CZ298895A3 - Compound analogous to sialyl lex, pharmaceutical composition containing thereof and process for preparing lactosammonium salt - Google Patents

Description

Sloučenina analogická sialyl Le^x, farmaceutický prostředek/ýT^A j ^fr - ť·' J a Λ -i jC obsahující a způsob přípravy laktosamoniové soli ' ovyc

Oblast techniky

QiSOQ y , ň > ΐ \

Tento vynalez se týká analog sialyl Lewis (^ialyl Le neboli SLe^x), jež inhibují buněčnou adhezi zprostředkovanou selektiny, prostředků obsahujících tato analoga a způsóEu jejich přípravy, a způsobů přípravy těchto analog.

Dosavadní stav techniky

Vaskulární endotheliální buňky a krevní destičky hrají klíčové role v řadě biologických odpovědí tím, že selektivně vážou určité buňky, například fagočytické leukocyty, v krevním oběhu. Například: Endotheliální buňky přednostně vážou monocyty a granulocyty před jejich migrací přes cévní stěnu a do okolní , tkáně při zánětlivé odpovědi.

určitých sloučeninách spouštějících zánět je známo, že působí přímo na vaskulární endothel a podporují adhezi leukocytů k cévní stěně. Buňky se pak pohybují přes stěny a do oblastí poranění nebo infekce.

buněčné adhezi se též soudí, že je zapojena do metastázování nádorů. Obíhající rakovinné buňky jakoby využívaly normální tělesné zánětlivé mechanismy a vážou se k oblastem cévních stěn, kde je endothel aktivován.

Krevní destičky jsou také zapojeny do podobných odpovědí.

destičkách je známo, že se aktivují během počátku hemostase a procházejí rozsáhlejšími morfologickými, biochemickými a funkčními změnami (např. rychlou granulární exočytózou nebo degranulací), při nichž alfa granulární membrána destičky fúzuje s vnější plasmatickou membránou. V důsledku toho se začnou exprimovat nové bílkoviny buněčného povrchu, jak odpovídá novým funkcím aktivovaných destiček, jako je schopnost vazby k .jiným aktivovaným destičkám a dalším buňkám. Aktivované destičky se zachytávají do rostoucího trombu nebo jsou rychle odstraněny z krevního oběhu. 0 aktivovaných destičkách je známo, že se vážou k fagocytickým leukocytům, včetně monocytů a neutrofilů. Příklady patologických a dalších biologických procesů, o nichž se soudí, že jsou zprostředkovávány tímto procesem zahrnují atherosklerózu, srážení krve a záněty.

Nedávné práce zjistily, že do rozeznávání různých obíhajících buněk endothelem a destičkami jsou zapojeny specializované povrchové rečeptořy na endothéliálních buňkách a destičkách, nazývané E-selektin (ELAM-1, endothelial leukocyte adhesion molecule-1) respektive P-selektin (GMP-140, granule membrane protein-140). 0 E-selektinu bylo například prokázáno, že zprostředkuje endotheliální. adhezi leuko.cytů, která je prvním krokem v mnohých' zánětlivých... odpovědích.: E-selektin:„konkrétně váže lidské neutrofily, monocyty, eosinofily, určité. T-lymfocyty [Graber et al., J. Imniunol. , 145: 819 (1990)], NK buňky a promyelocytické buňky linie HL-60.

E-selektin. je indukovatelně. exprimován;„na.vaskulárních. endotheliálních' buňkách. [Bevilacqua et al., Science- 243: 1160-1165 (1989) a Hession et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 87: 1673-1677 (1990)]. Pro tento receptor indukován zánětovými cytokiny jako je a faktorem nekrózy nádorů a (TNFa), bylo ukázáno, že je interleukin Ιβ > (IL-Ιβ) jakož i bakteriálním endotoxinem (lipopolysacharidem) [Bevilacqua et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 84: 9238-9242 (1987)]. Tyto sloučeniny zvyšují adhezi leukocytů Proč. Nati.

(neutrofilů) Acad. Sci. , a

84:

monocytů

9238-9242

GMP-140 a PADGEM) je přítomný polymorfonukleárních [Bevilacqua et al., (1987)].

P-selektin (známý rovněž jako na povrchu destiček a endotheliálních buněk, kde zprostředkuje interakce destička-leukocyt a endothel-leukocyt [Geng et al., Nátuře 343: 757-760 (1990)]. Takto je například známo, že aktivované destičky, které mají na svém povrchu exprimovaný granulární membrány exprimována,na povrch

P-selektin, se vážou k monocytům a neutrofilúm [Jungi et al., Blood 67: 629-636 (1986)], a že se rovněž vážou k liniím buněk podobných monocytům, např. HL-60 a U937 [Jungi et al. , Blood 61'. 629-636. (1986); Silverstein et al., J. Clin. Invest., 79:

867-874 (.1987) ] .

P-selektin je bílkovinou alfa o molekulové hmotnosti 140 000, jež je aktivované destičky při aktivaci destičky a granulární sekreci [Hsu-Lin et al., J. Clin. Invest., 259: 9121-9126 (1984);

Stenberg et al., J. Cell Biol. , 101: 880-886 (1985); Berman et al., J. Clin. Invest., 78: 130-137 (1986)]. Nalézá se i v megakaryocytech [Beckstead et al., Blood 67: 285-293 (1986)] a v endotheliálních buňkách [McEver et al., Blood 70: 335a (1987)] uvnitř Weibelových-Paladeho tělísek [Bonfanti et al., Blood 73: 1109-1112 (1989)]. Fúrie et al., U.S. patent číslo 4 783 330, popisují monoklonální protilátky reaktivní s P-selektinem.

Třetím receptorem je lymfocytární umísťovací receptor, MEL-14 antigen nebo jeho lidský protějšek LAM-1 (L-selektin) [Gallatin et al., Nátuře 304: 30-34 (1989); Siegellman et al.,

Science 243: 1165-1172 (1989); Rosen, Cell Biology 1: 913^919 (1989); a Lásky et al., Cell 56: 1045-1055 (1989)]. Navíc k umísťování lymfocytů se pro MEL-14 antigen/LAM-1 uznává funkce v ranné vazbě neutrofilů k endothelu.

Výraz selektin byl navržen pro obecnou třídu receptorů, jež zahrnuje E-selektin (ELAM-1), P-selektin (GMP-140) a L-selektin (MEL-14), pro jejich doménu podobnou lektinům a selektivní povahu jejich adhezivní funkce. Struktura a funkce selektinových receptorů byla objasněna klonováním a expresí cDNA plných délek kódujících všechny shorauvedené receptory [Bevilacqua et al., Science 243; 1160-1165 (1989), (ELAM-1); Geng et al., Nátuře 343: 757-760 (1990), (GMP-140); Lásky et al., Cell 56: 1045-1055 (1989), (MEL-14 antigen)].

Extracelulární část selektinú může být na základě homologií s dříve popsanými bílkovinami rozdělena na tři segmenty.

Aminokoncová oblast (kolem 120 aminokyselin) je příbuzná savčím lektinovým bílkovinám typu_C, jak_js.o.u_pó sány_Dr.i.ckame rem.,.

J. Biol. Chein. , 263: 9557-9560 (1988), jež indukují receptor CD23 .s nízkou afinitou. IgE.. Následuje polypeptidový segment, jenž má posloupnost příbuznou bílkovinám obsahujícím motiv epidermálního růstového faktoru (EGF). Konečně: Za EGF doménou je jeden nebo více tandemově se opakujících motivů, vždy po asi 60 aminokyselinách, příbuzných motivům nalézaným v rodině regulačních bílkovin komplementu.

U.Š. patent číslo 5 079 353 a jeho přiřazený U.S.

číslo 5 296 594 popisují syntézu a použití sialyl Le~ a Le^a' antigenů, jež jsou přítomné v rakovinných tkáních a patent sialyl jsou

U.S. patent číslo 5 143 712 různými’ receptory, jako je jako je sialyl Le^x jakož N-acetyllaktosamino (LacNAc) ligandy selektinových receptorů. popisuje vazebné interakce mezi ELAM-1 (E-selektin), a ligandy, i ligandy obsahujícími .několik, jednotek spolu s terminální sialyl skupinou a jednu nebo kukosylových skupin, jež jsou vázány ke GlcNAc části LacNAc jednotky.

Publikovaná mezinárodní přihláška WO - 91/19501 a WO 91/19502 zveřejňují, že oligosacharidý.obsahující pentamerní. a hexamerní struktury ukázané níže inhibují selektivně buněčnou vazbu mezi buňkami obsahujícími tento ligand (níže) a těmi, jež obsahují selektinový receptor, a že testované penta- a hexasacharidy poskytovaly lepší inhibici než SLe^x.

NeuAca2->3.Galpl->4(Fucal->3)GlcNAc3l,3Galp-; .... . ... NeuAca2—>3Gaipi—>4(Fucal->3)GlcNAc01,3Gaipi,4Glc-; a NeuAca2->3Gaipi->4{Fucal->3)GlcNAc = SLe^x.

Podstata vynálezu

Tento vynález uvažuje sloučeninu analogickou sialyl Le^x (SLe^x), která inhibuje adhezi buněk, jež mají na svém povrchu exprimovaný SLe^x, intermediární sloučeninu v syntéze inhibitoru, jakož i postup pro přípravu intermediátu a prostředku k

obsahujícího inhibitor.

Z— or⁵

Y je vybrán ze skupiny sestávající z C(0), S0₂, HNC(O), 0C(0) a SC(O);

R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z arylové, substituované arylové a fenyl C^-C^ alkylenové skupiny, kde arylová skupina má jeden pěti- nebo šestičlenný aromatický kruh, fúzované pěti/sestičlenné aromatické kruhy nebo dva fúzované šestičlenné aromatické kruhy, jejichž kruhy jsou vybrány ze skupiny sestávající z hydrokarbylových, monooxahydrokarbylových, monothiahydrokarbylových, monoazahydrokarbylových a diazahydrokarbylových kruhů a substituovaná arylová skupina je dříve uvedená arylová skupina, mající substituent vybraný ze skupiny sestávající z halo-, trifluormethylových, nitro-, Ci^_C_ig alkylových, alkylaminových, ^cl“^c18 di alkoxylových, amino-, mono C^-C ^cl”^c18 alkylaminových, *-18 benzylaminových, ^cl“^c18 alkylbenzylaminových, C1-C18 thioalkylových a ^Ci^-C18 alkyl karboxamidovych skupin, nebo _ .. . . ____

R³Y je allylkarbonyl nebo chloracetyl; o . .. Rť je. vybrán ze skupiny, sestávající z vodíku,. ^cl^c18 přímého řetězce, větveného řetězce nebo cyklického hydrokarbylu, C-j^-Cg alkyl Cý-Cg alkylen U)-karboxylátu, ^-trifCj-C^ alkyl/fenyl) silyl C₂~C₄ alkylenu, monósacharidu a disacharidu;

nebo OR² dohromady tvoří ^ci~^ci8 přímý řetězec, větvený řetězec nebo cyklický hydrokarbyl kařbamát;

R³ je vodík nebo ^c]_“^cg acyl;

R⁴ je vodík, C^-Cg alkyl nebo benzyí;

R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, benzylu, methoxybenzylu, dimethoxybenzylu a C^-Cg acylu;

R⁷ je methyl (CH₂) nebo hydroxyme.thyl (CH₂OH); a X je vybrán ze skupiny sestávající z C^-Cg acyloxy, C₂~Cg hydroxylacyloxy, hydroxy, halo a azido.

Y je s výhodu karbony1 [C(O)].

Pro jednu skupinu inhibitorů.je R² s výhodou monosacharid a výhodněji ^ci“^cig . alkylglykosid monosacharidu, R⁷ je methyl, Z je nechráněná, fuko- skupina, X je hydroxy1 a R³Y je jiné než allylkarbonyl nebo chloracetyl. Intermediát inhibitoru může mít kteroukoli z vysvětlených R skupin, s R³, R⁴ a R⁵ s výhodu jinými než vodík.

Obzvláště výhodný inhibitor odpovídá obecnému vzorci *

I

- 7 kde r! je jako výše a R^Y je jiné než allylkarbonyl nebo chloracetyl, X je jako výše a s výhodou jiné než Cj-Cg acyloxy a _Cl-C₆ hydoxylacyloxy, a R² a R⁷ jsou jak se rozebírá výše. V jednom provedení je R² s výhodu jiné než mono- a disacharid. Benzylová R² skupina je zde obzvláště výhodná.

Jiná skupina obzvláště obecnému vzorci výhodných inhibitorů odpovídá

kde R¹' je Jako výše až na to, že jsou vyloučeny allylkarbonylové nebo chloracetylové R^Y skupiny, X je jako výše a s výhodou jiné než C₁~Cg acyloxy a C^-Cg hydoxylacyloxy, R' je jako dříve a R² je mono- nebo disacharid.

Tento ··* farmaceuticky přijatelné prostředek.

Uvažuje se také farmaceutický farmaceutický prostředek obsahuje zředovadlo nebo nosič mající v sobě rozpuštěné nebo dispergované buněčnou adhezi inhibující množství sloučeniny obecného vzorce .-'13*

kde Y je vybrán ze skupiny sestávájící^:z C(0), S0₂, HNC(O), OC(O) a SC(O)ř______

R¹ je jak je definováno výše, a s výhodu je vybrán ze skupiny setávající z arylově, substituované arylové a fenyl C^-C-j alkylenové skupiny, kde arylová skupina je vybrána ze skupiny sestávající z furylu, thienylu, fenylu, naftylu, pyridylu, pyrazinylu, benzofuranylu, isobenzofuranylu, benzo (b nebo c] thienylu, pyrimidinylu, pyridazinylu, chinolinylu, isochinolinylu, chinoxalinylu, naftyridinylu, ftalazinylu a chinazolinylu, a substituovaná arylová skupina je dříve r

zmiňovaná arylová skupina,majícísúbstituent vybrány ze skupiny sestávající z halo-, trifluormethylových, nitro-, ^ci“^ci8 alkylových, ^ci^-ci8 alkoxylových, amino-, mono-C-^-C-^g alkylaminových, . di-C^-C₁₈ alkylaminových, benzylaminových a C^-C^g alkylbenzylaminových skupin;

R‘ je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, C^-C^g přímého řetězce, větveného řetězce nebo cyklického hydrokarbylu, C₁-C_g alkyl C₁~C₅ alkylen ω-karboxylátu, al-trifCj-C^ alkyl/fenyl) silyl C₂~C₄ alkylenu, monosacharidu a disacharidu nebo: OR² dohromady, tvoří ^ci^-cig přímý řetězec,. větvený řetězec nebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

R⁷ je methyl (CH₃) nebo hydroxymethyl (CH₂OH); a

X je vybrán ze skupiny setávající z C₁~C₆ acyloxy, C₂-C₆ hydroxylacyloxy, hydroxy, halo a azido.

Výše zmíněné výhody pro inhibitor se zachovávají pro farmaceutický prostředek.

Dále se uvažuje postup přípravy laktosamoniové soli. Tento postup zahrnuje tyto kroky:

a) smíchání laktulosy a primárního aminu, jenž je monosubstituovaným derivátem amonia, jehož dusíkový atom je vázán k reduktivně odstranitelné chránící skupině jako je benzylamin, za vytvoření reakční směsi. Primární amin slouží jako ‘reaktant i primární rozpouštědlo a je přítomen v množství 2- až 10-krát vyšším než je molární množství laktulosy, s výhodu ve 4- až

8-násobném molárním přebytku.

b) Reakční směs se udržuje při teplotě při teplotě 10°C až 60 °C, s výhodou při laboratorní teplotě až 50 °C, po dobu dostatečnou k vytvoření příslušného laktuloso N-glykosidu. Tato doba udržování se může pohybovat od dvou do sedmí dnů když jsou žádoucí maximální výtěžky.

c) Vytvořený laktuloso N-glykosid se ponechá reagovat s až ekvivalentním množstvím karboxylové kyseliny mající pK_a hodnotu 2,5 až 5,0 v rozpouštědle C₁~C₃ alkoholu, jako je methanol, při te'plotě 10 ’C až 30 °C k přesmyku laktuloso N-glykosidu na amino-blokovanou laktosamoniovou sůl, mající reduktivně odstranitelnou chránící skupinu vázanou k aminu. Laktuloso N-glykosid může být přítomen v 0,1 M až nasycené hladině; a

d) Chránící skupina je pak z řečené amino-blokované laktosamoniové soli reduktivně odstraněna např. hydrogenolýzou za tvorby laktosamoniové soli. Tato sůl je s výhodou izolována. ,,

Názvosloví použité k popisu oligosacharidových zbytků předkládaného vynálezu sleduje konvenční názvosloví. Pro jednotlivé monosacharidy se používají standardní zkratky, například GlcNAc pro 2-N-acetylglukosamin a GalNAc pro

2-N-acetylgalaktosamin? fukosa je Fuc, fruktosa je Fru, galaktosa je Gal, glukosa- je Glc, *a mannosa je Man. Pokud není vyznačeno jinak, všechny cukry kromě fukosy (L-isomer) jsou D-isomery v cyklické konfiguraci (např. pyranosy nebo furanosy). Dva anomery cyklických forem jsou označovány a a β.

Monosacharidy se obecně spojují glykosidickými vazbami za tvorby oligo- a polysacharidů. Orientace vazby vzhledem k rovině kruhu je vyznačena jako a a β. - Označeny jsou také konkrétní uhlíkové atomy, které tvoří vazbu mezi dvěma monosacharidy. Takto je β glykosidická vazba mezi C-l galaktosy a C-4 glukosy označena Galpl->4Glc. Pro D-cukry (např. D-GlcNAc, D-Gal, D-NeuAc a D-Man) označení a znamená, že hydroxyl navázaný k C-l (k C-2 v NeuAc) je pod rovinou kruhu a β, že je nad kruhem. V případě L-fúkosy označení a znamená, že hydroxyl je nad kruhem a β, že je pod ním.

Podrobný popis vynálezu

A. Sloučeniny,

Předkládaný vynález uvažuje sloučeninu analogickou SLe^x obecného vzorce A, níže, přičemž obecný vzorec pokrývá pentasacharidovou sloučeninu obecného vzorce I, která je analogem sialyl Le^x, jakož i její penta- a tetrasacharidové prekursory obecných vzorců II resp. III. Sloučenina obecného vzorce I inhibuje buněčnou adhezi zprostředkovanou buněčným povrchovým selektinovým receptorem.

V obecných vzorcích nahoře 'l'^c6 obecného vzorce

Z je vodík (H) nebo C-,-C, ι>

t v kterémžto případě je III, nebo a-L-fukosyl, nebo blokované cránící definována sloučenina jehož hydroxylové skupiny jsou volné * skupinou (benzyl nebo C^-Cg acyl), čímž je definována sloučenina obecného vzorce I nebo II, v závislosti na identitě R³, R⁴ a R⁵ (R³“⁵) skupin;

Y je vybrán ze skupiny sestávající z C(0), SO₂, HNC(.o) , 0C(0) a SC(O)?

R¹ j^e vybrán ze skupiny setávající z arylové, substituované arylové a fenyl C^-Cg alkylenové skupiny, kde arylová skupina má jeden pěti- nebo šestičlenný aromatický kruh, fúzované pěti/šestičlenné aromatické kruhy nebo dva fúzované šestičlenné aromatické kruhy, jejichž kruhy jsou vybrány ze skupiny sestávající z hydrokarbylových, monooxahydrokarbylových, monothiahydrokarbylových, monoazahydrokarbylových a diazahydrokarbylových kruhů a substituovaná arylová skupina je dříve uvedená arylová skupina, mající substituent vybraný ze skupiny sestávající z halo-, trifluormethylových, nitro-, ^C1 ^ci8 alkoxylových, amino-, mono ^ci“^ci8 l”^c18 alkylaminových, benzylaminových, ^cl^-c18 alkylbeňžylaminových, C^-C^g thioalkylových a C^-C^g alkyl karboxamidových skupin, nebo

R^Y je allylkarbonyl nebo chloracetyl;

* R je vybrán ze skupiny sestávající z. vodíku, ^C]_^-C₁₈ přímého řetězce, větveného řetězce nebo cyklického hydrokarbylu, C^-Cg alkyl C₁~C₅ alkylen d)-karboxylátu,cC-tri(C^-C^ alkyl/fenyl) silyl C₂-C₄ alkylenu, monosacharidú a disacharidu;

nebo OR² dohromady tvoří ^ci^-cig přímý řetězec, větvený řetězec nebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

alkylových, alkylaminových, ^cl”^c18 di

R³ je vodík nebo C^-Cg acyl;

R⁴ je vodík, C^-Cg alkyl nebo benzyl;

R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, benzylu, methoxybenzylu, dimethoxybenzylu a C^-Cg acylu;

R⁷ je methyl (CH₃)„ nebo hydroxymethyl (CH₂OH); a

X je vybrán ze skupiny sestávající z C^-ϋθ acyloxy, C₂~Cg hydroxylacyloxy, hydroxy, halo a azido.

Jak se poznamenává výše, Y může být jedna z řady skupin. Když Y je C(O), R¹Y je skupina acylového substituentu, takže se tvoří amid s dusíkovým atomem aminové skupiny sacharidu. Když Y je SO₂, R^Y vytváří skupinu sulfonylového substituentu, takže se tvoří sulfonamid s dusíkovým atomem aminu sacharidu. Když Y je HNC(O), R^Y vytváří skupinu aminokarbonylového substituentu, takže se tvoří močovinový substituent s dusíkovým atomem -sacharidu.--₇-Urethanový- substituent — se ~tvoří s dusíkem aminu“ sacharidu, když Y je oxykarbonyl, OC(O), zatímco thiourethan se tvoří, když Y je thiokarbonyl, SC(O). Skupina Y je s výhodou karbonylová skupina [c(0)].

R¹Y skupina může být také allylkarbonylová nebo chloracetylová skupina. Allylkarbonylová skupina R-^Y je obzvláště

výhodná pro sloučeninu obecného vzorce III,. protože poskytuje snadno zaměnitelnou skupinu R¹. Allylkarbonylová nebo chloracetylová skupina R¹Y je přítomná- ve sloučenině obecného vzorce III, a není přítomná v sloučenině žádného z. obecných vzorců I, II, A, B, nebo C (obecné, vzorce B a C jsou,ukázány později).

Jak je rozebíráno výše, skupina R^ může být arylová nebo substituovaná arylová skupina. Uvažované arylově skupiny jsou ty, které obsahují jeden pěti- nebo šestičlenný aromatický kruh, fúzované pěti- a šesti- (pěti/šesti-) členné kruhy nebo dva fúzované šestičlenné aromatické kruhy a zahrnují hydrokarbylové skupiny jako je fěnyl a naftyl, jakož i hydrokarbylové skupiny, obsahující kyslík, nebo síru, nebo jeden nebo dav dusíkové atomy, jež nahrazují uhlíkové atomy kruhu (mono- nebo a diazahydrokarbyl). Příklady arylových skupin zahrnují skupiny furylu, thienylu, pyridylu, pyrazinylu, benzofuranylu (benzo[b]furylu), isobenzofuranylu (benzo[c]furylu), benzothienylu (benzo[bjthienylu), isobenzothienylu (benzo[c]thienylu), pyrimidinylu, pyridazinylu, chinolinylu, isochinolinylu, a chinazolinylu, nesubstituovaná, naftyridinylu, ftalazinylu arylových skupin může být mít substituent vybraný ze chinoxalinylu,

Každá z těchto nebo každá může skupiny sestávající z halo-, trifluormethylóvých, nitro-, C₁~C₁₈ alkylových, C,-C·,,, alkoxylových, amino-, mono-Cj-Cj^g alkylaminových, di-C,-C_lg alkylaminových, C.-C,_o

1O alkylbenzylaminových a alkylkarboxamidových skupin.

Shora uvedené nesubstituované a substituované arylové R¹ skupiny jsou dobře známé v oboru, a každá může být vázána k dusíkovému atomu sacharidu s použitím dobře známé chemie.

Následující rozbor se proto soustředí na arylové hydrokarbylové +

skupiny, fenyl a naftyl, jež jsou typické pro skupinu, s pochopením, že jiné arylové a substituované arylové R¹ skupiny z výčtu se mohou využívat s chemií v podstatě podobnou.

Když R¹ je fenyl, mohou se používat benzoylchlorid nebo ví tvorbě výhodné amidové vazby. benzylsulfonylchlorid, se může ₂. Fehylisokyanid se použije když anhydrid kyseliny benzoové k Benzylsulfonylhalid, jako je používat podobně když Y je SO

Y je HNC(O). Fenylchlormravenčan se použije když Y je OC(O), zatímco fenylthiomravenčan se použije když Y je SC(O).

Ί

Konkrétně uvažované substituované fenylové R skupiny zahrnují ty, u nichž substituent může být zaveden -do kterékoli pozice kruhu., přičemž výhodné jsou meta a para pozice. Monosubstituované fenylové R¹ skupiny jsou výhodnější než disubstituované skupiny.

Uvažované halo substituenty zahrnují skupiny fluóru, chlóru, brómu a jódu, kde typické jsou p-chlorfenyl, m-chlorfenyl, τπ-jódfenyl, p-bromfenyl a o-fluorfenyl. Di-halosubstituované fenylové R¹ . skupiny jsou také uvažovány, jako 3,4-dichlorfenyl,

3,5-dichlorfenyl, 2-chlor-4-fluorfenyl a 3-brom-4-fluorfenyl. .

Typické C]_^-C_ig alkylové skupiny přítomné jako substituentové skupiny na fenylu R¹ skupiny zahrnují alkylové skupiny s přímým nebo větveným řetězcem, jako jsou methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, hexyl, oktyl, nonyl, decyl, dodecyl, teradecyl, hexadecyl a oktadecyl. Výhodné jsou C₁~c₁₂ alkylové skupiny, přičemž obzvláště výhodné jsou C _T - C ₆ alkylové skupiny a nejvýhodnější je methyl. Ty_p.icky_ zahrnují výhodné R¹ skupiny o-, m- a p-tolylové (methylfenylově) a p-t-butylfenylové skupiny jakož i 3,4-dimethylfenylově a 3,5-dimethylfenylové skupiny.

Typické ^ci“^ci8 alkoxylové skupiny jsou ethery obsahující ^cl^-c18 alkylovou skupinu, nebo obzvláště výhodnou C^-Cg alkylovou skupinu. Zde je výhodná methoxy skupina. Typicky zahrnují výhodné

Ί

R skupiny o-, m- a p-anisyl (methoxyfenyl) jakož i 3x4-dimethoxyfenýl a 3, 5-dimethoxyfényl. |

......'Nitrofenylová R^{1 _}skupina se snadno připraví acylací 1 * '* s*použitím 3- nebo 4-nitrobenzoylchloridu. Acylace 3,4- nebo

3,5-dinitrobenzoylchloridem poskytuje odpovídající 3,4a 3,5-dinitrofenylové R¹ skupiny. Tvorba amidů s použitím 3- nebo

4-trifluormethylbenzoylchloridu ' podobně poskytuje 3a 4-trifluormethylfenylové R¹ skupiny.

Substituovaná fenylová R¹ skupina může také obsahovat amino, mono-C₁-C_lg alkýlamínové, di-C^-C_lg alkylaminové, benzylaminové, ^cl^-c18 alkylbenzylaminové a ^ci~^ci8 alkylkarboxamidové substituenty, přičemž ^C]_^-C₁₈ alkylové substituenty jsou jak se rozebírá dříve.

Aminofenylové R¹ skupiny se . ne]snadněji připraví z odpovídajících nitrofenylových R¹ skupin katalytickou redukcí nitroskuipny po vytvoření amidické vazby, jak se rozebírá dříve.

Takto se například po použití 3- nebo 4-nitrobenzoylchloridu při tvorbě amidické vazby vytváří redukcí s paládiem na uhlí odpovídající 3- nebo 4-aminofenylová. R¹ skupina.„Podobné použití.

3,4- nebo 3,5-dinitrobenzoylchloridu poskytuje po redukci odpovídající 3,4- nebo 3,5-diaminofenylovou R¹ skupinu. 1 . Některé di-C^-Cg alkylaminobenzoové kyseliny, jako je

4-diethylaminobenzová kyselina a 3- . a „ 4-dimethylaminobenzová kyselina, se dají získat z komerčních zdrojů a použít k vytvoření patřičných benzoylhalidů nebo. anhydridů pro syntézu R-L-obsahujícího amidu. Ostatní di-C^-c^g alkylaminobenzoové kyseliny a ty sloučeniny, jež mají dvě dialkylaminové skupiny, mohou být připraveny s použitím dobře známých alkylačních technik z odpovídajících aminobenzoových kyselin nebo diaminobenzoových kyselin, jež jsou také komerčně dostupné.

Mono-C₁*-C₁₈ alkylaminofenylovou R¹ skupinu lze připravit z odpovídájícícho mono-Cj-C^g alkylaminobenzoylhalidu, jehož zbývající dusíková valence je blokována snadno odstranitelnou chránící skupinou, jako je t-Boc, jenž může být odstraněn kyselinou, nebo benzylová skupina, jež může být odstraněna, pokud je to žádoucí, hydrogenaci s použitím paládia na uhlí. Acylace tedy může proběhnout s použitím N-benzyl-N-propylaminobenzoylchloridu a s odstraněním N-benzylové skupiny katalytickou hydrogenaci, a poskytnout mono-C-j^-C^g alkylaminofenylovou, R¹ skupinu. Benzylová skupina samozřejmě nemusí být odstraňována a takto se dojde k ^ci“^ci3 alkylbenzylaminové skupině.

Každý z fénylůvých nebo substituovaných feňylovýčh substituentů diskutovaných výše může být vytvořen dobře známými reakcemi vytvářejícími amid. Při typické reakci reaguje patřičný benzoylhalid nebo anhydrid kyseliny benzoové, jako je p-fluorbenzoyl chlorid, nebo anhydrid kyseliny p-fluorbenzoové, s nechráněnou aminoskupinou jinak chráněného sacharidu, jak bude podrobně vysvětleno později.

Uvažovány jsou jak 1- tak 2-naftylové R¹ skupiny, s tím, že obzvláště výhodná je 2-naftylová skupina. Tyto sloučeniny lze také, jako výše, připravovat standardní technologií vytváření amidu, jako je reakce 2-naftoylchloridu s aminem patřičného cukru, jak se rozebírá výše.

Rozumí se, že podobné substituenty jsou přítomné na oxa-, aza- a diazahydrokarbylových arylových skupinách. Například k provedení acylační reakce lze využít kterýkoli z chloridů dvou kyselin furoylových, ze dvou thiofenkarboxylových chloridů, tří pyridinkarboxylových chloridů, chloridu kyseliny chinaldové, chloridu kyseliny 3-chinolinkarboxylové, 2-chinoxaloylchlorid a podobně.

Podobně, když R^je SO2 , se použije odpovídající sulfonylhalid. Například lze využívat benzensulfonylchlorid, toluensulfonylchlorid, 8-chinolinsulfonylchlorid, 1- nebo

2-naftalensulfonylchlorid a podobně k tvorbě sulfonamidu. ...

Když Y je HNC(O), vhodným reaktantem je isothiokyanát odpovídající dříve popsané karboxylové kyselině. Takovéto deriváty mohou být snadno připraveny z halidu kyseliny reakcí s azidem za tvorby acylazidu, který podléhá při zahřátí Curtiovu přesmyku na isokyanát.

Když Y je OC(O) nebo SC(O), hydroxy- nebo merkapto- t ' substituovaná arylOvá R^1_skúpiháše nechá reagovat s fosgenem za tvorby chlormravenčanu nebo chlorthiomravenčanu, jenž může . * reagovat s aminem sacharidu za tvorby urethanové nebo thiourethanové vazby k R¹. . j

Fenyl alkylenová R¹ skupina je C-]_-C₃ alkylenová skupina, která je sama substituovaná fenylovou skupinou, s výhodou na koncovém uhlíku hydrokarbylové skupiny. Tato R-^CÍO) skupina takto obsahuje fenolový kruh vázaný k řetězci _t«o 2 - 4 uhlíkových atomech. Typické' CfOjR¹ alkylenová skupiny zahrnují 2-fenylacetoyl, 3-fenylpropionyl a 4-fenylbutanoyl [0CH₂C(O), 0CH₂CH₂C(O) a 0(CH₂)₃C(O), kde φ = fenyl). Tyto sloučeniny mohou. být připraveny reakcí halidu nebo anhydridu patřičné kyseliny s cukerným aminem jako výše. Pro tvorbu nasycené alkylenová skupiny z nenasyceného hydrokarbylového řetězce se může využít katalytická redukce s použitím vodíku a katalyzátoru paládia na uhlí; výhodné jsou nasycené hydrokarbylové řetězce.

R² skupina vytváří β-glykosid s kruhovým systémem sacharidu.

Tato glykosidická vazba se může vytvořit s jednoduchým ^Ci^-C₁₃ hydrokarbylovým' alkoholem, esterem -hydróxykarboxylové kyseliny, » s -hydroxylovanou sialylovanou alkylovou skupinou, nebo s mono- .

a disacharidem, nebo OR² dohromady tvoří ^c]_^-ci8 P^í^Ý řetězec, * větvený řetězec nebo cyklický hydrokarbyl karbamát. ^cl^-c6 hydtokarbylová skupina, jako jsou ethylová nebo benzylová skupina, nebo monosacharid, jako je 3-galaktosyl, jsou obzvláště výhodné. R² může být i vodík.

Typické skupiny vytvářené z jednoduché prekursorové alkoholové skupiny zahrnují C^-C^g přímý řetězec, větvený řetězec nebo skupinu cyklického hydrokarbyl karbamátu. Ilustrativními skupinami jsou zde dříve popsané C₁-Cg alkylové skupiny, jež jsou výhodné, jakož i jejich nenasycené protějšky, jako je allyl-, snyl a but-3-ynyi, jakož delší iť ř

hydrokarbylové skupiny, jako je benzyl, dekahydronaftyl, nonyl, decyl (kapryl), dodec-7-enyl, myristyl, palmityl, stearyl, linolenyl a ricinoleyl.

^cl“^c18 hydrokarbyl karbamát se připraví reakcí isokyanátu odpovídajícího dříve diskutované CiC₁₈ hydrokarbylové skupině s hydroxylovou skupinou redukujícího konce cukru. 1-hydroxylová skupina koncové glukosylové jednotky může například reagovat s ethylisokyanátem za tvorby odpovídajícího ethylkarbamátu (urethanu). Karbonylová skupina karbamátu se nezapočítává do počtu uhlíkových atomů hydrokarbylu.

^cl^-c6 alkyl ^ci^_c5 alkylen íc-karboxylátová R² skupina je ^cl~^c6 alkylester C₂~Cg W-karboxylové kyseliny. Takovéto estery se. připravují z prekursorových esterůQj-hydroxykarboxylové kyseliny, jejichž hydroxylové skupiny se použijí k vytvoření glykosiďické vazby. Typické čč-hydroxykarboxylátové estery zahrnují methyl 2-hydroxyacetát, ethyl 3-hydroxypropionát, t-butyl

4-hydroxybutyrát, hexyl 5-hydroxypentanoát a methyl 6-hydroxyhexanoát. Hydroxylové a karboxylové skupinu jsou tedy na koncích řetězce a jsou oddělené 1-5 methylenovými skupinami. Výhodný je methyl 6-hydroxyhexanoát.

W-tri (C^-C₄ alkyl/feriýl) silyl C₂-C₄ alkylenová R² skupina se vytváří s příslušného prekursorového alkoholu, jehož substituovaná silylová skupina je na druhém konci řetězce, než je hydroxylové skupina (v co-pozici). Jak je dobře známo v oboru, substituované silylové skupiny mohou zahrnou mnohé kombinace ^cl^-c4 alkylových a fenylových skupin, jako je tri-C-j^-Cg alkyl, di-C₁~C₄ alkylfenyl, C-^—C₄ alkyldifenyl a, trifenyl. Typické substituované silylové skupiny zahrnují trimethylsilyl,

4-methylcyklohexyl, dodecyl (lauryl), oleyl, linoleyl, trifenylsilyl, di-t-butylmethylsilyl, dimethylfenylsilyl, t-butylfenylsilyl a podobně._

Typické mono- a discharidy zahrnují 3- á 4-glukosyl (3/4Glc), 3- a 4-galaktosyl_(3/4Gal),. kde 3-galaktosylová skupina je obzvláště výhodná, 3- a 4-N-acetylglukosyl (3/4GlcNAc), 2-,

3-, 4- a 6-mannosyl (2/3/4/6Man), 3- a 6-N-acetylgalaktosyl (3/6GalNAc) a Gaipi->4GlcNAc. Monosacharid může sám vytvářet glykosidickou vazbu se skupinou R®, která zahrnuje· vše kromně sacharidu skupiny R². Takto R® je R² jiná než mono- a discharid.

. ‘Obecný ’strukturní 'vzorec ' obzvláště výhodné sloučeniny obecného vzorce A, ma'jíčí redukční koncovou skupinu 3GalPÓR®, je ukázána níže v obecném strukturním vzorci B, kde X, Y, Z a R¹“⁴ , 6 7

R a. R. jsou jak je definováno dříve’. .

^inhibitorem buněčné adheze . á má strukturu obecného vzorce C, níže, kde X, Y, R¹ , R® a R⁷ jsou jak se uvádí dříve.'

β-glykosidická vazba tvořená -skupinou R² nebo R® může' být vytvořena dobře známými organickochemickými reakcemi, a to sacharidu a jiných prekursorú R² (R®) skupiny, jako reakcí

1-halo sacharidu s hydroxylem prekursorového alkoholu žádoucí R² (R⁶) skupiny v přítomnosti uhličitanu stříbrného (Ag₂CO₃) nebo triflatu stříbra, jakož i enzymatickými prostředky, jako s glykosyltransferasou pro sacharidy.

Uvažovaná R³ skupina může být vodík nebo C^-Cg acyl, jenž je částí esteru C^-Cg acylkarboxylové kyseliny. Cj-Cg acylová skupina je výhodná pro Sloučeninu obecného vzorce II. Typické ^Cl“^C6 acylové skupiny zahrnují formyl, acetyl, propionyl, butanoyl, isobutanoyl, pentanoyl a hexanoyl. Výhodná je acetylová skupina. Acylace sacharidové hydroxylové skupiny je dobře známa a může se provádět s použitím halidu nebo anhydridu patřičné kyseliny.

Uvažovaná R⁴ skupina pro obecný vzorec A může být vodík nebo n

^cl“^cg alkyl, jak se rozebírá dříve pro takovéto alkylové skupiny, nebo benzylová skupina. R⁴ skupina spolu s na ni vázaným kyslíkovým atomem tvoří alkoholovou část esteru. Výhodná je methylová skupina. R⁴ ester lze vytvořit standardními prostředky před adicí skupiny kyseliny sialové, po tvorbě sialylovaného sacharidu s použitím činidla jako je diazomethan, nebo reakcí laktonu s patřičným alkoholem, jak se rozebírá ohledně Schématu 2, později. 'rf

R⁴ skupina pro sloučeninu obecného vzorce III může být buď proton, ^ci^-c6 alkyl nebo benzylová skupina. Je-li R⁴ skupina přítomna jako proton, pak se rozumí, že tento proton může být nahražen farmaceuticky přijatelným kationtem (M), jako je amonium, sodík, draslík, vápník, hořčík a podobně. R⁴ proton nebo jiný kation se zde ve strukturách, jako je obecný vzorec I a C, typicky nevyžnačuje, protože sialyl karboxylová kyselina je obyčejně jonizovaná při fyziologických hodnotách pH kolem 7,2 -7,4 , při nichž se inhibitor obecného vzorec I nebo C používá. Takto je často sialyl karboxylová skupina zde vyznačena jako karboxylát.

R⁵ skupina je vodík, benzyl, methoxybenzyl (výhodný je 3nebo 4-methoxybenzyl), dimethoxybenzyl,„.jako . .je 3,4- nebo 3,.

5-dimethoxybenzyl, nebo ^cx^-cg acylová skupina, jak je rozebráno dříve. Benzylová skupina se obyčejně používá, když se organickochemickou syntézou přidává fukosylová skupina.______ — ~R³“ R⁴ a ~R⁵ skupiny jiné než vodík jsou chránícími skupinami, používanými v průběhu syntézy meziproduktů jako jsou sloučeniny obecných vzorců Β, II a III, výše. Když R³ = R⁴ = R⁵ = H (vodík), sloučenina obecného vzorce II se stává sloučeninou obecného vzorce I, zatímco sloučenina obecného vzorce B se stává sloučeninou obecného vzorce C, když Z je fuko. Podobně, když Z je fuko a R³ = r⁴ = r⁵ = vodík, sloučenina obecného vzorce A se stává sloučeninou obecného vzorce I.

....._Substituentová skupina- -X může - být - e^-Cg acyloxylová skupina^

t.j. C^-Cg acylester prekursorové hydroxylové skupiny v této pozici, C₂-C₆ hydroxylacyloxylová skupina, hydroxylová skupina, a halo skupina, jak se rozebírá dříve, nebo azido skupina. Typické ^ci^_c6 acylové skupiny již byly rozebírány, a C-^-Cg acyloxylová skupina je Cj-Cg acylová skupina, která navíc obsahuje další kyslíkový atom vázaný k uhlíkovému atomu karbonylu acylové skupiny. C₂-Cg hydroxylacyloxylová skupina je dříve rozebíraná C^-Cg acyloxylová skupina, která navíc obsahuje hydroxylovou sybstituentovou skupinu. Typické ^C2^-c6 hydroxylacyloxylové skupiny zahrnují hydroxyacetát, laktát, 3-hydroxybutyrát, 2-hydroxyisovalerát a 2-hydroxykaproát. Substituent X je obvykle jiný než C^-Cg acyloxy nebo C₂-Cg hydroxylacyloxy, pokud se sialylace a fukosylace neprovádějí enzymaticky, jak se rozebírá později.

Syntézy derivátu sialové kyseliny obsahujících substituent X jsou zveřejněny v publikované mezinárodní přihlášce WO'92/16640,'která byla publikována 1. října 1992. Použití těchto sloučenin sialylaci sacharidů je také zveřejněno v této publikaci.

R skupina je methyl nebo hydroxymethyl, takže spolu se znázorněnou karbonylovou skupinou [C(O)] tvoří R? N-acetylovou nebo N-hydroxyacetylovou skupinu. Deriváty kyseliny sialové obsahující kteroukoli R⁷ skupinu mohou být použity při enzymatické sialylaci, jak je zde popsáno.

Obzvláště výhodné inhibitorové sloučeniny obecných strukturních vzorců I a C jsou zobrazeny níže společně s číslem sloučeniny, t.j. sloučeniny 17, 30 - 38 a 43 - 51.

B. Syntéza sloučenin

Výše popsaná sloučenina analogická SLe^x může být připravena mnohými způsoby. Prováděny tedy mohou být enzymatické syntézy, mohou se použít syntézy používající pouze technik organické chemie, a využívat se mohou kombinace jak organických, tak enzymatických syntéz, jak se zde uvádí na příkladech.

Jedním způsobem odlišení mezi organickými a enzymatickými, syntézami je přítomnost jednoho nebo více enzymů v reakčním prostředí založeném na vodě (enzymatická syntéza) proti nepřítomnosti jakéhokoli enzymu ve spojitosti s reakčním prostředím, které je v podstatě bezvodé a používá organická rozpouštědla, jako je acetonitril, methanol, ethanol, dimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid (DMSO), benzen, aceton, dichlormethan, tetrahydrofuran (THF) a podobně (organická syntéza). Bez ohledu na to, která z těchto metod se použije, sacharidy zahrnující laktosamin, galaktosu a glukosamin, musí být v určitém bodu syntézy spojeny dohromady. Poněkud překvapivě je vazba Gaipi->4GlcN laktosaminu také jednou s těch, jež je obtížné vytvořit v syntéze uvažovaných sloučenin.

Laktosamin je sloučeninou uváděnou v - literatuře / ale není snadno dostupný. Laktosamin nebo deriváty laktosaminu přitom ale poskytují dobrý výchozí materiál pro syntézu uvažovaných sloučenin.

I když laktosamin není snadno dostupný, laktulosa, ketosa jež nemá žádnou aminoskupinu, ale obsahuje Galpl->4Fru vazbu, jež je příbuzná laktose a laktosaminu, je komerčně dostupná. Laktulosa, se svou již vytvořenou Gaipi->4Fru vazbou, poskytuje výchozí materiál pro jednu uvažovanou syntézu laktosaminu. Syntéza laktosaminu (sloučeniny 3) jako adiční soli kyseliny je vysvětlena obecně a konkrétně ve Schématu 1 resp. lA,.kde jsou i syntézy peracetyl N-ftalimidolaktosaminu (sloučenina 5) a peracetyl N-ftalimidolaktosamin β chloridu (sloučenina 6). Číslované sloučeniny obou schémat jsou totožné sloučeniny.

•-0·

^S<^h<sm<a 1τ\

ΗΛ hoV-A-_oh

OH

Laktulosa

Laktulosa tedy reaguje čistě s primárním aminem, jenž je amoniovým derivátem, jehož dusíkový atom je vázán k reduktivně odstranitelné blokovací skupině, benzylaminem, jako s reaktantem i rozpouštědlem, za tvorby odpovídajícího N-glykosidu, laktuloso N-benzyl glykosidu (Bn = benzyl; sloučenina 1). Reakce sloučeniny 1 s přibližně stechiometrickým množstvím organické karboxylové kyseliny, mající pKa hodnotu asi 2,5 až 5,0 (ledová kyselina octová) v methánolu poskytla N-benzyl laktosamonium acetát (sloučeninu 2) v 50 - 55 procentním výtěžku. Laktosamonium acetát (sloučenina 3) byl připraven hydrogenolýzou shora uvedeného methanolového roztoku s použitím paládia na uhlí (Pd/C).

Poznamenává se, že na místě benzylaminu lze použít jiné reduktivně odstranitelně blokované aminy. Například na monoa dimethoxybenzylaminy lze pohlížet jako na reduktivně odstranitelné blokované deriváty amonia v tom, že po reakci se sacharidem mohou být i mono- a dimethoxybenzylové skupiny odstraněny hydrogenolýzou. Podobně lze. použít allylamin, blokovací (PMSH) trifenylfosfinem [Pd(Ph₃)₄] v THF jako rozpouštědle.

Tedy: I když se benzylová skupina (Schéma - 1A)- používá vě Schématu 1 jako R^A , rozumí se, že jako R& se může použít monomethoxybenzylová, dimethoxybenzylová a allylová skupina.

Shora uvedený rozbor a ilustrace ve Schématech 1 a 1A vysvětlují postup pro přípravu laktosaminu nebo laktosamoniové soli z laktulosy. V souladu s tímto postupem, laktulosa se smíchá do reakční směsí s primárním aminem, jenž je monosubstituovaným derivátem amonia, jehož dusíkový atom je vázán k reduktivně odstranitelné blokovací skupině. Blokovaný derivát amonia slouží v tomto postupu jako reaktant i jako rozpouštědlo.

Blokovaný derivát amonia (neboli ' primární amin) je přítomen ve dvou- až asi desetinásobném molárním přebytku vzhledem k molárnímu množství použité laktulosy. Primární amin je s výhodou přítomen ve .čtyř- až osminásobném molárním přebytku.

s odstraňováním allylové s polymethylhydrosiloxanem skupiny pomocí reakce a paládium tetrakis26

Jak se poznamenává shora, uvažují se primární aminy obsahující jiné reduktivně odstranitelné blokovací skupiny. Takto 'b~y 1 y 'aTlyTamiřTa p-methbxy běnzy1~amitT“ úspěšně po už i ty ~k t vo r be laktuloso N-glykosidu, s převedením na' odpovídající

N-substituovaný laktosamin.

Reakční směs takto vytvořená se udržuje při teplotě 10°C až 60’C po dobu dostatečnou k vytvoření odpovídajícího laktuloso N-glukosidu, t.j. k náhradě 2-hydroxylóvé skupiny laktosy primárním aminem. Výhodná je teplota od laboratorní teploty (asi 20‘C) do 50^aC. ...

______Doba udržování__j_e__f _unkcí.._něk_olika..._ proměnných, j ako.... je molární přebytek primárního aminu, teploty, žádoucího množství laktuloso N-glykosidu, a může kolísat od asi 8 hodin, když je žádoucí malé množství produktu, až po dva týdny, při použití nízké teploty a malého množství primárního aminu. Například: Když se použil 4 - 7,5 molární přebytek primárního aminu (zde

I'·' benzylaminu), reakce byla úplná po době 7 dní udržování při laboratorní teplotě, ale méně než z 50 procent % úplná za tutéž dobu, když se -za stejných podmínek použil dvojnásobný přebytek benzylaminu. Když se teplota udržování zvýšila na 50“C, reakce s použitím čtyřnásobného nadbytku aminu byla úplná po dvou dnech (48 hodinách), zatímco reakční teplota 70°C způsobila rozklad.

Přítomnost katalyzátoru Lewisovské kyseliny, jako je chlorid zinečnatý, trifluormethansulfonát zinečnatý nebo trifluormethansulfonát hořečnatý, v reakční směsi zvyšovala reakční rychlost tak, že reakce používající 7,5 násobný přebytek benzylaminu, které byly bez katalyzátoru úplné po sedmi dnech při pokojové teplotě, doběhly k ‘ úplnosti za dva dny'(48 hodin). Podobný výsledek se získal s použitím kyseliny trifluoroctové jako katalyzátoru,·což je výhodné.

Laktulosa je nerozpustná v alkoholových rozpouštědlech, včetně methanolu. Láktulósu' lze rozpustit v hořkém DMF a udržet v roztoku po ochlazení. Jak methanol tak DMF se mohou použít jako spolurozpouštědlo s primárním aminem, když je přítomen také shora rozebíraný katalyzátor. Například: Když se methanol použil jako spolurozpouštědlo, nedošlo k žádné reakci ani při laboratorní teplotě, ani při 50’C. Když se však použil jako katalyzátor chlorid zinečnatý, s 4-násobným přebytkem benzylaminu a s methaňolem jako spolurozpouštědlem byla reakce úplná po 48 hodinách při laboratorní teplotě.

Laktuloso N-glykosid připravený jak se rozebírá výše je hygroskopický a proto se používá rychle po preparací. Tento N-glykosid se nechá reagovat s 0,1 ekvivalenty až s ekvivalentním množstvím (pro nej lepší výtěžky) karboxylové kyseliny, mající pKa hodnotu asi 2,5 až 5,0 , v alkoholovém rozpouštědle při teplotě 10°C až 30°c k převedení laktuloso N-glykosidu na laktosamoniovou sůl, jejíž aminoskupina je blokována s výše zmíněnou reduktivně odstranitelnou blokovací skupinou, t.j. na amino-blokovanou laktosamoniovou sůl mající reduktivně odstranitelnou blokovací skupinu vázanou k aminovému dusíkovému atomu.

Použitá karboxylová kyselina může být kterákoli z velkého počtu těchto kyselin, jak jsou dobře známé v oboru, jako je kyselina octová (pK_a = 4,76), propionová (pK_a = 4,88), máselná (pK-j. = 4,82), chloroctová (pK_a = 2,80) a methoxyoctová (ρΚ^ = 3,52), a podobně. Výhodná je ledová kyselina octová. Typické C^-C^ alkoholy zahrnují methanol, jenž je výhodný', ethanol, propanol a isopropanol. Výhodná je reakční teplota rovná laboratorní teplotě.

Koncentrace laktuloso N-glykosidu může kolísat od 0,1 M až po v podstatě nasycení. Typicky používané koncentrace jsou 0,5 až 1,5 M v rozpouštědle.

Reduktivně odstranitelná blokovací skupina je pak odstraněna. Hydrogenolýza s použitím paládiového katalyzátoru je výhodný postup tohoto odstranění, obzvláště když se použil benzylamin nebo methoxybenzylamin. PMSH a Pd(Ph₃)₄ se používají když primárním aminem je allylamin.

Shora uvedená redukce může probíhat v jakémkoli patřičném rozpouštědle pro laktosamoniový derivát. Například: Hydrogenolýzu lze provádět v^fokyselené vodě nebo v C^-C^ alkoholu jako výše.

PMSH a Pd(Ph₃)₄ se typicky používají v THF nebo podobném rozpouštědle.

Takto vytvoř-ená-laktosamoniová—sů-1—je—obeeně-po-preparaciizolována, i když, v závislosti na použitém, rozpouštědle a na použití určeném, pro tuto sloučeninu,- izolace není nezbytná. Tam, kde je žádoucí izolovat laktosamoniovou sůl, jejíž anion je při redukci, lze tuto sůl jako je chromatografie nebo připraven ze soli ionexovou následovanou extrakcí volné anionická forma kyseliny použité získávat dobře známými metodami, srážení. Volný laktosamin může být chromatografií nebo neutralizací, báze do patřičného organického rozpouštědla.

Methanolový roztok, obsahující sloučeninu 3 a pocházející z hydřogenolytické reakce, nebo jiný patřičný roztok se pak nechá reagovat s anhydridem kyseliny ftalové (PhthO) v přítomnosti alkalického katalyzátoru, jako je Na₂CO₃ za tvorby N-ftalamid polokyseliny, sloučeniny 4. Po vytvoření vhodné amid polokyseliny, např. sloučeniny 4, bylo odstraněno veškeré reaktivní rozpouštědlo, jako je methanol. Hydroxyly disacharidu byly peracylovány a ftalimidový kruh uzavřen vzniku peracetylované (Ac) ftalimidové sloučeniny 5 v 10 procentním výtěžku bráno na výchozí materiál.

Uvažuje se též další syntéza laktosamoniové soli z laktulosy.

Zde se ponechá laktulosa reagovat v nerezovém autoklávu s ekvimolárním množstvím octanu amonného v kapalném čpavku jako rozpouštědle, přičemž se kapalný * čpavek vychlazeného na -78°C. Výsledná reakční teplotu od nula„ stupňů C .do,asi, 80-°C, a - udržuje se po dobu pěti hodin až asi pěti dnů, v závislosti na použité teplotě a žádané konverzi. Tato reakce vytváří laktulso aminoglykosid.

Po odstranění čpavku a octanu amonného, přičemž octan ammoný se typicky,odstraňuje pod vakuem,- -se na výsledný materiál prostý amonia působí karboxylovou kyselinou, jako dříve, k vytvořeni laktosamoniové soli, např. sloučeniny 3. Na laktosamoniovou sůl se také působí jak je rozebráno výše k vytvoření sloučeniny 5.

přidává do autoklávu směs se zahřeje na β-anomer sloučeniny 5 se získal s celkovým výtěžkem 3,8 procenta v první krystalizaci, když se v prvním reakčním kroku použila reakční teplota 37’C a reakční doba 24 hodin.

I když výtěžek sloučeniny 5 byl nižší při použití této procedury než při dříve rozebraném postupu, takovýto postup se vyhne potřebě použití reduktivního odstraňování amino-blokující skupiny. Katalyzátor obsahující paládium používaný při této redukci je nejnákladnější činidlo používané při těchto syntézách. Poznamenává se, že lze jako rozpouštědlo použít methanolický čpavek místo kapalného čpavku, a obejít takto potřebu používání autoklávu.

Amin sloučeniny 5 ve Schématu 1 je znázorněn ve vazbě na skupiny R^B a R^B , které dohromady se zobrazeným dusíkovým atomem tvoří C₄-Cg cyklický imid, jako je typicky ftalimid (Phth) ve sloučenině 5. Poznamenává se, že anhydridy kyseliny jantarové, jablečné, mono- a dimethyljantarové a citrakonové se dají také použít k vytvoření podobných imidů tak, že R^B a R^B dohromady s dusíkovým atomem tvoří odpovídající imid. Cyklický imid tvořený

Ο Ώ

-NRR skupinou poskytuje aminochránící skupinu, která je stala za podmínek, kdy jsou 0-acylové skupiny, jako je acetát, odstraňovány, ale která může být lehce odstraněna hydrazinem. Poznamenává se také, že se nemusí používat anhydrid, ale může. se nahradit ^ci^-c6 alkyl poloester halidem, jako je methylftaloylchlorid.

Sloučenina 5 je ve Schématu 1 znázorněna jako β-anomer. α-acetát se vytváří také, a výtěžek žádaného β-acetátu lze téměř zdvojnásobit zakoncentrováním matečného louhu, z nějž se získala sloučenina 5, do pěny, s následným rozpuštěním v DMF a pak reakcí s hydrazinium acetátem, který odštěpuje acetátovou skupinu a způsobuje tvorbu β-ΟΗ anomeru. Po izolaci reakčního produktu běžnou extrakční technikou a vysušení, rozpuštění vysušeného materiálu v pyridinu a působení nadbytkem ačetanhydridu na pyridinový roztok se získá další 8,3-procentní celkový výtěžek sloučeniny 5. Dojde se ke konečnému 18,7-procentnímu výtěžku sloučeniny 5, bráno na výchozí materiál. - 30

Reakce sloučeniny 5 s AlClg v dichlormethanu za laboratorní teploty poskytla v podstatě kvantitativní výtěžek sloučeniny 6.

__Schéma 2, níže,_vysvětluje_„transformaci—sloučeniny—6-,peracetyl N-ftalimdolaktosamin β-chloridu, na plně chráněný sialylovaný .tetrasacharid, sloučeninu - 13. Takto- se ponechá sloučenina 6 reagovat při pokojové teplotě po dvě hodiny v kroku a se sloučeninou 9, jejíž syntéza se rozebírá v příkladech, v přítomnosti molekulárních sít, kolidinu a trifluormethansulfonátu (triflatu) stříbra, s použitím dichlormethanu jako rozpouštědla, k přípravě odpovídajícího trisacharidu. Na tento plně chráněný trisacharid se napřed působí v kroku 'b'8'0 procentní vodnou kyselinou octovou po dvě hodiny při 80°C k odstranění benzylidenové chránící skupiny na 4- a 6pozicích koncové Gal skupiny. Pak se v kroku c provede reakce hydrazin hydrátu se získaným částečně deprotektovaným trisacharidem za refluxování po 17 hodin k odstranění ftalimidoa acetyl- skupin a vytvoření plně deprotektovaného trisacharidu. Reakce deprotektovaného trisacharidu v 'kroku d s diallylpyrokarbonátem ve směsi methanol : voda (5 :·1^poskytla sloučeninu 10, kde AL je allylcarbamoyl.

Když R² ,není glykosidem jak se popisuje v syntézách Schématu 2, ale je výhodnou C^-C^g hydrokarbylovou skupinou, jako je benzyl, glykosylační kroky a a b se vynechají, s poskytnutím tetrasacharidu obecného vzorce A, I nebo II, kde R² je jiný než mono- nebo disacharid.

Sloučenina 10 pak byla enzymaticky sialylována v kroku e ve vodném pufru s použitím a-(2,3)-sialyltransferasy (EC 2.4.99.6) a rady jiných enzymů. Reakce byla,.sledována.» TLC po-10 -12 dnů při pokojové teplotě, kdy více než 95 procent sloučeniny 10 bylo spotřebováno a byla připravena sloučenina 11.

Sloučenina 11 byla získána jako hustý sirup, jenž byl dvakrát odpařen s pyridinem a pak držen.ve .vakuu po 20 hodin. Takto odvodněný materiál byl rozpuštěn v pyridinu, k němuž se přidalo katalytické množství 4-dimethylaminopyridinu jakož i anhydrid kyseliny octové. Dvě další přidání anhydridu kyseliny octové během následujících 44 hodin doplnily acetylační reakci a tvorbu laktonu mezi karboxylem sialylu a cukerným hydroxylem v kroku f. Pak byl k získanému materiálu přidán methanol k tvorbě sialyl methylesteru a pak byl přidán další anhydrid kyseliny octové k acetylaci uvolněného hydroxylu a tvorbě plně chráněné sloučeniny 12 v kroku g.

Musí být jasné, že sloučeniny 11 a 12 jsou sloučeniny obecných strukturních vzorců A a III. Při použití sloučeniny 12 jako příkladu, Z je C^-Cg acyl (acetyl), X je C^-Cg acyloxy (acetoxy), R² je 3GalpO-ethyl, R³ je acetyl, R⁴ je methyl a R¹ je allyloxy. Stejné musí být jasné, že dříve zmíněné jiné skupiny X pro sloučeninu kteréhokoli z obecných strukturních vzorců jsou pohodlně zavedeny v sialylačním kroku. Když je žádoucí, aby byly v inhibitorech obecných strukturních vzorců I a C přítomné X substituenty sialylové jednotky, což jsou C^-Cg acyloxy a ^Cx^-Cg hydroxylacyloxy, je s výhodou, aby sloučenina.10 (nebo disacharid bez 3GaipOR² skupiny) byla peracetylována, allyloxykarbamylová skupina (AL) sloučeniny 10 odstraněna, jako v kroku h, jednou z R¹ acylových skupin obsahujících fenylový kruh, jako v kroku c Schématu 3. Molekula je pak deprotektována a enzymaticky sialylována a fukosylována jak se rozebírá později. Pro jiné z R^1-4 skupin nebo podobné sloučeniny obecriých strukturních vzorců A, B nebo III, lze nahradit 3Galp glykosid p

R sloučeniny 9, acylačm činidlo kroků fa g, a esterifikačni alkohol kroku f.

Působení polymethylhydrosiloxanem (PMHS) na získanou sloučeninu 12 v bezvodém THF při laboratorní teplotě, následované působením paládium tetrakistrifenylfosfinu [Pd(Ph₃)₄] po 18 hodin poskytlo sloučeninu 13 s 87 procentním výtěžkem v kroku h.

Sc bi em j=> 7?

benzoylována v kroku b s benzoylchloridem prováděna v kroku c 15 s tri-O-benzyla tetramethylmočovinou na -20’C a přidáním

Ve Schématu 3, níže, je načrtnuta jedna zbývající syntéza pro ilustrativní inhibitor, sloučeninu 17 s obecnými vzorci I a C. Takto poskytuje reakce sloučeniny 13 s jedním ekvivalentem ledové kyseliny octové ve vodném methanolu při 50’C po 48 hodin selektivní deacylaci Glc 3-hydroxylu a dává sloučeninu 14 v 65 procentním výtěžku kroku a.

Sloučenina 14 byla pak selektivně v 83 procentním výtěžku reakcí v dichlormethanu s pevným hydrogenuhličitanem sodným při pokojové teplotě po 24 hodin za tvorby sloučeniny 15. V tomto kroku nebo v analogickém kroku jsou přidávány alternativní R¹ skupiny sloučenin obecných strukturních vzorců A, I, II, a III, když R² není sacharidová jednotka.

Organickochemická fukosylace byla Schématu 3 smícháním sloučeniny fukosylchloridem, molekulárními síty v dichlorethanu, následným ochlazením chloridu ciničitého a chloristanu stříbrného. Po pomalém zahřátí na pokojovou teplotu a míchání po 24 hodin byla připravena sloučenina 16 v 77 procentním výtěžku.

Sloučenina 16 je takto sloučeninou s obecnými strukturními vzorci A a B, kde Z je blokovaná fukosylová skupina, jakož i sloučeninou obecného vzorce II. Použití alternativních R⁵ skupin poskytuje zbývající sloučeniny těchto obecných strukturních vzorců, když jsou kombinovány s dříve rozebíranými skupinami X a R^{1 4}.

skupiny, R⁵, fukosylové sacharidové v kroku d hydrogenací s použitím uhlí [Pd(OH)₂/C] v methanolu jako pokojové teplotě po jednu hodinu O-benzylových chránících skupin.

O-benzylové chránící jednotky byly odstraněny hydroxidu paladnatého na rozpouštědle. Reakce při poskytla úplné odstranění Filtrace a zkoncentrování debenzylované sloučeniny poskytlo olej, který byl rozpuštěn ve směsi methanol : voda (4 : 1), k níž byl přidán práškový methoxid sodný v kroku e. Po 16 hodinách reakce při pokojové teplotě byl získán 72 procentní výtěžek inhibitoru, sloučeniny 17.

Když R⁵ je C-^-Cg acylová skupina hydrogenační krok se —_--—nepouží-vá-a-R—C^Cg-acy-lová-skupina—se-odstraní—spolu-s—R—a—R— skupinami. Použití Cj-Cg acylové skupiny a obejití hydrogenačního kroku též poskytuje cestu k syntéze R¹ skupin obsahujících nitroskupinu.

Schéma 3

V

Když R² skupina je mono- nebo disacharid použije se patřičně blokovaný mono- nebo disacharid, jako je sloučenina 9 Schématu 2. .Například:—La-k-tosa-í—G-j—Gyg-g-l-ykosid—laktosy^nebcTmerildiosa mohou být převedeny na chráněné (blokované) benzylidinové deriváty podobné derivátům sloučeniny 9 a pak ' použity ve spojovacím kroku a Schématu 2 a výsledný produkt použit v následujících krocích Schémat 2 a 3.

Rozumí se, že laktosamin a jeho deriváty mohou být připraveny jinými způsoby, dobře známými zkušeným pracovníkům. Dále se rozumí, že trisacharidová sloučenina 10 může být a jiných může být připravena enzymaticky reakcí ethyl-3-O-(2-N-allylc)xykarbonyl--2x amino-2-desoxy-p-D-glukopyranosyl)-p-D-galaktosidu s použitím uridin-5'-difosfát-galaktosyltransferasy s UDP-Gal, patřičných enzymů podle známých postupů. Podobně sloučenina 11 fukosylována enzymaticky s použitím některé fukosyltransferasy (FT), jako je fukosyltransferasa V, jakož i nukleotidového donoru cukru, GDP-fukosy, a jiných enzymů užitečných pro regeneraci GDP-fukosy, podle známých postupů. Samozřejmě jsou pro tyto změny syntézy vyžadovány menší změny v uvedených reakčních schématech, ale tyto změny jsou jistě v rámci zkušeností běžného pracovníka.

Ještě další užitečné syntetické v Schématu 4, níže. Zde je výchozím sloučenina 14a, sloučeniny 14 Schématu 3.

postupy jsou ukázány materiálem volná báze,

Schéma 4

'i· ·λ·8£

Takto byla sloučenina 14a ponechána v kroku aíreagovat s malým nadbytkem karbobenzoxychloridu (CBZ-C1) v dichlormethanu v přítomnosti hydrogenuhličitanu sodného, s následným přidáním dalšího ekvivalentního množství CBZ-C1 asi po osmnácti hodinách, za tvorby amino-chráněné sloučeniny 39 v 65 procentním výtěžku. Krok b Schématu 4 je v podstatě stejný glykosylační step jako je uveden v kroku c'Schématu 3, přičemž sloučenina 40 se tvoří v 73 procentním výtěžku, a zpět se získá 17 procent výchozí sloučeniny 39.

„ Fukosylovaný volný amin, sloučenina.41, se pak vytvořil v-96 procentním výtěžku v kroku c reakcí s 10 procenty Pd-C v mravenčanu amonném v ethanolu za refluxování. Volný amin 41 d sloučeniny 41 'byl potom ponechán reagovat s acyl (YR-¹-) chloridem v dichlormethanu v . přítomnosti hydrogenuhličitanu sodného k poskytnutí odpovídajícího hydroxy-blokované N-acetylované sloučeniny, zde. 3,5-dichlorbenzamidového derivátu, sloučeniny 42, ve vysokém výtěžku.

Struktury několika obzvláště výhodných inhibitorů, sloučenin 17, 30 - 38 a 43 - 51 již byly ukázány. Sloučeniny 30 - 33 byly připraveny z jejich příslušných prekursorových sloučenin 26-29 jak je popsáno pro konversi sloučeniny 16 na sloučeninu 17 ve Schématu 3. Sloučeniny 34 - 38 a 51 byly připraveny způsoby analogickými těm, co jsou uvedeny ve Schématu 3. Sloučeniny 43 49 byly připraveny podobně, s použitím obecného přístupu uvedeného ve Schématu 4. Sloučenina 50 byla připravena podle Schématu 3, s. použitím redukce ze Schématu 4, krok c. Tyto sloučeniny jsou sloučeninami o obecném strukturním vzorci I jakož i obecném strukturním vzorci A.

C. Způsoby testování inhibice buněčné adheze

Mnohé přímé a nepřímé způsoby pro in vitro vyhledávání inhibitorů interakcí ligand - receptor jsou dostupné a dobře známé těm, co jsou zběhlí v oboru. Stanovena může být například schopnost inhibovat adhezi buněk nesoucích SLe^x k buňkám exprimujícím konkrétní selektin.

Jak se rozebírá výše, geny některých selektinových receptorů byly klonovány, a tyto geny mohou tedy být vloženy a exprimovány v široké řadě buněk, jako jsou COS buňky, CHO buňky, adenovirem transformované lidské ledvinné buňky, jak se používají zde, a podobně, takže se v testech může používat některý rekombinantní selektinový receptor, jako je rELAM (rekombinantní ELAM-1), jak se popisuje později. Navíc: Buňky, které normálně neexprimují SLe^x, jsou schopné transformace jedním nebo více glykosyltransferasovými geny, jež udělují transformovaným buňkám schopnost syntetizovat tento ligand. [Viz např. Lowe et al. , Cell 63: 475-484 (1990)]. V některých testech se inhibitorová sloučenina nebo činidlo inkubuje se značenými,buňkami nesoucími SLe^x, a aktivované buňky, exprimující povrchové selektiny, jsou imobilizovány na pevném povrchu. Inhibice buněčné adheze pak může být stanovena detekcí značky vázané k povrchu po patřičném promytí.

-Jb-vítro-testy-uva-ž ováných—s-l-oučen-i-n^analogických-SLe^L-j-Sou.

typicky kompetiční testy, jež detekují schopnost uvažované sloučeniny kompetitivně inhibovat -vazbu selektinu k buňkám obsahujícím SLe^x. Buňkami obsahujícími selektin jsou typicky aktivované . destičky nebo endotheliální buňky s některým rekombinantním selektinem, podle jeho užitečnosti, zatímco buňkami nesoucími SLe^x jsou obyčejně neutrofily nebo HL-60 buňky.

Jiná provedení testů zahrnují detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti různých fyziologických změn bud v buňkách nesoucích SLe^x ligand nebo v buňkách nesoucích selektin, jak jsou důsledkem jejich interakce. Příklady vhodných testů zahrnují měření změn v transkripční aktivitě, vyvolaných vazbou (viz např. PCT publikaci. číslo. 37128.2.0.),. .detekci, extracelulárních účinků zprostředkovaných různými buňkami. (viz např. PCT publikaci, číslo 90/00503) a detekci změn membránového potenciálu jednotlivých buněk (viz např. U.S. patent číslo 4 343^782), jež jsou zde všechny zařazeny odkazem. Alternativně lze -^detekovat konformační změny v izolovaných,receptorech. * nebo·ligandech, viz např. U.S. patent číslo 4 859 609, jenž je zde zařazen odkazem. Ještě dále: Lze ' vázat . buňky exprimujíci SLe^x k selektinu navázanému na pevné podložce, lyžovat navázané buňky a testovat na bílkovinu, která může být přítomná pouze v navázaných buňkách.

Každá složka testu, včetně ligandu a selektinového receptoru, nebo SLe^x sloučeniny, může být navázána k pevnému povrchu. V oboru jsou známé mnohé způsoby k imobilizaci biomolekul- na pevné povrchy-. Například: Pevným-povrchem může. být membrána (např. nitocelulosa), mikrotitrační destička (např. PVC nebo polystyren), nebo zrnko. Žádaná složka může být navázána kovalentně nebo spojena nekovalentně prostřednictvím nespecifické vazby. - Jako materiál pro pevný povrch se může využívat široká řada organických a anorganických polymerů, jak přírodních, tak syntetických. Ilustrativní polymery zahrnují polyethylen, polypropylen, poly(4-methylbuten), polystyren, polymethakrylát, poly(ethylentereftalát), hedvábí, nylon, póly(vinylbutyrát), silikony, polyformaldehyd, celulosu, acetát _t celulosy, nitrocelulosu, atd.' Jiné materiály, jichž l2e využívat/ zahrnují papír, skla, keramické materiály, kovy, metaloidy, polovodičové materiály a podobně. Navíc jsou zahrnuty látky, které vytvářejí gely, jako bílkoviny, například želatiny, lipopolysacharidy, silikáty, agarosa, a polyakrylamidy, nebo polymery, které tvoří několik vodných fází, jako dextrany, polyalkylenglykoly (alkylen o 2 až 3 uhlíkových atomech) nebo povrchově aktivní látky, například amfifilní sloučeniny, jako fosfolipidy, alkylamoniové soli. s dlouhým alkylovým řetězcem (12 - 24 uhlíkových atomů) a podobně. Když je pevný povrch porézní, mohou se využívat různé velikosti pórů v závislosti na povaze systému.

f‘·.'

K získání různých vlastností se může při přípravě povrchu využívat více různých materiálů, obzvláště jako laminátů. Například: Potažení bílkovinou, jako je želatina, může ” být využito k odstranění nespecifických vazeb, zjednodušení kovalentní konjugace, zesílení signálu detekce a podobně.

Když je žádoucí kovalentní provázání sloučeniny a povrchu, povrch je obvykle polyfunkční nebo schopný stát se polyfunkčním. Funkční skupiny, které mohou být přítomné na povrchu a využívané k vazbě, mohou zahrnovat karboxylové kyseliny, aldehydy, aroinoskupiny, kyanové skupiny, skupiny ethylenu, hydroxylové skupiny, merkaptoskupiny a podobně. Způsob navázání široké řady sloučenin k různým povrchům je dobře znám a je bohatě vysvětlován v literatuře. Viz například Immobilized Enzymes, Inchiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) a Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 243: 3059 (1970), což je zde zařazeno odkazem.

Navíc ke kovalentnímu navázání mohou být ' použity různé navázání některé složky testu, typicky nespecifickou absorpcí

Povrch je typicky blokován druhou nespecifického navázání značených složek způsoby pro nekovalentní Nekovalentní navázání je sloučeniny k povrchu sloučeninou k zabránění testu. Alternativně · je povrch navržen ták, že váže nespecificky jednu složku, ale neváže významně další. Například: Povrch nesoucí lektin, jako je konkavalin A, váže sloučeninu obsahující -cukr—a-le—ne—značenou—b-í-l-kov-i-nu-—která—nen-í—g-l-y-kosyl ována—Různépevné povrchy pro použití k nekovalentnímu napojení složek testů jsou shrnuty v U.;S. patentech Čísla 4 447 576 a 4 254 082, jež jsou zde zařazeny odkazem.

Značka zmíněná shora může být připojena přímo nebo nepřímo k žádané složce testu podle způsobů dobře známých v oboru, nebo může být endogenní bílkovinou navázané buňky. Lze použít širokou řadu značek. Nejběžnější způsob detekce je použití autoradiografie se sloučeninami značenými ³H, ¹²⁵I, ³⁵S‘, ¹⁴C, nebo ³²P a podobně. Výběr radioaktivního isotopu závisí na přednostech výzkumu, daných snadností syntézy, různou stabilitou, a poločasem vybraného isotopu. Jiné, neradioaktivní značky zahrnují ligandy, jež se váží. ke značeným. protilátkám, fluorofory, chemiluminiscenční činidla, enzymy a protilátky, jež mohou sloužit, jako specifické vazebný člen pro značený ligand. Výběr značky závisí na potřebné citlivosti, snadnosti-konjugace se sloučeninou, požadavcích stability a dostupné instrumentaci.

Neradioaktivní značky . jsou často připojovány nepřímým způsobem. Obecné je molekula.ligandu (např. biotinu). navázána, kovalentně k jiné molekule. Ligand se pak váže k molekule anti-ligandu (např. streptavidinu), která je buď inherentně detekovatelná, nebo kovalentně navázána k signálnímu systému, jako je detekovatelný enzym, fluorescenční sloučenina, nebo chemiluminiscenční sloučenina. Ligandy a antiligandy lze široce obměňovat. Když ligand má přirozený antiligand, například biotin, thyroxin, a kortisol, -lze jej použít ve — spojení se .značenými,, přirozeně se vyskytujícími anti-ligandy. Alternativně lze používat haptenové nebo antigenní sloučeniny v kombinaci s protilátkou.

Dříve zmíněná ..značka může být - i enzym nebo jiná bílkovina přítomná v buňkách, jejichž adheze má být inhibována. Množství tohoto enzymy může být přitom používáno jako značka u stanovení rozsahu vazby. Myeloperoxidasa je jedna takováto bílkovina přítomná v buňkách HL-60, jež může být využita ve studiích inhibice vazby rozebíraných níže.

Také molekuly SLe^x mohou být přímo konjugovány ke sloučeninám generujícím signál, např. konjugací s enzymem nebo fluoroforem. Enzymy, o něž je zájem, jsou primárně hydrolasy, konkrétně fosfatasy, esterasy a glykosidasy, nebo oxidoreduktasy, konkrétně peroxidasy. Fluorescenční sloučeniny zahrnují fluorescein a jeho deriváty, rhodamin a jeho deriváty, dansýl, umbelliferon, atd. Chemiluminiscenční sloučeniny zahrnují luciferin, a 2,3-dihydroftalazindiony, např. luminol. K přehledu použití různých systémů vytvářejících signál viz U.S. patent číslo 4 391 904, jenž je zde zařazen odkazem.

D. Farmaceutické prostředky^

Uvažuje se_: také farmaceutický prostředek, obsahující uvažovanou sloučeninu' · analogickou SLe^x , rozpuštěnou nebo rozptýlenou ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo ředidle. Takovýto prostředek obsahuje adhezi inhibující množství dříve rozebírané uvažované sloučeniny analogické SLe^x. ..........

Uvažovaný farmaceutický prostředek může být použit k blokování nebo inhibici buněčné adheze spojené s řadou chorobných stavů. Například: Řada zánětlivých chorobných stavů je spojena se selektiny, exprimovanými na vaskulární endotheliální buňky nebo na destičky. Výraz zánět se zde používá tak, že odkazuje na odezvu jak specifického, tak nespecifického obranného systému. Reakce, specifického obranného systému je -reakce specifického imunitního systému na antigen. Příklady reakcí specifického obranného systému zahrnují protilátkovou odezvu na antigeny, jako jsou viry, a hypersensitivitu zpožděného . typu. Reakce nespecifického obranného systému je zánětlivá odpověď zprostředkovaná leukocyty obecně nevybavenými imunologickou pamětí. Takovéto buňky zahrnují makrofágy, eósinofily a neutrofily. Příklady nespecifických reakcí zahrnují okamžitý otok po včelím žihadle, a hromadění PMN leukocytů v místech

-bakteriální—-infekce—(např-.—pulmonární-inf il-tráty—_u-bakter-iální— pneumonie a hromadění hnisu v abscesech).

Jiné léčitelné chorobné stavy- zahrnují např. reumatoidní arthritidu, post-ischemické poškození tkáně zprostředkované leukocyty (reperfusní poškození), omrzliny nebo chladový sok, akutní poškození plic zprostředkované leukocyty (např. syndrom respirační nedostatečnosti dospělých), astma', traumatický šok, septický šok, nefritidu, a akutní a chronické záněty, včetně atypické dermatitidy, psořiasy, a zánétlivých střevních onemocnění. Různé patologické stavy zprostředkované destičkami, jako atherosklerosa a srážení krve, mohou být léčeny také. Navíc: Metastázování nádoru může být zabráněno nebo může být inhibováno inhibicí adheze obíhajících, nádorových, buněk. Příklady zahrnují nádory tlustého střeva a melanomy.

Příkladem obzvláště dobré odpovědi na léčbu., uvaž ovánými.. farmaceutickými -prostředky je reperfusní poškození. -Prostředek, jenž inhibuje interakci P-selektinového ligandu -může být f * obzvláště, užitečný u léčby nebo prevence.reperfusního. poškození. Uvažovaný farmaceutický prostředek lze použít profylakticky před operací srdce k podpoře, pooperační nápravy;.

Protože P-selektin je skladován ve Weibelových-Paladeho tělískách destiček a endoteliálních buněk a je uvolňován při aktivaci trombinem pro zprostředkování adheze neutrofilů a monocytů, inhibitory interakce P-selektinového ligandu mohou být obzvláště užitečné při minimizování poškození tkáně, které -často provází -' trombotické chorobné-- stavyNapříklad:-Takováto inhibice je terapeuticky cenná u pacientů, kteří nedávno prošli mrtvicí, infarkty myokardu, hlubokou trombózou žil, pulmonární embolií, atd. Tyto sloučeniny jsou obzvláště užitečné při pre-trombolytické terapii.

Uvažovaný prostředek najde konkrétní použití v léčbě druhotných účinků septického šoku nebo. roztroušené oběhové koagulace (DIC, disseminated intravascular coagulation). Migrace leukocytů do tkání během septického šoku nebo DIC mají často za následek patologický rozklad tkáně. Tito pacienti navíc mohou mít široce rozšířené mikrocirkúlační tromby a difusní záněty. Léčebný prostředek zde poskytnutý inhibuje migraci leukocytů do těchto míst a zmírňuje poškození tkáně.

, Inhibitor interakce selektinu a SLe^x ligandu je užitečný také při léčbě traumatického šoku a provázejícího akutního poškození tkané. Protože selektiny hrají roli při shromažďování leukocytů v místech poranění, obzvláště E-selektin v případech akutního poranění a zánětu, jejich inhibitory mohou být podávány místně nebo systémově ke kontrole poškození tkáně spojeného s takovýmito poraněními. Navíc: Pro specífitu takovýchto inhibitorů k místům zánětu, např. těm, kde jsou exprimovány ELAM-1 receptory, mohou tyto prostředky · být ve srovnání s tradičními protizánětlivými činidly účinnější a méně pravděpodobně způsobovat komplikace.

Předkládaný vynález takto také poskytuje farmaceutické prostředky, jež mohou být'používány’ při léčbě dříve zmíněných stavů. Uvažovaný. farmaceutický prostředek * se skládá z dříve popsané sloučeniny analogické SLe^x, jež inhibuje interakci mezi buněčným SLe ligandem a selektinovým receptorem, přičemž tato sloučenina je rozpuštěna nebo rozptýlena ve farmaceutickypřijátelném ředidle. Uvažovaný farmaceutický prostředek je vhodný pro použití v různých systémech dodávání léku. Ke krátkému přehledu současných způsobů dodávání léků viz Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).

Vzhledem ke složitosti zánětlivých odezev u savců, každý, kdo má zkušenosti, lehce rozpozná, že uvažovaný farmaceutický prostředek může dále obsahovat další sloučeniny, o nichž je známo, že interferují s . molekulami buněčné adheze. Například o molekulách patřících k rodině integrinových adhezních molekul se soudí, že hrají roli v uvolňování leukocytů z cév v bodech infekce. K přehledu o mezibuněčných adhezních receptorech, včetně selektinových receptorů, a jejich roli v imunitních funkcích, viz Springer., Nátuře -346: 424 - 434 ’ (1990). Navíc:’ Úspěšné působení s použitím uvažovaného farmaceutického prostředku může být také stanoveno pomocí vývoje stavu, jenž má být léčen. Protože různé adhez-i-vn-í—mo-lek-u-l-y—mohou—být—v—průběhu—choroby—nebo—stavu pozitivně nebo negativně regulovány v návaznosti na řadu faktorů, každý, kdo má zkušenosti, rozpozná, že pro léčbu různých zánětlivých stavů mohou být potřebné různé farmaceutické prostředky.

Pro farmaceutický prostředek, jenž se skládá ze sloučeniny analogické ’ SLe^x, jež se váže se selektinovým receptorem a inhibuje jeho vazbu k buňkám obsahujícím SLe^x ligand, se dávka sloučeniny různí podle např. konkrétní sloučeniny, způsobu podávání, konkrétní nemoci, jež se léčí, a její závažnosti, celkového zdravotního stavu a podmínek, v nichž se pacient nachází, a posouzení ošetřujícího lékaře. Pro léčbu reperfušního poškození je například, dávka, uvažované, sloučeniny analogické. SLe^x v rozsahu 50 μ,ς až 10 000 mg/den pro 70 kg'pacienta. Ideálně by mělo léčebné podávání začínat co nejdříve ják je možno, po infarktu myokardu nebo jiném poškození. Farmaceutický prostředek je míněn pro parenterální, topické, orální nebo lokální/podávání, jako pomocí aerosolu, nebo transdermálně-,. pro. profylaktické nebo léčebné působení.. Farmaceutický prostředek může být podáván v řadě jednotkových dávkovačích’ forem, závislých na způsobu podávání. Jednotkové dávkovači formy například vhodně pro orální podávání zahrnují prášky, tablety, pilulky, kapsle a dražé.

Farmaceutický prostředek je s výhodou podáván intravenózně. Vynález tedy poskytuje prostředek pro intravenózní podávání, jenž obsahuje roztok uvažované . sloučeniny analogické SLe^x, rozpuštěné nebo rozptýlené ve ve farmaceuticky přijatelném-ředidle (nosiči), s výhodou vodném nosiči. Lze použít řadu vodných nosičů, např. vodu, pufrovanou vodu, 0,4 procentní solný roztok, a podobně. Tyto prostředky mohou být sterilizovány konvenčními, dobře známými steri lizační-m-i technikami, nebo mohou . být sterilizovány, filtrací. Výsledné vodné roztoky mohou být baleny pro použití jako takové, nebo lyofilizovány, přičemž lyofilizovaný přípravek se kombinuje se sterilním vodným roztokem před podáváním.

Prostředek může obsahovat farmaceuticky přijatelné dodatečné látky, jak jsou potřebné pro přiblížení se fyziologickým podmínkám, jako jsou činidla nastavující pH a pufrovací činidla, činidla nastavující tonicitu, zvlhčovači činidla a podobně, například octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, sorbitan monolaurát, triethanolamin oleát, atd.

Koncentrace použité sloučeniny analogické SLe^x je obvykle přinejmenším 1 procento a dosahuje až 10 až 30 procent podle hmotnosti, a je zvolena primárně podle objemu kapaliny, viskozit, atd., v souladu s konkrétně zvoleným způsobem podávání. Jak je popsáno výše, prostředek může být podáván prostřednictvím liposomového přípravku.

Typický farmaceutický prostředek pro intravenózní podávání tedy může být upraven tak, že obsahuje 250 ml sterilního γ

Rmgerova roztoku a 25 mg sloučeniny analogické SLe . Konkrétní způsoby přípravy parenterálně podávatelných sloučenin jsou známě nebo zřejmé pro* osoby zběhlé v oboru, a jsou popsány podrobněji v např. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. vyd., Mack Publishing Company, Easton, PA (1985), jenž je zde zařazen * 4 odkazem.

Pro tuhé prostředky se mohou použít konvenční netoxická.tuhá ředidla (nosiče), jež zahrnují například, manitol, laktosu, škrob, glukosu, sacharosu, stearát hořečnatý ve farmaceutických kvalitách a podobně. Pro orální podávání se vytvoří farmaceuticky přijatelný netoxický prostředek zahrnutím jakéhokoli normálně používaného . excipientu, jako jsou nosiče z dřívějšího seznamu, a obecně 10 - 95 procent aktivní složky, jíž je dříve popsaná sloučenina analogická SLe^x, s výhodou kolem 20 procent (viz Remington's, výše).

Pro aerosolové podávání je uvažovaná sloučenina analogická

SLe^x s výhodou dodávána v jemně dělené formě spolu s povrchově aktivní látkou a propelantem. Typické procentní zastoupení sloučeniny analogické SLe^x je 0,5 až 30 procent podle hmotnosti, a s výhodou 1 až 10 procent. Povrchově aktivní látka musí být samozřejmě netoxická a s výhodou rozpustná v propelantu. Pro tato činidla jsou reprezentanty estery nebo částečné estery mastných kys.el.in.,_o.bsahuj.í.c.í.ch_od_6_p.o__2.2_uhlíko.v_ý_c.h_atomú.,_j ako_ kyseliny kapronové, oktanové, laurové, palmitové, stearové. linolové, linolenové, olestearové a . - oleové, s alifatickými polyhydroxylovými alkoholy nebo jejich cyklickými anhydridy jako např. ethylenglykolem, glycerolem, erythritolem, arabitolem, manitolem, sorbitolem a hexitolovými anhydridy odvozenými od sorbitolu, a polyoxyethylenové a polyoxypropylenové deriváty těchto esterů. Mohou se používat smíšené estery, jako jsou smíšené a přírodní glyceridy. Povrchově aktivní látka může představovat 0,1 až 20 procent hmotnosti prostředku, a s výhodou 0,25 až 5 procent. Zbytek prostředku je obyčejně propelant. Zkapalněný propelant je typicky za obyčejných podmínek plynem, a je zkondenzován pod tlakem. Mezi vhodné zkapalněné propelanty patří nižší alkany obsahující až 5 uhlíku,, jako. butan: a propan, a s výhodou fluorované nebo fluorchlorované alkany. Lze používat i směsi shorauvedených látek. Při výrobě aerosolů se.nádobka opatřená ventilem plní patřičným propelantem, obsahujícím jemně dělenou sloučeninu a povrchově aktivní .látku. Složky jsou tedy udržovány při zvýšeném tlaku.dokud nejsou uvolněny ventilem.

Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu analogickou SLe^x_může být podáván pro profylaktické nebo léčebné působení. Při léčebných aplikacích je prostředek podáván pacientovi, který již trpí chorobou, jak je popsána výše, v množství postačujícím k inhibici vazby mezi buňkami exprimujícími selektin a neutrofily; t.j. léčit nebo přinejmenším omezit symptomy choroby a.její komplikace.. Množství tomu přiměřené je definováno jako chemoterapeuticky účinná dávka nebo množství inhibující buněčnou adhezi. Množství účinná při tomto použití závisí na stupni choroby a na váze a celkovém stavu pacienta, ale obecně spadají pod ro.zsah 0,5..mg až. 1.0 000 mg sloučeniny analogické SLe^x na den u 70 kg pacienta, přičemž se dávky od 5 mg do 2.000 mg sloučeniny používají běžněji.

Při profylaktických aplikacích je prostředek obsahující uvažovanou sloučeninu podáván pacientovi, který je náchylný nebo jinak ohrožený' konkrétní chorobou. Takovéto množství je definováno jako profylakticky účinná dávka” a je také množstvím postačujícím k inhibici vazby (adheze) SLe^x obsahujících buněk k selektinu. Při tomto použití množství opět závisí na na pacientově zdravotním stavu a váze, ale obecně spadají pod rozsah 0,5 mg až 5 000 mg na 70 kg pacienta, běžněji od 5 mg do 2 000 mg na 70 kg tělesné váhy.

Jinou cestou k určení adhezi inhibujícího množství uvažované sloučeniny analogické SLe^x je porovnáni vazebné inhibice vykazované sloučeninou analogickou SLe^x s inhibici poskytovanou SLe^x samotným. Jednou vhodnou cestou je provést toto porovnání -₅₀ (koncentrace potřebné k tomu, aby vazba byla s použitím IC_S inhibována z jedné poloviny) pro dva porovnávané materiály, a založit používané množství na množství SLe^x a množství sloučeniny analogické SLe^x , jež je násobkem hodnoty IC₅₀ pro tuto sloučeninu.

Pro sloučeninu·, jejíž IC_5Q jě · asi jednou desetinou.IC₅₀ SLe^x samotného, bude množství typicky užitečné pro inhibici buněčné adheze u používání v množství desetkrát převyšujícím molární množství SLe^x. S výhodou je toto množství. .. čtyřnásobkem množství SLe^x.’ Ještě výhodnější je množství rovné množství SLe^x. Nejvýhodnější, jak je tomu s většinou zde popsaných sloučenin analogických SLe^x, je používané množství menší než používané množství SLe^x, jako je jedna polovina až jedna desetina molárního množství SLe^x samotného.

Podávání prostředku se může provádět, jednorázově nebo opakovaně, s hladinou a . rozvrhem dávek zvolenými ošetřujícím lékařem. V každém případě musí farmaceutický přípravek poskytovat množství sloučeniny analogické SLe^x dostačující k účinné léčbě pacienta.

Sloučeniny mohou nalézt také využití jako diagnostická činidla. Značené sloučeniny mohou být například použity k lokalizaci oblasti zánětu nebo metastázy nádoru u pacienta s podezřením na zánět. Pro toto použití mohou být sloučeniny značeny ¹²⁵I, ¹⁴C nebo triciem.

Příklady provedeni-vynálezu

Příklad 1

Laktuloso N-benzyl glykosid (sloučenina 1)

500 ml tříhrdlá baňka s kulatým dnem byla ponořena do ledové lázně a naplněna laktulosou (23,9 g, 69,8 mmol) a benzylaminem (109 ml, 526 mmol, 7,5 ekvivalentu). Baňka byla pak uzavřena a míchána magnetickým míchadlem. Ledová lázeň byla ponechána roztát a reakční směs ponechána pomalu se zahřívat na pokojovou teplotu. Rozpuštění pevného materiálu proběhlo během několika hodin a směs získala žlutou barvu. Ke sledování postupu reakce lze použít TLC v 60

CHC1₃ : MeOH : 15 mM CaCl.

(laktulosa má R_f = 0,45, produkt R_f = 0,75, vizualizace orcinolem). _

Reakce byla dosti pomalá a zdála se být ukončena po 5-7 dnech. V čase, kdy reakce byla posouzena jako úplná, bylo míchadlo vyjmuto a baňka opatřena míchačkou pro,.. mechanické míchání shora, a aparát byl ponořen do vodní lázně. Do baňky byl pak přidán hexan (250 ml) a smés byla prudce míchána po přibližně 60 vteřin. Míchání pak bylo přerušeno a směs byla ponechána na dvě. zřetelné vrstvy (toto rozdělení trvá od. 15 jedné hodiny). V tomto čase byla horní hexan/benzylaminová vrstva odstraněna odsátím hadičkou. Extrakce benzylaminu byla ještě dvakrát opakována s použitím hexanu k rozdělení minut do (250 ml porce) a pak byla provedena ještě třikrát s použitím 250 ml porcí diethyletheru (všechny extrakce se provedly na ledu).

Když byly provedeny tyto extrakce, zbýval viskózní světle žlutý zbytek. Tento materiál byl rozpuštěn v ethanolu (300 ml) a přenesen do 2-litrové baňky s jedním hrdlem a kulatým dnem. Žlutý roztok byl zkoncentrován na rotační odparce na hustý sirup. Aceton reagenční kvality (1000 ml) byl rychle míchán magnetickým míchadlem při nula stupních C, a na tento roztok se působilo ethanolovým sirupem. Při pomalém přidávání sirupu še začínala vytvářet bílá sraženina. Když bylo přidávání ukončeno, baňka byla uzavřena a uchovávána v -20°c mrazničce přes noc (asi 18 hodin). Po vyjmutí z mrazničky byl zřetelný bílý pevný koláč na dně baňky a supernatant byl jasně žlutý. Roztok byl pak dekantován a surová pevná sloučenina 1 byla odtažena pod vysokým vakuem k odstranění zbytkového acetonu. Produkt (sloučenina 1) je velmi nestálá pevná látka a byla používána okamžitě v další reakci.

Příklad 2 •U

N-benzyl-laktosamin, acetátová sůl (sloučenina 2) ......................

Surový produkt (sloučenina 1) z přípravy shora (30,1 g, 69,8 mmol,. teoretický výtěžek) byl rozpuštěn v 1000 ml methanolu reagenční kvality a míchán při pokojové teplotě. Pak byla přidána ledová kyselina octová (4 ml, 70 mmol) a baňka uzavřena. Slabě žlutá reakční směs byla ponechána s mícháním při pokojové teplotě a sledována TLC se stejným rozpouštědlovým systémem jaký je popsán výše. Produkt, sloučenina 2, byl patrný s R_f- 0,65 (zbytková laktosa je postřehnutelná na TLC od začátku této reakce, ale její množství se nezdá podstatně vzrůstat, jak reakce pokračuje). Když se sloučenina 1 zdá na TLC úplně spotřebována (24-48 hodin); z reakční směsi se odebere 100 μΐ a odpaří pod proudem argonu. Žlutý zbytek se pak rozpustí v CD^OD a odpaří znovu na žlutý zbytek. Tento materiál se pak rozpustí v D₂O a analyzuje pomocí ^H-NMR.

Tento surový roztok sloučeniny 2 byl pak použit v následující reakci. Pro výpočet výtěžku byl z reakční směsi odebrán malý podíl o známém objemu, zkoncentrován do sucha, rozpuštěn ve vodě, nastaven na pH > 10, a chromatografován s použitím rychlé chromatografie s reverzní fází na silikagelu, napřed vyvíjeném H₂0 a pak 2 : 1 H₂O : MeOH. Typické výtěžky z laktulosy byly 50 - 55 procent..

₀--_MHz~_s-_v-pp_in--vzhi-edem-k HOD)-7,44-(-m, -5H),- 5,49 .. (d, J =3 Hz, 1H), 5,05 (d, J = 8 Hz, 1H) , 4,39 (d, J = 7 Hz.,

1H), 4,38 (d, J =8 Hz, 1H), 4,35.(d, J = 7 Hz, 1H) , 4,.10 - 3,5 (m, 11 H), 3,24 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H), 3,00 (dd, J =

Hz, J = 10. Hz, 1H), 2,87 (s, 3H) ,

Příklad 3 Laktosamin, acetátová sůl (sloučenina 3)

2-litrová baňka, obsahující surový kyselý methanolový roztok sloučeniny 2 z předešlé reakce, byla vybavena trojčestným kohoutem a podrobena třikrát argon/vakuovému čistícímu cyklu , s použitím balonu argonu a zabudovaného propojení na, vakuum. Baňka byla otevřena a přidáno bylo 10 procent paládia na uhlí (7,4' g, 6,98 mmol). Baňka byla pak znovu vybavena troj čestným kohoutem a podrobena třikrát vakuovému čistícímu cyklu s použitím vodíkového plynu. Reakce pak byla udržována ve vodíkové atmosféře s použitím balonu.

Reakce býlá pečlivě sledována TLC (produkt má = 0,2). Když byl výchozí materiál spotřebován, byl odebrán 100 μΐ alikvot, dán do Eppendorfovy zkumavky, stočen v mikrocentifuze, a čirý supernatant byl odebrán a použit k přípravě NMR vzorku jako v předešlé reakci. Jakmile NMR ukázala úplnou ztrátu sloučeniny 2, kaše byla filtrována skrz vložku celitu na- nálevce se skleněnou fritou střední porozity s použitím methanolu. čirý žlutý roztok byl pak zkoncentrován rotačním odpařením na 140 ml v 500 ml baňce s kulatým dnem a použit surový v následující reakci. Sloučenina 3: ¹H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k HOD) 5,40 (d, J =3 Hz, 1H), 4,90 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,41 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,00 - 3,5 (m, 22H), 3,28 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H) , 2,98 (dd, J = 7 Hz, J = 8 Hz, 1H).

Příklad 4

2-Desoxy-2-(2'-karboxy)-benzamido-4-0-p-D-galaktopyranosyl)β-D-glukopyranosid (sloučenina 4) a

1,3,6-Tri-0-acetyl-2-desoxy-2-ftalimido-4-0-(2,3,4,6-tetra0-acetyl)-p-D-galaktopyranosyl)-β-D-glukopyranosid (sloučenina 5)

Surový kyselý methanolový roztok sloučeniny 3 z předešlé reakce, byl zředěn 14 ml H₂O a působilo se na něj uhličitanem sodným (29,7 g, 280 mmol) a následně anhydridem kyseliny ftalové (20,7 g, 140 mmol). Reakce byla pečlivě sledována, protože ze začátku dochází k pěnění. Po čtyřech hodinách reakce doběhla do konce a kaše byla zfiltrována skrz nálevku se skleněnou fritou k odstranění zbytků materiálu pocházejícího z uhličitanu sodného a anhydridu kyseliny ftalové. Filtrát pak byl zkoncentrován na pastu, zprvu rotačním odpařováním a pak pod vysokým vakuem, za poskytnutí sloučeniny 4). Odstranění stop methanolu a H₂O, zůstávajících v materiálu, tak důkladné, jak je jen možno, je podstatné pro zamezení vedlejším reakcím s acetanhydridem v následující acetylaci.

Když byl materiál posouzen jako dostatečně suchý, byl přidán pyridin (212 ml) a následně acetanhydrid (106 ml, 1.12 mol). Směs byla zprvu protřepávána ručně k podpoře rozpouštění, ale jakmile nasadila exotermní reakce,., rozpouštění pokračovalo a pak se používalo magnetické míchání. Po míchání přes noc (asi 18 hodin), TLC v 20 : 1 CHC1₃ : MeOH ukazovala převahu jedné UV.aktivní skvrny, která se pohybovala stejně jako autentickasToučenina 57 Roztok byl ochlazen na nula stupňů c, zpracován s 32 ml H₂O, a míchán 15 minut k hydrolýze přebytku ačetanhydridu. Roztok byl pak zředěn na 1000 ml dichlormethanem a promyt (3 x 1000.ml)

N HC1, (3 x 1000 ml) nasyceným NaHCO₃ a (1 x 1000 ml) nasyceným NaCl. Organický roztok byl pak vysušen (MgSO₄), zfiltrován a zkoncentrován na surový produkt. Pak se provedla ^H-NMR v CDC1₃, která ukazovala' směs přibližně 1:1 a- a β-anomerů. .

— Tento surový produkt—byl—rozpuštěn------v minimálním.... množství methanolu (30 ml) a nasazení krystalizace bylo záležitostí několika minut. Po ponechání při pokojové teplotě po několik hodin byl pevný podíl sebrán filtrací a promyt ledově chladným methanolem. Po vysušení na vzduchu byl produkt, sloučenina 5, získán (5,6 g, 10,4 procent) jako bílý prášek. ^H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k CHC1₃) 7,90 - 7,70 (m, 4H), 6,50 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,83 (dd, J = 10,5 HZ, J = 8 Hz, 1H), 5,36 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 5,15 (dd, J = 8 Hz, J = 10,5 Hz, 1H), 4,97 (dd, J = 10 Hz,

J = 3,5 Hz, 1H) , 4,56 - 3,83 (m, 9H), 2,20 - 1,90 (7s, 21H).

Příklad 5

Konverze 1,3,6-tri-0-acetyl-2-desoxy-2-ftaliraido-4-0-(2,3,4,

6-tetra-0-acetyl)-β-D-galaktopyranosyl)-β-D-glukopyranosidu na sloučeninu 5

Matečný louh, obsahující α-acetát z krystalizace sloučeniny 5 rozebírané výše, byl zkoncentrován do pěny a rozpuštěn v DMF (110 ml). Tento roztok byl míchán pod argonem při 55*C.' ' Pák byl přidán hydrazinium acetát (9,5 g, 104 mmol). Po 15 minutách ukázala TLC v 20 : 1 CHC1₃ : MeOH úplnou ztrátu výchozího materiálu a ukázala se nová skvrna s poněkud nižším R^. Reakční směs byla ochlazena na pokojovou teplotu a zředěna na

1000 ml’ ethylácetátem. Roztok byl pak promyt (2 x 1000 ml) H₂0 a (1 x 1000 ml) nasyceným NaCl. Organický roztok byl vysušen (MgSO₄), zfiltrován a zkoncentrován.

Surový koncentrovaný produkt byl rozpuštěn v pyridinu, 50 ml, a zpracován acetanhydridem (25 ml). Po míchání přes noc (asi 18 hodin), TLC v 20 : 1 CHC1₃ : MeOH ukazovala převahu jedné UV aktivní skvrny, která se pohybovala stejně jako autentická sloučenina 5. Roztok byl ochlazen na nula stupňů c, zpracován s 7,5. ml H₂0, a míchán 15 minut k hydrolýze přebytku acetanhydridu. Roztok byl pak zředěn na 250 ml dichlormethanem a promyt (3 x 250 ml) 2N HCl, (3 x 250 ml) nasyceným NaHCO₃ a (1 x 250 ml) nasyceným Naci. Organický roztok byl pak vysušen (MgSO^), zfiltrován a zkoncentrován na surový produkt. Surový produkt byl pak rozpuštěn v minimálním množství methanolu a znovu proběhla krystalizace. Po několika hodinách byla izolována pevná sloučenina 5 jako dříve za poskytnutí dalšího podílu produktu (4,4 g, 8,3 procent) jako bílého prášku. Celkový výtěžek sloučeniny 5 ve dvou podílech byl 18,7 procent, 10 g.

Příklad 5A

Alternativní příprava sloučeniny 5 z laktulosy

A. Laktuloso aminoglykosid (sloučenina 1A)

300-mililitrový nerezový autokláv, obsahující míchadlo, laktulosu (17,1 g, 50 mmol) a octan amonný (3,85 g, 50 mmol) byl ochlazen na -78°C a pak do něj bylo přidáno 80 ml kapalného čpavku. Autokláv byl uzavřen a ponechán s mícháním zahřát se na pokojovou teplotu. Když autokláv dosáhl pokojovou teplotu, byl umístěn do olejové lázně a zahříván na 35°C po 24 hodin. Autokláv byl pak ochlazen na pokojovou teplotu a opatrně vyvětrán do ovzduší. Jakmile veškerý čpavek vymizel, přibližně dvě hodiny., celý autokláv byl umístěn do vakuového exikátoru obsahujícího kysličník fosforečný a opatrně vystaven vakuu. Po udržování ve

-vakuu—přes_noc_s.e_stala 2 obsahu autoklávu světle žlutá pěna.

Sloučenina byla dosti hygroskopická a byla rychle vyňata z autoklávu a dána do uzavřené nádobky. Tento materiál byl použit jako surový v následujícím kroku.

B. Laktosamin acetát (sloučenina 2A)

Laktuloso aminoglykosid (sloučenina 10) (3,41 g, 10 mmol)· byl rozpuštěn byl rozpuštěn v 100 ml béžvódeho^-methanolu-a míchán při pokojové teplotě pod argonem. Pak byla přidána ledová kyselina octová (572 μ1,·»10 mmol). Po 24 hodinách byl žlutý roztok zkoncentrován do pěny, jež se ukázala obsahovat laktosaminovou acetátovou sůl jako 1 1 směs a- a β-anomerů. Zřetelné byly dva další produkty, o nichž se usoudilo, že jsou a plus b anomery gálaktopyranosyl mannosaminu. Tento produkt byl použit jako surový v následujícím kroku.

Sloučenina 5 pak byla připravena ze sloučeniny 2A s použitím surového materiálu získaného v kroku B, shora, s postupem Příkladu 4 v měřítku asi 1/7 - 1/10. Aceton tvořil asi jednu třetinu rozpouštědla použitého při přípravě ftalamid polokyseliny. Finálně vytvořený peracetyl ftalamid (sloučenina 5) byl připraven ve výtěžku 3.8 procent, bráno na laktulosu, s tím že nebyla snaha získat druhý podíl krystalů.

Příklad 6 l-Chlor-3,6-di-0-acetýl-2-desoxy-2-ftalimido-4-0-(2,3,4,6tetra-O-acetyl-^-D-galaktopyranosyl)-β-D-glukopyranosid (sloučenina 6)

Anomerický acetát (sloučenina 5) (3,3 g, 4,3 mmol) byl míchán ve 43 ml suchého CH₂Cl₂ při pokojové teplotě pod argonem. Pak byl přidán chlorid hlinitý (2,9 g, 21,5 mmol) v pevné formě. Po 40 minutách byla směs spláchnuta do děličky na objem 400 ml 1 : ί směsi CH₂C1₂ : H₂O. Směs byla protřepána, vodná vrstva odstraněna a organický roztok byl promyt 2 x 200 ml H₂O a 3 x 200 ml nasyceného roztoku NaHCO-j. Světle žlutý roztok byl pak vysušen (MgSO₄), zfiltrován a zkoncentrován na světle žlutý prášek (3,2 g, 100 procent). Tento materiál byl pak použit na kondenzaci v Příkladu 7.

Příklad 7

Ethyl β-D-galaktopyranosid (sloučenina 7)

Roztok 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-galaktosylbromidu (2,5 kg) v dichlormethanu (4 1) byl přidán s rychlostí 20 - 25 ml/min do reaktoru obsahujícího, uhličitan stříbrný (3,13 kg, 11,4 mol), 4 A molekulární síta (2,37 kg), dichlormethan (16 1) a bezvodý ethanol (4,0 1). Udržovalo se míchání poskytující prudké promíchávání těchto reagentů. Dvě hodiny po dosažení úplného přidání roztoku bromidu ukázala TLC na silikagelu vyvíjeném směsí 1:1, hexan : ethylacetát, nepřítomnost bromidu. V tomto čase byla reakční směs zfiltrována přes vrstvu celitu (1 kg) a filtrát byl odpařen při 30 - 35°C pod vakuem na hnědý olej (1,95 kg). Tento olej byl sušen pod vakuem 17 hodin. ^-H-NMR (CDCl₃) δ: 5,36 (IH, d, J₃^₄ = 3,7 HZ, H-4), -5,17 (IH, dd, J_{2 3}' = 11,0 Hz, Ή-2) ,

4,99 (1 H, dd, Η3), 4,46 (1Η, d, ,₂ = 8,3 Hz, H-l), 2,15, 2,05, 2,04, 1,95 (12H, 4S, OAc), 1,21 (3H, t, OCH₂CH₃).

Surový ethyl tetraacetyl galaktopyranosíd~~(’lV9’5^—kg )’ KyT rozpuštěn v be2vodém methanolu (11,7 1) a po kapkách bylo přidán 25· procentní roztok methoxidu sodného v methanolu (90 ml). Roztok byl míchán jednu hodinu a v tomto čase ukázala TLC na silikagelu vyvíjeném směsí ethylacetát : methanol, 1 : 2, nepřítomnost výchozího materiálu. Produkt měl Rf = 0,6. Roztok byl neutralizován přidáním Amberlitové IR-120 (H⁺) pryskyřice (0,6 kg) a mícháním. Když měl roztok pH = 6 - 7 pryskyřice byla. odstraněna -filtrací- —a-f-i-l-trát by-1 - -odpařen - pod vakuem. .k. .získání, světle žluté pevné látky. Tato pevná látka byla ponechána ochladit se na 25^eC a pak ochlazena na nula stupňů C k poskytnutí' bílé sraženiny. Filtrace této pevné látky dala ethyl β-D-galaktopyranosid, sloučeninu 7, (0,851 kg). ^H-NMR (D₂0) δ: 4,38 (1H, d, J-L ₂ = 8,0 Hz, H-l), 3,89 (1H, bd, J₃,₄ = 3,7 Hz, H-4)., 1,2 (3H, t, och₂ch₃).

Příklad 8

Ethyl 4,6-0-benzyliden-p-D-galaktopyranosíd (sloučenina 8)

Ethyl β-D-galaktopyranosid (sloučenina 7) (0,851 kg, 4,09 mmol) byl dán do 20 litrové baňky rotační vakuové odparky s toluensulfonovou kyselinou (1,5 g, 7,9 mmol). Baňka odparky byla .připevněna, .k odparce a .byl přisáním přidán dimethylacetal behzaldehydu (1,23 1, 8,18 mmol) Baňka se směsí byla nechána rotovat po čtyři hodiny. Mezi třiceti a čtyřiceti minutami po přidání acetalu bylo dosaženo téměř úplného rozpuštění, rychle následovaného, tvorbou těžké sraženiny. V rotaci se pokračovalo po čtyři hodiny a v tomto čase byl přidán triethylamin (1,5 1) k neutralizaci reakční směsi. Bylo nasazeno vakuum a rozpouštědlo odstraněno za získání pevné hmoty. Do baňky byl přidán hexan (61) a baňka se směsí byla nechána rotovat po 0,5 hodiny. Výsledná pevná látka byla odfiltrována a promyta na filtru směsí hexan : ethylether 1:1 (21). Takto získaná bílá pevná látka byla vysušena pod vakuem 17 hodin za poskytnutí čistého ethyl 4, 6-0-benzyliden-p-D-galaktopyranosid (sloučeniny 8) ve výtěžku 83 procent. ¹H-NMR (CDC1₃) δ: 7,53 (2H, m, aromát), 7,37 (3H, m, aromát), 5,57 (1H, s, CHPh), 4,29. (1H, d, J_{x 2} = 7,0 Hz, H-l),

4,21 (1H, d, J_lř4 = 3,27 Hz, H-4), 1,29 (3H, t, OCH₂CH₃).

Příklad 9

Ethyl 2-0-benzoyl-4,6-0-benzylíden-3~D-galaktopyranosid (sloučenina 9)

Ethyl 4,6-0-benzyliden-p-D-galaktopyřanosid (sloučenina 9) (0,924 kg, 3,12 mol) byl dán do 20 litrového reaktoru vybaveného vzduchovým pohonem, přikapávací nálevkou s vyrovnávačem tlaku a s přívodem plynu, chladící lázní a odvodem plynu. Před uzavřením baňky byly přidány dichlormeťhan (9,3 1) a pyridin (2 1), což poskytlo homogenní roztok. Přikapávací nálevka byla

Γ ¹ , naplněna chloracetylchloridem (0,388 kg,......3,43 mol, 273 ml) jako procentním roztokem v dichlormethanu. Baňka byla uzavřena a nasazen byl slabý proud suchého dusíku. Lázeň byla ochlazena na -65 °C + 5’C a reakční směs míchána 30 minut. V tomto čase bylo započato přidávání acylchloridu po kapkách s rychlostí 3 - 4 ml za minutu. Po úplném přidání tohoto roztoku byla reakční směs udržována při -65’C + 5°C po další jednu hodinu. V tomto čase byl do reakční směsi přidán benzoylchlorid (0,614 kg, 4,37 mol, 0,507 1) rychlostí 8 - 12 ml za minutu. Reakční směs byla ponechána ohřát se na pokojovou teplotu a- ponechána tak 17 hodin. Reakční směs byla zfiltrována k odstranění vysrážených solí a filtrát byl zkoncentrován ve vakuu k odstranění většiny dichlormethanu. Malý vzorek byl dán stranou pro ^H-NMR. ^H-NMR (CDCl₃r 5: 5,75 (1H, dd, J_{2 3} = 10,6 Hz, H-2), 5,56 (1H, s,

CHPh), 5,25 (1H, dd, Jx 4 = 3,44 Hz, H-3), 4,69 (1H, d, = 8—4_Hz___H-l.)____1-..15_Í3H. t. OCH₂CH₃)._

Ke koncentrátu byla přidána voda (180 ml) a výsledná směs byla promíchávána po. dvě hodiny při 40°C.. V tomto čase byla směs dále zkoncentrována za poskytnutí žlutého zbytku, jenž byl rozpuštěn v dichlormethanu (11 1) a přenesen do 50 litrového extraktoru. Organický roztok byl postupné extrahován ledově chladnou vodnou 0,5 N HC1 (11 1), vodným nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (ll 1) a chladnou vodou (11 1). Organická vrstva byla vysušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována, a filtrát byl odpařen za poskytnutí žlutě'pevné' látky, jež byla vysušena pod vysokým vakuem. Tato reakce byla sledována TLC na silikagelu vyvíjeném směsí 1 : 1, hexan : ethylacetát. Tato pevná látka byla rozpuštěna v hořkém ethanolu (9,5 1), což po ochlazení poskytlo ethyl 2-0-benzoyl4,6-0-benzyliden-p-D-galaktopyranosid, sloučeninu 9, (0,737 kg, 1,85 mol) ve výtěžku 53 procent. ^H-NMR (CDC1₃) δ: 5,59 (1H, s, CHPh), 5,36 (1H, dd, J_{2 3} = 10,07 Hz, H-2), 4,64 (ΙΗ,-dd, J= 8,21 Hz, H-l), 1,15 (3H, t, OCH₂CH₃).

Pro potvrzení že benzoát byl na C-2 a že c-3 nesl volný hydroxyl. byla k nmr vzorku přidána kapka trichloracetyl isokyanátu - a spektrum bylo přeměřeno. Toto spektrum obsahovalo dublet slabého pole dubletu při δ = 5,27 typickém pro H-3 galaktosy, jež je esterifikována na C-3. Původní filtrát získaný z reakční směsi obsahoval další množství produktu.

Příklad 10

Ethyl (β-D-galaktopyranosyl)-(1-4)-0-(2-N-allyloxykarbonyl2-desoxy-p-D-glukopyranosyl )-(1-3)-Ο-β-D-galaktopyr.anosid (sloučenina 10),, .

Ke směsi ethyl 2-0-benzoyl-4,6-0-benzyliden-p-D-galaktopyranosidu, sloučeniny 9, (0,76 g, 1,9 mmol), 4 A molekulárních sít (2 g), dichlormethanu (10 ml), kolidinu (0,278 ml, 2,1 mmol) a trifluormethansulfonátu stříbrného (0,522 g, 2 mmol) ochlazené na -25°C byl přidán po kapkách roztok l-chlor-3,6-di-O-acetyl2-desoxy-2-ftalimido-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-p-D-glukopyranosidu (sloučeniny 6 ; 1,484 g, 2 mmol) rozpuštěného v dichlormethanu (5 ml). Výsledná směs po úplném přidaní chloridu byla míchána a zahřáta na laboratorní teplotu.

Po dvou hodinách byla směs zředěna dichlormethanem a zfiltrována.

Filtrát byl promyt postupné vodným hydrogensiřičitanem sodným, vodnou kyselinou chlorovodíkovou, vodným hydrogenuhličitanem sodným a konečně vodou. Organická vrstva byla vysušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována, a odpařena za poskytnutí pevné hmoty, která byla rekrystalizována z dichlormethanu : hexanu. ' Na výsledný plně blokovaný trisacharid (0,66 g) se působilo 80 procentní vodnou kyselinou octovou (5 ml) při 80°C po dvě ú hodiny a v tomto čase bylo rozpouštědlo odstraněno odpařením.

Zbytek byl dvakrát spoluodpařován s toluenem-ethyleacetátem a poskytnul zbytek, který byl rozpuštěn v ethanolu (10 ml). Byl í přidán hydrát hydrazinu (0,3 ml) a-výsledná směs byla refluxována .

po 17 hodin k poskytnutí precipitátu, jenž byl zfiltró.ván . a po vysušení poskytnul pevnou látku (0,45 g). Tato pevná látka byla rozpuštěna ve směsi methanol : voda, 5 : 1, a působilo se na ni diallylpyrokarbonátem (0,166 ml) po jednu hodinu. Výsledná směs byla odpařena a roztřepána mezi dichlormethan a vodu. Vodná vrstva byla oddělena a zkoncentrována za poskytnutí sloučeniny 10 jako zbytku, který ztuhnul triturací s ethylacetátem ; acetonem,

2:1.

Toto poskytlo titulní trisacharid (sloučeninu 10), jenž byl enzymaticky sialylován k poskytnutí ethyl [natrium (5-acetamido3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-nonulopyranosylát))-(2,3) -0(β-D-galaktopyranosyl)-(1-4)-0-(2-N-allyloxykarbonyl-2-desoxyβ-D-glukopyranosyl)-(1-3)-Ο-β-D-galaktopyranosidu (sloučeniny 11), která byla identická se sloučeninou vytvořenou následujícím postupem.

Příklad 11

Ethyl [natrium (5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glyceroD-galakto-nonulopyranosylát)]-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosyl)-(l-4)-0-(2-N-allyloxykarbonyl-2-desoxy-p-Dglukopyranosyl)-(1-3)-0-p-D-galaktopyranosíd (sloučenina 11)

Následující popisuje enzymatickou konverzi disacharidu (sloučeniny 9) k produkci titulní sloučeniny (sloučeniny 11)

------s použ-i-tí-m gaTa-ktos-yl-transf-reas-y— a-sialyltransferasy..- .— ......

K vodě (12 1) byla přidána kyselina N-[2-hydroxyethyl] piperazin-N'-[2-ethansulfonová] (0,410 kg) a pH roztoku bylo nastaveno na 7,5. Byl přidán bovinní sérový albumin (17 g) a směs byla míchána dokud, nedošlo k úplnému rozpuštění. Byly přidány ethyl 3-0-(2-N-allyloxykarbonyl-2-amino-2-desoxy-p-D-glukopyranosyl)-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 9) (0,3 kg), glukoso-l-fošfát (0,271 kg), fosfoenolpyruvát (0,177 kg), chlorid draselný (0,087 kg), azid. sodný (8,4 g) a uridin-5'-difosfát (8,76 g) a výsledná směs byla míchána dokud se veškeré pevné látky, nerozpustily. . Pak byl přidán chlorid manganatý (1 M, 506 ml) a chlorid hořečnatý (1 M, 168 ml). Pak byly přidány pyruvátkinasa (42 000 U), uridin-5'-difosfát-glykosopyrofosforylasa (2 000 U), anorganická pyrofosfatasa (8 400 U), uridin5'- difosfát-galaktosoepimerasa (42 000 U) a uridin-5'-difosfátgalaktosyltransferasa (8 850 U). Konečný objem reakční směsi byl upraven vodou na 17 1. Po 48 hodinách byl přidán chlorid hořečnatý (1 M, 340 ml). Reakce byla sledována’TLC ha silikagelu vyvíjeném směsí isopropanol : 1 M octan amonný, 4:1. Po 8 - 9 dnech TLC ukázala, že reakce proběhla z > 95 procent a v tomto čase byl připraven následující roztok.

Byl připraven roztok kyseliny N-[2-hydroxyethyl]piperazinN'-[2-ethansulfonové] (0,528 kg) ve vodě (15 1) a pH výsledného roztoku roztoku bylo nastaveno na 7,5. Přidají se bovinní sérový albumin (22 g), azid sodný (11,5 g), kyselina síalová (0,242 g), ΐ

fosfoenolpyruvát (0,395 kg), a cytidin-5'-monofosfát (25 g), adenosxn-5'-trifosfát (4,7 g) a chlorid manganatý (1 M,-780 ml).

K tomuto roztoku byly přidány pyruvátkinasa (207 000 U), myokinasa (125 000 U), cytidin-5'-monofosfát-N-acetylneuraminátsyntetasa (3 245 U), anorganická pyrofosfatasa (9 400 U) a a-2,3-sialyltransferasa (l 640 U). objem této směsi byl upraven na 22 1 a tento roztok byl přidán ke galaktosyltransferasové reakci. Reakce byla sledována TLC na silikagelu vyvíjeném směsí isopropanol : 1 M óctan amonný, 4 : 1. Po 10 -12 dnech TLC ukázala, že reakce proběhla za poskytnutí > 95 procent, titulní sloučeniny, sloučeniny 11.

I

Příklad 12

Ethyl [methyl (5-acetamxdo-ⁱ3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra- $

O-acetyl-a-D-glycero-D-galakto-nonulopyranosylát)]-(2,3)-0(2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1-4)-0-(3,6-di0-acetyl-2-N-allyloxykarbonyl-2-desoxy-p-D-glukopyranosyl)(1-3)-0-2,4,6-tri-0-acetyl-^-D-galaktopyranosid (sloučenina 12)

Roztok (40 1) ethyl [natrium (5-acetamido-3,5-didesoxy-a-Dglycero-D-galakto-nonulopyranosylát)]-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosyl) - (1-4) -O- (2-N-allyloxykarbonyl-2-desoxy^-D-gluko-pyranosyl) (1-3 )-0^-D-galaktopyranosidu (sloučeniny 11) byl zfiltrován přes papír. Filtrát byl odpařen na hustý sirup v 50 1 rotační odparce.Sirup byl dvakrát spoluodpařen s pyridinem (2 x 2 1) a pak držen pod vakuem po 20 hodin. Do odpařovací baňka byl naplněn roztok N,N-dimethylaminopyridxnu (20 g) v pyridinu (12 1). Lázeň rotační odparky byla naplněna směsí voda-led a rotace pokračovala, když se přidával během 1 hodiny acetanhydrid (2 1); výsledná směs byla nechána pomalu rotovat 20 hodin při pokojové teplotě. Pro zajištění úplné acetylace se přidal další hodiny acetanhydrid (11) a směs byla nechána rotovat dalších 24 hodin. Směs byla kontrolována TLC (ethylacetát : hexan : ethanol, 10 : 10 : 3).

Po úplné reakci bylo nasazeno vakuum a sebráno 14 1 destilátu. K výslednému zbytku byl přidán v průběhu 1 hodiny methanol (15 1) a směs byla nechána rotovat 20 hodin- při po'Kojové teplotě. TLC na silikagelu (dichlormethan : aceton, 3:2) ukázala úplnou acetylaci, s produktem pohybujícím se trochu rychleji.

Byl přidán methanol (1 1) k rozkladu přebytku acetanhydridu, což bylo pozorovatelně exotermní. Po jedné hodině byla směs zkoncentrována na sirup, jenž byl pomocí směsi ethylacetát voda (13 1 / 13 1) přenesen do 50 1 extraktoru. Směs bylo prudce promíchána—Po—oddělení—fáz-í--by-la - spodní- vodná vrstva ..odtažena__ a zbývající organická vrstva zfiltrován přes papír. Filtrát byl promyt 5 procentní vodnou kyselinou chlorovodíkovou (15 1, vodná vrstva musí zůstat po promytí silně kyselá na pH papírek) a vodným 1 M hydrogenuhličitanem sodným (.15 1, vodná vrstva musí. zůstat po promytí alkalická na pH papírek). Organická vrstva pak byla přenesena do 20 1 nádoby, vysušena nad bezvodým síranem sodným a zfiltrována.

Filtrát byl zkoncentrován na polotuhý zbytek. Tento zbytek, byl rozpuštěn v dichlormethanu (3 1) a nanesen na kolonu silikagelu (10 kg) připravenou v dichlormethanu. Eluce napřed dichlormethanem (25 1), pak směsí 3 : 1 dichlormethan : aceton (25 1) a konečně směsí 1 : 1 dichlormethan : aceton (50 1) poskytla frakce obsahující produkt. Bylo dosaženo oddělení disacharidu po základní čáru, ale velmi málo byly odděleny stopy poněkud rychleji se pohybujícího materiálu. Frakce obsahující produkt byly odpařeny a znovu rozpuštěny v dichlormethanu (1,5 1). Tento roztok byl pomalu přidán k 'prudce* míchané směsi ethyletheru (7.5 1) a hexanu (10 1). Výsledná sraženina byla odfiltrována a promyta směsí ether : hexan, 2 : 1, vysušena na vzduchu přes noc, a pak sušena ve vysokém vakuu po 48 hodin. Precipitát se ukázal být titulní sloučeninou 13 podlé ^H-NMR a obsahoval malé množství rozpouštědla (1. - 5 procent hmotnost/hmotnost). ^H-NMR (CDC1₃) S: 4,67 (d, 1H, H-l''), 4,49 (d, 1H, H-l’), 4,33 (d, 1H, H-l).

Příklad 13

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetrao-acetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]-(2,3)0-(2,4,6-tri-o-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-O-(2amino-2-desoxy-3,6-di-0-acetyl-p-D-glukopyranosyl}-(1,3)~02,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 13)

K míchanému roztoku ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0-acetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)] — (2,3)-0-(2,4, 6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)(1-4)-0-(3,6-di-0-acetyl-2-N-allyloxykarbonyl-2-desoxy-p-D-glukopyranosyl)-(1-3)-0-2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosidu (sloučeniny 12) (5,10 g, 3,80 mmol) v bezvodém THF pod argonem byl za pokojové teploty přidán polymethylhydrosiloxan (420 :μ1). Reakční směs byla podrobena třikrát vakuovému čistícímu cyklu s argonem k odplynění roztoku. Baňka byla zabalena do hliníkové fólie k ochraně roztoku před světlem a na roztok bylo působeno paládium tetrakistrifenylfosfinem [Pd(Ph₃)₄ ; 158 mg, 0,14 mmol]. Po míchání po 18 hodin při pokojové teplotě ukazovala TLC ve směsi 10 : 1 CHC1₃ : MeOH úplné spotřebování sloučeniny 12 a jediný produkt o nižším R^. Reakční směs byla zředěna 60 ml EtOAc a promyta 2 x 200 ml ^0 a 1 x 200 ml nasyceného roztoku Naci, Organický roztok byl vysušen (MgSO₄), zfiltrován, zkoncentrován na rotační odparce a chromatografován na koloně koloně silikagelu o rozměru 65 mm x 10'' s použitím EtOAc : acetonu, 3 : 1, jako eluantu. Frakce obsahující produkt (podle

TLC) byly spojeny a zkoncentrovány za poskytnutí sloučeniny 13 (4,42 g, 87 procent) jako nahnědlé pevné látky. ¹H-NMR (300 MHz, & v ppm vzhledem k CHC1₃) 5,50 (m, 1H), 5,44 (dd, J = 6 Hz, J = 2 Hz, 1H), 5,35 - 5,01 (m),.4,89 (m, 2H), 4,63 (d, J = 6 Hz, 1H) , 4,59 - 4,35 (m), 4,22 - 3,38 (m), 3,81 (s, 3H) 2,69 (m, 1H) , 5,36 (d, J = 3, 5 Hz, 1H), 5,15 (dd, J = 8 Hz, J = 10,5 Hz, 1H), 2,57 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,21 (t, J = 5 Hz, 3H).

Příklad 14

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetrao-acetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát))-(2,3)0-(2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0-(2amino-2-desoxy-6-0-acetyl-3-D-glukopyranosyl)-(1/3)-0-2,4,6tri-O-acetyl-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 14)

K míchanému roztoku sloučeniny 13 (4,42 g, 3,29 mmol) v 366 ml 4 : 1 MeOH : H₂O v uzavřené baňce byla za pokojové teploty' přidána ledová’ kyselina octová^- (1’88 ^-μ! , 3 /29 mmol); Světle žlutý roztok byl pak zahřát na 50°C. Po 48- hodinách ukazovala TLC ve směsi 10 : 1 CHC1₃ : MeOH skoro úplné vymizení sloučeniny 13 a objevení se převažujícího produkt o poněkud vyšším Rf. Reakční směs byla ochlazena na pokojovou teplotu, zkoncentrována na rotační odparce na olej, a chromatografován na koloně silikagelu o rozměrech 65 mm x 10 s použitím 10 : 10 : 4 směsi EtOAc : hexan : MeOH jako eluantu.. Frakce obsahující produkt (podle TLC) byly spojeny a zkoncentrovány za poskytnutí sloučeniny 14 (2,78 g, 65 procent) jako pěny. ^H-NMR (300 MHz, fi v ppm vzhledem k CHC1₃) 5,50 (m, 1H), 5,40 (d, J = 2 Hz, 1H), 5,25 (d, J = 7 Hz, 1H) , 5,17 (dd, J = 6 Hz, J =7 Hz1H) , 5,04 (dd, J = 6 Hz, J = 7 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 3 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 6 Hz, 1H), 4,59 (dd, J = 3 Hz, J = 7 Hz, 1H), 4,42 -3,40 (m), 3,81 (s, 3H) 2,69 (m, 1H), 2,57 (dd, J = 3 Hz, J =10 Hz, 1H), 2,27 - 1,85 (I2s, 36H), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H),

1,21 (t, J = 5 Hz, 3H).

Příklad 15

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetraO-acetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]—(2,3)— 0-(2,4,6-tri-O-acetyl-p-D-galaktopyranosy1)-(1,4)-o-(2-benzamido-2-desoxy-6-O-acetyl-p-D-glukopyranosy1)-(1,3)-O-2,4,6tri-O-acetyl-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 15)

K míchanému roztoku sloučeniny 14 (150 mg, o,12 mmol) v 2 ml dichlormethanu za pokojové teploty pod argonovou atmosférou byl přidán bezvodý NaHC0₃ (40 mg, 0,48 mmol) a benzoylchlorid (34 mg, 0,24 mmol, 28 μΐ). Po míchání po 24 hodin ukazovala TLC ve směsi 80 : 10 EtOAC : aceton skoro úplné vymizení výchozího materiálu a objevení se materiálu o poněkud vyšším Rf. Reakční směs byla zředěna 150 ml ethylacetátu a promyta 1 x 50 ml H₂0. Organický roztok byl vysušen (MgSÓ₄), zfiltrován, zkoncentrován a chromatografován na koloně silikagelu s použitím 90 : 10 EtOAc : acetonu jako eluantu. Frakce obsahující produkt (podle TLC) byly spojeny a zkoncentrovány na rotační odparce a pak ve vysokém vakuu na voskovitou pastózní

pevnou	látku, sloučeninu 15 (140	mg,	85 procent)	. 1H-NMR	(300
MHz, δ	v ppm vzhledem k CHC13) 7,75 (d	, J = 7 Hz,	2H), 7,45	(ď,
J = .7	Hz,	1H),7,39 (dd, J =7	Hz,	J = 7 Hz,	2H), 6,45	(d,
J = 5	Hz,	1H), 5,50 (m, 1H), 5,40	(d,	J = 2 Hz,	1H), 5,37	(d,
J = 2	HZ,	1H), 5,27 (m, 1H), 5,09	(m,	1H), 4,82	(d, J = 3	HZ,
1H), 4	,63	(d, J = 6 HZ, 1H), 4,59	(dd,	J = 3 Hz,	J = 7 Hz,	1H) ,
4,3 -	3,40	(rn), 3,81 (s, 3H), 3,19	(m,	1H), 2,57	(dd, J = 3	Hz,
J = 10	HZ	, 1H), 2,27 - 1,85 (12s,	36H), 1,77 (dd	, J = 10	HZ,
J = 10	Hz,	1H), 1,21 (t, J = 5 HZ,	3H) .

Příklad 16

Ethyl— [methyl~ '’('5='a'cetamřdo-375-ďidesoxy-4'777879=tetra^ Ó-acetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]—(2_r3)— 0-(2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0-[(2,3,4tri-O-benzyl-a-L-fukopyranosyl)-(1, 3) ]-o-(2-benzamidó-2desoxy-3,6-di-O-acetyl-p-D-glukopyranosyl)-(1,3)-0-2,4,6tri-O-acetyl^-D-galaktopyranosid (sloučenina 16)

K míchanému roztoku sloučeniny 15 (140 mg, 0,1 mmol) v 1 ml dichlormethanu za pokojové teploty pod argonovou atmosférou byly přidány... práškovaná, plamenem sušená___4 A molekulární síta (100 mg), tetramethylmočovina (120 μΐ, 1 mmol) a tri-O-benzylfúkosylchlórid (218 mg, 0,5 mmol). Po míchání po jednu hodinu při pokojové teplotě byla reakce ochlazena na -20’C a zpracována s SnCl₂ (95 mg, 0,5 mmol) a AgClO₄ (126 mg,. 0,5 mmol),. Reakční směs byla ponechána pomalu se oteplit na pokojovou teplotu. Po míchání po 24 hodin ukazovala TLC ve směsi 10 : 1 CHCl^ : MeOH skoro úplné vymizení výchozího materiálu a objevení se materiálu ό poněkud nižším R_f. . ^J

Reakční směs byla zfiltrována přes vrstvu celitu s 50 ml dichlormethanu a filtrát byl promyt 2 x 50 ml. H₂O. Organický roztok byl vysušen (MgSO₄), zfiltrován, zkoncentrován a chromatografován na koloně silikagelu o rozměrech 20 mm x 6'' s použitím 10 : 10 : 3 směsi EtOAc : hexan : MeOH jako eluantu. Frakce ’ obsahující produkt (podle TLC) byly spojeny a zkoncentrovány na rotační odparce a pak ve vysokém vakuu na bílý film, sloučeninu 16 (140 mg, 77 procent). ¹H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem kCHClý) 7,46 (d, J - 7 Hz, 2H), 7)35 - 7,12 (m, 18H), 6,45 (d, J = 6 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,20 (m, 1H), 2,55 (dd, J = 4 HZ, J = 12 Hz, 1H), 1,18 (d, J = 6 HZ, 3H), 1,10 (t, J = 6 HZ, 3H).

Příklad 17 t

Ethyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranosylát)-(2,3)-o-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-0-(2-benzamido-2-desoxyf3-D-glukopyranosyl)-(l ,3)-Ο-β-D-galaktopyranosid (sloučenina 17)

K míchanému roztoku sloučeniny 16 (140 mg, 77 μιηοΐ) v 4 ml methanolu byl přidán hydroxid paladnatý na uhlí (140 mg, , 20 procentní podle hmotnosti paládia). Kašovitá směs byla podrobena třikrát vakuovému čistícímu cyklu s plynným vodíkem λ a pak držena pod vodíkem při tlaku jedné atmosféry při pokojové teplotě. Po jedné hodině ukazovala TLC ve směsi 5 : 1 EtOAC

MeOH úplné vymizení sloučeniny 16 a objevení se jediného materiálu o nižším R_f. Směs byla zfiltrována přes vrstvu celitu s 50 ml methanolu a zkoncentrována na rotační odparce na olej.

Tento olej byl rozpuštěn v 5 ml 4 : 1 MeOH : H₂O a míchán v uzavřené baňce za pokojové teploty, K míchanému roztoku byl přidán práškový methoxid sodný (140 mg, 2,6 mmol). Po 16 hodinách TLC v 60 : 50 : 15 CHC1₃ : MeOH : 15 mM CaCl₂ ukázala úplné vymizení výchozího materiálu a objevení se jediného produktu s nižším Rf.

Na tuto směs se působilo 1 gramem katexové pryskyřice Dowex 5x80-400 (vodíkové formy, čerstvě promyté methanolem), s mícháním po jednu minutu. Směs byla zfiltrována přes nálevku s fritou a filtrát zkoncentrován na rotační odparce na olej. Tento materiál byl chromatografován na koloně rozměrů 40 mm x 8' ' s médiem pro gelovou filtraci Bio-Rad Bio-Gel P2 (jemné zrnění) . a použitím 1 · M hydrogenuhličitanu amonného jako eluantu. Frakce obsahující produkt (podle TLC) byly spojeny a lyofilizovány na > bílý prášek, sloučeninu 17 (60 mg, 72 procent). ¹H-NMR (300 MHz, & v ppm vzhledem k HOD) 7,70 (d, J =7 Hz, 2H), 7,55 (d, J = 7 Hz, 1H), 7,47 (dd, J = 7 Hz, J = 7 Hz, 2H), 5,08 (d, J = 4Hz, 1H), 4,50 (d, J = 8 HZ, 1H), 4,27 (d, J = 8 Hz, 1H), .4,10 (d.,

J = 3 HZ, 1H), 4,05 - 3,40 (m), 2,70 (dd, J = 4,6 Hz, J = 12,4 Hz, 1H), 1,97 (s, 3H), 1,74 (dd, J = 12,4 Hz, J = 12,4 Hz, 1H), Ί—1-0—(-ty—J—=—5—Η-Ζ-ϊ—3H-)-,—1-,-07-(-d-,—J—=—7—HZ-,_3H.)---„---— 'Příklad 18 .....

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0acetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]-(2,3 )-O(2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-O-[(2,3,4tri-0-benzyl-a-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-O-(2-2'naftamido2-desoxy-3,6-di-0-acetyl-p-D-glukopyranosyl)-(1,3)-0-2,4,6tri-o-acetyl-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 29)

K míchanému roztoku sloučeniny 25 (připravené analogicky se sloučeninou 16; 90 mg, 48 μ,πιοί) v 5 ml methanolu byl přidán hydroxid paladnatý na uhlí (40 mg, 40 procentní podle hmotnosti paládia). Kašovitá směs byla podrobena třikrát vakuovému čistícímu cyklu s plynným vodíkem a pak držena pod vodíkem při tlaku jedné atmosféry při pokojové teplotě. Po 24 hodinách ukazovala TLC ve směsi 90 : 10 CH₂C1₂ : MeOH úplné vymizení sloučeniny 25 a objevení se jediného materiálu o nižším R_f. Směs byla zfiltrována přes vrstvu celiťu s 50 ml methanolu a zkoncentrována na rotační odparce na voskovitou pastózní pevnou látku. Tento produkt byl zpracován na koloně silikagelu s použitím směsi 90 : 10 CH₂C1₂ : MeOH jako eluantu. Frakce obsahující produkt (podle TLC) byly spojeny a zkoncentrovány k poskytnutí sloučeniny 29 (55 mg, 72 %). ^H-NMR (300 MHz, S v ppm vzhledem k CHC1₃) 8,39 (s, 1H), 7,94 (d, J = 7 Hz, 1H),

7,82 (m, 2H), 7,57 (m, 2H),~ 7,37 (m, 1H), 5,57 - 5,41-(m,. 3H),

5,22 (d, J = - 7 HZ, 1H), 5,15 (m, 1H), 4,87' - 4,39 (m), 4,35 (d,. J = 4 Hz, 2H), 4,19 -3,42 (m), 3,81 (s, 3H), 3,23.(m, 1H), 2,75 (bs, 1H), 2,57 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H), 2,27 - 1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H)-, 1,23 (d, J = 5 Hz,. 3H), 1,05 (d, J = 7 HZ, 3H).

sloučeniny sloučeniny

Při sledování postupů v podstatě podobných těm, které jsou rozebírány výše, a jako jsou ve Schématu 3 pro konverzi na sloučeniny 15, 16 a 17 byly připraveny také

- 38. Tabulky 1, 2 a 3 níže ukazují zobecněné struktury pro skupiny sloučenin odpovídajících sloučeninám 15, 16 nebo 17 a poskytují patřičná data pro každou z těchto sloučenin. Tabulka 1 ukazuje acylační činidlo použité pro přípravu každé R¹ skupiny. Tabulky 1 - 3 jsou následovány NMR daty a dodatečnými údaji pro některé z těchto sloučenin a inhibitorové sloučeniny 30 - 38, včetně výtěžků posledních kroků.

Tabulka 1

cca

148 mg,87% 0.4(90:10 EtOAc:aceton).

f coa

NOj cca

136 mg,78% 0.43 (90:10 EtOAc:aceton)

MOj

133 mg, 78% 0.40 (90:10 EtOAc:aceton)

143 mg, 82% 0,45 (90:10 EtOAc:aceton)

Tabulka 2

Sloučenina č. Glykosyl akceptor Výtěžek

Rf (rozpouštědlo)

18

135 mg,74% 0.35 (92:8 EtOAc:aceton) ·;

23_________ 19

100 mg,58% 0.39 (92:8 EtOAďaceton)

20

105 mg, 65% 0.37 (92:8 EtOAcacetorv)

21

100 mg, 58% 0.37 (92:8 EtOAc:aceton)

Sloučenina

Tabulka -3

. pentasacharid . .Výtěžek

62 mg. 60%

Rf .{.rozpouštědlo)

0.32 (90:10 CH₂CI₂:MeOH) mg,50% 0.39 (90:10 CH₂CI₂:MeOH) mg. 65% 0.31 (90:10 CH₂CI₂:MeOH)

Příklad 19

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-Oacetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]-(2,3 )-0(2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-O-(2-benzyloxykarbonylamido-2-desoxy-6-0-acetyl-p-D-glukopyranosyl)(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 39)

Roztok benzyloxykarbonylchloridu (CBZ-C1) (1,2 ml, 8,4 mmol) v CH₂C1₂ (2,0 mí) byl přidán po kapkách ke směsi sloučeniny 14a (10,8 g, 8,3 mmol) a NaHCO₃ (1,4 g, 16,6 mmol), a reakční směs byla míchána přes noc (asi 18 hodin). K této směsi byl přidán NaHC0₃ (1,4 g, 16,6 mmol) a CBZ-C1 (1,2 ml, 8,4 mmol), a výsledná směs byla míchána další čtyři hodiny. Výsledná směs byla zředěna AcOEt, promyta H₂O, vysušena nad MgSO₄ , zfiltrována a zkoncentrována. Zbytek byl chromátografován na koloně silikagelu k poskytnutí sloučeniny 39 (7,75 g, 65 procentní výtěžek) jako bílé pevné látky.

Příklad 20 '

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0acetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]-(2,3)-0(2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosy1)-(1,4)-0-[(2,3,4tri-O-benzyl-a-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-0-(2-benzyloxycarbonylamido-2-desoxy-3,6-di-0-acetyl-p-D-glukopyranosyl)-(1,3)0-2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 40)

K míchanému roztoku sloučeniny 39 (3,90 g, 2,72 mmol) ve 100 ml C1CH₂CH₂C1 byly přidány práškovaná molekulární síta (ΜΞ4Α) (12 g), tetramethylmočovina (TMU) (3,25 ml, 27,2 mmol) a 2,3,4-tri-O-benzyl-L-fukosylfluorid (CMH-048, 5,94 g, 13,6 mmol). Po míchání po 90 minut při pokojové teplotě byla směs odstíněna od světla, ochlazena na -20°C a zpracována s SnCl₂ (2,59 g, 13,6 mmol) a AgC10₄ (98 procentní, 2,88 g, 13,6 mmol). Reakční směs byla ponechána oteplit se na pokojovou'teplotu v průběhu 90 minut a míchána po 24 hodin. Pro dokončení reakce byly ke směsi při nula stupních C znovu přidány TMU (1,95 ml, -1-6773—~mmo±^-)^_;~CMH=O'4'8^ (375 6~g, 8717 mmol)7 Šnčl₂[1,55 g, 8,17 mmol) a AgClO₄ (1,73 g, 8,17 mmol) a směs byla'ponechána pomalu se oteplit na pokojovou teplotu. Po 48 hodinách byla výsledná směs zfiltrována přes vrstvu celitu a filtrát byl promyt H₂0. Organická fáze byla vysušena nad MgSO₄, zfiltrována, zkoncentrována a chromátografována na silikagelu (Hexan/AcOEt/ MeOH = 10/10/2) k poskytnutí sloučeniny 40 (3,65 g, 75 procentní výtěžek) a znovuzískání . výchozího materiálu, sloučeniny 39 (672 mg, 17 procentní výtěžek)._______ _____ ______— ------------ -----------Příklad 21

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0acetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]- ( 2,3)-0(2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-o-(2-amino-2desoxy-3,6-di-0-acetyl-fl-D-glukopyranosyl )-(1,3) -0-2,4,6tri-O-acetyl-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 41)

Směs sloučeniny 40 (3,06 g, 1,66 mmol), HCOONH₄ (1,05 g,

16,6 mmol) a 10 procentního Pd-C“ (vlhkého, 3,0 g) v EtOH (80 ml) byla refluxována s mícháním po 9,5 hodiny. K této směsi byly přidány další HCOONH₄ (1,05 g, 16,6 mmol) a 10 procentní Pd-C (3, 0 g) a výsledná směs byla refluxována dalších 11 hodin. Tato výsledná směs byla zfiltrována přes vrstvu Celitu a-zkoncentrována k poskytnutí sloučeniny 41 (2,30gf 96* procentní výtěžek) jako bílé pevné látky.

Příklad 22

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-Oacetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]-(2,3 )-0(2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-0-[(2-(3,5-dichlorbenzoylamido)2-desoxy-3,6-di-0-acetyí-p-D-glukopyranosyl]-(1,3)-0-2,4,6tri-O-acetyl-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 42) v ch₂ci₂

K míchanému roztoku sloučeniny 41 (40 mg, 0,028 mmol) (8,9 ml) byly přidány NaHCO^ (46 mg, 0,54 mmol) a 3,5-dichlorbenzoylchlorid (58,6 mg, 0,28 mmol). Po 12 hodinách za pokojové teploty byla reakční směs zředěna EtOAC a promyta H₂0. Organická fáze byla vysušena nad MgSO₄ , zfiltrována a odpařena k získání sloučeniny 42 (98,4 mg) jako světle žlutého oleje.

Příklad 23

t.

Ethyl [methyl- (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0acetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]-(2,3)-0(2,4,6-tri-0-acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-o-[(2-(3,5-dichlorbenzamido) 2-desoxy-3,6-di-0-acetyl-p-D-glukopyranosyl]-(1,3)-0-2,4,6tri-O-ácetyl^-D-galaktopyranosid (sloučenina 42)

K míchanému roztoku surové sloučeniny 42 (98,4 mg) v MeOH (8,9 ml) byl přidán 28 procentní NaOMe-MeOH (300 μΐ)? Po 48 hodinách za pokojové teploty byla směs zneutralizována DOWEXem 50W-X8 (H⁺ formou) a zfiltrována. Filtrát byl zkoncentrován, zředěn EtOAc a extrahován H₂0. Vodná fáze byla odpařena k získání odpovídajícího esteru. Na ester sé působilo 1 N NaOH (200 μΐ) v h₂O (5,0 ml). Směs byla míchána po 12 hodin za pokojové teploty, zneutralizována · DOWEXem 50W-X8 (H⁺ formou) a zfiltrována; Filtrát byl zkoncentrován, čištěn gelovou (p-2) filtrací (^H2° jako eluent) a lyofilizován k získání sloučeniny “43—('3Τ76~~πί51 kvantitativní výtěžek) jako bílého prášku. ^H-NMR (300 MHz, S v ppm vzhledem k H₂O) 7,61 (s, 3H), 5,00 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,47 (d, j = 7,59 Hz, 1H), 4,26 (d, J = 7,92 Hz, 1H), 4,09 (d, J = 2,97 Hz, 1H), 4,04 - 3,30 (m), 2,67 (m, 1H), 1,94 (s, 3H), 1,72 (t, J = 11,88 Hz, 1H), 1,09 (m, 6H) .

_____NMR data s 1 o.uč en in-18—-2 8— -----------------------Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0-acetylα-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát) ]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-Oacetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0-(2-fluorbenzamido-2-desoxy6-0-acetyl-p-D-glukopyranosyl)-(1,3)-0-2,4,6-tri-O-acetyl-p-Dgalaktopyranosid (sloučenina 18) ^H-NMR (300 MHz, δ v .ppm vzhledem k CHC1₃) 7,79 (m, 2H),

7,15	(m, 2H), 6,41 (d, J = 5 HZ, IH), '5,	,53 (m,	IH), 5,42	(m, IH),
5,23	(d, J = 7 Hz, IH), 5,17 (m, 2H),	4,89	(d, J = 3	Hz, IH),
4,63	(d, J = 6 Hz, IH), 4,59 (dd, J = 3	HZ, J	= 7 Hz, IH)	, 4,42 -
3,40	(m, IH), 2,57 (dd, J = 3 Hz, J --	= 10 Hz	, IH), 2,5	7 - 1,85
(12S,	36H), 1,77 (dd, J = 10 HZ, J =	10 Hz,	IH), 1,15	'(t, J =
5 Hz,	, 3H).

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,97tetra-0-acetyla-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylátj]-(2,3)-0-(2,4,6-tri-0acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0-(2-p-nitrobenzamido-2desoxy-6-0-acetyl-β-D-glukopyranosyl)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetylβ-D-galaktopyranosid (sloučenina 19) ^H-NMR (300 MHz, fi v ppm vzhledem k CHClg) 8,22 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,95 (d, J = 8 Hz, 2H), 6,81 (d, J = 5 Hz, 1H), 5,59 5,37 (m, 2H), 5,21 (d, J = 4 Hz, IH), 5,11 (m, 2H), 4,89 (d,

J = 2 Hz, 1H), 4,63 (d, J =5 Hz, 1H), 4,59 (dd, J = 1 Hz,

J = 7 Hz, 1H), 4,42 - 3,40 (m), 3,79 (s, 3H), 3,19 (m, 1H), 2,57 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H), 2,57 - 1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd,

J = 10 HZ, J = 10 Hz, 1H), 1,15 (t, J = 5 Hz, 3H).

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0-acetyla-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát) ]-(2,3 )-0-( 2,4,6-tri-0acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-O-[2-(E-l-oxo-3-fenylprop-2► en)amino-2-desoxy-6-0-acetyl-p-D-glukopyranosyl ] - (.1,3) -0-2,4,6tri-O-acetyl-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 20) ¹H-NMR (300 MHz, S v ppm vzhledem k CHC1₃) 7,57 (d, J = 11 Hz, 1H), 7,45 - 7,25 (m, 5H), 6,39 (d, J = 11 Hz, 2H) , 5,87 (d, J = 4 Hz, 1H), 5,45 (m, 1H) , 5,39 (m, 2H) , 5,21 (t, J = 7/ Hz, 1H), 5,17 - 4,97 (m, 2H), 4,89 (d, J =2 Hz, 1H), 4,635 (d, J = 5 Hz, 1H), 4,59 (dd, J = 1 Hz, J = 7 Hz, 1H), 4,42 - 3,40 (m), 3,79 (s,*3H), 3,05 (m, 1H) , 2,57 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H), 2,27 - 1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,15 (t, J = 5 Hz, 3H).

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0-acetyla-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát) ]-(2,3 )-0-( 2,4,6-tri-Oacetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(l ,4 )-0-( 2-2 ' -naftamido-2-desoxy6-0-acetyl-3-D-glukopyranosyl)-(1,3)-0-2,4,6-tri-O-acetyl-p-Dgalaktopyranosid (sloučenina 21) ^H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k CHC1₃) 8,25 (s, 1H), 7,95 - 7,42 (m, 6H), 6,58 (d, J = 5 Hz, 1H),. 5,53 (m, 1H), 5,44 (d, J =2 Hz, 1H), 5,41 - 5,23 (m), 5,17 - 5,01 (m), 4,89 (d, J = 3 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 6 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 6 Hz, 1H) , 4,59 (dd* J =3 Hz, J = 7 Hz, 1H), 4,42 - 3,40 (m), 3,81 (s, 3H), 3,27 (m, 1H), 2,57 (dd, J = 3 Hz, J =10 Hz, 1H), 2,27 - 1,85 (I2s, 36H), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,15 (t, J = 5 Hz, 3H)·.

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,β,9-tetra- O-acetyl^xH^lrycero-B-gal-akto-S-nonulOpyratfoisy 1^07=^273 )^0^(2 ^ye^ťři^ČH acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0-[(2,3,4-0-benzyl-a-Lfukopyranosy1)-(1,3)]-0-(2-p-fluorbenzamido)-2-desoxy-3,6-di-0acetyl-p-D-glukopyranosyl)-(1,3)-0-2,4,6-tri-O-acetyl-p-Dgalaktopyranosid (sloučenina 22) ^H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k CHCl-j) 7,42 (m, 2H),

7,39 - 7,17 (m, 15H), 6,95 (t, J = 7 Hz, 2H), 6,45 (d, J = 5 Hz) 1H), 5,57 - 5,37 (m, 3H) , 5,27 (d, J - 7 Hz, 1H), 5,17 --4,45' _(.m)_,_4_,_39—(d,—J—=—7—Hz-,—ΐ1H)-Í— 4-,-25- -3 ;41 “(m)— 3 ;81-(s , 3Ή) , 3721 (m, 1H), 2,57 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H), 2,27 - 1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,19 (d, J = 5 Hz, 3H), 1,15 (t, J = 5 HZ, 3H).

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra- 0-acetyla-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]-(2,3)-o-(2,4,6-tri-0acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0-[(2,3,4-0-benzyl-a-Lfukopyranosyl)-(l,3)]-O-(2-p-nitrobenzamido)-2-desoxy-3,6-di-Oacetyl-p-D-glukopyranosyl)-(1,3)-O-2,4,6-tri-O-acetyl-p-Dgalaktopyranosid (sloučenina 23) ’^H-NMR (300 MHz, 6 v. ppm vzhledem k CHC1₃) 8,15 (d, J = 8 HZ, 2H), 7,55 (d, J =8 Hz, 1H), 7,41 - 7,15 (m, 15H), 6,63 (d, J = 5 HZ, 1H), 5,48 (m, 1H), 5,43 (dd, J = 6 Hz, J = 2 Hz, 1H),

5,37 (d, J = 6 Hz, 1H), 5,19 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,15 - 4,45 (m) , 3,82 (s, 3H), 3,25 (m, 1H), 2,59 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H) , 2,27 - 1,85 (12Š*, 36H), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,19 (d, J = 5 Hz, 3H), 1,15 (t, J = 5 Hz, 3H).

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0-acetyla-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát))-(2,3)-O-(2,4,6-tri-0acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0-[(2,3,4-tri-O-benzyl-a-Lfukopyranosyl)-(1,3)]-o-[2-(E-l-oxo-3-fenylprop-2-en)amino2-desoxy-3,6-di-o-acetyl-p-D-glukopyranosyl)-(1,3)-0-2,4,6-tri-oacetyl-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 24) (300 MHz, δ v ppm vzhledem k CHCl₃) 7,42 (d, J = 11 HZ, 1H), 7,39 - 7,15 (m, 20H), 5,94‘(d, J = 11 Hz, 1H), 5,85 (d, J = 4 Hz, 1H), 5,55 - 5,29 (m, 4H), 5,17 - 4,42 (m), 4,25 (m, 2H), 4,17 - 3,40 (m), 3,79 (s, 3H), 3,05 (m, 1H), 2,57 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H), 2,27 - 1,85 (12s, 36H) , 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,19 (d, J =5 Hz, 3H), 1,15 (t, J =5 Hz, 3H) .

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0-acetyla-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát))-(2,3)-O-(2,4,6-tri-0acetyl-p-D-galaktopyranosyl )-(1,4) -O- [(2,3,4-tri-O-benzyl-a-L-; fukopyranosyl)-(1,3)]-O-(2-2'-naftamido-2-desoxy-3,6-di-0-acetylβ-D-glukopyranosyl)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetyl-p-Dgalaktopyranosid (sloučenina 25) ^H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k CHC1₃) 8,13 (s, 1H) , 7,84 (d, J = 7 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 7 Hz, 1H), 7,57 (m, 2H),

7,37 - 7,11 (m, 16H), 6,98 (d, J = 7 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 5 Hz, 1H), ,5,57 - 5,35 (m, 2H), 4,97 - 4,45 (m) , 4,25 (m, 2H), 4,19 - 3,42 (m), 3,81 (s,, 3H) , 3,23' (m, ΤΗ) , 2,57 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H), 2,27 -.1, 85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J =10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,Í9 (d, J = 5 Hz, 3H), 1,15 (t, J = 5 Hz, 3H).

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-O-acetyla-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát))-(2,3)-O-(2,4,6-tri-oacetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-O-[(2,3,4-tri-O-benzyl-a-L-__

Ϊukopyrano s y Γ)~( 1,3)) -0- (’2-p-f luorbenzamido-2-desoxy-3,6-di-0acetyl-p-D-glukopyranosyl )-(1,3) -0-2,4,6-tri-O-acetyl-f3-Dgalaktopyranosid (sloučenina 26) ¹H-NMR (300 MHz, S v ppm vzhledem k CHCl₃) 7,83 (m, 2H),

7,83 (m, 2H), 7,17 (m, 2H), 5,45 (m, 1H), 6,40 (m, 2H), 5,23 (d,

J = 5.Hz, 1H), 5,17 - 4,75 (m, 3H), 4,77 - 4,35 (m, 4H), 4,36 (m, _____2H _4_,_19—r_3_,_41_( m )-,_3 ,-8 l-(-s ,-3H-)-,-3-,-09-(bs-,- 1H-), - -2,6 2 (m -,- 1H) ,— · ----2,57 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H), 2,27 - 1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,24 (d, J = 5 Hz, 3H), 1,15 (t,

J = 5 Hz, 3H),

Ethyl [methyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-0-acetyla-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát))-(2,3)-0-(2,4 > 6-tri-0acetyl-p-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0-[(2,3,4-tri-O-benzyl-a-Lfukopyranosyl)-'(l ,3 ) ]-0-(2-p-aminobenzamido-2-desoxy-3,6-di-0acetyl-p-D-glukopyranosyl)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetyl-p-Dgalaktopyranosid (sloučenina 27)

	1H-NMR	(300 MHz, fi v	ppm vzhledem k CHC13)	7,	61 (d, J =
8 HZ	, 2H), 6,	75 (d, J = 5 Hz	, 1H), 6,57 (d, J =8	HZ,	. 2H),’5,57
(m,	1H), 5,43	(dd, J = 6 Hz,	J = 2 Hz, 1H), 5,27	(d,	J = 2 Hz,
1H) ,	5,19 (d,	J ~ 8 Hz, ΊΗ),	5,09 (ro, 1H), 4,95 (	ro, 2	H), 4,77 -
4,63	(m), 4,5	5 (dd, J = 7 Hz	, J = 1 Hz, 1H), 4,42	(d,	J = 4 Hz,
1H) 7	4,35 (ro,	2H), 4,21 - 3,	38 (m), 3, 82 (s, 3H),	3,1	7 (ro, 1H),
2,95	(bs, 1H)	, 2,59 (dd, J =	3 Hz, J - 10 Hz, 1H),	2,42	(bs, 1H),
2,27	- 1-,B5-	(12S, 36H), 1,7	7 (dď, J - 10 Hz, J	= 10	Hz, 1H),
1,22	(d, J =	5 Hz, 3H), 1,15	(t, J = 5 Hz, 3H).

Ethyl [methyl (5-acetamído-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-O-acetyla-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)]-(2,3)-O-(2,4,6-tri-Oacetyl-3-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-O-[(2,3,4-tri-O-benžyl-a-Lfukopyranosyl)-(1,3)]-o-[2-(3'-fenyl)propionamido-2-desoxy-3, 6di-O-acetyl-p-D-glukopyranosyl]-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acetyl-p-Dgalaktopyranosid (sloučenina 28) ¹H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k CHC1₃) 7,29 (m, 5H), 6,39 (d, J = 2.Hz, 1H), 5,85 (d, J = 4 Hz, 1H), 5,55 - 5,19 (m, 5H), 5,11 (t, J = 5 Hz, 1H), 4,95 (m, 4H), 4,71 - 4,35 (m) , 4,17 - 3,22 (m), 3,79 (s, 3H), 2,95 (t, J = 3 Hz, 2H), 2,57 (dd, J = 3 Hz, J = 10 HZ, 1H), 2,47 (d, J = 3 Hz, 2H), 2,27 - 1,85 (12S, 36H), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,24 (d, J = 5 Hz, 3H), 1,15 (t, J = 5 Hz, 3H).

Údaje pro sloučeniny 30 - 38

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-o-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-O-(2-p-fluorbenzamido-2-desoxy-p-Dglukopyranosyl)-(l,3)-0^-D-galaktopyranosid (sloučenina 30)

Rf = 0,62 (3 : 1 i-PrOH : NH₄OAc), bílá pevná látka, 41 mg, 96 procent. ~ ^H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem, k H₂0) „ 7,83 (m, 2H, aromát), 7,25 (m, 2H, aromát), 5,18 (d, J = 5 Hz,'.H-l (fuc), 1H), 4,95 (m), 4,56 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,37 (d, J.= 8 Hz, 1H), 4,19 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 4,15 - 3,42 (m), 2,77 (dd, J = 3 Hz, J - 10 Hz, 1H), 1,97 (s, 3H), 2,05 (s, 3H, NAc), 1,79 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,19 (m, 3H).

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-qal_aktor.2-nonulo-—

-pyr-anosy-l-átj - ¢273)^0^( β-D^gálaktopyranosy 1) -(1,4) -0[ (α-L-fukopyranosyl )-(1,3)] -0- (2-p-aminobenzamido-2-desoxy^-Dglukopyranosyl)-(l,3)-0-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 31)

Rf = 0,52 (3 : 1 i-PrOH : NH₄0Ac), bílá pevná látka, 26 mg, 96 procent.

^H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k H₂0) 7,65 (d, J = 9 Hz, 2H, aromát), 6,82.(d, .J = 9 Hz, 2H, aromát), 5,19 (d, J = 3 Hz, H-ι-fUC, 1Ή), 4,_38_l.d,_j__=_..:8_ΗΖ-,--1H)-,-4,-19 --(d, 3 = 2~Hz, 1H) ,

4,15 - 3,42 (m), 3,19 (q, J =6 HZ, 2H, Cff₂CH₃) , 2,79 (dd,

J - 3 Hz, J = 11 Hz, H_eg-3 (kyselina sialová), 1'H), 2,05 (s, 3H, NAc), 1,77 (dd, J =10 Hz, J = 10 Hz, H_ax~3 (kyselina sialová),

1H), 1,19 (d, J = 6 Hz, 3H, H-6-fuc), 1,17 (t, J = 6 Hz, 3H).

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0* [(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-0-[(2-(3^{* 1 * * * 5}-fenyl)-propionamido-2desoxy-p-D-glukopyranosyl] - (1,3)-Ο-β-D-galaktopyranosid (sloučenina 32)

Rf = 0,62 (3 : 1 i-PrOH : NH₄0Ac), bílá pevná látka, 47 mg, 98 procent.

¹H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k H-,0) 7,42 - 7,25 (m,

5H), 5,19 (d, J = 4 Hz, H-l-fuc, 1H), 4,95 (m), 4,57 (d, ’J = 8 Hz, 1H), 4,38 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,13 (d,..J = 2 „Hz, 1H), 4,11

- 3,42 (mi), 2,95. (t, J = 5 Hz, 2H, a-CH₂), 2,75 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, H_eg-3 (kyselina sialová), 1H), 2,63 (t, J = 5 Hz, 2H, CH₂Ph), 2,05 (s, 3H, NAc), 1,80 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, H_ax~3 (kyselina sialová), 1H), 1,24 (t, J - 5 Hz, 3H), 1,18 (d, J =

Hz, 3H).

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-O[(a-L-fukopyranosyl)-(l,3)]-0-(2,2'-naftamido-2-desoxy-p-Dglukopyranosyl)-(l,3)-0^-D-galaktopyranosid (sloučenina 33)

Rf = 0,52 (3 : 1 i-PrOH : NH₄OAc), bílá pevná látka, 35 mg, 96 procent.

^H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k H₂O) 8,39 (s, aromát, 1H), 8,02 (m, aromát, 2H), 7,82 (d, J = 7 Hz, aromát, 1H), 7,63 (m, aromát, 3H), 5,19 (d, J = 4 Hz, H-l (fuc), 1H), 4,95 (m), 4,57 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,19 (d, J = 2 Hz, 1H), 4,15 - 3,42 (m), 2,77 (dd, J = 3 Hz, J = 11 Hz, H_eq-3 (kyselina sialová), 1H), 2,05 (s, 3H, NAc), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, H_ax-3 (kyselina sialová), 1H), 1,19 (d, J =6 Hz, 3H, H-6-fuc), 1,05 (t, J = 6 Hz, 3H).

Ethyl [ (5-acětamido-3,5-rdidesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-O-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-0-(2,2*-fenylacetamido-2-desoxy-p-Dglukopyranosyl)-(l,3)-0-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 34)

R_f =0,62 (4,5 : 1 i-PrOH : NH₄OAc), bílá pevná látka, mg, 68 procent.

¹H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k H₂O) 7,45 - 7,27 (m,

5H), 4,85 (d, J = 3 Hz, H-l-fUC, 1H), 4,75 (m), 4,55 (d, J = 8 Hz, 1H) , 4,38 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,13 (d_r J = 2 Ηζ·, 1H), 4,09 - 3,42 (m), 2,78 (dd, J =3 Hz, J =10 Hz, H_ -3 (kyselina

V sialová), TH), 2,05 (2s, 5H, NÁc, PhCH₂),1,80 (dd, J = 10 Hz,

J = 10 Hz, H_ax-3 (kyselina sialová), 1H), 1,24 (t, J = 5 Hz, 3H), 1,18 (d, J = 5 HZ, 3H).

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-o-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-0-(2-p-methoxybenzamido-2-desoxy-p-Dglukopyranosyl~)-(^_ly3j-O-p-D-gaTaktopyranosid·”—(sToučenina—35j^-r~

R_f' = 0,52 (3 : 1 i-PrOH : NH₄0Ac), bílá pevná látka, 46 mg, 90 procent.

¹H-NMR (300 MHz, 5 v ppm vzhledem k H₂0) 7,75 (d, J = 9 Hz, 2H, aromát), 7,05 (d, J,= 9 Hz, 2H), 5,11 (d, J = 3 Hz, H-l-fuc, 1H), 4,95 (m), 4,52 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,25 (d, J =8 Hz, 1H),

4,19 (d, J = 2 Hz, 1H) , 4,15 3,39 (m) , 3’,82 (s, 3H, OCH₃) , 2,75 (dď, J = 3 Hz, j = 11 Hz, H_e_-3 (kyselina siaíová), 1H), 1,99 (s, 3H, NAc), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J =10 Hz, Η_&χ-3 (kyselina sialová), 1H), 1,17 (m, 5H, H-6-fuc, CH₂CH₃). _:

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-0-(p-D-galaktopyranosyl)-(l,4)-0- ~_; [(α-Lrfukopyranosyl)-(1,3)]-O-(2-p-terc-butylbenzamido-2-desoxyβ-D-glukopyranosyl)-(1,3)-Ο-β-D-galaktopyranosid (sloučenina.36)

R_f = 0,52 (3 : 1 i-PrOH : NH₄0Ac), bílá pevná látka, 46 mg, 90 procent.

¹H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k H2O) 7,65 (d, J = 9 Hz, 2H, aromát), 7,58 (d, J = 9 Hz, 2H), 5,19 (d, J = 4 Hz, H-l (fuc), 1H), 4,95 (m), 4,57 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,38 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,19 (d, J = 2 HZ, 1H), 4,15 - 3,39 (m), 2,73 (dd, J ~ 3 Hz, J = Ϊ1 Hz, Ηθ^-3 (kyselina sialová), 1H), 2,05 (s, 3H, NAcj, 1,77 (dd,. J =.10 Hz, J = 10 Hz, Hax-3 (kyselina sialová), 1H), 1,24 (S, 9H, ^t_Bu), 1,17 (m, 5H, H-6-fuc, CH2C/Í₃) .

(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulo pyranosylát)-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosyl) - (1,4)-0-[(a-L-fukopyranosy1)—(1,3)]—0-(2-benzamido-2-desoxy-β-D-glukopyranosyl)(l,3).-0-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 37) ¹H-NMR (300 MHz, & v ppm vzhledem k H₂0) 1,15 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH₃ Z fuc), 1,81 (1H, t, J = 10,4 Hz, H-3a z NANA), 2,02 (3H, S, CH₃CONH), 2,78 (1H, dd, J = 10,4 Hz, 3,2 Hz, H-3’’e z NANA), 3,5 - 4,2 (m), 4,4 - 4,8 (m), 5,16 (d, d, H-l z FUC, a, β), 5,2 (d, J =3,4 Hz, H-l, a), 7,5 - 7,8 (5H, aromát).

Benzyl (5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulo pyranosylát)-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0-[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-0-(2-benzamido-2-desoxy-p-D-glukopyranosyl)(1,3)-0-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 38) ^H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhledem k H₂0) 1,08 (3H, d, J =

6,4 Hz, CH₃ z fuc), 1,76 (1H, t, J =10,4 Hz, H-3'’a z NANA), 1,97 (3H, s, CH₃C0NH) , 2,7 (1H, dd, J = 10,4 Hz, 3,2 Hz, H-3”e Z NANA), 3,4 - 0,42 (m), 4,5 (1H, d, J = 7,7 Hz), 4,6 (1H, d, J = 8,0 Hz), 5,02 (d, J = 3,8 Hz, H-l z FUC), 7,1 - 7,8 (10H, aromát).

NMR data sloučenin 44 - 49

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-0-[2-(3,4-dichlorbenzamido)-2-desoxyβ-D-glukopyranoΞyl]-(l,3)-0-β-D-galaktopyranosid (sloučenina 44) ^H-NMR (270 MHz, δ v ppm vzhledem k H₂O) 7,82 (s, 1H) , 7,56 (m, 2H), 5,99 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 7,59 Hz, 1H), 4,25 (d, J = 7,91 Hz, 1H) , 4,15 - 3,22 (m), 2,66 (dd, J = 12,54 HZ , - J-= 3 ; 96 •“Η'Ζ'/'ΪΗΓ, 1 ,94 (s / ÁH) , l”/76'(t' J = 12,54 Hz , 1H) , 1,10 (m, 6H).

Ethyl [ (5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3) ]-0-(2-furanamido-2-desoxy^-Dglukopyranosyl)-(1,3)-Ο-β-D-galaktopyranosid (sloučenina 45) ¹H-NMR (270 MHz, δ v ppm vzhledem k H₂0) 7,59 (d, J = 1,98 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 3,63 Hz, 1H), 6,54 (dd, J = 3,36 Hz, J - 1, 98 Hz, 1H), 5,05 (d, J = 4,29 Hz, 1H) , 4,46 (d, J = 7,~59 Hz, 1H) ,

4,23 (d, J = 7,92 Hz, 1H), 4,06 (d, J = 2,97 Hz, 1H), 4,02 - 3,32 (m), 2,68 (dd, J = 12,87 Hz, J = 3,96 Hz, 1H), 1,95 (s, 3H),'1,77 (t., J = 12,87 Hz, 1H) , 1,08 (m, 6H) .

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-O-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(a-L-fukopyranosyl)-(l,3)]-0-(2-thiofenamido-2-desoxy-p-Dglukopyranosyl)-(1,3)-Ο-β-D-galaktopyranosid (sloučenina 46) ¹H-NMR (270 MHz, δ v ppm vzhledem k H₂0) 7,63 (m, 2H), 7,10 (m, IH), 5,06 (d, J = 3,63 Hz, IH), 4,46 (d, J = 7,92 Hz, IH),

4,23 (d, J = 7,92 HZ, IH), 4,06 (d, J = 3,30 Hz, IH), 4,04 - 3,30 (m), 2,67 (dd, J = 12,21 Hz, J = 3,96 Hz, IH), 1,94 (s, 3H), 1,73 (t, J = 12,21 Hz, IH), 1,07 (m, 6H).

Ethyl [(5-acetamido~3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-O-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-O[(a-L-fukopyranosyl)-(l,3)]—O—[2-(2-thiomethyl)nikotinamido-2desoxy-p-D-glukopyranosyl] - (1,3 )-Ο-β-D-galaktopyranosid (sloučenina 48) ¹H-NMR (270 MHz, δ v ppm .vzhledem k H₂0) 7,62 (m, 2H), 7,06

(m,	IH) ,	5,04	(d, J =	3,96	HZ,	IH)	, 4,43 (d,	J =	7,59	Hz,	IH) ,
4,23	(d,	J =	7,92 Hz,	IH),	IH),	4,	10 - 3,20	(m),	2,68	(m,	IH) ,
2,14	(s,	3H),	2,09 (s,	3H),	1,70	(m,	IH), 1,05	(m/	6H) .

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-o-[2 —(6-dodecyloxy-2-naftamido-2desoxy-p-D-glukopyranosyl] - (1,3)-Ο-β-D-galaktopyranosid (sloučenina 47) ^H-NMR (270 MHz, δ v ppm vzhledem k CH₃ÓH) 8,32 (s, IH), 7,90 - 7,78 (m, 3H), 7,26- 7,16 (m, 2H), 5,17 - 5,13 (m, IH), 4,48 - 4,40 (m, IH), 4,22 - 3,22 (m), 2,88 - 2,82 (m, IH), 2,01 (s, 3H), 1,85 - 1,19 (m), 0,91 - 0,85 (m, 3H).

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3 )-0-( β-D-galaktopyranosyl )-.(1,4)-ΟΙ-Ca-L-f ukopyranosyl )-(1,3)] -0- (2-m-butyloxybenzamido-2-desoxyβ-D-glukopyranosyl)-(1,3)-Ο-β-D-galaktopyranosÍd ~ (sloučenina 49) ^XH-NMR (270 MHz, 6 v ppm vzhledem k H₂O) 7,39 - 7,22 (m, 3H), 7,13 - 7,09 (m, 1H), 5,03 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,46 (d, J = 7,92 Hz, 1H), 4,07 - 3,34 (m) , 2,68 - 2,64 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,74 - 1,62 (m, 3H), 1,30 - 1,44 (m, 2H), 1,07 (t, J = 7,25 Hz, 3H), 1,06 (t, J = 5,60 Hz, 3H) , 0,84 (t, J = 7,58 Hz, 3H).

Údaje pro sloučeniny 50 a 51

Ethyl [(5-acetamido-3,5-didesoxy-g-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylát)-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosy1)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)]-O-(2-nikotinamido-2-desoxy-p-Dglukopyranosyl)-(1,3)-0-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 50)

Rf =0,22 (silikagel, iso-propanol /1 M NH₄OAc); ^XH-NMR (300 MHz,‘d₂0): δ 1,13 (d, 3H, J = 6,6 Hz, CH₃ Fuc), 1,15 (t, 3H, J = 6,7 Hz, OCH₂CH₃), 1,78 (t, 1H, J =11,9 Hz, H-3a NANA), 2,01 (ε, 3Η, COCH₃), 2,74 (dd, 1Η, J=4,4, 11,9, H-3e NANA), 3,41 - 4,33 (násobné vrcholy, 34H), 4,31 (d, 1H, J - 8,1 Hz, β-anomer Gal), 4,53 (d, 1H, J = 8,0 Hz, β-anomer Gal), 5,10 (d, 1H, J = 3,7 Hz, α-anomer Fuc), 7,56 (ní, 1H, H-5 pýridyl), 8,16 (dd, J =

1,3 8,1 Hz, H-4 pyridyl), 8,68 (m, 1H, H-6 pyridyl), 8,85 (s, 1H, H-2 pyridyl) .

Ethyl [natrium (5-acetamido-3,5-didesoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranosylát)-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranosyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranosyl)-(1,3)-0-]-(2-benzensulfonamido-2-desoxy-p-Dglukopyranosid)-(l,3)-0-p-D-galaktopyranosid (sloučenina 51)

R_f = 0,28 (silikagel, 20 procentní 1 M NH₄0Ac / iso-propanol). ^H-NMR (300 MHz, D₂0, ppm vzhledem k H₂0) : δ 7,92 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,69 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,60 (t, J = 7,2 HZ, 2H), 5,47 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 4,62 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,51 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,24 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,07 (dd, J = 3,1, 9,6 Hz, 1H), 3,99 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 3,96 - 3,46 (m, 29H), 2,75 (dd, J = 4,6, 12,5 Hz, 1H), 2,68 (dd, J = 8,1, 8,1 Hz, 1H), 2,02 (s, 3H), 1,78 (t, J = 12,1 Hz, 1H), 1,20 (t, 3H), 1,16 (d, J = 6,5 Hz, 3H).

Stanovení buněčné vazby ¹ Byl vyvinut modifikovaný test na adhezi s rekombinantním rozpustným E-selektinem / HL-60 buňkami k poskytnutí jednoduchého a vysoce reprodukovatelného způsobu, jímž se porovná potenciál oligosacharidových analog sialyl Lewis X V blokování E-selektinu. V tomto testu je rekombinantní rozpustný E-selektin (rELAM) navázán na plastikový povrch 96-jamkové ELISA destičky. Sloučenina analogická sialyl Le^x ve zředěních, jež mají být testovány, se přidá do jamek s následným přidáním buněk HL-60, jež nesou ligand pro E-selektin. Buňky jsou ponechány adherovat k testovací destičce pokryté E-selektinem a neadherované buňky jsou odstraněny promytím destičky s použitím automatické promývačky destiček. Navázané buňky jsou kvantifikovány měřením buněčného enzymu myeloperoxidasy. Koncentrace testovaného oligosacharidu potřebná k dosažení 50 procentní inhibice kontrolní adheze je použitá ke srovnání analog co do*účinnosti.

Eficience používání podobné navázáné rozpustné části —rekombinantního—ELÁM—1—-jako-substrátu-pr.o_v.azbu_HL-60 a dalších buněk, jež se vážou k buňkám obsahujícím receptor ELAM-l (E-selektin) byla prokázána Lobbem et al., J. Inununol. 147: 124-129 (1991).

MATERIÁLY A METODY __________Materiály _

Destičky ELISA, Immulon 2 (Dynatec Laboratories) (Fisher 14-245-61)

0,2 μπι filtrační jednotky (Nalgene #150-0020) rELAM (rekombinantní modifikovaný ELAM-l) afinitně purifikovaný, připravený jak následuje níže. Každá šarže rELAM byla funkčně testována ke stanovení patřičné koncentrace pro použití v testu. Šarže byla titrována v rozmezí 1 —>,5 μΐ/ml s použitím sloučeniny Z (popsané zde později) jako standardu. Pak byly připraveny malé alikvoty, rychle zamraženy v lázni suchého ledu a acetonu, a skladovány při -70°C. Každý alikvot byl otevřen jen jednou a pak odhozen nebo schraňován pro použití v jiných typech testů.

Zde používaná rozpustná forma E-selektinu (rELAM neboli sol-E-selektin) byla konstruována delecí transmembránové domény z cDNA. Tato rekombinantní cDNA byla klonována do savčího vektoru ' exprese pCDNAl- [derivátu pCDM8; .Seed, jVature.3 29: 840 (1987)], jenž obsahuje chimérní virový promotor cytomegaloviru/viru lidské imunitní nedostatečnosti. Když je zaveden do buněk lidské ledvinová nádorové linie 293 transformovaných adenovirem, exprese > z CMV je '-účinně' aktivována genovým, produktem El mechanismem, jenž nebyl zcela pochopen. Do buněk 293 byl zaveden konstrukt pCDNAl-sol-E-selektin, prostřednictvím kalciumfosfátového přenosu genu, a byla vytvořena stabilní linie exprimující vysoké hladiny sol-E-selektinu. Sol-E-selektin produkovaný těmito buňkami byl purifikován imunoafinitní chromatografií na koloně Protein-A Sepharosy s anti-E-selektin monoklonální protilátkou.

Konkrétněji: Lidská ledvinová nádorová linie buněk 293 transformovaných adenovirem byla získána z ATCC (CRL-1573). Buňky 293 byly rozrůstány jako adherantní kultura v DMEM, získaném od Whittaker Bioproducts {Walkersville, MD), doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS), získaného od JRH Biochemical (Lenexa, KS).

Plasmid pCDNAl, derivát pCDM8 [Seed, Nátuře 329: 840 (1987)], byl získán od fy. Invitrogen (San Diego, CA). Plasmid pBluescript II byl získán od fy. stratagene (San Diego, CA). Plasmid pSV2-neo [Southern et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 327 (1982)] obsahuje gen E. coli kódující aminoglykosid 3 '-fosfotransferasu. Když je pSV2-neo zaveden do savčích buněk, transfekované buňky Vykazují rezistenci k antibiotiku G418..

1,67 kbp DNA fragment kódující zkrácený strukturní gen pro E-selektin byl izolován polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) amplifikací cDNA odvozené z;mRNA, jež byla izolována z lidských endotheliálních buněk aktivovaných IL-1. Unikátní Cla 1 místo bylo vloženo 5'-amplimerem 28 nukleotidů nad iniciačním kodonem strukturního genu pro E-selektin. 3'-amplimer vložil za aminokyselinu 527 maturníhó E-selektinu terminační kodon TGA a následující unikátní Xhol restrikční místo. C-konec sol-E-selektinu se nachází u c-konce šestého opakovaného konsensus elementu, a tímto se zajišťuje delece transmembránové domény. 1,67 kbp PCR fragment byl ko-digerován restrikčními endonukleasami Cla l a Xho 1 a subklónován do restrikčních míst Cla 1 a Xho 1 klónovacího Vektoru pBluescript II, za poskytnutí vektoru pBSÍI-sol-Ě-seÍektin. Rozpustný E-selektin má délku 527 aminokyselin a obsahuje 11 potenciálních glykosylačních míst.

1,67 kbp DNA fragment obsahující cDNA sol-E-selektinu byl izolován z pBSII-sol-E-selektinu a subklónován do restrikčních míst Eco RV a Xho 1 vektoru exprese pCDNAl, čímž byl poskytnut vektor pCDNAl-sol-E-selektin.

pCDNAl-sol-E-selektin byl kotransformován s pSV2-neo, pomocí -kalciumfosfátové techniky_[Kriegler, Gene Transfer and

Expression: A Laboratory Manual, W. H. Freeman, New York, N.Y. (1991)] do buněk 293. Čtyřicet osm hodin po transfekci byly transfekované buňky 293 trypsinizovány a naneseny do DMEM, procentní FBS, a 600 rog/ml G418 (Geneticin, Sigma). Selekční médium bylo měněno každé tři dny, dokud nebyla získána stabilní G418-rezistentní populace.

Jednotlivé, klony G418-rezistentních buněk byly izolovány klónovacími válečky? Izolované klony byly -hodnoceny na syntézu sol-E-selektinu pomocí enzymového ímunosorpčního testu-fEtlSA-)-,--používajícího anti-E-selektin monoklonální protilátku, nazvanou CY1787, jako primární protilátku. Pozitivní klony byly nanášeny jako 10^ buněk / 100 mm misku. 24 hodin později byly metabolicky značeny . [³⁵S]-methiOninempo pět hodin.. Značený sol-E-selektin byl imunoprecipitován z .média anti-E-selektin monoklonální protilátkou* a elektroforován na 10 procentním PAGE gelu, gel byl vysušen a podroben autoradiografii. Klónř:293ff3 byl vybrán jako stabilní, buněčná, linie, která-produkoval největší množství 110-kD sol-E-selektinové. bílkoviny na buňku.

10-ti komůrková Nunc Cell. Factory (6250 cm^z celkové, plochy . povrchu, Nunc) byla naočkována 2,78 x 10⁶ buněk (klón 293#3) v 850 ml DMEM doplněném 5 procenty FBS a inkubována po 72 hodin při 37’C. Médium bylo sklizeno a nahrazeno 850 ml DMEM s 5 procenty FBS. Potom byla buněčná továrna inkubována po 48 hodin při 37*C, médium sklizeno podruhé a nahrazeno 850 ml .DMEM s 5 procenty FBS..Potom byla buněčná továrna inkubována po 48 hodin při 37°C a médium sklizeno potřetí (a naposled).

Po každém sklízení byl k médiu přidán 0,02 procentní azid sodný. Médium byly vyčištěno centrifugací '(5000 x g), ..přefiltrováno .přes 0,2 pm filtr a skladováno při 4’C do doby další purifikace.

Monoklonální protilátka CY1787 byla konjugována k protein-A Sepharose v podstatě jak je popsáno Schneiderem et al., J. Biol. Chem., 257: 10766 (1982). V krátkosti: 28 mg monoklonální protilátky CY1787 (5 mg/ml) v PBS bylo mícháno s 5 ml protein-A Sepharosy po 30 minut při pokojové teplotě. Zrnka byla pak čtyřikrát promyta centrifugací s 25 ml 0,2 M borátového pufru, pH 8,2, s následnými dvěma promytími s 10 ml 0,2 M triethanolaminem, pH 8,2. Náplň pak byla suspendována v 40 ml 0,2 M triethanolaminového pufru, pH 8,2, obsahujícího 0,02 M dimethylpimelimidát. Po reakci po 45 minut při pokojové teplotě za rotování byla náplň dvakrát promyta 0,02 M ethanolaminem, pH 8,2, s následnými třemi promytími s 10 ml 0,2 M borátového pufru, pH 8,2. Nenavázaná protilátka bylá odstraněna elucí s 0,1 M natriumacetátovým pufrem, pH 4,5. Z aplikované protilátky se 89 procent zkonjugovalo s protein-A Sepharosou.

Supernatant tkáňové kultury (2550 ml) procházel přes 0,7 cm x 1,5 cm předřazenou kolonou protein-A Sepharosy spojenou do . ·*.

serie s 0,7 cm x 1,5 cm afinitní kolonu CY1787-proteín-A ' /-¾¾

Sepharosy při průtoku 20 ml / hod. Kolony pak bylo odpojeny \ a afinitní kolona obsahující . CY1787 byla promývána 20 mM Tris ·.* pufrem, pH_ 7,5, obsahujícím. 150 mM NaCl a 2 mM CaCl₂, dokud se absorbance eluátu při 280 nm nepřiblížila k nule. Vázaný

E-selektin byl eluován 0,1 M natriumacetátovým pufrem, pH 3,5, obsahujícím 1 mM CaCl₂ s použitím gravitačního průtoku. Frakce -Á (1 ml) byly sbírány do 300 μΐ 2 M Tris, pH 10. Frakce obsahující bílkovinu byly spojeny a dialyzovány proti DPBS. Po zkoncentrování na Amicon Centriprep 30 do dosažení koncentrace bílkoviny přibližně 1 mg/ml byl purifikovaný E-selektin rozdělen na alikvoty a uchováván při ’ -80°C. Čistota podle SDS PAGE byla vyšší než 90 procent. Z 2550 ml média tkáňové kultury bylo vypurifikbváno celkově 10 mg E-selektinu.

Dulbecco PBS (DPBS) (Whittaker, 17-513B)

HL-60 (ATCC, CCL 240) Velká šarže buněk HL-60 byla ponechána narůst, byla testována na funkci v testu a ověřena na nepřítomnost mykoplasmy.

Buňky byly zamraženy při -180°C v 10 procentním DMSO, 10 procentním fetálním telecím séru, procentním RPMI 1640 (Whittaker) při ,, ...___ - 15 x 10⁶ buněk na zkumavku v 2 ml kryozkumavkách. Zamražování bylo provedeno v zařízení s řízenou rychlostí.

Sloučenina Z standardní SLe^x pentasacharid-OEt:

NeuAca2->3Galpl->4[Fucal->3]GlcNAcpl->3GalpOEt

Standard sloučeniny Z byl připraven jako 10 mM roztok v DPBS. Roztok byl uchováván při -20’C.

Pufr k promývání neutrofilů (NWB):

10X HBSS (Gibco, 310-4065)	20	ml
1 M HEPS (Gibco, 380-5630)	2	ml
Super Q H2O	178	ml
D-glukosa (Sigma, G 7021)	o,	4 g
	200	ml

Připravován denně čerstvý nebo skladován sterilizovaný při 4°C. pH 7,2 - 7,4, sterilizován filtrací (0,2 μ).

100 mM CaCl₂ , zásobní roztok:

Chlorid vápenatý, bezvodý (Baker, 1308) Super Q H₂O

Sterilizován filtrací (0,2 μ)

1,11 g

100 ml

100 ml

Pufr k promývání neutrofilů + l mM CaCl₂ + 0,1 procentní BSA (NWB/Ca/BSA)

Bovinní sérový albumin (Sigma, A-6918) 10 g

100 mM CaCl₂ , zásobní roztok 100 ml

NWB do 1000 ml pH 7,2 - 7,4. Sterilizován filtrací (0,2 μ), zásobní roztok skladován při 4°C.

Blokovací pufr:

DPBS (Whittaker, 17-513B) 100- ml

Bovinní sérový albumin (Sigma, A-6918) 1 g

100 ml ' pH 7,2 - 7,4. Sterilizován filtrací (0,2 μ), zásobní roztok skladován při 4°C.

Roztok kyseliny citrónové, 0,1 M:

Kyselina citrónová, volná kyselina (Sigma, C-0759) 10,5 g

Super Q h₂0 doplnit na 500 ml

........— Při-prav-it— -ve-----vo-lumetri-ckém nebo'—ka'1'i'břbvaněm valciT

Skladovat při pokojové teplotě.

Roztok fosforečnanu sodného, 0,2 M:

Fosforečnan sodný, dvojbazický, bezvodý (Na₂HPO₄) (Sigma, C-0759) 14,2 g

Super Q H₂0 doplnit na 500 ml

Připravit ve volumetrickém nebo kalibrovaném válci. Skladovat při pokojové teplotě.

♦ _% p_Ufr-_Citrát/fosfát:------------------— —------ —- --- -- —Roztok kyseliny citrónové, 0,1 M: . 24,3 ml

Roztok fosforečnanu sodného, 0,2 M: 25,7 ml

Super Q H₂0 50 ml

100 ml

Skladovat při pokojové teplotě.

Buněčný lyzační pufr:

Nonidet P 40 (NP-40) (Sigma, N-6507) 0,1 g

0,1 M citrát 24,3 ml

0,2 M fosforečnan sodný, dvojbazický 25,7 ml

Super Q H₂0 50 ml

100,0 ml

Skladovat při pokojové teplotě.

OPDA (o-fenylendiamin):

Pufr citrát/fosfát		10	ml
o-Fenylendiamin dihydrochlorid	(Sigma, P 8287)	10	mg
H2O2 (Sigma, H 1009)		10	μΐ
Připraven bezprostředně před	použitím. Peroxid	vodíku	byl
skladován v temnu při 10°C.

H2SO4 stóp pufr, 4 N	ml
Kyselina sírová, 18 M (Fisher, A300S-212)	111
Super Q H20	do 500	ml

Metoda

1. rELAM (sol-E-selektin) byl naředěn na koncentraci patřičnou pro běžnou šarži. V těchto testech byl rELAM používán v: 2,5 μ9/πι1 v DPBS. S použitím vícekanálové pipety bylo přidáno 50 μΐ na jamku do následujících jamek jedné ELXSA destičky: El - E6, F1 - F6 a G1 - G6. DPBS (50 μΐ) byl přidán do jamek H1, H2 a H3 pro použití jako kontroly. Na tuto destičku se odkazuje jako na pretestovací destičku.

Jedna další destička byla pokryta pro každé tři neznámé

... _______vzorky,.. je ž-.měl-y -být-tes-továny-.- Opět-s-použi-tím- vícekanálové' pipety bylo přidáno 50 μΐ zředěného rELAM do následujících jamek destiček: B1 - B12, Cl - C12, Dl - D12, El - E12, F1 F12, G1 - G12. Na tyto destičky se odkazuje jako na vzorkové destičky. Tyto destičky byly zakryty fólií a inkubovány tři hodiny při pokojové teplotě.

- 100 2. Destičky byly promyty třikrát s 200 μΐ blokovacího pufru.

Jamky byly znovu naplněny 200 μΐ blokovacího pufru, zakryty fólií a inkubovány jednu hodinu při pokojové teplotě.

3. Tři zkumavky zamražených buněk HL-60 byly rozmraženy na každé připravené dvě vzorkové destičky. Zkumavky byly rozmraženy rychle v lázni teploty 37°C. Buňky byly napipetovány do 15 ml centrifugační zkumavky obsahující 10 ml ledově chladného NWB 1 procentního BSA. Buňky byly centrifugovány sedm minut při- 1200 rpm v 4’C centrifuze-· _v a^--promyty-ještě--dvakrát—v—-NWB/-BSA-.- -Buňky byly spočítány------s použitím hemocytometru a resuspendovány na 10⁷ /ml v NWB + 1 procentní BSA + 1- mM CaCl₂.

4. Zatímco byly promývány buňky byly připraveny roztoky.

ά testovaných a standardních sloučenin, oligosacharidová sloučenina, jež měla být testována, byla navážena„do 1,5 ml Eppendorfovy zkumavky a byl přidán DPBS k přípravě vzorku jako 10 mM roztoku podle její molekulové hmotnosti. Alikvot objemu 6 μΐ byl odebrán z každého vzorku a po 2 μΐ bylo náneseno na každý čtvereček pH testovacího proužku.< Když vzorek neměl pH 7 - 7,4, pH hodnota byla nastavena do tohoto rozmezí, nebo jinak sloučenina nebyla testována. Test vyžaduje 180 μΐ 10 mM roztoku každé použité sloučeniny a 180 μ! 10 mM roztoku sloučeniny Z na každou destičku, včetně testovací destičky.

5. Blokované ELISA destičky byly převráceny s mávnutím a odsáty s prudkým poklepávání na papírový ručník tak, aby se odstranila z jamek veškerá kapalina. Do každé jamky pak bylo s. použitím vícekanálové pipety přidáno 4 0 μΐ NWB + .?

procentní BSA + 1 mM Ca²⁺.

101

6. Z jamek E6 a G6 pretestovací destičky byla odstraněna veškerá kapalina. Alikvot objemu 40 μΐ z 10 mM zásobního roztoku sloučeniny Z byl přidán do každé z těchto prázdných jamek, jakož i do jamek E5 a G5. Roztok v jamce E5 byl promíchán pipetováním 10 krát nahoru a dolu pomocí p 200 pipetoru nastaveného na 40 μΐ. Alikvot objemu 40‘μΐ roztoku byl odebrán z jamky a seriálně ředěn na destičce v jamce E4, pak E3 a pak E2, pokaždé s mícháním 10 krát. Alikvot objemu . 40 μΐ byl odebrán z poslední jamky a vyhozen. Tento postup byl opakován pro řady G4 až G2.

7. Buňky HL-60 (2 x 10⁶) byly přidány do každé jamky (s výjimkou Hl) v 20 μΐ s použitím vícekanálové pipety. Destička byla umístěna do třepačky destiček na pět vteřin, a ponechána stát 15 minut při pokojové teplotě.

8. Destička byla promyta s použitím promývačky Molecular

Devices Microplate; Washer. nastavené na pomalé dodávání tekutiny a tři promytí na jamku, s NWB + 1 procentní BSA + mM CaCl₂ jako promývacím roztokem.

9. Byl přidán buněčný lyzační.pufr (50 μΐ na jamku) a destička byla umístěna do třepačky destiček na pět minut při pokojové teplotě.

10. Byl přidán alikvot OPDA roztoku v objemu 50 μΐ na jamku, a destička byla umístěna do třepačky destiček na deset minut při pokojové teplotě.

11. Barevná reakce byla zastavena přidáním 40 μΐ H₂SO₄ stop pufru na jamku, a optická denzita (O.D.) jamek destičky byla čtena při 492 nm, s odečtením Hl jako blanku.

102

12. Negativní kontrola byla stanovena vzetím středu O.D. hodnot pro jamky H2 a H3. Toto je negativní vazebná kontrola bez E-selektinu. Pozitivní vazebná kontrola bylá vypočítána pro standardní křivku jako střed jamek El, Fl, F2, F3, F4,

F5, F6 a Gl. Když negativní vazebná kontrola bez E-selektinu byla větší než 10 procent středu pozitivní vazebné kontroly, v testu se nepokračovalo. Když tato hodnota byla menší nebo rovná středu pozitivní vazebné kontroly, duplikáty vzorků (E6, G6), (E5, G5), (E4, G4), (E3, G3) a (E2, G2) byly zprůměrovány. Každý průměr ’ duplikátůby 1 vydělen—hodnotou—středu-pozitivní- vazebné------kontroly, což dalo procento pozitivní vazby pro každou koncentraci testované sloučeniny. Procento pozitivní vazebné kontroly bylo vyneseno proti log koncentrace inhibitoru. Z grafu¹ byl stanoven bod 50 procentní inhibice. Tento bod musí ležet mezi 0,5 a 1,5 mM a když ne, v testu se nepokračuje.

13. Pokud byla.standardní křivka pretestovací destičky, v rozsahu přijatelných hranic, provedl se zbytek testu. Standardní sloučenina Z byla ředěna.na každé vzorkové destičce jako . v kroku 6. Testované sloučeniny byly ředěny podobně. Testované sloučeniny analogické SLe^x byly na destičce umístovány podle následující matrice:

Konc.			Test č. 1	Test č. 2	Test Č. 3
6,6 mM neboli	řeď.	1	B6, D6	B7, D7	......E7, G7
3,3 mM	řeď.	2	B5, D5	B8, D8	E8, G8
1,65 mM	řeď.	3	B4, D4	B9, D9	E9, G9
0,82 mM	řeď.	4	B3, D3	BIO, D10	E10, G10
0,412 mM	řeď.	5	B2, D2	Bil, Dli	Eli, Gll

103

14. Když byly všechny vzorky naředěny na destičku, byly přidány buňky HL-60 jako v kroku 7 shora a postup sledoval prováděni po krok 11 jako shora.

15. Střed pozitivní vazebné kontroly byla vypočítán pro test č. lz jamek B2, Cl-6 a D2; pro test č. 2 z jamek B12, C7-12 a D12; pro test č. 3 z jamek E12, F7-12 a G12. Procento pozitivní vazby pro každé, ředění každého testu bylo vyneseno do grafu a z grafu byl stanoven bod 50 procentní inhibice. Aktivita pro každou testovanou sloučeninu analogickou SLe^x byla zaznamenána jako poměr 50 procentní vazebné hodnoty pro standardní sloučeninu Z s vydělením 50 procentní vazebnou hodnotou pro testovaný vzorek SLe,^x. Hodnota pro SLe^x samotný byla stanovena podobně.

Poměry pro SLe^x některá uvažovaná analoga SLe^x jsou poskytnuty v Tabulce 4, níže.

104

Tabulka 4

Test buněčné adheze s E-selektinem

Poměr ( IC₅₀ sloučeniny 2

Sloučenina číslo sloučeniny IC₅₀ sloučeniny )

»

0.76

5.0

3.2

4.3

0.5.3

9.3

10.0

11.2

105

T1 ka 4 (pokračování)

Poměr ( IC₅₀ sloučeniny Z

Sloučenina Číslo sloučeniny IC₅₀ sloučeniny )

0.2

*

4.7

5.7

8.9

4.0

10.0

106

Tstt>u.Xlca 4 (pokračování)

Sloučenina

Číslo sloučeniny

Poměr ( ICgQ sloučeniny Z IC₅₀ sloučeniny )

6.0

6.0

0.3

3.0

3.0

107

Předešlé je pro předkládaný vynález míněno jako vysvětlující, ale ne omezující, četné variace a modifikace mohou být provedeny bez odchylek od skutečného ducha a rozsahu nových přístupů tohoto vynálezu.

A

A'

108

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   ΓΤ Sloučenina^ 'analogická 'sialyl Ue^x-obecného-vzorce——A—

   Y je vybrán ze skupiny sestávající, z. C(O), SO₂,„ HNC(O), 0C(0) a SC(O);

   R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z arylové, substituované arylové a fenyl C^-Cg alkylenové skupiny, kďe arylová skupina má jeden pěti- nebo šestičlenný aromatický kruh, fúzované pěti/sestičlenné aromatické kruhy nebo dva fúzované šestičlenné aromatické kruhy, jejichž kruhy jsou vybrány ze skupiny sestávající z hydrokarbylových, monooxahydrokarbylovýc.h, monothiahydrokarbylových, monoazahydrokarbylových a diazahydrokarbylových kruhů a substituovaná arylová skupina je řečená arylová skupina, mající substituent vybraný ze skupiny sestávající z haló-, trifluormethylových, nitro-, ” ^Cl^-C18 alkylových, ^ci^-ci8 alkoxylových, amino-, mono ^ci^ci8 alkylaminových, di ^ci^-ci8 alkylaminových, benzylaminových, ^cl^-c18 alkylbenzylaminových, C₁-C-_Lg thioalkylových a alkyl kářbbxamidóvých skupin, nebo

   R^XY je allylkarbonyl nebo chloracetyl;

   R² je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, C^-C-^g přímého řetězce, větveného řetězce nebo cyklického hydrokarbylu, C^-Cg

   109 alkyl C-j^-Cg alkylen Qrkarboxylátu, (-C^_tri (C^-C^ alkyl/fenyl) silyl ^c2^-c4 alkylénu, monosacharidu a disacharidu;

   nebo OR² dohromady tvoří ^ci^-ci8 P^ímý řetězec, větvený řetězec nebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

   R³ je vodík nebo C-^-Cg acyl;

   R⁴ je vodík, ^Cx^-Cg alkyl nebo benzyl;

   R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, benzylu, methoxybenzylu, dimethoxybenzylu a Cj-Cg acylu;

   R⁷ je methyl nebo hydroxyroethyl; a

   X je vybrán ze skupiny sestávající z C^-Cg acyloxy, C₂-Cg hydroxylacyloxy, hydroxy, halo a azido.
2. 2. Sloučenina analogická sialyl Le^x obecného vzorce II

   Y je vybrán ze skupiny sestávající z C(O), S0₂, HNC(O), 0C(0) a SC(O);

   R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z arylové, substituované arylové a fenyl c^-c^ alkylenové skupiny, kde arylová skupina má jeden pěti- nebo šestičlenný aromatický kruh, fúzované» pěti/sestičlenné aromatické kruhy nebo dva fúzované šestičlenné aromatické kruhy,...jej.ichž. „kruhy ..jsou......vybrány- ze skupinysestávající z hydrokarbylových, monooxahydrokarbylových, monothiahydrokarbylových, monoazahydrokarbylových a diazahydrokarbylových kruhu a substituovaná arylová skupina je řečená arylová skupina, mající substituent vybraný ze skupiny sestávající z halo-, trifluormethylových, nitro-, ^Cl^C18 alkylových, ' alkoxylových, amino-, ’ mono ^ci^_ci8

   110 alkylaminových, di a 1 kylam i nových, benzylaminových, ^cl^_c18 alkylbenzylaminových, thioalkylových a ^C1^-C₁₈ alkyl ~karbóxamidových'“skup'i’n7~neb'o ™ ~~ .........——- ———

   R² je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, C^-C₁₈ přímého řetězce, větveného řetězce nebo cyklického hydrokarbylu/ C^-Cg alkyl C^-Cg alkylen LO-karboxylátu, cj-trialkyl/fenyl) silyl

   C₂-C₄, alkylenu, monosacharidu a disacharidu;

   nebo OR² dohromady tvoří C^-C^g přímý řetězec, větvený řetězec nebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

   R³.je vodík nebo Cj-Cg.acyl;. . ......

   ¹___R⁴ je vodík, C-^-Cg alkyl nebo benzyl;____________ _L __________

   R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, benzylu, methoxybenzylu, dimethoxybenzylu a C^-Cg acylu;

   R⁷ je methyl nebo hydroxymethyl; a

   X je vybrán ze skupiny sestávající z ^ci^-cg acyloxy, C₂~Cg hydroxylacyloxy, hydroxy, halo a azido.

   Y je vybrán 2e skupiny sestávající z C(0), S0₂, HNC(O), OC(O) a SC(O);

   R¹ je vybrán ze skupiny sestávajícím ary lově, substituované

   111 arylové a fenyl C₁-C₃ alkylenové skupiny, kde arylová skupina má jeden pěti- nebo šestičlenný aromatický kruh, fúzované pěti/šestičlenné aromatické kruhy nebo dva fúzované šestičlenné aromatické kruhy, jejichž kruhy jsou vybrány ze skupiny sestávající z hydrokarbylových, monooxahydrokarbylových, monothiahydrokarbylových, monoazahydrokarbylových a diazahydrokarbylových kruhů a substituovaná arylová skupina je řečená arylová skupina, mající substituent vybraný ze skupiny sestávající z halo-, trifluormethylových, nitro-, ^ci^-ci8 alkylových, ^ci^-ci8 alkoxylových, amino-, mono C
3. 3-C18 alkylaminových, di ^cl^c18 alkylaminových, benzylaminových, ^cl~^c18 ^alfcylk^enzYl^ami^novÝ^ch, ^ci~C18 thioalkylových a ^Ci^-C₁₈ alkyl karboxamidových skupin, nebo

   R^XY je allylkarbonyl nebo chloracetyl;

   R^z je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, C^-C^g přímého řetězce, větveného řetězce nebo cyklického hydrokarbylu, C^-Cg alkyl C-j^-Cg alkylen qykarboxylátu, éú-tri(C₁-C₄ alkyl/fenyl) silyl ^c2^-c4 alkylenu, monosacharidu a disacharidu;

   nebo OR² dohromady tvoří ^ci”^ci8 přímý řetězec, větvený řetězec nebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

   R³ je vodík nebo C^-Cg acyl;

   R⁴ je vodík, C-j.-Cg alkyl nebo benzyl;

   R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, benzylu, methoxybenzylu, dimethoxybenzylu a Cy-Cg acylu;

   R⁷ je methyl nebo hydroxymethyl; a

   X je vybrán ze skupiny sestávající z C^-Cg acyloxy, C₂-Cg hydroxylacyloxy, hydroxy, halo a azido.

   112
4. 4. Sloučenina analogická , sialyl Le^x obecného vzorce I

   Y je -vybrán- ze skupiny sestávající z C(0), S0₂, HNC(O), _o.c.(O.)__a_SC-(-0-)-;------------—- ------------------ ------R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z arylové, substituované arylové a fenyl alky lenové skupiny, kde arylová skupina má jeden pěti- nebo šestičlenný aromatický kruh, fúzované péti/šestičlenné aromatické kruhy nebo dva fúzované šestičlenné aromatické kruhy, jejichž kruhy jsou vybrány ze skupiny sestávající z hydrokarbylových, monooxahydrokarbylových, monothiahydrokarbylových, monoazahydrókarbylových a diazahydrokarbylových kruhů a substituovaná arylová skupina je řečená arylová skupina, mající substituent vybraný ze skupiny sestávající z halo-, trifluormethylových, nitro-, ^ci~^ci8 alkylových, ^ci^-ci8 alkoxylových, amino-, mono ^ci~^ci8 alkylaminových, di ^ci“^ci8 alkylaminových, benzylaminových, ^cl^-c18 alkylbenzylaminových, thioalkylových a C^-C^g alkyl karboxamidových skupin, nebo

   R² je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, C-^-C^g přímého řetězce, větveného řetězce nebo cyklického hydrokarbylu, C^-Cg alkyl C-^-Cg alkylen νυ-karboxylátu, U)-tri(C₁-c₄ alkyl/fenyl) silyl C₂-C₄ alkylenu, monosacharidu a disacharidu;

   nebo 0R^z dohromady tvoří ^ci^-cj8 Přímý řetězec, větvený řetězec nebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

   R³ je vodík nebo ^C]_-C₆ acyl;

   R⁴ je vodík, CjqCg alkyl nebo benzyl;

   R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, benzylu, methoxybenzylu, dimethoxybenzylu a C^-Cg acylu;

   113

   R⁷ je methyl nebo hydroxymethyl; a

   X je vybrán ze skupiny sestávající z C^-Cg acyloxy, C₂-Cg hydroxylacyloxy, hydroxy, halo a azido.
5. 5. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že farmaceuticky přijatelné zřečfovadlo má v sobě rozpuštěné nebo dispergované buněčnou adhezi inhibující množství sloučeniny obecného vzorce I kde Y je vybrán ze skupiny sestávající z C(O), S0₂, HNC(O), 0C(0) a SC(O);

   R³· je jak je definováno výše, a s výhodu je vybrán ze skupiny sestávající z arylové, substituované arylové a fenyl ^cl^-c3 alkylenové skupiny, kde arylová skupina je vybrána ze skupiny sestávající z furylu, thienylu, fenylu, naftylu, pyridylu, pyrazinylu, benzofuranylu, isobenzofuranylu, benzo [b nebo c] thienylu, pyrimidinylu, pyridazinylu, chinolinylu, isachinoTinylu··, ' chinoxalinylu; ’ ~ naftyri'dřnylu7' ftalazinylu a chinazolinylu, a substituovaná arylová skupina je dříve zmiňovaná arylová skupina, mající substituent vybraný ze skupiny sestávající z halo-, trifluormethylových, nitro-, ^ci^-ci8 alkylových, ^<'i“^cis alkoxylových, amino-, mono-C3-C18 alkylaminových, di-c1-C18 alkylaminových, benzylaminových a ^C]_^_C18 alkylbenzylaminových skupin;

   114

   R² je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, ^ci^_c]_g přímého řetězce, větveného řetězce nebo cyklického hydrokarbylu, Cj-Cg alkyl^-Cp^C^aTkylenTiFkarboxyrátu, <iFťri(C^-C4 alkyl/fenyl) silyl~ ^C2~^C4 alkylenu, monosacharidu a disacharidu nebo OR² dohromady tvoří C1-C₁₈ přímý řetězec, větvený řetězec nebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

   R⁷ je methyl (CH₃) nebo hydroxymethyl (CH₂OH); a

   X je vybrán ze skupiny sestávající z C-^-Cg acyloxy, C₂~Cg , hydroxylacyloxy, hydroxy, halo a azido.

   __Způsob přípravy_laktosamoniové—soli-v -y z -n -a č-u j í cí-— se tím, že zahrnuje kroky

   a) smíchání laktulosy a primárního aminu, jenž je monosubstituovaným derivátem amonia, jehož dusíkový atom je vázán k reduktivně odstranitelné chránící skupině, za vytvoření reakční směsi, přičemž řečený primární amin slouží jako rozpouštědlo i reaktant a je přítomen v množství 2- až 10-krát vyšším než je molární množství laktulosy; *V

   b) udržování řečené reakční směsi při teplotě při teplotě 10°C až 60°C, po dobu dostatečnou k vytvoření příslušného laktuloso N-glykosidu;

   c) ponechání řečeného vytvořeného laktuloso N-glykosidu reagovat s až ekvivalentním množstvím karboxylové kyseliny mající pK_a hodnotu 2,5 až 5,0 v rozpouštědle C^-C-j alkoholu, při teplotě 10°C až 30°C k přesmyku řečeného laktuloso N-glykosidu na amino-blokovanou laktosamoniovou sůl, mající reduktivně odstranitelnou chránící skupinu vázanou k aminu;

   d) reduktivní odstranění chránící skupiny z řečené amino-blokované laktosamoniové soli za tvorby laktosamoniové soli.

   115
6. 7. Sloučenina podle nároku 4 vyznačující se tím, že je členem skupiny sestávající z

   116

   117
7. 8. Sloučenina podle nároku 4 vyznačující se tím, že je členem skupiny sestávající z

   0 ί CK 213 CEi

   118

   119
8. 9. Sloučenina podle nároku 4 vyznáJčující tím, že je členem skupiny sestávající z

   120

   Anotace

   Název vynálezu: Sloučenina analogická sialyl Le^x. farmaceuticky prostředek ji obsahující a způsob přípravy laktosamoniové soli f

   Vynález se týká analog sialyl Lewis^x (sialyl Le^x, SLe^x), jako inhibitorů buněčné adheze, zejména sloučenin analogických sialyl Le^x, inhibujících buněčnou adhezi mezi selektinovým receptorem a buňkami, jež exprimují sialyl Le^x na svůj povrch, jakož i způsobů a prostředků jejich použití, a způsobů a intermediátů jejich přípravy. Uvažované intermediáty mají 2-N-acetylový zbytek GlcNAc substituován YR¹ skupinou, kde Y je C(O), S0₂, HNC(O), 0C(0) a SC(O) a R¹ je arylový, substituovaný arylový nebo fenyl alkylenový zbytek. Obzvláště výhodné jsou inhibitorové sloučeniny obecného strukturního vzorce (I,/í

   Způsob přípravy laktosamoniové soli se vyznačuje (a) smícháním laktulosy a primárního aminu,- přičemž, primární amin slouží jako rozpouštědlo i reaktant; '(b) udržováním reakční směsi po dobu dostatečnou k vytvoření příslušného laktuloso N-glykosidu; c) reakcí vytvořeného laktuloso N-glykosidu s karboxylovou kyselinou za přesmyku laktuloso N-glykosidu na amino-blokovanou laktosamoniovou sůl, mající reduktivně odstranitelnou chránící skupinu vázanou k aminu; (d) reduktivním odstraněním chránící skupiny.

   V i

   I ;

   i (

   R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z arylové, substituované arylové·a fenyl C_n-C^ alkylenové skupiny, kde arylová skupina má. -jeden--pětř=-nebo-šestičlenný----aromatický —kruh, -—fúzované— pěti/šestičlenné aromatické kruhy nebo dva fúzované šestičlenné aromatické kruhy, jejichž kruhy jsou vybrány ze skupiny V sestávající . z hydrokarbylových, monooxahydrokarbylových, monothiahydrokarbylových, monoazahydrokarbylových a diazahydrokarbylových kruhů a substituovaná arylová skupina je řečená arylová skupina, mající súbstituent vybraný ze skupiny sestávající, z halo-, trifluormethylových, nitro-, ^Cl“^C18 alkylových, ^ci^-ci8 alkoxylových, amino-, mono ^ci^-ci8 alkylaminových, di ^ci”^ci8 alkylaminových, benzylaminových, ^cl“^c18 alkylbenzylaminových, Cf-C-^g thioalkylových a C^-Cfg alkyl karboxamidových skupin, nebo

   R² je vybrán ze skupiny sestávající z.vodíku, Ci“C₁₈ přímého řetězce, větveného řetězce nebo cyklického hydrokarbylu, C^-Cg alkyl Cf-Cg alkylen lú-karboxylátUjCd-triíCf-C^ alkyl/fenyl) silyl ^c2^-c4 alkylenu, monosacharidu a disacharidu;

   O ” * nebo OR dohromady tvoří C^-C^g přímý řetězec, větvený řetězec nebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

   R³ je vodík nebo C^-Cg acyl; ‘ jA

   R⁴ -je vodík, Cf-Cg alkyl nebo benzyl;

   R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, benzylu, t roethoxybenzylu, dimethoxybenzylu a Cf-Cg acylu;

   R⁷ je methyl nebo hydroxymethyl; a

   X je vybrán ze skupiny sestávající z C^-Cg acyloxy, C₂~Cg hydroxylacyloxy, hydroxy, halo a azido.