SK141695A3 - Analogous compound sialyl lex, pharmaceutical agent containing this compound and method of preparation of lactoseammoniacal salt - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka analógov sialyl Lewis^x (sialyl Le^x alebo SLe^x), ktoré inhibujú bunkovú adhéziu sprostredkovanú selektínni, prostriedkov obsahujúcich tieto analógy a spôsob ich prípravy. a spôsobu prípravy týchto analógov.

Doterajší stav techniky

Vaskulárne endoteliálne bunky a krvné doštičky majú kľúčovú úlohu v mnohých biologických odpovediach, pretože selektívne viažu určité bunky, napríklad fagocytické leukocyty v krvnom obehu. Napríklad: Endoteliálne bunky prednostne viažu monocyty a granulocyty pred ich migráciou cez cievnu stenu a do okolitého tkaniva pri zápalovej odpovedi.

O určitých zlúčeninách spúšťajúcich zápal je známe, že pôsobia priamo na vaskulárny endotel a podporujú adhéziu leukocytov na cievnu stenu. Bunky sa potom pohybujú cez steny a do oblastí poranenia alebo infekcie.

bunkovej adhézii sa tiež tvrdí, že je zapojená do metastázovania nádorov. Obiehajúce rakovinové bunky akoby využívali normálne telesné zápalové mechanizmy a viažu sa na oblasti cievnych stien, kde je endotel aktivovaný.

Krvné doštičky sú tiež zapojené do podobných odpovedí. 0 doštičkách je známe, že sa aktivujú počas počiatku hemostázy a prechádzajú rozsiahlejšími morfologickými, biochemickými a funkčnými zmenami (napr. rýchlou granulárnou exocytózou alebo degranuláciou). pri ktorých alfa granulárna membrána doštičky fúzuje s vonkajšou plazmatickou membránou.

10024

V dôsledku toho sa začnú exprimovat nové bielkoviny bunkového povrchu, ako odpovedá novým funkciám aktivovaných doštičiek, ako je schopnosť väzby na iné aktivované doštičky a ďalšie bunky. Aktivované doštičky sa zachytávajú do rastúceho trombu alebo sú rýchlo odstránené z krvného obehu. 0 aktivovaných doštičkách je známe, že sa viažu na fagocytické leukocyty, vrátane monocytov a neutrofilov. Príklady patologických a ďalších biologických procesov, o ktorých sa tvrdí, že sú sprostredkované týmto procesom zahŕňajú artériosklerózu, zrážanie krvi a zápaly.

Nedávne práce zistili, že do rozoznávania rôznych obiehajúcich buniek endotelom a doštičkami sú zapojené špecializované povrchové receptory na endoteliálnych bunkách a doštičkách, nazývané E-selektín (ELAM-1, endothelial leukocyte adhesion molecule-1) respektíve P-selektín (GMP-140, granule membráne protein-140). 0 E-selektíne bolo napríklad dokázané, že sprostredkuje endoteliálnu adhéziu leukocytov, ktorá je prvým krokom v mnohých zápalových odpovediach. E-selektín konkrétne viaže ľudské neutrofily, monocyty, eozinofily, určité T-lymfocyty [Graber et. al . , J. Immunoi., 145 - 819 (1990)1, NK bunky a promyelocyt. ické bunky línie HL-60.

E-selektín je indukovateľne exprimovaný na vaskulárnych endoteliálnych bunkách [Bevilacqua et al. , Science 243 1160-11.65 (1989) a Hession et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87^: 1673-1677 (1990)1. Pre tento receptor bolo ukázané, že je indukovaný zápalovými cytokínmi ako je interleukin 18 (IL-IP) a faktorom nekrózie nádorov a. (TNFa), ako aj bakteriálnym endotoxínom (lypopolysacharidom) [Bevilacqua et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 9238-9242 (1987)1. Tieto zlúčeniny zvyšujú adhéziu polymorfonukleárnych leukocytov (neutrofilov) a monocytov [Bevilacqua et. al . , Proc. Natl . Acad. Sci., 84= 9238-9242 (1987)].

P-selektín (známy tiež ako GMP-140 a PADGEM) je prítomný na povrchu doštičiek a endoteliálnych buniek, kde sprostredkuje interakcie doštička-leukocyt a endotel3

10024 leukocyt [Geng et al.. Náture 343= 757-760 (1990)1. Takto je napríklad známe, že aktivované doštičky, ktoré majú na svojom povrchu exprlmovaný P-selektín, sa viažu na monocyty a neutrofily [Jungi et al. , Blood 67 - 629-636 (1986)1 , a že sa taktiež viažu na línie buniek podobných monocytom, napr. HL-60 a U937 [Jungi et al.. Blood 67: 629-636 (1986); Silverst-ein et al., J. Clin. Invest., 79= 867-874 (1987)].

P-selektín je bielkovinou alfa granulárnej membrány, ktorá má molekulovú hmotnosť 140 000, a ktorá je exprimovaná na povrch aktivovanej doštičky pri a granulárnej sekrécii [Hsu-Lin et al 259: 9121-9126 (1984); Stenberg et al.

880-886 (1985);

aktivácii doštičky , J. Clin. Invest..

J. Celí Biol.. 101: Clin. Invest., 78:

Berman et al., J.

130-137 (1986)]. Nachádza sa aj v megakaryocytoch [Beckstead et al., Blood 67= 285-293 (1986)] a v endoteliálnych bunkách al.. Blood 70= 335a (1987)] vnútri [McEver et

Blood 73:

číslo 4 783 reaktívne um i estňovací

Weibelových-Paladeho teliesok [Bonfanti et al.

1109-1112 (1989)1. Fúrie et al., U.S. patent

330, opisujú monoklonálne protilátky s P-selektínom.

Tretím receptorom je lymfocytárny receptor, MEL-14 antigén alebo jeho ľudský protajšok LAM-1 (L-selektín) [Gallatin et al.. Náture 304: 30-34 (1989);

Siegellman et al., Science 243; 1165-1172 (1989); Rosen,

913-919 (1989); a Lásky et al., Celí 56: Navyše na umiestňovanie lymfocytov sa pre uznáva funkcia v

Celí Biology 1^:

1045-1055 (1989)1 MEL-14 antigén/LAM-1 neutrofilov na endotel.

Výraz selektín bol navrhnutý ktorá zahŕňa E-selektín L-selektín (MEL-14), kvôli selektívnej povahe ich ranej väzbe receptorov, (GMP-140) a

1ektínom í pre všeobecnú triedu (ELAM-1), P-selektín ich doméne podobnej adhéznej funkcie.

Štruktúra a funkcia selektínových receptorov bola objasnená klonovaním a expresiou cDNA plných horeuvedené receptory [Bevilacqua 1.160-1165 (1989). (ELAM-1); Geng dĺžok kódujúcich všetky et al., Science 243= et al.. Náture 343=

10024 ktorý má postupnosť motív epidermálneho

757-760 (1990), (GMP-140); Lásky et al.. Celí 56= 1045-1055 (1989). (MEL-14 antigén)].

Extracelulárna čast selektínov môže byt na základe homológií s už opísanými bielkovinami rozdelená na tri segmenty. Aminokoncová oblast (okolo 120 aminokyselín) je príbuzná lektínovým bielkovinám cicavcov typu C. ako sú opísané Drickamerom, J. Biol. Chem., 263= 9557-9560 (1988). ktoré indikujú receptor CD23 s nízkou afinitou IgE. Nasleduje polypeptidový segment, príbuznú bielkovinám. obsahujúcim rastového faktoru (EGF). Nakoniec: Za EGF doménou je jeden alebo viac tandemovo sa opakujúcich motívov, vždy po asi 60 aminokyselinách, príbuzných motívom nachádzaným v rodine regulačných bielkovín komplementu.

U.S. patent číslo 5 079 353 a jeho priradený U.S.

patent číslo 5 296 594 opisujú syntézu a použitie sialyl Le^x a sialyl Le³ antigénov, ktoré sú prítomné v rakovinových sú ligandmi selektínových receptorov. U.S.

712 opisuje väzbové interakcie medzi ako je ELAM-1 (E-selektín) a ligandy, ako aj ligandy, obsahujúcimi niekoľko (LacNac) jednotiek spolu s termálnou jednu alebo viac kukozylových skupín, ktoré sú viazané na GlcNac časti LacNac jednotky.

Publikované medzinárodné prihlášky VO 91/19501 a VO 91/19502 zverejňujú, že oligosacharidy obsahujúce pentamérne uvedené ďalej inhibujú selektívne bunkám i tkanivách a patent číslo 5 143 rôznymi receptormi, ako je sialyl Le^x N-aeety1 laktózamino sialyl skupinou a a hexamérne štruktúry bunkovú väzbu medzi (ďalej) a testované tými, ktoré obsahujú obsahujúcimi tento selektínový receptor, pentahexasacharidy poskytoval i

1igand a že lepšiu inhibíciu ako SLe^x.

NeuAc«2->3Galpl->4(Fuc«l->3 )GlcNAc(il, 3Gal<3- ;

NeuAc<x2->3Galf$l->4(Fucocl->3 )GlcNAc<3l, 3Galβΐ, 4Glc-: a NeuAc«2->3Galŕíl->4(Fucal->3 )GlcNAc = SLe^x .

10024

Podstata vynálezu

Tento vynález uvažuje so zlúčeninou analogickou sialyl Le* CSLe*). ktorá inhibuje adhéziu buniek, ktoré majú na svojom povrchu exprlmovaný SLe* . intermediárnu zlúčeninu v syntéze inhibítora. ako aj postup na prípravu intermediátu a prostriedku obsahujúceho inhibítor.

r⁵o ^orS

Y je vybraný zo skupiny HNCCO). OCCO) a SCCO):

R¹ je vybraný zo skupiny substituovanej arylovej kde arylová skupina pozostávajúcej z CCO). SO2 , pozostávajúcej z arylovej. a fenyl C-ι -C3 alkylénovej skupiny, má jeden pät- alebo šesťčlenný chromatický kruh. fúzované päť/šesťčlenné aromatické kruhy alebo dva fúzované šesťčlenné aromatické kruhy, ktorých kruhy sú vybrané zo skupiny z hydrokarbylových. monooxahydrokarby1ových.

pozos táva J úce j monot i ahydrokarby lových, monoazahydrokarby1ových a diazahydrokarbylových arylová skupina je skôr uvedená má substitút vybraný zo skupiny ťri f 1uormety1ových. nítrokruhov a substituovaná arylová skupina. ktorá pozostávajúcej z halo-.

Ci-Cia alkylových, Ci-Cie a 1koxy1ových, amino-, mono C1-C18 a 1ky1 am ínových. d i C1-C18 a 1ky1am ínových, benzy1 am ínových.

10024

Ci-Cia alkylbenzylamínových. Ci-Cte tioalkylových a Ci-Cie alkylkarboxamidových skupín, alebo

R¹Y le a 1lylkarbonyl alebo chlóracetyl:

R² Je vybraný zo skupiny pozostávalúčel z vodíka. C1-C18 priameho reťazca. vetveného reťazca alebo cyklického hydrokarbylu. Ci-Ce alkyl Ci-C5 alkylén Ω-karboxylátu. Q-tri(Ci-C-4 alkyl/fenyl) silyl C2-C4 alkylénu. raonosacharidu a dlsacharidu:

alebo OR² spolu tvorí Ci-Cie priamy reťazec, vetvený reťazec alebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

R³ le vodík alebo Ci-Có acyl;

R⁴ le vodík. Ci-Ce alkyl alebo benzyl:

R⁵ le vybraný zo skupiny pozostávaiúcel z vodíka, benzylu. metoxybenzylu. diraetoxybenzylu a Ci-Cô acylu;

R⁷ le metyl (CH3) alebo hydroxymetyl (CH2OH): a

X le vybraný zo skupiny pozostávajúce! z Ci-Cň acyloxy, C2-C6 hydroxyacyloxy. hydroxy. halo a azido.

Y le s výhodou karbonyl [CC011.

Pre jednu skupinu Inhibítorov le R² výhodne výhodnejšie Ci-Cis alkylglykozid nechránená fuko- skupina, než a 1ly1karbony1 alebo je metyl. Z le R¹Y le iné raonosacharid a monosacharidu. R⁷ X le hydroxy1 chlóracetyl. Intermediát inhibítora môže mat ktorúkoľvek z vysvetlených R skupín, s R³. R⁴ a R⁵ s výhodou inými než uodík.

Obzvlášť výhodný lnhibítor zodpovedá všeobecnému vzorcu

10024 kde R¹ je ako predtým a R¹Y je iné než al lylkarbony1 alebo chlóracetyl. X je ako vyššie a s výhodou iné než Ci-Ce hydroxyacyloxy a Ci-Ce hydroxyacyloxy. a R² a R⁷ sú ako predtým. V jednom vyhotovení je R² s výhodou iné než mono- a disacharid. Benzylová R² skupina je tu obzvlášt výhodná.

Iná skupina obzvlášt všeobecnému vzorcu výhodných inhibítorov zodpovedá

kde R¹ je ako predtým až na to. že sú vylúčené a 11y 1karbony1ové alebo ch 1óracety1ové R¹Y vyššie či s výhodou hydroxyacy1oxy, R⁷ je d i sacharid.

Uvažuje sa tiež iné než Ci-Cď ako predtým a skupiny, X je ako acyloxy a Ci-Ce R² je mono- alebo farmaceutický prostriedok. Tento farmaceutický prostriedok obsahuje farmaceutický prijateľné v sebe rozpustené alebo dispergované zried'ovadlo alebo nosič, bunkovú adhéziu inhibuíúce množstvo zlúčeniny podľa všeobecného vzorca

10024 kde Y je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z CCO), S0₂ . HNCCO), OCXO). SC(O);

R¹ je ako je definované predtým, a výhodne je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z arylovej, substituovanej arylovej a fenyl C1-C3 alkylénovej skupiny, kde arylová je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z furylu, fenylu, naftylu, pyridylu, pyrazinylu, benzoskupina tieny1u, furánylu, izobenzofuránylu, pyrimidinylu, pyradizanylu, benzo [b alebo c] tienylu, chinolinylu, izochinolinylu, chinoxalinylu, naftyridinylu, ftalazinylu a chinazolinylu, a substituovaná arylová skupina je predtým spomínaná arylová skupina, ktorá má substitút vybraný zo skupiny pozostávajúcej z halo-, trifluórmetylových, nitro-, Ci-Cie alkylových, Ci-Cie alkoxylových, amino-, mono-Ci-Cie a1kylamínových, di-Ci-Cis alkylamínových, benzylamínových a Ci-Cis alkylbenzylamínových skupín;

R² je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, Ci-Cia priameho reťazca, vetveného reťazca alebo cyklického hydrokarbylu, Ci-Ce alkyl C1-C5 alkylén Ω-karboxylátu, Ω-triCCi-C^ alkyl/fenyl) silyl C2-C4 alkylénu, monosacharidu a disacharidu alebo OR² spolu tvorí Ci-Cis priamy reťazec, vetvený reťazec alebo cyklický hydrokarby1 karbamát;

R⁷ je metyl (Cite) alebo hydroxymetyl <CH20H); a

X je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Ci-Ce acyloxy, C2-C6 hydroxyacyloxy, hydroxy, halo a azido.

Uvedené výhody pre inhibítor sa zachovávajú pre farmaceutický prostriedok.

Ďalej sa uvažuje postup prípravy laktózamóniovej soli. Tento postup zahŕňa tieto kroky a) zmiešanie laktulózy a primárneho amínu, ktorý je monosubstituovaným derivátom amónia, ktorého dusíkový atóm je viazaný na reduktívne odstrániteľní! chrániacu skupinu ako je benzylamín, za vytvorenia reakčnej zmesi. Primárny amín slúži ako reaktant. aj ako primárne rozpúšťadlo a je prítomný v množstve 2- až 10-krát vyššom ako je molárne množstvo

10024 laktulózy. s výhodou v 4- až 8- násobnom molárnom prebytku.

b) Reakčná zmes sa udržiava pri teplote 10°C až 60°C, výhodne pri laboratórnej teplote až 50°C. počas dostatočnej doby na vytvorenie príslušného laktulózo N-glykozidu. Táto doba udržiavania môže byt od dvoch do siedmich dní. pri ktorých sú dosahované maximálne výtažky.

c) Vytvorený laktulózo N-glykozid sa nechá reagovať s až ekvivalentným množstvom karboxylovej kyseliny, ktorá má pKa hodnotu 2,5 až 5,0 v rozpúšťadle Ci-C3 alkoholu, ako je metanol, pri teplote 10°C. až 30°C k prešmyku laktulózo N-glykozidu na na anino-blokovanú laktózamóniovú soľ. ktorá má reduktívne odstrániteľnú chrániacu skupinu viazanú na amín. Laktulózo N-glykozid môže byt prítomný v 0,1 M až nasýtenej hladine: a

d) Chrániaca skupina je potom zo spomenutej amino-blokovanej laktózamóniovej soli reduktívne odstránená napr. hydrogenolýzou za tvorby laktózamóniovej soli. Táto soľ je s výhodou izolovaná.

Názvoslovie použité na opis oligosacharidových zvyškov predkladaného vynálezu sleduje konvenčné názvoslovie. Pre jednotlivé monosacharidy sa používajú štandardné skratky, napr. GlcNAc pre 2-N-acetylglukozamín a GalNAc pre 2-N-acetylgalaktozamín: fukóza je Fuc, fruktóza je Fru, galaktóza je Gal, glukóza je Glc, a mannóza je Man. Pokiaľ nie je vyznačené inak, všetky cukry okrem fukózy CL-izomér) sú D-izoméry v cyklickej konfigurácii (napr. pyranózy alebo furanózy). Dva anoméry cyklických foriem sú označované a a β.

Monosacharidy sa všeobecne spájajú glykozidickými väzbami za tvorby oligo- a polysacharidov. Orientácia väzby vzhľadom na rovinu kruhu je vyznačená ako a a <3. Označené sú tiež konkrétne uhlíkové atómy, ktoré tvoria väzbu medzi dvoma monosacharidmi. Takto je β glykozidická väzba medzi C-l galaktózou a C-4 glukózou označená Ga^l->4Glc. Pre D-cukry (napr. D-GlcNAc, D-Gal, D-NeuÄc a D-Man) označenie a znamená, že hydroxyl naviazaný na C-l (na C-2 v NeuAc) je

10024 pod rovinou kruhu a β, že je nad kruhom. V prípade L-fukózy označenie a. znamená, že hydroxyl je nad kruhom a β, že je pod ním.

Podrobný opis vynálezu

A.Zlúčeniny

Predkladaný vynález uvažuje zlúčeninu analogickú SLe* podľa všeobecného vzorca A. pričom všeobecný vzorec pokrýva pentasacharidovú zlúčeninu podľa všeobecného vzorca I. ktorá je analógom sialyl Le*. ako aj jej penta- a tetrasacharidové prekurzory podľa všeobecných vzorcov II resp. III. Zlúčenina podľa všeobecného vzorca I inhibuje bunkovú adhéziu sprostredkovanú bunkovým povrchovým selektínovým receptorom.

R'O

10024

Z je vodík <H) alebo Ci-Ce acyl, pričom v jeho prípade je definovaná zlúčenina podľa všeobecného vzorca III. alebo α-L-fukozy1. ktorého hydroxylové skupiny sú voľné alebo blokované chrániacou skupinou Cbenzyl alebo Ci-Cď acyl). čím je definovaná zlúčenina podľa všeobecného vzorca I alebo II. v závislosti na identite R³. R⁴ a R⁵ (R^3-5) skupín;

Y je vybraný zo skupiny HNCCO). OCCO) a SCCO):

R¹ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z CCO). SO2.

substituovanej ary loveJ kde arylová skupina pozostávajúcej z ary lovej. a fenyl Ci-C3 alkylénovej skupiny, má jeden pat- alebo šesťčlenný aromatický kruh. fúzované pät/šestčlenné aromatické kruhy alebo dva fúzované šesťčlenné aromatické kruhy, ktorých kruhy sú vybrané zo skupiny z hydrokarbylových. raonooxahydrokarby1ových.

pozostáva júcej monot iahydrokarbylových. monoazahydrokarby1ových a diazahydrokarby1ových kruhov a substituovaná arylová skupina. ktorá pozostávajúcej z halo-.

arylová skupina je skôr uvedená má substitút vybraný zo skupiny tri f 1uórmetylových. nitroCi -Cl 8 alkylových. C1-C18 a 1koxy1ových. amino-. mono Ci-Cie a 1ky1 am ínových. d i Ci-Cia a 1 ky 1 am ínových. benzy1 am ínových. C1-C10 a 1 ky 1 berizy 1 am í nových . C1-C10 t i oa 1 ky I ových a C1-C18 a 1ky1karboxamidových skupín, alebo

R¹Y je a 11 y 1karbony1 alebo chlóracetyl;

je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka.

vetveného reťazca alebo cyklického hydrokarby1 u. Ci-Ce alkyl Ci-C5 alkylén Ω-karboxylátu. Q-t.riCCi-C^ alkyl/íenyl) silyl C2-C4 alkylénu. monosacharidu a disacharidu;

alebo OR² dohromady tvorí C1-C18 priamy reťazec.

R²

Ci-Cie priameho reťazca,

10024 vetvený reťazec alebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

R³ je vodík alebo Ci-Ce acyl;

R⁴ je vodík, C1-C6 alkyl alebo benzyl;

R⁵ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, benzylu, metoxybenzylu, dimetoxybenzylu a Ci-Cď acylu;

R⁷ je metyl (CH3) alebo hydroxymety1 (CH2OH); a X je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Ci-C6 acyloxy,

C2-C6 hydroxyacyloxy, hydroxy, halo a azido.

tvorí amid s Keď Y je SO2.

dusíkovým atómom amínu R¹Y vytvára skupinu

R¹ . je

Ako už bolo uvedené, Y môže byt jedna z mnohých skupín. Keď Y je C(0), R¹Y je skupina acylového substitútu, takže sa dusíkovým atómom amínovej skupiny sacharidu. R¹Y vytvára skupinu sulfonylového substitútu, takže sa tvorí sulfónamid s sacharidu. Keď Y je HNC(O) aminokarbonylového substitútu, takže sa tvorí močovinový substitút s dusíkovým atómom sacharidu. Uretánový substitút. sa tvorí s dusíkom amínu sacharidu, keď Y je oxykarbonyl, OCCO), zatiaľ čo tiouretán sa tvorí, keď Y je tiokarbonyl, SC(O). Skupina Y je výhodne karbonylová skupina [C(0)lR¹^ skupina môže byť tiež allylkarbonylová alebo chlóracetylová skupina. A1lylkarbonylová skupina R¹Y je obzvlášť výhodná pre zlúčeninu podľa všeobecného vzorca III, pretože poskytuje ľahko zameniteľnú skupinu Allylkarbonylová alebo chlóracetylová skupina R¹Y prítomná v zlúčenine podľa všeobecného vzorca III, a nie je prítomná v zlúčenine žiadneho zo všeobecných vzorcov I, II, A, B alebo C (všeobecné vzorce B a C sú ukázané neskôr).

Ako je poznamenané vyššie, skupina R¹ môže byt arylová alebo substituovaná arylová skupina. Uvažované arylové skupiny sú tie, ktoré obsahujú jeden pät- alebo šesťčlenný aromatický kruh, fúzované pät- a šesť- (pät/šesť-) Členné kruhy alebo dva fúzované šesťčlenné aromatické kruhy a zahŕňajú hydrokarbylové skupiny ako je fenyl a naftyl, ako aj hydrokarbylove skupiny, obsahujúce kyslík alebo síru, alebo jeden alebo dva dusíkové atómy, ktoré nahrádzajú

10024 uhlíkové atómy kruhu Príklady arylových skupín pyridylu, pyrazinylu, (mono- alebo diazahydrokarby1).

zahŕňajú skupiny furylu, tienylu, benzofuránylu CbenzoEb]furylu), izobenzofurány1u (benzoEclfurylu), benzotienylu CbenzoEblt, i eny 1 u ) , i zobenzot i eny 1 u pyridazinylu, chinolinylu naftyridinylu, ftalazinylu (benzoE c]tienylu), pyrimidínylu, izochinolinylu, chinoxalinylu,

Každá z týchto alebo každá môže a chinazolinylu.

arylových skupín môže byt nesubstituovaná mat substitút vybraný zo skupiny pozostávajúcej z halo-, trif luórmetylových, nit.ro-, Ci-Cis alkylových, Ci-Cis alkoxylových, amino-, mono-Ci-Ci8 alkylamínových, di-Ci-Cis alkylamínových, Ci-Cis alkylbenzylamínových a Ci-Cie alkylkarboxamidových skupín.

Hore uvedené nesubstituované a substituované arylové R¹ skupiny sú dobre známe v odbore a každá môže byt viazaná na dusíkový atóm sacharidu pri použití dobre známej chémie. Nasledujúci rozbor sa preto sústreďuje na arylové hydrokarbylové skupiny, fenyl a naftyl, ktoré sú typické pre skupinu, pri predpoklade, že iné arylové a substituované arylové R¹ skupiny zo zoznamu sa môžu využívať s chémiou v podstate podobnou.

Keď R¹ je fenyl, môžu sa používať benzylchlorid alebo anhydrid kyseliny benzoovej na tvorbu výhodnej amidovej väzby. Benzylsulfonylhalid, ako je benzylsulfonylchlorid, sa môže používať podobne, keď Y je SO2- Peny1izokyanid sa použije, keď Y je HNC(O). FényIchlórmravenčan sa použije, keď Y je OCCO), zatiaľčo fény1tiomravenčan sa použije, keď Y je SC(0).

Konkrétne uvažované substituované fenylové R¹ skupiny zahŕňajú tie, pri ktorých môže byt subst-itút zavedený do ktorejkoľvek pozície kruhu, pričom výhodné sú metá a para pozície. Monosubstituované fenylové R¹ skupiny sú výhodnejšie ako disubstit-uované skupiny.

Uvažované halo substitúty zahŕňajú skupiny fluóru, chlóru, brómu a jódu, kde sú typické p-chlórfeny1, m-chlórfenyl, m-jódfenyl, p-brómfenyl a o-fluórfenyl.

10024 hexyl, oktyl a oktadecyl.

Di-halosubstituované fenylové R¹ skupiny sú tiež uvažované, ako 3,4-dichlórfenyl, 3,5-dichlórfeny1, 2-chlór-4fluórfenyl a 3-bróm-4-fluórfenyl.

Typické Ci-Cie alkylové skupiny prítomné ako substitútové skupiny na fenyle R¹ skupiny zahŕňajú alkylové skupiny s priamym alebo vetveným reťazcom, ako sú metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, t-butyl, pentyl, nonyl, decyl, dodecyl, teradecyl, hexadecyl Výhodné sú C1-C12 alkylové skupiny, pričom obzvlášť výhodné sú C1-C6 alkylové skupiny a najvýhodnejší je metyl. Typicky zahŕňajú výhodné R¹ skupiny 0-, ma p-tolylové (mety1fénylové) a p-t-butylfenylové skupiny ako aj 3,4-dimetylfenylové a 3,5-dimetylfenylové skupiny.

Typické Ci-Cie alkoxylové skupiny sú étery obsahujúce Ci-Cis alkylovú skupinu alebo obzvlášť výhodnú Ci-Cď alkylovú skupinu. Tu je výhodná métoxy skupina. Typicky zahŕňajú výhodné R¹ skupiny 0-, m- a p-anizyl (metoxyfeny1) ako aj 3,4-dimetoxyfeny1 a 3,5-dimetoxyfeny1Nitrofenylová R¹ skupina sa ľahko pripraví acyláciou pri použití 3- alebo 4-nitrobenzoylchloridu. Acylácia 3,4alebo 3,5-dinitrobenzoylchloridom poskytuje zodpovedajúce 3,4- alebo 3,5-dinitrofenylové R¹ skupiny. Tvorba amidov použitím 3- alebo 4-trifluórmety1benzoy1chloridu podobne poskytuje 3- alebo 4-trifluórmety1fenylové R¹ skupiny.

Substituovaná fenylová R¹ skupina môže amino, mono-Ci-Cie alkylamínové, di-Ci-Cis benzylamínové, Ci-Cis alky1benzylamínové tiež obsahovať a1ky1am í nové, a C1-C18 a1ky1karboxam i dové substitúty sú také Am i nof eny1ové zodpovedá júcich substitúty, pričom C1-C18 alkylové ako sa uvádza skôr.

R¹ skupiny sa najľahšie pripravia zo nitrofenylových R¹ skupín katalytickou redukciou nitroskupiny po vytvorení amidickej väzby, ako sa uvádza skôr. Takto sa napríklad po použití 3- alebo 4-nitrobenzoylchloridu pri tvorbe amidickej väzby vytvára redukciou s paládiom na uhlí zodpovedajúca 3- alebo 4-aminofenylová R¹ skupina. Podobné použitie 3,4- alebo

10024

3,5-dinitrobenzoylchloridu poskytuje po redukcii zodpovedajúcu 3,4- alebo 3,5-diaminofenylovú R¹ skupinu.

Niektoré di-Ci-Ľ6 alkylaminobenzoové kyseliny, ako je 4-dietylaminobenzoová kyselina a 3-a 4-dimetylaminobenzoová kyselina, sa dajú získať z komerčných zdrojov a použiť na vytvorenie patričných benzoylhalidov alebo anhydridov pre syntézu R¹-obsahujúceho amidu. Ostatné di-Ci-Cie alkylaminobenzoové kyseliny a tie zlúčeniny, ktoré majú dve dialkylamínové skupiny, môžu byť pripravené použitím dobre známych alkylačných techník zo zodpovedajúcich aminobenzoových kyselín alebo diaminobezoových kyselín, ktoré sú tiež komerčne dostupné.

Mono-Ci-Cis alkylaminofenylovú R¹ skupinu možno pripraviť zo zodpovedajúceho mono-Ci-Cis alkylaminobenzoylhalidu, ktorého zostávajúca dusíková valencia je blokovaná ľahko odstrániteľnou chrániacou skupinou, ako je t-Boc, ktorý môže byť odstránený kyselinou alebo benzylová skupina, ktorá môže byť odstránená, ak je to žiadúce, hydrogenáciou použitím paládia na uhlí. flcylácia teda môže prebehnúť použitím N-benzyl-N-propylaminobenzoylchloridu a odstránením N-benzylovej skupiny katalytickou hydrogenáciou, a môže poskytnúť mono-Ci-Cie alkylaminofenylovú R¹ skupinu. Benzylová skupina samozrejme nemusí byť odstráňovaná a takto sa získa Ci-Cis alkylbenzylamínová skupina.

Každý z uvedených fenylových alebo substituovaných fénylových substitútov vyššie môže byť vytvorený dobre známymi reakciami vytvárajúcimi amid. Pri typickej reakcii reaguje príslušný benzoylhalid alebo anhydrid kyseliny benzoovej, ako je p-fluórbenzoy1, chlorid alebo anhydrid kyseliny p-fluórbenzoovej, s nechránenou aminoskupinou inak chráneného sacharidu, ako bude podrobne vysvetlené neskôr.

Uvažované sú ako 1- tak aj 2-naftylové R¹ skupiny s tým, že obzvlášť výhodná je 2-naftylová skupina. Tieto zlúčeniny možno t. iež, ako bolo uvedené, pripravovať štandardnou technológiou vytvárania amidu, ako je reakcia

2-naftoylchloridu s amínom príslušného cukru.

10024 využívať benzénsulfony18-chino1ínsulfony1chlorid, a podobne na tvorbu zodpovedájúci deriváty môžu reagovať chlórt-ioFenyl C1-C3 skupina, ktorá

Rozumie sa. že podobné substitúty sú prítomné na oxa-. aza- a diazahydrokarbylových arylových skupinách. Napríklad na uskutočnenie acylačnej reakcie možno využiť ktorýkoľvek z chloridov dvoch kyselín furoylových, z dvoch tiofénkarborboxylových chloridov, troch pyridínkarboxylových chloridov, chloridu kyseliny chinaldovej, chloridu kyseliny

3-chinolínkarboxylovej, 2-chinoxaloylchloridu a podobne.

Podobne, keď R¹ je SO2. sa použije zodpovedajúci sulfonylhalid. Napríklad možno chlorid, toluénsulfony1chlórid, i- alebo 2-naftalénsulfonylchlorid sulfonamidu.

Keď Y je HNCCO), vhodným reaktantom je izotiokyanát opísanej karboxylovej kyseline. Takéto byt ľahko pripravené z halidu kyseliny reakciou s azidom za tvorby acylazidu, ktorý podlieha pri zahriatí Curtiovmu prešmyku na izokyanát.

Keď Y je OC(O) alebo SCCO), hydroxy- alebo merkaptosubstituovaná arylová R¹ skupina sa nechá s fosgénom za vzniku chlórmravenčanu alebo mravenčanu, ktorý môže reagovať s amínom sacharidu za tvorby uretánovej alebo tiouretánovej väzby na R¹.

alkylénová R¹ skupina je C1-C3 alkylénová je samčí substituovaná fenylovou skupinou, s výhodou na koncovom uhlíku hydrokarbylovej skupiny. Táto R¹CCOj skupina takto obsahuje fenolový kruh viazaný na reťazec s 2-4 uhlíkovými atómami. Typické CCOjR¹ alkylénové skupiny zahŕňajú 2-fenylacetoy1,

3-fenylpropiony1 a 4-fenylbutanoy1 [ 0CH2 C C 0 ) , grCífeCffeCCO) či 0 CCH2 >3 C<0), kde 0 = fenyl]- Tieto zlúčeniny môžu byt pripravené reakciou halidu alebo anhydridu príslušnej kyseliny s amínom cukru ako bolo uvedené. Pre tvorbu nasýtenej alkylénovéj skupiny z nenasýteného hydrokarbylového ratazca sa môže využiť katalytická redukcia použitím vodíka a katalyzátora paládia na uhlí; výhodné sú nasýtené hydrokarby1ové reťazce.

10024

R² skupina vytvára β-glykozid s kruhovým systémom sacharidu. Táto glykozidická väzba sa môže vytvoriť s jednoduchým Ci-Cie hydrokarbylovým alkoholom, esterom -hydrokarboxylovej kyseliny, s -hydroxylovanou sialylovanou alkylovou skupinou alebo s mono- a disacharidom alebo OR² dohromady tvorí Ci-Cie priamy reťazec, vetvený reťazec alebo cyklický hydrokarby1 karbamát. Ci-C6 hydrokarby1ová skupina, ako sú etylová alebo benzylová skupina alebo monosacharid, ako je 3-galaktozy1, sú obzvlášť výhodné. R² môže byť aj vodík.

Typické R² skupiny vytvárané z jednoduchej prekurzorovej alkoholovej skupiny zahŕňajú Ci-Cie priamy reťazec, vetvený reťazec alebo skupinu cyklického hydrokarby1 karbamátu. Ilustratívnymi skupinami sú tu predtým opísané Ci-Cď alkylové skupiny, ktoré sú výhodné, ako aj ich nenasýtené proťajšky, ako je allyl-3-butenyl,

2-but-3-enyl a but-3-ynyl, ako aj ďalšie hydrokarbylové skupiny, ako je benzyl, 4-metylcyklohexyl, dekahydronafty1, nonyl, decyl (kapryl), dodecyl (lauryl), dodec-7-eny1, myristyl, palmityl, stearyl, oleyl, linoleyl, linolenyl a ricinoley1.

Ci-Cie hydrokarby1 karbamát sa pripraví reakciou izokyanátu zodpovedajúceho spomenutej Ci-Cis hydrokarbylovej skupine s hydroxylovou skupinou redukujúceho konce cukru.

1- hydroxylová skupina koncovej glukozylovej jednotky môže napríklad reagovať s ety1izokyanátom za tvorby zodpovedajúceho etylkarbamátu (uretánu). Karbonylová skupina karbamátu sa nezapočítava do počtu uhlíkových atómov hydrokarby1u.

Ci-Ce alkyl C1-C5 alkylén Ω-karboxylátová R² skupina je Ci-Ce alkylester C2-C6 Ω-karboxylovej kyseliny. Takéto estery sa pripravujú z prekurzorových estérov Ω-hydroxykarboxylovej kyseliny, ktorých hydroxylové skupiny sa použijú na vytvorenie glykozidickej väzby. Typické Ω-hydroxykarboxylátové estery zahŕňajú

2- hydroxyacetát, etyl 3-hydroxypropionát, mety 1 t-buty1

3-hydroxyprop i onát,

10024

C3/4Glc) skupina je (3/4GlcNac) .

a 6-N-acety1ga1aktozy1 Monosacharid inôže sára skupinou R⁶

4-hydroxybutyrát. hexyl 5-hydroxypentaonát a metyl

6-hydroxyhexaonát. Hydroxylové a karboxylové sú teda na koncoch retazca a sú oddelené 1-5 metylénovýrai skupinami Výhodný je metyl 6-hydroxyhexaonát.

0-triCCi-C4 alkyl/fenyl) silyl C2-C4 alkylénová R² skupina sa vytvára s príslušného prekurzorového alkoholu, ktorého substituovaná silylová skupina je na druhom konci retazca. ako je hydroxylová skupina (v Ω-pozícii). Ako je dobre známe v odbore, substituované silylové skupiny môžu zahrnút mnohé kombinácie Ci-C4 alkylových a fenylových skupín, ako je tri-Ci-Cô alkyl. di-Ci-C4 alkylfenyl. Ci-Ca alkyldifenyl a tri fenyl. Typické substituované silylové skupiny zahŕňajú trimetylsilyl. trifenylsilyl. di-t-butylmetylsilyl. dimetylfenylsilyl. t-buty 1 f eny .1 s i ly 1 a podobne.

Typické mono- a disacharidy zahŕňajú 3- a 4-glukozyl

3- a 4-galaktozyl <3/4Gal). kde 3-ga1aktozy1ová obzvlášt výhodná. 3- a 4-N-acety1glukozy1

4- a 6-mannozyl (2/3/4/6Man) . 3(3/6GalNAc) a Galpl->4GlcNAc. vytvárat glykozídickú väzbu so ktorá zahŕňa všetko okrem sacharidu skupiny R². Takto R⁶ je R² iná než mono- a disacharid.

Všeobecný štruktúrny vzorec obzvlášt výhodnej zlúčeniny podľa všeobecného vzorca A. ktorý má redukčnú koncovú skupinu 3GalpOR⁶, je ukázaná nižšie? vo všeobecnom štruktúrnom vzorci B. kde X. Y. Z. R^{1 4}. R⁶ sú predtým definované.

2-, 3-,

R⁷ sú tie, ako

10024

Obzvlášť výhodná zlúčenina podľa B je inhibítorora bunkovej adhézie a všeobecného vzorca C. nižšie, kde X. Y. predtým uvedené.

všeobecného vzorca má štruktúru podľa R¹ . R⁶ a R⁷ sú ako

všeobecného vzorca II. zahŕňajú formy 1. acetyl.

β-glykozidická väzba tvorená skupinou R² alebo R⁶ môže byt vytvorená dobre známymi organickochemickými rekciami, a to sacharidov a iných prekurzorov R² (R⁶) skupiny, ako reakcií 1-halo sacharidu s hydroxylom prekurzorového alkoholu žladúcej R² (R⁶) skupiny za prítomnosti uhličitanu strieborného (AgzCCte) alebo triflátu striebra. ako aj enzyraatickými prostriedkami, ako s glykozy1transferázou pre sacharidy.

Uvažovaná R³ skupina môže byt vodík alebo C1-C6 acyl. ktorý je častou esteru Ci-Ce acy1karboxylovej kyseliny. Ci-C₆ acylová skupina je výhodná pre zlúčeninu podľa Typické Ci-Ce acylové skupiny propionyl. butanoyl. izobutanoyl.

pent.anoyl a hexanoyl. Výhodná je acetylová skupina. Acylácia sacharidovej hydroxylovel skupiny je dobre známa a môže sa vykonávať. použitím halidu alebo anhydridu príslušnej kyseliny.

Uvažovaná R⁴ skupina pre všeobecný vzorec A môže byt vodík alebo Ci-Ce alkyl. ako sa uvádza predtým pre takéto alkylové skupiny, alebo benzy 1 ová skupina. R⁴ skupina spolu s na ňu viazaným kyslíkovým atómom tvorí alkoholoví! čast esteru. Výhodná je metyl ová skupina. R⁴ est.er možno vytvoriť štandardnými prostriedkami pred adíciou skupiny kyseliny

10024 sialovej, po tvorbe sialylovaného sacharidu pri použití činidla ako je diazometán alebo reakciou laktónu s príslušným alkoholom, ako sa uvádza v súvislosti so schémou 2 neskôr.

R⁴ skupina pre zlúčeninu podľa všeobecného vzorca III môže byť. buď protón, Ci -C6 alkyl alebo benzylová skupina. Ak je R⁴ skupina prítomná ako protón, potom sa rozumie, že tento protón môže byť nahradený farmaceutický prijateľným katiónom (M), ako je amónium, sodík, draslík, vápnik, horčík a podobne. R⁴ protón alebo iný katión sa tu v štruktúrach, ako je všeobecný vzorec I a C, typicky nevyznačuje, pretože sialy1 karboxylová skupina je obyčajne ionizovaná pri fyziologických hodnotách pH okolo 7,2 - 7,4, pri ktorých sa inhibítor podľa všeobecného vzorca I alebo C používa. Takto je tu často sialy1 karboxylová skupina tu vyznačená ako karboxylát.

R⁵ skupina je vodík, benzyl, metoxybenzyl (výhodný je

3- alebo 4-metoxybenzy1), dimetoxybenzy1, ako je 3,4- alebo 3.5-dimetoxybenzy1 alebo Ci-C6 acylová skupina, ako je uvedené skôr. Benzylová skupina sa obyčajne používa, keď sa organickochemickou syntézou pridáva fukozylová skupina.

R³, R⁴ a R⁵ skupiny iné než vodík sú chrániace skupiny, používané v priebehu syntézy medziproduktov ako sú zlúčeniny podľa uvedených všeobecných vzorcov B, II a III. Keď R³ = R⁴ = R⁵ = H (vodík), zlúčenina podľa všeobecného vzorca II sa stáva zlúčeninou podľa všeobecného vzorca I, zatiaľčo zlúčenina podľa všeobecného vzorca B sa stáva zlúčeninou podľa všeobecného vzorca C, keď Z je fuko. Podobne, keď Z je fuko a R³ = R⁴ = R⁵ = vodík, zlúčenina podľa všeobecného vzorca A sa stáva zlúčeninou podľa všeobecného vzorca I.

Substitútová skupina X môže byť C1-C6 acyloxylová skupina, t.j. Ci-Ce acylester prekurzorovej hydroxylovej skupiny v tejto pozícii, C2-C6 hydroxyacy1oxylová skupina, hydroxylová skupina a halo skupina, ako bolo uvedené, alebo azido skupina. Typické C1-C6 acylové skupiny už boli uvádzané a Ci-Ce acyloxylová skupina je Ci-Có acylová

10024 skupina, ktorá navyše obsahuje ďalší kyslíkový atóra viazaný na uhlíkový atóm karbonylu acylovej skupiny. C2-C6 hydroxy1acy1oxy1ová skupina je predtým rozoberaná Ci-Cô acyloxylová skupina. ktorá navyše obsahuje hydroxylovu substitútovú skupinu- Typické C2-C6 hydroxy1acy1oxylové skupiny zahŕňajú hydroxyacetát. laktát. 3-hydroxybutyrát. 2-hydroxyizovalerát a 2-hydroxykaproát. Substitút X je zvyčajne iný než Ci-Ce acyloxy alebo C2-C6 hydroxyacyloxy, pokiaľ sa sialylácia a fukozylácia neuskutočňujú enzymaticky. ako sa uvádza neskôr.

Syntézy derivátov sialovej kyseliny obsahujúcich sú zverejnené v publikovanej medzinárodnej 92/16640, ktorá bola publikovaná 1.októbra

1992. Použitie týchto zlúčenín sialylácie sacharidov je tiež uverejnené v tejto publikácii.

R⁷ skupina je metyl alebo hydroxymetyl, takže spolu so znázornenou karbonylovou skupinou [CCOj] tvoria R⁷ N-acetylovú alebo N-hydroxyacetylovú skupinu. Deriváty kyseliny sialovej obsahujúce ktorúkoľvek R⁷ skupinu môžu byt použité pri enzymatickej sialylácii. ako je tu opísané.

lnhibítorové substitút X prihláške VO

Obzvlášť výhodné zlúčeniny podľa všeobecných štruktúrnych vzorcov la C sú zobrazené ďalej spolu s číslom zlúčeniny, - 51.

t.j. zlúčeniny 17. 30 - 38 a 43

10024

10024 κο

HO

’OOC

MO OH I

MO

MO OM i

AcKH—•'I ' OOC

B. Syntéza z 1účen í n syntézy. môžu sa organickej chémie.

byt pripravená byt enzymatické používajúce len techniky sa môžu kombinácie ako

Opísaná zlúčenina analogická SL.e^x môže mnohými spôsobmi. Uskutočňované teda môžu použi t syntézy a využívať organických, tak aj enzymatických syntéz, ako sa tu uvádza na príkladoch.

Jedným spôsobom odlíšenia medzi organickými či enzymat i ckým i syntézami je prítomnosť jedného alebo viacerých enzýmov v reakčnom prostredí založenom na vode (enzyrnatická syntéza) oproti neprítomností akéhokoľvek enzýmu v spojitosti s reakčným prostredím. ktoré je v podstate bezvodé a používa organické rozpúšťadlá, ako je acetón i tri 1, metanol. etanol. dimetylformamid (DMF).

benzén. acetón, d tch 1órmetán.

d imetylsu1 foxid (DMSO) tetrahydrofurán (THF). a podobne (organická syntéza).

Bez ohľadu na to sacharidy zahŕňajúce laktozamín musia byt v určitom bode syntézy ktorá z týchto metód sa použije.

galaktózu a glukozamín. spojené dohromady. Trochu

10024 prekvapivo je väzba Gal<3l->4GlcN laktozamínu tiež jednou z tých. ktoré je obtiažne vytvoriť v syntéze uvažovaných zlúčenín.

Laktózamín je zlúčeninou uvádzanou v literatúre, ale nie je ľahko dostupný. Laktozamín alebo deriváty laktozamínu pritom ale poskytujú dobrý východzí materiál pre syntézu uvažovaných zlúčenín.

Aj keď laktozamín nie je ľahko dostupný. laktulóza. ketóza. ktorá nemá žiadnu aminoskupinu. ale obsahuje Gal0l->4Fru väzbu, ktorá je príbuzná laktóze a laktozamínu. je komerčne dostupná. Laktulóza, so svojou už vytvorenou Gal<3l->4Fru väzbou, poskytuje východzí materiál pre jednu uvažovanú syntézu laktozamínu. Syntéza laktozamínu (zlúčeniny 3) ako adičnej soli kyseliny je vysvetlená všeobecne a konkrétne v schéme 1 resp. IA. kde sú aj syntézy peracetyl N-fta 1 i m ido 1aktozamínu (zlúčenina 5) a peracetyl N-ftalÍra ido laktózam ín β chloridu (zlúčenina 6). Číslované zlúčeniny oboch schém sú totožné zlúčeniny.

ľl

r^Hj

MeOH

OAc

H₂ Pd/C

OAc

AcO OAc nr^br^b aici₃

AcO

Ac

OAc

AcO ''OAc

CH₂CH₂ ° o NR⁸R^a

10024

Schéma X A

BnNH₂

HO ΌΗ OH

Laktulosa

OAc

MeOH

H₂ Pd/C

1) PhthO (4).

2) (Ac)₂O

Laktulóza teda reaguje čisto s primárnym amínom. ktorý je amóniovým derivátom, ktorého dusíkový atóm ie viazaný na reduktívne odstrániteľnú blokovaciu skupinu, benzy1 am ínom. ako s reaktantom i rozpúšťadlom. za tvorby zodpovedajúceho N-glykozidu. laktulózo N-benzyl glykozidu (Bn = benzyl: zlúčenina 1). Reakcia zlúčeniny 1 s približne s tech iomet.r i ckým množstvom organickej karboxylovej kyseliny, ktorá má hodnotu pKa asi 2.5 až 5.0 (ľadová kyselina octová), v metanole poskytla N-benzyl 1aktózamóni um acetát (zlúčeninu 2) v 50 - 55 percentnom výťažku. Laktózamóni um acetát (zlúčenina 3) bol pripravený hydrogeno1ýzou uvedeného metanolového roztoku použitím paládia na uhlí (Pd/C).

Poznamenáva sa. že na mieste benzylamínu le možné použ i ť iné reduktívne odstrániteľné blokované amíny.

10024

Napríklad mono- a dimetoxybenzylamíny môžeme vnímať ako reduktívne odstrániteľné blokované deriváty amónia v tom, že po reakcii so a dimetoxybenzylové sacharidom môžu byť aj monoskupiny odstránené hydrogenolýzou.

Podobne možno použiť allylamín, s odstraňovaním a11ylovej blokovacej skupiny pomocou reakcie s polymetylhydrosiloxánom (PMSH) a paládium tetrakistrifenylfosfinom tPd(Ph3)4l v THF ako rozpúšťadle.

Teda: ftj keď sa benzylová skupina (schéma 1Ä) používa v schéme 1 ako R^A, rozumie sa, že ako R^A sa môže použiť monometoxybenzylová, dimetoxybenzylová a allylová skupina.

a ilustrácie v pre prípravu schémach 1 a IA laktozamínu alebo V súlade s týmto postupom, zmesi s primárnym amínom, derivátom amónia, ktorého reduktívne odstrániteľnú

Uvedený rozbor vysvetľujú postup laktózamínovej soli z laktulózy.

1aktu lóža sa zmieša do reakčnej ktorý je monosubstituovaným dusíkový atóm je viazaný na blokovaciu skupinu. Blokovaný derivát amónia slúži v tomto postupe ako reaktant aj ako rozpúšťadlo.

Blokovaný derivát amónia (alebo primárny amín) je prítomný v dva- až asi desaťnásobnom molárnom preby,tku vzhľadom na molárne množstvo použitej laktulózy. Primárny amín je s výhodou prítomný vo Stvor- až osemnásobnom molárnom prebytku.

Ako sa poznamenáva vyššie, uvažujú sa primárne amíny obsahujúce iné reduktívne odstrániteľné blokovacie skupiny. Takto boli allylamín a p-metoxybenzylamín úspešne použité na tvorbu laktulózo N-glykozidu, pri prevedení na zodpovedajúci N-substituovaný laktozamín.

Takto vytvorená reakčná zmes sa udržuje pri teplote 10°C až 60°C počas doby, ktorá je dostatočná na vytvorenie zodpovedajúceho laktulózo N-glukozidu, t.j. na vytvorenie náhrady 2-hydroxylovej skupiny laktózy primárnym amínom. Výhodná je teplota od laboratórnej teploty (asi 20°C) do 50°C.

Doba udržiavania je funkciou niekoľkých premenných, ako

10024 je molárny prebytok primárneho amínu, teploty, požadovaného množstva laktulózo N-glykozidu, a môže kolísať od asi 8 hodín, keď je požadované malé množstvo produktu, až po dva týždne, pri použití nízkej teploty a malého množstva primárneho amínu. Napríklad: Keď sa použil 4 - 7,5 molárny prebytok primárneho amínu (tu benzylamínu), reakcia bola úplná po dobe 7 dní udržiavania pri laboratórnej teplote, ale menej než z 50 % úplná za tú istú dobu, keď sa použil dvojnásobný prebytok benzylamínu. Keď sa teplota udržiavania zvýšila na 50°C, reakcia pri použití štvornásobného nadbytku amínu bola úplná po dvoch dňoch (48 hodinách), zatiaľčo reakčná teplota 70^θε spôsobila rozklad.

Prítomnosť katalyzátora Lewisovskej kyseliny, ako je chlorid zinočnatý, trif1uórmetánsu1f onát zinočnatý, trifluórmetánsulfonát horečnatý, zvyšovala v reakčnej zmesi reakčnú rýchlosť tak, že reakcia používajúca 7,5 násobný prebytok benzylamínu, ktorý bol bez katalyzátora úplný po siedmych dňoch pri izbovej teplote, bol úplný za dva dni dosiahol použitím kyseliny čo je výhodné.

prítomný aj použil ako

Napríklad:

tak aj DMF sa s primárnym amínom, keď je Keď sa metanol žiadnej reakcii ani Keď sa však použil 4-násobným prebytkom bola (48 hodín). Podobný výsledok sa trifluóroctovej ako katalyzátora,

Laktulóza je nerozpustná v alkoholových rozpúšťadlách, vrátane metanolu. Laktulózu možno rozpustiť v horúcom DMF a udržať v roztoku po ochladení. Ako metanol môžu použiť ako spolurozpúšťadlo uvedený katalyzátor, spolurozpúšťadlo, nedošlo k pri laboratórnej teplote, ani pri 50°C. ako katalyzátor chlorid zinočnatý so benzylamínu a s metanolom ako spolurozpúštadlom, reakcia úplná po 48 hodinách pri laboratórnej teplote.

Laktulózo N-glykozid, pripravený, ako bolo uvedené, je hygroskopický a preto sa používa rýchlo po preparácii. Tento nechá reagovať s 0,1 ekvivalentmi až množstvom (pre najlepšie výťažky) karboxyovej kyseliny, ktorá má pKa hodnotu asi 2,5 až 5,0, v C1-C3 alkoholovom rozpúšťadle pri teplote 10°C až 30°C,

N-glykozid sa s ekvivalentným

10024 aby sa laktulózo N-glykozid premenil na laktózamóniovú soľ, ktorej aminoskupiria je blokovaná vyššie spomenutou reduktívne odstrániteľnou blokovacou skupinou, t.j. na amino-blokovanú laktózamóniovú soľ, ktorá má reduktívne odstrániteľnú blokovaciu skupinu viazanú na amínový dusíkový atóm.

môže byt ktorákoľvek ktoré sú dobre známe octová (pKa = 4,76), propiónová CpKí = 4,82), chlóroctová

CpKí = 3,52) a podobne. Výhodná

Použitá karboxylová skupina z veľkého počtu týchto kyselín, v obore, ako je kyselina (pKa = 4,88), maslová (pKa = 2,80) a met.oxyoctová je ľadová kyselina octová. Typické C1-C3 alkoholy zahŕňajú metanol, ktorý je výhodný, etanol, propanol a izopropanol. Výhodná je reakčná teplota rovná laboratórnej teplote.

Koncentrácia laktulózo N-glykozidu môže kolísať od 0,1 M v podstate až po nasýtenie. Typicky používané koncentrácie sú 0,5 až 1,5 M v rozpúšťadle.

Reduktívne odstrániteľná blokovacia skupina je potom odstránená. Hydrogenolýza s použitím paládiového katalyzátoru je výhodný postup tohto odstránenia, najmä keď sa použil benzylamín alebo metoxybenzylamín. PMSH a Pd(Ph3)4 sa používajú, keď primárnym amínom je allylamín.

Uvedená redukcia môže prebiehať v akomkoľvek patričnom rozpúšťadle pre laktulózamóniový derivát. Napríklad: Hydrogenolýzu možno prevádzať v okysličenej vode alebo v C1-C3 alkohole ako vyššie. PMSH a Pd(Ph3)4 sa typicky používajú v THF alebo v podobnom rozpúšťadle.

Takto vytvorená laktózamóniová soľ je všeobecne po izolovaná, aj keď, v závislosti na použitom určenom pre túto zlúčeninu, Tam, kde je požadované izolovať laktózamóniovú soľ, ktorej anión je anionická forma kyseliny použitej pri redukcii, možno túto soľ získavať dobre známymi metódami, ako je chromatografia alebo zrážanie. Voľný laktozamín môže byt pripravený zo soli ionexovou preparac11 rozpúšťadle a na použití izolácia nie je nevyhnutná.

chromatografiou alebo neutralizáciou, po ktorej nasleduje

10024 extrakcia voľnej bázy do patričného organického rozpúšťadla. Metanolový roztok, obsahujúci zlúčeninu 3 hydrogénolytickej reakcie, alebo iný sa potom nechá reagovať s (PhthO) za prítomnosti a pochádzajúci í príslušný roztok kyseliny ftá1 ovej katalyzátora, polokyseliny, polokyseliny, ako je zlúčeniny

Na2CC>3 , za 4. Po vytvorení anhydridom alkalického tvorby N-ftalamid vhodnej amid napr. zlúčeniny 4, bolo úplne odstránené reaktívne rozpúšťadlo, ako je metanol. Hydroxyly disacharidu boli peracylované a peracetylovanej (Ac) ftaliinidový kruh uzavretý za vzniku ftalimidovej zlúčeniny 5 v 10percentnom výťažku vzhľadom na východzí materiál.

Uvažuje sa tiež ďalšia syntéza laktózamóniovej soli z laktulózy. Tu sa aútokláve s ponechá laktulóza reagovať v antikorovom ekvimolárnym množstvom octanu amónneho v kvapalnom čpavku ako rozpúšťadle, pričom sa kvapalný čpavok pridáva do autoklávu vychladeného na -78°C. Výsledná reakčná zmes sa zahreje na teplotu od nula stupňov C do asi 80°C a udržuje sa počas doby 5 hodín až asi 5 dní, v závislosti na použitej teplote a požadovanej konverzii. Táto reakcia vytvára laktulózo aminoglykozid.

Po odstránení čpavku a octanu amónneho, pričom octan amónny sa typicky odstraňuje vo vákuu, sa na výsledný materiál bez amónia pôsobí karboxylovou kyselinou, ako skôr, aby sa vytvorila laktózamóniová soľ, napr. zlúčenina 3. Na laktózamóniovú soľ sa tiež pôsobí, ako je spomenuté vyššie, aby sa vytvorila zlúčenina 5. β-anomér zlúčeniny 5 sa získal s celkovým výťažkom 3,8 percenta v prvej kryštalizácii, keď sa v prvom reakčnom kroku použila reakčná teplota 37°C a reakčná doba 24 hodín.

Aj keď výťažok zlúčeniny 5 bol nižší pri použití tejto procedúry ako pri skôr spomenutom postupe, takýto postup sa použitia reduktívneho odstraňovania skupiny. Katalyzátor obsahujúci paládium vyhne potrebe amino-blokujúcej používaný pri tejto redukcii je najnákladnejšie činidlo

10024 a dimety1 jantárovéj na vytvorenie podobných používané pri týchto syntézach. Poznamenáva sa, že možno ako rozpúšťadlo použiť metanolický čpavok namiesto kvapalného čpavku a vyhnúť sa takto potrebe používania autoklávu.

Amín zlúčeniny 5 v schéme 1 je znázornený vo väzbe na skupiny R^B a R®, ktoré dohromady so zobrazeným dusíkovým atómom tvoria C4-C8 cyklický imid, ako je typicky ftalimid (Phth) v zlúčenine 5. Poznamenáva sa, že anhydridy kyseliny jantárovej, jablkovej, monoa citrakónovej sa dajú tiež použiť imidov tak, že R^B a R^B dokopy s dusíkovým atómom tvoria zodpovedajúci imid. Cyklický imid tvorený -NR^BR^B skupinou poskytuje aminochrániacu skupinu, ktorá je podmienok, keď sú O-acy1ové skupiny, ako odstraňované, ale ktorá môže byť ľahko hydrazínom. Poznamenáva sa tiež, anhydrid, ale môže sa nahradiť hal i dom, ako je met-y 1 f ta 1 oy 1 chlorid.

Zlúčenine» 5 je v schéme 1 znázornená ako β-anomér. a-acetát sa vytvára tiež a výťažok požadovaného β-acetátu možno takmer zdvojnásobiť skoncentrovaním matečného lúhu, získala zlúčenina 5, do peny, s následným DMF a potom reakciou s hydrazinium acetátom, ktorý odštepuje acetátovú skupinu a anómeru. Po izolácii technikou, vysušení.

stála za je acetát, odstránená že sa nemusí používať Ci-Ce alkyl polyester z ktorého sa rozpustením v spôsobuje tvorbu (3-0H reakčného produktu bežnou extrakčnou rozpustení vysušeného materiálu v pyridíne a pôsobení nadbytkom acetanhydridu na pyridínový roztok sa získa ďalší 8,3-percentný celkový výťažok zlúčeniny 5. Získa sa konečný 18,7-percentný výťažok zlúčeniny 5, ktorý sa berie ako východzí materiál.

Reakcia zlúčeniny 5 s laboratórnej teplote poskytla výťažok zlúčeniny 6.

Schéma 2 ďalej vysvetľuje transformáciu peracetyl N-ftalimidolaktózamín β-chloridu chránený sialylový tetrasacharid ponechá zlúčenina 6 reagovat pri

AICI3 v dichlórmetáne pri v podstate kvantitatívny zlúčeniny 6, na úplne

13. Takto sa zlúčen i nu izbovej teplote 2 hodiny

10024 v kroku a so zlúčeninou 9, ktorej syntéza sa uvádza v príkladoch. v prítomnosti molekulárnych sít. kolidínu a trifluórmetánsulfonátu (triflátu) striebra. pri použití dichlórmetánu ako rozpúšťadla, na prípravu zodpovedajúceho trisacharidu. Na tento úplne chránený trisacharid sa najskôr pôsobí v kroku b 80 percentnou vodnou kyselinou octovou 2 hodiny pri 80°C na odstránenie benzy1idénovej chrániacej skupiny na 4- a 6- pozíciách koncovej Gal skupiny. Potom sa v kroku c uskutoční reakcia hydrazin hydrátu so získaným, čiastočne deprotekt-ovaným, trisacharidom za refluxovania počas 17 hodín na odstránenie ftalimido- a acetyl- skupín a na vytvorenie úplne deprotektovaného trisacharidu. Reakcia deprotektovaného trisacharidu v kroku d s diallylpyrokarbonátom v zmesi metanol ^: voda (5 - 1) poskytla zlúčeninu 10, kde AL je allylcarbamoy1.

Keď R² nie je glykozid, ako sa opisuje v syntézach schémy 2. ale je výhodnou Ci-Cie hydrokarbylovou skupinou, ako je benzy1, glykolyzačné kroky a a b sa vynechajú, s poskytnutím t-etrasacharidu podľa všeobecného vzorca A, I alebo II, kde R² je iný než mono- alebo disacharid.

Zlúčenina 10 potom bola enzymaticky sialylovaná v kroku e vo vodnom pufri pri použití a-C2,3)-sialyltransferázy CEC 2.4.99.6) a mnohých iných enzýmov. Reakcia bola sledovantí TLC počas 10 - 12 dní pri izbovej teplote, keď viac než 95 percent zlúčeniny 10 bolo spotrebovaných a bola pripravená zlúčenina 11.

Zlúčenina 11. bola získaná ako hustý sirup, ktorý bol dvakrát odparený s pyridínom a potom držaný vo vákuu 20 hodín. Takto odvodnený materiál bol rozpustený v pyridíne, ku ktorému sa pridalo katalytické množstvo 4-dimetylaminopyridínu ako aj anhydrid kyseliny octovej- Dve ďalšie pridania anhydridu kyseliny octovej počas nasledujúcich 44 hodín doplnili acetylačnú reakciu a tvorbu laktónu medzi karboxylom sialylu a cukorným hydroxylom v kroku f. Potom bol k získanému materiálu pridaný metanol na tvorbu sialyl metylesteru, potom bol pridaný ďalší anhydrid kyseliny

10024 octovej na acetyláciu uvoľneného hydroxylu a na tvorbu úplne chránenej zlúčeniny 12 v kroku g.

Musí byť jasné, že zlúčeniny 11 a 12 sú zlúčeniny podľa všeobecných štruktúrnych vzorcov A a III. Pri použití

Z je Ci-Ce acyl (acetyl). X je je GalpO-etyl, R³ je acetyl. R^-4 Rovnako musí byť jasné, že skôr pre zlúčeninu ktoréhokoľvek zo vzorcov sú pohodlne zavedené požadované, aby boli štruktúrnych vzorcov zlúčeniny 12 ako príkladu,

Ci-Ce acyloxy (acetoxy), R² je met.yl a R¹ je allyloxy. spomenuté iné skupiny X všeobecných štruktúrnych v sialylačnom kroku. Keď je v inhibítoroch všeobecných la C prítomné X substitúty sialylovej jednotky, čo sú Ci-Ce acyloxy a Ci-Ce hydroxyacyloxy, je výhodné, aby zlúčenina 10 (alebo disacharid bez 3GalpOR² skupiny) bola peracetylovaná, a1lyloxykarbamylová skupina (AL) zlúčeniny 10 odstránená, ako v kroku h, jednou z R¹ acylových skupín, ktoré obsahujú fenylový kruh, ako v kroku c schémy 3. Molekula je potom deprotektovaná a enzymaticky sialylovaná a fukozylovaná, ako sa uvádza neskôr. Pre iné z R^1-4 skupín alebo podobné zlúčeniny podľa všeobecných štruktúrnych vzorcov A, B alebo III, možno nahradiť 3Gal<3 glykozid R² zlúčeniny 9, acylačné činidlo krokov f aga esterifikačný alkohol v kroku f.

Pôsobenie polymety1hydroziloxánom (PMHS) na získanú zlúčeninu 12 v bezvodom THF pri laboratórnej teplote, nasledované pôsobením paládium tetrakistrifenylfosfínu [Pd(Ph3)q] počas 18 hodín poskytlo zlúčeninu 13 s 87 percentným výťažkom v kroku h.

10024 *E»c= 2

10024

V schéme 3 je načrtnutá jedna zostávajúca syntéza pre ilustratívny inhibítor, zlúčeninu 17 so všeobecnými vzorcami la C. Takto poskytuje reakcia zlúčeniny 13 s jedným ekvivalentom ľadovej kyseliny octovej vo vodnom metanole pri 50°C počas 48 hodín selektívnu deacyláciu Glc 3-hydroxylu a dáva zlúčeninu 14 v 65-percentnom výťažku kroku a.

Zlúčenina 14 bola potom selektívne benzoylovaná v kroku reakciou s benzoylchloridom hydogénuhličitanom sodným pri hodín za tvorby zlúčeniny 15.

sú pridávané všeobecných III, keď R² nie je b v 83-percentnom výťažku v dichlórmetáne s pevným izbovej teplote počas 24

V tomto kroku alebo v analogickom kroku alternatívne R¹ skupiny zlúčenín podľa štruktúrnych vzorcov A, I, II a sacharidová jednotka.

Organickochemická fukozylácia bola vykonávaná v kroku c schémy 3 zmiešaním zlúčeniny 15 s tri-Cl-benzy 1 fukozylchloridom, molekulárnymi sitami a tetrametylmočovinou v dichlórmetáne, následným ochladením na -20°C chloridu ciničitého a chlór istanú strieborného, zahriatí na izbovú teplotu a miešaní počas 24 hodín bola pripravená zlúčenina 16 v 77-percentnom výťažku.

zlúčeninou kde Z je a pridaním Po pomalom podľa všeobecných blokovaná fukozylová podľa všeobecného vzorca II. skupín poskytuje zostávajúce

Zlúčenina 16 je štruktúrnych vzorcov A a B, skupina, ako aj zlúčeninou alternatívnych R⁵

Použi tie zlúčeniny podľa týchto všeobecných štruktúrnych vzorcov, keď sú kombinované so skôr spomínanými skupinami X a R^{1 4}.

Q-benzylové chrániace skupiny R⁵, fukozylové sacharidové jednotky boli odstránené v kroku d hydrogenáciou s použitím hydroxidu paládnatého na uhlí [Pd(0H)2/C] v metanole ako rozpúšťadle. Reakcia pri izbovej teplote počas 1 hodiny poskytla úplné odstránenie 0-benzylových chrániacich skupín. Filtrácia debenzylovanej zlúčeniny poskytlo olej, v zmesi metanol '· voda C 4 : 1), ku a skoncentrovanie ktorý bol rozpustený ktorej bol pridaný práškový met-oxid sodný v kroku e. Po 16 hodinách reakcie pri

10024 izbovej teplote bol získaný 72-percentný výťažok inhibítora, zlúčeniny 17 Keď R⁵ je Ci-Ce acylová skupina, hydrogenačný krok sa nepoužíva a R⁵ Ci-Cď acylová skupina sa odstráni spolu s R³ a R⁴ skupinami. Požitie Ci-Ľ6 acylovej skupiny a obídenie hydrogenačného kroku tiež poskytuje cestu k syntéze R¹ skupín obsahujúcich nitroskupinu.

10024

7

10024

Keď R² skupina je mono- alebo disacharid. použije sa patrične blokovaný mono- alebo 9 podľa schémy 2. Napríklad laktózy alebo melibióza môžu disacharid, ako je zlúčenina Laktóza, Ci-Cis glykozid byt prevedené na chránené (blokované) benzylidínové deriváty podobné derivátom zlúčeniny 9 a potom použité v spojovacom kroku a schémy a výsledný produkt 2 a 3.

použiť v nasledujúcich krokoch schém sa, ze i ným i

Rozumie pripravené pracovníkom. Ďalej 10 môže byt a jeho deriváty dobre známym i môžu byť skúseným laktózamín spôsobmi, sa rozumie, že trisacharidová zlúčenina pripravená enzymaticky reakciou ety1-3-0-(2-N-a1 ly 1 oxy kar bony 1 -2-amino-2-dezoxy-(S-D-glukopyranozyl )-<3-D-galaktozidu pri použití uridín-5’-difosfátgalaktózy1transferázy s UDP-Gal a iných podľa známych postupov. Podobne môže fukozylovaná enzymaticky pri patričných enzýmov byt zlúčenina 11 použití niektorej fukozyltransferázy (FT), ako je fukozyltransferáza V, ako aj použitím nukleotidového donora cukru, GDP-fukózy a iných enzýmov užitočných pre regeneráciu GDP-fukózy, podľa známych postupov. Samozrejme pre tieto zmeny syntézy sú vyžadované menšie zmeny v uvedených reakčných schémach, ale tieto zmeny sú iste v rámci skúseností bežného pracovníka.

Ešte ďalšie užitočné syntetické postupy sú znázornené v schéme 4. Tu je východzím materiálom voľná báza, zlúčenina 14a, zlúčeniny 14 podľa schémy 3.

10024

Schéma -^E·.

I t CH

10024

Takto bola zlúčenina 14a ponechaná v kroku a reagovat s malým nadbytkom karbobenzoxychlorldu (CBZ-C1) v d ich1órmetáne za prítomnosti hydrogénuh1 ič1 tanú sodného, s následným pridaním ďalšieho ekvivalentného množstva

CBZ-C1 asi po 10 hodinách. za tvorby zlúčeniny 39 v 65-percent.nom výťažku.

je v podstate rovnaký glykolyzačný v kroku c podľa schémy am ino-chránenej Krok b podľa schémy krok. ako je uvedený z 1účen i na 40 sa tvor í . p r i č om v 73-percentnom výťažku a späť sa získa 17 percent, výchoďzej zlúčeniny 39.

amín. zlúčenina 41. sa potom výťažku v kroku c reakciou s 10 mravenčane amónnom amín 41 d zlúčeniny 41 CYR¹ j chloridom v hydrogénuh1 i či tanú sodného, zodpovedajúce hydroxy-blokované N-acety1ované zlúčeniny, tu 3.5-dich 1órbenzamidového derivátu, zlúčeniny 42. vo vysokom

Fukozylovaný voľný vytvoril v 96-percentnom percentami Pd-C v ref1uxovani a. Voľný reagovat. s v prítomnosti acy 1 v etanole za sa potom nechal d i ch 1órmetáne aby poskytol

10024 výťažku.

Štruktúry niekoľkých obzvlášť výhodných inhibítorov, zlúčenín 17, 30 - 38 a 43 - 51 už boli ukázané. Zlúčeniny 30 - 33 boli pripravené z im príslušných prekurzorových zlúčenín 26 - 29, ako je opísané pre konverziu zlúčeniny 16 na zlúčeninu 17 v schéme 3. Zlúčeniny 34 - 38 a 51 boli pripravené spôsobmi analogickými tým, ktoré sú uvedené v schéme 3. Zlúčeniny 43 - 49 boli pripravené podobne, pri použitím všeobecného prístupu uvedeného v schéme 4. Zlúčenina 50 bola pripravená podľa schémy 3, pri použití redukcie zo schémy 4, krok c. Tieto zlúčeniny sú zlúčeniny podľa všeobecných štruktúrnych vzorcov I a A.

C. Spôsoby testovania inhibície bunkovej adhézie

Mnohé priame a nepriame spôsoby pre in vitro vyhľadávanie inhibítorov interakciou ligand - receptor sú dostupné a dobre známe odborníkom zbehlím v odbore. Určená môže byť napríklad schopnosť inhibovať adhéziu buniek nesúcich SLe^x k bunkám exprimujúcim konkrétny selektín.

Ako bolo uvedené, gény niektorých selektínových receptorov boli klonované a tieto gény môžu teda byť vložené a exprimované v širokej škále buniek, ako sú COS bunky, CHO bunky, adenovírom transformované ľudské bunky obličiek, ako sa používajú tu, a podobne, takže sa testoch môže používať niektorý rekombinantný selektínový receptor, ako je rELAM (rekombinantný ELAM-1), ako sa opisuje neskôr. Navyše^: normálne neexprimujú SLe^x , sú schopné s jedným alebo viacerými

Bunky, ktoré transformácie glykozy It-ransf erázovými génmi, ktoré udeľujú transformovaným bunkám schopnosť syntetizovať tento ligand. [Pozri napr. Love et al., Celí 63= 475-484 (1990)1. V niektorých testoch sa inhibítorová zlúčenina alebo činidlo inkubuje

10024 s označenými bunkami, ktoré nesú SLe^x a aktivované bunky, exprimujúce povrchové selektíny, sú imobi1izované na pevnom povrchu. Inhibícia bunkovej adhézie potom môže byť určená detekciou značky viazanej na povrch po príslušnom premytí.

In vitro testy uvažovaných zlúčenín analogických SLe^x sú typicky kompetičné testy, ktoré detekujú schopnosť uvažovanej zlúčeniny kompetitívne inhibovať väzbu selektínu na bunky obsahujúce SLe^x . Bunkami obsahujúcimi selektín sú typicky aktivované doštičky alebo endoteliálne bunky s niektorým rekombinantným užitočnosti, zatiaľčo bunkami neutrofily alebo HL-60 bunky.

Iné vyhotovenia testov zahŕňajú detekciu alebo neprítomnosti rôznych fyziologických v bunkách nesúcich SLe^x ligand alebo v bunkách nesúcich selektín, ktoré sú dôsledkom ich interakcie. Príklady testov zahŕňajú meranie zmien v transkripčnej vyvolaných väzbou (pozri napr. PCT publikáciu selekt. í nom, nesúcimi SLe^x podľa jeho sú obyčajne prítomnosti zmien buď vhodných aktivite, číslo

3712820) sprostredkovaných publikáciu číslo detekciu extracelulárnych účinkov rôznymi bunkami (pozri napr. PCT 90/00503) a detekciu zmien membránového potenciálu jednotlivých buniek (pozri napr. U-S. patent číslo 4 343 782), ktoré sú tu všetky zaradené odkazom. Alternatívne možno detekovat koníormačné zmeny v izolovaných

U.S. patent číslo Ďalej možno viazať receptoroch alebo ligandoch, pozri napr.

859 609, ktorý je tu zaradený odkazom bunky exprimujúce SLe^x na selektín naviazaný na pevnej podložke, lyžovať naviazané bunky a testovať na bielkovinu, ktorá môže byt prítomná len v naviazaných bunkách.

Každá zložka testu, vrátane ligandu a selektínového receptora, alebo SLe^x zlúčeniny, môže byt naviazaná na pevný povrch. V odbore sú známe mnohé spôsoby na imobilizáciu biomolekúl na pevné povrchy. Napríklad: Pevným povrchom môže byt membrána (napr. nitrocelulóza), mikrotitračná doštička (napr. PVC alebo polystyrén), alebo zrnko. Žiadaná zložka môže byt naviazaná kovalentne alebo spojená nekovalentne

10024 prostredníctvom nešpecifickej väzby.

Ako materiál pre pevný povrch sa môže využívať množstvo organických a anorganických polymérov, ako prírodných, tak aj syntetických. Ilustrat-ívne polyméry zahŕňajú polyetylén, polypropylén, poly(4-metylbutén), polystyrén, polymetakrylát, poly(etyléntereftalát), hodváb. nylon, poly(vynilbutyrát), si 1 ikony, polyformaldehyd, celulózu, acetát celulózy, nitrocelulózu, atď. Iné materiály, ktoré možno využívať, zahŕňajú papier, sklá, keramické materiály, kovy, metaloidy, polovodičové materiály a podobne. Navyše sú zahrnuté látky, ktoré vytvárajú gély, ako bielkoviny, napríklad želatíny, 1ipopolysacharidy, silikáty, agaróza a polyakrylamidy, alebo polyméry, ktoré tvoria niekoľko vodných fáz, ako dextrány, polyalkylénglykoly (alkylén s 2 až 3 uhlíkovými atómami) alebo povrchovo aktívne látky, napríklad amfifilné zlúčeniny, ako fosfolipidy, alkylamóniové soli s dlhým alkylovým reťazcom (12 - 24 uhlíkových atómov) a podobne. Keď je pevný povrch porézny, môžu sa využívať rôzne veľkosti pórov v závislosti na povahe systému.

Na získanie rôznych vlastností sa môže pri príprave povrchu využívať viac rôznych materiálov, obzvlášť lamináty. Napríklad: Potiahnutie bielkovinou, ako je želatína, môže byť využité na odstránenie nešpecifických väzieb, zjednodušenie ková lentnej konjugácie, zosilnenie signálu detekcie a podobne.

Keď je žiadúce kovalentné previazanie zlúčeniny a povrchu, povrch je obvykle polyfunkčný alebo schopný stať sa polyfunkčným. Funkčné skupiny, ktoré môžu byť prítomné na povrchu a využívané na väzbu, môžu zahŕňať karboxylové kyseliny, aldehydy, aminoskupiny, kyanové skupiny, skupiny etylénu, hydroxylové skupiny, merkaptoskupiny a podobne. Spôsob naviazania širokej rady zlúčenín na rôzne povrchy je dobre známy a je vysvetľovaný v literatúre. Pozri napríklad Immobi1ized Enzymes, Inchiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) a Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 243: 3059 (1970),

10024 čo je tu zaradené vo forme odkazu.

Naviac na kovalentné naviazanie môžu byt použité rôzne spôsoby pre nekovalentné naviazanie niektorej zložky testu. Nekovalentné naviazanie je typicky nešpecifickou absorpciou zlúčeniny na povrch. Povrch je typicky blokovaný druhou zlúčeninou na zabránenie nešpecifického naviazania označených zložiek testu. Alternatívne je povrch navrhnutý tak. že viaže nešpecifický jednu zložku. ale neviaže významne ďalšiu. Napríklad: Povrch nesúci lektín, ako je konkavalín A. viaže zlúčeninu obsahujúcu cukor, ale nie označenú bielkovinu, ktorá nie je glukózylovaná. Rôzne pevné povrchy pre použitie na nekovalentné napojenie zložiek testov sú zahrnuté v U.S. patentoch čísla 4 447 576 a 4 254 082, ktoré sú tu zaradené vo forme odkazov.

Spomenutá značka môže byt pripojená priamo alebo nepriamo k žiadanej zložke testu podľa spôsobov dobre známych v odbore alebo môže byt endogénnou bielkovinou naviazanej bunky. Možno použiť, množstvo značiek. Najčastejší spôsob detekcie je použitie autorádiografie sa zlúčeninami označenými ³H, ¹²⁴I, ³⁵S, ^1,4C alebo ³²P a podobne. Výber rádioaktívneho izotopu závisí na prednostiach výskumu, daných jednoduchosťou syntézy, rôznou stabilitou a polčasom vybraného izotopu. Iné, nerádioaktívne značky, zahŕňajú ligandy, ktoré sa viažu na označené protilátky, fluórofóry, chemi luminiscenčné činidlá, enzýmy a protilátky, ktoré môžu slúžiť ako špecifický väzbový člen pre označený ligand. Výber značky závisí od potrebnej citlivosti, jednoduchosťou konjugácie so zlúčeninou, požiadaviek stability a dostupnej i nštrumentác i e.

Nerádioaktívne značky sú často pripájané nepriamym spôsobom. Všeobecne je molekula ligandu (napr. biotínu) naviazaná kovalentne na iné molekuly. Ligand sa potom viaže na molekulu anti-ligandu (napr. streptavidínu), ktorá je buď inherentne detekovateľná, alebo kovalentne naviazaná na signálny systém, ako je detekovateľný enzým, fluorescenčná zlúčenina alebo chemiluminiscenčná zlúčenina. Ligandy

10024 a antiligandy možno široko obmieňať. Keď má ligand prirodzený antiligand, napríklad biotín, tyroxín a kortizol, s označenými, prirodzene sa Alternatívne možno používať zlúčeniny v kombinácii možno ho použiť v spojení vyskytujúcimi anti-1igandmi. hapténové alebo antigénne s protilátkou.

Spomenutá značka môže byt aj enzým alebo iná bielkovina prítomná v bunkách, ktorých adhézia má byt inhibovaná. Množstvo tohoto enzýmu môže byt pritom používané ako značka pri stanovení rozsahu väzby. Myeloperoxydáza je jedna takáto bielkovina prítomná v bunkách HL-60, ktorá môže byt využitá v štúdiách inhibície väzby, ktoré sú rozoberané nižšie.

Molekuly SLe^x môžu byt tiež zlúčeniny generujúce signál, napr. alebo fluórofórom. Enzýmy, o ktoré hydrolázy, konkrétne fosfatázy, esterázy a glykozidázy, alebo oxidoreduktázy, konkrétne peroxidázy. Fluorescenčné zlúčeniny zahŕňajú fluoresceín a jeho deriváty, danzyl,

Chemiluminiscenčné zlúčeniny priamo konjugované na konjugáciou s enzýmom je záujem, sú primárne jeho deriváty, rodamín umbel1 iferón, atď.

zahŕňajú luciferín.

a 2,3-dihydroftalazindióny, napr. luminol. Pre prehľad použití rôznych systémov vytvárajúcich signál pozri U.S. patent, číslo 4 391 904, ktorý je tu zaradený vo forme odkazu.

D. Farmaceutické prostriedky

Uvažuje sa tiež farmaceutický prostriedok, obsahujúci uvažovanú zlúčeninu analogickú SLe^x , rozpustenú alebo rozptýlenú vo farmaceutický prijateľnom nosiči alebo riedidle. Takýto prostriedok obsahuje adhéziu inhibujúcu množstvo spomínanej zlúčeniny analogickej SLe^x.

Uvažovaný farmaceutický prostriedok môže byt použitý na blokovanie alebo inhibíciu bunkovej adhézie spojenej s množstvom chorobných stavov. Napríklad: Mnoho chorobných

10024 stavov je vaskulárne zápal sa specif ického spojených endoteliálne tu používa tak aj

Reakc i a specif ického so selektínmi, exprimovanými na bunky alebo na doštičky. Výraz tak. že odkazuje na odozvu ako nešpecifického obranného systému, ohraného systému je reakcia špecifického imunitného systému na antigén. Príklady reakcií špecifického obranného systému zahŕňajú proti látkovú odozvu na antigény, ako sú víry, a hypersenzitivitu opozdeného typu. Reakcia nešpecifického obranného systému je zápalová odpoveď sprostredkovaná leukocytmi, ktoré nie imunologickou pamäťou. Takéto bunky zahŕňajú eozinofily a néutrofily. Príklady nešpecifických reakcií zahŕňajú okamžité opuchnutie po včeľom žihadle a hromadení PMN leukocytov v miestach bakteriálnej infekcie (napr. pulmonárne infiltráty u bakteriálnej pneumónie a hromadenie sú vybavené makrofágy, hnisu v abscesoch)Iné liečiteľné reumatoidnú artritídu.

chorobné stavy zahŕňajú napr. post-ischemické poškodenie tkaniva sprostredkované leukocytmi (reperfúzne poškodenie), omrzliny alebo šok z chladu, akútne poškodenie pľúc sprostredkované leukocytmi (napr. syndróm respiračnej nedostatočnosti dospelých), astmu, traumatický šok, septický šok, nefritídu, akútne a chronické zápaly, vrátane atypickej dermatitídy, psoriázy a zápalových črevných ochorení. Rôzne patologické stavy sprostredkované doštičkami, ako artéroskleróza a zrážanie krvi, môžu byt liečené. Navyše nádoru môže byt zabránené alebo môže inhibíciou adhézie obiehajúcich nádorových buniek. Príklady zahŕňajú nádory hrubého čreva a melanómy.

Príkladom obzvlášt dobrej odpovede na liečbu uvažovanými farmaceutickými prostriedkami je poškodenie. Prostriedok, ktorý inhibuje

P-selektínového ligandu môže byt obzvlášt užitočný pri liečbe alebo prevencii reperfúzneho poškodenia. Uvažovaný farmaceutický prostriedok možno použiť profylaktický pred operáciou srdca na podporu pooperačnej nápravy.

Metastázovan i u byt inhibovaný reperfúzne interakciu

10024

Pretože P-selektín je skladovaný vo Weibel-Paládových telieskach doštičiek a endoteliálnych buniek a je uvoľňovaný pri aktivácii trombínom pre sprostredkovanie adhézie neutrofilov a nonocytov, inhibítory interakcie P-selektínového ligandu môžu byt obzvlášť užitočné pri minimalizovaní poškodeného tkaniva, ktoré často sprevádzajú trombotické chorobné stavy. Napríklad^ Takáto inhibícia je terapeuticky cenná u pacientov, ktorí nedávno prešli mŕtvicou, infarktmi myokardu, hlbokou trombózou žíl, pulmonárnou embóliou, atď. Tieto zlúčeniny sú obzvlášt užitočné pri pre-trombolytickej terapii.

Uvažovaný prostriedok nájde konkrétne použitie pri liečbe druhotných účinkov septického šoku alebo roztrúsenej obehovej koagulácie (DIC, diseminated intravascular coagulation). Migrácia leukocytov do tkanív počas septického šoku alebo DIC majú často za následok patologický rozklad tkaniva- Títo pacienti navyše môžu mat široko rozšírené mikrocirkulačné tromby a difúzne zápaly. Tu poskytnutý liečebný prostriedok inhibuje migráciu leukocytov do týchto miest a zmierňuje poškodenie tkaniva.

Inhibítor interakcie selektínu a SLe* ligandu je užitočný tiež pri liečbe traumatického šoku a liečbe sprevádzajúceho akútneho poškodeného tkaniva. Pretože selektíny majú význam pri zhromažďovaní leukocytov v miestach poranenia, obzvlášt E-selektín v prípadoch akútneho poranenia a zápalu, ich inhibítory môžu byt podávané lokálne alebo systémovo pre kontrolu poškodenia tkaniva spojeného s takýmito poraneniami. Navyše^: Pre špecifickosť takýchto inhibítorov na miesta zápalu, napr. tých, ktoré sú exprimované ELAM-1 receptormi, môžu tieto prostriedky byt v porovnaní s tradičnými protizápalovými činidlami účinnejšie a môžu s menšou pravdepodobnosťou spôsobovať komplikácie.

Predkladaný vynález poskytuje tiež farmaceutické prostriedky, ktoré môžu byť používané pri liečbe spomenutých stavov. Uvažovaný farmaceutický prostriedok sa skladá

10024 zlúčeniny analogickej SLe^x , ktorá inhibuje medzi bunkovým SLe^x ligandom a selektínovým zlúčenina je rozpustená alebo prijateľnom riedidle. Uvažovaný vhodný na použitie v rôznych Pre krátky prehľad súčasných pozri: Langer, Science 249= z opísanej interakciu receptorom, pričom táto rozptýlená vo farmaceutický farmaceutický prostriedok je systémoch dodávania lieku, spôsobov dodávania liekov

1527-1533 (1990).

Vzhľadom na zložitost zápalových odpovedí u cicavcov, každý, kto má skúsenosti, ľahko rozozná, že uvažovaný farmaceutický prostriedok môže ďalej obsahovať ďalšie zlúčeniny, o ktorých je známe, že interferujú s molekulami bunkovej adhézie. Napríklad o molekulách patriacich k rodine integrínových adhéznych molekúl sa usudzuje, že majú význam pri uvoľňovaní leukocytov z ciev v bodoch infekcie. Kvôli prehľadu o medzibunkových adhéznych receptoroch, vrátane selektínových receptorov, a o ich význame v imunitných funkciách, pozri Springer, Náture 346: 424 - 434 (1990). Navyše: Úspešné pôsobenie s použitím uvažovaného farmaceutického prostriedku môže byť tiež určené pomocou vývoja stavu, ktorý má byť liečený. Pretože rôzne adhezívne molekuly môžu byť v priebehu choroby alebo stavu pozitívne alebo negatívne regulované v náväznosti na rad faktorov, každý, kto má skúsenosti, rozozná, že pre liečbu rôznych zápalových stavov môžu byť potrebné rôzne farmaceutické prostriedky.

Pre farmaceutický prostriedok, ktorý sa skladá zo zlúčeniny analogickej SLe^x , ktorá sa viaže so selektínovým receptorom a inhibuje jeho väzbu na bunky obsahujúce SLe^x ligand, sa dávka zlúčeniny líši podľa napr. konkrétnej zlúčeniny, spôsobu podávania, konkrétnej choroby, ktorá sa lieči, a jej závažnosti, celkového zdravotného stavu a podmienok, v ktorých sa pacient nachádza, a podľa posúdenia ošetrujúceho lekára. Pre liečbu reperfúzneho poškodenia je napríklad dávka uvažovanej zlúčeniny analogickej SLe^x v rozsahu 50 jug až 10 000 mg/deň pre 70-kg

10024 pacienta. Ideálne by malo liečebné podávanie začínať čo najskôr ako je to možné po infarkte myokardu alebo inom poškodení. parenterá1ne, je určený pre lokálne podávanie pre profylaktické

Farmaceutický prostriedok topické, orálne alebo pomocou aerosólu alebo transdermálne, alebo liečebné pôsobenie. Farmaceutický prostriedok môže byť podávaný v mnohých jednotkových dávkovacích formách, závislých na spôsobe podávania. Jednotkové dávkovacie formy napríklad vhodné pre orálne podávanie zahŕňajú prášky, tabletky, pilulky, kapsule a dražé.

Farmaceutický prostriedok je výhodne podávaný intravenózne. Vynález teda poskytuje prostriedok pre intravenózne podávanie, ktorý obsahuje roztok uvažovanej zlúčeniny analogickej SLe*, rozpustenej alebo rozptýlenej vo farmaceutický prijateľnom riedidle (nosiči), výhodne vodnom nosiči. Možno použiť množstvo vodných nosičov, napr. pufrovanú vodu, 0,4-percentný soľný roztok, a podobne, prostriedky môžu byť sterilizované konvenčnými, známymi steri1izačnými technikami alebo môžu sterilizované filtráciou. Výsledné vodné roztoky môžu byť balené pre použitie ako také alebo lyofi 1izované, pričom lyofi 1 izovaný prípravok sa kombinuje so sterilným vodným podávaním. Prostriedok môže obsahovať prijateľné dodatočné látky, potrebné na fyziologickým podmienkam, ako sú činidlá pufrovacie činidlá, činidlá nastavujúce vodu, Tieto dobre byť roztokom pred farmaceutický priblíženie sa nastavujúce pH, tonicitu, zvlhčovacie činidlá a podobne, napríklad octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid vápenatý, sorbitan monolaurát, atď.

Koncentrácia použitej zlúčeniny chlorid draselný, trietanolamín oleát, analogickej SLe* je zvyčajne prinajmenšom 1 percento a dosahuje až 10 až 30 percent podľa hmotnosti, a kvapaliny, viskozít, atď, spôsobom podávania. Ako je je zvolená primárne podľa objemu v súlade s konkrétne zvoleným opísané vyššie, prostriedok môže byť podávaný prostredníctvom lipozómového prípravku.

10024

Typický farmaceutický prostriedok pre intravenózne podávanie teda môže byt upravený tak, že obsahuje 250 ml sterilného Ringerovho roztoku a 25 mg zlúčeniny analogickej SLe^x . Konkrétne spôsoby prípravy parenterálne podávateľných zlúčenín sú známe alebo zrejmé pre odborníkov v tejto nápr. Remington’s oblasti su opísané podrobnejšie v

Pharmaceutical Sciences. 17. vyd., Mack Publishing Company, Easton, PA ¢1985), ktorá je tu uvedená vo forme odkazu.

Pre tuhé prostriedky sa môžu použit konvenčné netoxické ktoré zahŕňajú napríklad manitol, sacharózu, stearát horečnatý vo farmaceutických kvalitách a podobne. Pre orálne podávanie sa vytvorí farmaceutický prijateľný netoxický prostriedok zahrnutím akéhokoľvek normálne používaného excipientu, ako sú nosiče zo skôr spomínaného zoznamu a všeobecne 10 - 95 tuhé riedidlá (nosiče), laktózu, škrob, glukózu, zložky, ktorou je výhodne okolo 20 opísaná zlúčenina percent (pozri percent aktívnej analogická SLe^x,

Rem i ngton’s).

Pre aerosólové podávanie je uvažovaná zlúčenina analogická SLe^x výhodne dodávaná v jemne delenej forme spolu s povrchovo aktívnou látkou a propelantom. Typické percentné zastúpenie zlúčeniny analogickej SLe^x je 0,5 až 30 percent podľa hmotnosti a výhodne 1 až 10 percent. Povrchovo aktívna lát-ka musí byt samozrejme netoxická a s výhodou rozpustná v propelante. Pre tieto činidlá sú reprezentanty estery alebo čiastočné estery mastných kyselín, obsahujúcich od 6 do 22 uhlíkových atómov, ako kyseliny kaprónové, oktánové, stearové, linolové, linolénové, s alifatickými polyhydroxylovými cyklickými anhydridmi ako napr.

etylénglykolom, glycerolom, erytritolom, arabitolom, manit-olom, sorbit-olom a hexitolovými anhydridmi odvodenými od sorbitolu, a polyoxyet-y lénové a polyoxypropy lénové deriváty týchto esterov. Môžu sa používať zmiešané estery, ako sú zmiešané alebo prírodné glyceridy. Povrchovo aktívna látka môže predstavovať 0,1 až 20 percent hmotnosti laurové, palmitové, olestearové a oleové, alkoholmi alebo ich

10024 prostriedku, a výhodne 0,25 až 5 percent. Zvyšok prostriedku je zvyčajne propelant. Skvapalnený propelant je za obyčajných podmienok plynom a je skondenzovaný pod tlakom. Medzi vhodné skvapalnené propelanty patria nižšie alkány obsahujúce až 5 uhlíkov, ako je bután a propán, a výhodne fluórované alebo fluórochlórované alkány. Možno používať aj zmesi vyššie uvedených látok. Pri výrobe aerosólu sa nádobka s ventilom plní príslušným propelantom, obsahujúcim jemne « delenú zlúčeninu a povrchovo aktívnu látku. Zložky sú teda udržiavané pri zvýšenom tlaku až dovtedy, kým nie sú • uvoľnené ventilom.

Farmaceutický prostriedok obsahujúci zlúčeninu analogickú SLe^x môže byt podávaný pre profylaktické alebo liečebné pôsobenie. Pri liečebných aplikáciách je prostriedok podávaný pacientovi, ktorý trpí chorobou, aká je opísaná vyššie, v množstve postačujúcom na inhibíciu väzby medzi bunkami exprimujúcimi selektín a neutrofily; t--j. liečiť alebo prinajmenšom obmedziť symptómy choroby a jej komplikácie. Množstvo tomu primerané je definované ako chemoterapeuticky účinná dávka alebo množstvo inhibujúce bunkovú adhéziu. Množstvo pri tomto použití závisí od stupňa choroby, od váhy a celkového stavu pacienta, ale všeobecne patrí do rozsahu 0,5 mg až 10 000 mg zlúčeniny analogickej SLe^x na deň u 70 kg pacienta, pričom dávky od 5 mg do 2 000 mg zlúčeniny sa používajú častejšie.

Pri profylaktických aplikáciách je prostriedok obsahujúci uvažovanú zlúčeninu podávaný pacientovi, ktorý je náchylný alebo inak ohrozený konkrétnou chorobou. Takéto množstvo je definované ako profylaktický účinná látka a ie tiež množstvom postačujúcim na inhibíciu väzby (adhézie) SLe^x obsahujúcich buniek na selektín. Pri tomto použití množstvo opäť závisí na zdravotnom stave pacienta a na váhe, ale všeobecne spadá pod rozsah 0,5 mg až 5 000 mg na 70 kg pacienta, bežnejšie od 5 mg do 2 000 mg na 70 kg telesnej váhy.

Inou cestou na určenie množstva, ktoré inhibuje adhéziu

10024 zlúčeniny analogickej SLe^x, je porovnávanie väzbovej inhibície vykazovanej zlúčeninou analogickou SLe^x s inhibíciou poskytovanou SLe^x samotným. Jednou vhodnou cestou je vykonať toto porovnanie s použitím IC50 (koncentrácie potrebnej na to, aby bola inhibovaná polovica väzby) pre dva porovnávané materiály a založiť používané množstvo na množstve SLe^x a množstve zlúčeniny analogickej SLe^x, ktoré je násobkom hodnoty IC50 pre túto zlúčeninu.

Pre zlúčeninu, ktorej IC50 je asi jednou desatinou IC50 SLe^x samotného, bude množstvo typicky užitočné pre inhibíciu bunkovej adhézie pri používaní v množstve desaťkrát prevyšujúcom molárne množstvo SLe^x. Výhodne je toto množstvo 4-násobkom množstva SLe^x. Ešte výhodnejšie je množstvo rovné množstvu SLe^x. Najvýhodnejšie, ako je tomu u väčšiny tu opísaných zlúčenín analogických SLe^x, je množstvo menšie než používané množstvo SLe^x, ako je jedna polovica až jedna desatina molárneho množstva SLe^x samotného.

Podávanie prostriedku sa môže vykonávať jednorázovo alebo opakovane, s hladinou a rozvrhom dávok zvolenými ošetrujúcim lekárom. V každom prípade musí farmaceutický prípravok poskytovať množstvo zlúčeniny analogickej SLe^x postačujúce na účinnú liečbu pacienta.

Zlúčeniny môžu byt tiež využité ako diagnostické činidlá. Označené zlúčeniny môžu byt napríklad použité na lokalizáciu oblasti zápalu alebo metastázy nádoru u pacienta s podozrením na zápal. Pre toto použitie môžu byt zlúčeniny označené ¹²⁵I, ¹⁴C alebo tríciom.

10024

Príklady vyhotovenia vynálezu

Príklad 1

Laktulózo N-benzyl glykozid (zlúčenina 1)

69,8 mmol) ekvivalentu)

500 ml banka s 3 hrdlami a s guľatým dnom bola ponorená do ľadového kúpeľa a naplnená 1aktulóžou (23,9 g, a benzylamínom (109 ml, 526 mmol, 7,5 Banka bola potom uzavretá a premiešavaná v magnetickej miešačke. Ľadový kúpeľ bol ponechaný roztopiť sa a reakčná zmes bola ponechaná pomaly sa zahrievať na izbovú teplotu. Rozpustenie pevného materiálu prebehlo počas niekoľkých hodín a zmes získala žltú farbu. Na sledovanie je možné použiť TLC v pomere 60 - 50 ^: 15 postupu reakcie CHCI₃ MeOH (1aktulóža

R_f = 0,45, byť ukončená po ma mM CaClz produkt Rf. = 0,75, vizualizácia orcinolom).

Reakcia bola dosť pomalá a zdala sa

5-7 dňoch. V čase, keď reakcia bola posúdená ako úplná, bolo miešadlo vybraté, banka bola . vybavená miešačkou na mechanické miešanie zhora a aparát bol ponorený do vodného kúpeľa. Do banky bol pridaný hexán (250 ml) a zmes bola prudko miešaná počas približne 60 sekúnd. Miešanie potom bolo prerušené a zmes bola ponechaná, aby sa rozdelila na dve zreteľné vrstvy (toto rozdelenie trvá od 15 minút do 1 hodiny). V tomto čase bola horná hexán/benzy1amínová vrstva odstránená odsatím hadičkou. Extrakcia benzylamínu bola ešte dvakrát opakovaná pri použití hexánu (250 ml porcia) a potom bola vykonaná ešte trikrát, pri použití 250 ml porcie dietyléteru (všetky extrakcie sa vykonali na ľade).

Keď boli vykonané tieto extrakcie, zostal viskózny svetlo-žltý zbytok. Tento materiál bol rozpustený v etanole (300 ml) a prenesený do 2-litrovej banky s jedným hrdlom a guľatým dnom. Žltý roztok bol skoncentrovaný na rotačnej

10024 odparovačke na hustý sirup. Acetón reagenčnej kvality 1000 ml) bal rýchlo miešaný magnetickým miešadlom pri 0°C a na tento roztok sa pôsobilo etanolovým sirupom. Pri pomalom pridávaní sirupu sa začínala vytvárať biela zrazenina. Keď bolo pridávanie ukončené, banka bola uzatvorená a uchovávaná v -20°C mrazničke cez noc (asi 18 hodín). Po vybratí z mrazničky bol zreteľný biely pevný koláč na dne banky a supernatant bol jasne žltý. Roztok bol potom dekantovaný a surová pevná zlúčenina i bola odtiahnutá vo vysokom vákuu na odstránenie zvyšného acetónu. Produkt (zlúčenina i) je veľmi nestála pevná látka a bola používaná okamžite v ďalšej reakcii.

Príklad 2

N-benzy1-laktozamín, acet-átová soľ (zlúčenina 2)

Surový produkt (zlúčenina 1,) z hore uvedenej prípravy (30,1 g, 69,8 mmol, teoretický výťažok) bol rozpustený v 1000 ml metanolu reagenčnej kvality teplote. Potom bola pridaná ľadová 70 mmol) a banka sa uzatvorila ~ ' pri izbovej teplote miesana aký a miešaný pri izbovej kyselina octová (4 ml. Slabo žltá reakčná zmes bola a sledovaná TLC s rovnakým je opísaný vyššie. Produkt s Rf = 0,65 (zvyšková laktóza je ale jej rozpúšťadlovým systémom, (zlúčenina 2) bol zreteľný postrehnuteľná. na TLC od začiatku tejto reakcie množstvo podstatne nevzrastá počas reakcie).

Keď je zlúčenina i na TLC úplne spotrebovaná (24 - 48 hodín), z reakčnej zmesi sa odoberie 100 jjl a odparí sa pod prúdom argónu. Žltý zvyšok sa potom rozpustí v CD3 OD a odparí znovu na žltý zvyšok. Tento materiál sa potom rozpustí v D2O a analyzuje sa pomocou ¹H-NMR.

Tento surový roztok zlúčeniny 2 bol potom použitý v nasledujúcej reakcii. Pre výpočet výťažku bol z reakčnej

10024 zmesi odobraný malý podiel známeho objemu, skoncentrovaný do sucha, rozpustený a chromatografovaný s reverznou fázou a potom 2=1 H2O 50 - 55 percent.

vo vode, nastavený pri použití rýchlej na silikagéli, vopred na pH > 10 chromatograf ie vyvíjanej H2O

MeOH. Typické výťažky z laktulózy boli

	1H-NMR (300	MHz	. S	v ppm	vzhľadom k HOD)	7,	44 (m,	5H) ,
5,49	(d,	J = 3	Hz,	IH) ,	5,05	(d, J = 8 Hz,	IH)	, 4,39	(d,
J =	7 Hz.	IH) ,	4,38	(d,	J = 8	Hz, IH), 4,35	(d,	J = 7	Hz,
IH) ,	4,10	- 3,5	(m,	11	H) , 3 ,	24 (dd, J = 3	Hz,	J = 10	Hz,
IH) ,	3,00	(dd, J	= 8	Hz,	J = 10	Hz, IH), 2,87	(s ,	3H) .

Príklad 3

Laktózamin, acetátová soľ (zlúčenina 3)

2-litrová banka, obsahujúca surový roztok zlúčeniny 2 z predošlej reakcie, trojcestným kohútikom a podrobená trikrát kyslý metanolový bola vybavená argón/vákuovému čistiacemu cyklu s použitím balónu argónu a zabudovaného prepojenia na vákuum. Banka bola otvorená a bolo pridaných 10 percent paládia na uhlí (7,4 g, 6,98 mmol). Banka bola potom znovu vybavená trojcestným kohútikom a podrobená trikrát vákuovému čistiacemu cyklu s použitím vodíkového plynu. Reakcia bola potom udržovaná vo vodíkovej atmosfére s použitím balónu. Reakcia bola starostlivo sledovaná TLC (produkt má spotrebovaný, Eppendorf ove j

Rf = 0,2). Keď bol východzí materiál bol odobraný 100 μΐ alikvót, daný do inikrocentrifúge a číry na prípravu NMR vzorky ukázala úplnú stratu skúmavky, stočený v supernatant bol odobraný a použitý ako v predošlej reakcii, zlúčeniny 2, kaša bola

Akonáhle NMR f i 1trovaná nálevke so sklenenou fritou strednej cez vložku celitu na porozity s použitím metanolu. Číry žltý roztok bol potom skoncentrovaný rotačným

10024 odparením na 140 ml v 500 ml banke s použitý surový v nasledujúcej reakcii. (300 MHz, 5 v ppm vzhľadom k HOD) 5,40 4,90 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,41 (d, J - 8 (m, 22 H), 3,28 (dd, J = 3 Hz, J = 10

J = 7 Hz, J = 8 Hz, 1H).

guľatým dnom a bol Zlúčenina 3= iH-NMR

(d,	J =	3 Hz,	1H) ,
Hz,	1H) ,	4,00	- 3,5
Hz,	1H) ,	2,98	(dd.

Príklad 4

2-Dezoxy-2-(2'-karboxy)-benzamido-4-0-p-D-galaktopyranozy1)-β-D-glukopyranozid (zlúčenina 4) a 1,3,6-Tri-0-acety1-2-desoxy-2-ftalimido-4-0-(2,3,4,6,-tetra-O-acety1)-β-D-galaktopyranozy1)-β-D-glukopyranozid (zlúčenina 5)

Surový kyslý netanolový roztok zlúčeniny 3 z predošlej reakcie, bol zriedený 14 ml H2O a pôsobilo sa naň uhličitanom sodným (29,7 g, 280 mmol) a následne anhydridom kyseliny ftálovej (20,7 g, 140 mmol). Reakcia bola starostlivo sledovaná, pretože zo začiatku dochádza k peneniu. Po 4 hodinách reakcia dobehla do konca a kaša bola sfiltrovaná cez nálevku so sklenenou fritou kvôli odstráneniu zvyškov materiálu pochádzajúceho z uhličitanu sodného a anhydridu kyseliny ftálovej- Filtrát bol potom skoncentrovaný na pastu, najprv rotačným odparovaním a potom vo vysokom vákuu, za poskytnutia zlúčeniny 4. Odstránenie stôp metanolu a H2O, zostávajúcich v materiáli, tak dôkladne, ako je to len možné, je podstatné kvôli zamedzeniu vedľajším reakciám s acetanhydridom v nasledujúcej acetyláci i.

Keď bol materiál posúdený ako dostatočne suchý, bol pridaný pyridín (212 ml) a následne acetanhydrid (106 ml, 1,12 mol). Zmes bola najprv pretrepávaná ručne na podporu rozpúšťania, ale akonáhle sa nasadila exotermná reakcia,

1.0024 rozpúšťanie miešanie. Po CHCI3 MeOH ktorá Roztok a miešaný 15 Roztok bol pokračovalo a potom sa používalo magnetické miešaní cez noc (asi 18 hodín), TLC v 20 - 1 ukazovala prevahu jednej UV aktívnej škrvny, sa pohybovala rovnako ako autentická zlúčenina 5. bol ochladený na 0°C, spracovaný s 32 ml H2O minút kvôli hydrolýze prebytku acetanhydridu. potom zriedený na 1000 ml dichlórmetánom a premytý (3 x 1000 ml) 2 N HC1, (3 x 1000 ml) nasýteným NalICCte a (1 x 1000 ml) nasýteným NaCl. Organický roztok bol vysušený (MgSOzj), sf iltrovaný produkt. Potom sa ukazovala zmes približne 1 produkt bol rozpustený (30 ml) a nasadenie potom vysušený (MgSOzj), sf iltrovaný a skoncentrovaný na surový produkt. Potom sa vykonala ¹H-NMR v CDCI3, ktorá : 1 ä- a (3-anomérov. Tento surový v minimálnom množstve metanolu kryštalizácie bolo záležitosťou niekoľkých minút. Po ponechaní pri izbovej teplote po niekoľkých hodinách sa pevný podiel zobral filtráciou a bol premytý ľadovo chladným metanolom. Po vysušení na vzduchu sa

produkt,	zlúčení]	ia 5,	získal	(5,6 g,	10,4 percent)	ako biely
prášok.	iH-	NMR	(300	MHz,	δ v	ppm vzhľadom	k CHCI3)
7,90 - 7	.70	(m,	4H) ,	6,50	(d, J	= 8 Hz, 1H),	5,83 (dd,
J = 10,5	Hz,	J =	8 Hz	1H),	5,36 (d	, J = 3,5 Hz,	1H), 5,15
( dd, J	= 8	Hz,	J =	10,5	Hz, 1H)	, 4,97 (dd,	J = 10 Hz,
J = 3,5	Hz,	1H) ,	4,56	- 3,83	(m, 9H)	, 2,20 - 1,90	(7s, 21H).

Príklad 5

Konverzia 1,3,6-tri-0-acety1-2-desoxy-2-ftalimido-4-0(2,3,4,6-tetra-0-acety1-)-β-D-galaktopyranozy1)-p-Dglukopyranozidu na zlúčeninu 5

Matečný lúh, obsahujúci <x-acetát z kryštalizácie spomínanej zlúčeniny 5, bol skoncentrovaný do peny a rozpustený v DMF (110 ml). Tento roztok bol miešaný pod argónom pri 55°C. Potom bol pridaný hydrazínium

10024 acetát ¢9,5 g, 104 mmol). Po 15 minútach ukázala TLC v 20 - 1 CHCI3 ^: MeOH úplnú stratu východzieho materiálu a ukázala sa nová škrvna s nižším Rf. Reakčná zmes bola ochladená na izbovú teplotu a zriedená na 1000 ml etylacetátom. Roztok bol potom premytý ¢2 x 1000 ml) H2O a Cl x 1000 ml) nasýteným NaCl. Organický roztok bol vysušený (MgSO^), sfiltrovaný a skoncentrovaný.

Surový koncentrovaný produkt bol rozpustený v pyridíne, 50 ml, a spracovaný acetanhydridom (25 ml). Po miešaní cez noc (asi 18 hodín), TLC v 20 1 CHCI3 ^: MeOH ukazovala prevahu jednej UV aktívnej skrvny, ktorá sa pohybovala rovnako ako autentická zlúčenina 5. Roztok bol ochladený na 0°C, spracovaný so 7,5 ml H2O a miešaný 15 minút kvôli hydrolýze prebytku acetanhydridu. Roztok bol potom zriedený na 250 ml dichlórmetánom a premytý (3 x 250 ml) 2 N HC1, (3 x 250 ml) nasýteným NaHC03 a (1 x 250 ml) nasýteným NaCl. Organický roztok bol potom vysušený (MgSO-a), sfiltrovaný a koncentrovaný na surový produkt. Surový produkt bol potom rozpustený v minimálnom množstve metanolu a znova prebehla kryštalizácia. Po niekoľkých hodinách bola izolovaná pevná zlúčenina 5 ako predtým, za poskytnutia ďalšieho podielu produktu (4,4 g, 8,3 percent) ako bieleho prášku. Celkový výťažok zlúčeniny 5 vo dvoch podieloch bol 18,7 percent, 10 g.

Príklad 5A

ZUternatívna príprava zlúčeniny 5 z laktulózy

Ä. Laktulózo aminoglykozid (zlúčenina IA)

300-mi11 i itrový antikorový autokláv, obsahujúci miešadlo, laktulózu (17,1 g, 50 mmolé a octan amónny

10024 ¢3,85 g. 50 mmol) bol ochladený na -78°C a potom bolo do neho pridané 80 ml kvapalného čpavku. Autokláv bol uzatvorený a ponechaný miešaním sa zahriať na izbovú teplotu. Keď autokláv dosiahol izbovú teplotu, bol umiestnený do olejového kúpeľa a zahrievaný na 35°C počas 24 hodín. Autokláv bol potom ochladený na izbovú teplotu a opatrne vyvetraný do ovzdušia. Akonáhle všetok čpavok zmizol, približne za 2 hodiny, celý autokláv bol umiestnený do vákuového exikátora obsahujúceho oxid fosforečný a bol opatrne vystavený vákuu. Po udržiavaní vo vákuu cez noc sa stala z obsahu autoklávu svetložltá pena. Zlúčenina bola dosť hygroskopická a bola rýchlo vybratá z autoklávu a daná do uzavretej nádobky. Tento materiál bol použitý ako surový v nasledujúcom kroku.

B. Laktózam í n acetát. (zlúčenina 2A)

Laktulózo 10 mmol) bol a miešaný pri aminoglykozid (zlúčenina rozpustený v 100 ml izbovej teplote pod pridaná ľadová kyselina octová (572

10) (3,41 g, bezvodého metanolu argónom. Potom bola μΐ, 10 mmol)hodinách bol žltý roztok skoncentrovaný do peny,

Po 24 ktorá obsahovala laktózamóniovú acetátovú soľ ako 1 : 1 zmes aa ŕJ-anomérov.

Zreteľné boli dva ďalšie produkty, o ktorých sa súdilo, že sú a plus b anoméry ga1aktopyranozy1 mannozamínu. Tento produkt bol použitý ako surový v nasledujúcom kroku.

Zlúčenina 5 bola potom pripravená zo zlúčeniny 2A pri získaného v kroku b, postupom 1/7 - 1/10. Acetón použitého pri

Finálne vytvorený peracetyl fta1amid bol pripravený vo výťažku 3,8 percent, ktorý použití surového materiálu v príklade 4 v mierke asi jednu tretinu rozpúšťadla polokyseliny.

(zlúčenina 5) tvoril asi príprave fta1amid bol braný na laktulózu, s tým, že nebola snaha získať druhý

10024 podiel kryštálov.

Príklad 6 l-Chlór-3,6-d i-0-acety1-2-dezoxy-2-ftalimido-4-0-(2,3, 4,6-tet.ra-0-acety 1 -β-D-galaktopyranozy 1 )-£-D-glukopyranozid (zlúčenina 6)

Anomérický acetát. (zlúčenina 5) (3,3 g, 4,3 mmol) bol miešaný v 43 ml suchého CH2CI2 pri izbovej teplote pod argónom. Potom bol pridaný chlorid hlinitý (2,9 g, 21,5 mmol) v pevnej forme. Po 40 minútach bola zmes spláchnutá do deličky na objem 400 ml 1 - 1 zmesi CH2CI2 ^: H2O. Zmes bola pretrepaná, vodná vrstva odstránená a organický roztok bol premytý 2 x 200 ml H2O a 3 x 200 ml nasýteného roztoku NaHCCto - Svetlo žltý roztok bol potom vysušený (MgSCka), sfiltrovaný a skoncentrovaný na svetlo žltý prášok (3,2 g, 100 percent). Tento materiál bol potom použitý na kondenzáciu v príklade 7.

Príklad 7

Etyl β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 7)

Roztok 2,3,4,6-tet-ra-0-acety 1 -galaktózy 1 bróm i du (2,5 kg) v dichlórmetáne (4 1) bol pridaný rýchlosťou 20 - 25 ml/m i n do reaktorci obsahujúceho uhličitan strieborný (3,13 kg, 11,4 mol), 4 A molekulárne sitá (2,37 kg), dichlórmetán (16 1) a bezvodý etanol (4,0 1). Udržovalo sa miešanie poskytujúce prudké premiešavanie týchto reagentov. Dve hodiny po dosiahnutí úplného pridania roztoku bromidu ukázala TLC na silikagéli vyvíjanom zmesou 1=1. hexán =

10024 etylacetát., neprítomnosť bromidu. V tomto čase bola reakčná zmes sfiltrovaná cez vrstvu celitu (1 kg) a filtrát bol pod vákuom počas 17 J₃,4 = 3,7 Hz, H-4), 4,99 (1H, dd, H3) hodín. ¹H-NMR 5,17 (1H, dd, 4,46 (1H, d.

2,04, 1,95 (12H, 4s, OAc),

Rf = 0,6. Roztok bol IR-120 (H⁺) živice odparený pri 30 - 35°0 (CDCI3) 6: 5,36 (1H, d,

J2.3 = 11,0 Hz, H-2), •J 1 „ 2 = 8,3 Hz, H-l), 2,15, 2,05,

1,21 (3H, t, OCH2CH3).

Surový etyl tetraacetyl galaktopyranozid (1,95 kg) bol rozpustený v bezvodom metanole (11,7 1) a po kvapkách bol pridaný 25-percentný roztok metoxidu sodného v metanole (90 ml)- Roztok bol miešaný 1 hodinu a v tomto čase ukázala TLC na silikagéli vyvíjanom zmesou etylacetát metanol, 1 - 2, neprítomnosť východzieho materiálu. Produkt mal neutrál izovaný pridaním Amberlitovej (0,6 kg) a miešaním. Keď mal roztok pH =6-7 živica bola odstránená filtráciou a filtrát bol odparený vo vákuu na získanie svetložltej pevnej látky. Táto pevná látka bola ponechaná ochladiť sa na 25°C a potom ochladená na 0°C na dosiahnutie bielej zrazeniny. Filtrácia tejto pevnej látky dala etyl p-D-galaktopyranozid, zlúčeninu 7, (0,851 kg). ^H-NMR (D₂0) S: 4,38 (1H, d,

Ji,2 = 8,0 Hz, H-l), 3,89 (1H, bd, J₃.4 = 3,7 Hz, H-4), 1,2 (3H, t, OCH2CH3).

Príklad 8

Etyl 4,6-0-benzy1idén-p-D-galaktopyranozid (zlúčenina 8)

Etyl (2-D-galaktopyranozid (zlúčenina 7) (0,851 kg, 4,09 mmol) bol daný do 20 litrovej banky rotačnej vákuovej odparky s toluénsulfónovou kyselinou (1,5 g, 7,9 mmol). Banka odparky bola pripevnená na odparku a prisaním bol pridaný dimetylacetal benzaldehydu (1,23 1, 8,18 mmol). Banka so zmesou bola 4 hodiny nechaná rotovať. Medzi 30

10024 a 40 minútami po pridaní acetalu bolo dosiahnuté takmer úplné rozpustenie, rýchlo nasledované tvorbou ťažkej zrazeniny. V rotácii sa pokračovalo ešte 4 hodiny a v tomto čase bol pridaný trietylamín (1,5 1) na neutralizáciu reakčnej zmesi. Bolo nasadené vákuum a rozpúšťadlo odstránené za získania pevnej hmoty. Do banky bol pridaný hexán (61) a banka so zmesou bola nechaná rotovať počas 0,5 hodiny. Výsledná pevná látka bola odfiltrovaná a premytá na filtri zmesou hexán - etylester 1:1 (2 1). Takto získaná biela pevná látka bola vysušená pod vákuom 17 hodín za poskytnutia čistého etyl 4, 6-0-benzy 1 idén-(X-D-galaktopyranozid (zlúčeniny 8) vo výťažku 83 percent. ^H-NMR (CDCI3) 6: 7,53 (2H, m, aromát), 7,37 (3H, m, aromát), 5,57 (1H, s, CHPh), 4,29 (1H, d,

H-l), 4,21 (1H, d, J1.4 = 3,27 Hz, H-4)

OCH2 CH3).

Jl.2 = 7,0 Hz, 1,29 (3H, t,

Príklad 9

Etyl 2-0-benzoy1-4,6-0-benzy1idén-p-D-galaktopyranozid (zlúčenina 9)

Etyl 4,6-0-benzy1idén-0-D-galaktopyranozid (zlúčenina 9) (0,924 kg, 3,12 mol) bol daný do 20 litrového reaktora vybaveného vzduchovým pohonom, prikvapkávajúcou nálevkou s vyrovnávacom tlaku a s prívodom plynu, chladiacim kúpeľom a odvodom plynu. Pred uzavretím banky bol pridaný dichlórmetán (9,3 1) a pyridín (2 1), čo poskytlo homogénny roztok. Prikvapkávajúca nálevka bola naplnená chlóracetylchloridom (0,388 kg, 3,43 mol, 273 ml) ako 60-percentný roztok v dichlórmetáne. Banka bola uzavretá a bol nasadený slabý prúd suchého dusíka. Kúpeľ bol ochladený na -65°C + 5°C a reakčná zmes bola miešaná 30 minút. V tomto čase sa začal pridávať acylchlorid po

10024 kvapkách s rýchlosťou 3 - 4 ml za minútu. Reakčná zmes bola ponechaná ohriať sa na Izbovú teplotu a bola tak ponechaná 17 hodín. Reakčná zmes bola sfiltrovaná na odstránenie vyzrážaných solí a filtrát bol skoncentrovaný vo vákuu na odstránenie väčšiny dichlórmetánu. Malá vzorka sa dala nabok pre ¹H-NMR. ¹H-NMR (CDCI3> 5,75 (1H, dd, J₂,3 = 10,6 Hz, H-2), 5,56 (1H, s, CHPh), 5,25 (1H, dd, Ji.4 = 3,44 Hz, H-3), 4,69 (1H, d, Ji,2 = 8,4 Hz, H-l), 1,15 (3H, t, 0CH₂ CH₃).

Ku koncentrátu bola pridaná voda (180 ml) a výsledná zmes bola premiešavaná počas 2 hodín pri 40°C- V tomto čase bola zmes ďalej skoncentrovaná, pričom poskytla žltý zvyšok, ktorý bol rozpustený v dichlórmetáne (11 1) a bol prenesený do 50-litrového extraktora. Organický roztok bol postupne extrahovaný ľadovo chladnou vodnou 0,5 N HC1 (11 1), vodným nasýteným roztokom hydrogénuh1 ičitanú sodného (11 1) a chladnou vodou (11 1). Organická vrstva bola vysušená nad bezvodým síranom sodným, sfiltrovaná a filtrát bol odparený, pričom poskytol žltú pevnú látku, ktorá bola vysušená pod vysokým vákuom. Táto reakcia bola sledovaná TLC na silikagéli vyvíjanom zmesou 1 - 1, hexán : etylacetát. Táto pevná látka bola rozpustená v horúcom etanole (9,5 1), čo po ochladení poskytlo etyl 2-0-benzoy1-4,6-0-benzy1idén-p-Dgalaktopyranozid, zlúčeninu 9, (0,737 kg, 1,85 mol) vo výťažku 53 percent.. ¹H-NMR (CDCI3) 5,59 (1H, s, CHPh), 5,36 (1H, dd, J₂.3 = 10,07 Hz, H-2), 4,64 (1H, dd, Ji,2 = 8,21 Hz, H-l), 1,15 (3H, t, OCH2CH3)Pre potvrdenie, že benzoát bol na C-2 a že C-3 niesol voľný hydroxid bola k nmr vzorke pridaná kvapka trichlóracetyl izokyanátu a spektrum bolo premerané. Toto spektrum obsahovalo dublet. slabého poľa dubletov pri 6 = 5,27 typickom pre H-3 galaktózu, ktorá je esterifikovaná na C-3. Pôvodný filtrát získaný z reakčnej zmesi obsahoval ďalšie množstvo produktu.

10024

Príklad 10

Etyl (β-D-galaktopyranozy1 )-(l-4)-0-(2-N-al lyloxykarbonyl -2-dezoxy-<3-D-glukopyranozy 1 )-(1-3) -Ο-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 10)

K zmesi etyl 2-0-benzoy1-4,6-0-benzy1idén-p-D-galaktopyranozidu, zlúčeniny 9, (0,76 g, 1,9 mmol), 4 A molekulárnych sít (2 g), dichlórmetánu (10 ml), kolidínu (0,278 ml, 2,1 mmol) a trifluórmetánsulfonátu strieborného (0,522 g, 2 mmol) ochladenej na -25°C bol pridaný po kvapkách roztok l-chlór-3,6-di-0-acety1-2-dezoxy-2-ftalimido -4-0-(2,3,4,6-t-etra-0-acety 1 -β-D-galaktopyranozy 1) -β-D-gluko pyranozidu (zlúčeniny 6: 1,484 g, 2 mmol) rozpusteného v

Výsledná dichlórmetáne (5 ml), chloridu bola miešaná a 2 hodinách bola zmes Filtrát bol premytý sodným, vodnou kyselinou hydrogenuh1ičitanom sodným a vrstva bola vysušená nad zmes po úplnom pridaní zahriata na laboratórnu teplotu. Po zriedená dichlórmetánom a sfiltrovaná. postupne vodným hydrogensíričitanom chlorovodíkovou, vodným nakoniec vodou. Organická bezvodým sfiltrovaná a odparená, pričom poskytla síranom sodným, pevnú hmotu, ktorá bola rekryštalizovaná z dichlórmetánu - hexánu

Na výsledný plne pôsobilo 80-percentnou 80°C počas 2 hodín odstránené odparením, s toulénom-etylacetátom blokovaný trisacharld vodnou kyselinou octovou a v tomto čase bolo

Zbytok bol dvakrát spoluodparovaný a poskytol zvyšok, ktorý bol (0,66 g) sa (5 ml) pri rozpúšťadlo rozpustený v etanole (10 ml). Bol pridaný hydrát hydrazínu (0,3 ml) a výsledná zmes bola refluxovaná počas 17 hodín na poskytnutie precipitátu, ktorý bol sfiltrovaný a po vysušení pevná látka bola a pôsobilo sa na poskytol pevnú látku (0,45 g). Táto rozpustená v zmesi metanol - voda, 5 : 1 ňu diallylpyrokarbonátom (0,166 ml) počas 1 hodiny. Výsledná zmes bola odparená a roztrepaná medzi dichlórmetán a vodu.

10024

Vodná vrstva bola oddelená a skoncentrovaná, pričom poskytla zlúčeninu 10 ako zvyšok, ktorý stuhol trituráciou s etylacetátom ' acetónom, 2 1.

Toto poskytlo titulný trisacharid (zlúčeninu 10), ktorý bol enzymaticky sialylovaný na na poskytnutie etyl [nátrium (5-acetamido-3,5-didezoxy-a!-D-glycero-D-galakto-noniilopyrano -zylát)] -(2,3)-0-(β-D-galaktopyranozy1 )-(1-4)-0-(2-N-allyloxykarbony 1 -2-dezoxy-(3-D-gal aktopyranozy l)-(l-3)-0-(S-Dgalaktopyranozidu (zlúčeniny 11) , ktorá bola identická so zlúčeninou vytvorenou nasledujúcim postupom.

Príklad 11

Etyl [nátrium (5-acetamido-3,5-didezoxy-<z-D-glycero-Dgalakto-nonulopyranozylát)]-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranozy 1)-(1,4)-0-(2-N-al ly 1 oxykarbony 1 - 2-dezoxy-(J-D-gl ukopyranozy1)-(l,3)-Ο-β-D-galaktopyranozidu (zlúčeniny 11)

Nasledujúce opisuje enzymatickú konverziu disacharidu (zlúčeniny 9) na produkciu titulnej zlúčeniny (zlúčeniny 11) s použitím galaktózyltransferázy a sialyltransferázy.

K vode (12 1) bola pridaná kyselina N-[2-hydroxyety1] piperazín-N'-[2-etánsu1 fónová] (0,140 kg) a pH roztoku bolo nastavené na 7,5. Bol pridaný bovinný sérový albumín (17 g) a zmes bola miešaná, až kým nedošlo k úplnému rozpusteniu. Boli pridané etyl 3-0-(2-N-allyloxykarbonyl-2-amino2-dezoxy-(3-D-glukopyranozy 1 )-p-D-galaktopyranozid (zlúčenina 9) (0,3 kg), glukózo-l-fosfát (0,271 kg), fosfoenolpyruvát (0,177 kg), chlorid draselný (0,087 kg), azid sodný (8,4 g) a uridín-5’-difosfát (8,76 g) a výsledná zmes bola miešaná pokiaľ sa všetky pevné látky nerozpustili. Potom bol pridaný chlorid mangánatý (1 M, 506 ml) a chlorid horečnatý (1 M, 168 ml). Potom boli pridané pyruvátkináza (42 000 U), uridín-5’-difosfát-glykozopyrofosforyláza

10024 (2 000 U), anorganická pyrofosfatáza (8 400 U), uridín-5'sledovaná i zopropanol a uridín

Konečný objem na 17 1. Po 48 hodinách 340 ml). Reakcia bola vyvíjanom zmesou 1. Po 8-9 dňoch TLC difosfát-galaktózoepimeráza (42 000 U)

-5’ -difosfát.-galaktozyltransf eráza (8 850 U) reakčnej zmesi bol upravený vodou bol pridaný chlorid horečnatý (1 M,

TLC na silikagéli

M octan amónny, 4 :

ukázala, že reakcia prebehla z > 95 percent a v tomto čase bol pripravený nasledujúci roztok.

Bol pripravený roztok kyseliny N-[2-hydroxyetyl]piperazín-N’-[2-etánsulfónovejl (0,528 kg) vo vode (15 1) a pH výsledného roztoku bolo nastavené na 7,5. Pridali sa bovinný sérový albumín (22 g), azid sodný (11,5 g), kyselina sialová f os f oeno1pyruvát (0,242 g),

-5’monofosfát (0,395 kg).

(25 g) adenozín-5’-trifosfát cytidín(4,7 g) a chlorid mangánatý (1 M, 780 ml). K tomuto roztoku boli pridané pyruvátkináza (207 000 U), myokináza (125 000 U), cytidín-5'-monofosfát-N-acetylneuraminát-syntetáza (3 245

U), anorganická pyrofosfatáza (9 400 U) a a-2,3sialyltransferáza (1 640 U). Objem tejto zmesi bol upravený na 22 1 a tento roztok bol pridaný ku galaktozyltransferáReakcia bola sledovaná TLC na silikagéli zovej reakcii, vyvíjanom zmesou 10 - 12 dňoch izopropanol TLC ukázala,

M octan amónny, 4 ' 1. Po že reakcia prebehla, pričom poskytla > 95 percent titulnej zlúčeniny, zlúčeniny 11.

Príklad 12

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-d idezoxy-4,7,8,9-t.etra -0-acety1-a-D-glycero-D-ga1akto-nonulopyranozylát)](2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acetyl-β-D-ga1aktopyranozyl)-(1,4) -0-(3,6-di-0-acety1-2-N-allyloxykarbonyl-2-dezoxy-£-Dglukopyranozy 1 )-(1,3)-0-2,4,6-tri -0-acety 1 -(J-D-ga 1 ak topyranozid (zlúčenina 12)

10024

Roztok (40 1) etyl [nátrium (5-acetamido-3,5-didezoxy-α-D-glycero-D-galakto-nonulopyranozylát)] -(2,3)-0-((J-Dgalaktopyranozy 1 )-(l-4)-0-(2-N-al lyloxykarbonyl-2-dezoxy-(3D-galaktopyranozy1)-(1-3)-Ο-β-D-galaktopyranozidu (zlúčeniny 11) bol sfiltrovaný cez papier. Filtrát bol odparený na hustý sirup v 50 1 rotačnej odparovačke. Sirup bol dvakrát spoluodparený s pyridínom (2x2 1) a potom bol držaný pod vákuom počas 20 hodín. Do odparovacej banky bol naplnený roztok N,N-dimetylaminopyridínu (20 g) v pyridíne (12 1). Kúpeľ rotačnej odparovačky bol naplnený zmesou voda-ľad a rotácia pokračovala, keď sa pridával počas 1 hodiny acetanhydrid (2 1); výsledná zmes bola ponechaná pomaly rotovať 20 hodín pri izbovej teplote. Pre zaistenie úplnej acetylácie sa pridal acetanhydrid (11) a zmes bola ponechaná rotovať ďalších 24 hodín. Zmes bola kontrolovaná TLC (etylacetát : hexán ^: etanol, 10 10 : 3).

Po úplnej reakcii bolo nasadené vákuum a zobralo sa 14 1 destilátu. K výslednému zvyšku bol pridaný v priebehu 1 hodiny metanol (15 1) a zmes bola nechaná rotovať 20 hodín pri izbovej teplote. TLC na silikagéli (dichlórmetán acetón, 3 2) ukázala úplnú acetyláciu, s produktom pohybujúcim séi trochu rýchlejšie.

Bol pridaný metanol (11) k rozkladu prebytku acetanhydridu, čo bolo pozorovateľne exotermné. Po 1 hodine bola zmes skoncentrovaná na sirup, ktorý bol pomocou zmesi etylacetát-voda (13 1/13 1) prenesený do 50 1 extraktora. Zmes bola prudko premiešaná. Po oddelení fáz bola spodná vodná vrstva odtiahnutá a ostávajúca organická vrstva bola sfiltrovaná cez papier. Filtrát bol premytý 5-percentnou vodnou kyselinou chlorovodíkovou (15 1, vodná vrstva musí zostať po premytí silne kyslá na pH papierik) a vodným 1 M hydrogénuhličitanom sodným (15 1, vodná vrstva musí zostať po premytí alkalická na ph papierik). Organická vrstva bola potom prenesená do 20 1 nádoby, vysušená nad bezvodým síranom sodným a sfiltrovaná.

Filtrát bol skoncentrovaný na polotuhý zvyšok. Tento

10024 zvyšok bol rozpustený v dichlórmetáne (31) a bol nanesený na kolónu silikagélu (10 kg) pripravenú v dichlórmetáne.

(25 1), potom zmesou 3 - 1 a konečne zmesou 1 = 1 poskytla frakciu obsahujúcu

Elúčia najprv dichlórmetán dichlórmetán produkt. Bolo d i ch1órmetánom acetón (25 1) acetón (50 1) odfiltrovaná a premytá na vzduchu cez noc a dosiahnuté oddelenie disacharidu po základnú Čiaru, ale veľmi málo boli oddelené stopy trochu rýchlejšie sa pohybujúceho materiálu. Frakcie obsahujúce produkt boli odparené a znovu rozpustené v dichlórmetáne (1,5 1). Tento roztok bol pomaly pridaný k prudko miešanej zmesi etyléteru (7,5 1) a hexánu (10 1). Výsledná zrazenina bola zmesou éter hexán, 2 - 1, vysušená potom bola sušená vo vysokom vákuu počas 48 hodín. Precipitát sa ukázal byt titulnou zlúčeninou 13 podľa ¹H-NMR a obsahoval malé množstvo rozpúšťadla (1-5 percent, hmotnost/hmotnost). ^H-NMR (CDCla) δ, 1H, H-ľ ' ) , 4,49 (d, 1H, H-ľ ) , 4,33 (d, 1H, H-l).

Príklad 13

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra -0-acety 1 - ce-D-glycero-D-galakto-nonulopyranozy lát) ] (2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozyl)-(1,4) -0-(2-amino-2-dezoxy-3,6-di-0-acety1-β-D-glukopyranozy 1 )-(1,3)-0-2,4,6-tri -0-acety 1 -<3-D-ga lak topyra noži d (zlúčenina 13)

K miešanému roztoku etyl [metyl (5-acetamido-3,5d i dezoxy-4,7,8,9-tetra-0-acety1-a-D-glycero-D-ga1akto-2nonulopyranozy lát) 1 - (2,3)-0-(2,4,6-tr i -0-acety 1 - (3-D-galaktopyranozyl)-(1-4)-0-(3,6-di-0-acety1-2-N-a1lyloxykarbonyl-2dezoxy-(3-D-galaktopyranozy 1 )-(1-3)-0-2,4,6-tr i -0-acety 1 -β-Dgalaktopyranozidu (zlúčeniny 12) (5,10 g, 3,80 mmol) v bezvodom THF pod argónom bol pri izbovej teplote pridaný

10024 polymetylhydroziloxan (420 pl). Reakčná zmes bola podrobená trikrát, vákuovému čistiacemu cyklu s argónom na odplynenie roztoku. Banka bola zabalená roztoku pred svetlom a na do hliníkovej fólie na ochranu roztok bolo pôsobené paládium t-etrakistrif enylfosf inom [Pd(Ph3)<i : 158 mg, 0,14 mmol]. Po miešaní počas 18 hodín pri izbovej teplote ukazovala TLC v zmesi 10 1 CHCI3 MeOH úplné spotrebovanie zlúčeniny 12 a jediný produkt s nižším Rf. Reakčná zmes bola zriedená 60 ml Et-OAc a premytá 2 x 200 ml H2O a 1 x 200 ml nasýteného Organický roztok bol skoncentrovaný roztoku NaCl sf i lt-rovaný, na a chromatografovaný na kolóne silikagélu 65 mm x 10’’ s použitím EtOÄc - acetónu, 3 = Frakcie obsahujúce produkt (podľa TLC) vysušený (MgSCM), rotačnej odparke o rozmeroch 1, ako eluát.

boli spojené a skoncentrované, pričom poskytli zlúčeninu 13 (4,42 g, 87 percent) ako nahnedlú pevnú látku. ¹H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhľadom na CHCI3) 5,50 (m, 1H), 5,44 (dd,

J = 6 Hz, J = 2

Hz, 1H), 5,35 - 5,01 (m), 4,89 (m, 2H), 4,63 (d, J = 6 Hz,

1H), 4,59 - 4,35 (m), 4,22 - 3,38 (m) (m, 1H). 5,36 (d, J = 3,5 Hz, 1H) J = 10,5 Hz, 1H). 2,57 (dd, J = 3 Hz, (t, J = 5 Hz, 3H).

3,81 (s, 3H), 2,69

5,15 (dd, J = 8 Hz,

J = 10 Hz, 1H), 1,21

Príklad 14

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra-0-acety1-a-D-glycero-D-galakto-nonulopyranozylát)1 (2.3) -0-(2,4,6-tri-0-acety1-β-D-ga1aktopyranozy1)-(1,4) -0-(2-amino-2-dezoxy-6-0-acety1-β-D-g1ukopyranozy1)(1.3) -0-2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 14)

K miešanému roztoku zlúčeniny 13 (4,42 g, 3,29 mmol) v 366 ml 4 - 1 MeOH - H2O v uzavretej banke bola pridaná pri

10024 izbovej teplote ľadová kyselina octová (188 jjI Svetlo žltý roztok bol potom zahriaty na hodinách ukazovala TLC v zmesi 10 : 1 CHCI3 úplné zmiznutie zlúčeniny 13 a objavenie sa prevažujúceho

3,29 mmol). 50°C. Po 48

MeOH skoro produktu s vyšším Rf. Reakčná zmes bola ochladená na izbovú teplotu, skoncentrovaná a chromatografovaná na 65 mm x 10’’ s použitím na rotačnej odparovačke na olej kolóne silikagélu s rozmermi

- 10 : 4 zmesi EtOAc hexán MeOH ako eluátu. Frakcie obsahujúce produkt (podľa TLC) boli spojené a skoncentrované, pričom poskytli zlúčeninu 14 (2,78 g, 65 percent) ako penu. ¹H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhľadom na CHCI3) 5,50 (m, 1H), 5,40 (dd, J = 2 Hz, 1H),

5.25 (d, J = 7 Hz, 1H), 5,17 (dd, J = 6 Hz, J = 7 Hz, 1H), 5,04 (dd, J = 6 Hz, J = 7 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 3 Hz, 1H),

4,63 (d, J = 6 Hz, 1H), 4,59 (dd, J = 3 Hz, J = 7 Hz, 1H),

4,42 - 3,40 (m), 3,81 (s, 3H), 2,69 (m, 1H), 2,57 (dd,

J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H), 2,27 - 1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd,

J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,21 (t, J = 5 Hz, 3H).

Príklad 15

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra -0-acety 1 - <z-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozy lát) ] (2.3)-0-(2,4,6-tri -0-acety 1 -(3-D-gal aktopyranozy 1)-(1,4) -0-(2-benzamido-2-dezoxy-6-0-acety1-β-D-glukopyranozy1) -(1,3)-0-2,4,6-tr i - 0-acety 1 - (3-D-gal ak topyranoz i d (zlúčenina 15)

K miešanému roztoku zlúčeniny 14 (150 mg, 0,12 mmol) v 2 ml dichlórmetánu pri izbovej teplote pod argónovou atmosférou bol pridaný bezvodý NaHC03 (40 mg, 0,48 mmol) a benzoylchlorid (34 mg, 0,24 mmol, 28 pl). Po miešaní počas 24 hodín ukazovala TLC v zmesi 80 : 10 EtOAc - acetón skoro úplné zmiznutie východzieho materiálu a objavenie sa

10024 materiálu s etylacetátu vysušený vyšším Rf a premytá (MgSO^) .

a chromatografovaný na kolóne

Reakčná zmes bola zriedená 150 ml 1 x 50 ml H2O- Organický roztok bol sfilt-rovaný, skoncentrovaný silikagélu s použitím 90

EtOAc ^: acetónu ako eluátu. (podľa TLC) boli spojené a potom vo vysokom vákuu

Frakcie obsahujúce skoncentrované na produkt rotačnej odparovačke a

pevnú látku,	zlúčeninu	15
(300	MHz, δ v	ppm vzhľadom
2H) ,	7,45 (d,	J = 7 Hz,	1H)
2H) ,	6,45 (d.	J = 5 Hz,	1H)
Hz,	1H), 5,37	(d, J =	2 Hz
1H) ,	4,82 (d,	J = 3 Hz,	1H)
(dd,	J = 3 Hz,	J = 7 Hz,	1H)
3,19	(m, 1H), 2,57	(dd
2,27	- 1,85 (12s, 36H)	, 1
1H) ,	1,21 (t,	J = 5 Hz,	3H) .

na voskovitú pastóznu

(140 mg,	85	percent).	1H-NMR
na CHC.13 )	7	,75 (d,	J =	7 Hz,
7,39	(dd,	J	= 7 HZ,	J =	7 Hz,
5,50	(m,	1H), 5,40	(d,	J = 2
1H) ,	5,27		(m, 1H),	5,	09 (m,
4,63	(d,	J	= 6 Hz,	1H)	, 4,59
4,3	- 3,40	(m). 3,81 (s	, 3H) ,
J =	3 Hz		J = 10	Hz,	1H) ,

(dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz,

Príklad 16

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra -O-acetyl-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát)](2.3) -0-(2,4,6-t.r i -0-acety 1 - β-D-galaktopyranozyl) (1.4) -0-(2,3,4-tri-0-benzyl-α-L-fukopyranozy1)-(1,3)10-(2-benzamido-2-dezoxy-3,6-di-0-acety1-β-D-g1ukopyranozy 1)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 16)

K miešanému roztoku zlúčeniny 15 (140 mg, 0,1 mmol) v 1 ml dichlórmetánu pri izbovej teplote pod argónovou atmosférou boli pridané práškované, plameňom sušené 4 A molekulárne sitá (100 mg), tetrametylmočovina (120 pl, 1 mmol) a tri-0-benzy1fukozy1ch 1orid (218 mg, 0,5 mmol). Po miešaní počas 1 hodiny pri izbovej teplote bola reakcia

10024 ochladená na -20°C a spracovaná s SnCl2 <95 mg, 0,5 mmol) a AgC104 <126 mg, 0,5 mmol). Reakčná zmes bola ponechaná pomaly sa otepliť. na izbovú teplotu. Po miešaní počas 24 hodín ukazovala TLC v zmesi 10 = 1 CHCI3 ^: MeOH skoro úplné zmiznutie východzieho materiálu a objavenie s,a materiálu s o niečo nižším Rf .

Reakčná zmes bola sfilt-rovaná cez vrstvu celitu s 50 ml dichlórmetánu a filtrat bol premytý 2 x 50 ml H2O. Organický roztok bol vysušený a chromatografovaný mm x 6^J EtOAc (podľa pri (MgSO^), prefi 1trovaný, skoncentrovaný na kolóne silikagélu o rozmeroch použití 10 - 10 3 zmesi hexán :MeOH ako eluátu. Frakcie obsahujúce produkt TLC) boli spojené a skoncentrované na rotačnej odparovačke a potom vo vysokom vákuu na biely film, zlúčeninu 16 (140 mg, 77 percent). ^^H-NMR <300 MHz, 6 v ppm vzhľadom na CHCI3) 7,46 (d, J = 7 Hz, 2H), 7,35 - 7,12 (m, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,20 (m, 1H),

1H), 1,18 (d, J = 6 Hz, 3H),

6,45 (d, J = 6 Hz,

2,55 (dd, J = 4 Hz, J = 12 Hz, 1,10 (t, J = 6 Hz, 3H).

18H)

Príklad 17

Etyl (5-acetamido-3,5-d.idezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2 -nonulopyranozy lát) ] - (2,3)-0 - (fj-D-gal aktopyranozy 1 ) (l,4)-0-[ (<z-L-fukopyranozy1 )-(1,3)] -0-(2-benzamido-2dezoxy-p-D-glukopyranozy1 )-(1,3) -0-(3-D-galaktopyranozid (zlúčenina 17)

K miešanému roztoku zlúčeniny 16 (140 mg, 77 umol) v 4 ml metanolu bol pridaný hydroxid paládnatý na uhlí (140 mg, 20-percentný podľa hmotnosti paládia). Kašovitá zmes bola podrobená trikrát vákuovému čistiacemu cyklu s plynným vodíkom a potom bola držaná pod vodíkom pri tlaku jednej atmosféry pri izbovej teplote. Po 1 hodine TLC

10024

EtOAc : MeOH úplné zmiznutie jediného materiálu s nižším Rf. Zmes bola sfiltrovaná cez vrstvu celitu s 50 ml metanolu a skoncentrovaná na rotačnej odparke na olej.

Tento olej bol rozpustený v 5 ml 4 1 MeOH H2O a miešaný v uzavretej banke pri izbovej teplote. K miešanému bol pridaný práškový metoxid sodný (140 mg, hodinách TLC v 60 50 ^: 15 CaCl2 ukázala úplné zmiznutie ukazovala v zmesi 5 = 1 zlúčeniny 16 a objavenie sa roztoku 2,6 mmol). CHCL3 - MeOH

Po 16 15 mM východzieho materiálu a objavenie sa n ižš ím Rf.

Na túto zmes sa jediného produktu s pôsobilo 1 gramom katexovej živice Dowex 5x80-400 (vodíkovej formy, čerstvo premytej metanolom), s miešaním počas 1 minúty. Zmes bola sfiltrovaná cez nálevku s fritou a filtrát bol skoncentrovaný na rotačnej odparovačke na olej- Tento materiál bol chromatografovaný na kolóne rozmerov 40 mm x 8*' s médiom pre gélovú filtráciu Bio-Rad Bio-Gel P2 (jemné zrnenie) a použitím 1 M hydrogenuhl ičitanu amónneho ako eluát-u. Frakcie obsahujúce produkt (podľa TLC) boli spojené a lyofi 1izované na biely prášok, zlúčeninu 17 (60 mg, 72 percent). ¹H-NMR (300 MHz,

S v ppm J = 7 Hz

J = 4 Hz 1H) , vzhľadom na HOD) 7,70 (d, J = 7 Hz,

1H) , 1H) , 4,10 (d,

7,47 (dd, J = 7 Hz, J = 7 Hz,

4,50 (d, J J = 3 Hz,

J = 4,6 Hz, J = 12,4 Hz,

2H)

2H) = 8 Hz, 1H), 4,27 (d, 1H), 4,05 - 3,40 (m),

1H), 1,97 (s, 3H),

7,55 (d, 5,08 (d,

J = 8 Hz, 2,70 (dd.

J = 12,4 Hz, J = 12,4 Hz, 1H). 1,10 (t, J = 5 Hz (d, J = 7 Hz, 3H).

1,74

3H) (dd,

1,07

Príklad 18

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra -0-acety 1 -<z-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozy lát)] 73

10024 (2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acetyl-β-D-galaktopyranozy1)-(1,4)

-0-(2,3,4-tri -0-benzy 1 -at-L-f ukopyranozy 1 )-(1,3)1-0-(22^J naftamido-2-dezoxy-3,6-di-0-acety1-β-D-glukopyranozy 1)-(1,3)-0-2,4, 6-t.ri -0-acety 1 -β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 29)

K miešanému roztoku zlúčeniny 25 (pripravenej analogicky so zlúčeninou 16; 90 mg, 48 jjmol) v 5 ml metanolu bol pridaný hydroxid paládnatý na uhlí (40 mg, 40-percentný podľa hmotnosti paládia). Kašovitá zmes bola podrobená trikrát vákuovému čistiacemu cyklu s plynným vodíkom a potom bola držaná pod vodíkom pri tlaku 1 atmosféry pri izbovej teplote. Po 24 hodinách ukazovala TLC v zmesi 90 : 10 CH2CI2 - MeOH úplné zmiznutie zlúčeniny 25 a objavenie sa jediného materiálu s nižším Rf. Zmes bola sfiltrovaná cez vrstvu celit-u s 50 ml metanolu a skoncentrovaná na rotačnej odparovačke na voskovitú pastóznu pevnú látku. Tento produkt bol spracovaný na kolóne silikagélu s použitím zmesi 90 : 10 CH2CI2 ^: MeOH ako eluátu. Frakcie obsahujúce produkt (podľa TLC) boli spojené a skoncentrované na poskytnutie zlúčeniny vzhľadom 7,82 (m, (55 mg, 72 &) na CHCI3) 8,39 (s,

2H), 7,57 (m. 2H)

3H), 5,22 (d, J = 7 Hz, 1H), J = 4 Hz

4,35 (d, J = 4 Hz, 2H) (m, 1H), 2,75 (bs, 1H), 2,27 - 1,85 (12s, 36H)

4,19 - 3,42 ¹H-NMR (300 MHz, δ v ppm 1H), 7,94 (d, J = 7 Hz, 1H),

7,37 (m, 1H), 5,57 - 5,41 (m,

5,15 (m, 1H), 4,87 - 4,39 (m), (m), 3,81 (s, 3H), 3,23

2,57 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, 1H),

1,77 (dd_:

J = 10 Hz, J = 10 Hz, 5 Hz, 3H), 1,05 (d, J = 7 Hz, 3H).

podstate podobných tým, ktoré sú v schéme 3 pre konverziu 16 a 17, boli pripravené tiež 1, 2 a 3

1H), 1,23 (d, J

Pri sledovaní postupov v sú rozoberané vyššie, a ako zlúčeniny 14 na zlúčeniny 15., zlúčeniny 18 - 38. Tabuľky ďalej ukazujú zovšeobecnené štruktúry pre skupiny zlúčenín zodpovedajúcich zlúčeninám 15, 16 alebo 17 a poskytujú patričné dáta pre každú z týchto zlúčenín. Tabuľka 1 ukazuje acylačné činidlo

10024 použité pre prípravu každej R¹ skupiny. Tabuľky nasledované NMR dátami a dodatočnými údajmi pre z týchto zlúčenín a inhibítorové zlúčeniny 30 - 38 výťažkov posledných krokov.

- 3 sú niektoré vrátane

10024

Tabuľka X

R¹ skupina

Zlúčenina č. Acylačné činidlo Výťažok Rf. (rozpúšťadlo) coo

148 mg,87% 0.4(90:10 EtOAc:aceton)

F cca

136 mg,78% 0.43 (90:10 EtOAc:aceton)

NO,

133 mg, 78% 0.40 (90:10 EtOAc:aceton)

NOj

143 mg, 82% 0.45 (90:10 EtOAc:acetorľ

10024

TsltBUJlľ’ 1<-Ξ· ΖΕΪ.

Zlúčenina č. Glykozyl akceptor Výťažok Rf (rozpúšťadlo)

135 mg.74% 0.35 (92:8 ElOAc:aceion)

19

100 mg.58% 0.39 (92:8 EtOAc:aceton)

20

105 mg, 65%

0.37 (92:8 EtOAc:acetonJ

21

100 mg, 58%

0.37 (92:8 ElOAc:ace!on)

10024

Tietbuľkra Cí

Zlúčenina č

Benzylovaný pentasacharid

Výťažok

R ť (rozpúšťadlo) mg,60% 0.32 (90:10 CH₂CI₂:MeOH) mg,50% 0.39 (90:10 CH₂Cl₂:MeOH) mg, 65% 0J1 (90:10 CH₂Cl₂:MeOH)

10024

Príklad 19

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra

-0-acety 1 -ct-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozy lát) ] (2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozyl)-(1,4) -0-(benzyl-oxykarbonylamido-2-dezoxy-6-0-acety1-β-Dg1ukopyranozy1)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 39)

Roztok benzyloxykarbonylchloridu (CBZ-C1) (1,2 ml,

8,4 mmol) V CH2CI2 (2,0 ml) bol pridaný po kvapkách k zmesi zlúčeniny 14a (10,8 g, 8,3 mmol) a NaHC03 (1,4 g,

16,6 mmol), a CBZ-C1 (1,2 ml, 8,4 mmol) a výsledná zmes bola miešaná ďalšie 4 hodiny. Výsledná zmes bola zriedená AcOEt, premytá H2O, a skoncentrovaná, s i 1 ikagélu na vysusena Zbytok bol poskytnutie nad MgSO-s, sfiltrovaná chromatografovaný na kolóne zlúčeniny 39 (7,75 g,

65-percentný výťažok) vo forme bielej pevnej látky.

Príklad 20

Etyl [metyl (5-acet.amido-3,5-d idezoxy-4,7,8,9-tetra -0-acety 1 - ct-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozy lát)] (2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozyl)-(1,4) -0-[(2,3,4-tri-0-benzyΙ-α-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0-(2benzyloxykarbonylam ído-2-dezoxy-3,6-di-0-acety1-β-Dg1ukopyranozy1)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 40)

K miešanému roztoku zlúčeniny 39 (3,90 g, 2,72 mmol) v 100 ml CICH2CH2CI boli pridané práškované molekulárne sitá (MS4A) (12 g), tetrametylmočovina (TMU) (3,25 ml, 27,2 mmol) a 2,3.4-t.ri-0-benzy 1-L-f ukozy lf luorid (CMH-048, 5,94 g,

10024

13,6 mmol). Po miešaní počas 90 minút pri izbovej bola zmes odtienená a spracovaná s SnCl2 (9E1-percentný , 2,88 g, od svetla, (2,59 g,

13,6 mmol) ochladená na 13,6 mmol) a Reakčná zmes teplote -20°C AgCICU bola ponechaná otepl.it sa na izbovú teplotu v priebehu 90 minút a bola miešaná počas 24 hodín.

reakcie boli , 16,3 mmol), 8,17 mmol)

Pre dokončenie znova pridané TMU (1,95 ml,

8,17 mmol), SnCl2 (1,55 g, a AgClOzj (1,73 g, 8,17 mmol) a zmes bola ponechaná pomaly sa otepliť na izbovú teplotu. Po 48 hodinách bola výsledná zmes sfiltrovaná cez vrstvu celitu a filtrát bol premytý H2O.

bola vysušená nad MgS04, sfiltrovaná, a chromatografovaná na silikagéli poskytnutie zlúčeniny 40 k zmesi CMH-048 pri 0°C (3,56 g.

Organická fáza skoncentrovaná (Hexán/AcOEt/MeOH = 10/10/2) na (3,65 g, 75-percentný výťažok) a znovuzískanie východzieho materiálu, zlúčeniny 39 (672 mg, 17-percentný výťažok)

Príklad 21

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra -0-acety1-ff-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát)1 (2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozy1)-(1,4) -0-[(α-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0-(2-amino-2-dezoxy-3,6d i -0-acety 1 -<S-D-g 1 ukopyranozy 1 -(1,3)-0-2,4,6-tri-0acetyΙ-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 41)

Zmes zlúčeniny 40 (3,06 g, 1,66 mmol), HCOONH4 (1,05 g, 16,6 mmol) a 10-percent.ného Pd-C (vlhkého, 3,0 g) v EtOH (80 ml) bola refluxovaná s miešaním počas 9,5 hodiny. K tejto zmesi boli pridané ďalšie HCOONH4 (1,05 g,

16,6 mmol) a 10-percentný Pd-C (3,0 g) a výsledná zmes bola refluxovaná ďalších 11 hodín. Táto výsledná zmes bola sfiltrovaná cez vrstvu Celitu a skoncentrovaná na poskytnutie zlúčeniny 41 (2,30 g, 96-percentný výťažok) vo

10024 forme bielej pevnej látky.

Príklad 22

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra

-0-acety1-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát)] ¢2,3)-0-(2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozy1)-(1,4) —O—[(a-L-fukopyranozy1)-(1,3)1-0-(2-(3,5-dichlórbenzoy1 amido)-2-dezoxy-3,6-di-0-acety1-p-D-g1ukopyranozy1(1,3)-0-2,4,6-tri -0-acety1-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 42)

K miešanému roztoku zlúčeniny 41 (40 mg, 0,028 mmol) v CH2CI2 (8,9 ml) boli pridané NaHC03 (46 mg, 0,54 mmol) a 3,5-dichlórbenzoylchlorid (58,6 mg, 0,28 mmol) hodinách pri izbovej Et-OÄc a premytá H2O. MgS0<i, sfiltrovaná a

Po 12 teplote bola reakčná zmes zriedená Organická fáza bola vysušená nad odparená na získanie zlúčeniny 42 (98,4 mg) vo forme svetlo žltého oleja.

Etyl [metyl (5-acet.amido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra -0-acety1-α-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát)] (2.3) -0-(2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozy1)-(1,4) — 0—[(α-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0-(2-(3,5-dichlórbenzamido)-2-dezoxy-3,6-di-0-acetyl-β-D-glukopyranozy1(1.3) -0-2,4,6-t.ri -0-acety 1 -β-D-gal aktopyranoz i d (zlúčenina 42)

K miešanému roztoku v MeOH (8,9 ml) bol surovej zlúčeniny 42 (98,4 mg) pridaný 28-percentný NaOMe-MeOH

10024 (300 μ 1 ) . Po 48 hodinách pri izbovej teplote bola zmes zneutralizovaná DOWEXom 50W-X8 (H⁺ formou) a sfiltrovaná. Filtrát bol skoncentrovaný, zriedený EtOAc a extrahovaný HzO. Vodná fáza bola odparená na získanie zodpovedajúceho esteru. Na ester sa pôsobilo 1 N (5,0 ml). Zmes bola miešaná počas

NaCIH (200 pl) v H₂0 12 hodín pri izbovej 50W-X8 (H⁺ formou) teplote, zneutralizovaná a sfiltrovaná. Filtrát bol

DOWEXom skoncentrovaný, čistený gélovou (p-2) filtráciou (H2O ako eluát) a bol lyofi 1izovaný na získanie zlúčeniny 43 (31,6 mg, kvantitatívny výtažok) vo forme bieleho prášku. ¹H-NMR (300 MHz, S v ppm vzhľadom na H₂0) 7.61 (s, 3H), 5,00 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 7,59 Hz, 1H), 4,26 (d, J = 7,92 Hz, 1H), 4,09 (d, J = 2,97 Hz, 1H), 4,04 - 3,30 (m), 2,67 (m, 1H), 1,94 (s,

3H), 1,72 (t, J = 11,88 Hz, 1H). 1,09 (m, 6H).

NMR dáta zlúčenín 18 - 28

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra-O-acety1 -a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát)]-(2,3)-0-(2,4,6tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozy1)-(1,4)-0-(2-fluórbenzamido -2-dezoxy-6-0-acet.yl - (3-D-glukopyranozy l-(l,3)-0-2,4,6-tri-0acetyl-(3-D-galaktopyranozid (zlúčenina 18) ¹H-NMR (300 MHz, S v ppm vzhľadom

2H) ,	7,15	(m, 2H), 6,41	(d	1, J =	5 Hz
5,42	; (m, 1	H), 5,23 (d, J =	7	Hz, 1	H) , 5
J =	3 Hz,	1H), 4,63 (d, J	=	6 Hz,	1H) ,
J =	7 Hz,	1H), 4,42 - 3,	40	(m,	111) ,
J =	10 Hz,	1H), 2,57 -	1 ,	85	(12s,
J =	10 Hz,	J = 10 Hz, 1H),	1.	15 (t	. J =

na CH	Cl3 )	7,79
1H) ,	5,53	(m,
17 (m,	2H) ,	4,89
4,59	(dd,	J = 3
2,57	(dd,	J = 3
36H)	1	,77

Hz, 3H).

(m, 1H) , (d,

Hz,

Hz, (dd,

10024

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra-0-acety1 -<z-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozy lát)] -(2,3)-0-(2,4,6tri-O-acetyΙ-β-D-galaktopyranozyl)-(1,4)-0-(2-p-nitrobenzamido-2-dezoxy-6-0-acety 1 -(3-D-glukopyranozy 1 - (1,3)-0-2,4,6tri-0-acetyΙ-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 19)

1H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhľadom	na CHCI3)	8,22 (d,
J = 8 Hz,	2H), 7,95	(d, J = 8 Hz, 2H),	6,81	(d,	J = 5	Hz,
1H), 5,59	- 5,37 (m	, 2H), 5,21 (d, J =	4 Hz,	1H) ,	5,11	(m,
2H), 4,89	(d, J = 2	Hz, 1H), 4,63 (d, .	J = 5	Hz,	1H) ,	4,59
(dd. J =	1 Hz, J =	7 Hz, 1H), 4,42 -	3,40	(m) ,	3,79	(s ,
3H), 3,19 (m, 1H)	, 2,57 (dd, J = 3	Hz, J	= 10	Hz,	1H) ,
2,57 - 1,:	85 (12s,	36H), 1,77 (dd, J	= 10	Hz, J	= 10	Hz,
1H), 1,15	(t, J = 5	Hz, 3H).

Etyl [metyl (5-acet.amido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-t.etra-0-acety 1 -a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát.)] -(2,3)-0-(2,4,6tri - 0-acety 1 -β-D-galaktopyranozy1 )-(1,4)-0- [2-(E-l-oxo-3fenylprop-2-en)amino-2-dezoxy-6-0-acety1-β-D-glukopyranozy1] -(1,3)-0-2,4,6-t.ri - 0-acety 1 - β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 20)

1H-NMR (300 MHz, δ v ppm
J - 11 Hz,	1H). 7,45 - 7,	25
2H), 5,87	(d, J = 4 Hz,	1H) .
5,21 (t,	J = 7 Hz, 1H),	5,
J = 2 Hz,	1H), 4,63 (d, J	= 5
J = 7 Hz,	1H), 4,42 - 3,40	(m)
2,57 (dd,	J = 3 Hz, J = 10	Hz,
1,77 (dd,	J = 10 Hz, J = 10 Hz

vzhľadom na CHCI3) 7 (m, 5H), 5,45 (m

- 4,97 Hz, 1H),

6,39 (d, J = 1H), 5,39(m (m, 2H), 4

4,59 (dd, J (d, 11 Hz,

2H) , 89 (d, 1 Hz, , 3,79 (s, 3H), 3,05 (m, 1H),

1H), 2,27 - 1,85 (12s, 36H), , 1H), 1,15 (t, J = 5 Hz, 3H).

10024

Etyl [mety1 (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7.8,9-tetra-0-acety1 -a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát)]-(2,3)-0-(2,4,6tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozyl)-(l,4)-0-(2-2'-naftamido2-dezoxy-6-0-acety1-β-D-glukopyranozy1)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0acety 1 -(i-D-galaktopyranozid (zlúčenina 21)

	*11-NMR	(300 MHz, S v ppm	vzhľadom	na CHCI3)	8,25 (s,
1H) ,	7,95 -	7,42 (m, 6H), 6,58	(d, J	=	5 Hz. 1H),	5,53 (m,
1H) .	5,44	(d, J = 2 Hz, 1H),	5,41 -	5 ,	23 (m), 5,	17 - 5,01
(m) ,	4,89	(d, J = 3 Hz, 1H), 4	,63 (d,	, J	= 6 Hz,	1H), 4,59
(dd,	J = 3	Hz, J = 7 Hz, 1H),	4,42	-	3,40 (m),	3,81 (s,
3H) ,	3,27	(m, 1H), 2,57 (dd	, J =	3	Hz, J = 10	Hz, 1H),
2,27	- 1,85	(12s, 36H), 1,77	(dd.	J	= 10 Hz, J	= 10 Hz,
1H) ,	1,15 (t, J = 5 Hz, 3H).

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-t.etra-0-acety 1 -α-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát)]-(2,3)-0-(2,4,6tr i -0-acety 1 -fX-D-galakt.opyranozy 1)-(1,4)-0-[ (2,3,4-0-benzy1α-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0-(2-p-fluórbenzamido)-2-dezoxy3,6-d i -0-acety 1 -D-g 1 ukopyranozy 1)-(1,3)-0-2,4,6-tri-0acetyl-(3-D-galaktopyranozid (zlúčenina 22) ¹H-NMR (300 MHz, S v ppm vzhľadom na CHCI3) 7,42 (m, 2H), 7,39 - 7,17 (m, 15H), 6,95 (t, J = 7 Hz, 2H), 6,45 (d, J = 5 Hz, 1H), 5,57 - 5,37 (m, 3H), 5,27 (d, J = 7 Hz, 1H), 5,17 - 4,45 (m), 4,39 (d, J = 7 Hz, 1H), 4,25 - 3,41 (m), 3,81 (s, 3H). 3,21 (m, 1H), 2.57 (dd, J = 3 Hz, J.= 10 Hz, 1H), 2,27 - 1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, 1H), 1,19 (d, J = 5 Hz, 3H), 1,15 (t, J = 5 Hz, 3H) .

10024

Etyl [mety1 (5-acetamido-3,5-d idezoxy-4,7,8,9-tetra-0-acety1 -cc-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozy lát) ] -(2,3)-0-(2,4,6trí-0-acety1-β-D-galaktopyranozyl)-(1,4)-0-[(2,3,4-0-benzy1α-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0-(2-p-nitrobenzamido)-2-dezoxy3,6-d .i -0-acety] -β-D-g 1 ukopyranozy 1 )-(1,3)-0-2,4,6-tri-0acety 1 -β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 23 )

1H-NMR (300 MHz,	δ v ppm	vzhľadom na CHCI3) 8,15 (d,
J = 8 Hz,	2H) ,	7,55	(d, J =	8 Hz, 1H),	7,41 - 7,15 (m,
15H), 6,	63	(d,	J =	5 Hz, 1H), 5,48 (m,	1H), 5,43 (dd.
J = 6 Hz,	J =	2	Hz,	1H), 5,37	(d, J = 6 Hz	1H), 5,19 (d.
J = 8 Hz,	1H)	, 5	,15 -	4,45 (m).	3,82 (s, 3H), 3,25 (m, 1H),
2,59 (dd,	J =	3	Hz, J	= 10 Hz,	1H). 2,27 -	1,85 (12s, 36H),
1,77 (dd	, J	=	10 Hz	, J = 10	Hz, 1H), 1,	19 (d, J = 5 Hz,
3H), 1,15	(t.	J	= 5 Hz, 3H).

Etyl [metyl (5-acetam ido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra-0-acety1 -a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozy1át)]-(2,3)-0-(2,4,6tri-O-acetyl-p-D-galaktopyranozyl)-(l,4)-0-[(2,3,4-tri-Obenzy1-«-L-fukopyranozy1)-(l,3)]-0-[2-(E-1-οχο-3-f enylprop2-en)amino-2-dezoxy-3,6-di-0-acety1-β-D-g1ukopyranozy1](1,3)-0-2,4,6-tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 24)

1H-NMR (300 MHz,	δ v ppm vzhľadom	na CHCI3)	7,42 (d,
J = 11 Hz,	1H), 7,39	- 7,15	(m,	20H) ,	5,94 (d, J	= 11 Hz,
1H), 5,85	(d, J =	4 Hz,	111)	5,55	- 5,29 (m	4H),
5,17 - 4,42	(m), 4,25	(m,	2H) ,	4,17 -	3,40 (m),	3,79 (s,
3H), 3,05	(m, 1H),	2,57	(dd,	J = 3	Hz, J = 10	Hz, 1H),
2,27 - 1,85	(12s, 36H), 1	,77	( dd, J	= 10 Hz, J	= 10 Hz,
1H), 1,19 (d	, J = 5 Hz	, 3H) ,	1,15	(t, J =	5 Hz, 3H).

10024

Etyl [metyl (5-acet.amido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra-O-acety 1 -a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát)] -(2,3)-0-(2,4,6tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozyl)-(l,4)-0-[(2,3,4-tri-0benzy1-α-L-fukopyranozy1)-(1,3)1-0-[2-2’-naftamido-2-dezoxy3,6-di - 0-acety 1 D-g 1 ukopyranozy 1 ] - (1,3)-0-2,4,6-tri -0acety1-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 25) ¹H-NMR (300 MHz, 6 v ppm

1H), 7,84 (d, (m,2H), 7,37 -

(d.	J = 5 Hz
4,25	(m, 2H).
2,57	(dd, J =
1,77	(dd, J
3H) ,	1,15 (t,

J = 7 Hz, 1H), 7,11 (m, 16H),

1H), 5,57 - 5,

4,19 - 3,42 (m) : Hz, J = 10 Hz, = 10 Hz, J = 10 ' = 5 Hz, 3H).

vzhľadom na CHCI3) 8,13 (s,

7,78 (d, J = 7 Hz, 1H), 7,57 6,98 (d, J = 7 Hz, 1H), 6,65 35 (m, 2H), 4,97 - 4,45 (m), , 3,81 (s, 3H), 3,23 (m, 1H).

1H), 2,27 - 1,85 (12s, 36H), Hz, 1H), 1,19 (d, J = 5 Hz,

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra-0-acety1 -a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát.)] - (2,3)-0-(2,4,6tri-0-acety 1 -β-D-ga 1 akt-opyranozy 1 )-(l,4)-0-[ (2,3,4-t.ri-0benzyl-α-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0 - [2-p-fluórbenzamido-2dezoxy-3,6-di-0-acety1-β-D-glukopyranozy11-(1,3)-0-2,4,6tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 26)

	1H-NMR (300 MHz. S v ppm vzhľadom na CHCI3) 7,83 (m,
2H) ,	7,83	(m, 2H), 7,17 (m	, 2H)	, 5,45 (m, 1H), 6,40	(m,
2H) ,	5,23	(d, J = 5 Hz,	1H) ,	5,17 - 4,75 (m,	3H) ,
4,77	- 4,35	(m, 4H), 4,36 (m,	2H) ,	4,19 - 3,41 (m), 3,81	(s,
3H) ,	3,09	(bs, 1H), 2,62	(m,	1H), 2,57 (dd, J = 3	Hz,
J =	10 Hz,	1H), 2,27 - 1,	85	(12s, 36H), 1,77	(dd,
J =	10 Hz,	J = 10 Hz, 1H), 1,	24 (d, J = 5 Hz, 3H), 1,15	(t,

J

Hz, 3H).

10024

Etyl [metyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra-0-acety1 -a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát)1-(2,3)-0-(2,4,6tri-0-acety 1 -(3-D-ga 1 aktopyranozy 1 )-(l,4)-0-[ (2,3,4-tri-Obenzyl-ä-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0-(2-p-aminobenzamido-2dezoxy-3,6-d i-0-acetyΙ-β-D-glukopyranozy11-(1,3)-0-2,4,6t.r i-0-acety 1-β-D-galaktopyranoz id (zlúčenina 27 )

	1H-NMR	(300 MHz, S	v ppm	vzhľadom na CHC13) 7,61 (d.
J = 8	Hz, 2H), 6,75 (d,	J = 5	Hz, 1H), 6,57 (d, J =	8 Hz,
2H) ,	5,57	(m, 1H), 5,43	(dd.	J = 6	Hz, J =	2 Hz, 1H)	, 5,27
(d.	J = 2	Hz, 1H), 5,19 (d.	J = 8	Hz, 1H)	, 5,09 (m	, 1H) ,
4,95	(m,	2H), 4,77	-4,63	(m) ,	4,55	(dd, J =	7 Hz,
J = 1	Hz,	1H), 4,42 (d. J =	2 Hz,	1H) ,	4,35 (m,	2H) ,
4,21	-3,38	(m), 3,82 (s	, 3H),	3,17	(m, 1H)	, 2,95 (bs	. 1H) ,
2,59	(dd.	J = 3 Hz,	J = 10	Hz,	1H) ,	2,42 (bs,	1H) ,
2,27	- 1,85	(12s, 36H)	, 1,77	(dd,	J = 10 Hz, J =	10 Hz,
1H) ,	1,22 (d, J = 5 Hz,	3H), 1,	15 (t,	J = 5	Hz, 3H)-

Etyl [metyl (5-acet.amido-3,5-didezoxy-4,7,8,9-tetra-O-acety1 -«-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozylát)1-(2,3)-0-(2,4,6tri-0-acety1-β-D-galaktopyranozyl)-(l,4)-Q-[(2,3,4-tri-0benzy 1 - <z-L-f ukopyranozy 1 )-(1,3)] -0- (2- (3' -fenyl )propionam i do -2-dezoxy-3,6-di-0-acety1-β-D-glukopyranozy1]-(1,3)-0-2,4,6tri-O-acetyl-p-D-galaktopyranozid (zlúčenina 28)

1	H-NMR	(300 MHz	, δ v ppm	vzhľadom	na CHCI3)	7,	29	(m,
511) ,	6,39	( d , J =	2 Hz, 1H)	5,85	(d, J	= 4	Hz,		1H) ,
5,55 -	5,19	(m, 5H)	, 5,11 (t,	J = 5 Hz,	1H) ,	4,95	(m		4H) ,
4,71 -	4,35	(m), 4,	17 - 3,22	(m), 3,79	(s.	3H) ,	2,	95	(t,
J = 3	Hz, 2H), 2,57	(dd, J = 3	Hz, J =	10 Hz,	1H) ,	2,	47	(d.
J = 3	Hz, 211), 2,27	- 1,85 (12s	, 36H).	1,77 (dd, J	=	10	Hz,
J = 10	Hz,	1H), 1,24 (d, J = 5	Hz, 3H),	1 , 15	(t,	J =	5	Hz,

3H) .

10024

Údaje pre zlúčeniny 30 - 38

Etyl [ (5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozy lát.)] -(2,3 )-0-( β-D-ga laktopyranozy 1 )-(1,4)-0[(α-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0-(2-p-fluórbenzamido-2-dezoxyβ-D-glukopyranozy 1] -d , 3)-0^-D-galaktopyranozid (zlúčenina 30)

Rť = 0,62 (3:1 i-PrOH ' NH^OAc), biela pevná látka, mg, 96 percent.

^H-NMR (300 MHz, S v ppm vzhľadom na H2O) 7,83 (m, 2H, aromát). 7,25 (m. 2H, aromát.), 5,18 (d, J = 5 Hz, H-l (fuc), IH), 4,95 (m), 4,56 (d, J = 8 Hz, IH), 4,37 (d, J = 8 Hz,

IH), 4,19 (d, J = 3,5 Hz, IH), 4,15 - 3,42 (m), 2,77 (dd,

J = 3 Hz, J = 10 Hz, IH), 1,97 (s, 3H), 2,05 (s, 3H, NAc), 1,79 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, IH), 1,19 (m, 3H).

Etyl [(5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozylát)]-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranozy1)-(1,4)-0[ (a-L-f ukopyranozy1)-(l,3)]-0-(2-p-ami nobenzamido-2-dezoxyβ-D-g 1 ukopyranozy 1] - (1,3 )-0^-D-galaktopyranozid (zlúčenina 31)

Rí = 0,52 (3 : 1 i-PrOH - NH^OAc) biela pevná látka, mg, 96 percent.

¹H-NMR (300 MHz J = 9 Hz, 2H, aromát) (d, J = 3 Hz, H-l-fuc J = 2 Hz, IH), 4,15 CH2CH3), 2,79 (dd, sialová), IH), 2,05 J = 10 Hz, Hax-3 J = 6 Hz, 3H, Η-6-fuc , 6 v ppm vzhľadom na ,6,28 (d, , IH), 4,38 - 3,42 (m)

J = 3 Hz, (s, 3H, (kyselina ), 1,17 (t,

H2O) 7,65 (d,

J = 9 Hz, 2H, aromát), 5,19 (d, J = 8 Hz, IH), 4,19 (d, 3,19 (g, J = 6 Hz, 2H,

J = 11 Hz, Ηθ<3-3 (kyselina NAc), 1,77 (dd, J = 10 Hz, sialová), IH), 1,19 (d,

J = 6 Hz, 3H).

10024

Etyl [ (5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonu lopyranozy lát.)] -(2,3)-0-(fJ-D-galaktopyranozy 1 )-(1,4)-0[(a-L-fukopyranozy1)-(l,3)]-0-[(2-(3'-fenyl)-propionamido2-dezoxy-(3-D-g 1 ukopyranozy 1 ] -(1,3 )-Ο-0-D-galaktopyranozid (zlúčenina 32)

Ri = 0,62 (3 - 1 i-PrOH NH<iOAc), biela pevná látka, mg, 98 percent.

¹H-NMR (300 MHz, S v ppm vzhľadom na H2O) 7,42 - 7,25 (m, 5H), 5,19 (d, J = 4 Hz, H-l-fuc, 1H), 4,95 (m), 4,57 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,38 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,13 (d, J = 2 Hz,

1H), 4,11 - 3,42 (m). 2,95 (t, J = 5 Hz, 2H, a-CH₂). 2,75 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, Heq-3 (kyselina sialová), 1H), 2,63 (t, J = 5 Hz, 2H, CH2PID, 2,05 (s, 3H, NAc), 1.80 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, Hax-3 (kyselina sialová), 1H), 1,24 (t, J = 5 Hz, 3H), 1,18 (d, J = 5 Hz, 3H).

Etyl [(5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonu lopyranozy 1 á t)]- (2,3)-0- ((3-D-gal aktopyranozy 1)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0-(2,2'-naftamido-2-dezoxy-p-Dg 1 ukopyranozy 1 )-(l, 3 )-0-<3-D-galaktopyranozid (zlúčenina 33 ) i-PrOH : NH^OAc), biela pevná látka.

Rf =0,52 (3 mg, 96 percent..

tH-NMR (300 MHz, S v ppm vzhľadom na 8,02 (m, aromát, 2H), 7,82 arornát aromát.

(f 11c) .

J = 2 Hz, J = 11 Hz 1,77 (dd

1H) III) , III) , , 7,63 (m, aromát, 3H), 5,19 (d, , 4,95 (m), 4,57 (d, J = 8 Hz 1H), 4,15 - 3,42 (m), 2,77

Heq-3 (kyselina sialová), 1H)

J = 10 Hz, J = 10 Hz, Hax-3

H2O) 8,39 (s, (d, J = 7 Hz, J = 4 Hz, H-l , 1H), 4,19 (d, (dd, J = 3 Hz,

III) , 3H) .

1,19 (d, J = 6 Hz, 3H, Η-6-fuc)

2,05 (s, 3H, NAc), (kyselina sialová), 1,05 (t, J = 6 Hz,

10024

Etyl [ (5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozylát)]-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranozy1)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranozy1)-(1,3)1-0-(2,2'-fenylacetamido-2-dezoxy -β-D-glukopyranozy1)-(1,3)-Ο-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 34)

Rf = 0,62 (4,5 1 i-PrOH = NH^OAc), biela pevná látka, 24 mg, 68 percent.

¹H-NMR (300 MHz, S v ppm vzhľadom na H₂0) 7,45 - 7,27 (m, 5H), 4,85 (d, J = 3 Hz, H-l-fuc, 1H), 4,75 (m), 4,55 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,38 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,13 (d, J = 2 Hz, 1H), 4,09 - 3,42 (m), 2,78 (dd, J = 3 Hz, J = 10 Hz, H_eq-3 (kyselina sialová). 1H), 2,05 (2s, 5H, NAc, PhCH₂), 1,80 (dd, J = 10 Hz, J = 10 Hz, Hax~3 (kyselina sialová), 1H), 1.24 (t, J = 5 Hz, 3H), 1,18 (d, J = 5 Hz, 3H).

Etyl [(5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozylát)1-(2,3)-Q-(β-D-galaktopyranozy1)-(1,4)-0[ (cc-L-f ukopyranozy 1 )-(1,3)1 -0-(2-p-metoxybenzamido-2-dezoxy -β-D-glukopyranozy1)-(l,3)-0^<-D-galaktopyranozid (zlúčenina 35)

Rf = 0,52 (3 = 1 i-PrOH - NIUOAc) biela pevná látka.

mg, 90 percent.

		1H-NMR (300	MHz, S	v ppm	vzhľadom na	H20)
J =	9	Hz, 2H, aromát),	7,05 (d	, J = 9 Hz	, 2H),
J =	3	Hz, H-l-fuc,	1H) ,	4,95 (m)	, 4,52 (d,	J = 8
4,25		(d, J = 8 Hz,	1H) ,	4,19 (d.	J = 2 Hz,	1H), 4
(m) ,		3,82 (s, 3H	0CH3), 2,75	(dd, J =	3 Hz,
Heq-	3	(kyselina sialová)	, 1H) , 1,	99 (s, 5H,	NAc ) ,

J = 10 Hz, J = 10 Hz, Ilax-3 (kyselinéi sialová),

J

7,75 (d,

5,11 (d, Hz, 1H), 15 - 3,39 = 11 Hz, 1,77 (dd, 1H), 1,17 (m, 5H, Η-6-fuc, CH₂CH3).

10024

Etyl [(5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozylát)]- (2,3)-0-(β-D-galaktopyranozyl)-(1,4)-0[(α-L-f ukopyranozy1)-(1,3)]-0-(2-p-terc-butylbenzamido-2dezoxy-p-D-glukopyranozy1)-(l,3)-0-p-D-galaktopyranozid (zlúčenina 36)

Rf = 0,52 (3 1 i-PrOH - NH^OAc), biela pevná látka, mg, 90 percent.

1H-NMR	(300 MHz, S	v ppm	vzhľadom	na	H2O)	7,65	(d
J = 9 Hz, 2H	, aromát),	7,58	(d, J = 9	Hz,	2H) ,	5,19	(d
J = 4 Hz, H-l	(fuc), 1H),	. 4,95	(m), 4,57	(d,	J =	8 Hz,	1H)

4,38 (d, J = 8 Hz. 1H), 4,19 (d, J = 2 Hz, 1H). 4.15 - 3,39 (m), 2,73 (dd, J = 3 Hz, J = 11 Hz, H_eq-3 (kyselina sialová), 1H), 2,05 (s, 3H, NAc), 1,77 (dd, J = 10 Hz,

J = 10 Hz, Hax-3 (kyselina sialová), 1H), 1,24 (s, 9H, t-Eíu), 1,17 (in, 5H, Η-6-fuc, CH2CH3).

(5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-noni.ilo pyranozylát)]-(2,3)-0-(£-D-galaktopyranozyl)-(1,4)-0[ (α-L-f ukopyranozy 1 )-(1,3)] -0- (2-benzamido-2-dezoxy-<2-Dg 1 ukopyranozy 1 )-(l, 3)-0-fi-D-galaktopyranozid (zlúčenina 37) ^^H-NMR (300 MHz, 6 v ppm vzhľadom na H2O) 1,15 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3 z fuc), 1,81 (1H, t, J = 10,4 Hz, H-3''a z NANÄ), 2,02 (3H, s, CH3CONH), 2,78 (1H, dd, J = 10,4 Hz,

3,2 Hz, H-3''e z NANA), 3,5 - 4,2 (m), 4,4 - 4.8 (m), 5,16 (d, d, H-l z FUC, α, β) , 5,2 (d, J = 3,4 Hz, H-l. a),

7,5 - 7,8 (5H, aromát).

10024

Benzy 1 (5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozylát)-(2,3)-0-(p-D-galaktopyranozyl)-(1,4)-0[ Cα-L-fukopyranozy 1 )-(1,3)] -0-(2-benzamido-2-dezoxy-ŕš-Dg1ukopyranozy1)-(1,3)-Ο-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 38) ¹H-NMR (300 MHz, δ v ppm vzhľadom na H2O) 1,08 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3 z fuc), 1,76 (1H, t, J = 10,4 Hz, H-3''a z NANA), 1,97 (3H, s, CH3CONH), 2,7 (1H, dd, J = 10,4 Hz, 3,2 Hz, H-3''e z NANA), 3,4 - 0,42 (m), 4,5 (1H, d,

J = 7,7 Hz), 4,6 H-l z FUC), 7,1 (1H, d, J = 8,0 Hz) 7,8 (10H, aromát).

5,02 (d, J = 3,8 Hz,

NMR dáta zlúčenín 44 - 49

Etyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozylát)-(2,3)-0-(<3-D-galaktopyranozy 1 )-(1,4)-0[(α-L-fukopyranozy1)-(1,3)1-0-C(2-(3,4-dichlórbenzamido)-2dezoxy-p-D-gl ukopyranozy 1)-(1,3) -0-(3-D-gal aktopyranozid (zlúčenina 44)

1H-NMR (270	MHz,	δ v	ppm	vzhľadom	na H2O) 7,82	(s,
1H), 7,56 (m.	2H) .	5,99	(d.	J = 3,96	Hz, 1H), 4,47	(d,
J = 7,59 Hz, 1H)	, 4,25 (d	, J	= 7,91 Hz	, 1H), 4,15 - 3	,22
(m), 2,66 (dd,	J = 12,54	Hz,	J = 3,96	Hz, 1H), 1,94	(s,
3H), 1,76 (t, J =	12,54 Hz,	1H) ,	1,10 (m,	6H).

Etyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozylát)-(2,3)-0-(.(i-D-galaktopyranozy 1)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranozy1)-(1,3)1-0-(2-furanamido)-2-dezoxy-p-Dglukopyranozy 1 )-(1,3) -0-<3-D-ga 1 aktopyranozid (zl účenina 45 ) ¹H-NMR (270 MHz, δ v ppm vzhľadom na H2O) 7,59 (d,

10024

J =	1,98	Hz, 1H),	7,10	(d, J	= 3,63	Hz, 1H). 6,54	(dd.
J =	3,36	Hz, J = 1	,98 Hz,	1H) ,	5,05 (d	, J = 4,29 Hz,	1H) ,
4,46	. (d.	J = 7,59	Hz, 1H)	, 4,23	(d, J	= 7,92 Hz, 1H),	4,06
(d,	J =	2.97 Hz,	1H) ,	4,02	- 3,32	(in), 2,68	(dd,
J =	12,87	Hz, J =	3,96 Hz	, 1H) ,	1,95	(s, 311), 1,77	(t.
J =	12,87	Hz, 1H),	1,08 (m	, 6H).

Etyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonu 1 opyranozy 1 át) - (2,3) -0- ((3-D-ga 1 aktopyranozy 1)-(1,4) -ΟΙ (α-L-fukopyranozy1)-(1,3)1-0-(2-tiofénamido)-2-dezoxy-p-Dg1ukopyranozy1)-(1,3)-0~ŕ-D-galaktopyranozid (zlúčenina 46)

	1H-NMR	(270 MHz, S v	PPm	vzhľadom na H2O) 7,63	(m,
2H) ,	7,	10	(m,	1H), 5,06	(d,	J = 3.63 Hz, 1H), 4,46	(d,
J =	7,92	Hz,	1H)	, 4,23 (d	J	= 7,92 Hz, 1H), 4,06	(d.
J =	3,30	Hz,	1H) ,	4,04 - 3,	30 (m), 2,67 (dd, J = 12,21	Hz,
J =	3,96	Hz,	1H) ,	1,94 (s,	3H) ,	1,73 (t, J = 12,21 Hz,	1H) ,
1,07	(m,	6H)

Etyl (5-aeetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-ga1akto-2nonulopyranozy lá t) - (2,3 )-0- (β-D-gal aktopyranozy1 )-(1,4) -ΟΙ (α-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0-[2-(2-tiomety1)nikotínamido)2-dezoxy-p-D-glukopyranozy11-(1,3)-0-p-D-galaktopyranozid (zlúčenina 48)

1H-NMR	(270 MHz, δ	v	ppm vzhľadom	na H2O) 7,62 (m.
2H), 7,06 (π, 1H), 5,	04	(d.	J = 3,96	Hz, 1H), 4,43	(d.
J = 7,59 Hz,	III), 4,23	(d,	J	=7,92 Hz	, 1H), 4,10 - 3	,20
(m), 2,68 (m	1H), 2,14	(t	;, 3H), 2,09	(s, 3H). 1,70	(m,
1H), 1,05 (m.	6H) .

10024

Etyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozylát)-(2,3)-0-(p-D-galaktopyranozyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranozy1)-(l,3)]-0-[2-(6-dodecyloxy-2-naftamido)2-dezoxy-p-D-glukopyranozy1]-CI,3)-0-£-D-galaktopyranozid (zlúčenina 47)

	1H-NMR (270 MHz,	S v ppm
1H) ,	, 7,90 - 7,78	(m,	3H), 7,26
(m,	1H). 4,48 -	4,40	(m, 1H),
(m,	1H), 2,01 (s	, 3H) ,	, 1,85 - 1

vzhľadom na CH3OH) 8,32 (s, - 7,16 (m, 2H), 5,17 - 5,13 4,22 - 3,22 (m), 2,88 - 2,82 19 (m), 0,91 - 0,85 (m, 3H).

Etyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozylát)-(2,3)-0-(p-D-galaktopyranozyl)-(1,4)-0[(α-L-fukopyranozy1)-(1,3)]-0-[2-m-butyloxybenzamido)-2dezoxy-p-D-glukopyranozy11-(1,3)-Ο-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 49)

	1H-NMR (270 MHz,	δ v ppm vzhľadom na H2O) 7,	39 - 7,22
(m,	3H), 7,13 - 7,09	(m,	1H), 5,03 (d, J = 3,96	Hz, 1H),
4,46	(d, J = 7,92 Hz,	1H) ,	4,07 - 3,34 (m), 2,68 -	2,64 (m,
1H) ,	1,93 (s, 3H),	1,74	- 1,62 (m, 3H), 1,30 -	1,44 (m,
2H) ,	1,07 (t, J = 7.	25 Hz,	3H), 1,06 (t, J = 5,60	Hz, 3H),
0,84	(t, J = 7,58 Hz,	3H) .

Údaje pre zlúčeniny 50 - 51

Etyl (5-acetamido-3,5-didezoxy-a-D-glycero-D-galakto-2nonulopyranozylát)-(2,3)-0-(β-D-galaktopyranozy1)-(1,4)-0[ (α-L-f ukopyranozy 1 )-(1,3)] -0- (2-n ikotínamido) -2-dezoxy-<3D-g1ukopyranozy1)-(1,3)-Ο-β-D-galaktopyranozid (zlúčenina 50)

10024

Rf = 0,22 (silikagél,

Ml-NMR (300 MHz, D₂0): S 1,13 1,15 (t, 3H, J = 6.7 Hz, izo-propanol /1 M NH^OAc); (d, 3H, J = 6,6 Hz, CH3 Fuc),

OCH2CH3), 1,78 (t. 1H, (d, 1H, pyridyl)

J = 11,9 Hz, H-3a NANA), 2,01 (s, 3H, COCH3), 2,74 (dd. 1H, J = 4,4, 11,9, H-3e NANA), 3,41 - 4,33 (násobné vrcholy, 34H), 4,31 (d, 1H, J = 8,1 Hz, β-anomér Gal), 4,53 (d, 1H,

J = 8,0 Hz, (5-anomér Gal), 5,10 α-anomér Fuc), 7,56 (m, 1H, H-5

J = 1,3, 8,1 Hz, H-4 pyridyl), 8,68 8,85 (s, 1H, H-2 pyridyl).

J = 3,7 Hz, 8,16 (dd, (m, 1H, H-6 pyridyl).

Etyl [nátrium (5-acetamido-3,5-didezoxy-o:-D-glycero-Dgalakt.o-2-nonulopyranozylát)-(2,3)-0-((S-D-galaktopyranozyl )(l,4)-0-[ (ec-L-fukopyranozy 1 )-(1,3)1 -0-(2-benzénsulfónamido)2-dezoxy-0-D-glukopyranozy 1 )-(l, 3)-0-ŕl-D-ga laktopyranozid (zlúčenina 51)

Rí = 0	,28 (si 1ikagél,	20-percentný	1 M	NH^OAc /
izo-propanol). 1H-NMR (300	MHz, D2 0, ppm	vzhľadom na H20):
S 7,92 (d,	J = 7,4 Hz, 2H),	7,69 (d, J =	7,2 Hz	, 1H), 7,60
(t, J = 7,	2 Hz, 2H), 5,47	(d, J = 4,0	Hz, 1H)	, 4,62 (d,
J = 8,1 Hz,	1H), 4,51 (cl	1, J = 7,6 Hz,	1H) ,	4,24 (d,
J = 8,0 Hz,	1H), 4,07 (dd,	J = 3,1, 9,6	Hz, 1H)	,3,99 (d,
J = 3,1 Hz,	1H), 3,96 - 3,46 (m, 29H),	2,75 (dd, J = 4,6,
12,5 Hz, 1H), 2,68 (dd, J =	8,1, 8,1 Hz,	1H), 2,	02 (s, 3H),
1,78 (t.	J = 12,1 Hz, 1H), 1,20 (t,	3H) ,	1,16 (d.

J = 6,5 Hz, 3H).

Určenie bunkovej väzby

10024

Bol vyvinutý modif ikovaný test na adhéziu / HL-60 bunkami na reprodukovateľného oligosacharidových s rekombinantným rozpustným E-selektínom poskytnutie jednoduchého a vysoko spôsobu, ktorým sa porovná potenciál analógov sialyl Levis X v blokovaní E-selektínu. V tomto teste je rekombinantný rozpustný E-selektín (rELAM) naviazaný na plastikový povrch 96-jamkovej ELISA doštičky. Zlúčenina analogická sialyl Le^x v zriedeniach, ktoré majú byt testované, sa pridá do jamiek s následným pridaním buniek HL-60, ktoré nesú ligand pre E-selektín.

Bunky sú pokryté ponechané adherovat na testovacej doštičke E-selektínom a neadherované bunky sú odstránené premytím doštičky s použitím automatickej premývačky doštičiek. Naviazané bunky sú kvántifikované meraním bunkového enzýmu myeloperoxydázy- Koncentrácia testovaného oligosacharidu potrebná na dosiahnutie 50-percentnej inhibície kontrolnej adhézie je použitá na porovnanie účinnosti analógov. Eficiencia používania podobnej naviazanej rozpustnej časti rekombinantného ELAM-1 ako substrátu pre väzbu HL-60 a ďalších buniek, ktoré sa viažu na bunky obsahujúce receptor ELAM-1 (E-selektín) bola preukázaná Lobbem et al.,

J.Immunol. 14?: 124-129 (1991).

MATERIÁLY A METÓDY

Materiály

Doštičky ELISA, Immunol 2 (Dynatec Laboratories) (Fisher 14-245-61)

0,2 pm filtračnej jednotky (Nalgene ít.150-0020) rELAM (rekombinantný modifikovaný ĽLAM-1) afinitne purifikovaný, pripravený ako sa uvádza ďalej. Každá šarža rELAM bola funkčne testovaná n£i stanovenie príslušnej koncentrácie na použitie v teste. Šarža bola titrovaná v rozmedzí 1-5 jul/ml s použitím zlúčeniny Z (tu opísanej

10024 neskôr) ako štandardu. Potom boli pripravené malé alikvóty.

rýchlo zamrazené kúpeli suchého ľadu a acetónu a skladované pri -70°C. Každá alikvóta bola otvorená len raz a potom bola odhodená alebo odložená na použitie v iných typoch testov.

Tu používaná rozpustná forma E-selektínu CrELAM alebo sol-E-selektín) bola konštruovaná deléciou transmembránovej domény z cDNA. Táto rekombinantné cDNA bola klonovaná do cicavčieho vektora expresie? pCDNAl /derivátu pCDM8: Seed, 840 ¢1987)/, ktorý obsahuje chimérnyvírový cytomegalovírusu/vírusu je zavedený ľudskej do buniek imunitnej 293 ľudskej adenovírom, produktom E1

Náture; 329 promotor nedostatočnosti- Keď ľadvinovej nádorovej línie transformovaných expresia z CMV je účinne aktivovaná génovým mechanizmom, ktorý nebol celkom pochopený. Do buniek 293 bol zavedený konštrukt pCDNAl-sol-E-selektín, prostredníctvom kalciumfosfátového prenosu génu, a bola vytvorená stabilná línia exprimujúca vysoké hladiny sol-E-selektínu.

Sol-E-selektín produkovaný týmito bunkami bol purifikovaný imunoafinitnou chromatografiou na kolóne Proteín-A Sefarózy a anti-E-selektín monoklonáInou protilátkou.

Konkrétnejšie: Ľudská ľadvinová nádorová línia buniek

293 transformovaných adenovírom bola získaná z ATCC CCRL-1573). Bunky 293 boli rozrastané ako adherantná kultúra v DMEM, získanom od Vhittaker Bioproducts CVa1kersvi 1le, MD) , doplnenom 10 percentami fetálneho bovinného séra CFBS), získaného od JRH Biochemical CLenexa, KS).

Plazmid pCDNAl, derivát pCDM8 /Seed

C1987)/, bol získaný od fy. Invitrogen (San Diego Plazmid pBluescript II bol získaný od fy. Straragene

Náture 329: 840

CA) . <San

Diego, CA). Plazmid pSV2-neo /Southern et al., J. Mol. Appl

E. coli kódujúci je pSV2-neo zavedený

Gen. 1:327 ¢1982)/ obsahuje gén aminoglykozid 3'-fosfotransferázu- Keď do buniek cicovcov, transfekované bunky vykazujú rezistenciu k antibiotiku G418.

1,67 kbp DNA fragment kódujúci skrátený štruktúrny gén

10024 pre E-selektín bol izolovaný polymerázovou retazovou reakciou (PCR) amplifikáciou cDNA odvodenej z mRNA, ktorá bola izolovaná z ľudských endoteliálnych buniek aktivovaných IL-1. Unikátne Clči 1 miesto bolo vložené 5’-amplimérom 28 nukleotidov nad iniciačným kodónom štruktúrneho génu pre

E-selektín. 3’-amplimér vložil za maturného E-selektínu terminačný kodón am i nokyse1 i nu 527 TGA a nasledujúce unikátne Xhol reštrikčné miesto. C-koniec sol-E-selektínu sa nachádza elementu, pri C-konci a týmto sa šiesteho opakovaného konsenzus zaistuje delécia transmembránovej poskytnutia

E-selektín domény. 1,67 kbp PCR fragment, bol kodigerovaný reštrikčnými endonukleázami Cla 1 a Xho 1 a subklonovaný do reštrikčných miest Cla 1 a Xho 1 klonovacieho vektora pBluescript II, za vektora pBSII-sol-E-selektín. Rozpustný má dĺžku 257 aminokyselín a obsahuje 11 potenciálnych glykozylačných miest.

1,67 kbp DNA fragment obsahujúci cDNA sol-E-selektínu bol izolovaný z pBSII-sol-E-selektínu a subklonovaný do reštrikčných miest Eco RV a Xho 1 vektora expresie pCDNAl, čím bol poskytnutý vektor pCdna-sol-E-selektín.

Tento pCDNAl-sol-E-selektín bol kotransformovaný s pSV2-neo, pomocou kalciumfosfátovej techniky [Kriegler, Gene Transfer and Expression^: A laboratory manual, V. H. Freeman, New York, N.Y. (1991)1 do buniek 293. Štyridsaťosem hodín po t-ransfekcii boli transf ekované bunky 293 trypsinizované a nanesené do DMEM, 10-percentnej FBS, a 600 mg/ml G418 (Geneticin, Sigma). Selekčné médium bolo menené každé tri dni, až kým nebola získaná stabilná G418-rezistentná populácia.

Jednotlivé klony G418-rezistentných buniek boli valčekmi. Izolované klony boli syntézu imunosorpčného testu primárnu protilátku. Pozitívne klony boli nanášané ako 10⁶ buniek / 100 mm misku. 0 24 hodín neskôr boli metabolický zničené [³⁵S1-metioninom počas 5 hodín. Značený izolované hodnotené enzýmového klonovac ími vzhľadom na sol-E-selektínu pomocou (ELISA), CY1787, ako

10024 sol-E-selektín bol imunoprecipitovaný z média anti-E-selektín monoklonáInou protilátkou a elektroforovaný na 10-percent.nom PAGE gél i, gél bol vysušený a podrobený autorádiografi i. Kloň 293#3 bol vybraný ako stabilná bunková línia. ktorá produkovala najväčšie množstvo 110-kD sol-E--selektínovej bielkoviny na bunku.

komôrková Nunc Celí Factory (6250 cm² celkovej plochy povrchu, Nunc) bola naočkovaná 2,78 x 10⁶ buniek (kloň 293#3) v 850 ml DMEM doplnenom 5 percentami FBS a inkubovaná počas 72 hodín pri 37°C. Médium bolo odobrané a nahradené 850 ml DMEM s 5 percentami FBS. Potom bola bunková továreň inkubovaná počas 42 hodín pri 37°C, médium bolo druhýkrát, odobrané a nahradené 850 ml DMEM s 5 percentami FBS. Potom bola bunková továreň inkubovaná počas 48 hodín pri 37°C a médium bolo odobrané tretíkrát (a napos1edy).

Po každom odobraní bol k médiu pridaný 0,02-percentný azid sodný. Médium bolo vyčistené centrifugáciou (5000 x g), prefi 1trované cez 0,2 pm filter a skladované pri 4°C až do doby ďalšej purifikácie. Monoklonálna protilátka CY1787 bola konjugovaná k proteín-A sefaróze v podstate tak, ako je to opísané Schneiderom et al-, J. Biol. Chem., 257 - 10766 (1982). V krátkosti - 28 mg monoklonálnej protilátky CY1781 (5 mg/ml) v PBS bolo miešaných s 5 ml proteín-A sefarózy počas 30 minút pri izbovej teplote. Zrnká boli potom štyrikrát premyté centrifugáciou s 25 ml 0,2 M borátového pufra, pH 8,2 s následnými dvoma premytiami s 10 ml 0,2 M trietanolamínom, pH 8,2. Náplň potom bola suspendovaná v 40 ml 0,2 M trietanolamínového pufra, pH 8,2, obsahujúceho 0,02 M dimetylpipelimidát. Po 45 minútovej reakcii pri izbovej teplote bola náplň počas rotovania dvakrát premytá 0,02 M etanolam inom, pH 8,2, s následnými tromi premytiami s 10 ml 0,2 M borátového pufra, pH 8,2. Nenaviazaná protilátka bola odstránené! elúciou s 0,1 M nátriumacetátovým pufrom, pH 4,5. Z aplikovanej protilátky sa 89 percent skonjugovalo s proteín-A sefarózou.

10024

Supernatant tkanivovej kultúry (2550 ml) prechádzal cez 0,7 cm x 1,5 cm afinitnú kolónu CY1787-proteín-A sefarózy pri prietoku 20 ml/hod. Kolóny potom boli odpojené a afinitná kolóna, obsahujúca CY1787 bola premývaná 20 mT Tris pufrom, pH 7,5, obsahujúcim 150 mM NaCl a 2mM CaCl2. až kým sa absorbencia eluátu pri 280 nm nepriblížila k nule. Viazaný E-selektín bol eluovaný 0,1 M nátriumacetátovým pufrom, pH 3,5, obsahujúcim 1 mM CaCl2 pri použití gravitačného prietoku. Frakcie (1 ml) boli zbierané do 300 ul 2 M Tris, pH 10. Frakcie obsahujúce bielkovinu boli spojené a dialyzované na DPBS. Po skoncentrovaní na Amicon Centriprep 30 do dosiahnutia koncentrácie bielkoviny približne 1 mg/ml bol purifikovaný E-selektín rozdelený na alikvóty a uchovávaný pri -80°C. Čistota podľa SDS PAGE bola vyššia než 90¾. Z 2550 ml média tkanivovej kultúry bolo vypurifikovaných celkovo 10 mg E-selektínu.

Dulbecco PBS (DPBS) (Vhittaker, 17-513B)

HL-60 (ATTC, CCL 240) Veľká šarža buniek HL-60 bola ponechaná narást, bola testovaná na funkčnosť, v teste a neprítomnosť mykoplazmy.

Bunky boli zmrazené pri -180°C v 10-percentriom DMSO, 10-percentnom fetálnom teľacom sére, 80-percentnom RPMI 1640 (Vhittaker) pri 15xl0⁶ buniek na skúmavku v 2 ml kryoskúmavkách. Zmrazovanie bolo vykonané v zariadení s riadenou rýchlosťou.

Zlúčenina Z - štandardný SLe* pentasacharid-OEt.NeuAc«2->3Gal(3l->4[Eucccl->3] GlcNAc3l->3Gal(i0et

Standard zlúčeniny bol pripravený ako 10 mM roztok v DPBS. Roztok bol uchovávaný pri -20°C.

Pufor na premývanie neutrofilov (NVB):

100

10024

10Χ HBSS (Gibco, 310-4065) 1 M HEPS (Gibco. 380-5630) Super Q H2O

D-glukóza (Sigma, G 7021) ml 2 ml 178 ml 0,4 g

200 ml

Pripravovaný pri 4°C. pH 7 denne čerstvý, alebo skladovaný sterilizovaný 2 - 7,4, sterilizovaný filtráciou (0,2 μ).

100 mM CaCl₂.

zásobný roztok·

Chlorid vápenatý, bezvodý (Baker, 1308) Super Q H2O

1,11 g 100 ml

Sterilizovaný filtráciou (0,2 μ)

Pufor na premývanie neutrofilov + 1 mM CaCl2 BSA (NVB/Ca/BSA)

100 ml 0,1 percentná

Bovinný sérový albumín (Sigma, A-6918) 100 mM CaCL2, zásobný roztok g 100 ml

NVB do

1000 ml pH 7,2 - 7,4. Sterilizovaný filtráciou (0,2μ), zásobný roztok skladovaný pri 4°C.

Blokovací pufor DPBS (Vhittaker, 17-513B)

Bovinný sériový albumín (Sigma, A-6918)

100 ml 1 g

100 ml

101

10024 pH 7,2 - 7,4. Sterilizovaný filtráciou (0,2μ), zásobný roztok skladovaný pri 4°C.

Roztok kyseliny citrónovej, 0,1

Kyselina citrónová, voľná kyselina (Sigma, C-0759) 10,5 g

Super Q HzO doplniť na 500 ml

Pripraviť, vo voluraetrickom alebo kalibrovanom valci. Skladovať pri izbovej teplote.

Roztok fosforečnanu sodného, 0,2

Fosforečnan sodný, dvojbázický, bezvodý (NaHaPCLs) (Sigma, C-0759) 14,2 g

Super Q H2O doplniť na 500 ml

Pripraviť vo volumetrickom alebo kalibrovanom valci. Skladovať pri izbovej teplote.

Pufor citrát/fosfát=

Roztok kyseliny citrónovej, 0,1 M ^: Roztok fosforečnanu sodného, 0,2 M Super Q H2O

24,3 ml 25,7 ml
50	ml
100	ml

Skladovať- pri izbovej teplote.

102

10024

Bunkový lyzačný pufor:

Nonidet P 40 (NP-40) (Sigma, N-6507)	0 ,	1 g
0,1 M cit-rát	24,3	ml
0,2 M fosforečnan sodný, dvojbázický	25,7	ml
Super Q H2O	50	ml

100 ml

Skladovať pri izbovej teplote.

□PDA (o-fenyléndiamín) ^:

Pufor cit-rát/fosf át 10 ml o-Feny1éndiamín dihydrochlorid (Sigma, P 8287) 10 mg H2O2 (Sigma, H 1009) 10 jjI

Pripravený bezprostredne pred použitím. Peroxid vodíka bol skladovaný v tme pri 10°C.

H2SO4 stop pufor, 4N

Kyselina sírová, IBM (Fisher, Ä300s-212) 111 ml

Super Q H2O do 500 ml

103

10024

Metóda

1. rELAM (sol-E-selektín) bol nariedený na koncentráciu príslušnú pre bežnú šaržu. V týchto testoch bol rELAM používaný v 2,5 ng/ml v DPBS. Pri použití viackanálovej pipety bolo pridaných 50 μΐ na jamku do nasledujúcich jamiek jednej ELISA doštičky: E1-E6, F1-E6 a G1-G6.

DPBS (50μ1) bol pridaný do jamiek Hl, H2 a H3 na kontrolné použitie. Na túto doštičku sa odkazuje ako na predtestovaciu doštičku.

Jedna dal šia doštička bola pokrytá pre každé tri neznáme vzorky, ktoré mali byt testované. Opäť pri použití viackanálovej pipety bolo pridaných 50pl zriedeného rELAM do nasledujúcich jamiek doštičiek’B1-B12, C1-C12, D1-D12, E1-E12, E1-E12, G1-G12. Na tieto doštičky sa odkazuje ako na vzorkové doštičky. Tieto doštičky boli zakryté fóliou a inkubované tri hodiny pri izbovej teplote.

2. Doštičky boli premyté trikrát s 200 μΐ blokovacieho pufra. Jamky boli znova naplnené 200 μΐ blokovacieho pufra, zakryté fóliou a inkubované jednu hodinu pri izbovej teplote.

3. Tri skúmavky zmrazených buniek HL-60 boli rozmrazené na každú z dvoch pripravených vzorových doštičiek. Skúmavky boli rýchlo rozmrazené v kúpeli s teplotou 37°C. Bunky boli napipetované do 15 ml centrifugačnej skúmavky obsahujúcej 10 ml ľadového NVB 1 percentného BSA. Bunky boli centrifúgované 7 minút pri 1200 rpm v 4°C centrifúge a premyté ešte dvakrát v NVB/BSA. Bunky boli spočítané pri použití hemocymetra a resuspendované na 10⁷/ml v NVB + 1 percentná BSA mM CaCl2.

104

10024

4. Zatlaľčo boli premývané bunky, boli pripravené roztoky testovaných a štandardných zlúčenín. 01igosacharidová zlúčenina, ktorá mala byt testovaná, bola navážená do

1,5 ml Eppendorfovej skúmavky a bol pridaný DPBS na prípravu vzorky ako 10 mM roztoku podľa jej molekulovej hmotnosti. Alikvóta objemu 6 pl bola odobraná z každej vzorky a po 2jul bolo nanesených na každý štvorček pH testovacieho prúžku. Keď vzorka nemala pH 7 - 7,4, hodnota bola nastavená do tohoto rozmedzia, lebo inak nebola zlúčenina testovaná. Test vyžaduje 180 pl 10 mM roztoku každej použitej zlúčeniny a 180 pl 10 mM roztoku zlúčeniny Z na každú doštičku, vrátane testovacej doštičky.

5. Blokované ELISA doštičky boli prevrátené s mávnutím a odsané s prudkúm poklepávaním na papierovú utierku tak, aby sa odstránila z jamôk všetka kvapalina. Do každej jamky bolo potom pri použití viackanálovej pipety pridaných 40 pl NVB + 1 percentná BSA + 1 mM Ca²⁺.

6. Z jamiek E6 a G6 predtestovacej doštičky bola odstránená všetka kvapalina. Alikvóta objemu 40 pl z 10 mM zásobného roztoku zlúčeniny Z bola pridaná do každej z týchto prázdnych jamiek, ako aj do jamiek E5 jamke E5 bol premiešaný pipetovaním a nadol pomocou p 200 pipetora nastaveného na 40 pl. Alikvóta objemu 40 pl roztoku bola odobraná z jamky a sériovo radená na doštičke v jamke E4, potom E3 a potom E2, objemu 40 a vyhodená.

a G5. Roztok v 10-krát. nahor zakaždým s miešaním pl bola odobraná Tento postup bol krát. Alikvóta z poslednej jamky opakovaný pre rady G4 až G2.

105

10024

7. Bunky HL-60 (2 x 10⁶ ) boli pridané do každej jamky (s výnimkou H10 v 20 ul pri použití viackanálovej pipety. Doštička bola umiestnená do trepačky doštičiek na pät sekúnd, a ponechaná štát 15 minút pri izbovej teplote.

8. Doštička bola premytá pri použití premývaeky Molecular Devices Microplate Vasher nastavenej na pomalé dodávanie tekutiny a tri premytia na jamku, s NVB +· 1 percentnou BSA + lmM CaCl2 ako premývacím roztokom.

9. Bol pridaný bunkový lyzačný pufor (50 μΐ na jamku) a doštička bola umiestnená do trepačky doštičiek na pät minút pri izbovej teplote.

10. Bola pridaná alikvóta OPDA roztoku v objeme 50 μΐ na jamku, a doštička bola umiestnená do trepačky doštičiek na desať minút pri izbovej tep1otelí. Farebná reakcia bola stop pufra na jamku, doštičky bola čítaná blanku.

zastavená pridaním 40 μΐ H2SCM a optická denzita (O.D.) jamiek pri 492 nm, s odčítaním Hl ako

12. Negatívna kontrola bola určená vzatím stredu O.D. hodnôt pre jamky H2 a H3. Toto je negatívna väzbová kontrola bez E-selektínu. Pozitívna väzbová kontrola bola vypočítaná pre štandardnú krivku ako stred jamiek E1, F1, F2, F3, F4, F5, F6 a Gl. Keď negatívna väzbová kontrola bez E-selektínu bola väčšia než 10 percent stredu pozitívnej väzbovej kontroly, v teste sa nepokračovalo. Keď táto hodnota bola menšia alebo rovná stredu pozitívnej väzbovej kontroly, duplikáty vzoriek (E6, G6), (E5, G5), (E4, G4), (E3, G3) a (E2,

G2) boli spriemerované. Každý priemer duplikátov bol vydelený hodnotou stredu pozitívnej väzbovej

106

10024 kontroly, čo dalo percento pozitívnej väzby pre každú koncentráciu testovanej zlúčeniny. Percento pozitívnej väzbovej kontroly“ bolo vynesené oproti log charakteristike koncentrácie inhibítora. Z grafu bol určený bod 50 percentnej inhibície. Tento bod musí ležať, medzi 0,5 a 1,5 mM, v opačnom prípade sa v teste nepokračuje.

13. Ak bola štandardná krivka predtestovacej doštičky v prijateľnom rozsahu, vykonal sa zvyšok testu. Štandardná zlúčenina Z bola riedená na každej vzorkovej doštičke ako v kroku 6. Testované zlúčeniny boli riedené podobne. Testované zlúčeniny analogické SLe^x boli na doštičke umiestňované podľa nasledujúcej matrice:

Kone.			Test	č. 1	Test	č. 2	Test	č. 3
6,6 mM alebo	ried.	1	B6,	D6	B7,	D7	E7,	G7
3,3 mM	r ied.	2	B5,	D5	B8,	D8	E8,	G8
1,65 mM	ried.	3	B4,	D4	B9,	D9	E9,	G9
0,82 mM	ried.	4	B3,	D3	B10,	D10	E10,	G10
0,412 mM	ried.	5	B2,	D2	Bil,	Dll	Eli,	Gll

Keď boli všetky vzorky nariedené na doštičku, boli pridané bunky HL-60 ako v kroku 7 a postup pokračoval až po krok 11.

15. Stred pozitívnej väzbovej kontroly bol vypočítaný pre test č.l z jamiek B2, Cl-6 a D2: pre test č.2 z jamiek B12. C7-12 a D12; pre test č.3 z jamiek E12, E7-12 a G12. Percento pozitívnej väzby pre každé riešenie každého testu bolo vynesené do grafu a z grafu bol určený bod 50-percentnej inhibície. Aktivita pre každú testovanú zlúčeninu analogickú SLe^x bola zaznamenaná

107

10024 ako pomer 50-percentnej väzbovej hodnoty pre štandardnú zlúčeninu Z s 50-percentnou väzbovou hodnotou pre testovanú vzorku SLe^x. Hodnota pre SLe^x samotný bola určená podobne.

Pomery pre niektoré uvažované analógy SLe^x sú poskytnuté v Tabuľke 4.

108

10024

Test. bunkovej adhézie s E-selektínom

Pomer

C IC50 zlúčeniny Z

Z1účen i na

Číslo z 1účen i ny

IC50 zlúčeniny )

0.76

5.0

30.

3.2

4.3

0.53

9.3 10.0 11.2

109

10024

Tabuľka (pokračovani e )

Pomer ( ICso zlúčeniny Z

Zlúčenina

Číslo zlúčeniny

IC50 zlúčeniny )

0.2

4.7

5.7

8.9

’OOC

4.0

MO o

10.0

110

10024

Tŕifciorkľéi XS=

C pokračovaní e)

Pomer ( IC50 zlúčeniny Z

Zlúčenina

Číslo zlúčeniny

IC50 zlúčeniny )

c

2.3

6.0

6.0

0.3

3.0

3.0

111

10024

Uvedené je pre predkladaný vynález mienené ako vysvetľujúce, ale nie obmedzujúce. Mnohé variácie a modifikácie môžu byt vykonané bez odchýliek od skutočného úmyslu a rozsahu nových prístupov podľa tohoto vynálezu.

- 112

10024

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Zlúčenina analogická sialyl Le^x podľa všeobecného vzorca A (A)
2. 2--^<-^6-or⁵ r⁵o ^orS je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z ECO). SO2.

   HNCCO). 0C<0) a SCCO):

   R¹ pozostáva júcei nonoti ahydroje vybraný zo skupiny pozostávajúcej z arylovej. substituovanej arylovej a fenyl Ci-C3 alkylénovej skupiny, kde arylová skupina má jeden päť- alebo šesťčlenný aromatický kruh, fúzované päť/šesťč1enné aromatické kruhy alebo dva fúzované šesťčlenné aromatické kruhy, ktorých kruhy sú vybrané zo skupiny z hydrokarby1ových. monooxahydrokarby1ových.

   karbylovýrh. monoazahydrokarby1ových a d iazahydrokarhy1ových kruhov a substituovaná arylová skupina je uvedená arylová skupina, ktorá má substitút. vybraný zo skupiny pozostáva júce j z halo-, t.r i f 1 uormet.y 1 ových , nitro-, Ci-Cie alkylových. C1-C-18 a l koxy l ových . amino-. mono O1-C18 a l kylam 1 nových. d i C1-C10 a 1kyI am ínových, benzylam fnových, Γι-Γιο a 1ky1benzy1 am 1 nových. C1-C10 t ioaIky1nvých a C1-C18 a 1 ky1karboxamidových skupín, alebo

   R¹Y ie a 1ly1karbouy1 alebo chloracetyl;

   R² je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka.

   113

   10024

   Ci-Cie priameho reťazca. vetveného reťazca alebo cyklického hydrokarby1 u. Ci-Cď alkyl Ci-Cs alkylén Ω-karboxy1átu. íl-tri(Ci-C4 alkyl/fenyl) silyl C2-C4 alkylénu. monosacharidu a disacharidu;

   alebo OR² spolu tvorí Ci-Cis priamy reťazec, vetvený reťazec alebo cyklický hydrokarbyl karbamát.;

   R³ je vodík alebo Ci-Cŕ acyl:

   R⁴ je vodík. Ci-C6 alkyl alebo benzyl:

   R⁵ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, benzylu. metoxybenzy1 u. dimetoxybenzy1 u a Ci-Ce acylu:

   R⁷ je metyl (CH3) alebo hydroxymetyl (CH2OH): a X je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Ci-Ce acyloxy,

   C2-Cô hydroxyacyloxy, hydroxy, halo a azido.

   2. Zlúčenina analogická sialyl Le^x podľa všeobecného (II) subst. 1 tuovane 1 a ry 1 ove j kde a rylová skupina

   Y je vybraný zo skupiny pozostávaiúcei z CCO). SO2. INCCO. ľ)C(O) a SCCO:

   R¹ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z arylovej, íi fenyl Ci -C 3 alkylénovej skupiny, má jeden päť- alebo šesťčlenný iromat.ický kruh. fúzované päť./šestč 1 enné aromatické kruhy ílebo dva fúzované šesťčlenné aromatické kruhy, ktorých :ruhy sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej : hydrokarby1ových. monooxahydrokarhy1ových, monot i aliydro:arby 1 ových . norioaza hyd roka rhy 1 ových a d i azahyd roka rby I ových :ruhov ,1 substituovaná ary 1 ová skupina je uvedená a ry 1 ová • kup i na. ktorá má subst it.út vybraný zo skupiny

   114

   10024 pozostávajúcej z halo-, tri f 1uorraetylových. nitro-. Ci-Cie alkylových. Ci-Cia a 1koxy1ových. amino-, mono Ci-Cie alkylamínových. d i Cj-Cia alkylamínových, benzylamínových, C-1-C18 a lky 1 benzy 1 am í nových . Ci-Cia t i oa 1 ky 1 ových a Ci-Cie alky1karboxaraidových skupín, alebo

   R² je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka. Ci-Cie priameho reťazca. vetveného reťazca alebo cyklického hydrokarbylu. Ct-Ce alkyl C1-C5 alkylén Ω-karboxy1átu. Q-t.rl(Ci-C4 alkyl/fenyl) silyl C2-C4 alkylénu. monosacharidu a disacharidu;

   alebo OR² spolu tvorí Ci-Cie priamy reťazec, vetvený reťazec alebo cyklický hydrokarbyl karbamát;

   R³ je vodík alebo Ci-Ce acyl;

   R⁴ je vodík, Ci-Ce alkyl alebo benzyl;

   R^& je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, benzy lu. metoxybenzy 111. d imetoxybenzy1 u a Ci-Cô acylu;

   R⁷ je metyl (CH3) alebo hydroxymety1 (CH2OH): a

   X je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Ci-Ce acyloxy, C2-C6 hydroxyacy loxy, hydroxy, halo a azido.
3. 3. Zlúčenin/i analogická sialyl vzorca B

   Le^x podľa všeobecného (B)

   HjC

   OR⁵

   R^só ^orS

   115

   10024

   Y je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z CCO), SO2, HNCCO), 0C(0) a SCCO);

   R¹ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z arylovej, substituovanej arylovej a fenyl C1-C3 alkylénovej skupiny, kde arylová skupina má jeden pät- alebo šesťčlenný aromatický kruh, fúzované päť/šesťčlenné aromatické kruhy alebo dva fúzované šesťčlenné aromatické kruhy, ktorých kruhy sú vybrané zo skupiny z hydrokarbylových, monooxahydrokarbylových, pozostávajúcej monot iahydrokarbylových, monoazahydrokarbylových a diazahydrokarbylových kruhov a substituovaná arylová skupina, ktorá pozostávajúcej z halo-, arylová skupina je skôr uvedená má substitút vybraný zo skupiny trifluormetylových, nitro-, Ci-Cis alkylových, Ci-Cie a 1koxylových, amino-, mono Ci-Cie alkylamínových, di C1-C18 alkylamínových, benzylamínových, Ci-Cis alky1benzylamínových, Ci-Cis tioalkylových a Ci-Cis alkylkarboxamidových skupín, alebo

   R¹ Y je allylkarbony1 alebo chlóracetyl;

   skupiny pozostávajúcej z vodíka, vetveného reťazca alebo cyklického

   R² je vybraný zo Ci-Cis priameho reťazca, hydrokarbylu, Ci-C6 alkyl C1-C5 alkylén Ω-karboxylátu, Q-tri<Ci-C4 alky1/fenyl) silyl C2-C4 alkylénu, monosacharidu a disacharidu;

   alebo OR² spolu tvorí Ci-Cie priamy reťazec, vetvený reťazec alebo cyklický hydrokarby1 karbamát;

   R³ je vodík alebo Ci-Cď acyl;

   R⁴ je vodík, Ci-Cď alkyl alebo benzyl;

   R⁵ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, benzylu, metoxybenzylu, dimetoxybenzylu a C1-C6 acylu;

   R⁷ je metyl (CH3) alebo hydroxymetyl (CH2OH); a X je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Ci-Cď acyloxy,

   C2-Cď hydroxyacyloxy, hydroxy, halo a azido.

   116

   10024

   Zlúčenina analogická sialyl Le* podľa všeobecného (I)

   Y ie vybraný zo skupiny pozostávajúcej z HNCCO), OCCO) a SCCO):

   CCO). SO2

   R¹ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z arylovej substituovanej arylovej kde arylová skupina a fenyl Ci-C3 alkylénovej skupiny, má jeden pät- alebo šesťčlenný aromatický kruh. fúzované päť/šesťčlenné aromatické kruhy alebo dva fúzované šesťčlenné aromatické kruhy, ktorých kruhy sú vybrané zo skupiny z hydrokarbylových. monooxahydrokarby1ových.

   pozostáva j úcej monot i ahydrokarbylových, monoazahydrokarbylových a diazahydrokarbylových kruhov a substituovaná ary lov čí skupina. ktorá pozostávajúcej z halo-.

   arylová skupina je skôr uvedená má substitút vybraný zo skupiny tri f 1uormetylových, nitroCi-Cie alkylových, Ct-Cia a 1 koxy1ových, amino-, mono Ci-Cie a 1ky1 am ínových . d i Ci-Cie a 1kylamínových. benzy1 am ínových . Ci-Cia a 1 ky 1 benzy 1 am í nových . Ci-Cia t. i na 1 ky 1 ových a Ci -Cie a 1ky1karboxamidových skupín, alebo

   R² je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka. C-i-C-ia priameho reťazca. vetveného reťazca alebo cyklického hydrokarby l u . Ci-Ce alkyl Ci -C5 a l ky l én Ω-karboxylátu, Ω-ťrt (C-ι-C.4 alkyl/fenyl) silyl C2 -Cť, alkylénu, monosaeharidu a d i sacharidu:

   alebo OR² spolu tvorí Ct-Cie priamy reťazec, vetvený reťazec alebo cyklický hydrokarbyl karbaináť;

   R³ je vodík alebo Ci-Cô acyl:

   R“¹ je vodík. Ľľ 1 -(’ô alkyl alebo benzyl:

   R⁵ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, benzylu. metoxybenzy1 u. d imetoxybenzy1 u a C1-Cô acyl u;

   117

   10024

   R⁷ je metyl (CH3) alebo hydroxymetyl (CH2OH): a X je vybraný zo skupiny pozostáva júcej z Ct-C& acyloxy.

   C2-C6 hydroxyacyloxy. hydroxy. halo a azido.

   5. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m. Že farmaceutický prijateľné zried'ovadlo má v sebe rozpustené, prípadne dispergovane bunkovú adhéziu inhibujúce množstvo zlúčeniny podľa všeobecného vzorca I kde Y je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z CCO). S0₂ . HNCCO), OCCO) a SCCO);

   R¹ je ako je definované vyššie a s výhodou je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z arylovej. substituovanej arylovej a fenyl Ci-C3 alkylénovej skupiny, kde arylová skupina má jeden pat- alebo šesťčlenný aromatický kruh. fúzované päť/šestč1enné aromatické kruhy alebo dva fúzované šesťčlenné aromatické kruhy s klip i ny pnzos t áva j úce i nwnooxahydrokarhy1ových. inonoazahydrokarby 1 ových a ktorých kruhy sú vybrané zo z hydrokarby1ových, m on o t. i a hyd m- kar by I ových .

   d iazahydrokarby1ových kruhov a substituovaná arylová skupina j·? skôr uvedená arylová skupina. k to rá m á pozostávajúcej z halo-.

   substitút- vybraný zo skupiny trif luormetylových, nit.ro-, O1-C-18 alkylových. Ci-lľui alkoxylových. amino-. mono C1-C18 a l ky i am í nových , d i Cr-Cie a 1 ky 1 am í nových . hoiizy l am í nových . Γ1-Γ10 a I ky i benzy I am 1'nových . Oi-Cm t. i oa 1 ky l ových a Ci-C-ia

   118

   10024 alky lkarboxamidových skupín ;

   R² je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka,

   Ci-Cis priameho reťazca, vetveného reťazca alebo cyklického hydrokarbylu, Ci-Cď alkyl Ci-Cs alkylén Ω-karboxylátu, Q-triCCi-C^i alkyl/fenyl) silyl C2-C4 a lky lénu, monosacharidu a disacharidu;

   R⁷ je metyl (CH3) alebo hydroxymetyl (CH2OH); a X je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z C1-C6 acyloxy,

   C2-C6 hydroxy1acyloxy, hydroxy, halo a azido.

   6.

   Spôsob prípravy laktózamóniovej soli, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky

   a) zmiešanie laktulózy a primárneho amínu, ktorý je monosubstituovaným derivátom araónia, ktorého dusíkový atóm je viazaný k reduktívne odstrániteľnej chrániacej skupine, za vytvorenia reakčnej zmesi, pričom uvedený primárny amín slúži ako rozpúšťadlo aj reaktant a je prítomný v množstve 2- až 10-k.rát vyššom, než je molárne množstvo laktulózy;

   b) udržiavanie uvedenej reakčnej zmesi pri teplote 10°C až 60°C, počas doby dostatočnej na vytvorenie príslušného laktulózo N-glykozidu;

   c) ponechanie uvedeného

   N-glykozidu reagovať s až karboxylovej kyseliny majúcej piť v rozpúšťadle Ci-C3 alkoholu, k prešmyku uvedeného laktulózo ain i ηα-bl okovanú 1 aktózamón i ovú soľ, odstrániteľnú chrániacu skupinu viazanú k amínu;

   d) reduktívne odstránenie chrániacej skupiny z uvedenej amino-blokovanej laktózamóniovej soli za tvorby laktózamóniovej soli.

   vytvoreného ekvivalentným laktulózo množstvom hodnotu 2,5 až 5,0 pri teplote 10°C až 30°C N-glykozidu na majúcu reduktívne

   119

   10024

   120

   10024

   121

   10024

   8. Zlúčenina podľa nároku 4, v y z n a č u j úca tým. že je členom skupiny skladajúcej sa z

   122

   10024

   123

   10024

   9. t ý

   Zlúčenina podľa nároku . že le členom skupiny.
4. 4. v y z n sklada júce j a č u j ú sa z a sa

   124

   10024 ·>