alchildefenil și trifenil. Grupe silii substituite model includ trimetilsilil, trifenilsilil, di-fbutilmetilsilil, dimetilfenilsilil, f-butilfenilsilil și alții asemenea.

Mono- și dizaharide model includ 3- și 4-glucozil (3/4 Glc), 3- și 4-galactozil (3/4 Gal), o grupă 3-galactozil fiind preferată în mod special, 3- și 4-N-acetilglucozil (3/4 GIcNAc), 2,3,4- și 6-manozil (2/3/4/6 Man) și 3- și 6-N-acetilgalactozil (3/6 GalNAc) și Galpl^4 790 GIcNAc. O monozaharidă poate ea însăși forma o legătură glicozidică cu o grupă R⁶, care include setul în afară de zaharul unei grupe R². De aceea, R⁶ este alt R² decât mono- sau dizaharida. O formulă structurală pentru un compus preferat cu formula A având o grupă 3GaipOR⁶ terminală reducătoare este prezentată mai jos în formula B structurală în care X,

Y, Z și R^1-4, R⁶ și R⁷ sunt așa cum s-au definit anterior. 795

Un compus preferat în mod special are formula B și este un inhibitor al legării celulare având o structură de formula C, de mai jos, în care X, Y, R¹, R⁶ și R⁷ sunt așa cum 805 au fost prezentate anterior.

Legătura β-glicozil formată cu o grupă R² sau R⁶ poate fi obținută prin reacții chimice 815 organice bine cunoscute în domeniu cu ambele zaharuri și alți precursori ai grupelor R²(R⁶), cum ar fi prin reacția unei 1-halo zaharide cu o grupă hidroxil al unui alcool precursor al grupei R²(R⁶) dorite în prezența carbonatului de argint (Ag₂CO₃) sau triftalatului de argint, precum și prin mijloace enzimatice cum ar fi cu glicozil transferaza pentru zaharide.

O grupă R³ studiată poate fi hidrogen sau CȚ-Cg acil, care reprezintă porțiunea acidă 820 a esterului acidului Ο,-Οθ acil carboxilic. O grupă C^Cg acil este preferată pentru un compus cu formula II. Grupele C^Cg acil model includ formil, acetil, propionil, butanoil, izobutanoil, pentanoil și hexanoil. O grupă acetil este preferată. Acilarea grupelor hidroxil ale zaharidei este bine cunoscută și poate fi realizată utilizând o halogenură acidă adecvată sau o anhidridă. 825

RO 117533 Β1

O grupă R⁴ de formula A poate fi un atom de hidrogen, un radical Ο,-Οθ alchil așa cum s-a discutat anterior pentru astfel de grupe alchil sau o grupă benzii. O grupă R⁴ împreună cu atomul de oxigen legat formează porțiunea alcoolică a unui ester. Este preferată o grupă metil. Esterul R⁴ poate fi format prin mijloace standard înainte de adiția grupei acidului sialic, după formarea zaharidei sialilate folosind un reactiv cum ar fi diazometan sau prin reacția unei lactone cu un alcool adecvat așa cum s-a discutat privitor la schema 2 în cele ce urmează.

Grupa R⁴ a unui compus cu formula II poate fi un proton, fie C^Cg alchil sau grupe benzii, C^Cg alchil fiind preferat. Când R⁴ este prezent ca proton, trebuie înțeles faptul că acest proton poate fi înlocuit de un cation acceptabil farmaceutic (M) cum ar fi amoniu, sodiu, potasiu, calciu, magneziu și alții asemenea. Protonul R⁴ sau alt cation nu este în mod tipic prezentat în structurile de aici cum ar fi formula I și C, deoarece acidul sialil carboxilic este în mod uzual ionizat la valori de pH fiziologice de aproximativ 7,2-7,4 la care un inhibitor cu formula I sau C este utilizat. De aceea, grupa sialil carboxil este adesea reprezentată ca un carboxilat.

O grupă R⁵ este un atom de hidrogen, un radical benzii, metoxibenzil (3- sau 4metoxibenzil fiind preferat), un dimetoxibenzil cum ar fi 3,4- sau 3,5-dimetoxibenzil sau o grupă CȚ-Cg acil așa cum s-a discutat anterior. O grupă benzii este în mod uzual utilizată când grupa fucozil este adăugată prin sinteză chimică organică.

Grupele R³, R⁴ și R⁵ altele decât hidrogen sunt grupe protectoare folosite în timpul sintezei intermediarilor cum ar fi compusul cu formula Β, II și III, de mai sus. Când R³=R⁴=R⁵=H (hidrogen) un compus cu formula II devine un compus cu formula I, în timp ce un compus cu formula B devine un compus cu formula C, când Z este o grupă fuco. în mod similar, când Z este fuco și R³=R⁴=R⁵=hidrogen, un compus cu formula A devine un compus cu formula I.

O grupă X substituentă poate fi o grupă Ο,-Cg aciloxi; de exemplu, un ester C^Cg acil al unei grupe hidroxil precursoare în aceea poziție, o grupă C₂-C₆ hidroxiaciloxi, o grupă hidroxil, o grupă halo, așa cum s-a discutat anterior sau o grupă azido. Grupele C^Cg acil model au fost deja discutate și o grupă Ο,-Οθ aciloxi este o grupă C_rC₆ acil care include mai departe un atom de oxigen suplimentar legat la atomul de carbon carbonilic al unei grupe acil. O grupă C₂-C₆ hidroxiaciloxi este o grupă CȚ-Cg aciloxi discutată mai sus care include în continuare o grupă hidroxil substituită. Grupele C₂-C₆ hidroxiaciloxi model includ hidroxiacetat, lactat, 3-hidroxibutirat, 2-hidroxizovalerat și 2-hidroxicaproat. Un substituent X este de obicei altul decât Ο^Οθ aciloxi sau C₂-C₆ hidroxiaciloxi numai dacă atât sialilarea și fucozilarea nu sunt realizate enzimatic, așa cum se va discuta în cele ce urmează.

Sintezele derivaților acidului sialic conținând un substituent X sunt prezentate în cererea internațională WO 92/16640 care s-a publicat la 1 Octombrie 1992. Utilizarea acestor compuși pentru sialilarea zaharidelor este de asemenea prezentată în această publicație.

O grupă R⁷ este metil sau hidroximetil astfel încât împreună cu grupa carboxil descrisă [C(O)]R⁷ formează o grupă N-acetil sau N-hidroxiacetil. Derivații acidului sialic conținând o grupare R⁷ pot fi utilizați într-o sialilare enzimatică așa cum se arată în această descriere.

Compușii inhibitori preferați în mod particular cu formulele structurale I și C sunt ilustrați mai jos, împreună cu numerele lor; de exemplu, compușii 17, 30-38 și 43-51.

RO 117533 Β1

RO 117533 Β1

Un compus analog SLe^x descris anterior poate fi preparat pe numeroase căi. Poate fi utilizată sinteza enzimatică completă; sinteza ce folosește numai tehnicile chimice organice poate fi utilizată de asemenea, precum și amestecuri de sinteze organice și enzimatice, așa cum este exemplificat în această descriere.

O cale de a distinge între sintezele organice și cele enzimatice este în prezența uneia sau a mai multor enzime într-un mediu de reacție bogat pe apă (sinteză enzimatică), contra absenței oricărei enzime cuplată cu un mediu de reacție care este în mod substanțial lipsit de apă și utilizează un solvent organic cum ar fi acetonitril, metanol, etanol, dimetilformamidă (DMF), dimetilsulfoxid (DMSO), benzen, acetonă, diclormetan, tetrahidrofuran (THF) și alții asemenea (sinteză organică).

Fără a ține seamă care din aceste metode este folosită, zaharidele lactozamină, galactoză și glucozamină trebuie asociate la un anumit punct în sinteze. Oarecum surprinzător, legătura GalȘI-4GlcN a lactozaminei este de asemenea una din cele mai dificile de format legături în sinteza unui compus studiat.

RO 117533 Β1

Lactozamina este un compus indicat în literatură, dar nu este disponibil prea ușor. Cu toate acestea, lactozamina sau un derivat al lactozaminei reprezintă o bună materie primă pentru sinteza unui compus studiat.

Deși lactozamina nu este disponibilă rapid, o cetoză care nu posedă o grupă amino, dar care conține o legătură Galpl-Eru ce este apropiată de lactoză și lactozamină este disponibilă comercial. Lactuloza, cu legătura sa GalȘI-4 gata formată, reprezintă o bună materie primă pentru una din sintezele studiate ale lactozaminei. O sinteză a lactozaminei (compusul 3) sub formă de sare acidă de adiție este ilustrată în mod general și specific mai jos în schemele 1 și respectiv 1A, așa cum ar fi sintezele peracetil N-ftalimidolactozaminei, (compusul 5) și ale clorurii de paracetil N-ftalimidolactoz-aminei B (compusul 6). Compușii numerotați în ambele scheme sunt aceiași compuși.

960

965

970

Schema 1

Lactuloză

975

OH
	Ț
rT-o		HO
HO ςθΗ			*HaN OH
		3	OAc
		1)	RBORB (4).
		2)	(Ac)2O

MeOH

H₂ Pd/C

980

AlCI₃

CH₂CH₂

	OAc AcO>
AcO-7
	7O AcOA—
AcO	Sdac	NReR0
	6

985

990

995

1) PhthO (4).

2) (Ac)₂O

1000

AcO

NPhth

AICI_a

CH₂CH₂

OAc ^AcO\ _

AcO ^OAc NPhth

1005

RO 117533 Β1

Astfel, lactuloza de reacționat cu o amină primară, care este un derivat de amoniu al cărui atom de azot este legat la o grupă de blocare care se îndepărtează prin reducere (benzilamina) și care este utilizat atât ca reactant cât și ca solvent, pentru a forma Nglicozida corespunzătoare și anume N-benzil glicozida lactulozei (Bn=benzil; Compusul 1). Din reacția compusului 1 în metanol cu aproximativ o cantitate stoechiometrică dintr-un acid carboxilic organic având o valoare pKa de la aproximativ 2,5 la 6,0 (acid acetic glacial) a rezultat acetat de N-benzil lactozamoniu (compus 2) cu randament de 50-55 %. Acetatul de lactozamoniu (compus 3) a fost preparat prin hidrogenoliză soluției metanolice menționate mai sus utilizând paladiu pe cărbune (Pd/C).

Este de subliniat faptul, că în locul benzilaminei pot fi utilizate alte amine blocate care se pot îndepărta în mod reductiv. De exemplu, mono și dimetoxibenzilaminele pot fi utilizate drept derivați de amoniu blocați, care se îndepărtează prin reducere, după reacția cu zaharidă; grupele mono și dimetiloxibenzil pot fi, de asemenea, îndepărtate prin hidrogenoliză. Alilaminele pot fi utilizate în mod similar, cu grupa alil de blocare, care poate fi îndepărtată prin reacția cu polimetilhidrosiloxan (PMSH) și tetrakis-trifenilfosfină de paladiu [Pd(PPh₃)₄] în THF drept solvent.

Astfel, deși în (schema 1A) o grupă benzii este utilizată ca R^A în schema 1, se va înțelege că o grupă monometoxi, dimetoxibenzil sau alil poate fi utilizată ca R^A. Discuțiile de mai sus și reacțiile ilustrate în schemele 1 și 1 A ilustrează un procedeu pentru prepararea lactozaminei sau a sării de amoniu a lactozei de la lactuloză. în concordanță cu acest procedeu, lactuloza este amestecată cu o amină primară care este un derivat de amoniu monosubstituit al cărui atom este legat la o grupă de blocare care se îndepărtează prin reducere pentru a forma un amestec de reacție. Derivatul de amoniu blocat servește atât ca reactant cât și ca solvent în acest procedeu.

Derivatul de amoniu blocat (sau amino primară) este prezent într-un exces molar de 2 la 10 ori mai mare decât cantitatea în moli de lactuloză utilizată. Amina primară este de preferință prezentă în exces molar de la 4 la 8 ori mai mare.

Așa cum s-a menționat anterior, pot fi folosite aminele primare care conțin alte grupe de blocare care se îndepărtează prin reducere. Astfel alilamina și p-metoxibenzilamina au fost utilizate cu succes pentru a forma N-glicozide ale lactulozei și rearanjate în lactozamina N-substituită corespunzătoare.

Amestecul de reacție astfel format este menținut la o temperatură de aproximativ 10°C la 60°C pe o perioadă de timp suficientă pentru a forma N-glicozida lactulozei corespunzătoare; de exemplu, pentru amina primară pentru a substitui grupa 2-hidroxil lactuloză. Sunt preferate, de la temperatura ambiantă a camerei (20°C) la aproximativ 50°C.

Timpul de menținere este funcție de diferite variabile, astfel ca excesul molar al aminei primare, temperatura de menținere și cantitatea dorită de N-glicozidă a lactulozei și poate decurge în timp de în jur de 8 h, atunci când sunt de dorit cantități mici de produs până la mai mult de 2 săptămâni, când se utilizează temperaturi scăzute și cantități de amină primară. De exemplu, când s-a utilizat un exces molar de 4-7,5 de amină primară (aici benzilamină), reacția a fost completă după un timp de menținere de 7 zile la temperatura camerei, dar mai puțin de 50 % din reacția completă pentru aceiași perioadă de timp, când s-a utilizat un exces dublu de benzilamină în aceleași condiții. Când temperatura de reacție a crescut la 50°C, reacția, utilizând un exces de 4 ori de amină, a fost completă după două zile (48 h), în timp ce la 70°C temperatura de reacție a cauzat descompunere.

Prezența catalizatorilor de tip acid Lewis, precum clorură de zinc, trifluorometansulfonat de zinc sau trifluoro-metansulfonat de magneziu în mediu de reacție, crește viteza de reacție, astfel ca reacția care a utilizat un exces de 7,5 de benzilamină a fost completă după 7 zile la temperatura camerei, fără catalizator a fost completă în două zile (48 h ). Un rezultat similar a fost obținut utilizând acid trifluoracetic drept catalizator, care este preferat.

RO 117533 Β1

1060

Lactuloza este insolubilă în solvenți alcoolici, incluzând metanolul. Lactuloza a fost dizolvată în DMF fierbinte și rămâne în soluție după răcire. Atât metanolul cât și DMF pot fi utilizați drept cosolvenți cu amină primară când este prezent de asemenea un catalizator ca cel discutat mai sus. De exemplu, când metanolul a fost utilizat ca un cosolvent, nu a avut loc nici o reacție, fie la temperatura camerei, fie la 50°C. Totuși când un catalizator de tip clorură de zinc a fost utilizat un exces de 4 ori de benzilamină și metanolul drept cosolvent, reacția a fost completă de 48 h la temperatura camerei.

N-glicozida lactulozei preparată așa cum s-a descris mai sus, este higroscopică și de aceea este utilizată rapid după prepararea sa. Această N-glicozidă se supune reacției cu 0,1 echivalent până la 1 echivalent (pentru cel mai bun randament) dintr-un acid carboxilic care are o valoare pKa de la 2,5 la 5,0 într-un solvent de tip alcool cu la o temperatură de aproximativ 10°C la aproximativ 30°C pentru a rearanja N-glicozida lactulozei într-o sare de amoniu a lactozei a cărei grupă aminică este blocată cu o grupă de mai sus de blocare care se îndepărteză prin reducere; de exemplu, o sare amino-lactozamoniu blocat având o grupă de blocare care se îndepărtează, legată la un atom de azot aminic.

Acidul carboxilic utilizat poate fi oricare dintr-un număr de astfel de acizi bine cunoscuți în domeniu; de exemplu acidul acetic (pKa=4,76), acidul propionic (pKa=4,88), acidul butiric (pK₁=4,82), acidul cloracetic (pKa=2,80), acidul metoxiacetic (pK₁=3,52) și alții asemenea. Este preferat acidul acetic glacial. Exemple de alcooli includ metanolul, care este preferat, etanolul, propanolul și de asemenea izo-propanolul. O temperatură de reacție cum este temperatura camerei ambiante este preferată.

Concentrația N-glicozidei lactulozei poate varia în domeniul de la 0,1 M la o saturație substanțială. Concentrațiile utilizate în mod caracteristic sunt de la 0,5 la 1,5 M în solvent. Grupa de blocare care se îndepărtează prin reducere este apoi îndepărtată. Hidrogenoliza care utilizează catalizator de paladiu este un procedeu preferat pentru această îndepărtare, în special când este utilizată benzilamina sau o metoxibenzilamină. Atunci când alilamina este amina primară sunt utilizate PMHS și Pd(PPh₃).

Reducerea de mai sus poate avea loc în orice solvent adecvat pentru derivatul de amoniu al lactozei. De exemplu hidrogenoliza poate fi condusă în apa acidulată sau alcool C^Cj ca mai sus. PMHS și Pd(PPh₃)₄ sunt în mod caracteristic utilizate în THF sau un solvent similar.

O astfel de sare de amoniu a lactozei este în general recuperată după preparare, deși în funcție de solventul utilizat și de domeniul de utilizare a compusului recuperarea nu este necesară. Când este necesară îndepărtarea sării de amoniu a lactozei, al cărui anion este anionul format de acidul utilizat în reducere, acesta poate fi obținut prin metode bine cunoscute precum sunt cromatografia și precipitarea. Lactozamina liberă poate fi preparată pornind de la sare prin cromatografie de schimb ionic sau prin neutralizare, urmată de extracția bazei libere într-un solvent organic adecvat.

O soluție metanolică care conține compusul 3 rezultând din reacția de hidrogenoliză sau altă soluție adecvată, s-a supus reacției cu anhidridă italică (PhthO) în prezența unui catalizator cum este Na₂CO₃ pentru a forma N-ftalimida semiacidă, compusul 4. După ce o amină semi-acidă adevcată, de exemplu compusul 4, s-a format, a fost îndepărtat orice solvent reactiv. Grupele hidroxilice ale dizaharidelor au fost apoi peracilați și inelul ftalimidic închis pentru a obține compusul 5 ftalimido peracetilat (Ac) cu randament de peste 10 % față de materiile prime.

1065

1070

1075

1080

1085

1090

1095

1100

RO 117533 Β1 în plus, este de asemenea realizabilă sinteza unei sări de amoniu a lactozei de la lactuloză.

Lactuloza se supune reacției într-o autoclavă de oțel inox cu o cantitate echimolară de acetat de amoniu și amoniac lichid drept solvent, amoniacul lichid fiind adăugat în autoclavă răcită la -78°C.

Amestecul de reacție care rezultă este încălzit la o temperatură de la 0°C la aproximativ 80°C și menținută o perioadă de timp de la 5 h la 5 zile, în funcție de temperatura utilizată și conversia dorită. După îndepărtarea amoniacului și a acetatului de amoniu, ultimul fiind în mod catracteristic îndepărtat sub vid, materialul care rezultă, liber de amoniac este tratat cu un acid carboxilic, ca mai sus, pentru a forma sarea de amoniu a lactozei, de exemplu, compusul 3. Sarea de amoniu a lactozei este de asemenea tratată, așa cum s-a descris mai sus, perntru a forma compusul 5. Anomerul β al compusului 5 a fost îndepărtat în general după prima recristalizare, cu o temperatură de reacție de 35°C, iar pentru prima etapă a reacției a fost necesar un timp de reacție de 24 h.

Deși randamentul compusului 5 a fost mai mic utilizând această procedură decât în procedeul discutat anterior, acest procedeu înlătură necesitatea de îndepărtare prin reducere a grupei de blocare a aminei utilizate în acest procedeu. Catalizatorul care conține paladiu pentru această reacție de reducere este cel mai scump reactiv utilizat în aceste sinteze.

Este de asemenea de menționat că amoniacul metanolic poate fi utilizat ca solvent mai degrabă decât amoniacul lichid, acesta eliminând necesitatea de a utiliza o autoclavă.

Amina compusului 5 în schema 1 este prezentată legată la R^B și grupele R^B care împreună cu atomul de azot descris formează o imidă ciclică C4-C8 cum este un model ftalimidic în compusul 5. Este de notat că anhidrida succinică, anhidrida maleică, anhidridele mono și dimetilsuccinică și anhidrida citraconică pot fi utilizate, de asemenea, pentru a forma imide similare, astfel ca R^B și R^B împreună cu atomul de azot să formeze o imidă corespunzătoare. O imidă ciclică formată de grupa -NR^BR^B conduce la o grupă protectoare aminică, care este stabilă în condiții în care grupele O-acil cum este acetatul, sunt îndepărtate, dar pot fi îndepărtate rapid cu hidrazină. Este de asemenea de notat că o anhidridă nu este necesar să fie utilizată, ci poate fi înlocuită cu o halogenură a unui semiester alchil Ο,-Ο6, cum este clorură de metil ftaloil.

Compusul 5 este prezentat ca un β-anomer; α-acetatul se formează de asemenea și randamentul β-acetatului dorit poate fi adesea dublat prin concentrarea apei mume din care s-a obținut compusul 5 ca o spumă urmată de redizolvarea în DMF și apoi reacția cu acetat de hidrazină, care desprinde grupa acetat și conduce la formarea β-ΟΗ anomerului. După izolarea produsului de reacție prin tehnici extractive uzuale și uscare, dizolvarea materialului uscat în piridină, tratamentul soluției piridinice cu un exces de anhidridă acetică, reacție și o extracție suplimentară, s-a obținut un procent de 8,3 peste randamentul total al compusului 5.

Reacția compusului 5 cu AICI₃ în diclormetan la temperatura camerei conduce la un randament substanțial cantitativ de compus 6. Schema 2, în cele ce urmează, ilustrează transformarea compusului 6 peracetil N-ftalimidolactozamină β-clorură, într-o tetrazaharidă sialilată protejată integral, compus 13. Astfel, compusul 6 s-a supus reacției la temperatura ambiantă timp de 2 h în etapa a cu compusul 9, a cărui sinteză este descrisă în exemple, în prezența sitelor moleculare, colidinei și trifluormetan-sulfonatului de argint (triflat) utilizând diclormetan ca solvent pentru a prepara trizaharida corespunzătoare. Această trizaharidă protejată integral a fost în primul rând tratată în etapa b cu acid acetic apos de concentrație

RO 117533 Β1

1150 % timp de 2 h la 80°C pentru a îndepărta grupa care protejează benzilidenul în pozițiile 4 și 6 ale unității Gal terminale. Hidratul de hidrazină a fost apoi supus reacției la reflux timp de 17 h cu trizaharida recuperată, parțial deprotejată în etapa c pentru a îndepărta grupele ftalimido și acetil și a forma trizaharida complet deprotejată. Reacția trizaharidei deprotejate în metanol: apă (5:1) cu dialilpirocarbonat în etapa d conduce la compusul 10, unde AL este alilcarbamoil.

Acolo unde R^z nu este o glicozidă așa cum s-a descris în sintezele schemei 2 și este o grupă hidrocarbil preferată este benzii, etapele de glicolizare a și b sunt omise, rezultând o tetrazaharidă cu formula A, I sau II unde R² este altul decât mono sau dizaharidă.

Compusul 10 a fost apoi sialilat enzimatic în etapa a utilizând o soluție tampon apoasă a-(2,3)-sialiltransferază (EC 2.4.99.6) și un număr de alte enzime. Reacția a fost controlată prin TLC timp de 10-12 zile la temperatura ambiantă, timp în care mai mult de 95 % din compusul 10 a fost consumat și a fost preparat compusul 11.

Compusul 11 a fost recuperat sub forma unui sirop gros care a fost evaporat de două ori cu piridină și apoi păstrat sub vacuum timp de 20 h. Astfel, materialul din care s-a îndepărtat apa, a fost redizolvat în piridină la care s-a adăugat o cantitate catalitică de 4dimetilaminopiridină (DMAP) așa cum a fost adăugată anhidrida acetică. Mai mult de două porții suplimentare de anhidridă acetică după următoarele 44 h completează reacția de acilare cu formarea unei lactone cu sialilcarboxil și cu o hidroxilzaharidă în etapa f. A fost adăugat apoi metanol la materialul recuperat pentru a forma esterul metil, sialil și după aceea s-a realizat o altă adiție de anhidridă acetică la hidroxidul liber acetilat pentru a forma compusul 12 protejat complet în etapa g.

Este evident faptul că, compușii 11 și 12 sunt compuși cu formulele structurale A și III. Utilizâd compusul 12 ca model, Z este C_rC₆ acil (acetil), X este C^Cg aciloxi (acetoxi), R² este 3 GaipO-etil, R³ este acetil, R⁴ este metil și R¹ este aliloxi. De asemenea este evident că alte grupe X menționate mai sus pentru un compus cu orice formulă structurală sunt convenabil introduse în etapa de sialilare. Dacă se dorește ca substituenții X ai grupei sialil care sunt Ο,-Cg aciloxi sau C^Cg hidroxiaciloxi să fie prezente într-un inhibitor cu formulele structurale I sau C, este de preferat ca, compusul 10 (sau o dizaharidă fără grupa 3GalȘOR²) să fie peracetilat, grupa carbamoil aliloxi (AL) a compusului 10 să fie îndepărtată ca în etapa h și înlocuită cu una din grupele R¹ acil care conține un ciclu fenilic ca în etapa c a schemei 3. Molecula este apoi deprotejată și sialilată enzimatic și fucozilată așa cum se descrie în continuare. Pentru alte grupe R^1-4 sau un compus similar de formula structurală A, B sau III, una poate substitui grupa 3Gaip glicozidă R² a compusului 9, agentul de acilare a etapelor f și g alcoolul de esterificare din etapei f.

Tratarea compusului 12 recuperat și uscat, cu polimetilhidrosiloxan (PMHS) în THF anhidru la temperatura camerei urmată de tratarea cu tetrakistrifenilfosfină de paladiu [Pd(PPh₃)₄] timp de 18 h conduce la obținerea compusului 13 cu randament de 87 % în etapa h.

1155

1160

1165

1170

1175

1180

1185

RO 117533 Β1

Schema 2

OEt

Schema 3 redată în continuare schițează o sinteză care rămâne neschimbată pentru ilustrativul compus 17 inhibitor, cu formulele I și C. Astfel, reacția compusului 13 cu un echivalent de acid acetic glacial în metanol apos, timp de 48 h la 50°C a condus la o deacilare selectivă a Glc 3-hidroxil și a dat compusul 14 cu randament 65 % în etapa a.

Compusul 14 a fost apoi benzoilat selectiv în etapa b cu randament 83 % prin reacția cu clorură de benzoil în diclormetan cu bicarbonat de sodiu solid la temperatura camerei timp de 24 h pentru a forma compusul 15. Grupe alternative R¹ ale unui compus cu formulele structurale A, I, II și III sunt adăugate la această etapă sau la o etapă analogă unde R² nu este o unitate de zaharidă.

O fucosilare chimică organică a fost condusă în etapa C a schemei 3 prin amestecarea compusului 15 cu fluorura de tri-O-benzil fucozil, site moleculare și tetrametil-uree în diclormetan, urmată de o răcire la -20°C și apoi de adăugarea clorurii stanoase și percloratului de argint. După o încălzire ușoară la temperatura camerei și agitare timp de 24 h, compusul 16 a fost preparat cu randament de 77 %.

RO 117533 Β1

Compusul 16 este astfel un compus cu formulele structurale A și B, unde Z este o grupă fucozil blocată și tot așa de bine un compus cu formula II. Utilizarea de grupe alternative R⁵ conduce la compuși care se mențin neschimbați cu acele formule structurale când s-au combinat cu grupele -X și R^1-4 discutate mai sus.

Grupele R⁵, care blochează O-benzil, ale unității fucozil zaharide au fost îndepărtate în etapa d prin hidrogenare utilizând hidroxid de paladiu pe cărbune [Pd(OH)₂/C] la temperatura camerei prevede îndepărtarea completă a grupării O-benzil. Filtrarea și concentrarea compusului debenzilat a condus la un ulei care a fost redizolvat în metanokapă (4:1) la care a fost adăugat pulbere de metoxid de sodiu în etapa e. După 16 h la temperatura camerei, a fost obținut cu un randament de 72 % compusul 17 inhibitor.

Unde R⁵ este o grupă acil CȚ-Cg, etapa de hidrogenare nu este utilizată și grupa R⁵, Ο,-Οθ acil este îndepărtată de grupele R³ și R⁴. Utilizarea unei grupe R⁵ C, -Q acil și evitarea unei etape de hidrogenare, este de asemenea o cale pentru sinteza grupelor R¹ care conțin grupa nitro.

Schema 3

1240

1245

1250

1255

1260

1265

1270

1275

1280

1285

RO 117533 Β1

Acolo unde grupa R² este o mono- sau dizaharidă, se utilizează o mono- sau dizaharidă adecvată blocată, cum este compusul 9 din schema 2. De exemplu, lactoza, o glicozidă a lactozei sau melibioza pot fi transformate în derivați benziliden protejați similar cu acel al compusului 9 și apoi utilizate în etapa de cuplare a din schema 2 și produsul rezultat poate fi utilizat în etapele consecutive din schemele 2 și 3.

Este de înțeles că lactozamina și derivații săi pot fi preferați prin alte metode bine cunoscute specialiștilor în domeniu.

Este de asemenea de înțeles că trizaharida compusului 10 poate fi preparată în mod enzimatic prin reacția compusului etil-3-0-(2-N-aliloxicarbonil-2-amino-2-deoxy-p-D-glucopiranozil)-P-D-galactozidă utilizând uridin-5'-difosfat-galactozil transferază cu UPD-Gal și alte enzime adecvate care urmează procedurile cunoscute. în mod similar compusul 11 poate fi fucozilat enzimatic utilizând o fucoziltransferază (FT) astfel ca fucoziltransferază V, tot așa ca și nucleotidă donoare de zahăr GDP-fucoză și alte enzime folositoare în regenerarea GDP-fucozei, utilizând procedee cunoscute. Desigur, schimbări nesemnificative în schemele de reacție arătate sunt cerute de acele schimbări sintetice, dar acele schimbări sunt bine cunoscute specialiștilor în domeniu.

O altă procedură sintetică folositoare este prezentată în schema 4 de mai jos. Aici, materiile prime sunt baze libere, compusul 14a, compusul 14 din schema 3.

c

d

RO 117533 Β1

1340

1345

1350

1355

Astfel compusul 14a s-a supus reacției în etapa a cu un exces mic de clorură carbobenzoxi (CBZ-CI) în diclormetan, în prezență de bicarbonat de sodiu urmând apoi o altă cantitate echivalentă de CbZ-CI aproximativ 8 h mai târziu pentru a forma compusul 39 amino protejat cu randament 65 %. Etapa b a schemei 4 este în mod substanțial aceeași etapă de glicozilare indicată în etapa c a schemei 3, cu compusul 40 care este obținut cu randament de 73 %, plus recuperarea cu randament de 17 % a materiei prime compusul 39.

Amina liberă fucozilată, compus 41, a fost după aceea obținută cu randament de 96 % în etapa c prin reacția cu 10 % Pd-C în formiat de amoniu, în etanol la reflux. Amina liberă a compusului 41a fost apoi supusă reacției în etapa d cu o clorură de acil (YR¹) în diclormetan în prezență de bicarbonat de sodiu pentru a da compusul N-acilat hidroxi-blocat corespunzător, derivatul 3,5-diclorbenzamidă, compusul 42, cu randament superior. Grupa hidroxil a fost deblocată prin reacția cu metoxid de sodiu 28 % în metanol cu randament cantitativ.

Structurile anumitor inhibitori preferați în mod special, compușii 17, 30-38 și 43-51 au fost deja arătate. Compușii 30-33 au fost preparați din precursorii lor respectiv compușii 26-29, așa cum s-a descris la conversia compusului 16 în compusul 17 în schema 3.

Compușii 34-38 și 51 au fost preparați în maniere analoage celor din schema 3. Compușii 43-49 au fost preparați în mod similar, utilizând calea generală indicată în schema 4. Compusul 50 a fost preparat urmărind schema 3, utilizând reducerea din schema 4, etapa c. Aceștia sunt compuși cu formula structurală I, ca și cei cu formula A.

C. METODE DE TESTARE A INHIBĂRII ADEZIUNII CELULARE

Numeroase metode directe și indirecte pentru alegerea “in vitro a inhibitorilor interacțiilor ligand-receptor sunt disponibile, și cunoscute celor care lucrează în domeniu. De exemplu, abilitatea de a inhiba adeziunea celulelor purtătoare de SLe^x la celulele ce exprimă o selectină particulară poate fi determinată.

Așa cum s-a discutat mai sus, câteva gene selectin receptoare au fost donate și, astfel genele pot fi inserate și exprimate într-o mare varietate de celule cum ar fi celule COS, celule CHO, celule din rinichiul uman transformate în adenoviruși așa cum se folosește aici

1360

1365

1370

1375

1380

RO 117533 Β1 și alții asemenea, astfel încât un receptor selectin rebombinat cum ar fi rELAM (ELAM-1 recombinat) poate fi folosit în teste, așa cum se descrie în cele ce urmează. în plus, celulele care nu exprimă în mod normal SLe* sunt capabile să fie transformate cu una sau mai multe gene de glicoziltransferază care conferă celulelor transformate abilitatea de a sintetiza ligandul. [Vezi: Lowe și colaboratorii, Cell, 63: 475-484 (1990)]. în anumite încercări compusul inhibitor sau agentul este incubat cu celule purtătoare SLe^x marcate și cu celule activate care exprimă selectine de suprafață a celulei sau selectin recombinat imobilizate pe suprafața solidă. Inhibarea adeziunii celulare poate fi determinată prin detectarea legăturii marcate la suprafață după spălări corespunzătoare.

în mod caracteristic in vitro a compusului analog SLe^x studiat sunt teste competitive care detectează capacitatea unui compus studiat de a inhiba legarea selectinei la celulele care conțin SLe^x. Celulele care conțin selectin sunt, în mod caracteristic, trombocite activate sau celule endoteliale activate cu un selectin recombinat, fiind astfel folositoare, în timp ce celulele purtoare de SLe^x sunt în mod uzual neutrofile sau celule HL-60. Alt test implică detectarea prezenței sau absenței diferitelor schimbări fiziologice fie în celulele purtătoare de ligand SLe^x, fie în celulele purtătoare de selectin care rezultă din interacțiune. Exemple ale testelor adecvate includ măsurători ale schimbărilor în activitatea de transcripție indusă prin legare (vezi: de exemplu, Publicația PCT nr.3712820), detectarea efectelor extracelulare mediate de diferite celule (vezi: de exemplu, Publicația PCT nr.90/00503) și detectarea schimburilor în potențialul membranei celulelor individuale (brevet US 4343782), toate fiind incluse în descriere printre referințe. în mod alternativ, pot fi detectate schimbările conformaționale în receptorii izolați sau liganzi; (brevet US 4859609), care este inclus în referințe. în continuare, se pot lega celule care exprimă SLe^x, la selectin legat de suportul solid, se pot distruge celulele de legare și testul pentru o proteină care poate numai să fie prezentă în celulele de legătură.

Orice component al probei care include ligand, receptor selectin sau compus SLe^x, poate fi legat la o suprafață solidă. Sunt cunoscute multe metode de imobilizare a biomoleculelor pe suprafețelor solide. De exemplu, suprafața solidă poate fi o membrană (de exemplu nitroceluloză), un disc de microtitrare (de exemplu din PVC sau polistiren) sau o bilă mică. Componentul dorit poate fi legat covalent sau atașat necovalent prin legare nespecifică.

O mare varietate de polimeri organici sau anorganici, atât naturali cât și sintetici pot fi utilizați ca materiale pentru suportul solid. Polimeri pentru ilustrare includ polietilenă, polipropilenă, (4-metilbuntenă), polistiren, polimetacrilat, poli(etilentereftalat), rayon, nylon, poli(vinil)butirat, siliconi, poliformaldehide, celuloză, acetat de celuloză, nitroceluloză, etc. Alte materiale care se pot utiliza includ hârtie, sticlă, ceramică, metale, metaloide, materiale semiconductoare, cermet sau altele asemenea. în plus sunt incluse substanțe care formează geluri precum proteinele, de exemplu gelatine, lipopolizaharide, silicați, agaroză și poliacrilamidă sau polimeri care formează anumite faze apoase, astfel ca dextranii, polialchilen glicolii (alchilen cu 2 la 3 atomi de carbon) sau agenți tensioactivi de exemplu compuși amfifilici cum sunt fosfolipidele, săruri de alchilamoniu cu lanț lung (2-24 atomi de carbon) și altele asemenea. Atunci când suprafața solidă este poroasă, pot fi utilizate diferite dimensiuni de particule în funcție de natura sistemului.

La prepararea suprafeței, pot fi utilizate o pluraritate de diferite materiale, în special ca laminate pentru a obține diferite proprietăți. De exemplu acoperiri de proteină, cum este gelatina pot fi utilizate pentru a evita legarea nespecifică, conjugarea covalentă simplificată, îmbunătățirea semnalului de detecție și altele asemenea.

Dacă se dorește legarea covalentă a unui compus și suprafață, suprafața este în mod polifuncțională sau capabilă a fi polifuncționalizată. Grupele polifuncționale care pot fi

RO 117533 Β1 prezente pe suprafață și utilizare pentru legare pot include acizi carboxilici, aldehide, grupări amino, grupe cian, grupări etilenice, grupări hidroxilice, grupe mercapto, și altele asemenea. Maniera de legare a diferitelor suprafețe este bine cunoscută și este amplu ilustrată în literatură. Vezi de exemplu: Enzime Imobilizate, Inchiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) și Caatrecasas, J.Biol.Chem., 245: 3059 (1970), care este incorpotară în referințe.

în plus față de legarea covalentă, diferite metode pentru legarea necovalentă a componenței probei, pot fi folosite. Legarea necovalentă este în mod caracteristic o absorbție nespecifică a unui compus la suprafață. în mod caracteristic, suprafața este blocată cu un al doilea compus pentru a preveni legarea nespecifică a componentelor probei marcate. în mod alternativ, suprafața este desemnată astfel că se leagă nespecific un component, dar nu se leagă în mod semnificativ, alt component. De exemplu, o suprafață purtătoare de lecitină cum este concanavalin A leagă un compus care conține hidrat de carbon dar nu o proteină marcată ce este lipsită de glicolzilare. Diferite suprafețe solide pentru utilizare în atașarea necovalentă a componentelor probei așa cum se descrie în brevet US 4447576 și US 4254082 care sunt incluse în referințe.

Marcarea menționată înainte poate fi cuplată direct și indirect la un component dorit al probei conform cu metode bine cunoscute în domeniu sau poate fi o proteină endogenă la celulele legate. Poate fi utilizată o mare varietate a markerilor. Componenta poate fi marcată prin oricare din metode multiple. Metoda cea mai obișnuită de detecție este utilizarea autoradiografiei cu compușii marcați ³H, ¹²⁵l, ³⁵S, ¹⁴C sau ³²P sau alții asemenea. Alegerea izotopului reactiv depinde de preferințele cercetării datorită ușurinței sintezei, stabilitatea care variază și de perioada de înjumătățire a izotopilor selectați. Alți markeri neradioactivi includ liganzi care leagă anticorpi marcați, fluorofori, agenți chemiluminescenți, enzime și anticorpi care pot servi ca membri perechii de legare specifică pentru un ligand marcat. Alegerea markerului depinde de sensibilitatea cerută, ușoară conjugare cu compusul cerințele de stabilitate și instrumentația adecvată.

Markerii nereactivi sunt adesea atașați prin semnificații indirecte. în mod general, o moleculă de ligand (de exemplu biotin) este legat covalent la moleculă. Ligandul este legat apoi la o moleculă de antiligand (de exemplu streptavidin) care este, fie detectat în mod esențial, fie legate covalent la un sistem de semnalizare, precum o enzimă detectabilă, un compus fluorescent sau un compus chemiluminescent. Liganzii și antiliganzii pot fi variați în limite largi. Acolo unde un ligand are un antiligand natural, de exemplu, biotin, tiroxină și cortizol pot fi utilizați în legătură cu antiliganzi marcați care se produc în mod natural. în mod alternativ, orice compus haptenic sau antigenic pot fi utilizați în combinație cu un anticorp.

Markerul menționat anterior poate fi de asemenea o enzimă sau o altă proteină prezentă într-o celulă a cărei adeziune poate fi inhibată. Cantitatea de enzimă poate fi utilizată astfel ca un marker pentru a determina cantitatea de legare. Mieloperoxidaza este una din astfel de proteine prezente în celulele HL-60 care este utilizat ca un marker în studiile de inhibare a legării discutate în continuare.

Moleculele SLe^x pot de asemenea să fie conjugate în mod direct la compuși care generează semnal, de exemplu, prin conjugare, cu o enzimă sau fluorofor. Enzime de interes ca markeri sunt hidrolaze primare în mod special fosfataze, asteraze și glicozidaze sau oxidoreductaze, peroxidaze speciale.

Compuși fluorescenți includ fluoresceina și derivații săi, rodamina și derivații săi, dansil, umbeliferonă, etc. Compușii chemiluminiscenți includ luciferin și 2,3-dihidroftalazinadione, de exemplu luminol. Pentru o trecere în revistă a diferitelor sisteme de producere a diferitelor semnale care pot fi utilizate, vezi brevet US 4391904, care este încorporat în referințe.

1435

1440

1445

1450

1455

1460

1465

1470

1475

1480

RO 117533 Β1

D. COMPOZIȚII FARMACEUTICE t

Invenția de față are ca obiect și o compoziție farmaceutică care conține un compus analog SLe^x studiat, dizolvat sau dispersat într-un purtător acceptabil farmaceutic sau diluent acceptabil farmaceutic. Astfel, o compoziție conține o cantitate de compus analog SLe^x studiat, discutat mai sus care inhibă adeziunea celulei.

Compoziția farmaceutică poate fi utilizată pentru a bloca sau pentru a inhiba adeziunea celulară asociată cu un număr de tulburări. De exemplu, un număr de tulburări inflamatorii sunt asociate cu selectine exprimate pe celulele endoteliale vasculare și pe trombocite. Termenul “inflamator” este utilizat cu referire la reacții ale sistemelor de apărare specifice și nespecifice. O reacție specifică a sistemului de apărare este o reacție a sistemului imun specific la un antigen. Modelul reacțiilor specifice sistemului de apărare includ răspunsul anticorpului la antigeni, cum sunt virusuri și hipersensibilitatea de tip întârziat.

O reacție nespecifică a sistemului de apărare este un răspuns inflamator mediat prin leucocite în general incapabile ale memoriei imunologice. Astfel de celule includ macrofagii, eozinofile și neutrofile. Exemple de reacții nespecifice includ umflarea imediată după o înțepătură de albină și colectarea de leucocite PMN pe locurile cu infecție bacteriană (de exemplu infiltrate pulmonare în pneumonii bacteriene și formarea puroiului în abcese).

Alte tulburări tratabile includ, de exemplu artrita reumatoidă, distrugerea țesutului mediată de leucocite post-ischemice (rană de la reperfuzie), rană provocată de degerătură sau șoc, rană acută la plămân mediată de leucocite (de exemplu, sindromul de pericol respirator la adult), astm, șoc traumatic, șoc septic, nefrite, inflamații acute și cronice, care includ dermatice atopice, psoriazis și afecțiuni inflamatorii ale intestinului. Diferite patologii mediate de trombocite sunt ateroscleroze și tromboze pot fi de asemenea tratate. în plus, metastaze tumorale pot fi inhibate sau prevenite prin inhibarea adeziunii celulelor canceroase. Exemple de asemenea boli includ carcinomul de colon și melanomul.

Printre alte exemple, rănile provocate de reperfuzie sunt în special potrivite pentru tratamentul cu o compoziție farmaceutică studiată. O compoziție care inhibă o interacție ligand-P-selectin, poate fi în mod particular, utilizată pentru tratarea și prevenirea rănilor de reperfuzie. O compoziție farmaceutică studiată poate fi utilizată în scopuri profilactice înainte de intervenții chirurgicale în scopul ameliorării recuperării postchirurgicale.

Deoarece P-selectin este depozitat în corpii Weibwl-Palade ai trombocitelor și a celulelor endoteliale și este eliberat prin activarea de către trombină, pentru a media adeziunea neutrofilelor și monocitelor, inhibitori ai interacțiunii ligandului P-selectin, pot fi utilizați în micșorarea distrugerii țesutului care adesea este însoțită de tulburări trombotice. De exemplu astfel de inhibitori pot avea o valoare terapeutică la pacienți care au avut congestie cerebrală, infarcturi miocardice, tromboze profunde ale venelor, embolii pulmonare, etc. Compușii sunt în special folosiți în terapii pre-trobotice.

Compoziția farmaceutică, conform invenției, și-a găsit o utilizarea în tratarea efectelor secundare ale șocului septic sau a coagulării intravasculare diseminate (DIC). Emigrarea leucocitelor în țesuturi în timpul șocului sau a DIC adesea conduce la distrugerea țesutului patologic.

în plus, acești pacienți pot avea trombi microcirculatori larg răspândiți și inflamații difuze. O compoziție terapeutică rezultată inhibă emigrarea leucocitelor în aceste locuri și pericolul înmuierii țesutului.

Un inhibitor al interacțiunii ligand SLe^x celular - selectin este de asemenea utilizat în tratamentul șocului traumatic și a rănirii acute a țesutului, asociat cu acesta. Deoarece selectinele joacă un rol în refacerea leucocitelor pe locurile rănite, în special în cazurile Eselectin ale rănii acute și inflamației, inhibitori care pot fi administrați local sau sistematic pentru a controla distrugerea țesutului asociat cu astfel de răniri. Mai mult, datorită

RO 117533 Β1 specificațiilor unor astfel de inhibitori pentru locurile inflamației, de exemplu, unde sunt exprimați receptorii ELAM-1, aceste compoziții pot fi mai eficiente și mai puțin posibile să cauzeze complicații când sunt comparate cu agenții anti-inflamatori tradiționali.

Astfel, prezenta invenție se referă la compoziții farmaceutice care pot fi utilizate în tratarea situațiilor mai sus menționate.

» I

O compoziție farmaceutică este constiutită dintr-un compus analog SLe^x descris mai sus care inhibă interacțiunea dintre un ligand SLe^x descris mai sus care inhibă interacțiunea dintre un ligand SLe^x celular și un receptor selctin, compus care este dizolavt sau dispersat într-un diluant acceptabil farmaceutic. O compoziție farmaceutică studiată este adecvată pentru utilizare într-o mare varietate de sisteme de eliberare a medicamentelor. Pentru o scurtă trecere în revistă a metodelor de eliberare a medicamentelor, vezi Langer, Science, 249: 1527-1533 (1990).

în lumina complexității răspunsului inflamator la mamifere, un specialist în domeniu va recunoaște ușor că o compoziție farmaceutică poate include în plus alți compuși cunoscuți pentru a interfera cu funcțiunea altor molecule de adeziune celulară. De exemplu, membri ai familiei integrin, de adeziune moleculară se crede că joacă un rol în extravazia leucocitelor a punctelor de infecție. Pentru o trecere în revistă a receptorilor de adeziune intracelulară, care includ receptorii selectin și rolul funcției lor imune, vezi Springer, Nature, 346: 425-434 (1990). în plus, tratamentul cu succes, utilizând o compoziție farmaceutică, poate fi de asemenea determinată prin starea de evoluție a bolilor ce trebuie tratate. Deoarece moleculele de adeziune diferită pot fi reglate mai sus sau mai jos în funcție de variația factorilor în timpul suferinței sau a bolilor, specialistul în domeniu va recunoaște că diferite compoziții farmaceutice pot fi necesare în tratamentul diferitelor etape inflamatorii.

Pentru o compoziție farmaceutică ce cuprinde un compus analog SLe^x care se leagă la receptorii selectin și inhibă legarea prin celulele care conțin ligand SLe^x, doza compușilor variază în funcție de compusul folosit, de modul de administrare, de afecțiunea specială care trebuie să fie tratată, de gravitatea sa, de întreaga stare de sănăatte a pacientului și de decizia medicului curant. De exemplu, pentru tratamentul rănirii la reperfuzare doza unui compus analog SLe^x, studiat este în domeniul 50 pg la 10000 mg/zi pentru un pacient de 70 kg. Ideal, administrarea terapeutică ar trebui să înceapă pe cât de repede posibil după infarctul miocardic sau altă afecțiune. O compoziție farmaceutică adecvată pentru adminsitrare parenterală, topică, orală sau locală, cum sunt aerosolii sau transdermal pentru tratament profilactic și/sau terapeutic. O compoziție farmaceutică poate fi adminsitrată într-o varietate de forme de unități de dozare depinzând de metoda de administrare. De exemplu, forme de unități de dozare adecvate pentru administrare orală include pulbere, tablete, pilule, capsule și drajeuri.

De preferință, o compoziție farmaceutică este administrată intravenos. Astfel acestă invenție se referă la o compoziție farmaceutică pentru administrare intravenoasă care cuprinde o soluție dintr-un compus analog SLe^x studiat, dizolvat sau dispersat într-un purtător acceptabil farmaceutic, de preferință un purtător apos. Pot fi utilizați, o varietate de purtători apoși, de exemplu apă, apă tamponată, 0,4 % saramură și altele. Aceste compoziții pot fi sterilizate prin metode convenționale, tehnici de sterilizare bine cunoscute sau pot fi filtrate steril. Soluțiile apoase care rezultă pot fi ambalate pentru utilizare așa cum sunt liofilizate, prepararea liofilizată putând fi combinată cu o soluție apoasă sterilă înainte de administrare. O compoziție poate conține substanțe auxiliare acceptabile farmaceutic așa cum sunt cele necesare pentru aproximarea condițiilor fiziologice, ca agenți de reglare a pH-ului și agenți tampon, agenți de reglare a tonicității, agenți de umectare și alții asemenea, ca de exemplu, acetat de sodiu, lactat de sodiu, clorură de potasiu, clorură de calciu, monolaurat sorbitan, oleat de trietinolamină, etc.

1530

1535

1540

1545

1550

1555

1560

1565

1570

1575

RO 117533 Β1

Concentrația de compus analog SLe^x utilizat este în mod uzual, de sau cel puțin de la 1 % la cel mult 10 % la 30 % în greutate și este selectat în primul rând prin volumele fluidului, viscozității, etc, în concordanță cu modul special de administrare selectat. Așa cum s-a descris mai sus, componentele compoziției pot fi eliberate pe calea preparatelor lipozomice.

Astfel o compoziție farmaceutică tipică pentru infuzii intravenoase poată să conțină până la 250 ml de soluție sterilă Ringer și 25 mg de compus analog SLe^x. Metode actuale pentru prepararea compușilor adminsitrați în mod parenteral sunt cunoscute specialiștilor în domeniu și sunt descrise mai detaliat de exemplu în Remington’s Pharmaceutical Sciences, Ed.17, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985) care este inclusă în referințe.

Pentru compoziții solide, diluenții purtători solizi convenționali netoxici pot fi utilizați, care includ, de exemplu, produsele de calitate farmaceutică ca manitol, lactoză, amidon, stearat de magneziu, zaharină de sodiu, talc, celuloză, glucoza, sucroză, carbonat de magneziu și alții asemenea. Pentru administrare orală, o compoziție farmaceutică acceptabilă netoxică este constituită prin încorporarea oricăror excipienți utilizați în mod normal, cum sunt cei purtători listați anterior și în general 10-95 % ingredient activ, care este, un compus analog SLe^x descris mai sus, de preferință în jur de 20 % (vezi indocația Remington’s de mai sus).

Pentru administrare sub formă de aerosol, un compus analog SLe^x studiat este de preferință furnizat sub formă fin divizat, cu un agent tensioactiv și de pulverizare. Procentele caracteristice ale compusului analog SLe^x sunt de la 0,5 la 30 % în greutate și de preferință de la 1 la 10 %. Agenții de suprafață trebuie desiogur să fie netoxici și de preferință solubili în purtătorul pulverizat. Reprezentativi pentru astfel de agenți sunt esterii sau esterii parțiali ai acizilor grași care conțin de la 6 la 22 atomi de carbon cum sunt acidul caproic, octanoic, lauric, palmitic, stearic, linoleic, linolenic, olesteric și oleic, acizi cu un alcool polihidric alifatic sau anhidridele lor ciclice cum sunt etilen glicol, glicerol, eritritol, arabinol, manitol, sorbitol, hexitol, anhidride derivate de la sorbitol și derivați de polioxi-etilenă și polioxopropilenă ai acestor esteri. Pot fi utilizate, amestecuri de esteri, cum sunt amestecuri de gliceride sau gliceride naturale. Agenții activi de suprafață pot constitui de la 0,25 la 5 %. Echilibrul compoziției este de obicei agentul de pulverizare. Agenții de pulverizare lichefiați sunt în mod caracteristic gaze în condiții ambiante și sunt condensate sub presiune. Printre agenții de pulverizare lichefiați sunt alcani inferiori care conțin până la 5 atomi de carbon, cum sunt butanul și propanul și de preferință alcani fluorurați și fluoroclorurați. Pot fi folosite și amestecuri ale acestora. în producerea de aerosoli un recipient echipat cu un ventil adecvat este umplut cu un agent de pulverizare potrivit, care conține compuși fin divizați și agenți tensioactivi. Ingredientele sunt menținute astfel la o presiune ridicată până sunt eliberate sub acțiunea ventilului.

O compoziție farmaceutică care conține un compus analog SLe^x care poate fi administrat pentru tratamente profilactice și/sau terapeutice.

în aplicațiile terapeutice, o compoziție este administrată la un pacient care suferă deja de o boală, ca cele descrise mai sus, în cantitate suficientă pentru a inhiba legarea între celulele care exprimă un selectin și neurofile; de exemplu, cură sau cel puțin reținerea parțială a simptomelor bolii și a complicațiilor sale. O cantitate adecvată pentru a realiza acest lucru este definită ca “doză eficientă terapeutic” sau “o cantitate care inhibă adeziunea celulei”. Cantitățile eficiente pentru acestă utilizare depinde de gravitatea bolii și de greutatea și de starea generală a pacientului, dar în general sunt cuprinse în limitele de la 0,5 mg la aproximativ 10000 mg de compus analog SLe^x pe zi pentru un pacient de 70 kg, un dozaj de la 5 mg la 2000 mg de compus pe zi fiind utilizat în mod obișnuit.

RO 117533 Β1

1630 în aplicații profilactice, o compoziție care conține un compus studiat este administrat la un pacient susceptibil sau aflat în condiții de risc ale unei boli speciale. Astfel o cantitate este definită ca fiind o “doză eficientă profilactic” și este de asemenea o cantitate suficientă pentru a inhiba adeziunea (legarea) la selectin, a celulelor care conțin SLe^x. în această utilizare, cantitățile precise depind de asemenea de starea sănătății pacientului și de greutatea sa, dar în general, este în limitele 0,5 mg la 5000 mg/70 kg, mai obișnuit de la 5 mg la 2000 mg pe 70 kg greutate corp.

O altă cale de a aprecia cantitatea, care inhibă adeziunea, dintr-un compus analog SLe^x studiat este aceea de a compara inhibarea legării prezentate de către compusul analog SLe^x la cel prevăzut de către SLe^x însuși. O cale convenabilă de a face această comparare este utilizarea IC50 (concentrația necesară pentru a inhiba legarea pe jumătate), a două materiale comparate și scăderea cantității utilizate dintr-o cantitate de SLe^x și o cantitate de compus analog SLe^x care este un multiplu al valorii IC50 pentru acest compus.

în mod caracteristic, un compus a cărui valoare este aproximativ 1/10 din valoarea lui SLe^x însuși, când este utilizat într-o cantitate molară de 10 ori față de SLe^x este o cantitate folositoare, care inhibă adeziunea. Mai preferabil, cantitatea este de 4 ori din cantitatea de SLe^x. Mai preferabil, cantitatea este egală cu cea a SLe^x. Cel mai preferabil, este cazul cu cei mai mulți compuși analogi descriși aici, cantitatea utilizată este mai mică decât cantitatea de SLe^x utilizată astfel ca 1/2 la 1/10, din cantitatea SLe^x însuși.

Administrări simple sau multiple ale compoziției pot fi conduse cu niveluri ale dozei și modelului care sunt selectate de medicul curant. în orice caz, formulările farmaceutice vor conține cantități din compusul analog SLe^x suficiente pentru tratarea eficientă a pacientului.

Compușii pot fi utilizați de asemenea ca reactivi de diagnosticare. De exemplu compușii marcați pot fi utilizați pe suprafețe localizate ale inflamației sau tumorilor metastazice la un pacient suspectat de a avea o inflamație. Pentru această utilizare compușii pot fi marcați cu ¹²⁵l, ¹⁴C sau tritiu.

Se dau în continuare exemple de realizare a invenției.

Exemplul 1. N-benzil glicozida lactulozei (compusul 1)

Un balon de 500 ml cu fund rotund cu 3 gâturi a fost imersat într-o baie de gheață și încărcat cu 23,9 g (69,8 mmoli) lactuloză și 109 ml (526 mmoli, 7,5 echivalenți) benzilamină. Balonul a fost închis și agitat cu un agitator magnetic. Baia de gheață a fost lăsată să se topească și masa de reacție a fost lăsată să se încălzească ușor la temperatura camerei. Dizolvarea materialului solid decurge câteva ore și amestecul de reacție devine galben la culoare. TLC în 60:50:15 CHCI₃:MeOH: 15 mM CaCI₂ pot fi utilizate pentru a supraveghea avansarea reacției (lactuloză R_t=0,45, produs R^O.ÎS, vizualizare cu orcinol).

Reacția s-a terminat încet și va fi completă în 5-7 zile. La acest timp reacția a fost considerată pentru a fi completă, agitatorul a fost îndepărtat din reacție, balonul a fost fixat cu un agitator mecanic la partea superioară și a fost imersat într-o baie de gheață. O cantitate de 250 ml de hexan au fost adăugați apoi în balon și amestecul a fost agitat viguros aproximativ 60 de secunde. Agitarea a fost apoi întreruptă și s-a permis amestecului să se separe în două straturi distincte (acestă separare are loc de la 15 minla 1 oră). în acest timp stratul superior hexan/benzilamină, a fost îndepărtat printr-un tub de scurgere. Extracția de benzilamină a fost repetată cu de două ori mai mult hexan (250 ml porții) și apoi încă de trei ori utilizând porții de 250 ml de dietileter (toate extracțiile s-au făcut în gheață).

După ce aceste extracții s-au realizat, s-a îndepărtat un reziduu galben pal vâscos.

Acest material a fost dizolavt în 300 ml etanol și a fost transferat într-un alt balon de 21 cu fund rotund cu un singur gât. Soluția galbenă a fost concentrată prin evaporare rotativă până la un sirop gros. O cantitate de 1000 ml acetonă de calitate pentru analiză, a fost apoi rapid agitată cu un agitator magnetic la 0°C și soluția a fost apoi tratată încet cu un lichid etanolic.

1635

1640

1645

1650

1655

1660

1665

1670

1675

RO 117533 Β1

Pe măsură ce acest sirop etanolic se adaugă, începe să se formeze un precipitat lăptos. După ce adiția a fost completă, balonul a fost acoperit și depozitat la -20°C, înghețat peste noapte (timp de 18 h ). După îndepărtarea din frigider, a apărut o turtă albă solidă pe fundul balonului și supernatantul a fost de culoare galben limpede. Soluția a fost decantată și solidul crud de compus 1 a fost expus sub vid înalt pentru a îndepărta acetona reziduală. Produsul (compusul 1) este un produs foarte instabil și a fost utilizat în reacția următoare.

Exemplul 2. Acetat de n-benzil-lactozamina (compus 2)

30,1 g (69,8 mmoli) de produs brut (compus 1) obținut mai sus au fost dizolvate în 1000 ml de metanol de calitate reactiv și agitat la temperatura camerei. O cantitate de 4 ml (70 mmoli) acid acetic glacial s-au adăugat apoi și balonul a fost acoperit. Amestecul de reacție galben pal a fost lăsat sub agitare la temperatura camrei și a fost controlat prin TLC în același sistem de solvent ca cel descris mai sus. Compusul 2 apare la R_f=0,65 (lactuloza reziduală este înregistrabilă prin TLC la începutul reacției, dar cantitatea sa nu pare să crească substanțial pe măsura evoluției reacției). Când compusul 1 apare să fie consumat complet prin TLC (24-28 h ), 100 pl au fost luați din amestecul de reacție și evaporați sub curent de argon. Reziduul galben a fost apoi dizolvat în CD₃OD și evaporat din nou la un reziduu galben. Acest material a fost apoi dizolvat în D₂O și a fost analizat prin ¹H-RMN.

Această soluție brută de compus 2 a fost utilizată apoi în reacția care urmează. în vederea calculării randamentului, o mică parte alicotă de volum cunoscut poate fi îndepărtată din amestecul de reacție, concentrată la sec, dizolvată în apă, adusă la pH >10 și cromatografiată utilizând cromatografia rapidă pe silica gel, cu fază inversă, eluând în primul rând cu H₂O și apoi cu 2:1 H₂O:MeOH.

Randamentul față de lactuloză a fost 50-55 %.

¹H-RMN(300 Mhz, δ în ppm referitor la HOD) 7,44(m,5H), 5,49(d, J=3Hz,1H), 5,05(d,J=8Hz,1H), 4,39(d,J=7Hz,1H), 4,38(d,J=8Hz, 2H), 4,35(d,J=7Hz,1H), 4,103,5(m,11H), 3,24(dd,J=3Hz,J=10 Hz,1H), 3,00(dd,J=8 Hz,J=10Hz,1H), 2,87(s,3H).

Exemplul 3. Acetat de lactozamină (compus 3)

Un balon de 2 I care conține soluție metanolică acidă de compus 2 din reacția anterioară și echipat cu robinete cu șlif cu 3 căi de închidere a fost trecut printr-un ciclu de 3 ori de purge argon/vid. Balonul a fost deschis și s-au adăugat 7,4 g (6,98 mmoli) de 10 % Pd/C. Apoi balonul s-a reechipat cu trei căi și supus de 3 ori unui ciclu vid/purge, utilizând hidrogen gazos. Reacția a fost ținută apoi sub o atmosferă de hidrogen utilizând un balon.

Reacția a fost urmărită prin TLC (produs R_f=0,2). Când materia primă a fost consumată, s-a îndepărtat o parte alicotă de 100 pl s-a plasat într-un tub ependorf, trecut într-un microfiltru și supernatantul a fost îndepărtat și utilizat pentru a prepara o mostră pentru RMN ca în reacția precedentă. Odată analiza RMN a arătat o pierdere completă a compusului 2, suspensia a fost filtrată printr-un strat filtrant de celită pe o pâlnie de sticlă sinterizată de porozitate medie utilizând metanol. Soluția clară galbenă a fost apoi concentrată prin evaporare rotativă la 140 ml într-un balon cu fund rotund de 500 ml și utilizat sub formă brută în reacția următoare. Compusul 3:¹H-RMN (300 Mhz, δ în ppm referitor la HOD) 5,40(d,J=3Hz,1H), 4,90(d,J=8Hz,1H), 4,41(d,J=8Hz,1H), 4,00-3,5(m,11H),

3,28(dd,J=3Hz,J=8 Hz,1H), 2,98(dd,J=7Hz,J=8Hz,1H).

Exemplul 4. 2-Deoxi-2-(2'-carboxi)-benzamido-4-Op-D-galactopiranosil)-p-D-glucopiranosidă(compus 4) și 1,3,6-Tri-O-acetil-2-deoxi-2-ftalimido -4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-PD-galacto-piranosil)-p-D-glucopiranosidă(compus 5)

Soluția brută metanolică de compus 3 a fost diluată cu 14 ml de H₂O și tratată cu

29,7 g (280 mmoli) carbonat de sodiu urmată de 20,7 g (140 mmoli) anhidridă italică.

Reacția a fost condusă cu grijă din cauza unor spumări care au loc inițial. După 4 h reacția

RO 117533 Β1

1725 a fost completă și suspensia a fost filtrată printr-o pâlnie de sticlă sinterizată pentru îndepărtarea carbonatului de sodiu rezidual și un material bazat pe ftalat. Filtratul a fost apoi concentrat în primul rând la o pastă prin evaporare rotativă și apoi sub vid înalt pentru a obține compusul 4. îndepărtarea cât se poate de mult a urmelor de metanol și apă rămase în material este esențial pentru evitarea reacției cu anhidridă acetică în acetilarea care urmează.

Când s-a considerat că materialul a fost suficient de uscat, s-au adăugat 212 ml piridină, urmată de 106 ml (1,12 moli) de anhidridă acetică. Amestecul a fost agitat manual la început pentru a produce dizolvarea, dar odată ce are loc inițial o reacție exotermă, dizolvarea este provocată și apoi se utilizează agitarea magnetică. După agitare peste noapte (după 18 h ), analiza TLC în 20:1 CHCI₃:MeOH indică preponderența unui spot UV activ major care se suprapune peste compusul 5 autentic. Soluția a fost răcită la 0°5 C, tratată cu 32 ml de H₂O și s-au agitat timp de 15 minpentru a hidroliza excesul de anhidridă acetică. Soluția a fost apoi diluată la 1000 ml cu diclormetan și spălată (3 x 1000 ml) cu HCI 2N, (3 x 1000 ml), cu NaHCO₃ saturată și (1 x 1000 ml) cu NaCI, saturată. Soluția organică a fost uscată pe MgSO₄, filtrate și concentrate la un produs brut. ¹H-RMN a fost apoi realizată în CDCI₃ și a indicat un amestec 1:1 de a și β anomeri. Astfel produsul brut a fost dizolvat într-o cantitate minimă de metanol (aproximativ 30 ml) și urmată de cristalizare în minute. După ce rămâne la temperatura camerei pentru anumite ore, solidul a fost colectat prin filtrare și spălat cu metanol cu gheață. După uscarea în aer a produsului, compusul 5 (5,6 g, 10,4 %) a fost colectat sub formă de pulbere albă.

¹H-RMN(300 Mhz, δ în ppm referitor la CHCI₃) 7,90-7,70(m,4H), 6,50(d,J=8Hz,1H), 5,83(dd,J=10,5Hz,J=8Hz,1H), 5,36(d,J=3,5Hz, 1H), 5,15(dd,J=8Hz,J=10,5Hz,1H),

4,97(dd,J=10Hz,J=3,5,1H), 4,56-3,83(m,9H), 2,20-1,90(7s,21H).

Exemplul 5. Conversia compusului 1,3,6-tri-O-acetil-2-deoxi-2-ftalimido-4-O-(2,3,4,6tetra-O-acetil-p-D-galactopi-anosil)-p-D-gluco-piranosidă la compusul 5

Apa mumă care conține α-acetat de la cristalizarea compusului 5 discutat mai sus a fost concentrată la o spumă și dizolvată în 110 ml DMF. Această soluție a fost agitată sub argon la 55°C. S-au adăugat apoi 9,5 g (104 mmoli) de acetat de hidrazină. După 15 minute, analiza TLC în 20:1 CHCI₃:MeOH a indicat o pierdere completă de materie primă și aparența unui spot R_f inferior. Amestecul de reacție a fost răcit la temperatura camerei și diluat la 1000 ml cu acetat de etil. Soluția a fost apoi spălată cu 2 x 1000 ml H₂O și 1 x 1000 ml cu NaCI. Apele organice au fost uscate (MgSO₄), filtrate și concentrate.

Produsul brut concentrat a fost dizolvat în 50 ml piridină și tratat cu 25 ml andidridă acetică. După agitare peste noapte (după 18 h ), analiza TLC 20:1 CHCI₃:MeOH a indicat un spot UV activ majoritar care este împreună cu compusul 5.

Soluția a fost răcită la 0°C, tratată cu 7,5 ml H₂O și agitată 15 minpentru a hidroliza excesul de anhidridă acetică. Soluția a fost diluată la 250 ml cu diclormetan și spălat cu 3 x 250 ml HCI 2N și cu 3 x 250 ml NaHCO₃ saturat și 1 x 250 ml cu NaCI saturată. Soluția organică a fost uscată pe MgSO₄, filtrată și concentrată la un produs brut. Produsul brut a fost apoi dizolvat într-o cantitate minimă de metanol și încă o dată cristalizată. După câteva ore, compusul 5 solid a fost izolat înainte de a obține o altă cantitate de produs (4,4 g, 8,3 %) sub formă de pulbere albă. Randamentul global de compus 5 din cele două recoltări, este de 10 g (18,7%).

Exemplul 5 A. Varianta de preparare a compusului 5 de la lactuloza Aminoglicozida lactulozei (compus 1A)

O autoclavă de 300 ml din oțel inoxidabil, care este prevăzută cu un agitator, 17,1 g (50 mmoli) de lactuloză și 3,85 g (50 mmoli) acetat de amoniu au fost răcite la -78°C și s-au încărcat 80 ml de amoniac lichid. Autoclava a fost etanșată și s-a acceptat să se încălzească

1730

1735

1740

1745

1750

1755

1760

1765

1770

RO 117533 Β1 la temperatura camerei, sub agitare. Odată ce autoclava a atins temperatura camerei, a fost introdusă într-o baie de ulei și încălzită la temperatura camerei până la 35°C timp de 24 h. Autoclava a fost apoi răcită la temperatura camerei și cu grijă s-a făcut legătura cu atmosfera (s-a depresurizat). Odată ce tot amoniacul a fost risipit, în aproximativ 2 h, întreaga autoclavă a fost plasată într-un exsicator de vid care conține pentoxid de fosfor, și cu grijă pus sub vid înaintat. După ce a fost ținut sub vid înalt peste noapte, conținutul autoclavei a devenit o spumă galben pal. Compusul a fost destul de higroscopic și a fost repede îndepărtat din autoclavă și plasat într-un recipient etanș. Acest material brut a fost utilizat în reacția care urmează.

B. Acetat de lactozamină (compus 2A)

3,41 mg, (10 mmoli) de aminoglicozidă a lactulozei (compus 10) au fost dizolvate în 100 ml de metanol amhidru și agitat la temperatura camerei sub argon. Au fost apoi adăugați 572 pl (10 mmoli) de acid acetic glacial. După 24 h soluția galbenă a fost concentrată la o spumă care rezultă că, conține acetat de lactozamină sub forma unui amestec 1:1 de a și β anomeri. Alte două produse au rezultat, care se crede că sunt anomerii a și b ai galactopiranozil manozaminei. Acest produs a fost utilizat în reacția care urmează.

Compusul 5 a fost apoi preparat pornind de la compusul 2A prin utilizarea materialului brut obținut în etapa b, de mai sus, cu procedurile din exemplul 4 la scala 1/7-1/10. Acetona a constituit aproximativ 1-3 din solventul utilizat pentru a forma ftalimida semi acidă, în cele din urmă s-a produs peracetil ftalimida (compusul 5), care s-a obținut cu randament de 3,8 % față de lactuloză, o a doua cantitate de cristale nefiind căutată.

Exemplul 6. 1-Clor-3,6-di-O-acetil-2-deoxi-2-ftalimido-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-pD-galacto-piranosil)-P-D-glicopiranozidă (compus 6)

3,3 mg (4,3 mmoli) de acetat anomeric (compus 5) s-a agitat în 43 ml de CH₂CI₂ uscat sub argon la temperatura camerei. O cantitate de 2,9 mg (21,5 moli) triclorură de aluminiu au fost adăugate apoi, sub forma unui solid. După 40 minute, amestecul a fost spălat într-o pâlnie separatoare la un volum de 400 ml în 1:1 CH₂CI₂:H₂O. Amestecul a fost agitat, faza apoasă a fost îndepărtată și soluția organică a fost spălată cu 2 x 200 ml cu H₂O și 3 x 200 ml cu soluție saturată de NaHCO₃. Soluția limpede de culoare galben pal a fost apoi uscată pe (MgSO₄), filtrată și concentrată la o pulbere galben pală (3,29 mg, 100096). Acest material a fost apoi utilizat pentru condensarea în exemplul 7.

Exemplul 7. Etil β-d-galactopiranozida (compus 7)

2,5 kg dintr-o soluție de bromură de 2,3,4,6-tetra-O-acetil galactozil în 41 diclormetan a fost adăugată cu o viteză de 20-25 ml/minut la un reactor încărcat cu 3,13 kg (11,4 moli) carbonat de argint, 2,37 kg site moleculare de 4 Â, 16 1 diclormetan și 4 I alcool anhidru. Agitarea a fost menținută pentru a produce o amestecare viguroasă a reactivilor. Două h după adiția completă a soluției de bromură a fost realizată analiza TLC pe silica gel developată cu hexan:acetat de til 1:1 care nu a indicat prezența bromurii. în acest moment amestecul de reacție a fost filtrat printr-un strat de celită (1 kg) și filtratul a fost evaporat la 30-35°C sub vid pentru a da un ulei maro (1,95 kg). Acest ulei a fost uscat sub vid timp de 17 h. ¹H-RMN(CDCI₃)0: 5,36 (1H,d,J₃₄=3,7Hz,H-4), 5,17(1 H,dd,J₂₃=11,0Hz,H-2), 4,99 (1H,dd, H-3), 4,46(1 H,d,J₁₂=8,3Hz,H-1), 2,15, 2,05, 2,04, 1,95(12H,4s, OAc),

1,21(3H,t,OCH₂CH₃).

O cantitate de 1,95 kg de etil tetraacetil galactopiranozidă a fost dizolvată în 11,7 I metanol anhidru și s-au adăugat în picături 90 ml metoxid de sodiu soluție 25 % în metanol.

Soluția a fost agitată 1 oră și în acest moment, analiza TLC pe silica gel developată cu acetat de metil’.metanol 2:1 nu a arătat prezența materiei prime. Produsul are un R_f=0,6.

Soluția a fost neutralizată prin adăugare de 0,6 kg rășină Amberlit IR-120 (H⁺) și agitare.

RO 117533 Β1

1825

Când soluția are un pH =6...7, rășina a fost îndepărtată prin filtrare și filtratul a fost evaporat sub vid pentru a rezulta un solid galben pal. Acest solid a fost dizolvat în 11 Ide etanol fierbinte. Soluția care rezultă s-a lăsat să se răcească la 25°C și apoi s-a răcit la 0°C pentru a da un precipitat alb. Filtrarea acetui solid a dat etil^-D-galactopiranozidă, compus 7 (0,851 kg). ¹H-RMN(D₂O)0: 4,38 (1H,d,J₁₂=8,0,4.1), 3,89(1 H,dd,J₃₄=3,7Hz,H-4), 1,2 (3H,t,OCH₂CH₃).

Exemplul 8. Etil 4,6-o-benziliden-fi-d-galactopiranozida (compus 8)

O cantitate de 0,851 kg (4,08 moli) etil β-D-galactopiranozidă compus 7 au fost încărcate într-un balon rotovapor de 20 I cu 1,5 g (7,9 mmoli) acid toluen sulfonic. Balonul evaporator a fost fixat la evaporator și 1,23 I (8,18 moli) de dimetil acetal de benzaldehidă au fost adăugați prin aspirație. Amestecul a fost rostogolit timp de 4 h. între 30 și 40 min după adăugarea acefalului, soluția aproape completă a fost obținută, urmată rapid de apariția unui precipitat greu. Rotația s-a continuat timp de 4 h, timp la care au fost adăugați 1,5 ml de trietilamină pentru a neutraliza amestecul de reacție. S-a aplicat vid pentru a îndepărta solventul în scopul de a obține o masă solidă. O cantitate de 6 I de hexan au fost alimentați într-un balon și amestecul rostogolit pentru 0,5 h. Solidul care a rezultat a fost filtrat și spălat pe un filtru cu 2 litri hexan.etil eter 1:1. Solidul alb astfel obținut a fost uscat sub vid timp de 17 h pentru a da etil 4,6-0-benziliden-p-D-galactopiranozidă, compus 8 (1,0 kg, 3,38 moli) cu randament de 83 %. ¹H-RMN(CDCI₃)5: 7,53(2H,m,aromatic), 7,37(3H,m, aromatic), 5,57(1H,s,CHPh), 4,29(1H,d,J₁₂=7,0Hz,H-1), 4,21 (1H,d,J ₃^3,27Hz,H-4), 1,29(3H,t,OCH₂CH₃).

Exemplul 9. Etil-2-o-benzoil-4,6-o-benziliden-p-d-galactopiranozida (compus 9)

O cantitate de 0,924 kg (3,12 moli) etil 4,6-0-p-D-galactopiranozidă, compus 8, a fost alimentată într-un reactor de 20 litri, echipat cu circulație de aer, o pâlnie de adiție care egalizează presiunea, cu orificiu pentru admisia gazului, o baie de răcire și un orificiu de evacuare, a gazului. înainte de etanșarea balonului, s-au adăugat 9,3 I diclormetan și 2 I piridină obținându-se o soluție omogenă. Pâlnia de adiție a fost încărcată cu 0,388 kg (3,43 moli, 273 ml) clorură de cloracetil sub formă de soluție 60 % în diclormetan. Balonul a fost etanșat și a început introducerea unui debit mic de azot uscat. Baia a fost răcită la 65°C±5°C timp de încă o oră. în acest moment 0,614 kg (4,37 moli, 0,507 I) de clorură de benzoil au fost adăugate la amestecul de reacție la o viteză de 8-12 /minut. Amestecul de reacție a fost lăsat să se încălzească la temperatura camerei și lăsat 17 h. Amestecul de reacție a fost filtrat pentru a îndepărta sărurile precipitate și filtratul a fost concentrat în vid pentru a îndepărta cât mai mult diclormetan.

O mostră mică a fost suspusă analizei ¹H-RMN, (CDCI₃) δ: 5,75(1 H,dd, J₂₃=10,6Hz,H2), 5,56(1 H,s,CHPh), 5,25(1 H,dd, J₃₄=3,44Hz,H-2), 4,69(1 H,d,J₁₂=8,48Hz,H-1), 4,48(1 H,bd,H-4), 1,15(3H,t,OCH₂CH₃).

O cantitate de 180 ml apă a fost adăugată la concentrat și amestecul care rezultă a fost agitat timp de 2 h la 40°C. în acest moment amestecul de reacție a fost concentrat suplimentar pentru a da un reziduu galben care a fost dizolvat în 11 I diclormetan și transferat într-un extractor de 50 litri. Soluția organică a fost în mod succesiv extrasă cu 11 I soluție 0,5N de HCI răcită cu gheață, 111 soluție apoasă saturată de bicarbonat de sodiu, și 111 apă rece. Stratul organic a fost uscat pe sulfat de sodiu anhidru (1,0 kg), filtrat și filtratul a fost evaporat pentru a da un solid galben care a fost uscat sub vid. Această reacție a fost controlată prin TLC pe silica gel developat cu hehan:acetat de etil 1:1. Acest solid a fost dizolvat în 9,51 etanol fierbinte, sare după răcire și filtrare a dat etil 2-0-benzoil-4,6-0-benziliden-Ș-Dgalactopiranozidă compus 9 (0,737 kg, 1,85 moli), randament 59 %. ¹H-RMN,(CDCI₃)5: 5,59 (1H,s,CHPh), 5,36(1 H,dd,J_{2 3}=10,07Hz,H-2), 4,64(1H,d, J, ₂=8,21Hz,H-1),

1,15(3H,t,OCH₂CH₃).

1830

1835

1840

1845

1850

1855

1860

1865

RO 117533 Β1

Pentru a confirma că benzoatul la C-2 și că C-3 poartă o grupă hidroxilică liberă, s-a adăugat la mostra RMN, o picătură de tricloracetilizocianat și s-a determinat spectrul. Acest spectru conține un câmp al dubletului, jos, la 5=5,27 tipic al H-3 al galactozei care este esterificată la C-3. Filtratul original obținut din amestecul de reacție a conținut cantități suplimentare de produs.

Exemplul 10. EW(/3-D-ga/actop/ranoz/7)-(1-4)-O-(2-/V-a//7ox/carbon/7)-2-cteox/-/3-Dglucopiranozil)-(1-3)-O-(3-D-galactopiranosidă (compus 10)

La un amestec de 0,76 g (1,9 moli) de etil 2-O-benzoil-4,6-O-benziliden-p-D-galactopiranozidă, compus 9, 2 g site moleculare de 4 Â, 10 ml diclormetan, 0,278 ml (2,1 mmoli) colidină și 0,522 g (2 moli) trifluoronetansulfonat, răcit la -25°C, s-a adăugat în picături o soluție de 1,484 g (2 moli) de clorură de 4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-3-D-galacto-piranozil)3,4,6-tri-O-acetil-2-deoxi-2-ftalimido-Ș-D-gluco-piranozil (compus 6), dizolvat în 5 ml diclormetan. Amestecul care rezultă a fost agitat și încălzit la temepratură ambiantă după adăugarea completă a clorurii. După 2 h amestecul a fost diluat cu diclormetan și filtrat. Filtratul a fost spălat succesiv cu bisulfit de sodiu apos, acid clorhidric apos, bicarbonat de sodiu apos și în final apă. Stratul organic a fost uscat pe sulfat de sodiu anhidru, filtrat și comparat pentru a da o masă solidă care a fost recristalizată din diclormetan:hexan.

0,66 g de trizaharidă blocată total, care rezultă a fost tratată cu 5 ml soluție de acid acetic 80 % la 80°C timp de două ore, timp la care solventul a fost îndepărtat prin evaporare. Reziduul a fost coevaporat cu toluen:acetat de etil de două ori pentru a da un reziduu care a fost dizolvat în 10 ml etanol. O cantitate de 0,3 ml hidrat de hidrazină a fost adăugată și amestecul rezultat a fost refluxat 17 h pentru a da un precipitat care a fost filtrat pentru a da 0,46 g de solid după uscare. Acest solid a fost dizolvat în metanokapă 5:1 și tratat cu 0,166 ml dialilpirocarbonat pentru o oră. Amestecul care a rezultat a fost evaporat și împărțit între diclormetan și apă. Stratul apos a fost separat și concentrat pentru a obține compusul 10 sub forma unui reziduu ce a fost solidificat prin triturare cu acetat de etikacetonă 2:1.

Aceasta asigură trizaharida din titlu (compusul 10) care a fost sialilată enzimatic pentru a da etil[sodiu-(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-nonulopiranosilonat)j(2-3)-0-(Ș-D-galactopiranoizil)-(1,4)-0-(2-N-aliloxicarbonil-2-deoxi-3-D-glucopiranozil-(1,3)Ο-β-D-galactopiranozidă (compus 11) care a fost identic cu acel produs în procedura care urmează.

Exemplul 11. Etil [sodiu-(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-nonulopiranosilonat)]-(2-3)-0-(P-D-galactopiranoizil)-(1,4)-0-(2-N-alil-oxicarbonil-2-deoxi-P-Dglucopiranozil-(1,3)-O-P-D-galactopiranozidă (compus 11) în continuare se descrie conversia enzimatică a dizaharidei (compus 9) pentru a produce compusul din titlu (compusul 11) utilizând galactozil transferaza și sialil transferaza.

La 12 I apă au fost adăugate 0,410 kg de acid N-[2-hidroxietil]piperazin-N’-[2-acid etansulfonic] și pH -ul soluției rezultate a fost ajustat la 7,5. S-au adăugat 17 g ser de albumină de bovină și amestecul a fost agitat până ce s-a obținut o soluție completă 0,3 kg de etil-3-0-(2-N-aliloxi-carbonil-2-amino-2-deoxi^-D-glucopiranozil)^-D-galacto-piranozidă (compus 9) 0,271 kg glucoză-1-fosfat, 0,177 kg fosfoenolpiruvat, 0,087 kg clorură de poatsiu, 8,4 g azidă de sodiu și 8,76 g uridină-5'-difosfat au fost adăugate și amestecul care rezultă s-a agitat până ce toate solidele s-au dizolvat. S-au adăugat apoi clorură de mangan (1M, 506 ml) și clorură de magneziu (1M, 168 ml). 42000 U piruvat de kinază, 2000 U uridină-5'-difosfat pirofosforilază, 8400 U pirofosfatază aorganică, 91000 U uridină-5'-difosfat galactoză epimerază și 8850 U uridină-5'-difosfat galactozil transferază au fost apoi adăugate. Volumul final al amestecului de reacție a fost ajustat la 17 I cu apă. După 48 h au fost adăugați 340 ml (1M) de clorură de magneziu. Reacția a fost controlată prin TLC pe silica gel developată cu izopropanol, acetat de amoniu 1M 4:1. După 8-9 zile TLC a indicat că reacția a fost condusă până la 95 % randament la care timp a fost preparată soluția următoare.

RO 117533 Β1

1925

S-a preparat o soluție din 0,528 kg acid N-[2-hidroxietil]piperazină-N’-[2-acid etansulfonic] în 15 I de apă, și pH -ul acesteia a fost ajustat la 7,5. Apoi s-au adăugat 22 g ser de albumină de bovină, 11,5 g de azidă de sodiu, 0,242 kg de acid sialic, 0,395 kg fosfoenol piruvat, 25 g citidină-5'-monofosfat, 4,7 g adenazină 5'-trifosfat, 780 ml (1M) clorură de mangan. La acestă soluție au fost adăugate 207000 U piruvat kinază, 125000 U miokinază, 3245 U citidină-5'-monofosfat-N-acetilneuroaminic acid sintează, 9400 U pirofosfatază anorganică și 1640 U a-2,3-sialil-transferază. Volumul acestui amestec a fost ajustat la 22 I și acestă soluție a fost adăugată la reacția glucozil transferazei. Reacția a fost controlată prin TLC pe silica gel developată cu izopropanol: acetat de amoniu 1M 4:1. După 10-12 zile, TLC a indicat că reacția a fost condusă pentru a da >95 % compusul din titlu (compus 11).

Exemplul 12. Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-Dgalacto-nonulo-piranosilonat)]-(2-3)-O-(2,4,6-tri-O-acetil-Ș-D-galactopiranoizil)-( 1 -4)-0-(3,6di-0-acetil-2-N-aliloxicarbonil-2-deoxi^-D-glucopiranosil)-(1 -3)-0-2,4,6-tri-O-acetil-p-Dgalactopiranozidă (compus 12)

I soluție de etil[sodiu-(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-nonulopiranosilonat)]-(2-3)-0-8-D-galacto-piranoizil-(1-4)-0-(2-N-aliloxicarbonil-2-deoxi-Ș-D-glucopiranozil-(1-3)-0-p-D-galactopiranozidă (compus 11) a fost filtrată prin hârtie. Filtratul a fost evaporat la un sirop gros într-un rotovapor de 50 I. Siropul a fost coevaporat de două ori cu 2 x 2 I de piridină, apoi se păstrează sub vid timp de 20 h. Balonul de evaporare a fost încărcat cu o soluție de 20 g Ν,Ν-diaminopiridină în 121 piridină. Baia evaporatorului rotativ, a fost încărcată cu amestec apă-gheață și rotirea a fost continuată în timp ce s-au adăugat 6 I de anhidridă acetică în timpul unei perioade de 1 oră. La 2 h după adăugarea completă s-au mai adăugat 2 I anhidridă acetică și amestecul care rezultă a fost lăsat timp de 20 h sub rotație lentă, la temperatura camerei. Pentru a asigura completa acetilare, s-a mai adăugat 11 de anhidridă acetică și amestecul a fost rotit încă 24 h. Reacția a fost controlată prin TLC (acetat de etil:hexan:etanol 10:10:3).

După completa reacție a fost aplicat vid și a fost colectat 14 I de distilat. La reziduul rezultat, s-au adăugat 15 I metanol după o perioadă de 1 oră și amestecul a fost rotit la temperatura camerei pentru 20 h. în acest moment, analiza TLC pe silica gel, (acetat de etil:hexan:etanol, 10:10:3 și diclormetan:acetonă 3:2) au prezentat o conversie completă a lactonei la un spot cu deplasare lentă, care a corespuns compusului monohidroxi esterului metilic. Amestecul a fost apoi concentrat (181) și a fost răcit în apă cu gheață în timp ce s-au adăugat 3 I de anhidridă acetică pe o perioadă de 30 minute. Analiza TLC pe silica gel (diclormetan:acetonă 3:2) a indicat o acetilare completă cu produs care migrează ușor mai repede.

I de metanol a fost adăugat pentru a distruge excesul de anhidridă acetică în momentul în care s-a înregistrat o exotermă mică. După 1 oră, amestecul a fost concentrat la un sirop, care a fost transferat într-un extractor de 501 cu ajutorul unui amestec acetat de etil.apă (13/131). Amestecul a fost agitat viguros. După separarea de fază, stratul inferior a fost îndepărtat și stratul organic care a rămas a fost filtrat prin hârtie. Filtratul a fost spălat cu 151 acid clorhidric apos 5 % (stratul apos va avea încă pH puternic acid la hârtie de 1 pH după spălare), și bicarbonat de sodiu 1M (151, stratul apos va fi încă alcalin la hârtie de filtru după spălare). Stratul organic a fost apoi transferat într-un recipient de 20 I, uscat pe sulfat de sodiu anhidru și a fost filtrat.

Filtratul a fost concentrat până la un reziduu semi-solid. Acest reziduu a fost dizolvat în 31 diclormetan și aplicat pe o coloană de silica gel (10 kg), umplută cu diclormetan. Prima eluare cu 25 I diclormetan:acetonă (50:1) a dat fracțiuni care conțin produs. Separarea de bază a fost realizată din material dizaharidic, dar o foarte mică separare a fost realizată din urmele de material care (se deplasează) migrează ușor mai repede. Fracțiunile care conțin

1930

1935

1940

1945

1950

1955

1960

1965

RO 117533 Β1 produs au fost evaporate și redizolvate în diclormezan (1,5 I). Această soluție a fost adăugată lent la un amestec agitat viguros, de eter etilic (7,5 I) și 101 hexan. Precipitatul care rezultă a fost filtrat și spălat cu eter:hexan 2:1, uscat la aer peste noapte, apoi uscat sub vid înaintat pentru 48 h. Precipitatul reprezintă compusul din titlu (compusul 12) în urma analizării prin ¹H-RMN și conține o mică cantitate de solvent rezidual (1-5 % greutate/greutate). ¹H-RMN,(CDCI₃)5: 4,67(d,1H,H-1), 4,43(d,1H,H-T), 4,33(d,1H,H-1).

Exemplul 13. Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-Dgalacto-2-nonulo-piranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-P-D-galactopiranoizil)-(1,4)-0-(2amino-2-deoxi-3,6-di-O-acetil-P-D-glucopiranosil)-( 1,3)-0,2,4,6-tri-O-acetil-p-Dgalactopiranozidă (compus 13)

La o soluție sub agitare de 5,10 g (3,80 moli) de etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi4,7,8,9-tetra-0-acetil-a-D-glicero-D-galacto-nonilo-piranosilonat)]-(2-3)-0-(2,4,6-tri-0-acetilp-D-galactopiranoizil)-(1-4)-0-(3,6-di-0-acetil-2-N-aliloxicarbonil-2-deoxi-p-D-glucopiranosil)(1-3)-0-2,4,6-tri-0-acetil-3-D-galactopiranozidă (compus 12) în THF anhidru sub argon la temperatura camerei au fost adăugați 420 μΙ de polimetilhidrosiloxan. Amestecul de reacție a fost supus unui ciclu vid/purje de 3 ori pentru a degaza soluția. Balonul a fost acoperit în folie de aluminiu pentru a proteja soluția de lumină și soluția a fost tratată cu 158 mg (0,14 mmoli) tetrakistrifenilfosfină de paladiu [Pd(PPh₃)₄]. După agitare timp de 18 h la temperatura camerei, analiza TLC în 10:1 CHCI₃:MeOH a indicat consumarea completă a compusului 12 și prezența unui singur produs cu Rf mai mic. Amestecul de reacție a fost diluat cu 600 ml de EtOAc și spălat cu 200 ml de H₂O și 1 x 200 ml de soluție saturată de NaCI. Soluția organică a fost uscată pe (MgSO₄), filtrată, concentrată prin evaporare rotativă și cromatografie rapidă pe o coloană de silica gel de 65 mm x 10 utilizând 3:1 EtOAc.acetonă ca eluent. Fracțiile care conțin produs (analizate prin TLC) au fost împărțite și concentrate pentru a obține compusul 13 (4,42 mg, 87 %), un solid cafeniu, ¹H-RMN(300 Mhz,6 în ppm relativ la CDCI₃): 5,50(m,1H), 5,44(dd,J=6Hz,J’=2Hz,1H), 5,35-5,01 (m), 4,89(m,2H), 4,63(d,J=6Hz,1H), 4,59-4,35(m), 4,22-3,38 (m), 3,81(s,3H), 2,69(m,1H), 2,57(dd,J=3Hz, J=10Hz,1H), 2,27-1,85(12s,36H), 1,77(de,J=10Hz,J=10Hz,1H), 1,21(t,J=5Hz,3H).

Exemplul 14. Etil [metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-gliceroD-galacto-2-nonulo-piranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-p-D-galactopiranoizil)-( 1,4)-O(2-amino-2-deoxi-6-O-acetil-p-D-glucopiranosil)-( 1,3)-0,2,4,6-tri-O-acetil-p-Dgalactopiranozidă (compus 14)

La o soluție agitată de 4,42 g (3,29 mmoli) de compus 13 în 366 ml de MeOH:H₂O 4:1 la temperatura camerei într-un balon cu capac a fost adăugat acid acetic glacial (188 μΙ, 3,29 mmoli). Soluția galben pal a fost apoi încălzită la 50°C. După 48 h analiza TLC în 10:1 CHCI₃:MeOH a indicat aproape completa dispariție a compusului 13 și apariția unui produs predominant cu R, ușor mai mare. Reacția a fost răcită la temperatura camerei, concentrată prin evaporare rotativă, într-un ulei și cromatografiată rapid pe o coloană de 65 mm x 10 de silica gel utilizând 10:10:4 EtOAc:hexan:MeOH ca eluent. Fracțiunile care conțin produs (analizate prin TLC) au fost împărțite și concentrate pentru a da compusul 14 (2,78 gm, 65%) ca o spumă. ¹H-RMN(300 Mhz, δ în ppm în CDCI₃): 5,50(m,1H), 5,40(d,J=6Hz,J=2Hz,1H), 5,25(d,H=7Hz,1H), 5,17 (dd,J=6Hz,J=7Hz,1H),

5,04(dd,J=6Hz,J=7Hz,1 H), 4,89(d,H=3Hz, 1H), 4,63(d,H=6Hz,1H),

4,59(dd,J=3Hz,J=7Hz,1H), 4,42-3,40(m), 3,81 (s,3H), 2,69(m,1H), 2,57(dd,J=3Hz,

J=10Hz,1H), 2,27-1,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz,J=10Hz,1H), 1,21 (t,J=5Hz,3H).

RO 117533 Β1

Exemplul 15. Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-Dgalacto-2-nonulo-piranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranoizil)-( 1,4)-0-(2benzamido-2-deoxi-6-O-acetil-P-D-glucopiranosil)-( 1,3)-0,2,4,6-tri-O-acetil-p-Dgalactopiranozidă (compus 15)

La o soluție sub agitare din 150 mg (0,12 mmoli) compus 14 în 2 ml de diclormetan la temperatura camerei sub atmosferă de argon, au fost adăugate 40 mg (0,48 mmoli) NaHCO₃ anhidru și 34 mg (0,24 mmoli, 28 pl) clorură de benzoil. După agitare timp de 24 h, analiza TLC în 80:20 EtOAc:acetonă a indicat completa consumare a materiei prime și apariția unui material cu Rf ușor mai mare. Amestecul de reacție a fost diluat cu 150 ml de acetat de etil și spălat cu 1 x 50 ml de H₂O. Soluția organică a fost uscată pe MgSO₄, filtrată, concentrată și cromatografiată rapid pe o coloană de silica gel utilizând 90:10 EtOAc:acetonă ca eluent. Fracțiunile care conțin produs (analizate prin TLC) au fost împărțite și concentrate prin evaporare totativă și apoi la vid pentru a da un solid ceros. Compusul 15 (140 mg, 83 %). ¹H-RMN(300 Mhz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 7,75(d,H=7Hz,1H), 7,45(d,H=7Hz,1H), 7,39(dd,J=7Hz, J=7Hz,2H), 6,45(d,H=5Hz,1H), 5,50(m,1H), 5,40(d,J=2Hz,1H),

5,37(d,J=2Hz,1H), 5,27(m,1H), 5,09(m,1H), 4,82(d,J=3Hz,1H), 4,63(d,H=6Hz,1H),

4,59(dd,J=3Hz,J=7Hz,1 H), 4,39-3,40(m), 3,81(s,3H), 3,19(m,1H),

2,57(dd,J=3Hz,J=10Hz,1H), 2,27-1,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz,J=10Hz,1H),

1,15(t,J=5Hz,3H).

Exem pl u 116. Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-Dgalacto-2-nonulo-piranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-p-D-galactopiranoisil)-( 1,4)-O[(2,3,4-tri-O-benzil-a-L-fucopiranosil)-( 1,3)]-O-(2-benzamido-2-de-oxi-3,6-di-O-acetil-fi-Dglucopiranosil)-( 1-3)-0,2,4,6-tri-O-acetil-p-D-galactopiranosidă (compus 16)

La o soluție sub agitare de 140 mg (0,1 mmoli) compus 15 în 1 ml diclormetan la temperatura camerei sub atmosferă de argon s-au adăugat 100 mg de site moleculare 4 Â uscate la flacără, sub formă de pulbere, 120 ml (1 mmol) tetrametiluree și 218 mg (0,5 mmoli) fluorură de tro-O-benzil-fucozil. După agitare timp de o oră la temperatura camerei, amestecul de reacție a fost răcit la -20°C și tratat cu 95 mg (0,5 mmoli, SnCI₂ și 126 mg (0,5 mmoli) AgAIO₄. Amestecul de reacție a fost apoi încălzit lent la temperatura camerei. După agitare timp de 24 h, analiza TLC în 10:1 CHCI₃:MeOH a indicat consumarea completă a materiei prime și apariția unui produs cu R_f sensibil mai mic. Amestecul de reacție a fost filtrat printr-un strat de celită cu 50 ml de diclormetan și filtratul a fost spălat 2 x 50 ml apă. Soluția organică a fost uscată pe MgSO₄, filtrată și concentrată și cromatografiată rapid pe o coloană de silica gel20 mm x 6 utilizând 10:10:3 EtOAc:hexan:MeOH ca eluent. Fracțiunile care conțin produs (așa cum s-a analizat prin TLC) au fost împărțite și concentrate prin evaporare și apoi supuse la vid înalt cu obținerea unui film alb, pentru a da compus 16 (140 mg, 77 %). ¹H-RMN(300 MHz,δ în ppm referitor la CDCI₃): 7,46(d,H=7Hz,2H), 7,35-7,12(m,18H), 6,45(d,H=6Hz,1H), 3,82(s,3H), 3,20(m,1H),

2,55(dd,J=4Hz,J=12Hz,1H), 1,18(d,J=6Hz,3H), 1,10(t,J=6Hz,3H).

Exem p I u 117. Etil(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulo-piranosilonat)-(2,3)-O-(-[3-D-galactopiranoisil)-( 1,4)-O-[a-L-fucopiranosil)-( 1,3)]-O-(2-benzamido-2deoxi-fi-D-glucopira-nosil)-( 1,3)-O-fi-D-galactopiranosidă (compus 16)

La o soluție sub agitare de 140 mg (77 pmoli) compus 16 în 4 ml metanol au fost adăugate 140 mg (20 % în greutate paladiu) hidroxid de paladiu pe cărbune. Dispersia a fost apoi trecută de 3 ori printr-un ciclu vid/purjă, cu hidrogen gazos și apoi păstrată sub hidrogen la o presiune de o atmosferă la temperatura camerei. După o oră, analiza TLC în 5:1

EtOAc.MeOH a indicat completa dispariție a compusului 16 și apariția unui singur material cu R_f mai mic. Dispersia a fost filtrată printr-un strat de celită cu 50 ml de metanol și concentrată prin evaporare rotativă, la un ulei.

2015

2020

2025

2030

2035

2040

2045

2050

2055

2060

RO 117533 Β1

Acest ulei a fost dizolvat în 5 ml de 4:1 MeOH:H₂O și agitat la temperatura camerei într-un balon acoperit. La soluția agitată s-au adăugat 140 mg (2,6 mmoli) metoxid de sodiu pulbere. După 16 h analiza TLC în 60:50:15 CHCI₃:MeOH:15 mM CaCI₂, a indicat completa dispariție a materiei prime și apariția unui singur produs cu R_f mai mic.

Amestecul a fost tratat cu 1 g rășină schimbătoare de cation de tip Dowex 50 x 8 400 (forma hidrogen, proaspăt spălată cu metanol) și agitat timp de 1 minut. Amestecul a fost filtrat printr-o pâlnie cu frită și filtratul concentrat prin evaporare rotativă la un ulei. Acest material a fost cromatografiat pe o coloană de 40 mm x 8 cu mediu de filtrare gel de tip BioGel P2 (dimensiunea particulelor:fină) utilizând ca eluent 0,1 M bicarbonat de amoniu. Fracțiunile care conțin produs (analizate prin TLC) au fost împărțite și liofilizate la o pulbere albă de compus 17 (60 mg, 72 %). ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 7,70(d,J=7Hz,2H), 7,55(d,H=7Hz,1H), 7,47(dd,J=7Hz, J=7Hz,2H), 5,08(d,J=4Hz,1H), 4,50(d,J=8Hz,1H), 4,27(d,J=8Hz,1H), 4,10(d,J=3Hz,1 H), 4,05-3,40(m), 2,70(dd,J=4,6Hz, J=12,4Hz,1H), 1,97(s,3H), 1,74(dd, J=12,4Hz,J=12,4Hz,1H), 1,10(t,J=7Hz,3H),

1,07(d,J=7Hz,3H).

Exemplul 18. Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-Dgalacto-2-nonulo-piranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-T-D-galactopiranoisil)-( 1,4)-O-[(aL-fucopiranosil)-( 1,3)]-O-(2-2'-naftamido-2-deoxi-3,6-di-O-acetil-p-D-glucopiranosil)-(1,3)-O2,4,6-tri-0-acetil-P-D-galactopiranosidă (compus 29)

La o soluție agitată de 90 mg (48 pmol) compus 25 preparat în mod analog compusului 16, în 15 ml metanol s-au adăugat 40 mg (40 % în greutate) paladiu. Suspensia a fost apoi trecută de 3 ori printr-un ciclu vid/purjă cu hidrogen gaz și păstrat sub hidrogen la presiune de 1 atmosferă la temperatura camerei. După 24 h, analiza TLC în 90:10 CH₂CI₂:MeOH a indicat completa dispariție a compusului 25 și apariția unui singur material cu R_f mai mic. Suspensia a fost filtrată printr-un strat de celită cu 50 ml de metanol și concentrată prin evaporare rotativă, la un solid ceros. Produsul a fost tratat prin cromatografie rapidă pe silica gel utilizând 90:10 CH₂CI₂:MeOH ca eluent. Fracțiunile care conțin produs (analizate prin TLC) au fost apoi împărțite și concentrate pentru a da compusul 29 (55 mg, 72 %) ca un solid ceros alb. ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 8,39 (s,1H), 7,94(d,J=7Hz,2H), 7,82(m,2H), 7,57(m,2H), 7,37 (m, 1H), 5,57-5,41 (m,3H), 5,22(d,H=7Hz,1H), 5,15(m,1H), 4,97-4,39(m), 4,35(d,J=4Hz,2H), 4,19-3,42(m), 3,81(s,3H), 3,23 (m,1H), 2,75(bs,1H), 2,57(dd,J=3Hz,J=10Hz,1H), 2,27-1,85 (12s,36H),

1,77(dd,J=10Hz,J=10Hz,1H), 1,23(d,J=5Hz,3H), 1,05(t,J=5Hz,3H).

Urmând procedurile similare cu cele prezentate mai sus ca și în schema 3 pentru conversia compusului 14 în compușii 15, 16 și 17, au fost de asemenea preparați compușii de la 18-38. Tabelele 1, 2 și 3 de mai jos indică structurile generalizate pentru grupele de compuși care corespund compușilor 15, 16 sau 17 și cuprind alte date pertinente pentru fiecare din acești compuși. Tabelul 1 prezintă agentul de acilare utilizat pentru a prepara fiecare grupă R¹. Tabelele 1-3 sunt urmate de datele RMN și date suplimentare pentru mulți dintre acești compuși și compușii inhibitori 30-38, care includ randamentele ultimelor etape.

RO 117533 Β1

2105

R’ Grup

2110

Compus f

Agent de acilare coo

F

COQ

Randament R< (solvent)

1-48 mg,87% 0.4(90:10 EtOAC’.acetonă)

136 mg,78% 0.43 (90:10 EtOAc:acetonă)

2115

WOj

2120

133 mg, 78%

0.40 (90:10 EtOAc:acetonă)

2125

143 mg, 82%

0.45 (90:10 EtOAc:acetonă)

Compusul #

GUcozil acceptor

Randament

2130

2135

Ri (solvent)

18

I35mg,74% ' 0.35 (92:8 ElOAc:acetonă)

2140

100 mg .58%

0.39 (92:8 E1OAc:acelonă)

105 mg, 65%

037 (92:8 ElOAc:acetonă)

21

100 mg. 58%

0.37 (92:8 EtOAc:acetonâ)

2145

2150

RO 117533 Β1

Tabelul 3

Compusul #

Pentazaharidă benzilată

Randament

R< (solvent)

mg,60%

0.32 (90:10 CH₂CI₂:MeOH) mg,50% 0.39 (90:10 CH₂CI₂:MeOH)

Exemplul 19. Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-Dgalacto-2-nonulo-piranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-fi-D-galactopiranoisil)-( 1,4)-0-( 2benziloxicarbonilamido-2-deoxi-6-O-acetil-p-D-glucopiranosil)-( 1,3)-0-2,4,6-tri-O-acetil-p-Dgalactopiranosidă (compus 39)

O soluție de 1,2 ml (8,4 mmoli) de clorură de benziloxicarbonil (CBZ-CI) în 2,0 ml CH₂CI₂ a fost adăugată în picături la un amestec de 10,8 g (8,3 mmoli) compus 14 a și 1,41 g (16,6 mmoli) în 100 ml CH₂CI₂ și amestecul de reacție a fost agitat peste noapte (timp de 18 h ). La acest amestec au fost adăugate 1,4 g (16,6 mmoli) de NaHCO₃ și 1,2 ml (8,4 mmoli) CBZ-CI și amestecul rezultat a fost agitat încă 4 h. Amestecul rezultat a fost diluat cu AcOEt, spălat cu apă, uscat pe MgSO₄, filtrat și concentrat. Reziduul a fost cromatografiat pe silica gel pentru a da compusul 39 (7,75 g, 65 %) cu un solid alb.

Exemplul 20. Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-Dgalacto-2-nonulo-piranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acetil-P-D-galactopiranoisil)-( 1,4)-O(1,4)-O[2,3,4-tri-O-benzil-a-L-fucopiranosil)-( 1,3)]-O-(2-benziloxi-carbonilamido-2-deoxi-3,6di-O-acetil-l3-D-gluco-piranosil)-( 1,3)-0-2,4,6-tri-O-acetil-[3-D-galactopiranosidă (compus 40)

La o soluție de 3,90 g (2,72 mmoli) compus 39 în 100 ml de CICH₂CH₂CI s-au adăugat 12 g de site moleculare 4 Â sub formă de pulbere, 3,25 ml (27,2 moli) tetrametil uree (TMU) și fluorură de 2,3,4-tri-O-benzil-L-fucozil (CMH-048, 5,94 g, 13,6 mmoli). După agitare timp de 90 de min la temperatura camerei, amestecul a fost protejat de lumină, răcit la -20°C și tratat cu 2,59 g (13,6 mmoli) SnCI₂ și 2,88 g (13,6 mmoli) de AgCIO₄ 98 %. Amestecul de reacție a fost lăsat să se încălzească la temperatura camerei pe o perioadă de 90 min și agitată timp de 24 h. în scopul completării reacției s-au adăugat din nou 1,95 ml (16,3 mmoli) TMU, 3,56 g (8,16 mmoli) CMH-048, 1,55 g (8,17 mmoli) SnCI₂ și 1,73 g (8,17 mmoli) AgCIO₄ la 0°5 C și apoi s-a lăsat să crească ușor temperatura până la temperatura camerei. După 48 h, amestecul care rezultă a fost filtrat printr-un strat de celită și filtratul a fost spălat cu apă. Faza organică a fost uscată pe Na₂SO₄, filtrat, concentrat și cromatografiat pe silica gel (Hexan:AcOEt:MeOH=10/10/2) pentru a obține compusul 40 (3,65 g 73 %) și recuperat materia primă, compusul 39 (672 mg, 17%).

RO 117533 Β1

Exemplul21. Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-Dgalacto-2-nonulo-piranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-fi-D-galactopiranoisil)-( 1,4)-O-[(aL-fucopiranosil)-( 1,3)]-O-(2-amido-2-deoxi-3,6-di-O-acetil-(3-D-glucopiranosil)-( 1,3)-0-2,4,6tri-O-acetil^-D-galactopiranosidă (compus 41)

Amestecul format din 3,06 g (1,66 mmoli) compus 40,1,05 g (16,5 mmoli) HCOONH₄ și 3,0 g Pd/C 10 % umed în 80 ml EtOH s-a refluxat cu agitare timp de 9,5 h. La acest amestec a fost adăugat mai mult de 1,05 g (16,6 mmoli) HCOONH₄ și 3,0 g (Pd/C 10 % și amestecul rezultat a fost refluxat încă 11 h. Amestecul care rezultă a fost filtrat printr-un strat de celită și concentrat pentru a obține compusul 41 (2,30 g, 96 % randament) sub forma unui solid alb.

Exemplul22. Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-Dgalacto-2-nonulo-piranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-^D-galactopiranoisil)-( 1,4)-O-[(aL-fucopiranosil)-( 1,3)]-O-[2-(3,5-diclorbenzoilamido-2-deoxi-3,6-di-O-acetil-p-Dglucopiranozil)]-( 1,3)-0-2,4,6-tri-O-acetil-P-D-galactopiranosidă (compus 42)

La o soluție de 40 mg (0,028 mmoli) compus 41, în 8,9 ml CH₂CI₂ s-au adăugat 46 mg (0,54 moli) de NaHCO₃ și 58,6 mg (0,28 mmoli) clorură de 3,5-diclorbenzoil. După 2 h la temperatura camerei, amestecul de reacție s-a diluat cu EtOAc și s-a spălat cu H₂O. Faza organică a fost uscată pe MgSO₄ filtrată și evaporată pentru a rezulta compusul 42 brut (98,4 g) ca un ulei galben pal.

Exemplul 23. Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-Dgalacto-2-nonulo-piranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-[3-D-galactopiranoisil)-( 1,4)-O-[(aL-fucopiranosil)-( 1,3)]-O-[2-(3,5-diclorbenzamido-2-deoxi-3,6-di-O-acetil-fi-D-glucopiranosil)- (1,3)-0-2,4,6-tri-O-acetil-p-D-galactopiranosidă (compus 43)

La o soluție 98,4 mg compus 42 brut în 8,9 ml MeOH s-au adăugat 300 ml NaOMeMeOH de concentrație 28 %. După 48 h la temperatura camerei amestecul a fost neutralizat cu DOWEX 50W-X8 (forma H^?) și filtrat. Filtratul a fost concentrat, diluat cu EtOAc și extras cu H₂O. Faza apoasă a fost evaporată pentru a da esterul corespunzător. Esterul a fost tratat cu 200 pl NaOH 1N în 5,0 ml H₂O. Amestecul a fost agitat timp de 12 h la temperatura camerei, neutralizat cu DOWEX 50W-X8 (forma H^?) și filtrat. Filtratul a fost concentrat, purificat prin filtrare pe gel (p-2) cu apă drept eluent și liofilizat pentru a obține compusul 43 (31,6 mg, randament cantitativ) sub formă de pudră albă.

¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,61 (s,3H), 5,00(d,J=3,96Hz,1H), 4,47(d,H=7,59Hz,1H), 4,26(d,J=7,92Hz,1H), 4,09(d,J=2,97Hz,1H), 4,04-3,30(m),

2,67(m,1H), 1,94(s,3H), 1,72(t,J=11,88Hz,1H), 1,09(m,6H).

Date RMN ale compușilor 18-28

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-0-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranosil)-(1,4)-O-(2-pfluorobenzamido-2-deoxi-6-0-acetil-3-D-glucopiranosil)-(1,3)-0-2,4,6-tri-O-acetil-p-Dgalactopiranosidă (compus 18) ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 7,79(m,2H), 7,15(m,2H), 6,41(d,J=5Hz,1H), 5,53(m,1H), 5,42(m,1H), 5,23 (d,J=7Hz,1H), 5,17(m,2H), 4,89(d,J=3Hz,1H), 4,63(d,J=6Hz,1H), 4,59(dd,J=3Hz,J=7Hz,1H), 4,42-3,40(s,3H), 3,19(m,1H),2,57 (dd,J=3Hz,J=10Hz,1H),2,27-1,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz, J=10Hz,3H), 1,15(t,J=5Hz,3H).

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-p-D-galactopiranosil)-(1,4)-O-(2-pnitrobenzamido-2-deoxi-6-0-acetil^-D-glucopiranosil)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetil-p-Dgalactopiranosidă (compus 19)

2205

2210

2215

2220

2225

2230

2235

2240

2245

2250

RO 117533 Β1 ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 8,22(d, J=8Hz,2H),

7,95(d,J=8Hz,2H), 6,81(d,J=5Hz,1H), 5,59-5,37(m, 2H), 5,21 (d,J=4Hz,1H), 5,11(m,2H),

4,89(d,J=2Hz,1H), 4,63(d, J=5Hz,1H), 4,59(dd,J=1Hz,J=7Hz,1 H), 4,42-3,40(m), 3,79(s,3H),

3,19(m,1H), 2,57(dd,J=3Hz,J=10Hz,1H), 2,27-1,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz, J=10Hz,3H),

1,15(t,J=5Hz,3H).

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-0-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acetil-Ș-D-galactopiranosil)-(1,4)-0-[2-(E-1-oxo -3fenilprop-2-enă)amino-2-deoxi-6-0-acetil-P-D-glucopirano-sil]-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetil-Ș-Dgalactopiranosidă (compus 20) ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 7,57(d, J=11Hz,1H), 7,457,25(m,5H), 6,39(d,J=11Hz,1H), 5,87(d, J=4Hz,1H), 5,45(m,1H), 5,39(m,2H), 5,21 (t,J=7Hz,1H), 5,17-4,97(m,2H), 4,89(d,J=2Hz,1H), 4,63(d,J=5Hz,1H), 4,59(dd,J=1Hz, J=7Hz,1H), 4,42-3,40(m), 3,79(s,1H), 3,05(m,1H), 2,57 (dd, J=3Hz,J=10Hz,1H), 2,271,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz, J=10Hz, 3H), 1,15(t,J=5Hz,3H).

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranosil)-(1,4)-0-(2-2'-naftamido2-deoxi-6-O-acetil-p-D-glucopiranosil)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetil-P-D-galactopiranosidă (compus 21) ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 8,25(s,1H), 7,95-7,42(m,6H), 6,58(d,J=5Hz,1H), 5,53(m,1H), 5,44 (d,J=2Hz,1H), 5,41-5,23(m), 5,17-5,01(m),

4,89(d,J=3Hz,1H), 4,63(d,J=6Hz,1H), 4,59(dd,J=3Hz,J=7Hz,1H), 4,42-3,40(m), 3,81 (s,3H), 3,27(m,1H), 2,57(d,J=3Hz,J=10Hz,1H), 2,27-1,85 (12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz, J=10Hz,3H), 1,15(t,J=5Hz,3H).

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acetil-P-D-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(2,3,4-tri-0benzil-a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-O-(2-p-fluorobenzamido-2-deoxi-3,6-di-O-acetil-3-Dglucopiranosil)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranosidă (compus 22) ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 7,42(m,2H), 7,39-7,17(m,15H), 6,95(t,J=7Hz,2H), 6,45(d,J=5Hz,1H), 5,57-5,37(m,3H), 5,27 (d,J=7Hz,1H), 5,17-5,45(m), 4,39(d,J=7Hz,1H), 4,25-3,41 (m), 3,81(s,3H), 3,21(m,1H), 2,57(dd,J=3Hz, J=10Hz,1H), 2,271,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz, J=10Hz,1H), 1,19(d,J=5Hz,3H), 1,15(t,J=5Hz,3H).

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-0-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranosil)-(1,4)-0-((2,3,4-tri-Obenzil-a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-(2-p-nitrobenzamido-2-deoxi-3,6-di-0-acetil-P-Dglucopiranosil)-(1,3)-0-2,4,6-tri-O-acetil-Ș-D-galactopiranosidă (compus 23) ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 8,15(d,J=8Hz,2H), 7,55(d,J=8Hz,2H), 7,41-7,15(m,15H), 6,63(d,J=5Hz,1H), 5,48(m,1H), 5,43(dd,J=6Hz,J=2Hz,1H), 5,37 (d,J=6Hz,1H), 5,19(d,J=8Hz,1H), 5,15-4,45(m), 4,42 (t,J=4Hz,1H), 4,25(m,2H), 4,183,40(m), 3,82(s,3H), 3,25(m,1H), 2,59(dd,J=3Hz,J=10Hz,1H), 2,27-1,85(12s,36H),

1,77(dd, J=10Hz, J=10Hz,3H), 1,15(t, J=5Hz,3H).

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-0-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-3-D-galactopiranosil)-(1,4)-0-((2,3,4-tri-Obenzil-a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-[(E-1-oxo-3-fenilprop-2-enă)amino-2-deoxi-3,6-di-0-acetil8-D-glucopiranosil]-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranosidă (compus 24) ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 7,42(d,J=11Hz,1H), 7,397,15(m,20H), 5,94(d,J=11Hz,1H), 5,85(d,J=4Hz,1H), 5,55-5,29(m,4H), 5,17-4,42(m),

4,25(m,2H), 4,17-3,40(m), 3,79(s,3H), 3,05(m,1H), 2,57(dd,J=3Hz, J=10Hz,1H), 2,271,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz,J=10Hz,3H), 1,19(d,J=5Hz,3H), 1,15(t,J=5Hz,3H).

RO 117533 Β1

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-0-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acetil^-D-galactopiranosil)-(1,4)-0-[2,3,4-tri-Obenzil-a-L-fucopiranosil-(1,3)]-0-(2-2'-naftamido-2-deoxi-3,6-di-0-acetil-p-D-glucopiranosil)- (1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranosidă (compus 25) ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 8,13(s,1H), 7,84(d,J=7Hz,1H), 7,78(d,J=7Hz, 1H), 7,57(m,2H), 7,37-7,1 (m, 16H), 6,98(d,J=7Hz, 1H), 6,65(d,J=5Hz, 1H), 5,575,35(m,2H), 5,22(d,J=7Hz,1H), 5,15-5,01 (m,3H), 4,97-4,45(m), 4,25(m,2H), 4,19-3,42(m), 3,81(s,3H), 3,23(m,1H), 2,57 (d,J=3Hz,J=10Hz,1H), 2,27-1,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz, J=10Hz,3H), 1,19(d,J=5Hz,3H), 1,05(t, J=5Hz,3H).

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-0-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-3-D-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-Lfucopiranosil)-(1,3)]-0-(2-p-fluorobenzamido-2-deoxi- 3,6-di-0-acetil-8-D-glucopiranosil)- (1.3) -0-2,4,6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranosidă (compus 26) ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 7,83(m,2H), 7,17(m,2H), 5,45(m,1H), 6,40(m,2H), 5,23 (d,J=5Hz,1H), 5,17-4,75(m,3H), 4,77-4,45(m,4H9, 4,36(m,2H), 4,193,41(m), 3,81 (s,3H), 3,09(bs,1H), 2,62(m,1H), 2,57(dd,J=3Hz, J=10Hz,1H), 2,271,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz,J=10Hz,1H), 1,24 (d,J=5Hz,3H), 1,15(t,J=5Hz,3H).

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-p-D-galactopiranosil)-(1,4)-O-[(a-Lfucopiranosil)-(1,3)]-0-(2-p-aminobenzamido-2-deoxi- 3,6-di-O-acetil-p-D-glucopiranosil)- (1.3) -0-2,4,6-tri-O-acetil-Ș-D-galactopiranosidă (compus 27) ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 7,61 (d, J=8Hz,2H), 6,75(d,J=5Hz,1H), 6,57(d,J=8Hz,2H), 5,57(m,1H), 5,43(dd,J=6Hz,J=2Hz,1H),

5,27(d,J=2Hz,1H), 5,19 (d,J=8Hz,1H), 5,09(m,1H), 4,95(m,2H), 4,77-4,63(m),

4,55(dd,J=7Hz,J=1Hz,1H), 4,42(t,J=4Hz,1H), 4,35(m,2H), 4,21-3,38(m), 3,82 (s,3H), 3,17 (m,1H), 2,95(bs,1H), 2,59(dd,J=3Hz,J=10Hz,1H), 2,42(bs,1H), 2,27-1,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz, J=10Hz,1H), 1,22(d, J=5Hz,3H), 1,15(t,J=5Hz,3H).

Etil[metil-(5-acetamido-3,5-dideoxi-4,7,8,9-tetra-O-acetil-a-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosilonat)]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-O-acetil-Ș-D-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-Lfucopiranosil)-(1,3)]-0-[2-(3'-fenil)-propionamido-2-deoxi-3,6-di-0-acetil-p-D-glucopiranosil)- (1.3) -0-2,4,6-tri-O-acetil-3-D-galactopiranosidă (compus 28) ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la CDCI₃): 7,29(m,5H), 6,39(d,J=2Hz,1H), 5,85 (d,J=4Hz,1H), 5,55-5,19(m,5H), 5,11 (t,J=5Hz,1H), 4,95(m,4H), 4,71-4,35(m), 4,17-3,22(m), 3,79 (s, 3H), 2,95(t,J=3Hz,2H), 2,57(dd,J=3Hz,J=10Hz,1H), 2,47 (t, J=3Hz,2H), 2,271,85(12s,36H), 1,77(dd,J=10Hz,J=10Hz,1H), 1,24 (d,J=5Hz,3H), 1,15(t,J=5Hz,3H).

Date pentru compușii 30-38

Etil[5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(PD-galactopiranosil)-(1,4)-O-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-(2-p-fluorobenzamido-2-deoxi- β-Dglucopiranosil)-(1,3)-O-p-D-galactopiranosidă (compus 30)

Rf = 0,62(3:1 i-PrOH:NH₄OAc), solid alb, 41 mg, 96 %.

¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,83(m,2H, aromatic), 7,25(m,2H, aromatic), 5,18(d,J=5Hz,H-1(fuc),1H), 4,95(m), 4,56(d,J=8Hz,1H), 4,37(d,J=8Hz,1H), 4,19(d,J=3, 5Hz,1H), 4,15-3,42(m), 2,77(dd,J=3Hz,J=10Hz,1H), 2,05(s,3H, NAc), 1,79(dd,J=10Hz,J=10Hz,1H), 1,19(m,3H).

Etil[5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(pD-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-(2-p-aminobenzamido-2-deoxi- β-Dglucopiranosil)-(1,3)-O^-D-galactopiranosidă (compus 31)

Rf = 0,52(3:1 i-PrOH:NH₄OAc), solid alb, 26 mg, 96 %.

2300

2305

2310

2315

2320

2325

2330

2335

2340

2345

RO 117533 Β1 ¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,65(d,J=9Hz,2H,aromatic),

6,82(d, J=9Hz,2H), 5,19(d, J=3Hz,H-1 -fuc, 1H), 4,95(m), 4,59(d, J=8Hz, 1H), 4,38(d, J=8Hz, 1H),

4,19(d,J=2Hz,1H), 4,15-3,42(m), 3,19(q,J=6Hz,2H,CH₂CH₃), 2,79 (dd,J=3Hz,J=11Hz,H_eq3(sialic acid),1H), 2,05(s,3H, NAc), 1,77(dd,J=10Hz,J=10Hz,H_ax-3(sialic acid),1H),

1,19(d, J=6Hz, 3H,H-6-fuc), 1,17(t,J=6Hz,3H).

Etil[5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(pD-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-(2-(3'-fenil)-propionamido-2-deoxi-pD-glucopiranosil)-(1,3)-0-p-D-galactopiranosidă (compus 32)

R_f = 0,62(3:1 i-PrOH:NH₄OAc), solid alb, 47 mg, 98 %.

¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,42-7,25 (m,5H), 5,19(d,J=4Hz,H-1fuc,1H), 4,95(m), 4,57(d, J=8Hz,1H), 4,38(d,J=8Hz,1H), 4,13(d,J=2Hz,1H), 4,11-3,42(m), 2,95(t, J=5Hz,2H,a-CH₃), 2,75(dd,J=3Hz,J=10Hz,H_eq-3(sialic acid), 1H),

2,63(t,J=5Hz,2H,CH₂Ph), 2,05(s,3H,NAc), 1,80(dd,J=10Hz, J=10Hz,H_ax-3(sialic acid),1H), 1,24(t,J=5Hz,3H), 1,18(d,J=5Hz, 3H).

Etil[5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(PD-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-(2,2'-naftamido-2-deoxi-P-Dglucopiranosil)-(1,3)-0-p-D-galactopiranosidă (compus 33)

R_f = 0,52(3:1 i-PrOH:NH₄OAc), solid alb, 35 mg, 96 %.

¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 8,39(s, aromatic,1H), 8,02(m,aromatic,2H), 7,82(d,J=7Hz, aromatic,1H), 7,63(m,aromatic,3H), 5,19(d,J=4Hz,H-1fuc,1H), 4,95(m), 4,57 (d,J=8Hz,1H), 4,35(d,J=8Hz,1H), 4,19(d,J=2Hz,1H), 4,15-3,42 (m), 2,77(dd,J=3Hz,J=11Hz,H_eq-3(sialicacid),1H), 2,05(s,3H, NAc), 1,77(dd,J=10Hz,J=10Hz,H_ax3(sialic acid),1H), 1,19(d, J=6Hz,3H,H-6-fuc), 1,05(t,J=6Hz,3H).

Etil[(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(PD-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)-0-(2,2'-fenilacetamido-2-deoxi- p-Dglucopiranosil)-(1,3)-0-p-D-galactopiranosidă (compus 34)

R_f = 0,62(4,5:1 i-PrOH:NH₄OAc), solid alb, 24 mg, 68 %.

¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,45-7,27(m,5H), 4,85(d,J=3Hz,H-1fuc,1H), 4,75(m), 4,55(d,J=8Hz, 1H), 4,38(d,J=8Hz,1H), 4,13(d,J=2Hz,1H), 4,09-3,42(m), 2,78(dd,J=3Hz,J=10Hz,H_eq-3(sialic acid),1H), 2,05(2s, 5H,Nac, PhCH₂), 1,80(dd,J=10Hz,J=10Hz,H_ax-3(sialic acid),1H), 1,24(t, J=5Hz,3H), 1,18(d,J=5Hz,3H).

Etil[(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiraoosilooat]-(2,3)-0-(PD-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-(2-p-metoxibenzamido-2-deoxi-p-Dglucopiranosil)-(1,3)-0-p-D-galactopiranosidă (compus 35)

R_f = 0,52(3:1 i-PrOH:NH₄OAc), solid alb, 46 mg, 90 %.

¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,75(d,J=9Hz,2H,aromatic), 7,05(d, J=9Hz,2H), 5,11 (d, J=3Hz,H-1 -fuc, 1H), 4,95(m), 4,52(d, J=8Hz, 1H), 4,25(d, J=8Hz, 1H), 4,19(d, J=2Hz,1H), 4,15-3,39(m), 3,82(s,3H,OCH₃), 2,75(dd,J=3Hz, J=11Hz,H_eq-3(sialic acid),1H), 1,99(s,3H, NAc), 1,77(dd,J=10Hz, J=10Hz,H_ax-3(sialic acid),1H), 1,17(m,5H,H-6fuc,CH₂CH₃).

Etil[(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-O-(PD-galactopiranosil)-(1,4)-O-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-O-(2-p-terț-butilbenzamido-2-deoxi-pD-glucopiranosil)-(1,3)-0-p-D-galactopiranosidă (compus 36)

Rf = 0,52(3:1 i-PrOH:NH₄OAc), solid alb, 46 mg, 90 %.

¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,65 (d,J=9Hz,2H,aromatic),

7,58(d,J=9Hz,2H), 5,19(d,J=4Hz,H-1-fuc, 1H), 4,95(m), 4,57(d,J=8Hz,1H),

4,38(d,J=8Hz,1H), 4,19(d, J=2Hz,1H), 4,15-3,39(m), 2,73(dd,J=3Hz,J=11Hz,H_eq-3(sialic acid),1H), 2,05(s,3H, NAc), 1,77(dd,J=10Hz,J=10Hz,H_ax-3(sialic acid),1H), 1,24(s,9H,’-Bu),

1,17(m,5H, H-6-fuc,CH₂CH₃).

RO 117533 Β1 (5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat)-(2,3)-0-(P-Dgalactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-(2-benzamido-2-deoxi-3-Dglucopiranosil)-(1,3)-0-p-D-galactopiranosidă (compus 37)

R_f = 0,52(3:1 i-PrOH:NH₄OAc), solid alb, 26 mg, 96 %.

¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 1,15(3H,d, J=6Hz,CH₃ de fuc), 1,81(1H,t,J=10,4Hz,H-3a de NANA), 2,02(3H, s,CH₃CONH), 2,78(1 H,dd,J=10,4Hz,H-3 e de NANA), 3,5-4,2(m), 4,4-4,8(m), 5,09-5,16(d,d,H-1 de FUC.B), 5,2(d,J=3,4Hz, H-1), 7,57,8(5H,aromatic).

Benzil(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat)-(2,3)-0(p-D-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-(2-benzamido-2-deoxi-p-Dglucopiranosil)-(1,3)-0-p-D-galactopiranosidă (compus 38).

¹H-RMN(300 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 1,08 (3H,d,J=6,4Hz,CH₃ de Fuc), 1,76(1H,t,J=10,4Hz,H-3a de NANA), 1,97(3H,s,CH₃CONH), 2,7(1 H,dd,J=10,4Hz,H-3 e de NANA), 3,4-4,2(m), 4,4-4,8(m), 4,5(1 H,dJ=7,7Hz), 4,6(1 H,d,J=8,0Hz), 5,02(d,J=3,8Hz,H-1 de FUC), 7,1-7,8(1 OH,Aromatic).

Date RMN pentru compușii 44-49

Etil[(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(3D-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-[2-(3,4-diclorbenzamido)-2-deoxi-pD-glucopiranosil]-(1,3)-0-Ș-D-galactopiranosidă (compus 44) ¹H-RMN(270 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,82(s,1H), 7,5(m,2H), 5,99(d,J=3,96Hz,1H), 4,47(d,J=7,59Hz,1H), 4,25(d, J=7,91Hz,1H), 4,15-3,22(m),

2,66(dd,J=12,54Hz,J=3,96Hz,1H), 1,94(s,3H), 1,76(t,J=12,54Hz,1H), 1,0(m,6H).

Etil[(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(pD-galactopiranosil)-(1,4)-O-[(a-L-fucopiranosil)]-(1,3)-O-(2-furanamido-2-deoxi-Ș-Dglucopiranosil)-(1,3)-O-p-D-galactopiranosidă (compus 45) ¹H-RMN(270 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,59(d, J=1,98Hz,1H), 7,10(d,J=3,63Hz,1H), 6,54(dd,J=3,36Hz, J=1,98Hz, 1H), 5,05(d,J=4,29Hz,1H),

4,46(d,J=7,59Hz,1H), 4,23(d, J=7,92Hz,1H), 4,06(d,J=2,97Hz,1H), 4,02-3,32(m), 2,68(dd, J=12,87Hz,J=3,96,1H), 1,95(s,3H), 1,77(t,J=12,87Hz,1H), 1,08(m,6H).

Etil[(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(pD-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)]-(1,3)]-0-(2-tiofenamido-2-deoxi-Ș-Dglucopiranosil)-(1,3)-0-P-D-galactopiranosidă (compus 46) ¹H-RMN(270 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,63(m,2H), 7,10(m,1H), 5,83(d,J=3,63Hz,1H), 4,46(d,J=7,92Hz,1H), 4,23(d, J=7,92Hz,1H), 4,06(d,J=3,30Hz,1H), 4,04-3,30(m), 2,67(dd, J=12,21Hz,J=3,96,1H), 1,94(s,3H), 1,73(t,J=12,21Hz,1H),

1,07(m,6H).

Etil[(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(PD-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)]-(1,3)]-0-[2-(2-tiometil)nicotiamido-2-deoxi-ȘD-glucopiranosil]-(1,3)-O-Ș-D-galactopiranosidă (compus 48) ¹H-RMN(270 MHz, δ în ppm referitor la H₂O): 7,62(m,2H), 7,06(m,1H), 5,04(d,J=3,96Hz,1H), 4,43(d,J=7,59Hz,1H), 4,23(d, J=7,92Hz,1H), 4,10-3,20(m),

2,68(m,1H), 2,14(s,3H), 2,09(s,3H), 1,70(m,1H), 1,05(m,6H).

Etil[(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(PD-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)]-(1,3)]-0-[2-(6-dodeciloxi-2-naftamido)-2deoxi-P-D-glucopiranosil)-(1,3)-0-p-D-galactopiranosidă (compus 47) ¹H-RMN(270 MHz, δ în ppm referitor la CH₂OH): 8,32(s,1H), 7,90-7,78(m,3H), 7,267,16(m,2H), 5,17-5,13(m,1H), 4,48-4,40(m,1H), 4,22-3,32(m), 2,88-2,82(m,1H), 2,01 (s,3H), 1,85-1,19(m), 0,91-0,85(m,3H).

2400

2405

2410

2415

2420

2425

2430

2435

2440

RO 117533 Β1

Etil[(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-(PD-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)]-(1,3)-0-(2-m-butiloxibenzamido)-2-deoxi-8D-glucopiranosil)-(1,3)-0^-D-galactopiranosidă (compus 49) ¹H-RMN(270 MHz, δ în ppm referitor la H₂O):7,39-7,22 (m,3H), 7,13-7,09(m,1H), 5,03(d,J=3,96Hz,1H), 4,46(d,J=7,92Hz, 1H), 4,23(d,J=7,92Hz,1H), 4,07-3,34(m), 2,682,64(m,1H), 1,93(s,3H), 1,74-1,62(m,3H), 1,30-1,44(m,2H), 1,07(t,J=7,25Hz, 3H), 1,06(d,J=5,60Hz,3H),0,84(t,J=7,58Hz,3H).

Date pentru compușii 50 și 51

Etil[(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)-0-$D-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)]-0-(2-nicotinamido-2-deoxi-8-Dglucopiranosil)-(1,3)-0^-D-galactopiranosidă (compus 50)

Rf = 0,22(silice, izo-propanol/1M:NH₄OAc).

¹H-RMN(300 MHz, D₂): 1,13(d,3H,J=6,6Hz,CH₃fuc), 1,15(t, 3H,J=6,7Hz,OCH₂CH₃), 1,78(t,1H,J=11,9Hz,H-3a NANA), 3,41 -4,33(plicuri multiple,34H), 4,31(d,1H,J=8,1HzJ3anomer Gal), 4,53(d,1H,J=8,0Hz,B-anomer Gal), 5,10(d,1H,J=3,7Hz,a-anomer Fuc), 7,56(m,1H,H-5 piridil), 8,16(dd, 1H,J=1,3, 8,1Hz,H-4 piridil), 8,68(m,1H,H-6 piridil), 8,85(s,1 Η,Η-2 piridil).

Etil[sodiu(5-acetamido-3,5-dideoxi-a-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosilonat]-(2,3)0-(8-D-galactopiranosil)-(1,4)-0-[(a-L-fucopiranosil)-(1,3)-0-]-(2-benzensulfonamido-2deoxi^-D-glucopiranosidă)^-D-galactopiranosidă (compus 51)

R_f = 0,28(silice, 20% 1M NH₄OAc/izopropanol).

¹H-RMN(300 MHz D₂O, ppm referitor la H₂O): 7,92(d,J=7,4Hz, 2H),

7,69(d,J=7,2Hz,1H), 7,60(t,J=7,2Hz,1H), 5,47(d,J=3,96Hz, 1H), 4,62(d,J=8,1Hz,1H), 4,51(d,J=7,6Hz,1H), 4,24(d,J=8,0Hz, 1H), 4,07(dd,J=3,1, 9,6Hz,1H), 3,99(d,J=3,1Hz,1H), 3,96-3,46 (m,29H), 2,75(dd,J=4,6, 12,6Hz,1H), 2,68(dd,J=8,1, 8,1Hz1H), 2,02(s,3H), 1,78(t,J=12,1Hz,1H), 1,20(t,3H), 1,16(t,J=6,5Hz, 3H).

Teste de legare celulară

Un test de legare celulară a unui E-selectin/HL-60 recombinat modificat solubil s-a realizat pentru a da o metodă simplă și foarte ușor de reprodus cu care să se compare potențialul de blocare E-selectin al analogilor oligozaharidei ai sialil Lewis X. în acest test, E-selectin recombinat solubil (rELAM) este legat la suprafața plastică a unei plăcuțe ELISA cu 96 de locuri pentru probe. Diluții ale compușilor analogici SLe^x de testat sunt adăugate în locurile pentru probă, urmate de celulele HL-60 care transportă ligandul pentru E-selectin. Celulelor li se permite să adere la plăcuța acoperită cu E-selectin și celulele neaderente sunt îndepărtate prin spălarea plăcuței cu un spălător automat de plăcuțe. Celulele legate sunt determinate cantitativ prin măsurarea enzimei celulare mieloperoxidază. Concentrația oligozaharidelor testate necesară pentru a realiza în proporție de 50 % inhibiția adeziunii este folosită pentru a compara eficiența analogilor. Eficacitatea folosirii unei porțiuni de ELAM-1 similar legat, recombinat, solubil, ca substrat pentru legarea HL-60 și a altor celule care se leagă de celule conținând receptorul ELAM-1 (E-selectin) a fost demonstrată de Lobb et al.J.lmmunol. 147:124-129 (1991).

Materiale și metode

Materiale

Plăcuță ELISA, Immunolon 2 (Dynatec Labotatories)(Fischer 14-245-G1)

Unități de filtru 0,2 m (Nalgene # 150-0020).

rELAM(ELAM-1 recombinat modificat) purificat, cu o afinitate mai mare, preparat după cum urmează. Fiecare probă de rELAm a fost testată funcțional pentru a determina concentrația adecvată pentru utilizarea în teste. O probă a fost titrată într-un interval de

RO 117533 Β1

1-5 pg/ml folosind inhibarea de către compusul Z (descris în cele ce urmează) ca standard. Mici părți alicote au fost apoi preparate, au fost înghețate repede și apoi uscate pe o baie de gheață-acetonă și au fost depozitate la -70°C.

Fiecare parte alicotă a fost descrisă numai o singură dată și apoi au fost îndepărtate sau păstrate pentru utilizarea în alte tipuri de teste.

Forma solubilă a E-selectin (rELAM sau sol-E-selectin) folosită aici a fost prelucrată prin ștergerea domeniului transmembranei din ADNc. Acest ADNc recombinat a fost donat într-un vector pCDNA 1 de expresie la un mamifer (un derivat al pCDM8; Sud, Nature 329: 840 (1987)) care conține promotorul virusului uman imunodeficitar/citomegalovirusului himeric. Când se introduce într-o linie celulară 293 de adenovirus transformat din rinichiul uman, expresia promotorului CMV este activată în mod eficient de către produsele genei E1 printr-un mecanism care nu a fost încă în întregime elucidat. Construcția pCDNA 1 - sol-Eselectin a fost introdusă prin intermediul unui transfer de gene mediat de fosfat de calciu în celulele 293 și a fost generată o linie celulară stabilă exprimând nivele înalte de sol-Eselectin. Sol-E-selectin produs de aceste celule a fost purificat prin cromatografie de imunoafinitate pe o coloană de Sepharoză de Proteină-A de anticorp monoclonal anti-Eselectin.

Mai specific, linia celulară 293 de adenovirus transformat din rinichiul uman s-a obținut din ATCC (CRL-1573). Celulele 293 au fost crescute ca culturi aderente în DMEM, obținut din Whittaker Bioproducts (Walkersville, MD), suplimentat cu 10 procente de serfetal de bovină (FBS), obținut din JRH Biochemical (Lenexa KS).

Plasmidul pCDNA 1, un derivat al pCDM8 (Seed, Nature, 339: 840 (1987)), a fost obținut din Invitrogen (San Diego, CA). Plasmidul pBluescript II a fost obținut din Stratagen San Diego, CA). Plasmidul pSV2-neo (Southern et al., J.Mol.AppI.Gen.. Ț 327 (1982)) conține gene de E.coli care codifică gena aminoglicozid 3'-fosfotransferazei. Când pSV2-neo este introdus în celule de mamifer, celulele transfectate manifestă rezistență la antibiticul G418.

Un fragment de 1,67 Kbp de ADN codificând o genă structurală din E-selectin a fost izolat prin amplificarea reacției catenei de polimerază (PCR) a ADNc derivat din ARN mesager care s-a izolat din celulele endoteliale IL-1 activate uman. 5'-Amplimerul a inserat un situs unic Cla 1 de restricție de 28 nucleotide în sus din codonul de inițiere al genei structurale a E-selectin. 3'-Amplimerul a inserat codonul de terminație TGA supă aminoacidul cu numărul 527 al E-selectin-matur, urmat de un situs unic Xhol de restricție. Capătul carboxi al sol-E-selectin este localizat la capătul carboxi al elementului care se repetă a șasea oară, prin aceasta ștergând domeniul transmembranei. Fragmentul de 1,67 Kbp de PCR a fost codigerat cu endonucleazele de restricție Cla 1 și Xho și a fost subclonat în situsurile de restricție Cla 1 și Xho ale vectorului de donare pBluescript II, ducând la un vector pBSII-solE-selectin. Sol-E-selectin are 527 aminoacizi lungime și conține 11 situsuri de N-glicolizare potențiale.

Un fragment de 1,67 Kbp de ADN conținând sol-E-selectin ADNc a fost izolat din pBSII-sol-E-selectin și a fost subclonat în situsurile EcoRV și Xho 1 ale vectorului de expresie pCDNA 1, prin aceasta ducând la un vector pCDNA 1-sol-E-selectin.

PCDNA1 -sol-E-selectin a fost cotransferat cu pSV2-neo prin tehnica fosfatului de calciu (Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual. W.H.Freeman, New

York, N.Y.(1991) în celule 293. La 48 h după transfecție, celulele 293 transfectate au fost tripsinizate și glacate în DMEM, 10 procente FBS și 600 mg/ml de G418 (Geneticin, Sigma).

Mediul de selecție a fost schimabt la fiecare trei zile până ce s-a format o populație stabilă rezistentă la G418.

2495

2500

2505

2510

2515

2520

2525

2530

2535

2540

RO 117533 Β1

Clone singulare de celule rezistente la G418 au fost izolate prin cilindrii de clonare.

Clonele izolate au fost probate pentru sinteza sol-E-selectinei prin testul imunosorbent de legare a enzimelor (ELISA) folosind anticorpul monoclonal anti-E-selectin denumit CY 1787 ca anticorp primar. Clonele pozitive s-au placat pe o plăcuță cu 10⁶ celule/100 mm. Ele au fost marcate metabolic 24 h mai târziu cu [³⁵S]-metionină timp de cinci ore.

Sol-E-selectin marcat a fost imunoprecipitat din mediu cu anticorpul monoclonal antiE-selectin și a fost supus electroforezei printr-un gel PAGE 10 %, gelul s-a uscat și a fost supus autoradiografului. Clona 293#3 a fost selectată ca linie celulară stabilă care produce cea mai mare cantitate de proteină 110-Kd sol-E-selectin.

O “Fabrică de Celule Nuc” cu 10 compartimente (suprafața totală de 6250 cm², Nune) s-a însămânțat cu 2,78 x 10® celule (clona 293#3) în 850 nl în DMEM suplimentat cu 5 % FBS și incubat la 37°C timp de 72 h. Mediul a fost recoltat și înlocuit cu 850 ml DMEM și FBS 5 %. După ce “fabrica” de celule a fost incubată la 37°C timp de 48 h, mediul a fost recoltat pentru a treia (și ultima) oară.

După fiecare recoltare, a fost adăugată azidă de sodiu 0,2 % la madiu. Mediul a fost limpezit prin centrifugare (5000 x g), trecut printr-un filtru de 0,2 mm și depozitat la 4°C până la o purificare ulterioară.

Anticorpul monoclonal CY1787 a fost conjugat cu Sepharoză proteină A în mod esențial așa cum a fost descris de Schneider et al., J.Biol.Chem, 257: 10766 (1982). Pe scurt, 28 mg de CY 1787 monoclonal (5 mg/ml) în PBS a fost amestecat cu 5 ml de Sepharoză proteină-A timp de 30 min la temperatura camerei. Picăturile au fost spălate apoi de patru ori prin centrifugare cu 25 ml de soluție tampon de borat 0,2 M, pH =8,2, urmată de două spălări cu 10 ml trietanolamină, pH =8,2. Rășina a fost apoi suspendată în 40 ml de soluție tampon de trietanolamină 0,2 M, pH =8,2, conținând dimetilpimelimidat 0,02 M. După ce a avut loc reacția timp de 45 min la temperatura camerei pe un rotator, rășina a fost spălată de două ori cu etanolamină 0,02 M, pH =8,2, urmat de trei spălări cu 10 ml de soluție tampon de borat 0,2 M, pH =8,2. Anticorpul nelegat a fost îndepărtat prin eluție cu soluție tampon de acetat de sodiu 0,1 M, pH =4,5. Din anticorpul folosit, 89 % a fost conjugat cu Sepharoză proteină-A.

2550 ml de supernatant al culturii de țesut a fost trecut printr-o precoloană 0,7 cm x 1,5 cm de Sepharoză proteină-A conectată în serie la o coloană de afinitate 1,5 cm x 3 cm de Sepharoză proteină-A-CY 1787 cu o viteză de 20 ml/oră. Coloanele au fost deconectate și coloana de afinitate conținând CY 1787 a fost spălată cu soluție tampon tris 20 mM, pH =7,5, conținând NaCI 150 mM și CaCI₂ 2 mM până când absorbția la 280 mm a eluentului se apropie de zero. E-selectin legat a fost eluat cu soluție tampon de acetat de sodiu 0,1 M, pH =3,5, conținând CaCI₂ 1 mM folosind curgerea gravitațională. O cantitate de 1 ml de fracții a fost colectată în 300 ml de tris 2M, pH =10. Fracțiile conținând proteine au fost puse laolaltă și au fost supuse dializei împotriva DPBS. Urmărind concentrația unui Amicon Centriprep 30 până când concentrația proteinei este de aproximativ 1 mg/ml, E-selectin purificat a fost împărțit în părți alicote și a fost depozitat la -80°C.

Puritatea a fost mai mare de 90 % prin SDS-PAGE. Un total de 10 mg de E-selectin a fost purificat din 2550 ml mediu de cultură celulară.

Dulbecco’s PBS(DPBS) (Whittaker, 17-513 B) HL-60(ATCC, CCL 240). O mare cantitate de celule HL-60 a fost crescută, testată pentru funcționare în probe și verificată de lipsă de micoplasmă. Celulele au fost apoi înghețate la -180°C în 10% DMSO, 10% serfetal de vițel, 80% RPMI 1640 (Whittaker) la 15 x 10® celule per fiolă în 2 ml criofiole. înghețarea a fost realizată folosind un frigider cu viteză de înghețare controlată.

Compusul Z Standard SLe^x pentazaharidă -OEt:

NeuAca2 - 3Gaipi [Fucal 3]GlcNAc31 _ 3GalpOEt

RO 117533 Β1

Compusul Z standard a fost preparat sub formă de soluție 10 mM în DPBS. Soluția 2590 a fost depozitată la -20°C.

Soluție tampon neutrofilă pentru spălare (NWB):

x HBSS (Gibco, 310-4065) ......................................... 20ml

1M HEPES (Gibco, 380-5630) .......................................... 2ml

Super QH₂O .....................................................178 ml 2595

D-Glucoză (Sigma, G 7021)........................................... 0,4q

200 ml

Soluție preparată proaspăt zilnic sau depozitată sterilizată la 4°C pH =7,2-7,4, sterilizare prin filtru (0,2 μ)

Depozit de CaCI₂100 mM:2600

Clorură de calciu anhidră (Baker, 1308)................................. 1,11g

Super Q H₂O .....................................................100ml

Sterilizare prin filtru (0,2 m) ..........................................100ml

Soluție tampon neutrofilă de spălare + 1 mM CaCI₂+0,1% BSA(NWB/Ca/BSA).2605

Albumină din ser de bovină (Sigma, A-6918).............................. 10g

Depozit de CaCI₂100 mM ...........................................100ml

NWB la......................................................... 1000ml pH de 7,2 la 7,4. Sterilizare prin filtru (0,2 μ), stocare la 4°C.

Soluție tampon de blocare2610

DPBS (Whittaker, 17-513) ...........................................100ml

Albumină din ser de bovină (Sigma, A-6918)............................... 1q

100 ml pH de 7,2 la 7,4. Sterilizare prin filtru (0,2 μ), stocare la 4°C.

2615

Soluție de acid citric, 0,1 M:

Acid citric, anhidru, acid liber, (Sigma C-0759)............................ 10,5 g

Super Q H₂O ............................................. aduce la 500 ml

Preparare în cilindru volumetric sau gradat. Depozitare la temperatura camerei.

2620

Soluție de fosfat de sodiu, 0,2 M:

Fosfat de sodiu, dibazic, anhidru (Na₂HPO₄) (Sigma, S-0876)................................................... 14,2g

Super Q H₂O .............................................. aduce la 500 ml

Preparare în cilindru volumetric sau gradat. Depozitare la temperatura camerei.2625

Soluție tampon citrat/fosfat:

Soluție de acid citric (0,1 M)......................................... 24,3ml

Soluție de fosfat de sodiu (0,2 M)..................................... 25,7ml

Super Q H₂O ......................................................50 ml 2630

100 ml

Depozitată la temperatura camerei.

Soluție tampon pentru liza celulelor:

Nonidet P40(NP-40) (Sigma, N-6507) ................................... 0,1 g 2635

0,1 M Citrat...................................................... 24,3ml

0,2 M Fosfat de sodiu, dibazic ....................................... 25,7ml

Super QH₂O .................................................... 50,0ml

100,0 ml

Depozitată la temperatura camerei.2640

RO 117533 Β1

OPDA(p-fenilendiamină):

Soluție tampon citrat/fosfat........................................... 10 ml

Diclorură de 0-fenilendiamină (Sigma, P 8287)............................ 10 mg

H₂O₂ (Sigma, H 1009)................................................ 10 μΙ

Trebuie preparat imediat înainte de folosire. Apa oxigenată a fost depozitată la întuneric la 10°C.

Soluție tampon Stop H₂SO₄, 4N

Acid sulfuric 18M (Fisher, A300s-212) ................................. 111 ml

Super Q H₂O...............................................până la 500 ml

Metoda

1. rELAM (sol-E-selectin) a fost diluat la o concentrație adecvată în actuala cantitate. Pentru aceste teste, rELAM a fost folosit la 2,5 pg/ml în DPBS. Utilizând o pipetă cu mai multe canale, 50 μΙ per preparare de probă au fost adăugați la următoarele prelevări ale unei plăcuțe ELISA: E1-E6, F1-F6 și G1-G6. 50 μΙ DPBS au fost adăugați în probele prelevate Η_υ H₂ și H₃ pentru utilizarea lor drept control. Această plăcuță este menționată ca plăcuța de pretestare.

O plăcuță adițională de testare a fost acoperită cu fiecare din cele trei probe necunoscute de testat. Din nou, folosind o pipetă cu mai multe canale, 50 μΙ din rELAM diluat au fost adăugați în următoarele probe prelevate ale plăcuțelor: B1-B12, C1-C12, D1-D12, E1, E12, F1-F12, G1-G12. 50 μΙ DPBS au fost adăugați în locurile pentru probe Η_υ H₂ și H₃ pentru utilizarea lor drept control. Aceste plăcuțe sunt cunoscute ca fiind plăcuțe de probă. Aceste plăcuțe au fost acoperite cu folie și au fost incubate trei ore la temperatura camerei.

2. Plăcuțele au fost spălate de trei ori cu 200 μΙ soluție tampon de blocare. Locurile pentru probe au fost reumplute cu 200 μΙ soluție tampon de blocare, au fost acoperite cu folie și incubate la temperatura camerei o oră.

3. Trei fiole de celule HL-60 înghețate au fost dezghețate pentru fiecare două plăcuțe de probă preparate. Fiolele au fost dezghețate repede pe o baie de apă la 37°C. Celulele au fost pipetate într-un tub de centrifugă de 15 ml conținând 10 ml NWB rece ca gheața 1% BSA. Celulele au fost centrifugate timp de șapte minute la 1200 rpm într-o centrifugă la 4°C și au fost spălate de încă două ori în NWB/BSA. Celulele au fost numărate folosind un hemocitometru și au fost resuspendate la 107/ml în NWB + 1% BSA + CaCI₂1mM.

4. în timp ce celulele au fost spălate, soluțiile de compuși standard și de testat au fost preparate. Compusul oligozaharidic de testat a fost cântărit în tuburi Eppendorf de 1,5 ml și o cantitate suficientă de DPBS a fost adăugată pentrii a face din fiecare probă o soluție 10 mM conform cu masa sa moleculară. O parte alicotă de 6 μΙ din fiecare probă a fost îndepărtată și 2 μΙ au fost picurați în fiecare pătrat al unei fâșii de testat pH -ul. Dacă proba nu are pH 7-7,4, valoarea pH -ului a fost ajustată la acea valoare sau compusul nu a fost testat. Testul necesită 180 μΙ dintr-o soluție 10 mM din fiecare soluție de compus de utilizat și 180 μΙ dintr-o soluție 10 mM a compusului Z standard pentru fiecare plăcuță de analizat incluzând și plăcuța de probă.

5. Plăcuțele ELISA blocate au fost răsturnate, micșorate ușor și șterse prin lovirea viguroasă de prosoape de hârtie pentru a îndepărta tot lichidul. Din probele prelevate. în fiecare loc pentru probă au fost adăugați 40 μΙ NWB + BSA 1 % + Ca²⁺1 mM folosind o pipetă cu mai multe canale.

6. Tot lichidul a fost îndepărtat din locurile pentru probe E6 și G6 ale plăcuței de pretestare. O parte alicotă de 40 μΙ dintr-un stoc de compus Z 10 mM a fost adăugată în fiecare din locurile pentru probă goale, precum și în locurile pentru probă E5 și G5. Soluția din locul pentru probă E5 a fost amestecată prin pipetarea a 40 μΙ în sus și în jos de 10 ori

RO 117533 Β1 cu un set de pipete p 200. O parte alicotă de 40 pl din soluție a fost îndepărtată din locul pentru probă și a fost diluată în serie de-a lungul plăcuței în locurile pentru probă E4 și apoi E3 și apoi în E2, de fiecare dată amestecând de 10 ori. O parte alicotă de 40 μΙ a fost îndepărtată și distrusă din ultimul loc pentru probă. Această procedură a fost reperată pentru rândurile G4 până la G2.

7. 2 x 10⁵ celule HL-60 au fost adăugate în fiecare godue (cu excepția lui H1) în 20 μΙ folosind o pipetă cu mai multe canale. Plăcuța a fost palsată pe un agitator de plăcuțe timp de cinci secunde și apoi a fost lăsată să stea 15 min la temperatura camerei.

8. Plăcuța a fost spălată folosind un spălător numit dispozitiv molecular pentru microplăcuțe ajustat la o curgere lentă a lichidului și programat pentru 3 spălări pe loc de probă cu NWB + 1 % BSA + CaCI₂1 mM ca soluție de spălare.

9. Au fost adăugați 50 μΙ per loc de probă soluție tampon pentru liza celulelor și plăcuța a fost plasată pe un agitator de plăcuțe timp de cinci minute la temperatura camerei.

10. O parte alicotă de 50 μΙ per probă prelevată dintr-o soluție de OPDA a fost adăugată și plăcuța a fost plasată pe un agitator de plăcuțe timp de zece minute la temperatura camerei.

11.0 reacție de formare de culoare a fost oprită prin adiția 40 μΙ per probă prelevată soluție tampon Stop H₂SO₄ și densitatea optică (O.D.), pentru probele prelevate plăcuței a fost citită la 492 nm, folosind locul pentru probă H1 ca martor.

12. Controlul negativ a fost determinat prin analizarea semnificației valorilor O.D. pentru locurile de probă H2 și H3. Aceasta este “controlul negativ al nelegării E-selectin”. “Controlul pozitiv al legării” a fost calculat pentru curba standard a valorilor date de godeurile E1, F1, F2, F3, F4, F5 F6 și G1. Dacă “controlul negativ al nelegării E-selectin” este mai mare de 10% din “controlul pozitiv al legării”, proba nu a mai fost continuată. Dacă această valoare a fost mai mică sau egală cu 10% din “controlul pozitiv al legării”, probelor duplicate (E6, G6), (E5, G5), (E4, G4), (E3, G3) și (E2, G2) și s-a făcut o medie. Fiecare medie a duplicatelor a fost împărțită prin valoarea “controlului pozitiv al legării” pentru a da procentajul legării pozitive pentru fiecare concentrație a compusului testat. Procentul “controlului pozitiv al legării” a fost reprezentat grafic în funcție de logaritmul concentrației inhibitorului. Punctul de 50% al inhibiției a fost determinat de grafic. Acest punct ar trebui să se afle între 0,5 și 1,5 mM și dacă nu, testul nu se continuă.

13. Dacă curba standard a plăcuței de pretestare a fost în limite acceptabile, testul a continuat. Compusul Z standard a fost diluat pe fiecare plăcuță de probă ca la punctul 6. Compușii testați au fost diluați în mod similar. Compușii analogi SLe^x testați au fost plasați pe plăcuțe conform cu următorul model:

2690

2695

2700

2705

2710

2715

2720

2725

Conc.	Proba # 1	Proba # 2	Proba # 3
6,6 mM sau Dil.1	B6, D6	B7, D7	E7, G7
3,3 mM sau Dil.2	B5, D5	B8, D8	E8, G8
1,65 mM sau Dil.3	B4, D4	B9, D9	E9, G9
0,82 mM sau Dil.4	B3, D3	B10, D10	E10, G10
0,412 mM sau Dil.5	B2, D2	B11,D11	E11, G11

2730

Când toate probele de testat au fost diluate pe plăcuță, celulele HL-60 au fost adăugate ca la punctul 7 de mai sus și procedura a fost urmărită ca la punctul 11 de mai sus.

2735

RO 117533 Β1

15. “Controlul pozitiv al legării” a fost calculat pentru proba #1 din probele prelevate B2, C1-6 și D2; pentru proba #2 din probele prelevate B12, C7-12 și D12; și pentru proba #3 din probele prelevate E12, F7-12 și G12. Procentul legării pozitive pentru fiecare diluție a fiecărei probe a fost reprezentat grafic și punctul de 50% al inhibiției a fost determinat tot din grafic. Activitatea pentru fiecare compus analog SLe^x testat a fost înregistrată ca raportul dintre valorile de legare de 50% pentru compusul Z standard și valoarea de legare de 50% pentru proba de SLe^x testată. Valoarea pentru SLe^x însuși a fost determinată în mod similar.

Rapoartele pentru însuși SLe^x și alți câțiva compuși analogi SLe^x studiați au fost redate în tabelul 4 de mai jos.

Compusul

Compusul Nr.

Tabelul 4

Proporție

Compusul Z ICșn \

Compusul IC50 /

0.76

5.0

3.2

4.3

0.53

10.0

11.2

RO 117533 Β1

Compusul

	Tabelul 4 (continuare)	2785
Compusul Nr.	Proporție / Compusul Z lCsn \ \ Compusul ICjo /

2790

0.2

2795

35	4.7	2800
36	5.7 8.9	2805
		2810
37	4.0	2815
38	10.0	2820

RO 117533 Β1

Compusul

Compusul Nr.

Tabelul 4 (continuare)

Proporția (Compusul Z IC«in \

Compusul IC₅₀ )

HO

6.0

6.0

0.3

3.0

Revendicări

Claims (8)

1. Derivați de analogi sialil Le^x inhibitori ai adeziunii celulare, caracterizați prin aceea că au formula generală structurală următoare:

RO 117533 Β1 în care Z este un atom de hidrogen, o grupă acil (Ț-Cg,

2870

Y este selectat din grupul care constă din C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O);

R¹ este selectat din grupul care constă dintr-un radical arii, arii substituit, o grupare fenil CȚ-C3 alchilen, în care gruparea arii are un ciclu aromatic cu 5 sau 6 membri, un ciclu aromatic condensat cu 5 sau 6 membri, sau două cicluri aromatice condensate cu 6 membri, cicluri care sunt selectate din grupul care constă din cicluri de hidrocarbil, monooxahidrocarbil, monotiahidrocarbil, monoazahidrocarbil și diazahidrocarbil, iar gruparea arii menționată care are un substituent selectat dintre halo, trifluormetil, nitro, alchil θΓθ18> alcoxi CȚ-C^, amino, mono C_rC₁₈ alchilamino, di-CȚ-C^ alchilamino, benzilamino, C_rC₁₈ alchilbenzilamino, 0,-C^ tioalchil și alchil carboxamido, sau R¹Y este aliloxicarbonil sau cloracetil;

R² este selectat din grupul care constă din hidrogen, hidrocarbil (Ț-C^ cu catenă lineară, ramificată sau ciclică, Ο^Οθ alchil Ο_ΓΟ₅ alchilen - ω - carboxilat, ω-tri (C_rC₄ alchil/fenil) silii C₂-C₄ alchilen, monozaharidă și dizaharidă, sau împreună cu OR² formează un carbamat de hidrocarbil 0,-C^ cu catenă lineară, ramificată sau ciclică;

R³ este hidrogen sau acil Ο_ΓΟ₆;

R⁴ este hidrogen, alchil Ο,-Ce sau benzii;

R⁵ este selectat din grupul care constă din hidrogen, benzii, metoxibenzil, dimetoxibenzil și acil C₄-C_e;

R⁷ este metil sau hidroximetil; și

X este selectat din grupul care constă din aciloxi CȚ-Cg, hidroxilaciloxi C₂-C₆, hidroxi, halo și azido.

2. Derivați de analogi sialil Le^x inhibitori ai adeziunii celulare, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că au următoarea formulă generală structurală:

2875

2880

2885

2890

2895

2900

2905

Y este selectat din grupul constând din C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O),

R¹ este selectat din grupul care constă dintr-un radical arii, arii substituit și o grupare fenil C_rC₃ alchilen, în care gruparea arii are un ciclu aromatic cu 5 membri, un ciclu aromatic cu 6 membri sau două cicluri aromatice condensate cu 6 membri, cicluri care sunt selectate din grupul care constă din ciclurile hidrocarbil, monooxahidrocarbil, monotiahidrocarbil, monoazahidrocarbil și diazahidrocarbil, iar gruparea arii substituită este gruparea arii menționată având un substituent selectat din grupul care constă din halo, trifluormetil, nitro, C_rC₁₂ alchil, alcoxi (Ț-C^, amino, mono-C^C^ alchilamino, di-C^C^ alchilamino, benzilamino, alchil benzilamino, tioalchil și alchil CȚ-C^ carboxamido, sau

2910

2915

RO 117533 Β1

R² este selectat din grupul care constă din hidrogen, hidrocarbil Ο,-C^ linear, ramificat sau ciclic, C^-Cg alchil C_rC₅ alchilen-uj-carboxilat, u)-tri(C -Q șlchil/fenil) silii alchilen C₂-C₄, monozaharidă și dizaharidă, sau împreună cu OR² formează carbamat de hidrocarbil cu catenă lineară, ramificată sau ciclică;

R³ este hidrogen sau acil C_rC₆;

R⁴ este hidrogen, alchil C^-Cg sau benzii;

R⁵ este selectat din grupul care constă din hidrogen, benzii, metoxibenzil, dimetoxibenzil și acil

R⁷ este metil sau hidroximetil; și

X este selectat din grupul care constă din aciloxi C^-Cg, hidroxilaciloxi C₂-C₆, hidroxi, halo și azido.

3. Derivați de analogi sialil Le^x, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că au formula generală structurală următoare:

în care Z este hidrogen, acil C^Cg sau

Y este selectat din grupul care constă din C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O);

R¹ este selectat din grupul care constă dintr-o grupare arii, arii substituit și fenil alchilen, în care gruparea arii are un ciclu aromatic cu 5 sau 6 membri, un ciclu aromatic condensat cu 5 sau 6 membri, sau două cicluri aromatice condensate cu 6 membri, cicluri care sunt selectate din grupul care constă din ciclurile hidrocarbil, monooxahidrocarbil, monotiahidrocarbil monoazahidrocarbil și diazahidrocarbil, iar gruparea arii substituită este gruparea arii menționată având un substituent selectat din grupul care constă dintr-o grupare halo, trifluormetil, nitro, alchil C^C^, alcoxi Ο,-C^, amino, mono Q-Qe alchilamino, di-alchil amino, benzilamino, alchil benzilamino, tioalchil și alchil C_rC₁₈ carboxamido, sau

R¹Y este aliloxicarbonil sau cloracetil;

R³ este hidrogen sau acil C^Cgi

R⁴ este hidrogen, alchil C^Cg sau benzii;

R⁵ este selectat din grupul care constă din hidrogen, benzii, metoxibenzil, dimetoxibenzil și C^Cg acil;

RO 117533 Β1

R⁶ este selectat din grupul care constă din hidrogen, hidrocarbil cu catenă lineară, ramificată sau ciclică, C^Cg alchil C^C ₅ alchilen-uj-carboxilat și u)-tri(C ₇C ₄ alchil/fenil) silii alchilen C₂-C₄, sau împreună cu OR⁶ formează carbamat de hidrocarbil θΓθ18 cu catenă lineară, ramificată sau ciclică;

R⁷ este metil sau hidroximetil; și

X este selectat din grupul care constă din aciloxi C^Cg, C₂-C₆ hidroxilaciloxi; hidroxi, halo și azido.

4. Derivați de analogi sialil Le^x, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că au următoarea formulă generală:

2965

2970

2975

2980 în care Y este selectat din grupul care constă din C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) și SC(O);

R¹ este selectat din grupul care constă dintr-o grupare arii, arii substituit și fenil alchilen, în care grupa arii are un ciclu aromatic cu 5 sau 6 membri, un ciclu aromatic condensat cu 5 sau 6 membri, sau două cicluri aromatice condensate cu 6 membri, cicluri care sunt selectate din grupul care constă din ciclurile hidrocarbil, monooxahidrocarbil, monotiahidrocarbil, monoazahidro-carbil și diazahidrocarbil, iar gruparea arii substituită este gruparea arii menționată având un substituent selectat din grupul care constă din halo, trifluormetil, nitro, alchil θΓθιβ> alcoxi C^C^, amino, mono-C^C^-alchilamino, di-C^C^alchilamino, benzilamino, alchil C_rC₁₈ benzilamino, C_rC₁₈ tioalchil și C_rC₁₈ alchil carboxamido;

R² este selectat din grupul care constă din hidrogen, hidrocarbil Ο,-C^ cu catenă lineară, ramificată sau ciclică, C^-Cg alchil C^Cg alchilen ω-carboxilat; oj-trKC-t-C^ alchil/fenil)silil C₂-C₄ alchilen, monozaharidă și dizaharidă, sau împreună cu OR² formează un hidrocarbil carbamat cu catenă lineară, ramificată sau ciclică;

R⁷ este metil sau hidroximetil; și

X este selectat din grupul care constă din aciloxi Ο,-Cg, hidroxilaciloxi C₂-C₆, hidroxi, halo și azido.

5. Derivați conform revendicării 4, caracterizați prin aceea că reprezintă un membru selectat din grupa care constă din:

2985

2990

2995

3000

RO 117533 Β1

F

RO 117533 Β1

6. Derivați conform revendicării 4, caracterizați prin aceea că reprezintă un compus selectat din grupa care constă din:

3055

3060

O(CH₂)jCH₂

3065

3070

3075

3080

3085

RO 117533 Β1

7. Derivați conform revendicării 4, caracterizați prin aceea că reprezintă un compus selectat din grupa care constă din:

t-Βυ

RO 117533 Β1

3140

3145

3150

3155

8. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că este constituită dintr-un diluant acceptabil farmaceutic, în care este dizolvată sau dispersată o cantitate de derivați de analogi sialil Le^x, care inhibă legarea celulară, definiți în revendicarea 1.