CZ89098A3 - Syntetické polylaktosaminy obsahující až multivalentní sLEX a metody pro jejich použití - Google Patents

Description

Syntetické polylaktosaminy obsahuj ícu/multivalentní sLEX a metody pro jejich použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález je zaměřen na nové kompozice a jejich použití v léčbě zánětlivých odpovědí. Přesněji, vynález je zaměřen na nové syntetické oligosacharidové konstrukty, Zejména na poly-N-acetyllaktosaminy s navázanými mnohotnými sLEX a na jejich použití pro blokování vazby lymfocytů na odpovídající óligosácháridý na povrchu éndotélu a tak na redukci nebo zmírnění nežádoucí zánětlivé odpovědi a jiných chorobných stavů charakterizovaných vazbou lymfocytů. Dále je vynález zaměřen na použití nových sacharidů pro blok bakteriální adherence na endotel a tak na prevenci a/nebo léčbu bakteriálních infekcí. Další použití předkládaného vynálezu spočívá v oblasti protinádorové terapie, kde je metastasování sLex-pozitivních tumorů inhibováno těmito glykany.

Dosavadní stav techniky

Buněčná adhese zprostředkovaná selektiny

Migrace bílých krvinek z krve do oblastí patologických stavů v těle se nazývá zánětlivá kaskada. Děje buněčné adhese jsou umožněny specifickou vazbou leukocytů na endotel cév, které jsou v blízkosti zánětlivého insultu; proti takovým adhesím působí cévní střihové síly a vysoký stupeň průtoku, který působí pro udržení leukocytů v cirkulaci a napomáhají přesunu leukocytů do požadovaného místa.

·· 4 4 · · Β 4 · · • · 4 ♦ ♦ ··· * 4 • 44 » . 4 4 ♦ 4 4 4 • · · ·♦ · ♦ 4« 4 4 ··

Migrace' leukocytů během zánětlivé odpovědi se účastní čtyři rodiny cévních adhesních molekul: (1) rodina integrinů, (2) receptory rodiny integrinů, imunoglobulinová rodina, (3) rodina selektinů a (4) receptory rodiny selektinů, specializované uhlovodany sialomucinové adhesní rodiny.

Selektiny jsou také známé jako lektinové buněčné adhesní molekuly (LEC-CAM). Selektiny se klasifikují do tří skupin: L-selektin (LECAM-1, LAM-1, gp90^MSL, Leu-8, TQ-1, CD62L a DREG) je exprivován na různých leukocytech a je konstitutivně exprivován na lymfocytech, monocytech, neutrofilech a eosinofilech. E-selektin (LECAM-2, CD62E a ELAM-1) je exprivován na ěndotelu aktivovaném zánětlivými mediátory. P-selektin (GPM-140, PADGEM, LECAM-3 a CD62P) je skladován v alfa-granulích destiček a ve Weibel-Paladeovych tělíscích endoteliálních buněk a je také exprivován na endotelu aktivovaném zánětlivými stimuly. Zdá se, že všechny členy selektinové rodiny zprostředkují buněčnou adhesi přes rozpoznávání uhlovodanů.

Současný koncept extravasace leukocytů je založen na postupném účinku několika adhesních molekul umístěných na povrchu leukocytů a endotelu. Extravasace lymfocytů je iniciována interakcí členů selektinové rodiny s jejich receptorovými protějšky obsahujícími oligosacharid. Pro přehled nynějších znalostí o adhesi lymfocytů viz např. Springer, T. A., Annu. Rev. Physiol. 57: 827 - 872 (1995) .

Všechny selektiny se váží na sialyl Lewis x (neuNAca2-3GalSl-4 (Fucal-3)GlcNAc (sLE^ nebo sLex) a sialyl Lewis a(neuNAca2-3GalE 1-3(Fucal-4)GlcNAc (sLE^a nebo sLea) stejně jako na příbuzné uhlovodanové sekvence (Bertozzi C., Chemistry and Biology, 2: 703 ~ 708 (1995)). Na L-selektinu dependentní rozpoznávání předchází normální extravasaci lymfocytů do periferních lymfatických uzlin (Gallatin, W.M., et al., Nátuře, 303: 30 - 34 (1983)) a do místa zánětu (Ley, K. et al., Blood 77: 2553 - 2555 (1991)), kde oba tyto děje jsou narušeny u L-selektin deficientních myší (Arbones, M.L et al., Immunity 1: 247 - 260 (1994)).

V současné době jsou známy tři glykoproteinové ligandy pro L-selektin: GlyCAM-1, CD34 a MAdCAM-1. Přesné struktury biologických ligandů pro L-selektin nejsou dosud známy, ale základní uhlovodanové epitopy mají některé společné strukturální vlastnosti. Jsou to O-glykosidicky vázané oligosacharidy mucinového typu s N-acetyllaktosaminovou kostrou, která je 3N-sialyzovaná nebo 3N-sufatovaná, 3-fukosylovaná a někdy 6- nebo 6N-sulfatovaná na distálním N-acetylaktosaminovém konci.

Multivalenčnost sacharidových ligandů zvyšuje vazbu selektinu. Poslední studie ukázaly, že schopnost oligosacharidu inhibovat *· adhesi leukocytů zprostředkovanou L-selektinem se zvyšuje se zvyšujícím se počtem sialyl LE^ skupin (Turunen, J.P. et al., J. Exp. Med. 182 (4): 1133 - 1141 (1995)), a že multivalentní sialyl LE^X jsou zejména účinné jako inhibitory E-selektinu (DeFrees, S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 115: 7549 - 7550 (1993); Welply, J.K. et al., Glycobiology 4: 259 - 265 (1994); DeFrees S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 66 - 79 (1995)). Polylaktosaminová kostra ligandů P-selektinu PSGL-1 je rozvětvená a obsahuje několik fukos (Wilkins P.P. et al., J. Biol. Chem. 271: 18732 18742 (1996)) a přítomnost mnohotně fukosylovaných a mnohotně sulfatovaných glykanů v GlyCAM-l (Hemmerich, S. et al., J. Biol. Chem. 270: 12035 - 12047 (1995)) naznačuje, že také jednotlivé přirozené uhlovodanové ligandy pro selektiny mohou být

• · 4 4 • · 4	4 4 • 4	• • 4 4	• 4 4 ·	• · 4 ·
• 4 4	• 4	• 4	•	• *
• · 4 * 4	44'	• ·	44	•

multivalentní.

Velké množství endoteliálních buněk v periferních mízních uzlinách exprivuje sialyl Lewis x a sialyl Lewis a (sLex a sLea) epitopy (Paavonen and Renkonen, Am. J. Pathol. 141: 1259 - 1264 (1992); Munro, J.M. et al., Am. J. Pathol. 141: 1397 - 1408 (1992); Sawada, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193: 337

I - 347 (1993)), což jsou Části receptorů pro L-selektin.

í j Endoteliální buňky v několika jiných lokalitách jsou sLea a sLex negativní, ale zánětlivá stimulace může indukovat dříve negativní endotel k expresi těchto oligosacharidových struktur de novo (Turunen J. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994)).

Bylo ukázáno, že kultivované endoteliální buňky mohou generovat n.

alespoň sLex, protože mají několik funkčních «2,3 sialyl- a «1,3 fukosyltransferas, enzymů, které se účastní generování sLex z (póly) laktosaminů (Majuri, M et al., Eur. J. Immunol. 24: 3205 3210 (1994)).

Mnoho studií naznačilo, že selektiny jsou zahrnuty ve velkém množství aktuních a chronických zánětlivých stavů v mnoha tkáních. Bylo naznačeno, že mohou být navržena léčiva, která by narušila škodlivou migraci leukocytů, které poškozují tkáň v mnoha abnormálních zánětlivých stavech. Nicméně, pouze velmi vysoké koncentrace (v řádu mM) monomerních cukrů s nábojem blokují adhesi. Bylo ukázáno, že specifická sada polyvalentních, . aniontových cukrů, jako je fukoidin (polymer fukosa-4-sulfatu) a i polyfosfomananový ester buněčné stěny kvasinek (PPME) blokují ; tuto adhesi v koncentracích v řádu nM (Stoolman, L.M. et al., J.

Cell. Biol. 99: 1535 - 1540 (1984)). Kromě toho, bylo popsáno, že oligosacharidy odvozené od sLɳ⁶ struktury mají protizánětlivou aktivitu. Jak u formy obsahující kyselinu sialovou (sLE^), tak u • ♦ · · · * « ···· • φ · φ · * · · · · «· • · · φ · · · · · ··♦ · · ·*· *«·« · » · ····· ·♦ »· · · ·« sulfátové (sulfo-LE^) formy tohoto oligosacharidu byla popsána protizánětlivá aktivita in vivo (Lásky, L.A. Annu. Rev. Biochem. 64: 113 - 139 (1995) ; Mulligan, M.S. et al., Nátuře 364: 149 151 (1993); Mulligan, M.S. et al., J. Exp. Med. 178: 623 - 631 (1993); Buerke, M. et al., J. Clin. Invest. 91: 1140 - 1148 (1994) a Nelson, R.M. et al., J. Clin. Invest. 91: 1157 - 1166 (1993)).

Protože lymfocytární infitrace je zásadní pro akutní rejekci orgánového transplantátu (Renkonen, R. et al., Cell Immunol. 77: 188 - 195 (1983)), je analýza regulace migrace lymfocytů do štěpu významná. Bylo ukázáno, že peritubulární kapilární endotel (PTCE) v ledvinných transplantátech začíná exprivovat sLex de novo a váže zvýšené množství lymfocytů během, rejekce (Turunen J. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994)).

U.S. patent č. US 5352670 od Venot et al. popisuje metodu pro enzymatickou syntesu α-sialyzovaného oligosacharidového glykosidu za použití sialyltransferasy, analogu CMP-sialové kyseliny jako donoru kyseliny sialové a oligosacharidového glykosidu jako akceptorové molekuly, mající EGal(1-3)EGlcNAc nebo EGal(1-4)EGlcNAc disacharid na neredukujícím konci.

Mezinárodní patentová přihláška č. W095/03059 (Gaeta et al.) popisuje syntetický sacharid, který obsahuje dvě glykosidicky vázané sLex skupiny, které jsou užitečné v blokování buněčné adhese, zejména inhibicí vazby E-selektinu. Tyto sLex obsahující oligosacharidy jsou synteticovány na galaktosové kostře.

Oblast vynálezu

Rozpoznání L-selektinu na buněčném povrchu uhlovodanovými ligandy způsobuje přilnutí lymfocytů na kapilární endotel v místě zánětu. Protože tento primární kontakt je bezpodmínečně nutný pro extravasaci leukocytů do tkáně, je inhibice volnými oligosacharidy schopnými kompetice s přirozenými ligandy L-selektinu atraktivní terapeutickou volbou.

Rozpoznáním významu kontroly abnormálních zánětlivých stavů a. uvědomění si potřeby léků toto zprostředkujících syntetizovali vynálezci oligosacharidy, které jsou schopné inhibovat odpovědi zprostředkované selektiny. Tyto studie vyvrcholily identifikací nových oligosacharidů, které blokují vazbu lymfocytárního L-selektinu na odpovídající oligosacharidy na endoteliálním povrchu a klinickou léčbou navrženou pro redukci zánětu v důsledku podání takových oligosacharidů pacientovi, který potřebuje takovou léčbu.

V souladu s tím je vynález za prvé zaměřen na syntetické oligosacharidy, zejména na divalentní sLex a tetravalentní sLex oligosacharidy a na jiné sLex obsahující oligosacharidy z vyšší multivalencí, významně prosté přirozených nečistot, a na kompozice, které je obsahují. Syntetické oligosacharidy podle předkládaného vynálezu obsahují lineární nebo rozvětvenou polylaktosaminovou kostru (LacNac)_n, kde N>1 a kde jsou vazby mezi zbytky £1-3' a/nebo £1-6', na kterou jsou navázány NeuNaca2~3Gal£l“4 (Fucl-3GlcNac (sLE^3e) epitopy £1-3? a/nebo £1-6' vazbami, kde znamená: NeuNac:kyselina sialová, Gal: galaktosa, Fuc: fukosa, GlcNac: N-acetylglukosamin. Takové oligosacharidy jsou schopné vázat selektinové molekuly, které jsou na zevním ρρ.νr_c.hu—1-ymfoeytů, zejména L-selektin, a fea-k· bránit vazbě lymfocytů na odpovídající oligosacharidy pro selektin na endoteliálním povrchu.'

Vynález je dále zaměřen na tetravalentní sLex glykan rozvětvené polylaktosaminové kostry. Ve srovnání s monovalentním sLex tetrasacharidem je poskytnut 100-násobně silnější inhibitor L-selektinem zprostředkované adhese lymfocytů na endotel při réjekci srdečních a ledvinných transplantátů u krys.

Vynález je dále zaměřen na tetravalentní sLex glykan, který má sLex zbytky na lineární polylaktosaminové kostře. Tetravalentní sLex glykan mající lineární kostru tří LacNac zbytků je silným inhibitorem L-selektinem zprostředkované buněčné adhese.

Vynález je dále zaměřen na oligosacharidy splňující několik charakteristik ligandů L-selektinu: konkrétně, dodekamerní O-glykosidické jádro 2 typu oligosacharidu alditolu s rozvětvenou polylaktosaminovou kostrou mající dvě distální a2,3' sialyzované a al,3 fukosylované N-acetyllaktosaminové skupiny (sialyl Lewis x, sialyl Le^). V tomto provedení může být NeuNaca2-3GalEl-4 (Fucl-3)GlcNac (sLE³*¹) epitop vázán &1-3'-, Sl-6'- nebo Sl-6vazbou na disacharid alditol. Mono-fúkosy1ováný alditol (t.j. monovalentní sialyl Le*) signifikantně inhibuje na L-selektinu závislou vazbu lymfocytů a difúkosy1ováný dodekasacharid alditol (t.j. divalentní sialyl Le^) je velmi silným inhibitorem (IC_so, inhibiční koncentrace zabraňující 50% vazby = 0,15 μΜ).

Vynález je také zaměřen na metodu pro enzymatickou syntesu takových oligosacharidu a alditolů.

• · · · · · « *··>· • · · · to to ··· · · «· ·· ··· · · · ··· · · ··· ·*·· ··· ····· ·· ·· ·· ··

Vynález je dále zaměřen na metodu pro inhibici selektinem zprostředkované vazby lymfocytů na povrch endotelu, zejména L-selektinem zprostředkované vazby, ale také E- a P- selektinem zprostředkované vazby, podáním oligosacharidové kompozice podle předkládaného vynálezu, včetně výše uvedených enzymaticky syntetizovaných alditolů, zejména tam, kde je taková adhesní reakce mezi lymfocyty a endoteliálními buňkami asociována S chronickým nebo akutním zánětem, který vede k rejekci transplantátu, artritidě, revmatoidní artritidě, infekci, dermatitidě, zánětlivým _;střevním chorobám a autoimunitním ......

onemocněním.

Vynález je dále zaměřen na metodu pro prevenci a/nebo léčbu bakteriálních infekcí podáním oligosacharidové kompozice podle předkládaného vynálezu.

Vynález je dále zaměřen na léčbu rakoviny podáním oligosacharidové kompozice podle předkládaného vynálezu.

Vynález je dále zaměřen na metodu pro blokování nebo narušení škodlivé migrace leukocytů do místa patogenní expozice u jakýchkoliv zánětlivých stavů.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 (panely a-1): vazba lymfocytů na endoteliální struktury v normální a v transplantované srdeční tkáni v Stampér-Woodruffově testu. Mikrofotografie byly provedeny tak, aby lymfocyty (kulaté a černé) byly v ohnisku a tkáň pod nimi (šedá) byla mírně mimo ohnisko. Navázané lymfocyty jsou označeny malými černými šipkami. Panel (a) ukazuje, že pouze velmi malý ·

• 444 • · • 4«4

4 44

4 44

444 4444·4·

444 44 · 4 ·· ··44 počet lymfocytů je navázán na endokard v normálních srdcích. V (b) syngenních štěpech, stejně jako v (c) (alograftech) je počet navázaných lymfocytů také velmi nízký. Stejné pozorování bylo provedeno v arteriolách; na tyto struktury v (d) normálních srdcích prakticky neadherují lymfocyty a vazba v (e) syngenních štěpech a (f) alograftech je také velmi nízká. Na venuly (označené přerušovanou čarou) z (g) normálních Srdcí a (h) syngenních štěpů adheruje pouze málo lymfocytů, ale na venuly v (i) alograftech adheruje zvýšené množství lymfocytů. Na vnitrosvalové kapiláry adheruje pouze málo, lymfocytů v (j) ,.

normální tkáni, stejně jako v (k) syngenních štěpech. Panel (1) ukazuje, že zde je jasné zvýšení adhese lymfocytů na vnitrosvalové kapiláry u alograftů. Na tomto panelu je možné.: vidět velké množství příčných a podélných řezů vnitrosvalovymi kapilárami a pouze několik lymfocytů adherujících k těmto strukturám je označeno šipkami. Všimněte si, že na všech panelech jsou také některé lymfocyty adherující přímo na myokard a neležících na jakýchkoliv endoteliálních strukturách (jsou označeny bílými šipkami na panelech a a 1).

Obrázek 2: Účinek různých enzymaticky syntetizovaných rozvětvených oligosacharidových konstruktů na adhesi lymfocytů a endotel alograftů. Ačkoliv oligosacharidy sLex rodiny redukují vazbu lymfocytů, inhibiční kapacita tetravalentních sLex je významně vyšší než inhibiční kapacita jiných sLex oligosacharidů. Všechny sLN postrádající fukosu byly bez efektu. Je presentován průměr a SEM jednoho representativního pokusu ze tří.

Obrázek 3 (panely a-d): Expanse 500 MHz ^XH-NMR spektra dvoj anténových glykanů. A) Glykan 2. B) Glykan 3. C) Glykan 4. D) Směs glykanů 5 a 6. Intensita levé expanse je dvojnásobkem

• ·«			««	··
• · ·		• ·		•	•	•	•
• «	•	• «	• · ·	•	•	··
							*
• · • · ··	•	• ·	« · « ·	·«		*·	•

intesity pravé. HOD a ssb označuj í pozice residuálního signálu vody a jejího spinového vedlejšího svazku, v příslušném pořadí. Signály označené hvězdičkou vycházejí z nečistoty přítomné v deuterizované vodě. Indikátorové linie na obrázku jsou umístěny v hodnotách chemického posunu specifikovaných signální multiplety. Pro přesné hodnoty chemického posunu viz tabulku 3.

Obrázek 4 (panely a-c): Chromatografická analýza fukosyltransferasových produktů glykanu 3. A) HPAE-PAD chromatografie produktu z kompletní reakce. Sloupec ukazuje, jak byl glykan 4 odebírán. PAD odpověď je ukázána jako nepřerušovaná čára, Na-acetatový gradient jako přerušovaná čára. B) HPAE-PAD chromatografie z částečné reakce. Píky označené Dl, D2 a D3 representují sacharid 4, směs sacharidů 5 a 6 a sacharid 3, v příslušném pořadí. C) Papírová chromatografie současného β-galaktosidasového a β-N-acetylhexosaminidasového trávení směsi desialyzováných sacharidů 5 a 6. Chromatografie byla provedena s vrchní fází (4:1:5) n-butanol-kyselina octová-voda na Whatman III Chr papíru jak to popisuje Niemela, R. et al., Glycoconjugate. J. 12: 36 - 44, (1995)). Šipky A a B ukazují eluční pozice Galfil-4(Fucal-3)GlcNAcfil-6Galfi-4GlcNAc a GalSl-4(Fucal-3)GlcNAc &l-3Gal£-4GlcNAc, v příslušném pořadí.

Obrázek 5 (panely a-b): Chromátografická analýza meziproduktů a konečných produktů v syntese glykanu 9. A) Iontová výměnná chromátografie na MonoQ 5/5 HR-koloně sacharidů získaných ze oí2,3-sialyltransferasové reakce 7. šipky označené Zero, Mono, Di a Tri označují eluční pozice GlcNAc, 3'-sialyllaktosy, disialyzovaného a trisialyzováného oligosacharidového markéru, v příslušném pořadí. UV-absorbance při 214 nm je representována tlustou čarou a NaCl gradient přerušovanou čarou. Sloupec ukazuje ···· * · r » « * · • · · · · ♦ ·· · ··« • ♦ · ··♦· *«· •· ·· ·· * · * · «* materiál odebraný jako tetrasialo sacharid 8. B) HPAE-PAD chromatografie fukosyltransferasových produktů sacharidu 8. píky označené Tl, T2 a T3 representují tetra, tri a difukosylové produkty 8, v příslušném pořadí. Chvostování píků se přisuzuje katalyzované 2-epimerisaci redukujícího konce GlcNA sacharidů. PAD odpověď je ukázána jako nepřerušovaná linie, Na-Acetatový gradient jako přerušovaná linie.

Obrázek 6 (panely a-c): Expanse 500 MHz ^XH-NMR spektra tetraantenových glykánů. A) Spektrum sacharidu 7. B). Spektrum _? sacharidu 8. C) Spektrum sacharidu 9. Signály označené hvězdičkou vycházejí z nečistoty přítomné v deuterizované vodě. Intensita levé expanse je dvojnásobkem intesity pravé expanse.

Linie na obrázku označují chemický posun signálního multipletu. Pro přesné hodnoty chemického posunu viz tabulku 4.

Obrázek 7 (panely a-b): Hmotnostní spektrometrie (MALDI-MS) desialyzovaných tetraantenových oligosacharidů. A) Hmotnostní spektrum desialyzovaného sacharidu z píku Tl, obrázek 5B. B) Hmotnostní spektrum desialyzovaného sacharidu z píku T2, obrázek 5B.

Obrázek 8: Účinek enzymaticky syntetizovaných sLex (prázdné symboly) a sLN (plné symboly) oligosacharidů na adhesy lymfocytů na endotel ledvinného štěpu. Prázdná kolečka (o): mono sLex (glykan 1), plná kolečka (·): mono sLN, prázdné čtverečky (Π) di SLex (glykan 4), plné čtverečky (0) di sLN (glykan 5), prázdné trojúhelníčky U) tetra sLes (glykan 9, plné trojúhelníčky (4) tetra sLN (glykan 8). Lymfocyty blokující kapacita tetravalentního sLex byla jasně vyšší než ostatních sLex oligosacharidů Je presentován průměr ze tří pokusů, SEM nikdy

• Φ*	φ·	φφ	φφ
φφφ «	φ φ	φ	φ · φ
	• φ	• Φφ	φ φ
φφφ	φ φ	• φ	φ φ
• Φ φ φφ	• ·	φφ	φφ

nepřesáhla 10%; pro přehlednost není uvedena.

Obrázek 9: Nárys způsobu syntesy tetravalentního sialyl Lewis x sacharidu 17 s lineární kostrou a dále Lewis x sacharidu 18 z glykanu 12.

ό* Obrázek 10: A. Aniontová výměnná {Mono Q) chromatografie glykanu 16. B. HPAE-PAD chromatografie glykanu 17, izolovaného ze syntetizační směsi gelovou filtrací. Hlavní pík eluující v 8 min. representuje glykan 17, zatímco o píku ve 12 min. se soudí, že obsahuje jeho ManNac analog s redukujícím koncem. Poslední uvedený je pravděpodobně tvořen bazí-katalyzovanou epimerizací na C2 redukujícího konce Glc-NAc glykanu 17 a/nebo prekursorů. Žádný oligosacharid eluující v 15 - 17 minutě, v očekávané oblasti eluce trifukosylových analogů glykanu 17, nebyl pozorován.

Obrázek 11: Expanse ^XH-NMR spektra glykanu 16. Panel B: ¹H-NMR spektrum glykanu 17. Rezonance označené hvězdičkou (*) vycházejí z neznámých nečistot.

Obrázek 12: Na L-selektinu závislá vazba lymfocytů na endotel rejektováných transplantátů srdce u krys za přítomnosti syntetických oligosacharidů. Je presentován průměr + SEM jednoho representativního pokusu ze tří provedených. Tetravalentní sialyl Lewis glykany 9 a 17 inhibovaly adhesy lymfocytů silně, s b hodnotami IC_so okolo 1 nM. Nefukosylované analogy 8 a 16 neměly žádné inhibiČní vlastnosti.

Obrázek 13: Struktura sacharidů alditolové serie a označení monosacharidových zbytků.

·* · · · · · · * « · · « ···· · · · · · · · · ·· · · · ·

Obrázek 14 (panely A-C). Chromatografická analýza sacharidů po glykosyltransferasových reakcích. Čísla píků označují sacharidy v tabulce 6. A. Analýza produktů glykosyltransferasové reakce sacharidu 24 HPAEC s 60 mM NaOH jako eluens. Jsou ukázány vypočítané pozice non-, mono-, a digalaktosylovaných produktů. B. Analýza reakční směsi po sialyltransferasové reakci sacharidu 25 ť’ aniontovou výměnou chromatografií na Mono Q koloně.

Disialyldekasacharid 26 byl získán jako hlavní produkt. Další dva píky v oblasti oligosacharidů s nábojem jsou CMP (a) a NeuAc (b), C. Separace mono a difukosylováných sacharidů (27 a 28, v příslušném pořadí) vzniklých z fukosyltransferasové reakce 26 pomocí HPAEC. Lineární gradient NaAc byl aplikován od 100 mM NaOH, 25 mM NaAc v minutě 0 do 100 mM NaOH, 100 mM NaAc v minutě 20.

Obrázek 15 (panely A-D): Rozložení ^H-NMR spektra sacharidů 25 (panel A), 26 (B), 27 (C) a 28 (D). Rezonance označené hvězdičkou jsou neuhlovodanového původu.

Obrázek 16: Část TOSCY spektra O-glykosidického divalentního alditolu 28 (spin-lock čas 80 ms). Z rozložení ukazujícího korelační píky mezi anomerními a neanomerními protony GlcNA zbytků, je pro většinu protonů jasný posun dolů způsobený fukosylací zbytků pro GlcNA zbytky 5 a 6, ale ne pro zbytek 3.

Obrázek 17: DQFCOSY spektrum divalentního sLex O-glykan alditolu 28 použitého pro sestavení přesahujících ^H-NMR rezonancí.

Obrázek 18: Účinek enzymaticky syntetizovaných oligosacharidových konstruktů na adhesy lymfocytů na peritubulární kapilární endotel rejektovaného ledvinného alograftu. Použité symboly jsou: prázdné čtverečky ( ) O-glykan nesoucí dvě sialyl LacNAc jednotky 26, prázné trojúhelníčky ( ) monovalentní sialyl Le^x O-glykan 27, prázdná kolečka (o) divalentní sialyl Le^ glykan 28, plné trojúhelníčky ( ) monovalentní sialyl Le^ tetrasacharid 1, plná kolečka (o) i-* divalentní sialyl Le^x glykan 4. Divalentní oligosacharid

O-glykosidického typu alditol 28 byl jasně nejúčinějším inhibitorem ve srovnání s monovalentním analogem 27 bez fúkosového zbytku v 6-vázaném rameni. Současně, glykan 2.6 nenesoucí žádnou fukosu, neinhiboval vazbu lymfocytů vůbec. Sacharid 4, postrádající redukovanou O-glykosidickou jádrovou sekvenci 28, byl o něco slabším inhibitorem než 28, což ukazuje, že o-glykosidická jádrová sekvence může být také významná pro vazbu. Je ukázán průměr + SEM representativního pokusu ze tří nezávislých pokusů.

Předkládaný vynález se týká nových oligosacharidů a farmaceuticky přijatelných kompozic, které je obsahují, a jejich použití v terapeutické metodě pro léčbu akutních nebo chronických zánětlivých stavů. Syntetické oligosacharidy podle předkládaného vynálezu obsahují lineární nebo rozvětvenou polylaktosaminovou kostru (LacNac)_n, kde N>1 a kde jsou vazby mezi zbytky £1-3' a/nebo £1-6', na kterou jsou navázány > NeuNaca2-3Gal£l-4 (Fucl-3GlcNac (sLE³¹) epitopy £1-3' a/nebo £1-6' vazbami, kde znamená: NeuNac:kyselina sialová, Gal: galaktosa, Fuc: fukosa, GlcNac: N-acetylglukosamin. Takové oligosacharidy jsou preferovaně multimery monovalentních sLex, a zejména divalentní a tetravalentní multimery sLex, jak je znázorněno v tabulce 2 a na obrázcích 9 a 13. V preferované provedení je • · syntetický oligosacharid tetravalentní sLex konstrukt 22-sacharidu jak je ukázán v tabulce 2 a na obrázku 9.

Syntesa takových multimerních forem sLex je dosažena chemickými a/nebo enzymatickými prostředky. Například, konstrukce monovalentního sLex tetrasacharidu, divalentního sLex dekasacharidu a tetravalentního sLex 22-sacharidu mající rozvětvenou polylaktosaminovou kostru může být provedena za použití N-acetyllaktosaminu,· hexasacharidu Galfil-4GlcNAcEl-6 (GalíŠl-4GlcNAc£l-3)Gal£l-4GalNAc (Wilkman, A. et al., Carbohydrate Res. 226: 155 - 174 (1993)) a tetradekasacharidu GalEl-3GlcNAcfil- 6 (Galfil-4GlcNAcSl- 3) Galfil-4G1C NAcSl - 6 (Galfcl - 4G1 cNAcEl - 6 (Galfil -GlcNAcfil - 3) GalBl -G1 cNAcfil - 3) GalŠl- 4 GlcNAc (Seppo, A. et al., Bioch. 34: 4655 - 4661 (1995)) jako akceptorů pro mono-, di- a tetravalentní sLex sacharidy, v příslušném pořadí (viz též příklad 2) . Akceptory jsou nejprve a2,3 sialyzovány jejich inkubací do vyčerpání s CMP-ŇeuNAc a 0i2,3 sialyltransferasou z lidské placenty. Izolované, plně sialyzované sacharidy jsou potom al,3 fukosylovány do vyčerpání GDP-fukosou a částečně přečištěným přípravkem lidské mléčné al,3 fukosyltransferasy jako to popisuje Natunen, J. et al,, Glycobiol. 4: 577 - 583 (1994)) (zde uvedeno jako odkaz). Velikosti vzorku jsou hodnoceny UV absorpcí proti zevnímu N-acetylglukosaminu. Charakterizace konstruktů byla provedena iontovou výměnou chromatografií a ID ^H NMR spektroskopií při 500 MHz. Tetravalentní sLex 22-sacharidy mající lineární polylaktosaminovou kostru mohou být získány syntesou o pěti krocích vycházející z oktamerního polylaktosaminu LacNA cSl-3 ' (GlcNAcBl-6 ') LacNAcÉl-3 ¹ (GlcNAcEl-6 ¹) LacNAc (kde LacNAc je disacharid Galfil-4GlcNAc) nejprve jeho prodloužením v fil,3-GlcNAc transferasové reakci. Izolovaná sacharidová směs je podrobena reakci katalyzované El,6-GlcNAc transferasou z prasečí žaludeční sliznice. Vzniklý oligosacharid je potom přeměněn

El,4-galaktosyltransferasovou,reakcí na rozvětvené uspořádání sedmi LacNac jednotek, které jsou dále sialyzovány a fukosylovány na tetravalentní sLex sacharid (viz také příklad 6).

é* Předkládaný vynález se také týká enzymatické syntesy oligosacharidových alditolů, které mají některé charakteristické «* rysy L-selektinových ligandů, a které jsou schopné působit jako inhibitory vazby L-selektinu na ligand.. V. tomto provedení mohou , být NeuNAca2-3GálEl-4(Fucl-3)GlcNac(sLe^x) epitopy navázány El-3'-, El-6'- nebo El-6- vazbou na disacharid alditol. Takové alditoly jsou preferovaně multimery monovalentních sLex, a zejména divalentní multimery sLex jak je znázorněno na obrázku 13. V zejména preferovaném provedení je. alditol dodekamerní oligosacharid alditol s O-glykosidickým jádrem 2 typu s rozvětvenou polylaktosaminovou kostrou mající dvě distální a2,3N síalyzované a «1,3 fukosylované N-acetyllaktosaminové skupiny (sialyl Lewis x, sialyl Le³¹) jak je znázorněno na obrázku 13. Struktura každého sacharidu v průběhu syntesy z disacharídu GalEl-3GalNAc na dodekasacharid alditol byla stanovena několika metodami včetně 1- a 2- rozměrové/‘H-NMR spektroskopie. Poslední krok syntesy, al,3 fukosylace 6-vázaného ramene, probíhal pomalu a byl asociován se znatelným posunem v H-l rezonanci GlcNAc zbytku v rozvětvené N-acetyllaktosaminové jednotce.

'4

Po analýze několika strukturálních rysů ligandů pro selektin bylo rozhodnuto syntetizovat sialyzované O-glykosidické polylaktosaminové alditoly s žádným, jedním, nebo dvěma al,3 vázanými fukosovými zbytky na sialyzovaných N-acetyllaktosaminových zbytcích. Vynálezci zde popisují • · · ♦ ·· to to * '· • · * · · to toto to to toto toto b » · ···· ♦·*»· • · · to · to » » *·· »í U» · enzymatickou syntesu vhodných deka- až dodekasacharidů, jejich strukturální charakterizaci chromatografií a 1- a 2- rozměrovou ^TH-NMR, a jejich použití jako inhibitorů pro L-selektinem zprostředkovanou vazbu lymfocytů na endotel na dobře dokumentovaném modelu rejekce ledvinného transplantátu u krys (Renkonen, R. et al., Am. J. Pathol. 137: 643 - 651 (1990); Turunen, J.P. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994)).

Konečný produkt syntesy a jeho analoga bez jednoho nebo obou fúkosových zbytků byly testovány jako inhibitory L-selektinem zprostředkované interakce lymfocyt-endotel v rejekci krysího transplantátu ledviny. Zatímco nefukosylovaný O-glykosidický oligosacharid alditol neměl žádnou inhibiční aktivitu, monofukosylovaný alditol (t.j. monovalentní sialyl Le^x) signifikantně zabraňoval vazbě a difukosylováný dodekasacharid alditol (t.j. divalentní sialyl Le^) byl velmi silný inhibitor (IC . inhibiční koncentrace bránící 50% vazby = 0,15 μΜ) .

Kromě multivalenčnosti se zdá, že GalEl-3GalNAc-ol sekvence O-glykosidického jádra zvyšuje afinitu glykanu k L-selektinu. Toto bylo naznačeno paralelními inhibičními pokusy, kde byly disialyzované a difukosylováné rozvětvené polylaktosaminové dekasacharidy, podobné divalentnímu dodekasacharidů alditolu, ale bez redukovaného O-glykosidického jádra, méně účinnými inhibitory (IC_so = 0,5 μΜ) než O-glykosidický dodekasacharid alditol. Tak v jednom určitém preferovaném provedení vynálezu alditol obsahuje GalEl-3GalNAc-ol sekvenci v O-glykosidickém jádře.

Nefukosylovaný O-glykosidický konstrukt 26 (pro čísla disacharidů viz obrázek 13) neměl žádnou inhibiční aktivitu, zatímco monofukosylovaný (27) bránil 37% vazby lymfocytů závislé • ·· ·· to.to ·· ·· «·, » · · · · *···

V · » · to · to · to to. · ·.

b · b · · · · v to* · · to to. to· · ·· to · · · • to to to · v· ·· · · · · na L-selektinu v koncentraci 0,5 μΜ. Difukosylovaná molekula (28) byla velmi silným inhibitorem (1C = 0,15 μΜ). Proto, přítomnost mnohočetných sialyl Le^ epitopů na distálním konci zvyšuje afinitu sacharidu k L-selektinu. Kromě toho, dříve syntetizovaný divalentní sialyl Le^ glykan (4), postrádající proximální Galfil-3GalNAc-ol sekvenci sloučeniny 28, ukázál v paralelním pokusu menší inhibiční kapacitu než alditol 28.

V metodě pro léčbu zánětu podle předkládaného vynálezu podle předkládaného vynálezu je pacientovi (zvířeti a zejména člověku), který potřebuje takovou léčbu, podána účinná dávka syntetického uhlovodanu podle předkládaného vynálezu, obyčejně ve farmaceuticky přijatelné kompozici. Pacientovi může také být podána kompozice obsahující směs multivalentních forem, zejména účinnou směs divalentních a tetravalentních sLex sloučenin ukázaných v tabulce 2 a na obrázku 9a 13. Takové farmaceutické kompozice mohou dále obsahovat žádoucí přísady, jako jsou například protilátky nebo jejich konjugáty, které rozpoznávají a váží se na leukocytární L-selektin, takže působí v souladě s a zvyšují účinnost syntetických uhlovodanů podle předkládaného, vynálezu.

Zánětlivými stavy jsou míněny fyziologické nebo patologické stavy, které jsou doprovázeny zánětlivou odpovědí. Takové stavy zahrnují, ale nejsou omezeny na, tkáňové/orgánové transplantace jako jsou kožní štěpy, rejekce ledviny, srdce, plic, jater, kostní dřeně, rohovky, slinivky, tenkého střeva, artritida, infekce, dermatósa, zánětlivá střevní onemocnění a autoimunitní onemocnění.

Zánětlivé stavy mohou být chronické nebo akutní, a mohou být • »· ·· ·4 ···· *· · 4 * · i · · ·· • 4 · · · · ·· 4 * · . · 4 « « · · · · · ·'· ·· » 4 4 * * · 4 · ·^:4 «·· it *4 μ · ·«4 centralizovány ve tkáni, která exprivuje receptor pro L-selektin buď konstitutivním, nebo indukovatelným způsobem. Jak je zde ukázáno, tkáně, které jinak neexprivují receptor pro L-šelektin, mohou být indukovány k jeho expresi za jistých fyziologických stavů. Například, jak je zde ukázáno, sLex exprese je indukována na kapilárním endotelu akutně rejektováných orgánových transplantátů a tato de novo exprese sLex přitahuje lymfocyty z cirkulace do transplantátů, což vyvolává zánět a rejekci. Nicméně, metoda podle vynálezu blokuje vazbu lymfocytárního L-selektinu na odpovídající oligosacharidy na povrchu endotelu.

Termínem významně prostý nečistot je míněno, že multivalentní sLex je přečištěn na takový stupeň, že neobsahuje žádné, nebo přijatelné hladiny, nežádoucích nebo postradatelných substancí, které byly přítomny v průběhu in vitro nebo in vivo syntesy uvedeného multivalentního sLex.

Termíny léčba nebo léčení jsou míněny tak, že zahrnují podání syntetických oligosacharidů podle předkládaného vynálezu subjektu za účely, které zahrnují profylaxi, zmírnění, prevenci nebo léčbu onemocnění zprostředkovaných ději selektinové adhese, zejména ději L-selektinem zprostředkované adhese. Taková léčba nemusí nutně zcela zmírnit zánětlivou odpověď. Dále, taková léčba může, být použita spolu s jinými tradičními způsoby léčby pro redukci zánětlivých stavů, jak jsou odborníkům v oboru známy.

Metody podle předkládaného vynálezu mohou být poskytnuty jako preventivní léčba před detekcí, například, zánětlivého stavu, takže brání rozvoji takového stavu u pacienta s vysokým rizikem vzniku takového stavu, jako jsou například pacienti po transplantaci.

• * · ·	•	4	• ’
• · ·	•	•	• · ·	• · ' · ·
·.[ » ·	«	•	'	• · ·
♦ * · f		««	t t	f·' »·

Při podání lidskému nebo zvířecímu pacientovi může být kompozice podle předkládaného vynálezu formulována jakýmkoliv způsobem, který jí činí vhodnou pro orální, pařenterální, včetně intramuskulárního, intravenosního nebo subkutánního, intracisternální, intravaginální, intraperitoneální, lokální, včetně prášků, mastí, nebo kapek, nasální, včetně sprayů, lokální, enterální nebo rektální podání. Takmůže být činidlo například ve formě injikovatelné formulace, aerosolové formulace, suspense, roztoku, disperse, emulse, sterilního prášku,, nálevu, atd..Činidlo může být formulováno s farmaceuticky přijatelnými přísadami, nosiči, rozpouštědly nebo vehikuly, např. izotonickým fyziologickým roztokem, ethanolem, polyolem, polyethylenglykolem, glycerolem a podobně, podle běžné farmaceutické praxe. Velikost dávky činidla bude dostatečná pro dosažení protizánětlivého účinku způsobeného blokováním selektinem, a zejména L-selektinem zprostředkovaných adhesních dějů u pacienta.

Pevné dávkové formy pro orální podání zahrnují kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule. V pevných dávkových formách může být aktivní sloučenina smísena s alespoň jednou inertní obvyklou přísadou, plnidlem nebo extenderem, pojivém, zvlhčovacím činidlem, desintegrujícím činidlem, činidlem zpomalujícím rozpouštění, zvlhčujícím činidlem, adsorbentem, kluzným činidlem, a/nebo pufrovacím činidlem. Pevné dávkové formy jako jsou tablety, dražé, kapsle, pilulky a granule mohou být připraveny s potahy a pláštěm. Aktivní sloučeniny mohou také být v mikroenkapsulováné formě s jednou nebo více přísadami.

Kapalné dávkové formy pro orální podání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulse, roztoky, suspense, sirupy a elixíry. Kromě

_Γ M·· bfc' ne nř,¹. . ··»<!£ <?'< c ě- t tn , r t‘ ♦:,'·- *

M b b. r fí <jh> ř r . ·κ*ϊ·χ ;? | t;. t b í #> t c te c i <? · c 0 «í? »· i*?>.. Ih. b υ fc.H %·' ·· i.i i <»*>.$> óís· b? óf i; í ří i aktivních sloučenin mohou kapalné dávkové formy obsahovat inertní ředidla běžně používaná v oboru jako je voda nebo jiná . rozpouštědla, solubilizační činidla a emulsif ikátořy. r._fc ,,

L , *' l i

i Kromě,takových inertních ředidel-může kompozice také obsahovat í přísady, jako jsou zvlhčující činidla,_vemulsifikační nebo:*¹ ) suspendující4činidla,· sladidla, příchutě a voňavé látky.

i.

i lí i¹ Suspenze -mohou <kromě aktivních- sloučenin obsahovat

L- — . suspendující činidlo.................. ........

• Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být také podány ve formě liposomů. Jak je v oboru známo, liposomy jsou obecně odvozeny od fosfolipidů nebo od jiných lipidových substancí.. Liposomy jsou tvořeny mono nebo multilamelárními hydratovanými kapalnými krystaly, které jsou disperzovány ve vodném mediu. Může být použit jakýkoliv netoxický, fyziologicky přijatelný a ; metabolizovatelný lipid schopný tvorby liposomů; Předkládané:

kompozice ve formě liposomů mohou obsahovat kromě syntetických multivalentních sLex obsahujících polylaktosaminů podle předkládaného vynálezu stabilizující činidla, konzervační Činidla, přísady a.podobně. Preferovanými lipidy jsou ,fosfolipidy _ta fosfatidylcholiny (lecitiny), jak přirozené, tak syntetické.

Metody pro tvorbu liposomů,jsou₄v oboru dobře-známé.

J. .Λ Λ. 4 1. * ' < L .· ^? * Kompozice a metody podle předkládaného vynálezu jsou vhodné pro léčbu jakýchkoliv stavů, na kterých se účastní selektinem, a zejména L-selektinem zprostředkovaná adhese, která zvyšuje zánětlivou reakci. . Tak je činidlo použitelné pro léčbu stavů zahrnujících, ale_tbez omezení_M septický šok, chronická zánětlivá onemocnění jako je psoriasa, a revmatoidní artritida a reperfusní poškození, které se vyskytuje po srdečních příhodách, mrtvici, a orgánových transplantacích, traumatický šok, multiorgánové selhání, automimunitní onemocnění, asthma, zánětlivá střevníonemocnění, rejekce tkáně, artritida, infekce, zejména lokální infekce, dermatosy atd. V každém případě je účinné množství sloučenin podle předkládaného vynálezu podáno bud' samostatně, nebo jako součást farmaceuticky přijatelné kompozice pacientovi, který potřebuje takovou léčbu. Je také známo, že může být .pacientovi,, který-potřebuje-takovou léčbu, -podána-kombinace sloučenin.

Bylo ukázáno, že buněčná adhese způsobená sLex a sLea má roli při metastasování jistých nádorů. V souladu s tím je dalším použitím předkládaného vynálezu protinádorová léčba, kde může být metastasování sLex pozitivních tumorů inhibováno těmito glykany.

V jiném provedení jsou účinné dávky kompozic podle předkládaného vynálezu podány proto, aby poskytly terapeutický přínos proti sekundárním škodlivým účinkům zánětu. Účinným množstvím kompozice podle předkládaného vynálezu je míněno množství, kterým je dosažena určitá úleva u pacienta, kterému je léčba podána. Abnormálními zánětlivými stavy u hostitele jsou míněny stavy, kdy stupeň zánětu u subjektu přesahuje normu pro subjekt, který je zdravy, nebo přesahuje požadovaný stupeň. Sekundárním tkáňovým poškozením nebo toxickými účinky jsou míněny tkáňová poškození nebo toxické účinky, které se vyskytují v jinak zdravých tkáních, orgánech a buňkách v důsledku přítomnosti nadbytečných selektinem, a zejména L-selektinem zprostředkovaných adhesních dějů, vzniklých v důsledku primárních stimulů kdekoliv v těle.

• »· **| · ♦ • ♦ · ·· · «· *· ♦ · • »4 4 t* 44 · ♦'·4 • « < ** :

• ·· ♦4 » ·,» « ·· 4

V metodách podle předkládaného vynálezu vede infuse kompozic podle předkládaného vynálezu ke zmenšení schopnosti selektin exprivujících leukocytů přilnout a tak se připojit na endotel, což brání nebo inhibuje adherenci takových buněk v místě zánětu a lokalizovanému poškození endotelu, a tak brání nežádoucímu pohybu leukocytů nebo přesunu do poškozené tkáně nebo buněk.

V souladu s tím poskytují farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu kompozice obsahující syntetické uhlovodany a alditoly podle předkládaného vynálezu, v množství dostatečném.......

pro antagonizaci (plnou nebo částečnou) přirozeného selektiiiu pacienta, a zejména L-selektinu, vazbou na přirozené cíle takového selektinu u takového pacienta, a specificky vazbou na endoteliální buňky.

. Oligosacharidy podle předkládaného vynálezu mohou být konjugovány, buď chemicky nebo metodami genetického inženýrství, na fragmenty nebo na jiná činidla, která zaměřují takové sloučeniny, které se váží na selektin, do požadovaného místa: účinku. Alternativně, jiné sloučeniny mohou být konjugovány, buď chemicky nebo genetickým inženýrstvím, na oligosacharidy podle předkládaného vynálezu tak, že posilují nebo dodávají další vlastnosti takovým oligosacharidům nebo kompozicím, které je obsahují, zejména vlastnosti, které zvyšují schopnost sloučenin způsobit zmírnění toxických účinků způsobených adhesí, nebo navozují odplavení sloučenin z krve, nebo způsobují jiné výhodné vlastnosti.

Množství a režimy pro podání oligosacharidů vážících se na selektin a kompozic obsahujících oligosacharidy podle předkládaného vynálezu může být snadno určeno odborníky v

•							«·		·♦
·· *		•	•	«	« '	•		•	> : ·
• *		*	•	•		♦		•
·! *		* ·	♦	•	• ·	•	·«	•
« ·		•	•	•	« ·			•	• «
·♦ Φ				• ·	• '				• ·

klinickém oboru léčby zánětlivých onemocnění jako je artritida, tkáňové poškození a rejekce tkáně. Obecně, dávka kompozice podle předkládaného vynálezu se bude velmi lišit v závislosti na úvách jako je: typ použitého syntetického uhlovodanu, věk, zdravotní stav, typ léčeného onemocnění, typ současné léčby, pokud je nějaká, frekvenci léčby a charakteru požadovaného účinku, rozsah tkáňového poškození, trvání příznaků, a kontraindikace, pokud jsou nějaké, a na jiných okolnostech upravovaných jednotlivým lékařem. Požadovaná dávka může být podána v jedné nebo ve více aplikacích pro získání požadovaného výsledku, farmaceutické ... kompozice obsahující oligosacharidy podle předkládaného vynálezu, jako je tetravalentní sLex 22-sacharid, nebo difukosylovaný dodekasacharid alditol, mohou být dodány v jednotkové dávkové; formě.

Farmaceutické kompozice obsahující syntetické oligosacharidy podle předkládaného vynálezu mohou být podány v jakémkoliv vhodném farmaceutickém nosiči pro podání. Mohou být podány v jakékoliv formě, která bude způsobovat profylaktickou, paliativní, preventivní nebo terapeutickou léčbu stavů zprostředkovaných selektinem, a zejména L-selektinem, u lidí a u zvířat. Pro definování, výraz způsob léčby onemocnění a podobné výrazy, jak je použit i ve specifikacích a nárokách, znamená i způsob prevence takového onemocnění.

Způsob podle předkládaného vynálezu je užitečný pro prevenci rejekce nebo zánětu transplantované tkáně nebo orgánů jakéhokoliv typu, například srdce, plic, ledvin, kožních štěpů, tkáňových štěpů, atd.

Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat

	4		··	4*
♦ · ·		4'	•	•	• ·	•
	•	•	•	• «·	• «	*·
							•
	•		*	• *	v		•
♦ ·»				··	« · *

sterilní vodná nebo nevodná rozpouštědla, suspenze a emulse, zejména pokud jsou určeny pro parenterální podání. Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, rybí olej a injikovatelné organické estery. Vodné nosiče zahrnují vodu, roztoky voda-alkohol, emulse, suspense, včetně fyziologického roztoku a pufrovaných medicinálních vehikul včetně roztoku chloridu sodného, Ringrova roztoku obsahujícího laktosu, nebo fixovaných olejů. Intravenosní vehikula zahrnují roztoky tekutin a Živin, elektrolytové roztoky, jako jsou-ty, které jsou založeny na Ringrově dextrose, a . podobně.

Kompozice podle.předkládaného.vynálezu mohou být podány pomocí pump, nebo ve formě se zpomaleným uvolňováním, zejména tam, kde je primární poškození spíše prodloužené nebo oddálené, než akutní. Například, primární poškození je často spíše prodloužené nebo oddálené u infekce nebo výronu, kde se poškození tkáně nebo svalů objevuje (nebo persistuje) několik dní po primární infekci nebo poškození. Molekuly vážící selektin podle předkládaného vynálezu mohou být také podány do specifických orgánů ve vysokých koncentracích pomocí vhodně zavedených katetrů, nebo podáním takových molekul jako součásti chimérických molekul (nebo komplexů), které jsou zaměřeny na cílové specifické orgány.

Podání formy se zpomaleným uvolňováním je vhodné u těch pacientů, kde jsou indikovány opakované injekce po dlouhou dobu. Například, je žádoucí podat kompozici podle předkládaného vynálezu ve formě se zpomaleným uvolňováním tam, kde jsou způsoby podle předkládaného vynálezu použity pro léčbu genetických nebo chronických zánětlivých onemocnění, které jsou způsobené selektiny, proto, aby se maximalizoval komfort pacienta.

• »· .. . ·· ·. ··.

·.· ♦ · · · « · · . * • | · · · · <·· ·’ · *·.

♦ ·ι. · . · «L _ · A . ί» · ·4 · ·♦♦ 9 9 9'9 9 9 Μ

Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být použity v dávkových formách jako jsou tablety, kapsle, prášek v sáčkách, nebo kapalné roztoky pro orální podání, pokud není biologická aktivita aktivního multimerního uhlovodanu zničena procesem trávení a pokud charakteristiky sloučeniny umožňují absorpci ve střevě.

Farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu jsou vyráběny známým způsobem, jako je například běžné míšení,

- - granulování, výroba dražé, rozpouštění, lyofilizace nebo.podobné procesy. Kompozice podle předkládaného vynálezu nacházejí uplatnění v kontrole zánětlivého fyziologického poškození, jak akutního, tak chronického. Kompozice podle předkládaného vynálezu brání maximálnímu účinku tělu vlastních mechanismů pro rozpoznávání selektinem zprostředkované adhese.

V intravenosní dávkové formě mají, kompozice podle předkládaného vynálezu dostatečně rychlý nástup účinku pro to, aby byly použitelné pro akutní zvládnutí potenciálního tkáňového poškození.

Dále, verze s nižší účinností jsou užitečné při zvládání středně těžkých nebo chronických selektinem zprostředkovaných zánětlivých onemocnění.

Akutní rejekce orgánového transplantátu je charakterizována těžkou lymfocytární infiltrací. Bylo již dříve popsáno, že alterace endotelu štěpu vedou ke zvýšenému přesunu lymfocytů do štěpu. Zde uvedené příklady ukazují, že selektin, a zejména L-selektin, je indukován v důsledku takového štěpu ve tkáni a také že lymfocyty adherují k endotelu rejektóvaných transplantátů

		-w-w
•I ·	•	«' 4	to	• 4'	to 4
•	•	• 4	♦·<	9 9'	··
'i ·	4	• 4 4	• 4 4	·· ·.	4 4
1 ·	4	4 4	* 4	4	4 4
♦ ··		• ·	• to	• to'	··

srdce, ale ne k endotelu syngenních štěpů nebo normálních srdcí analyzovaných in vitro Stamper-Woodruffovým vazebným testem. Enzymaticky bylo syntetizováno několik členů sLex rodiny a byla analyzována jejich schopnost blokovat adhesi lymfocytů na srdeční endotel. Monovalentní sLex (tetramer), divalentní sLex (dekamer) a tetravalentní sLex (22-mer) všechny signifikantně redukovaly vazbu lymfocytů, ale inhibice tetravalentním sLex konstruktem byla jasně lepší než u ostatních členů sLex rodiny. Nejdůležitější kontrolní oligosacharidy, sialyl laktosaminy (sLN) bez fukosy,. ale se stejným nábojem jako členové sLex rodiny, neměly žádný účinek na vazbu lymfocytů.

Dále, jsou zde popsány metody syntetizování sialyzovaných O-glykosidických polylaktosaminových alditolů, které jsou účinnými inhibitory L-selektinem zprostředkované vazby lymfocytů na endotel. Konkrétně, difukosylováný dodekasacharid alditol (divalentní sLex) inhibuje 50% vazby v koncentraci 0,15 μΜ. Divalentní sLex alditol obsahuje GalSl-3GalNAc-ol sekvenci v O-glykosidickém jádře o které se soudí, že zvyšuje afinitu glykanu k L-selektinu.

Následující příklady representují nejprve syntesu komplexu oligosacharidů v dostatečných množstvích (jak je popsáno v příkladech) tak, že je možné rutinně provádět typy pokusů popsané v této přihlášce. Předkládaný vynález překonává v tomto oohledu dřívější obtíže.

Následující příklady jsou míněny jako ilustrace předkládaného vynálezu a nejsou v žádném ohledu limitující.

• 4 «	♦ 4	4 4	44	• 4	44
9 4	b 4	4	-4 4	•
4	4 4	4 4	4 4'4	• 4	44
			4 4		4
	• 4	• 4	4	4
• 4 4	4«	44	4 4	4 ··	44

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zvířecí modely pro L-selektinem zprostředkovanou rejekci transplantátu a tesť pro inhibici adhese

Rejekce transplantátu je zánětlivý proces charakterizovaný lymfocytární infiltrací. Dřívější pozorování ukázala, že peritubulární kapilární endotel (PTCE) je místem vstupu lymfocytů do rejektovaného renálního alotransplantátu. Během rejekce začínají PTCE exprivovat sialyl Lewis x de novo a váží lymfocyty mechanismem významně závislým na L-selektinu. Proto, inhibice interakce lymfocyt-endotel oligosacharidovými ligandy L-selektinu nabízí atraktivní alternativu pro prevenci zánětu a rejekce. Již dříve bylo ukázáno, že počet lymfocytů infiltrujících Štěp se dramaticky zvyšuje během akutní rejekce z normální hodnoty okolo 5xl0⁶ na více než 30xl0⁶.

Zvířecí modely rejekce srdečních a ledvinných transplantátů využívají inbrední WF (RT1^V) a DA (RT1“) kmeny krys, které se chovají v kolonii a jsou řádně testovány na vnitrokmenový příjem transplantátů, stejně jako na absenci vnitrokmenové smíšené lymfocytární kultury. DA transplantáty WF příjemcům jsou alotransplantáty, WF štěpy WF a DA štěpy DA slouží jako syngenní kontroly. Zvířecí modely jsou podrobněji popsány v (Renkonen, R. et al., Transplantátion 47: 577 - 579 (1989); Renkonen, R. et al., Am. J. Pathol. 137: 643 - 651 (1990); Turunen J.P. et al., Transplantation 54: 1053 - 1058 (1992); Turunen, J.P. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994); Turunen, J.P. et al., J. Exp. Med., 182: 1133 - 1142 (1995)).

4	4 4		4·		• f	♦ ·	»4
4		•	•	4	•	4 4	4	•
* 4		4	•	4	4 4»	4 4	• 4
								•
4: 4		•	·'	4	• 4	4	•	•
·· »	• 4		• 4		II	·«	II

Stampér-Woodruffův test vazby

Malé části odebraných syngenních (DA do DA a WF do WF) , alogenních (DA do WF) transplantátů byly umístěny do Tissue Tek media (Lab-Tek Production, Naperville, 111.) a byly rychle zmraženyv kapalném dusíku. 8 μπι silné zmrazené řezy byly připraveny během jedné hodiny před použitím řezů v testu vazby lymfocytů na endotel (Renkonen, R. et al., Transplantát ion 47: 577 - 579 (1989); Renkonen, R. et al., Am. J. Pathol. 137: 643

- 651 (1990); Turunen J.P. et al., Transplantation 54: 1053

- 1058 (1992); Turunen, J.P. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130

- 1136 (1994); Turunen, J.P. et al., J. Exp. Med., 182: 1133

- 1142 (1995)) .

Jednotlivé buněčné suspense lymfocytů mesenteriálních lymfatických uzlin byly vyrobeny mechanickou desintegrací v RPIM 1640 mediu (Gibco, Grand Island, NY) doplněném HEPES (25 mm) a 0,5¾ fetálním telecím sérem a buňky byly prosety přes síto s póry.· velikosti 50 μπι. Více než 99% buněk byly lymfocyty a populace lymfocytů se skládala z 80-90% CD-3 pozitivních T buněk, 50-60% CD-4 pozitivních T buněk, 25-35% CD8-pozitiviních T buněk a 10-20% CD19 pozitivních B buněk, jak bylo analyzováno průtokovou cytometrií a imunoperoxidasovým barvením z cytocentrifugovaných přípravků.

3xl0^e buněk ve 100 μτπ media bylo umístěno na vrch tkáňových řezů za použití kroužku z vosku pro zabránění úniku kapaliny. Řezy byly horizontálně rotovány na třepačce při 60 rpm po dobu 30 minut při +4 °C. Po inkubaci bylo medium šetrně odstraněno absorpčním papírkem a řezy byly fixovány v 1,5%' chladném glu t ar aldehydu přes noc. Řezy byly barveny thioninem po dobu 30

•				4 ·		4«		··
• ·	•		♦		*	•	4 4	•	•
•	•		•	4	•		• *	• ·
									4
*1			•	• l	*	4' 4	•	•	•
·♦·		« ·		«4		• 4	4«	• 4

minut. Nadbytek thioninu byl Šetrně vypláchnut v PBS a řezy byly umístěny do PBS-glycerolu (1:1) nebo do Aquamount Mountant, (BHD Limited, Poole, England). Z těchto přípravků se určil počet lymfocytů navázaných na různé struktury. Z každého vzorku bylo analyzováno alespoň 10-20 polí s vysokou četností, přičemž každá skupina obsahovala 3-4 zvířata.

Extravasace lymfocytů během rejekce srdečního transplantátu

Endotel ve tkáňových řezech připravených z alotransplantátů vázal signifikantně více lymfocytů ve srovnání s endotelem v řezech připravených ze syngenních transplantátů normálních srdcí (tabulka 1, obrázek 1).

Tabulka 1. Počet in vitro adherujících lymfocytů na jedno mikroskopické pole pří velkém zvětšení v normálním srdci a v syngenních nebo alogenních srdečních transplantátech .v den 3 po transplantaci. Je presentován průměr a SEM sedmi nezávislých pokusů.

	Normální	Syngenní transplantáty	Alogenní transplantáty
Celková oblast	47,4 + 4,3	71,1 ± 5,6	151,6 + 16,1
Endokard	0,1 + 0,1	2,1 + 0,7	2,8 + 1,3
Arterioly	0,1 + 0,1	2,1 + 0,1	1,6 + 0,7
Venuly	5,2 + 0,4	7,6 + 0,5	12,2 ± 1,6
Mezisvalové
kapiláry	23,8 + 3,1	42,7 + 3,8	119,4 + 12,4
Myokard	17,3 ± 0,0	16,6 + 1,1	15,6 + 1,9

* «* *« · 4 ·· ··

4 4 · 4 4 4 4 4 · ·

4 4. «44» · 444

V 4 ··· 4 4 4« Μ· 4' 4

444 4444 44*

4 · «4 44 »4 4 ·. 44

Když bylo anatomické umístění analyzovány podrobněji, byl endotel rozdělen do několika kategorií podle velikosti cévních struktur: (i) endokard, (ii) arterioly, (iii) venuly a (iv) mezisvalové kapiláry. Adhese lymfocytů byla testována v těchto různých kompártmentech a bylo zjištěno, že během rejekce je zvýšena v mezisvalových kapilárách a venulách (tabulka 1, obrázek 1). Byla zde konstantní nízká základní hladina vazby lymfocytů na myokard ve všech srdečeních vzorcích.

Specificita adhese. lymfocytů na. endotel byla demonstrována několika způsoby: i) prakticky nebyla přítomna v syngenních štěpech nebo v normálních neošetřených srdcích (tabulka 1), ii) nebyla ovlivněna původem adherujících lymfocytů (t.j. jak DA, tak WF buňky adherovaly stejně dobře na DA a WF štěpy (data nejsou ukázána) a iii) byla inhibována ošetřením tkáňových řezů sialydasou před přidáním lymfocytů. .

Zvýšená vazba lymfocytů na endotel alotransplantátů ledvin

V Stampér-Woodruffově testu se vazba lymfocytů na endotel' alotransplantátů zvýšila 4x ve srovnání s syngenními transplantáty nebo kontrolními ledvinami. Většina navázaných lymfocytů v alotransplantátech byla umístěna na peritubulárním kapilárním endotelu (PTCE), zatímco na endotel větších cév a glomerulů v alotransplantátech neadherovalo signifikantně více lymfocytů než na stejné struktury v syngenních transplantátech nebo v normálních ledvinách. Adhese lymfocytů na PTCE během rejekce transplantátu byla z větší části závislá na L-selektinů. Současně vykazovaly PTCE rejektováných ledvin morfologické rysy podobné endotelu lymfatických uzlin a začínaly reagovat de novo s anti sLex mAb a L-selektin-IgG fůsním proteinem (Renkonen, R. et

• 4 1 4 • 4 4	• 4 • 4	« ♦ · 4	4 4 4 4	a	• 4 4
				•	•
• · 4	M 4	« 4	•	•	4
·*» 4*	44	4«	• 4		*4

al., Am. J. Pathol. 137: 643 - 651 (1990); Turunen, J.P. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994)).

i·

Testování nových molekul inhibujících adhesy

Všechny nové oligosacharidové konstrukty podle předkládaného vynálezu byly testovány na schopnost inhibovat adhesy lymfocytů na endotel krysích transplantátů srdce a ledvin, u kterých probíhala akutní rejekce, což jsou modely, kde hraje L-selektin zásadní úlohu. Oligosacharidy byly rozpuštěny ve vazebném pufru a lymfocyty byly inkubovány v těchto roztocích po dobu 30 minut při +4 °C. Potom byly lymfocyty v sacharidových roztocích přidány do Stamper-Woodruffova vazebného pufru bez dalšího promývání a test byl proveden tak, jak je popsáno výše.

Příklad 2

Syntesa a charakterizace syntetických glykanů majících rozvětvenou polylaktosaminovou kostru (Tučně vytištěné číslování odpovídá glykanovým strukturám v tabulce 2)

Materiály a metody

Akceptorové sacharidy

N-acetyllaktosamin (GalSl-4GlcNAc) byl získán od Sigma. Glykany 2 a 7 byly syntetizovány enzymovou in vitro syntesou jak je popsána (Renkonen, O et al. Biochem. Cell Biol. 68: 1032 1036 (1990); Seppo, A. et al., Biochemistry .34: 4655 - 4662 (1995)).

•				··	··	• a
44 4	•	4	•	•	• 4	• a
• ·	•	•	•	444	• ·	a·
• A	9	φ A	4	a «o	a«t	V 4
• ·	•	A	«	• 4	•	• 4
	»1		4*	44	ti	• a

Enzymové přípravky

Lidské placentám! mikrosomy, obsahující a2,3-sialyltransferasovou aktivitu (van den Eijnden and Schiphorst, J. Biol. Chem. 256: 3159 - 3162 (1981)) byly připraveny následujícím způsobem: 100 g čerstvé lidské placenty bylo homogenizováno v 500 ml chladného 0,1 M Tris-maleinanu, pH 6,7 při +4 °C. Homogenát byl centrifugován při 3400 g při +4 °C po dobu 30 minut a supernatant byl dále centrifugován při 200000 g při +4 -°C po dobu 60 minut. Mikrosomová peleta byla suspendována v 10 ml 0,1 M Tris-maleinanu, pH 6,7 za zisku suspense obsahující 80 mg/ml proteinu (Bradford, M.M. Anal. Biochem. 72: 248 - 254 (1976)).

al,3/4-fukosyltransfersa byla extrahována z lidského mléka za použití SP-Sephadex C-50 jak je popsáno (Eppenberger-Castori, S. et al., Glycoconjugate J. 6: 101 - 114 (1989)). Z 1 1 ohřátého mléka bylo získáno 100 ml fukosyltransferasy. Pool byl koncetrován na 5 ml za použití Amicon ultrafiltračního přístroje vybaveného membránou s hraniční hodnotou 30 kDa. Tento přípravek obsahoval 8 mU/ml celkové fukosyltransferasy a 0,79 mg/ml proteinu.

Transferasové reakce

0í2,3-sialyltransferasova reakce byla provedena ve 100 μΐ 0,1 M Tris-maleinanu, pH 6,7 obsahujícího oligosacharidový akceptor odpovídající 100-200 nmol akceptorových míst (t.j. neredukujících koncových galaktosových zbytků), 10-ti násobný nadbytek CMP-NeuNAc a 25 μΐ lidských placentárních mikrosomů obsahujících oí2,3 sialyltransferasovou aktivitu. Reakční směsi byly inkubovany

v	V»	w		V V
·· 9	•		9	•	» ·	•
• *	•	• ·	···	• ·	··	φ
• ·	•	•	9	• ·		•	A
···		99		It	«·

po 12 - 18 hodin při 37 °C a reakce byly ukončeny přidáním 100 μΐ vody a zahřátím ve vodní lázni s vřící vodou po dobu 2 minut. Srážející se protein se odstranil centrifugací, supernatant a proplachovací kapalina byly lyofilizovány a oligosacharidy byly přečištěny ze směsi gelovou filtrací na Superdex 75 HR koloně, al,3/4-fukosyltransferasové reakce byly provedeny jak je popsáno (Palcic, M.M. et al., Carbohydr. Res. 190: 1-11 (1989)) a ukončeny byly gelovou filtrací na Superdex 75 HR koloně.

Trávení glykosidasou

Pro sialydasové reakce bylo 1-4 nmol oligosacharidů rozpuštěno v 16 /il 0,1 M pufru octanu sodného, pH 5,0. Reakce byla započata přidáním 40 mU (4 μΐ) sialydasy z Artrobacter ureafaciens (Boehringer), reakční směs byla inkubována po dobu 16 hodin při 37 °C a reakce byla ukončena gelovou filtrací na Superdex 75 koloně.

Pro současné β-N-acetylhexosaminidasové a β-galaktosidasové reakce bylo 1-20 nmol oligosacharidů rozpuštěno v 30 μΐ pufru citrátu sodného pH 4,0. Reakce byla započata přidáním 150 mU (2,4 μΐ) β-N-acetylhexosaminidasy ze semen jack beán (Sigma) a 100 mU (15 μΐ) β-galaktosidasy (Sigma) do reakční směsi. Po inkubaci (16 hodin při 37 °C) byla reakce ukončena zahřátím ve vařící vodní lázni po dobu 3 minut.

Chromátografické metody

Aniontová výměna chromátografie s vysokým pH s pulsní amperometrickou detekcí (HPAEC-PAD) na (4 x 250 mm) Dionex CarboPac PA-1 koloně byla provedena tak, jak je popsáno (Helin,

J. et al., Carbohydr. Res. 266: 191 - 209 (1995)). Kolona byla eluována rychlostí 1 ml/minutu a byla ekvilibrována výchozím pufrem před injekcí vzorku. Frakce s maximy byly odebírány manuálně a byly neutralizovány ihned přidáním 0,5 objemů chladné 0,4 kyseliny octové a byly sušeny vakuovou centrifugou. Sušený materiál byl odsolen kapalinovou chromatografií s vysokou rozlišovací schopností (HPLC) gelovou filtrací na Superdex 75 koloně.

Aniontová výměnná chromatografie na MonoQ (5/5) koloně (Pharmacia) byla provedena za použití LKB 2150 HPCL pumpy a LKB 2152 HPCL kontrolního systému vybaveného nízkotlakým mísícím systémem. Kolona, kalibrovaná vodou, byla eluována rychlostí 1 ml/minutu, nejprve izokraticky vodou a potom lineárními gradienty NaCl jak je ukázáno na obrázku 5. Eluát byl monitorován Kratos Spectroflow 757 UV monitorem při 214 nm nebo 205 nm. Mono-, di- a trisialyzované markéry ukázané na obrázku 5 byly NeuNAa2-3Gal£l-4GlcNAc (Oxford Glycosystems), NeuNAa2-6GalSl-4GlcNAcfil-2Manal-6(NeuNAa2-6GalÉl-4GlcNAcSl-2 Manal-3)ManSl-4GlcNAc a NeuNAca2-6GalSl-4GlcNAc£l-2Manal-6 (NeuNAa2-3GalEl-4GlcNAcSl-4(NeuNAa2-6Gal£l-4G1cNAcfil-2)Manal-3 GlcNAc, v příslušném pořadí. Poslední dva byly dary od Dr, Gerard Strecker (University of Lilie, France).

HPLC gelová filtrační chromatografie na Superdex 75 HR (10/30) koloně (Pharmacie, Sweeden) byla provedena za použití LKB 2150 HPCL· pumpy. Kolona byla vyplachována při 1 ml/minutu za použití 50 mM NH₄HCO₃ pro potlačení iontových výměných účinků kolony. Výtok byl monitorován Spectra-Physics 8450 UV monitorem při 214 nm nebo při 205 nm. Množství sacharidu v každém píku bylo hodnocena z plochy píků vzhledem k externímu standardu (GlcNAc nebo NeuNAc), kdy byl brán v úvahu počet karbonylových skupin v každém píku. Přesnost kvantifikace byla hodnocena jako lepší než + 20%.

NMR spektroskopie

Před NMR analýzou byly oligosacharidové vzorky opakovaně rozpuštěny v 99,96% D_a0 (C.I.L., MA, USA) a lyofilizovány. Nakonec byly vzorky rozpuštěny v 99,996% D^O a prosety přes filtr s nylonovou membránou. ^H-.NMR spektrum bylo zaznamenáváno za použití Varian-Unity-500 spektrometru operujícího při protonové frekvenci 500 MHz. Teplota sondy byla určena na 23 °C nebo 27 °C. Nosič frekvence byl umístěna na vrch residuálního H^O/HDO signálu a potlačení rozpouštědla bylo provedeno použitím modifikované WEFT sekvence. Hodnoty chemického posunu jsou vyjádřeny v ppm stupnici s ohledem na vnitřní acetonovou signální sadu k 2,225 ppm. Jednotlivé monosacharidové zbytky jsou označeny horním indexem ukazujícím kratším nedvojznačným způsobem glykosidické vazby mezi monosacharidem a redukujícím koncem glykanu.

Hmotnostní spektroskopie

Hmotnostní spektrometrie s desorpcí matrice laserem (MALDI-MS) nederivatizovaných oligosacharidů byla provedena LASERMAT přístrojem (Finnigan MAT Ltd., U.K.). OeperaČní podmínky a postupy byly modelovány podle práce Karasa (Karas and Hillenkamp, Anal.Chem. 60: 2299-2301 (1988)). Vzorek byl rozpuštěn v 50 mM 2,5-dihydroxy kyselině benzoové /v acetonitrilu/vodě 70:30 podle objemu) a 1 pl směsi obsahující 10-30 pmol oligosacharidů byl aplikován na standartní cíl z nerez oceli. Kapka se nechala zaschnout do mikrokrystalické formy před

·· « ·	• ·	•	• ·	a ·
• · to	• «	to « to	to ·	a ·
• to to ·	β ό	• *·	• to ·	to «
* · to	• to	• to	*	• ·
·«· ··	• ·	to to	• to	• to

vložením do přístroje. Oligomanosa 9 (Man^GlcNAc^; Mw =. 1884;

zdroj: prasečí tyreoglobulin) od Oxford Glycosystems, U.K., byla použita pro zevní kalibraci.

) • · · · * · * · « » · · · « · · « « · · « » · « · » · · ·♦ · · » 4 O « · O « » · · ····* * · «· 99 9 9

Tabulka 2: Struktura syntetických meziproduktů a produktů předkládané studie

Glykan	Struktura-
1 rx	3GaiPl-4GlcNAc NcuNAcoZ^Fucal^
ΰ	Galpl-4GlcNAcP^ jGalpMGlcNAcpl GaiPl-iGIcNAcpl^'
3	!M3«mcP1>íwo;A.At NeuNAccc2 „ „ /3 3Galpl-4GlcNAcplx NeuNAcaZ^
4	3GaíPl-4GIcNAcP\ NcuNAca2 Fucal^3 *Gaipl-4GlcNAc 3Gaipi-4GlcNAcPr NeuNActí^ Fucalz'z3
5	3Gaipi-4GlcNAcp\ NeuNAcaŽ^ Fucal/3 * Galpl-4GlcNAc 3Gaipi-4GlcNAcpr NcuNAcft2Z
6	3Gaipi-4GlcNAcPl\ NcuNAca2 ^Galpl-4GIcNAc 3Gaipi-4GIcŇAcpr NeuNAcož^ Fucal^
	Galpl-4GlcNAcPl\fi 3 GaiPl-4GlcNAcpl GaiPl-4GlcNAcpr ...... 1 Galpl—4GlcNAc GaiPMGlcNAcplx A / , ® Galpl-4GIcNAcPl Galpl-4GlcNAcpl

8	/3Galpl-401cNAcPlx NcuNAcal 6 „ _ /3GaiPl-4GlcNAcPl/3Ga,í]1“iG!í;NAcPlX6 NcuNActt2 jGaIpl—4GlcNAcpl ^GaiPl^GlcNAcPl^ NcuNAcc2
9	3GaiPl-4GlcNAcPl\ NeuNAceZ Fučel”3 3 GaiPl~4GlcNAcPl ^GaiPMGlcNAcpIX \ NcuNAce2 Fučel-'3 ?Galpl-4GlcNAc JGalpMGIcNAcPl \ f NeuNAcel Fucar'3 „ Gaipi-4GIcKAcPr y3Galp!-4GlcNAcpl X J NeuNAcež Fučel3
10	3GaIpl-4GlcNAcplx NcuNAcdi A GaiPl-4G!cNAcpL ^Galpl-^GlcNAcpl ' \ NeuNAce2 Fučel3 ?Ga!pl-4GlcNAc JGaiPWGIcNAcPl X f NeuNAce2Z Fučel·3 3 GaiPl-4GlcNAcPr y3Galpl-4GlcNAcpIX NcuNAcoZ Fučel?3
11	3GaiPl-4GlcNAcplx NeuNAce2 Fučel*3 3 Gaipi-4GlcNAcpL ^GaiPl-éGlcNAcPl ' \ NeuNAce2 Fučel*3 $ Galpl^GlcNAc z3GaIpl-4GlcNAcPlX / NeuNAca2/‘ * jGalPMGIcNAcPf ,3GalPl-4GlcNAcpIX NeuNAce2 Fučel*3

Enzymatická syntesa oligosacharidů

Enzymaticky byly syntetizovány oligosacharidy representující mono- a oligovalentní sialyl Lewis x glykany (sLex), stejně jako jejich analoga bez fúkosy (sialyl LN)' pro pokusy buněčné adhese. Syntesa obsahovala použití dříve generované poly-N-acetyllaktosaminové kostry (Renkonen, O. et al., Biochem. Cell. Biol., 68: 1032 - 1036 (1990); Seppo, A. et al., Biochemistry 34: 4655 - 4662 (1995)), která byla konvertována do mono-, di-,- a tetravalentních sLex glykanů 1, 4 a 9 (strukturu viz tabulka 2) za použití reakce a2,3-sialylace a al,3-fukosylace. Glykan 9 representuje největší čistý oligosacharid takto konstruovaný z moonosacharidového primerů. Podobně jako jiné produkty syntesy byl důkladně analyzován za použití mnoha technik včetně NMR-spektroskopie a hmotností spektrometrie. Všechny fukosové zbytky byly přeneseny spíše na sialyzované, než na proximální a vnitřní Gal£l-4GlcNAc zbytky glykanů 3 a 8, jak bylo předpokládáno (Niemela, R. et al., Glycoconjugate J. 12: 36 - 44 (1995)), ale jedna ze čtyř sialyzovaných Galfil-4GlcNAc jednotek reagovala o mnoho pomaleji než ostatní, což vedlo ke tvorbě trifukosylovaného meziproduktu (buď glykanů 10 nebo 11) v neočekávaně čisté formě.

Syntesa monovalentního sLex glykanů 1

Glykan 1 byl připraven z GalEl-4GlcNAc enzymatickou a2,3-sialyzací následovanou enzymatickou al,3-fukosylací jak bylo popsáno (de Vries et al., FEBS Lett., 330: 243 - 248 (1993)). Přečištěný produkt byl charakterizován ^XH-NMR nukleární magnetickou resonanční (NMR) spektroskopií při 500 MHz a bylo pozorováno spektrum identické k dříve pozorovanému (data nejsou t>6 Γ·ί;.· ο». i’řl «•Μ 6 6 f 6'·*' c í- t· «

9( t‘ 6 t t »n ¢1 . f; I; β <í i

W tv e e' f t í ' M č o ďí; ft

W. «< 6 c. t i? í_;. .i:

r»Ot? r,r c.í n,.čí; , ukázána) (Balí et al., J.‘ Am. Chem. Soc. 114: 5449 - 5451 (1992); de Vries et al., FEBS Lett., 330: 243 - 248 (1993)).

*· . ý·* '·* | f fr'¹·' 1 ' t. . ». *<> ..»·.

Syntesa glykanu 3 ^ř. ; . <

*. . s ..

* ” * vr . .J, ,.

Enzymatické.generování biantenového glykanu 3 bylo popsáno dříve (Renkoneri, 0. et al‘.,, Biochem.,. Cell. Biol.‘, 68:’1032 - 1036¹' (1990) . 'Nyní byly, na. jeho·; distální GalBl-4GlcNAc jednotky připojeny'a2,3-vázané kyseliny <sialové: Glykan., 2 (100 nmol) byl inkubován+syCMP-NeuNAc -a- «2,3-sialy 11řahsferasóu .přítomnou..v.,______ .mikrosomech lidské¹ placenty, a. vzniklá směs byla frakciónována .aniontovou výměnnou HPLC. Frakce (.85 ml) eluované jako disialyzovaný oligosacharidový markér byly odebírány, lyofilizovány, odsoleny gelovou filtrací a podrobeny NMR analýze.

. ^XH-NMR spektrum: disialyzovaného produktu (obrázek 3B, pro hodnoty Chemického'posunu-viz tabulku 3 )₄ ukazuje, že je presentován glykan 3;.Ve srovnání se spektrem glykanu 2 (obrázek 3A, tabulka 3) > je přidání dvou NeuNAc <,ukázáno signály NeuNAe H-3ax a H-3eq, dvou ekvivalentů při.2,757 a. 1,799 ppm, v příslušném, pořadí (obrázek 3B) .. signály akčeptořových„zbytků <*Gal· a.*^sGal jsou posunuty směrem dolů +0,081 a+0,079 ppm, v , příslušném pořadí,, a.nové signály dvou ekvivalentů .se objevují při 4,117. ppm· jsou*přiřazeny, k Η-3· a2,3-sialyzovaných .galaktos. Tyto signály⁷ značících skupin Jsou charakteristické pro o/2,3-sialyzaci distálních galaktos (Vliegenthart, J.F.G. et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 41: 209 - 374 (1983); Kamerling and Vliegenthart, Biol. Magn. Res. 10: 1 - 287 (1992); Machytka, D. et al., Carbohydr. Res. 254: 289 - 294 (1994).

«44 · • « 4	• * 4 4	• 4 4 4	4 4 4 4	4	4 4 4
				•	4
4 4 4	4 4	• 4	*	4	4
• 4 4 4 4	4 4	4 ·			44

Syntesa glykanu 4

Vzorek glykanu 3 (75 nmol) byl inkubován s GDP-Fuc a lidskou mléčnou al-3-fukosyltransferasou. MonoQ iontová výměnná chromatografie reakční směsi dávala vznik píku eluujícího jako disialyzovaný markerový oligosacharid (není ukázáno). Tento materiál byl podroben HPAE chromatografií za zisku jediného hlavního píku (74 nmol, obrázek 4A). Tento materiál eluuje dříve ^.^než^výchozí.materiál nebo_monofukosylovaný produkt získaný v částečné reakci (viz dále), což naznačuje, že představuje difúkosy1ováný produkt (Hardy, M.R. and Townsend, R.R. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 3289 - 3293 (1988)).

^XH-NMR spektrum difukosylovaného produktu (obrázek 3C, tabulka 3) ukazuje, že dvě fukosy byly přeneseny na akceptor, za zisku glykanu 4. H-l signály fukos resonovaly při 5,117 ppm a 4,078(a)/5,091(β) ppm (³FucH-l a ^eFucH-l, v příslušném pořadí). V glykanu 4 byly také H-l signály ³Gal a ^eGal posunuty (-0,027 a -0,028 ppm, v příslušném pořadí) ve srovnání s odpovídajícími signály ve glykanu 3. Oproti tomu, H-l signál rozvětvené galaktosy byl prakticky nezměněn, což ukazuje, že GlcNAc na redukujícím konci nebyl fukosylován. Toto potvrzuje a rozšiřuje naše předchozí data ukazující, že Galfil-4GlcNAc zbytky polylaktosaminů tvořící^větvení nejsou za_použitých_podmínek fukosylovány (Niemela et al., Glycoconjugate J. 12: 36 - 44 (1995)).

Syntesa glykanů 5 a 6

Byla také provedena Částečná fukosyltransferasová reakce glykanu 3 za použití omezení reakční doby a množství GDP-(^X4,C) Fuc

fr • t ·	♦	0 ·	•:	• ·	•	1 ·
«	•	v	• · ·	• ·		« *
					«	*
0 *	0	0 ·	• 0	•	•	«
• · ·	0 *	• ·	« ·	• «		• ·

donoru. HPAE-chromatografie reakční směsi (obrázek 4B) ukázala píky Dl a D3, které eluují jako difukosylovaný produkt 4 a nereagovaný akceptor 3, v příslušném pořadí; pík meziproduktu D2 představuje směs monofukosylovaných produktů 5 a 6. Pro zjištění složení byla D2 směs desialyzována a potom inkubována s β-N-acetylglukosaminidasou a fi-galaktosidasou, které narušily nefukosylovaná větvení (Kobata, A., anal. Biochem. 100: 1,- 14 (1979)), ale fukosylovaná ramena nechaly intaktní (t.j. horní větev desialyzovaného 5 a dolní větev desialyzovaného 6 zůstala . intaktní). Vzniklá směs izomerických pentasacharidů byla nakonec separována papírovou chromatografií (obrázek 4C) (Niemela et al., Glycoconjugate J. 12: 36 - 44 (1995)). Data ukázala, že pík D2 představuje 1:3 směs 5 a 6. NMR-spektrum píku D2 ukázalo silný Fuc H-l signál při 5,117 ppm a slabý signál při 5,078/5,091 ppm, což umožňuje jednoznačné přiřazení odpovídajících signálů v glykanu 4 (tabulka 3) . Již dříve jsme ukázali, že kromě 3 je také dvojanténový glykan 2 al,3-fúkosy1ován v částečné reakci } preferovaně v 1,3-vázaném rameni za použitých podmínek (Niemela et al., Glycoconjugate J. 12: 36 - 44 (1995)).

*4

«	* i	• ·-	• 4	• 4
«4 ·	•	• Φ	·'	• ·	Φ		•
• «	•	• ♦	• · ·	« 4	a	• 4
• «	•	• ·	• ·	V	•		•
·· ·	« ·	« ·		··		··

Tabulka 3: ^H-NMR chemické posuny® signálů strukturálních reportérových skupin syntetických glykanu 2-4 a 6.

1		Glyfcan
Zbytek t e	proton	2	3	4	6
GIcNAc	H-l	5.209/4.729	5.215/4.72^	5.215/4.712	5.214/4.72^
Gal	H-l	4.457/4.45£	4.459	4.454	4.455
	H-4	4.151	4.142	4.135	N.D.
JGlcNAc	H-l	4.700/4.69*	4.699/4.69;	4.706	4.708/4.69’
‘GIcNAc	H-l	4.624/4.61Í	4.612/4.60(	4.607	4.612/4.60;
3Gal	H-l	4.478	4.559	4.532	4.533
	H-3	N.D.	4.117	4.088	N.D.
‘Gal	H-l	4.463/4.467	4.544	4.516	4.545
	H-3	N.D.	4.117	4.088	N.D.
fyeuNAc	H-3ax		2.757	2.762	2.764
	H-3eq		1.799	1.796	1.797
‘NeuNAc	H-3ax		2,757	2.762	2.755
	H-3eq		1.799	1.796	1.801
^uc	H-l			5.117	5.117
	H-5			4.819	N.D.
	H-6			1.663	1.667
‘Fuc	H-l			5.078/5.091	Λ
	H-5			4.819	-
	H-6			1.663	*

® Chemické posuny jsou uvedeny ve stupnici ppm š ohledem na vnitřní acetonovou signální sadu při 2,225 ppm. Pokud jsou pro resonanci uvedeny dvě hodnoty oddělené lomítkem, pak označují α/β anomery uvažované molekuly.

Pro přesné určení monosacharidovych zbytků viz oddíl materiály a metody.

N.D. Není určeno * · · · ·» toto toto ♦ ♦ · ♦ » to to to to to to toto to · · ♦ · · · ·· · • · to « toto toto ··»·· _Λ r- tototot··» · ·· *±D toto· to* ♦· ·· ♦···

Syntesa glykanu 8

Enzymatické generování tetraantenového glykanu 7 bylo popsáno dříve (Seppo, A. et al., Biochemistry 34: 4655 - 4662 (1995); nyní byly na jeho distální GalSl-4GlcNAc jednotky připojeny terminální «2,3-NeuNAc. Vzorek 7 (7 nmol) byl inkubován s CMP-NeuNAc a a2,3-sialyltransferasou a zpracován jak je uvedeno výše. Iontová výměnná chromatografie na MonoQ koloně (obrázek 5A) dávala minoritní produkt eluující jako t-risialooligosacharidový markér, zatímco hlavní produkt (59 nmol) eluoval pomaleji.

¹H-NMR spektrum hlavního produktu potvrdilo jeho totožnost jako sloučeniny 8 (obrázek 6B, tabulka 4). Ve srovnání se spektrem akceptorového glykanu 7 (obrázek 6A) ukazuje spektrum 8 jasně přenos čtyř ekvivalentů NeuNAc v á2,3-vazbě. Zjištění NeuNAc H-3ax signálu při 1,803 ppm a H-3eq signálu při 2,756 ppm, čtyř ekvivalentů obou, ukazuje, že nově připojené NeuNAc zbytky jsou opravdu v q-2,3- vazbě (Vliegenthart, J.F.G. et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 41; 209 - 374 (1983); Kamerling and Vliegenthart, Biol. Magn. Res. 10: 1 - 287 (1992); Machytka, D. et al., Carbohydr. Res. 254: 289 - 294 (1994). Toto je podpořeno zjištěním charakteru čtvrtého píku při 4,119 ppm, který může být přiřazen k H-3s předposledních galaktos. Charakteristicky jsou H-l signály předposledních galaktos také posunuty o +0,080 ppm dolů u sloučeniny 3, což bezpečně určuje akceptorová místa v molekulách.

4b

1	4 4	4·	»4	• 4	4 4
	4	4	4	•	4	4 »	4 4
4 4	4 4	4 β 4	4 4	4 4	♦ 44 9 0 4	• 4 «00	• 4 4 4
*	• 4	Λ 4	4 4	•	• ·
• · 4	44	4*	• 4	··	··

Tabulka 4: ^XH-NMR chemické posuny®· signálů strukturálních reportérových skupin syntetických glykanů 7-9.

1		Glytfan
Zbytek 4	proton	7*	8	9
GlcNAc	H-l	5.207/4.725	5.210/4.72Í	5.210/4.721
Gal	H-l	4.459	4.460	4.456
‘GlcNAc	H-l	4.705	4.703	4.709
‘GlcNAc	H-l	4.626	4.620'	4.623‘
3Gai	H-l	4.459	4.460	4.456
‘Gal	H-l	4.445	4.445	4.440
J3+wGlcNAc	H-l	4.697	4.689	4.695
wGlcNAc	H-l	4.638	4.620'	4.604*
‘‘GlcNAc	H-l	4.614	4.598'	4.556*
w^Gal	H-l	4.480	4.5S9	4.534
	H-3	N.D.	4.119	4.089
‘•‘♦“Gal	H-l	4.464	4.544	4.517
	H-3	N.D.	4.119	4.089
NeuNAc	H-3ax	-	2.756	2.762
	H-3eq		1.803	1.798
i*’.«Fuc	H-l	-	-	5.118
	H-6	-	-	1.668
«♦«FUC	H-l	•	•	5.084 5.077^
	H-6	-	-	1.668

^a Chemické posuny jsou uvedeny ve stupnici ppm s ohledem na vnitřní acetonovou signální sadu při 2,225 ppm. Pokud jsou pro resonanci uvedeny dvě hodnoty oddělené lomítkem, pak označují a/£ anomery uvažované molekuly.

Pro přesné určení monosacharidových zbytků viz oddíl materiály a metody.

° Data z (27) <3.

£

N.D. Není určeno.

·* Určení může být zaměněno.

^e,eFucH-l a ⁶'³FucH-l signály nemohou být určeny samostatně.

Syntesa glykanů 9

Glykan 8 byl inkubován s GDP-Fuc a al,3fukosyltransferasou z lidského mléka. Reakční směs byla frakcionována HPAE chromatografií (obrázek 5) a byly získány dva hlavní píky eluující dříve než výchozí materiál. Pík Tl byl určen jako tetrasialo-tetrafukó-glykan 9, zatímco pík T2 představoval téměř čistý jediný izomer tetrasialo-trifuko-glykanů. Vedlejší pík T3 byl pokládán za směs tetrasialo-difuko-glykanů.

Tl glykan byl desialyzován sialidasou z A.ureafaciens a potom byl podroben současnému ošetření β-galaktosidasou a β-N-acetyhexosaminidasou, Gelová filtrace následovaná HPAE-chromatografií ukázala, že desialyzovaný Tl zůstal intaktní (data nejsou ukázána) . Tato data určují, že v Tl byly přítomny čtyři fukosy, navázané na sialyzované Gal£l-4GlcNAc jednotky v neredukujících koncích akceptorového glykanů 8. Proto Tl sacharid představuje glykan 9.

^XH-NMR spektrum Tl sacharidu (obrázek 6C; tabulka 4) potvrdilo, že jsou přítomné čtyři α-vázané fukosy. Toto může být pozorováno jako čtyři Fuc H-l signály při 5,119 ppm (dva ekvivalenty), 5,084 ppm a 5,076 ppm (vždy jeden ekvivalent), v příslušném pořadí, a jako Fuc H-6 signál při 1,668 ppm (12 ekvivalentů) . Fuc H-5 signál při asi 4,81 ppm nemohl být přesně umístěn a změřen vzhledem k několika překryvům s residuálním HDO pikem. V H-l signálech galaktos v glykanů 8 byly pouze předposlední, sialyzované zbytky posunuty při fukosylaci. Tyto posuny (-0,025 ppm pro ³'³Gal + ³*^eGal a -0,027 ppm pro ^e,3Gal + ^e,6Gal) potvrzují, že fukosylace a sialyzace proběhla pouze na distálních GalSl-4GlcNAc jednotkách 7. Nedetekovali jsme žádné

	4*	»4		• 4	44
• 4 4	4	4	4	4	' 4	4''	4
• 4	•	4	4	4 4 4	4 4	4 4
							4
• 4	•	4	4	4 4	4	4	•
• · 9	4 ·		4 4	4 4	w 4	4 4

známky α2.6 vazby NeuNAc v glykanech 8 nebo 9. I pokud malá množství a2,6-NeuNAc v 8 unikla z naší NMR analýzy, měla by být eliminována z tetrafukosylováného glykanu 9 vzhledem ke své neschopnosti stát se fukosylovanými (Paulson, J.C. et al., J. Biol. Chem. 253: 5617 - 5624 (1978)).

Charakterisace syntetických glykanů představujících 10 nebo 11

Většina z T2 materiálu (obrázek 6C, tabulka 4) představovala jediný izomer, kde chyběla Fuc v jedné-distální. větvi, ale.v ostatních třech byla přítomná. Ve srovnání se spektrem glykanu 9 byl Fuc H-l signál při 5,084 ppm u T2 sacharidu silně redukován. U glykanu 9 je tento signál přiřazen H-l fukosy navázané bud' ^e*^eGlcNAc, nebo ⁶'³GlcNAc. V souladu s tím představuje T2 sacharid buď glykan 10, nebo glykan 11 v téměř čisté formě.

Počet Fuc zbytků v desíalyzovaných Tl a T2 sacharidech byl potvrzen hmotnostní spektrometrií s desorpcí matrice (MALDI-MS). Desialyzovaný Tl sacharid (obrázek 7A) ukázal jediný pík s m/z = 3183 Da (počítáno pro Fuc₄Hex_vHexNAc_,+NA⁺) 3183 Da) , zatímco desialyzovaný ukázal jediný pík s m/z = 3035 Da (počítáno pro Fuc Hex HexNAc +NA*)3035 Da).

*7 Ύ *

Příklad.3

Všechny enzymaticky syntetizované oligosacharidy sialyl Lewis x typu inhibují adhesy lymfocytů na endotel rejektovaných srdečních transplantátů.

Rejekce srdečních transplantátů je charakterizována těžkou infiltrací štěpu lymfocyty (Renkonen, R. et al., Cell. Immunol.

ΊΊ: 188 - 195, (1983); Hayry, Ρ. et al., Immunol. Rev. 77: 85 142 (1984); Turunen, J.P. et al., Transplantation 54: 1053 - 1058 (1992)). Tato přihláška ukazuje, že srdeční endotel, který neexprivuje sLea a sLex u normálních zvířat, může být indukován tak, že exprivuje tyto oligosacharidové epitopy během episod rejekce transplantátu. Tato de novo exprese sialyzovaných Lewis oligosacharidů vede k zvýšené adhesy lymfocytů na endotel způsobem závislým na sLea, sLex a L-selektinu. Endotel odmítnutých srdečních štěpů, ale ne endotel normálních srdcí nebo syngenních štěpů, se barví přímo L-selektin-IgG fúsním proteinem.

Inhibice adhese lymfocytů na srdeční endotel během episod akutní rejekce oligosacharidy byla vyšetřována za použití rodiny oligosacharidů syntetizovaných enzymatickou syntesou v příkladu 2: monovalentního sLex tetrasacharidu (1), divalentního sLex dekasacharidu (4) a tetravalentního sLex 22-merního oligosacharidů (9) a jejich nefukosylovaných sialyl laktosaminových analogů (3, 8). Lymfocyty byly preinkubovány po dobu 30 minut s různými koncentracemi oligosacharidů a potom byly umístěny do Stamper-Woodruffova vazebného testu bez dalšího promytí. Tyto oligosacharidy neměnily signifikantně vazbu lymfocytů na syngenní štěpy, která byla pouze o něco vyšší než vazba na normální srdeční tkáň (tabulka 1 a data nejsou ukázána). Na druhou stranu, všechny členy sLex rodiny byly účinné v inhibici adhese lymfocytů na srdeční endotel, ale tetravalentní sLex byla jasně nejlepší ve srovnání s ostatními sLex oligosacharidy (obrázek 2) . současně, nefukosylované sialyl-laktosaminové glykany byly bez efektu.

Výsledky ukazují, že tetravalentní sLex (22-měrní oligosacharid) je nej lepší v inhibici L-selektin závislé adhese lymfocytů na srdeční endotel ve srovnání s di- nebo monovalentními oligosacharidy (deka- a tetramery, v příslušném pořadí), Oproti tomu, sLN oligosacharidy neměly žádný účinek na adhesi lymfocytů. Dohromady tato data ukazují, že zvýšení endotelové exprese sLeá a sLex je zásadní pro vznik lymfocytárního zánětu závislého na L-selektinu v rejektovaných srdečních alograftech, a že oligosacharidy mohou inhibovat tento proces.

Příklad 4

Multivalentní sLex-oligosacharidy jsou vysoce afinitní inhibitory adhese lymfocytů (Čísla uvedená tučně odpovídají glykanovým strukturám v tabulce 2)

Za použití zvířecího modelu popsaného v příkladu 1 byly ledvinné štěpy odebrány 3 den po transplantaci, kdy probíhá akutní rejekce. Lymfocyty byly, nebo nebyly, předem ošetřeny po dobu 30 minut různými oligosacharidovými konstrukty a byly přidány do Stamper-Woodruffova testu vazby. Po 30 minutách testu vazby byly nenavázané buňky vypláchnuty a byl určen počet navázaných buněk. Jak je vidět z obrázku 8, všechny «2, 3-kyselinu sialovou- a «1,3-fukosu- obsahující polylaktosaminy (t.j. mono-, di- a tetravalentní sLEx, struktury 1, 4 a 9, v příslušném pořadí) byly schopné inhibovat signifikantně vazbu lymfocytů na PTCE. Adhese lymfocytů se snížila o 39% působením 0,5 μΜ monovalentního sLex (1), a IC_so hodnoty pro di- a tetravalentní sLex (4 a 9) byly 1 μΜ a < 0,05 μΜ, v příslušném pořadí. V nejúčinější použité koncentraci inhiboval glykan 9 • « • · · » »· adhesi lymfocytů z více než 73%, což je oněco lepší než 60% inhibice získaná ve stejném testu za použití funkčně aktivní ani-L-selektinové protilátky HRL-1 (Turunen, J. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994)).

Žádná ze struktur bez fukosy, t.j. sialyllaktosaminů a glykanů 3 a 8, ani nefunkční anti-L-selektinová protilátka, neinhibovaly adhesi lymfocytů, což naznačuje zásadní roli fukosy v tomto testu. Tetravalentní glykan 9 byl jasně nejúčinějším inhibitorem, což naznačuje, že se může.vázat na několik molekul L-selektinu na povrchu lymfocytů.

Již dříve bylo ukázáno, že tento test měří především adhesi závislou na L-selektinu. al,3-vázané fukosylové zbytky představují základní strukturální rys inhibiČních sacharidů ve vazebném testu. Tento rys je.také charakteristikou oligosacharidů schopných vazby na L-selektin (Foxall, C. et al., J. Cell. Biol. 117: 895 - 902 (1992); Imai, Y. et al., Glycobiology 2: 373 - 381 (1992)). I když není možné vyloučit roli na E- a P- selektinu závislé adhese v tomto testu, není pravděpodobné, že by probíhala, protože použité lymfocyty byly sLex negativní.

Mezi syntetickými sLex glykany byl tetravelentní 9 jasně nej silnějším inhibitorem adhese lymfocytů (IC_so< 50 nM) . Rozmezí dávky sLex glykanů použité v této studii byly 1000-násobně nižší než je popsáno v literatuře pro monovalentní sLex a rekombinantní selektiny fixované na mikrotitrační plotny (Foxall, C. et al., J. Cell. Biol. 117: 895 - 902 (1992)). Pravděpodobně nemohou být dva použité testy (Stamper-Woodruffův a fixované rekombinantní selektiny na plotně) přímo srovnávány mezi sebou, protože vazebné síly jsou různé (Varki, A., Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 7390 ·· ·· • · ♦ ' • · ·♦ ·♦· ♦ ♦ • * · ·· ·Ι •«β ♦ · · * • *· ·· ·« • ♦ ♦ * · ··· • · · «·· 19 • · · · ·· ··

- 7397 (1994)) .

Vysoká afinita glykanu 9 pro L-selektin je velmi pravděpodobně generována mnohočetností vazebných sLex epitopů. Toto vede k možnosti, že se jedna molekula 9 může vázat ve Stamper-Woodruffově testu na několik uhlovodany rozpoznávajících domén (CRD) L-selektinu na povrchu lymfocytů. Zesilováni L-selektinových CRD na buněčném povrchu může probíhat bez ohledu na monomer-oligomerový status proteinu. I monomerní receptory. imobil i z ováné interakcí- s jinými povrchovými složkami, se mohou stát zesilovanými na buněčném povrchu s jednotlivými hemaglutininovými trimery v intaktních chřipkových virech pomocí bivalentních sialosidů (Glick, G.D. et al., J. Biol. Chem. 266: 23660 - 23669 (1991)).

Potenciální význam má také délka sacharidových řetězců navázaných na sLex. determinanty dohromady v glykanu 9. sLex epitopy v 9 jsou vázány dohromady řetězci skládajícími se z až pěti monosacharidových jednotek. Kromě toho, všechny tyto řetězce obsahují alespoň jednu GlcNAcfil-6Gal vazbu dodávající jim mimořádnou délku a flexibilitu. Je představitelné, že délka a flexibilita meziúseků sacharidového řetězce připojených na vazebné epitopy zvyšuje možnost vazby na mnoha místech 9, což vede k zesítění lektinových domén L-selektinu.

Významné zvýšení inhibiční účinnosti 9 bylo pozorováno, pokud bylo 5 μΜ primárního roztoku ředěno (obrázky 2 a 8). Toto naznačuje, že 5 μΜ množství tetravalentního ligandu se může vázat na molekuly L-selektinu zejména monovalentním způsobem, zatímco pravděpodobnost vícemístné vazby 9 se zvyšuje se ředěním ligandu. Pokud representuje skutečné nebo funkční oligomery (např.

•	··	* ·	* ·	99	9 9
• * ·		9	•	•	9	9	•	9
• 9	9	9	•	• · ·	9	•	9 9
								9
• 9	9	9	•	9 9		•	•	9
9 9 9	• ·		• 9	t 9	99		• 9

monomery, které jsou spojeny mezi sebou jinými složkami buněčného povrchu), pak se L-selektin zdá být méně dostupným pro PTCE vazbu ve stavu obsahujícím multivalentně navázané inhibitory, než univalentně navázané inhibitory. Existuje několik příkladů multivalentních sacharidových ligandů, které mají významně vysoké afinity pro vhodné lektiny navázané na membránu. Klasická práce Lee et al. (Lee, P.,T, et al., Biochemistry 23: 4255 - 4261 (1984); Lee, R.T. et al., Biochemistry 28: 8351 - 8358 (1989)) ukazuje, že oligomerní lektiny váží multivalentní sacharidy s významně vysokou afinitou.. Bylo ukázáno jinde, že tetravalentní oligosacharid obsahující čtyři distální Galal-3Gal zbytky účinně inhibuje adhesi myších spermií na vajíčko, zatímco analogický monovalentní pentasacharid Galal-3GalEl-4GlcNAcSl-3GalSl-4G1 cNAc nikoliv (Litscher, E. et al., Biochemistry 34: 4662- (1995)). Bylo také pozorováno, že oligovalentní sLex ligandy E-selektinu jsou lepší inhibitory adhese, než monovalentní sLex (DeFrees, S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 115: 7549 - 7550 (1993); Welpy, J.K. et al., Glycobiol. 4: 259 - 265 (1994)), ale předkládaná práce je první demonstrací zvýšené účinnosti multivalentních ligandů v inhibici adhese lymfocytů v modelovém systému závislém na L-selektinu.

Syntetický glykan 9 inhibuje L-selektinem zprostředkovanou adhesi ve Stamper-Woodruffově testu vazby předkládaných pokusů v zaznamenání hodně nízkých koncentracích. Data z pokusů in vivo injekce s krysami a kočkami také demonstrují hodnoty nízkých koncentrací sLex v inhibici krátkodobého P-selektinem zprostředkovaného zánětu (Mulligan, M.S. et al., J. Exp. Med. 178: 623 - 631 (1993); Mulligan, M.S. et al., Nátuře 364: 149 151 (1993); Buerke, M. et al., J. Clin. Invest. 93: 1140 - 1148 (1994)), I dlouhodobé (48 h) zánětlivé odpovědi mohou být

•	• 4	4·	4 4	4 4	4 4
* « 4	4	4	•	4	4 4	•	•
4 4	4	4	•	4 4 4	• 4	• 4
						4	4
4 4	4	4	4	4 4	4	•	4
444	44		4 4	4 ·	» ·	- -

inhibovány kontinuální infúsí anti-L-selektinové mAb zvířeti. Zajímavé je, že se u těchto zvířat nevyvíjely změny v diferenciálním počtu leukocytů periferní krve (Arbones, M.L. et al., Immunity 1: 247 - 260 (1994); Pizcueta and Luscinskas, Am. J. Pathol. 145: 461 - 469 (1994)).

Enzymatická syntesa oligosacharidů (glykan 9 a glykan 17) popsaná v příkladech 2 a 6, v příslušném pořadí, znamená nejčistší glykany, jak byly syntetizovány z výchozích monosacharidů. Kromě toho, glykan 9, tetravalentní, tetraantenový sLEx je nejlepším inhibitorem adhese lymfocytů na endotel v modelu, který je z hlavní části závislý na L-selektinu, což naznačuje, že L-selektin může účinkovat jako funkční oligomer na povrchu lymfocytů.

Rozsah dávek monovalentního sLex glykanů použitý v této studii byl 1000-krát nižší než je popisováno pro inhibici vazby mezi solubilním rekombinantním L-selektinem a imobilizovanými sLex glykolipidy (Foxall, C. et al., J. Cell. Biol. 117: 895 - 902 (1992)), Samozřejmě, data ze dvou studií nemohou být přímo srovnávána (Varki, A., Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 7390 - 7397 (1994)) . Zajímavé je, že data získaná v pokusech vazby provedených s lymfocyty a rejektovaným endotelem krysích srdcí (Turunen, J.P. et al., J. Exp. Med. 182(4): 1133 - 1141 (1995)) i se sacharidy 1, 4 a 9 byla dosti podobná datům, která jsou předkládána. Podobnost pravděpodobně odráží rozhodující interakce mezi sacharidy a L-selektinem na povrchu lymfocytů v obou sadách pokusů.

Data z pokusu injekce in vivo provedených na krysách a na kočkách také ukazují hodnoty nízkých koncentrací monovalentních ·

sLex v inhibici krátkodobého zánětu zprostředkovaného L-selektinem (Buerke, M. et al., J. Clin. Inv. 93: 1140 - 1148, (1994); (Mulligan, M.S. et al., J. Exp. Med. 178: 623 - 631 (1993); Mulligan, M.S. et al., Nátuře 364: 149 - 151 (1993)). I dlouhodobé (48 h) zánětlivé odpovědi mohou být inhibovány kontinuální infusí anti-L-selektinové mAb zvířatům. Zajímavé je, že ani tato zvřata, ani L-selěktin-knock-outované myši nevykazovaly alterace v diferenciálním počtu leukocytů periferní krve (Arbones, M.L. et al., Immunity 1: 247 - 260 (1994); Pizcueta and Luscinskas, Am. J. Pathol. 145: 461 - 469 (1994)).

Příklad 5

Léčba pacientů sLex

Pacient, u kterého byl diagnostikován zánětlivý stav, je léčen kompozicí obsahující, multivalentní sLex, například tetravalentní sLex 22-sacharid. Kompozice je ve farmaceuticky přijatelné přísadě v dávce dostatečné pro blokování vazby lymfocytů na odpovídající oligosacharidy na povrchu endotelovych buněk. . Kompozice je podávána v takovém režimu, že je dosažena sérová koncentrace v řádu nanomolů až mikromolů, dokud není stav dostatečně zmírněn.

Při podání pacientovi je kompozice formulována jakýmkoliv způsobem, který ji činí vhodnou pro orální, parenterální, nasální, enterální nebo rektální podání, s farmaceuticky přijatelnými přísadami nebo vehikuly, například izotonickým salinickým roztokem, v souladu s běžnou farmaceutickou praxí. Dávka Činidla bude dostatečná pro způsobení protizánětlivého účinku blokováním selektinem, a zejména L-selektinem zprostředkovaných dějů adhese u pacienta.

Kompozice a metody podle předkládaného vynálezu jsou vhodné pro léčbu jakýchkoliv stavů obsahujících adhesí na selektin, a zejména L-selektin, zprostředkované zvýšené zánětlivé reakce. Tak je činidlo užitečné pro léčbu takových stavů, jako je rejekce tkáně, artritida, infekce, zejména lokální infekce, dermatosy, zánětlivé střevní choroby, autoimunitní onemocnění, atd.

Účinnou hladinou kompozice podle předkládaného vynálezu je míněna hladina, při které je dosaženo určitého zmírnění obtíží u pacienta, kterému je taková léčba podávána. Abnormální zánětlivým stavem u pacienta je míněn stupeň zánětu, který přesahuje normu pro normální zdravotní stav subjektu, nebo *

přesahuje žádoucí hladinu. Sekundárním tkáňovým poškozením nebo toxickými účinky jsou míněny tkáňová poškození nebo.toxické účinky, které se vyskytnou v jinak.zdravých, tkáních, a jejich buňkách, z důvodů přítomnosti nadbytečných selektinem, a zejména L-selektinem, způsobených adhesních dějů, včetně dějů způsobených primárními stimuly kdekoliv v těle.

Při infusi kompozic podle předkládaného vynálezu pacientovi se předpokládá, že povede ke zmenšení schopnosti leukocytů exprivujících Selektin přilnout a tak se připojit na endotel, což brání nebo inhibuje adhesi takových buněk v místě zánětu a lokalizuje poškození endotelu, a tak brání nežádoucímu přesunu leukocytů nebo jejich toku do postižených tkání nebo buněk.

V souladu s tím jsou farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu podány v množství dostatečném pro antagonizaci (plnou nebo částečnou) přirozeného selektinu

C *7 .j / pacienta, a zejména L-selektinu, vazbou na biologické cíle takového selektinu u takového pacienta, a zejména na endotelové buňky. .

Množství a režimy pro podání uhlovodanů vážících selektin a kompozic podle předkládaného vynálezu může být snadno určeno odborníky v klinickém oboru léčby zánětlivých onemocnění, jako je artritida, tkáňové poškození nebo rejekce tkáně. Obecně, dávka kompozice podle předkládaného vynálezu se bude velmi lišit podle následujících.okolností: typu použitého syntetického uhlovodanu, věku, zdravotního stavu, léčeného onemocnění, typu současné léčby, pokud je nějaká, frekvence léčby a charakteru požadovaného účinku, rozsahu poškození tkáně, pohlaví, trvání příznaků, a kontraindikací, pokud jsou nějaké, a na jiných okolnostech, které budou upraveny ošetřujícím lékařem. Požadovaná dávka může být podána v jednom nebo ve více aplikacích pro získání požadovaného výsledku.

Příklad 6

Syntesa a charakterizace tetravalentního sLex glykanu majícího lineární polylaktosaminovou kostru (Nástin způsobu syntesy využitého v presentovaném příkladu je ukázán na obrázku 9 a tučně vytištěné číslice odpovídají strukturám glykanu na obrázku 9)

Materiál a metody

Syntesa oktasacharidového glykanu 12 □ O

Na hexasacharid LacNAcSl-3¹LacNAcSl-3¹LacNAc byly připojeny dvě Sl,6-vázané GlcNAc větve jeho inkubací s UDP-GlcNAc a centrálně účinkující Bl,6-GlcNAc transferasou, přítomnou v krysím séru (Gu et al., J. Biol. Chem., 267: 2994 - 2999 (1992)). Vzniklý glykan 12 byl přečištěn chromatografií a rozsáhle charakterizován degradačními pokusy, stejně jako ^XH-NMR a MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií.

^XH-NMR spektroskopie

Před NMR pokusy byly sacharidy dvakrát lyofilizovány z ²H20 a potom byly rozpuštěny v 600 ml ²H20 (99,996%, Cambridge Isotope Laboratories, Woburn, MA, USA). NMR pokusy byly provedeny na Varian Unity 500 spektrometru při 23 °C. Při snímání protonového spektra byla použita modifikace WEFT sekvence (Hard et al., Eur. J. Biochem., 209: 895 - 915 (1992)). ^XH chemické posuny byly vztaženy k acetonu, 2,225 ppm.

Hmotnostní spektrometrie s desorpcí matrice laserem/s průletovým analyzátorem

MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byla provedena způsobem pozitivní reflexe iontů za ozáření dusíkovým laserem (337 nm) a 2,5-dihydroxybenzoovou kyselinou jako matricí s Finnigan Vision 2000 průletovým analyzátorem (Thermo BioAnalysis, Ltd., Hemel Hempstead, UK) pracujícím při 5 kv urychlovacím napětí a se 4 kv po urychlení na detektoru. Byla použita zevní kalibrace. Hmotnostní stanovení jsou uvedena jako průměrné hmotnostní hodnoty, pokud není uvedeno jinak.

c n

Transferasové reakce

Reakce s prasečí žaludeční fil,6-GlcNAc transferasou (Piller et al., J. Biol. Chem. 259: 13385 - 13390 (1984)), lidskou mléčnou El,4-galaktosyltransferasou (Brew et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 59: 491 - 497, (1968)), lidskou sérovou El,3-GlcNAc transferasou (Yates and Watkins, Carbohydr. Res., 120: 251 - 268 (1983)), lidskou placentami a2,3-sialyltransferasou (Nemansky and van den Eijnden, Glycoconjugate J. 10: 99 - 108 (1993)) a lidskou mléčnou al., 3-fukosyltransferasou (Eppenberger-Castori et al., . ..

Glycoconjugate J. 6: 101 - 114, (1989); Natunen et al.,

Glycobiology, 4: 577 - 83 (1994)) byly provedeny v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve (Maaheimo et al., Eur. J. Biochem., 234: 616 - 625 (1995)).

Chromátografické metody

Gelová vylučovací chromátografie na Superdex 75 HR (Pharmacia, Sweden) byla provedena na dvou následných kolonách (10 x 300 mm) promývaných rychlostí 0,5 ml/min vodou (neutrální sacharidy) nebo 0,05 M NH₄HC0₃ (sacharidy obsahující kyselinu sialovou). Výtok byl monitorován při 214 nm a oligosacharidy byly kvantifikovány . proti externím GlcNAc a Neu5Ac.

Pro aniontovou výměnnou chromatografií byla MonoQ (5/5) kolona (Pharmacia) vyplachována rychlostí 1 ml/minutu, nejprve izokraticky vodou po dobu 4 minut a potom lineárním gradientem 0 až 0,05 M NaCl po dobu více než 8 minut a nakonec lineárním gradientem 0,05 až 0,5 M NaCl po dobu více než 8 minut.

Aniontová výměnná chromatografie s vysokým pH s pulsní amperimetrickou detekcí (HPAEC-PAD) byla provedena na (4 x 250 mm) Dionex CarboPac PA-1 koloně při průtoku 1 ml/minutu, nejprve izokraticky 100 mM octanem sodným ve 100 mM NaOH po dobu 5 minut a potom lineárním gradientem 100 až 200 mM octanu sodného ve 100 mM NaOH po dobu více než 55 minut. Získané frakce byly neutralizovány 0,4 M vodnou kyselinou octovou a odsoleny za použití gelové vylučovací chromatografie na Superdex HR 75.

Trávení exoglykosidasami

Pro štěpení šialydasou A.ureafaciens (Boehringer Mannheim, Germany) byla vzorky sacharidů inkubovány přes noc s 80 mU enzymu ve 40 μΐ 100 mM octanu sodného, pH 5,0. Inkubace s β-galaktosidasou ze semen jack beán byla provedena jak bylo popsáno dříve (Renkonen et al., Glycoconjugate J., 6: 129 - 140 (1989)). V paralelních β-galaktosidasové reakcích byl disacharid (³H)Galbl-4GlCNAc zcela degradován za uvolnění (³H)Gal.

Enzymatická syntesa tetravalentního sLex glykanu majícího lineární polylaktosaminovou kostru (glykan 17)

Syntesa o pěti krocích byla započata od oktamerního polylaktosaminu LacNAcBl-3'(GlcNAcBl-6')LacNAcEl-3'(GlcNAc fil-6')LacNAc (12).

Oktasacharid 12 (150 nmol) byl nejprve prodloužen v βΐ-3-GlcNAc transferasové reakci. Nonasacharid 13 a nějaký nezreagovaný 12 byly izolovány jako směs pomocí Superdex 75 HR chromatografie a byly podrobeny reakci katalyzované Bl,6-GlcNAc transferasou z prasečí žaludeční sliznice. Vzniklý oligosacharid měl pět složek v hmotnostní spektrometrii s desorpcí laserem/ionizačním průletovým analyzátorem (MALDI-TOF), od GlcNAc Gal (48%) a GlcNAc Gal (23%) do GlcNAc Gal (2,6%).

6 3 4 2

Komplexní směs byla generována S-galaktosidasovou a β-N-acetyl-glukosaminidasovou aktivitou o které je známo, že je přítomna v surovém El,6-GlcNAc transferasovém extraktu z prasečí žaludeční sliznice (Helin et al, FEBS Lett., 335: 280 - 284 (1993)) . Superdex 75 HR chromatografie směsi produktu dávala dva dobře separované píky (naní ukázáno). Podle MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie měl hlavní pík, eluující v 60,94 minutě, dvě hlavní složky: (M + Na)* m/z 1949,5 (65%) representující GlcNAc₇Gal₃ (kalk. m/z 1949,8) a (M + Na)* m/z 1746,7 (30%) representující GlcNAc Gal (kalk. m/z 1746,6). Nejvíce zastoupený iont v molekulárním iontovém regionu hmotnostního spektra vedlejšího píku v 62,94 minutě měl (M + Na)* m/z 1380,5 (monoizotopický), což naznačuje, že obsahoval zejména (70%) GlcNAc_sGal₂ (kalk. monoizotopičky m/z 1380,5). Málo zastoupené píky monoizotopických m/z 1177,4, 1542,5 a 1746,0 mohly být přiřazeny k GlcNAc^Gal^, GlcNAc_sGal₃ a GlcNAc₆Gal₃, v příslušném pořadí (kalk. monoizotopické hodnoty m/z 1177,4, 1542,6 a 1745,6). Na Superdex HR 75 byla separace mezi glykanem 14 a GlcNAc_sGal₃, postrádajícím dva GlcNAc zbytky, okolo dvou minut.

El,4-galaktosyltransíerasová reakce přeměnila 14 na 15, rozvětvenou skupinu sedmi LacNAc jednotek. Superdex 75 HR chromatografie ukázala dobře vytvarovaný oligosacharidový pík, objevující se o 2,2 minuty dříve než akceptor 5 (není ukázáno). Na Biogel P-4 kolonách také zpomalovaly čtyři další galaktosové zbytky migraci oligosacharidů stejně jako dva další GlcNAc zbytky (Yamashita et al., Methods Enzymol., 83: 105 - 126 (1982)). MALDI-TOF hmotnostní spektrum galaktosylovaného oligosacharidů ukázalo signály při m/z 2598,1, určené jako (M + Na)*

GlcNAc^Gal^, glykan 15, (kalk. m/z 2598,4) (65%) a m/z 2233,0, určené jako (M + Na) ⁺ GlcNAc_eGal_e, (kalk. m/z 2233,0) (35%).

a2,3-sialyltransferasova reakce přeměnila 15 na 16; koncentrát byl izolován za použití gelové vylučovací chromatografie na Superdex 75 HR (není ukázáno). Pro další přečištění byl koncentrát podroben aniontové výměnné chromatografií na MonoQ-koloně (obrázek 10A). Glykan 16 se v tomto pokusu choval podobně jako izomerní tetrasialo glykan 9, popsaný v příkladu 2. Po.odsolení na Superdex 75. HR bylo získáno 45 nmol přečištěného glykanu 16. ¹H-NMR spektrum glykanu 16 (obrázek 11A a tabulka 5) potvrdily jeho strukturu.

Malý vzorek glykanu 16 byl podroben HPAE-PAD chromatografií na Dionex koloně CarboPac PA-1, Objevil se ve 43 minutě (není ukázáno), v pozici ekvivalentní pozici izomerní tetrasialo sloučeniny 8 popsané v příkladu 2.

al, 3-fukosyltransferasová reakce přeěmnila glykan 16 (38 nmol) na tetravalentní sLex sacharid 17. Předběžné přečištění 17 bylo provedeno chromatografií na Superdex 75 HR. Následující HPAE chromatografie na CarboPac PA-1 koloně dávála 8 jako dobře utvořený pík objevující se v 8 minutě (obrázek 10B). Přítomnost čtyř fukosylových zbytků dramaticky redukovala afinitu glykanu ke CarboPac PA-1, ve srovnání s glykanem 16. O tomto jevu je ’* známo, že je charakteristický pro fukosylované sacharidy (Hardy,

M.R. and Townsend, R.R., Carbohydr. Res. 188: 1-7 (1989)).

* Paralelní pokusy s tetravalentním glykanem 9 (viz tabulku 2) ukázaly, že 1 nmol vzorků glykanu 9 a 17 chromatografovály společně na CarboPac PA-1 v 9 minutách;trifukosylovaný analog glykanu 9 (glykan 10 popsaný v příkladu 2) se objevil v těchto pokusech o mnoho později, v 16 minutě. Odsolení na Superdex 75 HR koloně dalo zisk 24 nmol glykanu 17.

··

4 · · ♦ ·♦ * · • 4 ·« ·♦ · • *

Tabulka 5 ^XH-NMR chemické posuny strukturálních reportérových skupin glykanu 16 a 17 při 23 °C.

Glykan

Zbytek	n: oa	Proton 16	17
GlcNAc	I (a)	H-l	5.214	5.214
GlcNAc	Κβ)	H-l	4.725	4.713
Gal	2,5,11	H-l	4.458	4.452
		H-4	4.143	4.133
'GlcNAcb)	3	H-I	4.691	4.684/4.687
GlcNAcb)	4	H-l	4.606/4.612	4.603
GlcNAc	8,14	H-l	4.691	4.696
GlcNAc	9,15	H-l	4.620	4.603
Gal	6,12,18	H-l	4.544	4.517
Gal	17	H-l	4.558	4.533
	6,12,17,18	H-3	4.119	4.089
Fuc	7,13,20	H-l		5.076
		H-5		4.820
		H-6		1.166
Fuc	19	H-l		5.119
		H-5		4.820
		H-6	-	1.166
Neu5Ac	10,16,21,22	H-3ax	1.803	1.798
		H-3eq	2.756	2.762

Číslování zbytků je následující: _e Neu5Aca2^z3^¹^^I/j^GIcNAc^^! „ ΝώΛΜ'³“’¹·^^^Ac‘\ ‘ iOalUMClcNAcd

Feeei' jGalpMGJcNAeřr

NWSAC^’¹!⁰“*⁰’¹⁷ »1 Fucar ^GŮpl-íGlcNAc ^to> Dvě uvedené hodnoty chemického posunu vycházejí, ze signálů representujících a- a β-pyranosické formy glykanu.

Strukturální charakterizace glykanu

ÍC

V

4	··	i*	toto	• to			··
• to ·	to	•	•	•	•	•	•		•
• to	•	to	to	• toto	•	•		*·
						•		to
toto to	to ·	to	• to	«·			4 ·

^XH-NMR spektrum glykanu 17 (obrázek 11B a tabulka 5) potvrdilo strukturu. Vedle redukujícího konce GlcNAc jsou viditelné H-l signály tří El,3-vázaných GlcNAc zbytků při 4,684 - 4,696 ppm a jsou spojeny s H-l signály tří El,6-vázaných GlcNAc jednotek při 4,603 ppm. Šest GlcNAc zbytků se váže na tři galaktosy, které jeví H-4 rezonanci při 4,133 ppm, charakteristický chemický posun pro H-4 galaktosy, která je disubstituována GlcNAc jednotkami v pozicích 3 a 6 (Koenderman et al., Eur. J. Biochem., 166: 199

208 (1987)). H-l region galaktosy ukazuje signály tří rozvětvujících se galaktos při 4,452 ppm, které náleží sialyzovaným galaktosám tří El,6-vázaných sLex determinant při 4,517 ppm a El,3-vázaným sLex při 4,533 ppm. H-3 signály těchto galaktos jsou charakteristicky (Kamerling and Vliegenthart, Biological Magnetic Resonance, Berliner and Reuben, vydavatelé, svazek 10, Plenům Press, New York and London (1992), str. 1 •a

287)) při 4,089 ppm. Horizontální a vertikální H-3.rezonance NeuSAc při 2,762 a 1,798 ppm, v příslušném pořadí, potvrzují přítomnost čtyř ekvivalentů «2,3-vázaných NeuSAc (Kamerling and Vliegenthart, Biological Magnetic Resonance, Berliner and Reuben, vydavatelé, svazek 10, Plenům Press, New York and London (1992), str. 1 - 287)). Signály methylových protonů při 2,04 ppm odpovídají přítomnosti 11 N-acetylových skupin. H-l fúkosového zbytku v Bl,3-vázané sLex determinantě rezonuje při 5,119 ppm, zatímco H-l tří El,6-vázaných sLex jednotek rezonuje při 5,076 ppm. H-5 a H-6 signály fukos rezonovaly charakteristicky (de Vries et al., FEBS Lett., 330: 243 - 248 (1993); Vliegenthart et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 41: 209 - 374 (1983)) při 4,820 a 1,166, v příslušném pořadí. Integrály H-l a H-6 protonů ukázaly přítomnost čtyř fukos.

r r

QQ

Přítomnost čtyř fukosových zbytků v glykanu 17 byla potvrzena degradačními pokusy a následující MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií. Vzorek glykanu 17 (2 nmol) byl ošetřen sialidasou z Arthrobacterium ureafaciens. Odsolená reakční směs byla podrobena MonoQ chromatografií, která ukázala, že byl tvořen 1 nmol neutrálního asialo-oligosacharidu 18. V MALDI-TOF hmotnostním spektru glykanu 18 byl hlavní (M+Na)^ pík representující 80% polylaktosaminových signálů, pozorován při m/z 3182,8 (počítáno pro Fuc^Gal^GlcNAc^, 3182,9). Dvě menší složky, viditelné ve spektru,se chovaly jako Fuc^Gal^GlcNAc^ (12%) a FuC₃Gal_eGlcNAc_e (8%). Menší signály mohou představovat degradační produkty vytvořené během desialyzace nebo hmotnostní spektrometrie, protože opakovaná HPAE-PAD chromatografie intaktního 8 na CarboPac PA-1 selhala při odhalení jakéhokoliv množství materiálu eluujícího v 16 minutě, okolo očekávané pozice NeuBAc Fuc Gal GlcNAc .

3 7 7

Glykan 18 odolával ošetření β-galaktosidasou ze semen jack beán. Nezměněné MALDI-TOF hmotnostní spektrum mělo Fuc^Gal^GlcNAc^ (M+Na)* signál (kalk. m/z 3182,9) jako hlavní složku, měřenou při m/z 3182,8 před a při m/z 3183,2 po ošetření. Resistence na β-galaktosidasu je charakteristická pro koncové' Galb-1(Fucal-3)GlcNAc sekvence (Kobata, Anal. Biochem., 100: 1-14 (1979)). Proto, všechny fukosové zbytky glykanu 17 byly navázány na distálně umístěné, sialyzované N-acetyllaktosaminové jednotky. Data potvrdila a rozšířila dřívější zjištění ukazující, že «1,3-fukosyltransferasy z lidského mléka nereagují s LacNAc zbytky, které mají větvení v 6'-pozici (Niemela, R. et al., Glycoconjugate J., 12: 36 - 44 (1995); Maaheimo H. et al., Eur. J. Biochem., 234: 616 - 625 (1995); Seppo, A. et al., Glycobiology, 6: 65 - 71 (1996)).

4	»4	'4 4		44	4 4
♦ · ·	4	4	4	4	4 4
4 4	4	4	4	444 .	4 4
? *		* *		• *
44 4	4 4	4 4		4 4	4 4

Příklad 7

Tetravalentní sLex glykany, odvozené od lineární nebo od rozvětvené polylaktosaminové kostry, jako inhibitory adhese lymfocytů na endotel závislé na L-selektinu

Transplantace a testy adhese lymfocytů

Deset až dvanáct týdnů staré krysy inbredních WF (RT1^V) a DA (RTl^a) kmenů byly použity pro transplantace a testy adhese . lymfocytů jak byly popsány v příkladu 1. Test vazby se skládal ze tří pokusů provedených ve třech různých dnech. Každý pokus obsahoval inkubaci lymfocytů se šesti jednotlivými řezy rejektovaného srdce za přítomnosti sacharidů v daných koncentracích.

Inhibice adhese lymfocytů zprostředkované L-selektinem

V paralelních pokusech byla srovnávána kapacita tetravalentních sLex glykanu 9 a 17 a nefukosylovaných analogů glykanu 8 a 16 v inhibici adhese lymfocytů závislé na L-selektinu na srdeční endotel během akutní rejekce. Lymfocyty byly předem inkubovány po dobu 30 minut s různými koncentracemi oligosacharidu a byly potom použity ve Stamper-Woodruffově testu vazby v inkubačním mediu jak je popsáno v příkladu 1.

Dva sLex nesoucí glykany 9 a 17 byly účinné v inhibici adhese lymfocytů na aktivovaný srdeční epitel, kdy IC_so hodnoty byly okolo 1 nM pro oba sLex glykany (obrázek 12) . Rozhodující kontrolní sacharidy 8 a 16, mající stejný náboj, stejnou celkovou strukturu a přibližně stejnou velikost, ale zbavené fukos,

4 4 4

4 4

4 44«

4« 4 «4 • 4 44

4 · ·

4 44

4 4 4 >4 44 • ♦ · · · 4

4« »44 »44 ··

c. o v v neměnily vazbu lymfocytů vzhledem k základní hodnotě. Tato data naznačují, že jak rozvětvené, tak lineární tetravalentní sLex glykany jsou mimořádně účinné v inhibici adhese lymfocytů na endotel závislé na L-selektinu tak redukují zánět asociovaný s rejekcí.

Biologické vlastnosti glykanu 17 s lineární kostrou se podobaly vlastnostem izomerního glykanu 9 s rozvětvenou kostrou. Oba tyto glykany byly velmi silnými antagonisty L-selektinu ve Stamper-Woodruffo.vě pokusu adhese: Glykan 17 jevil silný inhibiční efekt pod 0,5 nM a glykan 9 byl stejně silný antagonista L-selektinu (viz obrázek 12). Zaznamenání hodné je, že oba 17 a 9 vykazovaly vysokoafinitní vazbu na L-selektin. Toto je analogické s daty (Crottet et alGlycobiology 6: 191 - 208 (1996)), která ukazují, že podsady mucinů různého původu jsou vysoce afinitní ligandy selektinů. Samozřejmě, ani jedinečné kostrové skupiny, ani striktně definované vazebné determinanty nejsou nutné pro vysoce afinitní rozpoznávání L-selektinu. Spíše jsou významná seskupení sLex/sLea příbuzných determinant, které jsou správně přítomné na kostrách polylaktosaminového nebo polypeptidového charakteru. V předkládaných příkladech byly aktivity glykanů 17 a 9 zcela závislé na přítomnosti intaktních sLex sekvencí ve vazebných determinantách; přítomnost al,3-vázaných fúkosových zbytků nebyla pro rozpoznávání nutná.

Zde popsané nízké nanomolární koncentrace sLex glykanů jsou o několik řádů nižší než inhibiční koncentrace monovalentních sLex. Jiné běžné vysoce afinitní inhibitory L-selektinu zahrnují muciny endotelového a jiného původu (Baumhueter, S., et al., Science 262: 436 - 438, (1993); Berg, E.L. et al., Nátuře 366: 695 - 698 (1993); Crottet, P. et al., Glycobiology 6: 191 - 208 (1996);

69	• 0 · • 4 · · 0 0 0	*· 44 • 4 0 * * ··«	4» · » 0 0 0 • 4 44
	#4· 4 0	4· ’00’	4 · ’ «*

Hemmerich, S. et al., Biochemistry 33: 4820 - 4829 (1994); Hemmerich, S. et al., J. Biol. Chem., 270: 12035 - 12047 (1995); hemmerich, S. and Rosen, S.D., Biochemistry 33: 4830 - 4835 (1994); Imai, Y. and Rosen, S.D. Glycoconjugate J. 10: 34 - 39 (1993); Imai, Y. et al., J. Cell. Biol. 113: 1213 - 1222 (1991); Lásky, L.A. et al., Cell 69: 927 - 938 (1992)). Zajímavé je, že 0-vázané oligosacharidy uvolňované z těchto mucinů bazickým borohydridem nevykazovaly jakoukoliv detekovatelnou vazbu na L-selektin v pokusech afinitní chromatografie ( Crottet, P. et al., Glycobiology 6: 191 - 208 (1996)). Data předkládaného vynálezu ukazují, nicméně, že oligosacharidy správné struktury mohou být rozpoznávány L-selektinem s vysokou afinitou.

Vysoká biologická aktivita glykanů 17 a 9, při srovnání s monovalentním sLex, je způsobena jejich multivalencí.

Multivalentní sLex glykany zkříženě váží dvě nebo několik molekul L-selektinu, o kterých je známo, že jsou seskupeny na vrcholech mikroklků lymfocytů (Hasslen, S.R. et al., Histochem. J. 27: 547 - 554 (1995); von Andrian et al., Cell 82: 989 - 999 (1995)). Segmentální flexibilita L-selektinu je nápomocna v presentaci domén rozpoznávajících uhlovodan (Rosen, S.D. and Bertozzi, C.R. Cur. Opin. Cell. Biol., 6: 663 - 673 (1994)), což umožňuje tvorbu zkřížených vazeb přes sousedství jednotlivých sLex determinant v dané molekule ligandu. Proximální konce dvou sLex determinant 9, například, jsou od sebe vzdáleny nejčastěji pouze 2 nm, i v maximálně roztažené konformaci polylaktosaminové kostry (Renouf, D.V. and Hounsell, E.F. Int. J. Biol. Macromol. 15: 37 - 42 (1993)). Nicméně, vysoce afinitní vazba na buněčné povrchy byla pozorována se solubilním monomerním P-selektinem (Ushiyama, S. et al., J.Biol. Chem., 268: 15229 - 15237 (1993)) a E-selektinem (Hensley, P. et al., J. Biol. Chem. 269: 23949 - 23958 (1994)),

Φ· »♦ • « » · • · · * • ·* · t ·« ·· • ·♦ ·· ·· φ · · · · φ · f · φφφ φΦΦ ΦΦ ·* Φ· což ukazuje, že multivalentní sLex glykany získávají svou vysokou afinitu vazbou na dvě různá místa v L-selektinovém monomeru. Kromě toho, nová data (Málhotra, R. et al., Biochem. J. 314: 297 - 303 (1996)) naznačují, že interakce L-selektinu a jeho endotelových ligandů vyžaduje obsazení jak sLex rozpoznávajícího místa (CRS), tak odlišného sousedního vazebného místa rozpoznávajícího acidické determinaty (ARS). Toto uspořádání bude podobné ke dráze obsahující tyrosin sulfátové zbytky bezprostředně sousedící se sialyzovanými oligosacharidy, která generuje rozpoznávání P-selektinu v PSGL-1 (Sako, D. et al., Cell 83: 323 - 331 (1995); Wilkins, P.P. et al., J. Biol. Chem. 270: 22677 - 22680 (1995)). Proto, tetravalentní sLex glykany 17 a 9 se váží na monomerní L-selektin dvěma způsoby, specifickou vazbou mezi jednou sLex determinantou a CRS, a méně specifickou vazbou mezi kyselinou sialovou a jiným sLex zbytkem v ligandu a ARS L-selektinu. Toto umožňuje, aby i částečně fukosylované deriváty terasialoglykanu 16, například, byly dobrými inhibitory adhese. Bez ohledu na způsob vazby jsou sacharidový antagonisté L-selektinu, doložené příklady glykanu 17 a 9, jsou silnými protizánětlivými léčivy, protože jsou mnohem méně antigenní, než muciny nebo neoglykoproteinové ligandy selektinů (Welply, J.K. et al., Glycobiology, 4: 259 - 265 (1994)).

Kromě procesů zprostředkovaných L-selektinem inhibují glykany 17 a 9 adhesní fenomen zprostředkovaný jinými selektiny. Například, data Nelsona a kol. (Nelson, R.M. et al., Blood 82: 3253 - 3258 (1993)) ukazují, že adhese závislá na E-selektinu může být i účiněji inhibována sLex sacharidy, než procesy zprostředkované L-selektinem.

• ·* ·· 4* 44 4f >4 4 · 444 · 4 4 4 · 4 4 4 4·· 4 4 44

4 4 f4 44 44 444 4 4 ··«'·*' '»· ’··' 4« 44

Příklad 8

Syntesa a chárakterisace oligosacharidových alditolů (Tučně vytištěné číslice odpovídají strukturám glykanů na obrázku 13)

Materiál a metody

Enzymy

Prasečí žaludeční fil,6-N-acetylglukosaminyltransferasa (EC

2.4.1.148), hovězí mléčná βΐ,4-galaktosyltransferasa (EC 2.4.1.90), lidská sérová β1,3 N-acetylglukosaminyl-transferasa (EC 2.4.1.149), lidská placentám! a2,3-sialyltransferasa a lidská mléčná al,3/4-fukosyltransferasa.

Sacharidy a monosacharidové nukleotidy

GalEl-3GalNAc, UDP-GlcNAc, UDP-Gal, CMP-NeuAc a GDP-Fuc byly získány od Sigma, St. Louis, MO, USA.

NeuAca2-3Galfil-4(Fucal-3)GlcNAc (sialyl Le^) a

NeuAca2-3Galfil-4(Fucal-3)GlcNAcfil-3(NeuAca2-3Galfil-4(Fucal-3) GlcNAcfil-6)GalBl-4GlcNAc 4 byly syntetizovány in vitro jak je popsáno v příkladu 2.

Transferasové reakce

Reakce s prasečí žaludeční fil,6

N-acetylglukosaminyltransferasou (EC 2,4.1.148) (Seppo, A. et

·* ·	• ·	•	«	• ·
• · ♦	« ·	*« *	* ·	• ·
« ·	• ·	• ·		• ·
• · · « ·	• v	« ·	• ·	• 0

al., Biochem. Cell. Biol. 68: 44 - 53 (1990)), hovězí mléčnou £1,4-galaktosyltransferasou (EC 2.4.1.90) (Sigma) (Brew, K. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 59: 491 - 497 (1968)) a lidskou sérovou £1,3 N-acetylglukosaminyl-transferasou (EC 2.4.1.149) (Seppo, A. et al., Biochem. Cell. Biol. 68: 44 - 53 (1990)), byly provedeny v podstatě tak, jak je uvedeno v citovaných odkazech.

Použité lidské placentární mikrosomy, obsahující

0f2,3-sialyltransferasovou aktivitu, byly připraveny jak je popsáno v příkladu 2. Transferasové reakce byly provedeny v 50 μΐ pufru, inkubací 100 nmol sacharidu (odpovídajících 200 nmol akceptorových míst) se 2 μπιοί CMP-NeuAc a 25 μΐ lidských placentárních mikrosomů při 37 °C po dobu 17 hodin. Reakce byla ukončena zahřátím v lázni s vroucí vodou po dobu 5 minut. Srážející se protein byl odstraněn a kombinovaný supernatant a výplachy byly lyofilizovány.

al,3/4-fukosyltransferasa (8 mU/ml celkové fukosyltransferasy; 0,79 mg/ml proteinu) byla extrahována z lidského mléka jak je popsáno v příladu 2 a transferasová reakce byla provedena jak je popsáno.(Palcic, M.M. et al., Carbohydr. Res. 190: 1-11 (1989)).

Redukce tetrasacharidu Gal£l-4GlcNAc£l-6(Gal£l-3)GalNAc (22) byla provedena s NaBh^ v podstatě jak je popsáno (Rašilo and Renkonen, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 363: 89 - 93 (1982)). Úplnost reakce byla kontrolována podrobením sacharidu bez boritanu ^XH-NMR. .

» ·

Chromatografické metody

Gelová vylučovací chromátografie na koloně Bio-Gel P-2 (Bio-Rad. Richmond, CA, USA) (1 x 144 cm) nebo na Bio-Gel P-4 (1 x 145 cm) byla provedena s 0,02% vodným NaN₃.

Gelová vylučovací chromatografie na Superdex 75 HR (10 x 300 mm) Pharmacia, Sweden) byla provedena vodou (neutrální sacharidy) nebo 0,05 M NH₄HCO₃ (sacharidy obsahující kyselinu sialovou). Výtok, byl monitorován při 205 nebo 214 nm a oligosacharidy byly kvantifikovaný proti externím GIcNAc a NeuAc.

Aniontová výměnná chromatografie s vysokým pH s pulsní amperimetrickou detekcí (HPAEC-PAD) byla provedena na (4 x 250 mm) Dionex CarboPac PA-1 koloně při průtoku 1 ml/minutu. Neutrální sacharidy byly chromatografovány jak bylo dříve popsáno (Maaheimo, H. et al., FEBS Lett. 349: 55 - 59 (1994)). Sialyzované sacharidy byly eluovány lineárním gradientem NaAc od 100 mM NaOH, 25 mM NaAc v minutě 0 do konečného složení 100 mM NaOH, 100 mM NaAc v minutě 20. Odebrané frakce byly neutralizovány 0,4 M kyselinou octovou a odsoleny Superdex chromatografií.

Aniontová výměnná chromatografie na MonoQ (5/5) koloně (Pharmacia) byla provedena následujícím způsobem: kolona byla eluována izokraticky 1 ml/minutu vodou po dobu 4 minut, potom lineárním gradientem NaCl do koncentrace 0,05 M ve 12 minutě a potom lineárním gradientem NaCl do konečné koncentrace 0,5 M ve 20 minutách. Výtok byl monitorován při 214 nm.

¹H-NMR spektroskopie

Před NMR pokusy byly sacharidy dvakrát lyofilizovány z ²H20 a potom byly rozpuštěny v 600 μΐ ³Ha0 (99,996 atom %, Cambridge Isotope Laboratories, Woburn, MA, USA). NMR pokusy byly provedeny na Varian Unity 500 spektrometru při 300 °K. Při snímání ID protonového spektra byla použita modifikace WEFT sekvence (Hard et al., Eur. J. Biochem., 209: 895 - 915 (1992)). Překrývající se rezonance byly stanoveny pomocí DQFCOSY (Marion and Whthrich, Biochem. Biophys. Res. Commun. 117: 967 - 974 (1985)) a TOCSY

- (Bax and Davis, J. Mag. Reson. 65: 355 - 360 (1985)). Pro tyto pokusy byla typicky odebrána matrice o 4k x 512 bodech a 90° posun sine-bell hmotnostní funkce byl použit v obou dimenzích před Fourierovou transformací. Mezi snímáním byl použit relaxační odklad 1 sekunda a, v TOSCY, byly použity spin-lock časy mezi 80 a 300 ms (MLEV-17). ¹H chemické posuny byly vztaženy k internímu acetonu, 2,225 ppm.

Syntesa oligosacharidu alditolu

Hexasacharid alditol GlcNAcEl-3(GlcNAcSl-6)GalEl-4GlcNAcfil-6 (Galfil-3)GalNAc-ol 24 byl syntetizován jak bylo popsáno dříve (Maaheimo, H. et al., FEBS Lett. 349: 55 - 59 (1994)).

Oktasacharid alditol 25

Hexasacharid alditol 24 byl galaktosylován inkubací s lidskou mléčnou Sl-4 galaktosyltransferasou a 4-násobným molárním nadbytkem UDP-Gal. Oktasacharidový alditolový produkt GalEl-4 G1cNAcEl-3(GalEl-4GlcNAc£l- 6)GalEl-4G1cNAcEl-6(GalBl-3)GalNAc-ol 25 byl přečištěn HPAEC (obrázek 14A). Z několika reakcí bylo

4*4 · 4 4 « · * 4 4 4 ♦ 4 4 444 * * 4 ě 4 4 44 444* • « · 4 ·. · · t • 44 44 ·· »· ·♦ ·· získáno 400 nmol 25. Při srovnání ^XH-NMR spektra 24 ukazoval anomerní region spektra 25 dva nové jednoprotonové dublety při 4,480 a 4,465 ppm (obrázek 15A) . Na základě našich předešlých stanovení částečně galaktosýlováného 24 (Maaheimo, H. et al., FEBS Lett. 349: 55 - 59 (1994)) mohou být tyto stanoveny jako zbytky 7 a 8, v příslušném pořadí (viz obrázek 13 pro systém označení). H-3 a H-4 rezonance distálních GlcNAc zbytků 5 a 6 také vykazují dramatický posun dolů (tabulka 6), který je charakteristický pro £1,4 galaktosylaci (Whitfield, D.M. et al., Can. J. Chem. 68: 942 - 952 (1990)). Zajímavé je, že H-l a H-2 GlcNAc zbytku 3 vykazovaly mírný posun nahoru po galaktosylaci distálních GlcNAc zbytků.

Disialodekasacharid alditol 26

Pro syntesu disialodekasacharidu alditolu 26 byly čtyři vsádky 25 po 100 nmol inkubovány při 37 °C po dobu 17 hodin se 2μτηο1 CMP-NeuAc a 25 μΐ lidských placentárních mikrosomů obsahujících oí2,3 sialyltransferasovou aktivitu. Reakční směs byla potom frakcionována iontovou výměnnou chromatografií na MonoQ 5/5 koloně (obrázek 14B) a produkt eluující jako disialyloligosacharid (26) byl odsolen Superdex 75 chromatografií. NMR spektrum tohoto materiálu (obrázek 15B) ukázalo signály horizontálního a vertikálního H-3 NeuAc při 2,756 a 1,800 ppm, v příslušném pořadí, kdy oblast obou signálů odpovídá dvěma protonům. Tyto chemické posuny.jsou charakteristické pro a2,3 vázané NeuAc (Kamerling and Vliegenthart, Biological Magnetic Resesonance, Berliner nad Reuben, vydavatelé, svazek 10, Plenům Press, New York and London (1992), str. 1 - 287), zatímco žádné signály nebyly detekovány při 2,71 nebo 1,74 ppm, což ukazuje, že žádné detekovatelné množství «2,6 vázaných NeuAc nebylo přítomno ve vzorku. Také značný posun H-3 rezonancí galaktos 7 a 8 dolů (tabulka 6) potvrzuje, že NeuAc zbytky jsou «2,3 vázané na distální galaktosy (Ichikawa, Y. et al., J. AM. Chem. Soc. 114: 9283 - 9298 (1992)). Jelikož rezonance galaktosy 2 nebyla vůbec změněna, nebyla fil,3 vázaná galaktosa jádra sialyzována (Oehrlein, R. et al., Carbohydr. Res. 244: 149 - 159 (1993)). Tak, podle NMR-dat je struktura tohoto materiálu NeuAc«2-3GalEl-4GlcNAc£l-3(NeuAca2-3 GalEl-4GlcNAcSl-6)Galfil-4 GlcNAcBl-6(GalEl-3)GalNAc-ol 26. Ze čtyř reakcí bylo získáno 357 nmol 26.

-V

Tabulka 6 - ^H-chemické posuny sacharidů 19-28 při 300 K

Zbytek proton

Sacharid

	19	20	21	22	23	24	25	26	27	20
1	H1	5216(0) /4.693(8)	5.197(0)/4.664(61	6.196(0)/4.664(6)	3.79S	3.793	3.794	3792	1793	ad.1	1794
	ΗΓ	•		•	3.735	1732	1732	3.732	1733	ad.	1735
	K2	4277(α)/1989(Β)	4286(0)/1972(6)	4287(0^/1974(6)	4392	4393	4393	4293	4.393	4.392	4.392
	H3	4.032( β)/1861(β)	4.020(0)/1850(6)	4.020(α)/3.650(6)	4.062	4.062	4.062	4.062	4.062	ad	4.063
	H4	4.248(0)/4.101(0)	4214(0)/4.146(6)	4215(0)/4.147(6)	3.467	3.465	3.461	3.462	3.463	1462	1464
	H5	4.140(^/1712(6)	4228(0)/1799(6)	4233(0)/1768(6)	4281	4280	4284	4284	4284	4204	4281
	H6	3.730(0) /3.79(0)	4.011(0)/3.82(6)	4.011(0)/182(6)	3933	3.930	3.933	3931	1831	ad	1926
		176( ň	3.774( o)/171(6)	3.780(0)/375(0)	1683	3.687	1687	3683	3.683	ad	1682
2	H1	4.493/4,437	4.489/4.431	4.408/4.431	4.466	4.468	4.466	4.485	4.463	4.463	4.403
	K	1624	1520	1523/1522	3361	1562	3.562	3563	1565	ad	3567
	KS	1621	3.625/1614	3.621/1614	3.667	3.672	3.671	3.6/0	3.670	ad	1868
	H4	1912	1914/3.907	3912/3907	3502	3502	1903	3901	1904	ad	1900
3	H1		4570/4.584	4.593/4.587	4561	4S58	4.566	4560	4.561	<560	<552
	82		1704	1759	3755	3757	1788	1780	1778	ad	3.762
	83		3543	1704	3896	3.682	1696	3.696	1699	ad	1700
	H4		1436	3719	3.698	1695	3.542	1845	1639	ad .	1648
	H5		3485	., 1602 . .	3399	.3596	. 3599	1595	1597 -	- ad	.. 3596
	HB		1748	3.637	3996	3.995	1908	1967	39Θ6	ad.	1985
	re		3926	3992	3031	3620	1824	1823	1823	ad	3521
4	H1			4.472	4.471	4.458	4.450	4.451	4.455	4.451	4.450
	K2			1541	3536	3584	3.573	1571	1568	ad	1557
	K3			1669	3661	3.724	3.710	3.710	3.711	ad.	3.701
	H4			3929	3927	4.450	4.138	4.144	4.140	ad	4.134
	H5			1729	172	ad	rud.	ad	fl.d	ad	ad.
	H5			374	376	ad	rud.	n.d	ad.	ad.	ad
5	H1					4.084	4.679	4.700	4.895	4.701	4.703
	82					1756	3.750	3800	1800	ad	1963
	H3					3567	3587	173	ad.	ad.	1078
	84					3.474	1474	3739	373	ad	1917
	H5					1437	1437	3.581	3583	ad	1568
	H6					1898	3501	1960	1965	ad	Iflfl
	re					1761	1781	.3856	1868	ad.	3L897
6							<585	4519	4.60B	4.607	<606
	re						1580	1724	1736	ad.	1907
	K3						1547	170	ad	ad	1006
	H4						1427	1710	1711	ad	1941
	H5						3452	1591	1591	ad	1592
	86						1916	1975	1975	ad.	1999
	w						1740	1827	1840	ad	1880
7	H1							4.480	4557	<528	4532
	K2							3542	3571	ad	1525
	H3							1665	4.116	ad	4.090
	H4							1826	1960	ad.	1534
8	K1							4.465	4.542	4542	4515
	re							3546	3573	ad	9.525
	H3							1665	4.118	ad.	4.090
	K4							3526	1860	ad	1934
ti	HJm								3758	2.760	£762
	H3«|								1.800	1.794	1.796
	H4								1689	ad.	1684
	85								1849	ad.	1851
	86								1638	ad	1660
	H7								1593	ad	1597
	HB								1032	ad	3557
	HB								1075	ad.	1877
	-re								3.645	ad.	1848
10									2.766	£764	£782
									1500	1.801	1.798
	M								1689	ad	1684
	H5								1649	ad	1851
	HB								1636	ad	1660
	H7								3593	ad	1697
	HB								3JBS2	ad	1897.
	H9								1875	ad	1877
	re								1645	ad	1648
11	81									1116	1117
	re									ad	1676
	83									ad	1901
	M									ad	1783
	H5									<819	4519
	H3									1.167	1.167
12	H1										1066
	re										1687
	K3										1889
	H4										1779
	re										4516
	re										1.187

Pro čísla sacharidů a označení viz obrázek 13 a) N.D. - není určeno

V V» w· ww ·· ·· ««·· * · · ···,' β « · · · Μ· · · ··

Mono- a difukosylace disialyldekasacharidu alditolů 26 na alditoly 27 a 28

347 nmol vzorek 26 byl podroben transferasové reakce se 700 nmol GDP-Fuc a 625 μυ lidské mléčné al,3 fukosyltransferasy. Reakční směs byla inkubována při 37 °C po dobu 64 hodin a reakce byla ukončena během směsi přes Superdex 75 kolonu. Když byl stupeň fukosylace studován NMR, ukázala integrace dvou dubletu při 5,086 a 5,117 ppm (H-l rezonance nových fukos), že 100% jedné z větví bylo fukosylováno, ale že pouze 40% druhé bylo fukosylováno. (není ukázáno). Pro maximalizaci množství difukosylovaného materiálu byla směs podrobena druhému kolu fukosyltransferasové reakce se 600 nmol GDP-Fuc a 540 μϋ enzymu. Vzniklá směs mono- a difukosylovaných alditolů byla potom frakcionována HPAEC a byly získány dva píky odpovídající di- a monofukosylováným produktům 28 (125 nmol) a 27 (60 nmol) , v příslušném pořadí (obrázek 14C).

Charakterizace fukosylováných sacharidů alditolů 27 a 28 ^XH-NMR

Ve srovnání s 26 (obrázek 15B) ukazuje anomerní region spektra monofukosylováného materiálu (obrázek 15C) jeden nový protonový dublet při 5,116 ppm, zatímco spektrum difukosylovaného materiálu (obrázky 15D a 17} ukazuje dva dublety při 5,117 a 5,086. Tyto jsou H-l rezonance nových fukos. Struktura monofukosylovaného glykanů byla stanovena srovnáním s NMR daty z částečně fukosylovaného NeuAca2-3Gal£l-4GlcNAcSl-3(NeuAca2-3Gal£l-4 GlcNAc£l-6)Gal£l-4GlcNAc, kde H-l fukosy navázané na 3-vázané rameno rezonuje při 5,116 ppm, zatímco fukosy navázané na 6-vázané rameno rezonuje při vyšším poli. Proto se usoudilo, že • « • ·· • · ·· fukosa v presentovaném monofúkosy 1 ováném glykanu (5,116 ppm) je í cel-3 vázaná na GlcNAc zbytek 5. To, že fukosa byla skutečně vázaná na 3-vázané rameno, bylo také ukázáno mírným posunem rezonance H-l dolů u £1,3 vázaného GlcNAc (5), zatímco H-l signál £1,6 vázaného GlcNAc (6) byl nezměněný. Strukturální signály reportérových skupin galaktosy 7 a NeuAc 9 také vykazovaly malé změny v chemickém posunu, zatímco signály zbytků 8 a 10 byly nezměněny. Tato data určují strukturu monofukosylováného materiálu jako glykan 27.

V difukosylovaném materiálu 28 je H-l signál GlcNAc zbytku 6, na který se váže druhá fukosa, téměř bez posunu (4,606 vs. 4,608 ppm), zatímco tentýž signál GlcNAc (3) prodělal posun nahoru, z 4,561 na 4,552 ppm (tabulka 6) . Druhá nová fukosa byla navázána na zbytek 6, nicméně, byla určena stanovením jiných protonů GlcNAc zbytků 3 a 6 (obrázky 16 a 17) . Srovnání chemických posunů s posuny u 26 ukázalo, že ačkoliv také H-2 GlcNAc 3 měl posun na o něco vyšší pole, H-2, H-3 a H-4 GlcNAc 6 prodělaly značný posun dolů charakteristický pro al-3 fukosylaci (Ichikawa, Y. et al·., J. AM. Chem. Soc. 114: 9283 - 9298 (1992); Wormald, M.R. et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 180: 1214 - 1221 (1991)). Skutečnost, že fukosa v monofukosylováném materiálu je navázána na zbytek 5, je také možné stanovit H-l rezonancemi distálních galaktos 7 a 8 v 28.

* Příklad 9 ._A Inhibice adhese lymfocytů zprostředkované L-selektinem alditolem (Tučně vytištěná čísla odpovídají strukturám glykanů na

T»¹’·! , T1T, ts> e iýi fcV b ob,

H b’ »p? b?

ft;. . íh <řL. «

Τ„· τι l> ή é« r

Cit e ϋ κc ijt. pt, r c í;>.<·.

c . *» r q r> t · Γ·-í;

I: 7.‘i:

j·. ť- b · .obrázku Ί3}' .

O-glykosidické, rozvětvené oligosacharidy mající 0, jeden nebo dva^términální sialyl Lě* motivy· (glykany 26, 27 a 28 popsané v příkladu.8) byly studovány jako inhibitory adhese lymfocytů „ závislé na L-selektinu na peritubulární kapilární endotel rejektovaných alotransplantátů ledvin.

'v »·' .·. ~ ' s. - V®1- i ·. .

,_ltDeset..až dvanáct týdiiů. staré krysy inbredních WF (ΚΤΙ'Ό a DA (RTl^a) kmenů byly, použity pro transplantace a testy adhese .lymfocytůLjak,. byly popsány v příkladu 1; Test vazby-se skládal·- ze - tří .pokusů provedených ve třech různých dnech. Každý pokus Obsahoval inkubaci lymfocytů. se třemi jednotlivými řezy rejektované ledviny za přítomnosti sacharidů v daných koncentracích;..dvanáct jednotlivých polí bylo analyzováno ze všech inkubací. .. >

' * ¹ .· .

Dodekasacharid 'alditol 28 mající dvě sialyl Le^x determinanty se ukázal-být účinným inhibitorem adhese lymfocytů.· závislé na L-selektinu’na endotel rejektovaných krysích ledvin a IC_so 0.,.,15 μΜ (obrázek 18) . Současně, glykan 27, s pouze 3-vázaným ramenem fukosyl ováným,'.. byl ..mnohem,, slabší inhibitor,; zatímco glykan 26, postrádající obě fukosy, prakticky neměl inhibiční aktivitu. Zatímco tyto výsledky naznačují, že náboj sám o sobě není vysvětleném ..pro .zvýšenou afinitu divalentníčh sialyl Le^ glykanů pro L-selektin, podtrhávají také význam fukosové skupiny v oligosacharidech vážících se na selektiny, jak bylo ukázáno dříve (Turunen,,. JÍP. et al., J. Exp. -Med. ’ 182.(4) : 1133 - 1141 (1995); Imai, Y. et al., Glycobiology 2: 373 - 381 (1992); Mulligan, M.S. et al., Nátuře. 364: 149,- 151 (1993),).. Vysoká afinita pro E-selektin byla dříve demonstrována pro divalentní sialyl Le^x

•	»9	94	II	4 «	vv
íl 9	9	9	•	♦	• 9	9 '	9
4 4	•	*	4	49 4	• 9	99	4
• ·	•	•	9	4 9	9	4	9
• 4 4	9 9	»9		49	9 ·

glykany (DeFrees, S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 115: 7549 - 7550 (1993); DeFrees, S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 66 - 79 (1995)) a s BSA konjugovaným sialyl Le^ (Welply, J.K. et al., Glycobiólogy 4: 259 - 265 (1994)), a pro L-selektin s di- a tetravalentními sialyl Le^ konstrukty (Turunen, J.P. et al., J. Exp. Med. 182(4): 1133 - 1141 (1995)).

Fyzikální základ zvýšeného inhibičního potenciálu di- a multivalentních oligosacharidů je stále otevřenou otázkou. O --selektinech-se- předpokládá·, ’že se vyskytují- jako multimery — (Rosen, S.D. and Bertozzi, C.R. Cur. Opin. Cell. Biol., 6: 663 - 673 (1994); Ushiyama, S. et al., J. Biol. Chem. 268: 15229 15237 (1993)), což může vysvětlovat vyšší afinitu multivalentních ligandů. V glykanu 28, nicméně, jsou dvě sialyl Le^ determinanty separovány pouze jednou monosacharidovou skupinou, díky čemuž je nepravděpodobné, že by se mohly vázat nezávisle na různé podjednotky multimerního proteinu, pokud jsou presentovány vedle sebe na povrchu buňky. Na druhou stranu, vazebný protein pro kyselinu sialovou u B-buněk, CD22, který se váže specificky na trisacharid NeuAc«2-6Galfil-4GlcNAc, tvoří nekovalentní oligomery, a má signifikantně vyšší afinitu pro analogický divalentní glykan než pro monovalentní trisacharid (Powel, L.D. et al., J. Biol. Chem. 270: 7523 - 7532 (1995)).

V nové prázi studovali DeFrees et al., inhibici E-selektinem zprostředkované adhese pomocí pozičních izomerů dvou sialyl Le^x skupin vázaných galaktosou a zjistili, že 3,6-vázaný sialyl Le³* dimer je nejúčinějším inhibitorem (DeFrees, S.A. et al., J. AM. Chem. Soc. 117: 66 - 79 (1995)). Jak uvádí Graves et al., rentgenová struktura E-selektinu nevylučuje dimerickou formu sialyl Le^x jako ligand, ačkoiv autoři považují zvýšení vazebné

aktivity za malé (Graves, B.J. et al., Nátuře 367: 532 - 538 (1994)) .

Inhibiční schopnost monovalentního sialyl Le^ undekameru 27, majícího fukosu ve 3- vázaném rameni, byla stejná jako u monovalentního sialyl Le^x tetrasacharidu 1 (popsaného v příkladu 2) při optimální koncentraci (obrázek 18). Toto ukazueje, že zvýšení velikosti glykanu nezvyšuje automaticky afinitu pro L-selektin. Inhibiční schopnost pozičního izomeru 27, majícího monovalentní 6-vázanou sialyl Le^ skupinu, není známa;principielně je možné, že v divalentním glykanu 28 se hlavně 6-vázaná sialyl Le^ skupina váže na selektin a zvýšená afinita jednoduše odráží rozdíl mezi dvěma větvemi.

Ačkoliv bylo nedávno popsáno, že N-glykany E-selektinového ligandu ESL-1 jsou nutné pro vazbu (Steegmaler, M. et al., Nátuře 373: 615 - 620 (1995)), většina biologických ligandů pro L- a P-selektiny jsou O-glykany (Schimizu and Shaw, Nátuře 366: 630 631 (1993)). Glykoproteinové ligandy pro L-selektin mají velké množství blízko sebe umístěných sialyzovaných O-vázaných oligosacharidů (Lásky, L.A: et al., Cell 69: 927 - 938 (1992); Baumhueter, S: et al., Science 262: 436 - 438 (1993); Berg, E.L t al., Nátuře 366: 695 - 698 (1993); Norgard, K.E. et al., J. Biol. Chem. 268: 12764 - 12774 (1993)), které presentují distální sialyl Le^ skupiny selektinu způsobem podobným rozvětvenému poly-N-acetyllaktosaminovému skeletu.

Zde byla inhibiční schopnost dodekasacharidu alditolu 28 srovnávána se schopností glykanu 4 (popsaného v příkladu 2), který nemá redukovanou sekvenci O-glykosidického jádra (obrázek 18). Jelikož se 28 jevil jako o něco lepší inhibitor než 4, může

4· · · · · · • » · · · ··♦ sekvence jádra zvyšovat afinitu pro L-selektin. Je pozoruhodné, že u 28 měly NMR signály fukosových a galaktosových zbytků dvou sialyl Le³¹ skupin různé chemické posuny, zatímco rozdíl mezi rameny byl velmi malý, když byly dvě sialyl Le³' skupiny navázány na ethyl glykosid galaktosy (DeFrees, S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 66 - 79 (1995)). Toto naznačuje, že proximální část 28 ovlivňuje vlastnosti distálních sialyl Le^ skupin. V souladu s tím, jádrová struktura 28 není přímo zahrnuta ve vazbě, ačkoliv zvyšuje afinitu pro L-selektin.

Toto je poprvé, kdy byla testována účinnost kompletních sialyl⁷ Le³¹ obsahujících O-glykanů v modelu adhese lymfocytů závislé na L-selektinu. Vynálezci stanovili, že divalentní sialyl Le³⁵ O-glykan je signifikantně lepší inhibitor než analog postrádající jednu nebo obě fúkosy.

Příklad 10

Léčba sLex pozitivních nádorových metastas sLex

Molekuly obsahující uhlovodany byly přepokládány u mnoha onemocnění, včetně autoimunitních onemocnění, zánětlivých stavů, peptických vředů, infekčních onemocnění a nádorů. Kromě toho, změny v povrchových uhlovodanových molekulách na lidských nádorových buňkách umožňují identifikaci lidských glykoproteinů nádorových antigenů pro mnoho typů nádorů, včetně melanomů, gliomů, neuroblastomů a karcinomů prsu, slinivky břišní, plic, prostaty a ledvin. Jeden člen lektinové rodiny vazebných proteinů pro uhlovodany byl silně asociován jak s metastasami, tak se zkrácenou dobou přežití u pacientů s karcinomem prsu. Koncový cukr na uhlovodanové molekule, na který se lektin váže, byl

	4 •	v •	• •	• 9 9 999	• 4 4 4
	•	•	4	9	4 4	4
ς z

identifikován jako N-acetyl galaktosamin. Kromě toho, stejný N-acetylgalaktosaminový cukr byl nalezen na několika jiných typech nádorů, včetně karcinomu prostaty, žaludku a kolorektálního karcinomu, a byl asociován ze zvýšeným metastasováním a redukovaným přežíváním ve všech případech (Hughes, S. Scrip. Květen 1994, str. 28 - 31) . iné studie ukázaly, že buněčné linie karcinomu střeva adherují na určité selektiny cestou sialyl Lewis x a sialyl Lewis a oligosacharidů (Majuri, M.L. et al., Int. J. Cancer 63: 551 - 559 (1995); Majuri, M.-L. et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm. 182(3): 1376 1382 (1992)).

V souladu s tím mohou být syntetické polylaktosaminy obsahující sLex podle předkládaného vynálezu použity pro inhibici metastasování sLex pozitivních nádorových buněk. Stručně, pacient, u kterého byl diagnostikován takový nádor, je léčen kompozicí obsahující multivalentní sLex, například tetravalentní sLex 22-sacharid. Kompozice je ve farmaceuticky přijatelné přísadě v dávce dostatečné pro inhibici metastas sLex pozitivních nádorových buněk blokováním vazby nádorových buněk na přirozené sLex. Dostatečná dávka kompozice je dána v takovém režimu, že je dosažena sérová koncentrace v řádu nanomolů až mikromolů, dokud není stav dostatečně zmírněn.

Při podání pacientovi je kompozice formulována jakýmkoliv způsobem, který ji činí vhodnou pro orální, parenterální, nasální, enterální nebo rektální podání s farmaceuticky přijatelnou přísadou nebo vehikulem, např. s izotonickým fyziologickým roztokem, v souladu s běžnou farmaceutickou praxí. Dávka činidla bude dostatečná pro způsobení anti-metastatického účinku blokováním selektinem, a zejména L-selektinem • *Φι Φ φ · φφ • φ φ ♦ · φφφ φ φφ φφ φ φ · · φ · φ φφφ zprostředkované adhese nádorových buněk u pacienta.

Účinnou hladinou kompozice podle předkládaného vynálezu je míněna hladina, kterou je dosaženo určitého zlepšení u pacienta, kterému je tato léčba podána.

Farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu jsou podány v množství dostatečném pro antagonizování {úplné nebo částečné) nativního selektinu pacienta, a zejména L-selektinu, vazbou na biologické cíle jako je selektin u takového pacienta, a specificky na sLex pozitivní nádorové buňky.

Množství a režimy pro podání uhlovodanů vážících selektin a kompozic podle předkládaného vynálezu může být snadno určeno odborníky v klinickém oboru terapie nádorů. Obecně, dávka kompozice podle předkládaného vynálezu se bude velmi lišit podle: typu použitého syntetického uhlovodanu, věku, zdravotního stavu, léčeného onemocnění, typu současné léčby, pokud je nějaká, frekvenci léčby a charakteru požadovaného účinku, rozsahu tkáňvého poškození, pohlaví, trvání příznaků, a kontraindikací, pokud jsou nějaké, a na jiných okolnostech podle úvahy ošetřujícího lékaře. Požadovaná dávka může být podána v jedné nebo ve více aplikacích pro získání požadovaného výsledku.

Příklad 11

Léčba infekce sLex

Použití sLex jako protiinfekční látky je založeno na pozorování, že oligosacharidy jsou přítomny na povrchu všech savčích buněk a ež jsou využívány bakteriemi, viry a jinými φ * φ φφφ φ · φ φφ φφ · φ φ infekčními mikroorganismy pro vstup do těchto buněk (Hughes, S. Scrip. Květen 1994, str. 28 - 32). Například, lidský sialyl Lewis x antigen je značně exprivován na povrchu Streptococcus gallolyticus, který způsobuje u lidí infekční endokarditidu (Hirota, K. et al., Lancet 347: 760 (1996); Hirota, K. et al., FEMS Immunol and Med. Microbiol. 12: 159 - 164 (1995). Tak, zaplavení těla jedním určitým typem oligosacharidu je jedním možným terapeutickým přístupem pro určitou infekční chorobu (Hughes, S. Scrip. Květen 1994, str. 28 - 32). Jednou výhodou, kterou mají oligosacharidy před konvenčními anti-infekčními léčivy je, že jsou účinné v prevenci, stejně jako v terapii infekčních onemocnění. Oproti tomu, použití antibiotik v profylaxi infekce může vést ke vzniku resistence. Kromě toho, protože oligosacharidy nezabíjejí bakterie, ale pouze inhibují jejich vazbu na lidské tkáně, nepůsobí žádný selekční tlak na růst rezistentních mikroorganismů (Hughes, S. Scrip. Květen 1994, str. 28 - 32).

Syntetické polylaktosaminy obsahující sLex podle předkládaného vynálezu použity pro léčbu nebo prevenci infekčních onemocnění. Stručně, pacient, u kterého bylo diagnostikováno takové infekční onemocnění je léčen kompozicí obsahující multivalentní sLex, například tetravalentní sLex 22-sacharid. Kompozice je ve farmaceuticky přijatelné přísadě v dávce dostatečné pro blokování infekčního mikroorganismu, např. bakterie, z vazby na odpovídající oligosacharidy na odpovídajícím, např. endotelovém, povrchu buněk. Kompozice je dána v takovém režimu, že je dosažena sérová koncentrace v řádu nanomolů až mikromolů, dokud není stav dostatečně zmírněn.

Při podání pacientovi je kompozice formulována jakýmkoliv

* 1*	toto	toto	• to	toto
toto to	•	♦ *	•		♦ to	«	to
♦ to	to	to	•	to »	♦ ·	• to
							to
• «	•	to. . ·	to	to		to .	to
v « v	*	w·		to »	• ·	* to

způsobem, který ji činí vhodnou pro orální, parenterální, nasální, enterální nebo rektální podání s farmaceuticky přijatelnou přísadou nebo vehikulem, např. s izotonickým fyziologickým roztokem, v souladu s běžnou farmaceutickou praxí. Dávka činidla bude dostatečná pro způsobení anti-infekčního účinku blokováním selektinem, a zejména L-selektinem zprostředkovaných adhesních dějů u pacienta.

Účinnou hladinou kompozice podle předkládaného vynálezu je míněna hladina, kterou je dosaženo určitého zlepšení u pacienta, kterému je tato léčba podána.

Farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu jsou podány v množství dostatečném pro antagonizování (úplné nebo částečné) nativního selektinu pacienta, a zejména L-selektinu, vazbou na biologické cíle jako je selektin u takového pacienta, a zejména na endotelové buňky.

Množství a režimy pro podání uhlovodanů vážících selektin a kompozic podle předkládaného vynálezu může být snadno určeno, odborníky v klinickém oboru terapie infekčních onemocnění. Obecně, dávka kompozice podle předkládaného vynálezu se bude velmi lišit podle: typu použitého syntetického uhlovodanu, věku, zdravotního stavu, léčeného onemocnění, typu současné léčby, pokud je nějaká, frekvenci léčby a charakteru požadovaného účinku, rozsahu tkáňvého poškození, pohlaví, trvání příznaků, a kontraindikací, pokud jsou nějaké, a na jiných okolnostech podle úvahy ošetřujícího lékaře. Požadovaná dávka může být podána v jedné nebo ve více aplikacích pro získání požadovaného výsledku.

« « *· • «4' · ··

Všechny zmíněné odkazy jsou v přihlášce uvedeny jako odkaz.

Ačkoliv.předešlý popis popisuje určitá preferovaná provedení, mělo by být jasné, že předkládaný vynález není jim/ omezen. Odborníkům v oboru bude jasné, že může být provedeno mnoho modifikací popsaných provedení a že takové modifikace spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Claims (27)

1. Patentově n a xr o lc y

   1. Syntetický oligosacharid obsahující lineární polylaktosaminovou kostru (LacNac)_n, kde n>l a vazby mezi zbytky jsou Él-3' a/nebo β1-6', na kterou jsou dva nebo více NeuNacoí2-3GalEl-4 (Fucl-3)GlcNac epitopy navázány fil-3' a/nebo £1-6' vazbami.
2. 2. Syntetický oligosacharid podle nároku 1 obsahující dva NeuNaca2-3Galfil-4(Fucl-3)GlcNac epitopy.
3. 3. Syntetický oligosacharid podle nároku 1 obsahující čtyři NeuNaca2-3Galfil-4(Fucl-3)GlcNac epitopy.
4. 4. Syntetický oligosacharid obsahující polylaktosaminovou kostru (LacNac)_n, kde n>l a vazby mezi zbytky jsou βΙ-3¹ a/nebo £1-6', na kterou jsou dva nebo více NeuNaca2-3Galfil-4(Fucl-3)GlcNac epitopy navázány βΙ-3' a/nebo £1-6’ vazbami, kde uvedený oligosacharid má O-glykosidické jádro obsahující Gal£l-3GalNAc-ol sekvenci.
5. 5. Syntetický oligosacharid podle nároku 4 obsahující dva NeuNaC0í2-3GalBl-4 (Fucl-3)GlcNac epitopy.
6. 6. Farmaceuticky přijatelná kompozice obsahující oligosacharid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5.
7. 7.. Způsob pro prevenci nebo léčbu zánětlivých stavů u pacienta jsou £1-3' a/nebo £1-6', na kterou jsou dva nebo více

   NeuNaca2-3Gal£l-4(Fucl-3)GlcNac epitopy navázány £1-3' a/nebo £1-6' vazbami, uvedenému pacientovi.

   • ·· ·· »· 1· ·· * • « « v * • • · • • · • • ·♦ • • · • » • · • • • « * « · · * w v v v v *
8. 8. Způsob podle nároku 7vyznačující se tí m^žeu uvedeného pacienta bylo diagnostikováno, nebgL-ge-TÍzíko vzniku, onemocnění vybrané ze skupiny^KLáda^ícTse z tkáňové rejekce, orgánové rejekce^a-rtritidy, infekce, dermatosy, zánětlivého stževníKóonemočnění a autoimunitního onemocnění.
9. 9. Způsob podle nároku 7 v y z n a č u j í c_í__s—e—t—í—nrr^že

   W&deným-enemocněiiím j e tkáňová nebo orgánová rej ekce.
10. 10. Způsob podle nároku 7 v y z n a Ě u j í c í__s_e—b—;í—nh—že u-vedeným-onemocněiiínr^e revmatoidní artritida.
11. 11. Způsob, podle nároku 7 v y značuj ící _s_e.—t—í—my—že uvedeným—onemO“cněmm je chronické onemocnění střeva.
12. 12. Způsob podle nároku 7 v y z n a č u j_-í—c—í-—; uvedeným-paciefitem je zvíře.

    m, že
13. 13. Způsob podle nároku 7 v y značuj í c í . e—t—í-my—že uvedeným-paclentem^-je člověk.
14. 14. Způsob pro ochranu před rejekcí transplantované tkáně nebo orgánu vyznačující se tím, že obsahuje-^odanT” farmacetické kompozice obsahující syntet-ický^roligosacharid obsahující polylaktosamjjiQvou'Ttostru~(LacNac) , kde n>l a vazby mezi zbytky^ £1-3' a/nebo £1-6', na kterou jsou dva nebo více aca2-3Gal£l-4(Fucl-3)GlcNac epitopy navázány £1-3' a/nebo • · £1-6' vazbami, uvedenému pacientovi, který dostal uvedený transplantát.
15. 15. Způsob podle nároku 14 vyznačuj ící s_e—-t—í—m, že uvedený orgán je vybrán—ze—skupíríý^skTádajTcT^e^z srdce, plic nebo^redvirT
16. 16. Způsob podle nároku 14 vyznačuj ící-—s—e—t -í—m, t, že-uveďenou transplantovanou tkání je kůže.
17. 17. Způsob podle nároku 14 vyznačuj í cl · s_e—-te—írnU že uvedená transplantovanátkáň/orgán-T^v^rána ze skupiny skládaj ící—se—z^kOsbna~dřeně. rohovky, slinivky břišní a tenkého střeva.
18. 18. Způsob pro blokování škodlivé migrace leukocytů u abnormálních zánětlivých stavů u pacienta v y z n ící setím, že obsahuje podáni farmacetické^kornpozice obsahující syntetický oligosacharid obsahujíp>-p5Íylaktosaminovou kostru (LacNac)_n, kde n>l a vazby—mezi zbytky jsou £1-3' a/nebo £1-6', na kterou jsou^yarTíebo více NeuNaca2-3Gal£l-4(Fucl-3)GlcNac epitopy^xialTazány £1-3' a/nebo £1-6' vazbami, uvedenému pacientovi.

    *Wi
19. 19. Způsob pro prevenci nebo léčbu bakteriální infekce u** pacienta vyznačuj ícíse tím, že obsahujě^podání farmacetické kompozice obsahující syntetieký^oligosacharid obsahující polylaktosaminovou^kesťru (LacNac)_n, kde rul a vazby mezi zbytky jsou £l>3J-^7nebo £1-6', na kterou jsou dva nebo více NeuNaco2^3Gai£Í^4(Fucl-3)GlcNac epitopy navázány £1-3' a/nebo £Jr=^‘^rvazbami, uvedenému pacientovi.

    to to
20. 20. Způsob podle nároku 19 v y z n a č U-j-i-c-á s^e že^uvedei^u-ba-kterialní infekcí je streptococcová infekce.
21. 21. Způsob podle nároku 19 v y z n a č u j_í_c—í-—s—e—t^- í itr; že uvedenýnrpacientem je zvíře.
22. 22. Způsob podle nároku 19 v y z n a č ující se t í-m^—že uvedeným-pae-ientem^-j'e^— člověk,
23. 23. Způsob pro prevenci nebo léčbu nádorových metastas u pacienta vyznačujícíse· tím, že obsahujj^poďárií farmacetické kompozice obsahující syntetický^oťťígosacharid obsahující polylaktosaminovou ko&títrTLacNac)_n, kde n>l a vazby mezi zbytky jsou ^l-3J^,a/iiěĚo £1-6', na kterou jsou dva nebo více NeuNaca2-3GaLEi'^r''4 (Fucl-3)GlcNac epitopy navázány £1-3' a/nebo Ej^e-^^azbami, uvedenému pacientovi.
24. 24. Způsob podle nároku 23 v y z n a č_u_j—£ uvedený—nádo-r^ie^SEex pozitivní.

    m, že
25. 25. Způsob podle nároků 23 nebo 24 vyznačuj ící se tím, že uvedený nádor je vybrán ze skupiny—skiá^ájíci^sez karcinomu-prsiT7^prostaty\ žaludku a tlustého střeva a konečníku.
26. 26. Způsob podle nároku 23 vyznačuj i c í—s—e—-t—í πη—ζ'£ uvedeným pacientem j e zvíře.
27. 27. Způsob podle nároku 23 vy z n ačující s a—t í -mj—žeuyedeným-^aeienbenr j e^—člověk”