HU216312B - Eljárás szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására - Google Patents

Eljárás szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU216312B
HU216312B HU9204091A HU409192A HU216312B HU 216312 B HU216312 B HU 216312B HU 9204091 A HU9204091 A HU 9204091A HU 409192 A HU409192 A HU 409192A HU 216312 B HU216312 B HU 216312B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
priority
june
moiety
compound
selectin
Prior art date
Application number
HU9204091A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT69652A (en
HU9204091D0 (en
Inventor
Frederico C. A. Gaeta
James C. Paulson
Mary S. Perez
Robert Murray Ratcliffe
Original Assignee
Cytel Corp.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cytel Corp. filed Critical Cytel Corp.
Publication of HU9204091D0 publication Critical patent/HU9204091D0/hu
Publication of HUT69652A publication Critical patent/HUT69652A/hu
Publication of HU216312B publication Critical patent/HU216312B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát eljárásők képezik szelektinreceptőrhőz kötődniképes (I) általánős képletű mőlekűlarész(eke)t tartalmazó gyógyászatikészítmény előállítására, tővábbá eljárásők vegyülete szelektin-közvetített sejtadhéziót gátló hatásának vizsgálatára. A találmányszerinti megőldás alkalmas gyűlladásős főlyamatők csökkentésére vagygátlására, tővábbá őlyan gyűlladásős betegségek és más patőlógiáselváltőzásők kezelésére, amelyeket in ercellűláris adhézió közvetít. ŕ

Description

A találmány tárgyát eljárások képezik szelektinreceptorhoz kötődni képes molekularész(eke)t tartalmazó vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, továbbá eljárások vegyületek szelektinközvetített sejtadhéziót gátló hatásának vizsgálatára.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható gyulladásos folyamatok csökkentésére vagy gátlására, továbbá olyan gyulladásos betegségek és más patológiás elváltozások kezelésére, amelyeket intercelluláris adhézió közvetít.
A vaszkuláris endoteliális sejtek, valamint vérlemezkék kulcsfontosságú szerepet játszanak számos biológiai folyamatban azáltal, hogy szelektíven megkötnek bizonyos sejteket, így például a fagocitáló (falósejt működést kifejtő) leukocitákat a vérrendszerben. így például az endoteliális sejtek megkülönböztetetten kötik meg a monocitákat és granulocitákat, mielőtt azok még a véredények falain keresztüljutnának és a környező szövetekbe kerülnének gyulladásos folyamat során. Ismertek bizonyos gyulladást kiváltó vegyületek, amelyek közvetlenül a vaszkuláris endotheliumon hatnak és elősegítik a leukociták érfalakhoz való adhézióját. A sejtek ezután az érfalakon keresztüljutva a károsodás vagy fertőzés területére jutnak. A vaszkuláris endotheliumhoz való celluláris adhézió valószínűleg részt vesz a tumor-metasztázis folyamatokban is. A keringő rákos sejtek látszólag kihasználják a szervezet normál gyulladásos mechanizmusát és a véredények falához kötődnek, ahol az endothelium aktiválódik.
A vérlemezkék szintén részt vesznek hasonló folyamatokban. A vérlemezkékről ismert, hogy a hemosztázis iniciálási folyamata alatt aktiválódnak és fontos morfológiai, biokémiai és funkcionális változásokon mennek keresztül (például gyors granulális exocitózis vagy degranulálódás), amely folyamatban a lemezkék alfa-granulátum membránja a külső plazmamembránnal egyesül. Ennek eredményeképpen új sejtfelületi proteinek expresszálódnak, ami az aktivált lemezkéknek új funkciót ad, így például képessé teszi őket arra, hogy mind más aktivált vérlemezkékhez, mind más aktivált sejtekhez kötődjenek. Az aktivált vérlemezkék ezután növekvő trombusokká alakulnak vagy pedig gyorsan kiürülnek a vérkeringésből. Az aktivált vérlemezkékről ismert, hogy kötődnek a fagocitáló leukocitákhoz, beleértve a monocitákat és a neutrofiieket is. Ilyen patológiai elváltozások és más biológiai folyamatok közé amelyekről ismert, hogy őket ezen folyamatok közvetítik - tartozik például az ateroszklerozis, a vérrögösödés és a gyulladás.
Az endoteliális sejteken és vérlemezkéken lévő sejtfelületi receptorokra specializálódott, utóbbi időben végzett kutatásokkal kimutatták, hogy az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 (ELAM-1) és a granulális membrán protein-140 (GMP-140) részt vesznek a különböző keringő sejteknek az endothelium és vérlemezkék által való felismerésében. Ezek a receptorok felületi glükoproteinek, amelyek lektinszerű doméneket, az epidermális növekedési faktorral homológ szakaszt, valamint a komplementer szabályozó proteinekkel homológ szakaszt tartalmaznak (Bevilacqua és munkatársai, Science, 243:1160 [1989]). így például az ELAM-1-ről kimutatták, hogy közvetíti az endoteliális leukocita adhéziót, ami az első lépés a legtöbb gyulladásos folyamatban. Az ELAM-1 különösen kötődik a humán neutrofilekhez, monocitákhoz, eozinofilekhez, bizonyos T-limfocitákhoz (N. Graber és munkatársai, J. Immunoi., 145:819 [1990]), az NK sejtekhez, valamint a promielocita HL-60 sejtvonalhoz.
A „szelektin” megnevezést javasolták a receptorok általános csoportjára, amelyekbe tartozik az ELAM-1 és a GMP-140, ezek lektinszerű doménjei, valamint az adhéziós funkciójuk szelektív természete alapján. Ezek a sejtfelületi receptorok a legkülönbözőbb sejtekben expresszálódnak. A GMP-140 (ez PADGEM-ként is ismert) jelen van a vérlemezkék és endoteliális sejtek felületén, ahol a vérlemezke-leukocita és endotélium-leukocita kölcsönhatásokat közvetítik. A szelektincsoport egy másik tagja az MEL-14 antigén, valamint ennek LAM-1 humán analógja, amelyek a limfociták sejtfelületi receptoijai és nyirokmirigy irányító receptorként hatnak. A szelektinreceptorok által felismert ligandum pontos természete még nem ismert.
Különböző más módszereket is kifejlesztettek a szelektinek hatásának blokkolására és így a celluláris adhézió gátlására. így például javasolták az ELAM-1 gyei szembeni monoklonális antitestek alkalmazását az endothelium-leukocita adhézió gátlására és így patológiás folyamatok, például gyulladás kezelésére. Az endoteliális interleukin-8-ról szintén kimutatták, hogy gátolja a leukocita-endothelium kölcsönhatást.
A ligandum-receptor kölcsönhatás megfelelő értelmezésével lehetségessé válik a szelektinközvetített celluláris adhézióra igen specifikus nagy hatású inhibitorok kifejlesztése, amelyek alkalmasak a terápiás célú felhasználásra. A ligandumot vagy a ligandumokat alkalmazni lehet továbbá más gyógyhatású vegyületek, így például gyulladásgátló szerek, valamint antioxidánsok irányítására a beteg helyre. Jelenleg ezen próbálkozásokat gátolja, hogy nem kielégítően ismert a ligandumok és a megfelelő sejtek receptormolekulái közötti kölcsönhatás. A jelen találmány célja, hogy ezt, valamint más egyéb szükségleteket is kielégítsen.
A találmány új kompozíciókra vonatkozik, amelyek szelektíven kötik a szelektinreceptorokat és amelyek legalább egy szelektinmegkötő részt tartalmaznak. A találmány szerinti szelektinmegkötő részt a következő I általános képlettel újuk le:
R i - GalB 1,4(Fucal,3)GlcN Ac - (R2)a I amely képletben
R, jelentése egy oligoszacharid vagy egy II általános képletű csoport:
R3 COOH \ I
C-csoport II /
R4 amely képletben r3 és K| jelentése azonos vagy különböző és lehet -H, 1-8 szénatomos alkil-, hidroxi-1-8 szénatomos
HU 216 312 Β alkil-, -aril-1-8 szénatomos alkil- vagy -alkoxi1-8 szénatomos alkilcsoport,
R2 jelentése Bl, 3Gal, al, 2Man vagy al, 6GalNac, és a értéke 0 vagy 1.
Egy előnyös kiviteli formánál Rf jelentése szialsav, általában NeuAc vagy NeuGc. Ha Rj jelentése egy oligoszacharid, az előnyösen NeuAc@2, 3GalBl, 4GllcNAcBl,3 vagy NeuGca2,3GalBl, 4GlcNAcBl,3. A szelektinmegkötő rész általában egy olyan oligoszacharid, amely a minimális tetraszacharidot (SLX) tartalmazza, amelyet a szelektinreceptor felismer.
A találmány szerinti vegyületet egy poliszacharidból állítjuk elő, amely ismétlődő egységként tartalmazza a nem fukozilált SLX magszerkezetet. Fukozilálás hatására többértékű SLX-hordozó poliszacharidot nyerünk. Erre a célra előnyös poliszacharidok az la, II és III típusú poliszacharidok, valamint a B Streptococcus csoportból származó poliszacharidok. Többértékű szelektinmegkötő vegyületet nyerünk ugyancsak, ha egy szelektinmegkötő részt különböző linker részekhez kötünk.
A találmány szerinti kompozíciók gátolják a szelektin sejtfelületi receptorok által közvetített intercelluláris adhéziót és ily módon képesek gátolni például a gyulladásos és más patológiai folyamatokat, amelyek a celluláris adhézióval kapcsolatosak. A találmány szerinti szelektinmegkötő készítmény lehet egy poliszacharid, egy glükoprotein, egy glükolipid vagy egy oligoszacharid.
A találmány oltalmi körébe tartoznak a fenti vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények is. Ezek a gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak például liposzómákat, amelyek a szelektinreceptorokat szelektíven megkötni képes részeket, valamint gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot tartalmaznak. Az ilyen részeket tartalmazó liposzómák irányító hordozóanyagként is szolgálhatnak a konvencionális kemoterápiás szer számára, amely szert a liposzómába foglalunk és amely azon célsejthez lesz szállítva, amely a szelektinreceptort expresszálja. A kemoterápiás szer általában egy gyulladásgátló szer vagy egy antioxídáns. A fenti molekularészek alkalmazásával a liposzómába foglalt kémiai szert a kívánt helyre juttatunk, és ez egy igen alkalmas és hatásos módszer a hatóanyag terápiás mennyiségének csökkentésére és a mellékhatások minimalizálására.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak továbbá immunoglobulinokat is, amelyek alkalmasak a szelektinreceptor által felismert oligoszacharid ligandum szelektív megkötésére. Ilyen alkalmas immunoglobulinok például a következők: CSLEX-1, FH6, SNH3, SNH4 és VIM-2.
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá a kezelési eljárás, amelyben az intercelluláris adhéziót gátoljuk a kóros folyamatok, így például gyulladás során, azáltal, hogy a betegnek a szelektinreceptorok megkötésére képes vegyület terápiásán hatásos dózisát adagoljuk. A szelektinreceptor, így például az ELAM-1 vagy GMP-140 a vaszkuláris endoteliáris sejteken vagy vérlemezkéken expresszálódhat. A gyulladásos folyamat lehet például szeptikus roham, szepszissel kapcsolatos seb, akut légzőszervi megbetegedés stb.
A mellékelt ábrákon a következőket illusztráljuk:
Az 1. ábrán az SLX (LÉC 11) expresszáló sejtek azon képességét mutatjuk be, hogy az IL-1B aktivált endoteliális sejtekhez kötődnek, összehasonlítva az olyan sejtekkel, amelyek nem szializált Lex (CH0-K1 és LÉC 12) expresszálók.
A 2. ábrán az SLX-re specifikus monoklonális antitestek azon képességét mutatjuk be, hogy a HL-60 sejtek szelektinközvetített kötését blokkolják 37 °C hőmérsékleten (2A ábra) és 4 °C hőmérsékleten (2B ábra) összehasonlítva azon monoklonális antitestekkel, amelyek nem kötik az SLX determinánsokat.
A 3. ábrán az LÉC 11 (3A ábra) és az LÉC 12 (3B ábra) sejtek SLX és nem SLX specifikus monoklonális antitestekkel való inkubálásának hatását mutatjuk be az aktivált endoteliális sejtekhez való kötődésre.
A 4. ábrán bemutatjuk a HL-60, LÉC 11 és LÉC 12 sejtek szialidázzal való kezelésének hatását, amely kezelést az aktivált endoteliális sejtekhez való kötődés előtt végeztünk.
Az 5. ábrán összehasonlítjuk a glükolipideket tartalmazó liposzómák és az SLX, Lex vagy hasonló szénhidrát szerkezetek azon képességét, hogy hogyan gátolják a HL-60 sejtek kötődését az aktivált endoteliális sejtekhez.
A 6. ábrán összehasonlítjuk az SLX és Lex determinánsokra specifikus antitestekkel való GMP-140 közvetített vérlemezkeadhézió-gátlást.
A 7. ábrán összehasonlítjuk a glükolipideket tartalmazó liposzómák és SLX, Lex vagy hasonló szénhidrát szerkezetek azon képességét, hogy hogyan gátolják a HL-60 sejteknek az aktivált vérlemezkékhez való kötődését.
A 8. ábrán összehasonlítjuk a glükolipideket tartalmazó liposzómák és az SLX, Lex vagy hasonló szénhidrát szerkezetek azon képességét, hogy hogyan gátolják a PMN sejteknek az aktivált vérlemezkékhez való kötődését.
A 9. ábrán bemutatjuk a GMP-140 közvetített adhézió glükolipidekkel való gátlását, amelyek terminális szialsavként NeuAc-t vagy NeuGc-t tartalmaznak.
A 10. ábrán bemutatjuk, hogy a profilaktikusan adagolt ELAM-1 elleni monoklonális antitestek hogyan gátolják a lipopoliszacharidok által indukált halálozást patkányok esetében.
All. ábrán bemutatjuk, hogy a terápiásán adagolt ELAM-1 elleni monoklonális antitestek hogyan gátolják a lipopoliszacharidok által indukált halálozást patkányoknál.
A találmány készítményekre és eljárásokra vonatkozik, amelyek gátolják a celluláris adhézió által közvetített gyulladásos és más kóros folyamatokat. A találmány vonatkozik továbbá vegyületekre (például glükokonjugátumokra és monoklonális antitestekre), amelyek képesek blokkolni vagy gátolni a szelektin sejtfelületi receptorok által közvetített sejtadhéziót. Vonatkozik a találmány továbbá az ilyen vegyületek előállítására, valamint vizsgálatára is, továbbá vonatkozik ezen vegyületek diagnosztikai és terápiás célú alkalmazására is.
HU 216 312 Β
A találmányunk alapja a szénhidrát részek felismerése, amelyeket a szelektin sejtfelületi receptorok felismernek. Mint már a fentiekben említettük, a szelektinek, amelyeket a sejtadhéziós molekulák „LEC-CAM” családjaként is ismerünk, különleges glükoproteinek, amelyek különböző sejtek felületén expresszálódnak. így például az ELAM-1 indukálhatóan expresszálódik a vaszkuláris endoteliális sejteken (Bevilacqua és munkatársai, supra, és Hession és munkatársai, Proc. Nat’l. Acad. Sci., 87:1673-1677 [1990]). Erről a receptorról kimutatták, hogy a gyulladásos citokinek, így például interleukin IB (IL-IB) és a tumor nekrózis faktor a (TNFa), valamint a bakteriális endotoxin (lipopoliszacharid) által indukálható (Bevilacqua és munkatársai, Proc. Nat’l. Acad. Sci., 84:9238-9242 [1987]). Ezek a vegyületek közvetlenül az endoteliális sejtekre hatnak in vitro és lényegesen növelik a polimorf magú leukocita (neutrofil) és monocita adhéziót.
Mint már a fentiekben is említettük, a GMP-140 a vérlemezke és endoteliális szekréciós granulátumok membrán glükoproteinje (Geng és munkatársai, Natúré, 343, 757-760 [1990].) Az aktivált vérlemezkékről - amelyek a felületükön a GMP-140-t expresszálják ismert, hogy a monocitákhoz és a neutrofilekhez kötődnek (Jungi és munkatársai, Blood, 67:629-636 [1986]), valamint kötődnek a monocitaszerű sejtvonalakhoz, így például a HL-60 és U937-hez is (Jungi és munkatársai, supra, Silverstein és munkatársai, J. Clin. Invest., 79:867-874 [1987]). A GMP-140 egy alfagranula membránprotein, amelynek molekulatömege 140000 és amely az aktivált vérlemezkék felületén expresszálódik a vérlemezke-stimuláció és a granula szekréció hatására (Hsu-Lin és munkatársai, J. Bioi. Chem., 259:9121-9126 [1984]; Stenberg és munkatársai, J. Cell Bioi. 101:880-886 [1985]; Berman és munkatársai, J. Clin. Invest.78:130-137 [1986]). Megtalálható továbbá a megakariocitákban (Beckstead és munkatársai, Blood, 67:285-293 [1986]), valamint az endoteliális sejtekben (McEver és munkatársai, Blood, 70:355a [1987]) a Weibel-Palade testeken belül (Bonfanti és munkatársai, Blood, 73:1109-1112 [1989]). Fürié és munkatársai (US 4 783 330) monoklonális antitesteket ismertetnek, amelyek a GPM-140-nel reakcióképesek.
Egy harmadik szelektinreceptor a limfocita irányító receptor MEL-14 antigén vagy ELAM-1 (Gallantin és munkatársai, Natúré, 304:30-34 [1983]; Siegellmenés munkatársai, Science, 243:1165-1172 [1989]; Rosen, Cell Biology, 1:913-919 [1989]; Lasky és munkatársai, Cell, 56:1045-1055 [1989]). Úgy gondolják, hogy a MEL-14 antigén/ELAM-1 limfocita irányító tulajdonságán túlmenően hat a neutrofil endotheliumhoz való kötődés kezdetén is.
A szelektinreceptorok szerkezetét és működését az összes ilyen, a receptorokat kódoló cDNS teljes hosszúságának klónozásával és expressziójával mutatták be (Bevilacqua és munkatársai, Science, supra, [ELAM-1], Geng és munkatársai, supra, [GMP-140], és Lansky és munkatársai, supra, [MEL-14 antigén]). A szelektinek extracelluláris részét három szegmensre lehet osztani, az előzőekben ismertetett proteinekkel való homológiájuk révén. Az N-terminális szakasz (körülbelül 120 aminosav) megegyezik a C-típusú emlős lektin protein családdal (Drickamer, J. Bioi. Chem., 263:9557-9560 [1988]), amely alacsony affinitású CD23 IgE receptort tartalmaz. A következő polipeptidszegmens, amelynek szekvenciája megegyezik az epidermális növekedési faktor (EGF) motívumot tartalmazó proteinek szekvenciájával. Ezután az EGF dómén után egy vagy több tandem ismétlődő motívum következik, amelyek mindegyike 60 aminosavat tartalmaz és amely azonos a komplementer szabályozó proteinek családjában találhatókéhoz.
Mivel a szelektinreceptorok lektinszerű domént tartalmaznak, a molekulák specificitása valószínűleg a protein-szénhidrát kölcsönhatáson alapul. A bizonyítékok azt jelzik, hogy a Lewis X antigén, amelyet SLXként jelölünk, szialilezett, fukozilezett N-acetil-laktózamin egysége az, amelyet a szelektinreceptor lektinszakasza felismer. A kísérletek különösen kimutatták, hogy ezt a részt mind az ELAM-1, mind a GMP-140 részek felismerik. A találmány szerinti vegyületek ezt a fukozilált, szialilezett N-acetil-laktóz-egységet különböző konfigurációkban tartalmazzák.
A találmány értelmében alkalmazott szelektív kötődés kifejezés azt jelenti, hogy az egyik molekula (itt receptor) egy másik molekulát (itt ligandum) specifikusan felismer a második molekula meghatározott helyén lévő térbeli vagy poláris elrendeződés révén. A két molekula között létrejön a szelektív kötődés, ha az affinitás eléggé erős. A kötési affinitást az affmitási konstanssal (Ka) jelöljük, amely a kapcsolódott és nem kapcsolódott konfigurációk egyensúlyi koncentrációjára vonatkozik, azaz Ka=[R-L]/[R]-[R]-[L] ahol [R], [L] és [R-L] jelentése a receptor (R), a ligandum (L) és a receptorligandum komplex (R-L) egyensúlyi koncentrációja.
A receptorok és a ligandummolekulák közötti specifikus kötődési kölcsönhatások közé tartoznak a reverzibilis nemkovalens kapcsolatok, így például elektrosztatikus vonzások, Van dér Waals erők, valamint hidrogénkötések általánosságban lásd (Stryer, Biochemistry, W. H. Freeman and Company, N. Y. 3. kiadás, 1988). A szelektív kötődések közé tartoznak például az antitest-antigén felismerések, az enzim-szubsztrátum felismerések stb.
Az oligoszacharid részek leírásánál alkalmazott nómenklatúra megegyezik a szokásos nómenklatúrával. Az egyes monoszacharidok számára a szokásos rövidítéseket alkalmazzuk. így például 2-N-acetil-glükózamint GlcNac-ként, a fúkózt Fuc-ként, a galaktózt Gálként, és a glükózt Glc-ként jelöljük. A két szialsav, amely a találmány szerinti oligoszacharidokon jelen lehet az 5-N-acetil-neuraminsav (NeuAc) és az 5-Nglükolil-neuraminsav (NeuAc). Hacsak másképp nem jelöljük, mindegyik cukor, kivéve a fukózt (L-izomer), D-izomer a ciklusos konfigurációban (például piranóz vagy furanóz). A ciklusos forma két anomeijét a és β jelöléssel látjuk el.
A monoszacharidok általában glükozidkötéssel kapcsolódnak, és így alakul ki az oligo- és poliszacharid. A kötések orientációját a gyűrű síkjához viszonyítva a4
HU 216 312 Β val, illetve β-val jelöljük. Megjelöljük a szénatomokat is, amely a két monoszacharid közötti kötést létesítik, így például a galaktóz C-l és a glükóz C-4 szénatomja közötti β glükozidkötést GalBl, 4Glc-ként jelöljük. A D-cukrok esetén (például D-GlcNAc, D-Gal és GNeuAc) az a jelölés azt jelenti, hogy a C-l (NeuAc esetén C-2) szénatomhoz kapcsolódó hidroxil a gyűrű síkja alatt van, illetve a B azt, hogy a gyűrű síkja felett van. Az L-fukóz esetében az a jelölés azt jelenti, hogy a hidroxil a gyűrű síkja felett, a B jelölés pedig azt, hogy a gyűrű síkja alatt van.
Miután az SLX-et szénhidrát ligandumként azonosítottunk, amely közvetíti a leukocita-endothelium és leukocita-vérlemezke sejtadhéziót, az SLX-et tartalmazó vegyületeket, valamint hasonló szerkezeteket de novo tisztíthatunk vagy szintetizálhatunk. Mint a következőkben látni fogjuk, a találmányunk számos vegyületet biztosít, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti szelektinmegkötő részt. így például biomolekulákat alkalmazhatunk mint molekularész-hordozó vegyületet. A biomolekulák ilyen megnevezése magában foglalja a korlátozás szándéka nélkül a biológiailag szignifikáns molekulákat, így például az aminosavakat (és ezek utánzóit), oligopeptideket, proteineket (például glükoproteinek és protein hormonok), zsírsavakat, lipideket (például glükolipidek, foszfolipidek, sfingolipidek és gangliozidok), szteroid hormonokat, oligoszacharidokat, poliszacharidokat és nukleinsavakat (például dezoxiribonukleinsav és ribonukleinsavak). Ezeket a vegyületeket a szakember számára ismert szokásos eljárásokkal nyerhetjük és/vagy szintetizálhatjuk. Továbbá, a molekularészt hordozó vegyületek széles skáláját állíthatjuk elő de novo a következőkben leírtak szerint.
Az ilyen vegyületeket különböző célokra használhatjuk, beleértve például az SLX-hordozó sejteknek a szelektinreceptorokat expresszáló sejtekhez való kötésének kompetitív gátlására. A találmány szerinti vegyületeknek a sejtfelületi szelektinhez való kötődésével meggátoljuk a szelektin és a migráló sejten lévő natív SLX ligand közötti egymásra hatást, meghiúsítva a leukociták és más sejtek normál és patológiai kötődését az endotheliumhoz vagy a vérlemezkékhez. így azok a vegyületek, amelyek egy vagy több szelektinmegkötő részt tartalmaznak, hatásos inhibitorként szolgálnak például gyulladásos folyamatok, aterosclerosis, alvadásos vagy más endoteliális vagy vérlemezke-közvetített patológiás elváltozások esetén.
Az SLX-ben lévő szialsavcsoport különböző formában lehet jelen addig, amíg a szelektinkötés szignifikánsan nincs befolyásolva. A szialsav tipikusan 5-N-acetilneuraminsav (NeuAc) vagy 5-N-glikolil-neuraminsav (NeuGc). Ezek helyén azonban más szialsavak is alkalmazhatók. A szialsavak különböző formáit, amelyek a jelen találmánynál felhasználhatók, általánosságban például a következő irodalmi helyen ismertetik: R. Schauer, Methods in Enzimology, 50:64-89 (1987) és Schaur, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 40:131 -234. Mint azt majd a IX. példában bemutatjuk, a szelektinreceptorok affinitása azonos, ha az oligoszacharid NeuAc-re vagy NeuGc-re végződik. így az „SLX” kifejezés a minimális tetraszacharid egységre vonatkozik (szialsav a2, 3GalBl,4[Fucal,3]GlcNA[Bl,3]), amelyben a szialsav NeuAc, NeuGc vagy más ekvivalens szialsav forma. A bemutatott szerkezetek, amelyek a NeuAc szialsavcsoportot tartalmazzák, vonatkoznak ezen többi formákra is, különösen azokra, amelyek az NeuGc-t tartalmazzák.
Kísérletekkel igazoltuk, hogy a következő képletnek megfelelő pentaszacharid egy minimális szerkezet, amely lényegesen nagyobb inhibíciós hatással rendelkezik, mint a tetraszacharid: NeuAca2, 3GalBl,4[Fucal,3] GlcNAcBl,3GalB-. így bizonyos előnyös kiviteli formáknál az oligoszacharid ezt a pentaszacharid szerkezetet tartalmazza.
Az alap SLX egység más egyéb variációit szintén felismerik a szelektinreceptorok. így például a VIII. példában bemutatottak szerint az SY2-ként jelölt oligoszacharid molekula (VIM-2 antigénként is ismert), amelynek szerkezete a következő: NeuGca2,3GalBl, 4GlcNacBl ,3GalBl ,4[Fucal ,3]GlcNAcBl ,3GalBl ,4 GlcB, hasonlóképpen kötődik a szelektinreceptorokhoz, mint az SLX. Az SY2 rész két szialilezett N-acetil-laktóz-amin egységet tartalmaz, amelynek egyike az SLX. így a szelektinreceptorok által felismert oligoszacharidok tartalmazhatnak több szialilezett N-acetil-laktózamin egységet, amelyek közül legalább egy fukozilezett (Teimeyer és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:1138-1142 [1991]).
A találmány szerinti oligoszacharid részek előnyösen szialsavcsoportra végződnek. Bizonyos kiviteli formáknál a szialsavcsoport még tovább kapcsolódhat egy másik szacharidcsoporthoz, így például egy második szialsavcsoporthoz a2,8 kötéssel.
Egy másik megoldásnál a terminális szialsavcsoportot más különböző gyökök helyettesíthetik. így például bizonyos szelektinmegkötő részeket a következő III általános képlettel írunk le:
RrNeuAca2,3GalBl ,4GlcNAcB 1 -, III amely képletben
Rí jelentése II általános képletű csoport,
R3 COOH \ I
C-csoport II /
R4 amely képletben
R2 és R3 jelentése azonos vagy különböző és lehet H,
1-8 szénatomos alkil-, hidroxi-1-8 szénatomos alkil-, vagy alkoxi-alkil-csoport, vagy
R2 és R3 együttesen egy 4-8 tagú karbociklusos vagy heterociklusos gyűrűt is jelenthet.
Az SLX és más hasonló szerkezeteket különböző sejtekből a sejtfelületi glükoproteinekből vagy glükolipidekből nyerhetjük. így például az SLX antigén jelen van az LÉC 11 sejtek, a CHO sejtek glükozilációs mutánsának N-kötésű szénhidrátcsoportjain. Az LEC11 expresszálja ezt a különleges glükopeptidet, amely egy terminális szerkezetet tartalmaz, amely az SLX szekvenciában mind szialsavat, mind fukózt tartalmaz:
HU 216 312 Β
NeuAca2,3GalBl ,4GlcNAcB 1-R |al,3 Fuc ahol R jelentése
2Man Fuc
|«1,6 |al,6
ManB 1,4GlcN AcB 1,4GlcNAcB 1, Asn
|al,4 (±SLX)Bl,2Man (lásd Stanley és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263:11374 [1988]). A következőkben ismertetett eljárás alkalmazásával kimutattuk, hogy az LEC11 mutáns az aktivált humán vaszkuláris endoteliális sejtekhez kötődött. Sem a természetes eredetű CHO sejtek, sem más hasonló glükozilált mutáns CHO sejtvonalak, amelyek nem tartalmazzák a különleges glükolizációs mintát (SLX), nem mutatnak hasonló szintű kötődést.
Az egyéb források közé, amelyekkel az SLX egységeket előállíthatjuk, tartozik bármely sejt, amely természetből expresszálja a molekularészt a glükolipid vagy glükoprotein szénhidrátcsoportokon. Ilyenek például a polimorf magú neutrofilek, limfociták, tumorsejtek vagy HL-60 sejtek, amelyeket ezen egység kinyerésére alkalmaznak. Más egyéb sejtek is, amelyek kapcsolódnak az aktivált vaszkuláris endotheliumhoz, szintén alkalmazhatók a ligandum izolálására (Symington és munkatársai, J. Immunoi. 134:2498-2506 [1985], Mizoguchi és munkatársai, J. Bioi. Chem. 259:11940-11957 [1984], Mizoguchi és munkatársai, J. Bioi. Chem. 259:1194311948 [1984], Paietta és munkatársai, Cancer Rés. 48:28-287 [1988]).
Az SLX-et vagy annak utánzóját tartalmazó vegyületeket előállíthatjuk természetes forrásokból ismert eljárások szerint, amelyeket felületi glükoproteinek, glükopeptidek, oligoszacharidok és glükolipidek elválasztására alkalmaznak sejtekből (Gerard, Purification of glycoproteins, és Thomas és munkatársai, Purification of membráné proteins, Guide to Protein Purification, 182. kötet, Methods in Enzymology (német kiadás, [1990]). így például az LEC11 sejteket alkalmazhatjuk az olyan glükoproteinek vagy glükolipidek előállításához, amelyek az SLX egységet tartalmazzák, például Stanley és munkatársai fentiekben hivatkozott publikációjában leírtak szerint. Röviden, ennél úgy járunk el, hogy az LEC11 sejtet a vesicular stomatitis vírussal megfertőzzük. Az LÉC 11 által kimutatott szerkezeti szénhidrát módosulatokat ezután a vírus G glükoproteinjének N-kapcsolású biantennáriás szénhidrátján expresszáljuk. A vírust egyensúlyi gradiens centrifugálással elválasztjuk, a glükopeptideket proteináz emésztés alkalmazásával kinyerjük Stanley és munkatársai módszere szerint.
Különböző módszereket alkalmazunk a szelektinmegkötő rész elválasztására a HL-60, HT-29, colo 205, neutrofil és más egyéb sejtvonalakból, amelyek a szelektinek által felismert ligandumot tartalmazzák. Mivel a ligandum általában ezen sejttípusok sejtfelületén expresszálódik, az egyik megoldás szerint a ligandumban gazdag plazmamembrán frakciót izoláljuk. Ha egyszer már a plazmamembránokat izoláltuk, a ligandumokat elválaszthatjuk, majd ezt követően monoklón antitestekkel azonosítjuk, különösen olyanokkal, amelyek az SLX oligoszachariddal és a hasonló szerkezetekkel reakcióképesek, így például az FH6, SNH3 és CSLEX1 monoklón antitesteket alkalmazhatjuk.
A szelektin ligandumnak a glükoproteinben való jellemzésénél az oligoszacharid lánc szerkezeti analízisében általában az első lépés az oligoszacharid felszabadítása. Ezt a protein-szénhidrát kötés kémiai hasításával vagy pedig endoglükozidázokkal végzett specifikus felszabadítással végezzük. A legtöbb esetben különböző eljárások alkalmazhatók az egyes glükproteinekhez szükséges pontos körülmények meghatározásához. Az asszparagin-kötésű oligoszacharidok hidrazinolízissel, endoglükozidázokkal, erőteljes alkálikus hidrolízissel és trifluor-acetolízissel szabadíthatok fel. Az O-kapcsolású szénhidrát egységek alkálikus vagy β-eliminációval szabadíthatok fel. Az oligoszacharidokat a glükopeptidektől gélszűréssel választjuk el. A kapott oligoszacharidokat ezután egymástól gélszűrés, HPLC, vékonyrétegkromatográfia és ioncserés kromatográfia kombinációjával választjuk el. Az elválasztott oligoszacharidokat ezután teljes analízisnek vetjük alá. Az elválasztott oligoszacharid egységek teljes szerkezeti analíziséhez szükséges a monoszacharid egységek, ezek gyűrű formájának, konfigurációjának (D vagy L) az anomer kötések (a vagy B), a cukrok között lévő kötések, valamint ezek szekvenciájának meghatározása. Továbbá, megállapítjuk bármely szubsztituens csoport helyzetét is. A monoszacharidok közötti glükozidos kötések helyzetének meghatározásához metilezéses analízist alkalmazunk. A cukorcsoportok anomer konfigurációj át 500 - M Hz1H -NMR-spektroszkópiával határozzuk meg. A teljes szerkezeti szénhidrát analízis körülményeit és a módszereket általánosságban a következő irodalmi helyen ismertetik: (Beeley, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, kiadók Burdon és Knippenberg, Elsevier, Amsterdam 1985).
A technika állása szerint, egy oligoszacharid cukrainak teljes jellemzésére szolgáló analitikai eljárások közé tartoznak például a következők: FAB-MS (gyors atombombázásos spektrometria), HPAE (magas pH-jú anioncserélő kromatográfia) és Ή-NMR. Ezek az eljárások egymást kiegészítik. Az utóbbi időkben ismertetett példák arra, hogy hogyan lehet egy oligoszacharid szerkezetének teljes jellemzését elvégezni, például a következő publikációban vannak összefoglalva: (Spellman és munkatársai, J. Bioi. Chem. 264:14100 [1989] és Stanley és munkatársai, supra). Az egyéb módszerek közé tartoznak továbbá a pozitív ion gyors atombombázásos spektroszkópia (FAB-MS), valamint a metilezési analízis gázkromatográfiával, továbbá az elektronbombázásos tömegspektroszkópia (GC/EI-MS), mint azt például a 89305153.2 számú európai szabadalmi bejelentésben ismertetik.
A glükolipidek szelektin ligandjának jellemzésénél az egyik módszer szerint úgy járhatunk el, hogy a sejteket szerves oldószer alkalmazásával összetörjük, elvá6
HU 216 312 Β lasztjuk a glükolipideket, majd ezeket SLX-szel szemben monoklón antitestekkel reagáltatva azonosítjuk, monoklón antitestként például a következőket lehet alkalmazni: FH6, SNH3, SNH4, CSELEX-1 vagy VIM2, majd meghatározzuk az oligoszacharid lánc szerkezetét. Az SLX-tartalmú glükolipidek és gangliozidok előállításához a glükolipid készítményekhez alkalmas ismert eljárásokat lehet alkalmazni (például Leeden és munkatársai, J. Neurochem. 21:829 [1973]). így például a glükolipideket a következő sejtekből extraháljuk: HL-60, HT-29, PMN sejtek, humán leukociták és más sejtvonalak, amelyek a szelektin ligandumot expresszálják, ezen extrakcióhoz a szakterületen ismert módszerek alkalmazhatók: például (Symington és munkatársai, J. Immunoi. 134:2498 [1985] és Macher és Beckstead, Leukémia Rés. 14:119-130 [1990]). A sejteket szuszpenzióban növesztjük, majd centrifugálással elválasztjuk. A glükolipideket a sejt pelletből kloroform/metanol=2/l és izopropil-alkohol/hexán/víz= 55/25/20 eleggyel extraháljuk Kannagi és munkatársai módszere szerint (Kannagi és munkatársai, J. Bioi. Chem. 257:14865 [1982]). A kapott extraktumokat ezután kloroform/metanol/víz=3/2/l eleggyel megosztjuk, Folch-megosztással. A kapott felső fázis tartalmazza a gangliozidokat, és az alsó fázis a glükolipideket.
A gangliozidokat (glükoszfingolipidek, legalább egy szialsav részt tartalmaznak) tartalmazó felső fázist elválasztjuk és semleges és savas frakcióra osztjuk meg DEAE-Sephadex kromatográfia alkalmazásával Leeden és Yu módszere szerint (Leeden és Yu, Methods Enzymol. 83:139 [1982]). A kapott gangliozidokat egyesítjük, liofilizáljuk, majd kloroform/metanol=2/l elegyben oldjuk. A Folch-megosztás alsó fázisa tartalmazza a glükolipideket. Ezeket elválasztjuk és preparatív vékonyrétegkromatográfíával kloroform/metanol/víz=60/35/8 oldószerelegy alkalmazásával szeparáljuk Symington módszere szerint.
A szelektin ligandumokat tartalmazó gangliozidok és glükolipidek azonosításához immunokémiai glükolipid analízist végzünk Magnani és munkatársai módszere szerint (Magnani és munkatársai, Anal. Biochem. 109:399 [1980]). Ennél úgy járunk el, hogy a fentiek szerint nyert gangliozidot tartalmazó anyagot vékonyréteg-kromatográfiának vetjük alá, majd a vékonyréteg lemezt l25I-vel jelzett CSLEX-1 vagy más monoklón antitest jelenlétében, amely specifikusan kötődik az SLX-hez vagy más azonos szerkezethez, inkubáljuk. A jelzett antitesttel végzett inkubálást követően a lemezeket radiográf detekciós filmmel exponáljuk, majd előhívjuk. A röntgenfilmen megjelenő fekete pontok felelnek meg a monoklonális antitesthez kötött gangliozidoknak, ezeket a szilícium-dioxid-lemez megfelelő részeiről történő lekaparással kinyerjük és a gangliozidokat kloroform/metanol/víz eleggyel eluáljuk. A glükolipideket szintén megszárítjuk, majd kloroformban ismételten szuszpendáljuk és hasonlóan vékonyréteg-kromatográfiával elválasztjuk és radiojelzett antitesttel ellenőrizzük. A glükolipidekből származó oligoszacharidok szerkezeti analízisét lényegében a glükoproteinek számára előírtak szerint végezzük.
Az SLX egységet tartalmazó oligoszacharidokat a szakterületen ismert módszerek szerint glükoproteinekből állítjuk elő (lásd például Gerard, supra, 537-539). Az N-kötésű oligoszacharidok hasításához N-glükozidáz F (N-glikanáz) enzimet alkalmazunk, míg az O-kötésű csoportokat endo-acetil-galaktóz-aminidáz alkalmazásával hasítjuk.
Az SLX egységet vagy ennek utánzóját tartalmazó szintetikus vegyületeket, amelyekben ezen csoportok a legkülönbözőbb molekularészeknél kapcsolódhatnak, a kívánt felhasználási céltól függően állítjuk elő. így például az SLX csoportot ganglioziddá alakíthatjuk úgy, hogy a ceramidcsoportot a redukáló terminális GlcNAc egység C-l helyén kapcsoljuk. Az SLX szerkezetek, valamint más hasonló szerkezetek azonban a legkülönbözőbb más csoporthoz is kapcsolódhatnak, így például a különbözőképpen szubsztituált amincsoportokhoz, heterociklusos csoportokhoz, éterkötésekhez, amelyek egyenes vagy elágazó láncú szénláncon vannak, éterkötésekhez, amelyek aril- vagy alkil-aril-csoportokon helyezkednek el. A szelektinmegkötő csoport kapcsolódhat különböző poliszacharidokhoz, aminosavakhoz, aminosavutánzókhoz, oligopeptidekhez vagy proteinekhez is, ezek előállításához szintén ismert eljárások alkalmazhatók.
Az alkilcsoport kifejezés magában foglal bármely egyenes vagy elágazó láncú, telített vagy telítetlen szénhidrogénláncot, így például az 1-8 szénatomos alkilcsoportokat, így például a metil-, etil-, η-propil-, butil-, n-hexil- stb. csoportokat, 3-7 szénatomos cikloalkilcsoportokat, 4-8 szénatomos cikloalkil-metil-csoportokat. Az arilcsoport kifejezés magában foglal bármilyen aromás szénhidrogéncsoportból származtatott csoportot, amelyet egy atom eltávolításával nyerünk, így például lehet a benzolból származtatott fenilcsoport. Az aromás szénhidrogéncsoportok lehetnek egy vagy több telítetlen gyűrűsek, így például lehet naftilcsoport. Az alkoxicsoport kifejezés magában foglalja mindazon alkilcsoportokat, amelyek egy oxigéncsoporton keresztül kapcsolódnak, így például lehet etoxicsoport. A heterociklusos vegyület magában foglal minden gyűrűs vegyületet, amely 3 vagy több atomból áll, és amelyeknél legalább egy atom szénatomtól eltérő, így például N, O, S, Se, P vagy As atom. Ilyen vegyületek közé tartoznak például a furánok, pirimidinek, purinek, pirazinok stb. Az oligo kifejezés magában foglalja mindazon polimer molekulákat, amelyek 2- körülbelül 10 csoportból állnak, például aminosavból (oligopeptidek), monoszacharidokból (oligoszacharidok), valamint nukleinsavakból (oligonukleotidok). A poli kifejezés utal mindazon polimer molekulákra, amelyek több, mint 10 tagból állnak.
A szelektinmegkötő rész többértékű formáinak előállításához az SLX egységet tartalmazó monomer egységeket vagy más szerkezeteket kapcsoljuk egymáshoz, és így nyerünk olyan molekulákat, amelyek 1 - körülbelül 4 vagy még több szelektinmegkötő részt tartalmaznak. Példaképpen megemlítünk egy többértékű formát, amelynél az egységek a következő képletnek megfelelően kapcsolódnak egymáshoz:
Υ Υ
II II V
-NH-C-NH-(CH2)„-NH-C-NH- vagy Υ Υ
II II νι
-NH-C-NH-(CH2)n-W-(CH2)m-NH-C-NH amely képletekben m és n értéke azonos vagy különböző és lehet 2-12 közötti szám, Y jelentése O vagy S és W jelentése O, S vagy NH.
Egy másik formánál az említett molekularész 5-14 tagú gyűrű, amely kétszeresen szubsztituált a következő csoporttal:
Y
II VII
-NH-C-NHamely képletben Y jelentése O vagy S és a szubsztituens a cisz- vagy transz-helyzetben helyezkedik el.
Az SLX egységek vagy más azonos szerkezetek különböző heterociklusos vegyületekhez, így például amelyek nitrogénatomot tartalmaznak, is kapcsolódhatnak. Ebben az esetben az egység előnyösen a gyűrűn lévő nitrogénatomokhoz kapcsolódik úgy, hogy mindegyik nitrogénatomhoz egy-egy egység csatlakozik. Ilyen heterociklusos vegyület lehet például a piperazin és a homopiperazin.
Más módszer szerint az SLX egység vagy más hasonló szerkezet többértékű formáját előállíthatjuk úgy is, hogy a kívánt részt az előre kialakított hordozórészhez kapcsoljuk, amely több kapcsolási helyet tartalmaz.
így kapcsolhatjuk az SLX csoportot például a lizin, a lizintartalmú peptidek, proteinek, glükoproteinek vagy ilyen vegyületek aszparagin oldalláncának aminocsoportjaihoz.
Egy másik módszer szerint a többértékű szelektinmegkötő vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy a kívánt monoszacharidcsoportot a poliszacharidokhoz adagoljuk. így például az olyan poliszacharidot, amelyben lévő ismétlődő egység az SLX lineáris magszerkezetével rendelkezik (azaz fukózcsoport nélküli), úgy alakíthatjuk a többértékű, SLX-tartalmú poliszachariddá, hogy enzimes úton fukoziláljuk. Erre a célra előnyösen a B Streptococcus csoportból nyert la, II vagy III típusú natív poliszacharidot alkalmazzuk. Ezek a poliszacharidok ismert módszerekkel izolálhatok a sejtvonalakból, amelyek az American Type Culture Collection-nél vannak deponálva (la típus: ATCC No. 12400 és 31574, II típus: ATCC No. 12973 és 31576 és III típus: ATCC No. 31577) (Jennings és munkatársai, Biochem. 22, 1258-1263 [1983], valamint a 8706267 számon közzétett PCT bejelentés).
Ezek a poliszacharidok a következő képletnek megfelelő ismétlődő egységeket tartalmazzák :
la típus:
NeuAca2,3GalBl ,4GlcNAcBl ,3GalBl,4—>
|B1,4
Glc
T
II típus:
1· X
NeuAca2,3GalB 1,4GlcNAcB 1,3GalB 1,4GlcB 1,3GlcB 1,2-> IBI,6 Gál
III típus:
I
Glc |B1,6
NeuAca2,3GalB 1,4GlcNAcB 1,3GalBl ,4->
A fenti szerkezetekben a nyilak jelzik a poliszacharid molekulákban a váz szerkezetet. Mint az látható, az la típusú poliszacharidok olyan ismétlődő egységet tartalmaznak, amelyek oldallánca megfelel az SLX lineáris magszerkezetének. A másik két poliszacharid esetén a váz tartalmazza az SLX magszerkezetet. Ezen poliszacharidok enzimatikus fukozilálásával, amelyhez a 1,3 fukozil-transzferázt alkalmazunk, nyeljük a többértékű SLX vegyületet ismert módszerek szerint. A fukozilálás után az ismétlődő egységek a következő képletnek felelnek meg:
la típus:
NeuAca2,3GalB 1,4(Fuca 1,3)GlcNAcBl ,3GalB 1,4->
IBI,4
Glc
T
II. típus:
I
NeuAca2,3GalBl ,4(Fucal,3)GlcNAcBl ,3GalBl ,4GlcBl ,3GlcBl,2-> |B1,6 Gál
ΠΙ. típus:
Glc |B1,6
NeuAcot2,3GalBl,4(Fucal,3)GlcNAcBl,3GalBl,4—>
HU 216 312 Β
Erre a célra a teljes poliszacharid vagy annak fragmensei egyaránt alkalmazhatók, így például 5000 és 300 000 közötti, előnyösen 25 000 és 100 000 közötti molekulatömegű poliszacharidokat alkalmazunk. Az la típusú poliszacharid bármelyik oldallánca fukozilálható az aktív poliszacharid előállítása céljából, általában 5-200, előnyösen 50-150 oldalláncot fukozilálunk.
A szelektinmegkötő rész szintézisét végezhetjük kémiai, enzimatikus vagy kombinált kémiai és enzimatikus módszerekkel (lásd például a 319253 számú európai közzétételi iratot). Egy előnyös módszernél (lásd A reakcióvázlat) egy 1 vagy több N-acetil-glükózamid egységet (GlcNAc-R) tartalmazó vegyületet reagáltatunk egymást követően egy galaktozil-transzferázzal (N-acetil-glükózamin 61,4 galaktozil-transzferáz [E. C. 2.4.1.90], egy szialil-transzferázzal [GalBl,4GlcNAca2,3] szilalil-transzferáz [E.C. 2.4.99.6] vagy GalBl,3GalNAca2,3 szilaliltranszferáz [E. C. 2.2.99.4]) és egy fukozil-transzferáz (N-acetil-glükózaminid «1,3 fukozil-transzferáz [E. C. 2.4.1.152], amikor is a végső, SLX-tartalmú szerkezetet nyerjük. Ebben az esetben R jelentése lehet egy hordozó molekularész vagy egy aktiválható köztitermék, amely lehetővé teszi a megfelelő hordozóhoz való kötést. Mindegyik enzimatikus reakciónál a megfelelő nukleotid cukrot alkalmazzuk donor szubsztrátumként a következő intermedier kialakítása céljából az SLX szintézise során. A glükozil transzferáz reakciókat legelőnyösebben alkálikus-foszfatát adagolásával végezzük (például boíjúbélből származó, CIAP) annak érdekében, hogy a nukleozidfoszfát mellékterméket megkössük, amely a reakciót gátolja.
GicNac-R
UDP-Gai -J
UDP - —
Gaf01.4GicNac-R
CMP-NeuAc _J
CMP · —Ί
NeuAca2.3Gaipi ,4GlcNac-R GDP-Fuc — U
GDP*· 4 NeuAca2.3Gal01.4
GteNac-R (SLX-R)
I
FucálJ
A reakcióvázlat
Az SLX csoporttal analóg szénhidrátcsoportok preparatív enzimatikus szintézisének általános körülményei ismertek (Toone és munkatársai, Tetrahedron 45:5365-5422 [1989]; Wong és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 47:5416-5418 [1982]; Unverzagt és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 112:9308-9309 [1990]; Prieels és munkatársai, J. Bioi. Chem. 256:1045610463 [1981]). Mindegyik kulcsfontosságú enzimatikus reakciót már bemutatták (Beyer és munkatársai, Adv.
Enzymol. 52:23-176 [1981]; Toone és munkatársai, supra, Howard és munkatársai, J. Bioi. Chem. 262: 16830-16837 [1981]). A preparatív reakciókhoz a galaktozil-transzferázt és a szialil-transzferázt vagy -transzferázokat természetes forrásokból nyerik ki (Beyer és munkatársai, supra, és Weinstein és munkatársai, J. Bioi. Chem. 257:13835-13844 [1982]). A fukoziltranszferázt szintén természetes forrásokból lehet nyerni, mint azt Crawley és Hindsgaul ismertetik (Crawley és Hindsgaul, Carbohyd. Rés. 193:249-256 [1989]). A galaktozil-transzferáz és a szialil-transzferáz cDNSjeit klónozták (Paulson és Colley, J. Bioi. Chem. 264:17615-17618 [1989]), ez lehetővé teszi az oldható rekombináns enzimek előállítását a nagyipari preparatív szintézishez (Colley és munkatársai, J. Bioi. Chem. 264:17619-17622(1989]).
A nagyipari előállításhoz szükséges elegendő mennyiségű fukozil-transzferáz előállításához az enzimet klónozzuk és rekombináns, oldható enzimként expresszáljuk valamely, a szakterületen ismert eljárás szerint. Egy előnyös módszernél az RNS-t a természetes típusú CHO sejtekből és LÉC 11 sejtekből nyeljük ki Chirwing és munkatársai módszere szerint (Chirgwin és munkatársai, Biochemistry 18:5213-5299 [1979]), és a poli A+RNS-t kromatográfiával izoláljuk oligo(dT)cellulózon. Az LEC11 sejtekből a cDNS-t Sambrook és munkatársai módszere szerint nyerjük (Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, [1989]; Cold Spring Harbor Press, New York). A cDNS-t Davis módszere szerint vonjuk ki (Davis, Handbook of Experimental Immunology, 2. kötet, 1-13 [1986]), feleslegben alkalmazott, a természetes típusú CHO sejtekből származó poli A+RNS alkalmazásával, amely nem expresszálja a kívánt fukozil-transzferázt, de egyébként tartalmazza az LÉC 11 sejtek legtöbb mRNS faját. A cDNS könyvtárat ezután a CDM8 expressziós vektorban konstruáljuk, a kivont cDNS felhasználásával (Seed, Natúré, 329:840-842 [1987]). A fukozil-transzferázt expresszáló kiónokat az expressziós klónozási módszerrel izoláljuk (Larsen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 86:8227-8231 [1989]), amelyhez COS-1 sejtek transzfekcióját alkalmazzuk, majd kinyerjük az SLX antigént expresszáló sejteket a CSLEX antitest vagy más, az SLX antigénre specifikus antitest alkalmazásával. A fukozil-transzferáz teljes hosszúságú kiónját alkalmazhatjuk ezután az oldható rekombináns enzim előállításához (Colley és munkatársai, supra).
Egy másik SLX forrás az a!-sav glükoprotein, amely egy plazma glükoprotein, amelynek szénhidrát-részét lehet fukozilálni az SLX előállítása céljából (Alpha-Acid, glycoprotein: Genetics, Biochemistry, Physiological Functions, and Pharmacology, Bauman és munkatársai, kiadó [Wiley 1989], és Walz és munkatársai, Science 250:1132-1135 [1990]).
Bár az enzimatikus vagy a kombinált kémiai és enzimatikus szintézis az előnyös az SLX vegyületek előállítására, ezeket kémiai szintézissel is előállíthatjuk, ezeket az eljárásokat a B és C reakcióvázlaton mutatjuk be.
Az SLX szerkezet alkotó darabjait előállították. így például a glükozidokat tartalmazó szialsav, amely az SLX-et is tartalmazza, előállítása az EP 319253A2-es számon közzétett európai szabadalmi bejelentésben van ismertetve. Nicolau és munkatársai (Nicolau és munkatársai, J. Amer. Chem. Soc., 112:3683 [1990]) egy teljes szintézist ismertetnek a glükoszfmgolipidek tumorral kapcsolatos Lex családjának előállítására. Ennél a védett triszacharid GalBl,4(Fucal,3)GlcNAc (A) szintézisét írják le, mint azt a B reakcióvázlaton bemutatjuk. Ezen intermediert a megfelelő glükozil akceptorral (például egy alkoholcsoport) reagáltatva nyerjük a B vegyületet. A glükózamin-rész szelektív védőcsoport eltávolításával és acetilezésével, mint azt lényegében Nicolau leírja, nyerjük a C vegyületet. A C vegyületet szialil-transzferázzal reagáltatva nyerjük a kívánt SLX-R vegyületet, bár itt a B reakcióvázlat szerint eljárva relatíve kis kihozatalt érünk el.
Ennél a szintetikus eljárásnál módosított fukozidokat is alkalmazhatunk, így nyerjük az SLX analógokat, amelyek ebben a csoportban különböznek egymástól. így például α-D-arabinozil-glükozidokat állíthatunk elő ismert eljárásokkal (Nicolau és munkatársai, J. Amer. Chem. Soc. 112:3693-3695 [1990]) a tri-O-benzil-arabinozil-halogenideken keresztül. Más C-5 aril vagy alkil-szubsztituált arabinozil-molekulákat állíthatunk elő Danishefsky és munkatársai módszere szerint (Danishefsky és munkatársai, J. Amer. Chem. Soc., 107:1274 [1985], Danishefsky, Aldrichimica Acta. 19:59-68 [1986]) és vezethetjük be hasonlóképpen a diszacharidba.
A C reakcióvázlat szerint az (A) képletű triszacharidról a védőcsoportokat részlegesen eltávolítjuk, így nyerjük a D képletű vegyületet, amelyet ezután a peracetilezett szialsav-metilészterrel ([E] vegyület) reagáltatunk Kameyama és munkatársai módszere szerint (Kameyama és munkatársai, IV. Inti. Carbohyd. Symp., Abst. No. A096, [1990], és Carbihydrate Rés., 209: c 1 - c4 [ 1991 ]), így nyeljük az (F) képletű vegyületet kromatográfiás tisztítás után. Ezt a vegyületet ezután metil-hidrazinnal kezelve N-acetilezve, O-dezacetilezve és észter-hidrolízist végezve nyerjük az SLX-R vegyületet.
A B és C reakcióvázlatokon R előnyös jelentései például a következők: alkilcsoport (egyenes vagy elágazó láncú, telített, mono- és poli-telítetlen); szerin (D vagy L); szerintartalmú peptidek; di- és trialkanolaminok (például Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978, és Cuatrecasas, J. Bioi. Chem. 245 3059 [1970], ahol N jelentése 2-20 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú, telítetlen mono- és poli-telítetlen lánc). R jelentése lehet továbbá arilcsoport, szubsztituált arilcsoport (szubsztituens például Me, OH, I; önmagában vagy kombinációban, amely l25I-t tartalmaz), alkil-aril-, aril-alkilvagy más egyéb csoport, amely a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvalóan a kívánt célra alkalmas. A jód bevezetése a fenolos csoportokba, így például a tirozidba, a szakterületen ismert. A fenolokat tartalmazó gyökös csoportok alkalmasak a 125i radioizotóp bevezetésére, így diagnosztikai célra alkalmas vegyületeket nyerünk.
Az SLX egységet vagy más megfelelő szerkezetet tartalmazó vegyületek alkalmazhatók továbbá olyan egyéb vegyületek kimutatására, amelyek képesek a szelektinek által közvetített intercelluláris adhéziót gátolni. Számos módszer alkalmazható a vizsgálandó vegyületek azon biológiai aktivitásának kimutatására, hogy képesek a szelektinközvetített folyamatokat gátolni. Ideális esetben a jelen találmány szerinti vizsgálat lehetővé teszi nagyipari méretekben a különböző vegyületek in vitro vagy in vivő kiválasztását.
A kiválasztandó szer vagy tesztvegyület tipikusan egy szintetikus vagy természetben előforduló biomolekula, így például egy peptid, polipeptid, protein (például monoklón antitest), egy szénhidrát (például oligoszacharid), egy glükokonjugátum, nukleinsav vagy más hasonló. A vegyületek szintetikus előállításához például a fentiekben ismertetett, az oligoszacharidok előállítására alkalmas eljárás alkalmazható (lásd még Khadem, Carbohydrate Chemistry, Academic Press, San Diego, CA, 1988). A meghatározott összetételű polipeptidek előállítására alkalmas eljárások a szakterületen ismertek (Atherton és munkatársai, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989). Ha a szintetikus tesztvegyület egy polimer (például polipeptid vagy poliszacharid), azt előnyösen szisztematikus úton változtatjuk meg a monomerek szekvenciájának azonosítására, amely monomerek a kívánt hatással rendelkeznek (US 4833 092). A tesztvegyületet elválaszthatjuk természetes forrásból is, így például állati, növényi, gomba- vagy bakteriális sejtből a fentiekben ismertetett ismert eljárások szerint. A potenciálisan alkalmas monoklón antitesteket szintén ismert módszerekkel, például a következőkben ismertetett módszerekkel állíthatjuk elő.
A találmány szerinti vizsgálati eljárás különösen alkalmas olyan vegyületek azonosítására, amelyek antagonistaként hatnak vagy a ligandummolekula agonistái. Antagonisták azok a vegyületek, amelyek megfordítják a ligandum fiziológiai hatását vagy kizáiják, hogy ezen ligandum a receptorhoz kötődjön. Egy antagonista általában közvetlenül vagy közvetve versenyben van a ligandummal a receptorhoz való kötődésben és így csökkenti a receptorhoz között ligandummolekulák arányát. Általában egy antagonista a természetes ligandum topográfiai ekvivalense és közvetlenül versenyben van a ligandummal a szelektin kötési helyeiért. Az ilyen vegyületeket említjük „utánzóként”. Egy SLX utánzó egy olyan molekula, amely szerkezetileg és funkcionálisan helyettesítője lehet az SLX-molekulának abban, hogy a szelektinreceptor felismeri. Más esetben, ha a ligandum és a tesztvegyület a receptorhoz egyidejűleg képes kötődni, a vegyület nemkompetitívként működik. A nemkompetitív inhibitorok úgy hatnak, hogy csökkentik vagy gátolják a receptor-ligandum kölcsönhatás révén létrejövő fiziológiai hatásokat, inkább, mint hogy csökkentik a ligandummolekulák kötődését a receptorhoz. Végül, a találmány szerinti vizsgálatokat alkalmazhatjuk a szintetikus vagy természetben előforduló agonisták azonosítására, azaz azokhoz, amelyek kötődnek a receptorokhoz és a természetes ligandumhoz hasonló fiziológiai folyamatokat iniciálnak.
A ligandum-receptor kölcsönhatások inhibitorainak in vitro kiválasztására számos közvetlen és közvetett módszer ismert a szakterületen. így például meghatározható az a képesség, amely gátolja az SLX-hordozó sejtek adhézióját az adott szelektint expresszáló sejtekhez. Mint már azt a fentiekben említettük, a szelektinreceptor géneket klónozták, így a géneket a legkülönbözőbb sejtekbe lehet inszertálni és expresszálni, így például a COS sejtekbe, CHO sejtekbe stb. Továbbá, a sejtek, amelyek normál körülmények között nem expresszálják az SLX-et, képesek arra, hogy transzformálják őket egy vagy több glükozil-transzferáz génnel, amelyek a transzformáit sejteknek azt a képességet biztosítják, hogy a ligandumot szintetizálják (Lowe és munkatársai, Cell, 63:475-484 [1990]). Általában úgy járunk el, hogy a tesztvegyületet vagy szert a jelzett SLX-hordozó sejtekkel és a szilárd hordozón immobilizált aktivált endoteliális sejtekkel inkubáljuk. A celluláris adhézió gátlását ezután úgy határozzuk meg, hogy kimutatjuk a felületen lévő jelzett kötéseket a megfelelő mosások után. A következőkben ismertetett vizsgálatnál promielocitikus HL-60 sejteket és aktivált humán endoteliális sejteket vagy aktivált vérlemezkéket alkalmaztunk.
Miután azonosítottuk a szelektinreceptorokra specifikus ligandumokat, az izolált ligandummolekulákat szintén alkalmazhatjuk ennél a vizsgálatnál. Az „izolált szelektinmegkötő szer” vagy „izolált SLX-rész” kifejezések olyan szelektinmegkötő vegyületre vonatkoznak, amelyek a natív állapotuktól eltérőek, így például nincsenek egyesülve egy olyan sejt sejtmembránjával, amely normál esetben a ligandumot expresszálja. így egy izolált SLX-rész lehet egy izolált molekula, így például egy oligoszacharid vagy egy glükokonjugátum komponense. Az izolált molekulát szintetizálhatjuk vagy az SLX-hordozó sejtek sejtmembránjaiból nyerhetjük. Más módszernél az izolált szelektinmegkötő szert vagy SLX-részt egyesíthetjük egy liposzómával vagy egy szilárd felülethez kapcsolhatjuk, mielőtt a vizsgálatnál felhasználjuk. A szelektinmegkötő liposzómák, valamint a különböző biomolekulák immobilizálására szolgáló eljárásokat a következőkben részletesen ismertetjük.
A találmány szerinti in vitro vizsgálatok tipikusan kompetíciós vizsgálatok, amelyek alkalmasak annak kimutatására, hogy a tesztvegyület kompetitív módon gátolja a vegyület kötését, amelyről ismert, hogy az vagy a receptorhoz, vagy a ligandumhoz kötődik. Általában az SLX és a szelektinreceptor közötti kötés gátlását vizsgáljuk. Más kötési kapcsolatok gátlása szintén lehetséges, így például lehetséges egy monoklonális antitest (például CSLEX-1) és az SLX vagy egy SLX-utánzó és egy szelektin-inhibitor közötti kötés gátlása. A kompetetív vizsgálatok számos típusa ismert (például US 3376110 és 4016043, Harlow és Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, N. Y. [188]).
A találmány szerinti vizsgálati módszer alkalmas továbbá arra is, hogy a tesztvegyület kötődését vizsgáljuk önmagában egy komponenshez, inkább, mint hogy alkalmazzuk a kompetíciós vizsgálatot. így például az immunoglobulinok alkalmazhatók olyan vegyületek azonosítására, amelyek az SLX-részt tartalmazzák. A monoklonális antitest vizsgálatokhoz ismert eljárásokat, így például az ELISA módszert alkalmazhatjuk (Halow és Lane, supra). Az SLX antigént tartalmazó glükolipidek vizsgálatánál a monoklón antitesteknek az antigénekkel való reakcióképességét a TLC immunofestés módszerével vizsgáljuk eredetileg Magnani és munkatársai által leírt módszer alkalmazásával (Magnani és munkatársai, Anal. Biochem. 109:399-402 [1980]), vagy alkalmazhatjuk a Kanagi és munkatársai által ismertetett szilárd fázisú radioimmuno vizsgálatot is (Kanagi és munkatársai, Cancer Rés., 43:4997-5005 [1983]). A glükoproteineket standard immunoblotting eljárásokkal vizsgáljuk (lásd például Halow és Lane, supra). A szendvicsszerű vizsgálati formák szintén alkalmasak (lásd például az US 4 642 285,4299916 és 4 361904 számú szabadalmi leírások, valamint Harlow és Lane supra). Általában a kötési vizsgálat során azonosított vegyületeket tovább vizsgáljuk a receptor-ligandum kölcsönhatások gátlására vonatkozó képességük meghatározására.
Más vizsgálati formák magukban foglalják a különböző, vagy a ligandumot hordozó, vagy a szelektint hordozó sejtek fiziológiai változásának, jelenlétének vagy távollétének kimutatását, amely változások a kölcsönhatásokból következnek. Az ilyen alkalmas vizsgálatok közé tartozik például a kötés által kiváltott transzkripciós aktivitás megváltozásának meghatározása (lásd például 3 712 820 számú európai közzétételi irat), a különböző sejt-közvetített extracelluláris hatások megállapítása (90/00503 számú PCT közzétételi irat), valamint az egyes sejtek membránpotenciáljában bekövetkező változások kimutatása (US 4 343 782 számú szabadalmi leírás). Más módszernél, az izolált receptorokban vagy ligandumokban bekövetkező szerkezeti változásokat vizsgáljuk (US 4859609 számú szabadalmi leírás).
Bármelyik, a vizsgálatban részt vevő komponenst, ligandumot, a receptort vagy a tesztvegyületet szilárd felülethez köthetjük. A biomolekulák szilárd felületeken való immobilizálására számos módszer ismert. így például a szilárd felület lehet egy membrán (például nitrocellulóz), egy mikrotiter tárcsa (például PVC vagy polisztirol) vagy gyöngy. A kívánt komponenst kovalens vagy nem kovalens kötéssel köthetjük specifikus kötéseken keresztül.
A szilárd felületekhez a szerves vagy szervetlen polimerek, mind természetes vagy szintetikus eredetűek, széles skáláját alkalmazhatjuk. Példaképpen említjük a következőket: polietilén, polipropilén, poli(4-metil-butén), polisztirol, polimetakrilát, poli(etilén-tereftalát), rayon, nejlon, poli(vinil-butirát), szilikonok, poliformaldehid, cellulóz, cellulóz-acetát, nitro-cellulóz stb. Alkalmazhatók továbbá a következő anyagok is: papír, üvegek, kerámiák, fémek, metalloidok, félvezető anyagok, cermetek vagy más hasonlók. Továbbá, ezen anyagokon kívül olyan anyagok is alkalmazhatók, amelyek géleket képeznek, így például a proteinek, például zselatinok, lipopoliszacharidok, szilikátok, agaróz, valamint poliakrilamidok vagy olyan polimerek, amelyek különböző vizes fázisokat alkotnak, így például dextránok, polialkilénglikolok (2-3 szénatomos alkilének) vagy felületaktív anyagok, így például amfilikus vegyületek, így például foszfolipidek, hosszú, 12-24 szénatomos alkil-ammóniumsók és más hasonlók. Ha a szilárd felület porózus, a pórusok mérete különböző lehet a rendszer természetétől függően.
A felületek kialakításánál a legkülönbözőbb féle anyagokat alkalmazhatjuk, így például laminátokat is kialakíthatunk különböző tulajdonságok biztosítására, így például proteinbevonatot, így például zselatint alkalmazhatunk a nemspecifikus kötések elkerülésére, a kovalens kötések egyszerűsítésére, valamint a kimutatási jelek fokozására stb.
Ha a vegyület és a felület között kovalens kötés szükséges, a felület általában polifunkciós legyen vagy képes legyen polifunkcióssá alakulni. A felületen jelenlévő funkciós csoportok, amelyek szükségesek a kötéshez, például a következők lehetnek: karbonsavak, aldehidek, aminocsoportok, merkaptocsoportok stb. A különböző felületekhez való kötéshez a vegyületek széles köre ismert és alkalmazott az irodalom szerint (lásd például Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978, és Cuatrecases, J. Bioi. Chem. 245 3059 [1970]).
A kovalens kötések mellett különböző módszerek ismertek a nemkovalens kötések kialakításához. A nemkovalens kötésnél a vegyület tipikusan nemspecifikusan abszorbeálódik a felületen. Általában a felületet egy második vegyülettel blokkoljuk a jelzett vizsgáló komponensek nemspecifikus kötésének meggátlására. Más módszernél a felületet úgy alakítjuk ki, hogy az nemspecifikusán kössön meg egy komponenst, de ne legyen szignifikáns kötésű egy másik számára. így például a lecitint, így például Concanavalin A-t tartalmazó felületek megkötik a szénhidráttartalmú vegyületeket, de nem kötik meg a jelzett proteint, amely nem glükozilált. A különböző szilárd felületeket, amelyek a vizsgálati vegyületek nemkovalens kötéséhez alkalmazhatók, például az US 4447576 és 4254082 számú szabadalmi leírásokban foglalják össze.
Számos vizsgálatnál alkalmazunk jelzett vizsgálati komponenseket, így például SLX ligandumokat, SLX utánzókat, immunoglobulinokat, receptorokat vagy tesztvegyületeket. A jelzés közvetlenül vagy közvetve kapcsolódhat a kívánt komponenshez, ezt a szakterületen ismert módon végezzük. Jelzésként a legkülönbözőbb jelzéseket alkalmazhatjuk, és a komponenseket egy vagy több módszerrel is jelzéssel elláthatjuk. A legáltalánosabb detektálási módszer az autoradiográfia, amelynél 3H, 1251, 35S, 14C vagy 32P jelzett vegyületeket alkalmazunk. A radioaktív izotóp kiválasztása függ különböző kutatási szempontoktól, így például a könnyű szintézistől, a változó stabilitástól, valamint a kiválasztott izotóp felezési idejétől. Más, nem radioaktív jelzések közé tartoznak a ligandumok, amelyeket a jelzett antitestekhez kötünk, fluoroforokhoz, kemilumineszcensz szerekhez, enzimekhez kötünk, valamint antitestek, amelyek egy specifikus kötési pár tagjaként szolgálnak egy jelzett ligandum számára. A jelzés megválasztása függ a kívánt érzékenységtől, a kapcsolat könnyű kialakításától, a stabilitási körülményektől, valamint a rendelkezésre álló műszerezettségtől.
A nemradioaktív jelzéseket gyakran indirekt eszközökkel kötjük. Általában a ligandummolekula (biotin) kovalens kötéssel kapcsolódik a molekulához. A ligandum ezután egy antiligandumhoz (például streptavidin) kapcsolódik, amely vagy önmagában olyan, hogy kimutatható, vagy kovalens kötéssel kapcsolódik egy jelzőrendszerhez, így például egy detektálható enzimhez, egy fluoreszcensz vegyülethez vagy egy kemilumineszcensz vegyülethez. A ligandumok és az antiligandumok széles körben változhatnak. Ha ligandumnak van egy természetes antiligandumja (ilyen például a biotin, a tiroxin és kortizol), az alkalmazható együttesen a jelzett, természetben előforduló antiligandummal. Más módszernél bármely haptán vagy antigén vegyület alkalmazható az antitesttel kombináltan.
A molekulákat közvetlenül kapcsolhatjuk egy jelt kibocsátó vegyülethez, így például egy enzimhez vagy fluoroforhoz. A jelzőként alkalmazható enzimek elsődlegesen hidrolázok, különösen foszfatázok, észterázok és glükozidázok vagy oxidoreduktázok, különösen peroxidázok. A fluoreszcensz vegyületek közé tartozik például a fluoreszcein és származékai, a rodamin és származékai, danzil, umbelliferon stb. A kemilumineszcensz vegyületek közé tartozik például a luciferin és a 2,3-dihidro-naftalizindionok, így például a luminol. A különböző, jelzéseket adó rendszerek összefoglalását például az US 4 391 904 számú szabadalmi leírás tartalmazza.
Mint azt már a fentiekben említettük, a különböző, hozzáférhető SLX-egységet vagy SLX-utánzót tartalmazó inhibitor vegyületek mellett a találmány vonatkozik monoklón antitestekre is, amelyek képesek a szelektinek által közvetített intercelluláris adhézió gátlására, valamint vonatkozik az ilyen antitestek azonosítására szolgáló eljárásokra is. A monoklón antitestek a szelektin ligandumhoz vagy a receptorhoz kötődnek és blokkolják a celluláris adhéziót. Ily módon a szakember számára ismert számos eljárás, amellyel a különböző immunoglobulin molekulákat elő lehet állítani vagy manipulálni lehet, alkalmazható az intercelluláris adhézió gátlására.
A találmány értelmében az „immunoglobulin” kifejezés olyan proteinre vonatkozik, amely egy vagy több polipeptidet tartalmaz, amely lényegében immunoglobulin génekkel van kódolva. A felismert immunoglobulin gének közé tartoznak például a következők: kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epszilon és mu konstans szakaszú gének, valamint a myriad immunoglobulin változó szakaszú gének. Az immunoglobulinok különböző formákban fordulhatnak elő az antitestek mellett, így például Fv, Fab és F(ab)2 formában, valamint egyetlen láncú formában (Huston és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:5879-5883 [1988] és Bírd és munkatársai, Science 242:423-426 [1988], általánosságban lásd: Hood és munkatársai, Immunology, 2. kiadás, Benjámin N. Y. [1984], és Hunkapiller és Hood, Natúré, 323:15-16 [1986]).
Az SLX antigénekhez kötődő antitesteket különböző módon állíthatjuk elő. A nem humán eredetű monoklón antitestek, így például szarvasmarha, lagomorpha, equine stb. antitestek előállítása jól ismert és elvégezhető például úgy, hogy az állatot az SLX antigénnel vagy egy az antigént tartalmazó glükoproteint vagy glükolipidet tartalmazó készítménnyel immunizáljuk. Az antitest-termelő sejteket az immunizált állatból nyerjük ki, immortalizáljuk és kiválasztjuk vagy először kiválasztjuk a virális felületi protein és a receptormolekula kölcsönhatásának gátlására alkalmas antitestet, majd ezután immortalizáljuk. A különböző, a monoklonális antitestek előállítására szolgáló eljárásokat Harlow és Lane publikációjában foglalták össze (Harlow és Lane, Antibodies, A Laboratory Manual [1988], supra).
Egy humán antigénnel szembeni humán monoklonális antitest előállítása (az az eset, ha az SLX egységet humán szövetből izoláljuk) az ismert eljárásokkal nehézségekbe ütközik. így kívánatos lehet, hogy a nem humán antitestek, így például az F(ab’)2 antitest antigén-megkötő szakaszait vagy hiper-változtatható szakaszait humán konstans szakaszokba (Fc) vagy keret szakaszokba transzferáljuk rekombináns DNS eljárással és így állítsuk elő a lényegében humán molekulákat. Az ilyen módszerek a szakterületen ismertek és például az US 4 816397, valamint EP 173494 és 239400 számú szabadalmi leírásokban ismertetik. Eljárhatunk úgy is, hogy egy DNS szekvenciát izolálunk, amely a humán monoklonális antitestet vagy annak egy részét kódolja és amely specifikusan kötődik a humán SLX-hez úgy, hogy a humán B sejtek DNS könyvtárából választjuk ki ismert módon (Huse és munkatársai, Science, 246:1275-1281 [1989]), majd a szekvenciát, amely a kívánt specificitású antitestet (vagy kötő-fragmenst) kódolja, klónozzuk és kibővítjük.
Különböző, az utóbbi időben hozzáférhető monoklonális antitest alkalmazható a találmány értelmében a szelektinek által közvetített intercelluláris adhézió gátlásában. Alkalmazhatók így például a következők: CSELX-1 (Campbell és munkatársai, J. Bioi. Chem., 259:11208-11214 [1984]), a VIM-2, amely felismeri az SLX-től kissé különböző szekvenciát (Macher és munkatársai, supra), az FH6 (US 4904596) vagy az SH3 és SH4, amelyeket Dr. S. Hakomiri származtatott (Biomembrane Institute, Seattle, Washington).
A találmány szerinti vegyületek, beleértve az immunoglobulinokat, alkalmazhatók az alábbiakban részletezett gyógyszerkészítmények előállításához. Ha a vegyület egy oligoszacharid vagy glükokonjugátum, az SLX vagy SLX-utánzó rész különböző formákban lehet jelen, de képes kell hogy legyen a szelektinreceptorhoz való hatásos kötésre, mint például az ELAM-1, GMP140 vagy MEL-14 antigénhez, és ezáltal gátolja az intercelluláris adhéziót.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények alkalmazhatók a celluláris adhézió blokkolására vagy gátlására számos ezzel kapcsolatos betegségnél. így például számos gyulladásos betegség kapcsolatos a szelektinekkel, amelyek a vaszkuláris endotéliális sejtekben vagy vérlemezkékben expresszálódnak. A „gyulladásos” kifejezés utal mind a specifikus, mind a nemspecifikus védelmi rendszer reakcióira. Specifikus védelmi rendszer reakciója egy, a specifikus immunrendszer reakciója az antigénnel. Az ilyen specifikus védelmi rendszer reakciók közé tartoznak például az antitest válaszok az antigénekre, így például vírusokra, valamint a késleltetett típusú hiperszenzitivitás. A nemspecifikus védelmi rendszer reakciója egy gyulladásos folyamat, amelyet olyan leukociták közvetítenek, amelyek általánosságban képtelenek az immunológiai emlékezésre. Az ilyen sejtek közé tartoznak például a makrofágok, euozinofilek és neutrofilek. A nemspecifikus reakciók közé tartozik például a méhcsípés utáni azonnali duzzadás, és a PMN leukociták összegyűjtése a bakteriális fertőzés helyén (például pulmonáris infiltrátumok a bakteriális tüdőgyulladásoknál és a gennyképződés tályogoknál).
Az egyéb, kezelhető betegségek közé tartoznak például a következők: rheumatikus artritis, poszt-ischemiás leukocita-közvetített szövetkárosodások (reperíúziós károsodás), fagyás okozta károsodás vagy sokk, akut leukocita-közvetített tüdőkárosodás (például a felnőtt légzőrendszeri károsodás szindróma, aduit respiratory distress syndrome), asztma, traumatikus sokk, szeptikus sokk, neffitisz, valamint akut és krónikus gyulladások, beleértve az atopiás dermatitiszt, psoriasist, továbbá gyulladásos bélbetegség. A különböző vérlemezke-közvetített patológiás elváltozások közé tartozik például az aterosclerosis és a vércsomósodás, ezek szintén kezelhetők. Továbbá, a tumor metasztázisok gátolhatok vagy megelőzhetők a cirkuláló ráksejtek adhéziójának gátlásával. Példaképpen a bél és melanoma karcinomát említjük.
Példaképpen megemlítjük, hogy a reperíúziós károsodások különösen kezelhetők a találmány szerinti készítményekkel. Azon készítmények, amelyek gátolják GMP140 szelektin-ligandum kölcsönhatást, különösen alkalmasak a reperíúziós károsodások kezelésére és megelőzésére. A találmány szerinti készítmények alkalmazhatók profilaktikusan a szívműtéteket megelőzően a műtét utáni felépülés fokozására.
Mivel a GMP-140 a vérlemezkék és endotéliális sejtek Weibel-Palade testjeiben tárolódik és a trombinnal való aktiválás hatására szabadul fel és közvetíti a neutrofilek és monociták adhézióját, a GMP-140-ligandum kölcsönhatást gátló anyagok különösen előnyösek a szövetkárosodások minimalizálásában, amely gyakran kísérője a trombolitikus betegségeknek. így például az ilyen inhibitorok terápiás hatásúak olyan betegeknél, akik nemrégen kaptak agyvérzést, miocardiális infarktust, mélyvénás trombózist, tüdőembóliát stb. A vegyületek különösen alkalmasak a pretrombolitikus terápiában.
A találmány szerinti készítmények különösen előnyösen alkalmazhatók szeptikus sokk vagy disszeminált, intravaszkuláris koaguláció (DIC) másodlagos hatásainak kezelésére. A szeptikus sokk vagy DIC alatt bekövetkező leukocita migráció a szövetekbe gyakran eredményez patológiás szövetelváltozást. Továbbá, ezeknél a betegeknél eltelj edt mikrocirkulációs trombusok és diffúz gyulladás is előfordulhat. A találmány szerinti gyógyszerkészítmé13
HU 216 312 Β nyék gátolják a leukociták vándorlását ezeknél a helyeknél és csökkentik a szövetkárosodást.
A találmány szerinti szelektin-ligandum kölcsönhatást gátló anyagok továbbá alkalmasak traumatikus sokk, valamint az ezekkel összefüggő akut szövetkárosodások kezelésére is. Mivel a szelektinek szerepet játszanak a leukocitáknak a károsodás helyén való felgyülemlésében (különösen ELAM-1 esetén), az akut károsodás és gyulladás esetén ezek inhibitorait lokálisan vagy szisztémásán adagolhatjuk az ilyen károsodásokkal összefüggő szövetkárosodások kezelésére. Továbbá, mivel az ilyen inhibitorok specifikusak a gyulladás helyére, például ahol ELAM-1 receptorok expresszálódnak, a találmány szerinti készítmények hatásosabbak és kisebb valószínűséggel okoznak komplikációkat, ha a tradicionális gyulladás elleni szerekkel hasonlítjuk össze őket.
A fentieknek megfelelően a találmány vonatkozik a gyógyszerkészítményekre, amelyek a fentiekben említett tünetek kezelésére alkalmasak. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a következőket tartalmazzák: biomolekulák vagy más vegyületek, amelyek SLX-egységet tartalmaznak, antitestek, amelyek kötődnek az SLX-hez vagy más egyéb vegyületek, amelyek gátolják az SLX ligandum és a szelektinreceptorok közötti kölcsönhatást, valamint gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagok. A találmány szerinti biomolekulák lehetnek peptidek, polipeptidek, proteinek (például immunoglobulinok), szénhidrátok (például oligoszacharidok vagy poliszacharidok), glükokonjugátumok (például glükolipidek vagy glükoproteinek), nukleinsavak, vagy más hasonló vegyületek. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a legkülönbözőbb hatóanyag szállítási rendszerben alkalmazhatók. A hatóanyag szállítási rendszerek rövid összefoglalása található például a következő irodalmi helyen: (Langer, Science, 249: 1527-1533 [1990]).
Tekintve az emlősöknél előforduló gyulladásos folyamatok komplexitását, a szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti gyógyszerkészítmények az SLX-hordozó vegyületek mellett más egyéb vegyületeket is tartalmazhatnak, amelyekről ismert, hogy befolyásolják egyéb celluláris adhéziós molekulák szerepét. így például az adhéziós molekulák integrin családja játszhat szerepet a leukociták érből való kilépésében a fertőzés helyén. Az intercelluláris adhéziós receptorokra, beleértve a szelektinreceptorokra, valamint ezek szerepére az immun funkciókban, összefoglalás található például a következő publikációban: (Springer, Natúré, 346:425-434 [1990]). Továbbá a találmány szerinti gyógyszerkészítményekkel végzett sikeres kezeléseket meghatározhatjuk a kezelni kívánt tünetek kifejlődésének állapotával. Mivel a különböző adhéziós molekulák a betegségek folyamatában a különböző faktorokra adott válaszok következtében lehetnek alul- vagy felülszabályozottak, a szakember számára nyilvánvaló, hogy különböző gyógyszerkészítmények szükségesek a különböző gyulladásos állapotok kezelésére.
Az egyik kiviteli formánál a találmány szerinti gyógyszerkészítmény SLX ligandumát arra használjuk, hogy egy konvencionális gyulladás elleni hatóanyagot vagy más szert a szövetkárosodás specifikus helyére irányítsunk. Ha egy szelektinmegkötő részt, így például egy SLX ligandumot vagy SLX utánzót alkalmazunk egy hatóanyagnak a szelektinreceptorokhoz, így például a vaszkuláris, endoteliális sejthez való irányítására, ezen hatóanyagok magasabb koncentrációban lesznek a károsodás helyén. A konvencionális gyulladás elleni szerek mellékhatásai lényegében kiküszöbölhetők az alacsony dózisokkal, a szemek a károsodás helyére való lokalizálásával és/vagy a szer szállítás előtti befoglalásával.
Az irányító komponens, azaz az SLX ligandum vagy egy SLX utánzó, amely a kívánt szelektinhez kötődik, közvetlenül vagy közvetve a kemoterápiás szerhez is lehet kapcsolva. A kapcsolás, amelyet például a szakterületen ismert módszerekkel végezhetünk, nem szabad, hogy gátolja a ligandum azon képességét, hogy a receptorhoz kötődjön, nem csökkentheti lényegesen a kemoterápiás szer aktivitását. Az irányítás céljára a legkülönbözőbb kemoterápiás szert kapcsolhatjuk. így például a gyulladás elleni szerek, amelyek az SLX-hordozó vegyülethez kapcsolhatók, lehetnek például a következők: immunomodulátorok, vérlemezke aktiváló faktor (PAF) antagonisták, ciklooxigenáz inhibitorok, lipoxigenáz inhibitorok, valamint leukotrién antagonisták. Néhány előnyös képviselő például a következő: ciklosporon A, indometacin, naproxen, FK506, nikofenolsav stb. Hasonlóképpen alkalmasak az antioxidánsok, például a szuperoxid-dizmutáz a reperfüziós károsodások kezelésében, ha azokat SLX ligandummal vagy ezek utánzóival irányítjuk. Hasonlóképpen irányíthatók a rákellenes szerek is, úgy hogy az SLX ligandumot vagy annak utánzóját a kemoterápiás szerhez kapcsoljuk. Ilyen kapcsolható szerek például a következők: daunomicin, doxorubicin, vinblasztin, bleomicin stb.
A szelektinreceptorhoz való irányítást végezhetjük például továbbá amphipathokon keresztül vagy kettős karakterű molekulákkal (poláros/nempoláros), amelyek a vizes oldatban aggregátumokat képeznek. Az amphipath molekulák közé tartoznak például a következők: nempoláros lipidek, poláros lipidek, mono- és digliceridek, szulfatidok, lizolecitin, foszfolipidek, szaponin, epesavak és sóik. Ezek a molekulák emulziók, habok, micellák, oldhatatlan monorétegek, folyékony kristályok, foszfolipid diszperziók és lamelláris rétegek formájában fordulhatnak elő. Ezeket általában liposzómaként említjük. Az ilyen készítményekben a szállítandó hatóanyagot a liposzóma részeként építjük be a szelektinreceptorhoz kötődni képes SLX ligandummal vagy annak utánzójával együtt. így a liposzómát, amely tartalmazza a kívánt kemoterápiás szert, közvetlenül a károsodott szövethez irányíthatjuk a szelektin-SLX ligandum kölcsönhatás révén. Ha a liposzómákat a befolyásolt sejtek közelségébe juttattuk, azok a kívánt gyógyszerkészítményt odaszállítják.
A találmány szerinti liposzómákat ismert hordozóképző lipidekből alakítjuk ki, amelyek lehetnek természetes vagy negatív töltésű foszfolipidek vagy szterin, így például koleszterin. A lipidek kiválasztását különböző meggondolások alapján végezzük, így például a liposzóma méret, valamint a Eposzoménak a véráramban való stabilitása alapján.
A liposzómákban a fő lipid komponens általában a foszfatidin-kolin. A különböző lánchosszúságú és telítettségi mértékű acilcsoportokat tartalmazó foszfatidilkolinok kereskedelemben beszerezhetők vagy ismert eljárásokkal izolálhatok vagy szintetizálhatok. Általában a kevésbé telített foszfatidin-kolinok könnyebben alakíthatók méretre, különösen ha a liposzómák mérete 0,3 mikron alatti kell, hogy legyen szűréssel való sterilizálás céljából. A liposzómák méretezésére, valamint szűrve sterilizálásra szolgáló eljárásokat a következőkben részletezzük. A foszfolipid acilláncának összetétele befolyásolhatja a liposzóma stabilitását a vérben. Egy előnyös foszfatidin-kolin a részlegesen hidrogénezett tojás foszfatidil-kolin.
A liposzómák irányítása különböző irányítószerek alkalmazásával (például ligandumok, receptorok és monoklón antitestek) a szakterületen jól ismertek (például US 4957 773 és 4603 044 számú szabadalmi leírások). Irányítószerként különböző molekulatömegű glükoproteinek és glükolipidek alkalmazhatók. Előnyösen kevesebb, mint 300000 dal tón, előnyösen 40000 és 250000 dalion molekulatömegű glükoproteineket alkalmazunk, még előnyösebbek a 75000 és 150000 közötti glükoproteinek. A glükolipidek molekulatömege kevesebb, mint 10000 dalton, előnyösen 600 és 4000 dalton közötti érték.
Az irányítószer liposzómához való kötésére ismert eljárások alkalmazhatók. Ezen módszerek közé tartozik a liposzómák lipid komponensekbe, így például foszfatidil-etanol-aminba való beépítése, amely utóbbi vegyületet aktiválni lehet, hogy az irányító vegyületet megkösse, vagy ezek lehetnek derivatizált lipofil vegyületek, így például a lipid-derivatizált bleomicin. Az antitest-irányított liposzómákat például olyan liposzómák felhasználásával nyerjük, amelyek protein A-t tartalmaznak (Renneisen és munkatársai, J. Bioi. Chem., 265:16337-16342 [1990] és Leonetti és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 87:2448-2451 [1990]).
Az irányító mechanizmushoz általában szükséges, hogy az irányítószer a liposzóma felületén oly módon helyezkedjen el, hogy az irányítószer a szelektinreceptorral való kölcsönhatáshoz hozzáférhető legyen. A liposzómát általában úgy alakítjuk ki, hogy a kapcsoló részt építjük be először a membránba a membrán kialakításakor. A kapcsoló rész kell, hogy egy lipofil részt tartalmazzon, amely erősen be van ágyazva és szorosan kapcsolódik a membránhoz. Kell továbbá tartalmazzon egy hidrofil részt is, amely kémiailag hozzáférhető a liposzóma vizes felületén. A hidrofil részt úgy választjuk meg, hogy az kémiailag alkalmas legyen stabil kémiai kötés létesítésére az irányítószerrel, amelyet később adagolunk. E célból a kapcsoló molekula mind a lipofil kapcsoló részt, mind a hidrofil reakcióképes csoportot kell, hogy tartalmazza az irányítószerrel való reakcióhoz és annak érdekében, hogy az irányítószert a megfelelő pozícióban tartsa, a liposzóma felületéből kinyúlva. Bizonyos esetekben lehetséges az irányítószert a kapcsoló molekulához közvetlenül is kötni, de a legtöbb esetben előnyösebb egy harmadik molekula alkalmazása, amely kémiai hídként szolgál és így köti össze a kapcsoló molekulát - amely a membránban van - az irányító molekulával, amely háromdimenziós formában a hólyagok felületéről messzire kinyúlik. A liposzóma töltése egy igen fontos jellemző a liposzómának a vérből való kiürülése szempontjából, a negatív töltésű liposzómákat gyorsabban veszi fel a rektikuloendoteliális rendszer (Juliano, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 63:651 [1975]), és így rövidebb felezési időt mutat a véráramban. A hosszabb cirkulációs felezési idővel rendelkező liposzómák általában kívánatosabbak a terápiás és diagnosztikai célú felhasználásoknál. Azok a liposzómák, amelyek 8-12 vagy 24 óráig megmaradnak a véráramban, nyújtott felszabadulást biztosítanak a találmány szerinti szelektin-ligandum inhibitoroknak vagy lehetővé teszik az inhibitorok irányítását (amely inhibitorok jelzettek is lehetnek és így in vivő diagnosztikai leképezést biztosítanak) a kívánt helyre, mielőtt még a rektikuloendoteliális rendszerből eltávoznának.
A liposzómákat általában 5-15 mol% negatív töltésű foszfolipidek, így például foszfatidil-glicerin, foszfatidilszerin vagy foszfatidil-inozit alkalmazásával állítjuk elő. A negatív töltésű foszfolipidek, így például a foszfatidilglicerin arra is szolgál, hogy megakadályozza a spontán liposzómaaggregációt és így minimalizálja a méreten aluli liposzómaaggregátumok képződésének rizikóját. Membrán-merevítőszerek, így például szfingomielin vagy egy telített semleges foszfolipid, legalább 50 mol% koncentrációban, valamint 5-15 mol% monoszialilgangliozid adagolásával növelni lehet a liposzómák cirkulációját a véráramban, mint azt általánosságban az US 4 837 028 számú szabadalmi leírásban ismertetik.
Továbbá, a liposzómaszuszpenziók tartalmazhatnak még lipid-protektív szereket, amelyek a lipideket és a hatóanyag komponenseket védik a szabad gyökös és lipid-peroxidatív károsodásokkal szemben a tárolás ideje alatt. Lipofil szabad gyökös megkötőszerként előnyösen például alfa-tokoferolt és vízoldható vas-specifikus kelátokat, így például ferri-oxianint alkalmazunk.
A liposzómák előállítására számos módszer ismert (például Ann. Rév. Biophys. Bioeng., 9:467 [1980], US 4235 871,4 501 728 és 4 837 028 számú szabadalmi leírások). Az egyik módszernél többrétegű, heterogén méretű hólyagocskákat állítunk elő. Ennél a módszernél a lipidekből álló hólyagocskákat alkalmas oldószerben vagy oldószer rendszerben oldjuk, majd vákuumban vagy inért gázatmoszférában szárítjuk, és így vékony lipidfilmet nyerünk. Kívánt esetben a filmet ismételten alkalmas oldószerben, így például tercier-butanolban feloldjuk, majd liofilizáljuk és így még homogénebb lipidkeveréket nyerünk, amely könnyebben hidratálódó porszerű formában van. Ezt a filmet bevonjuk az irányítandó hatóanyag és az irányító komponens vizes oldatával, majd hagyjuk hidratálódni, általában 15-60 percen át keverés közben. A kapott többrétegű hólyagok méreteloszlása eltolódhat a kisebb méretek felé, ha a lipidek hidratációját erőteljes keverés közben végezzük vagy pedig szolubilizáló detergenst, így például dezoxikolátot adagolunk.
A hidratációs közeg az irányítani kívánt hatóanyagot olyan koncentrációban tartalmazza, amely szükséges a liposzómák belső térfogatában a végső liposzómaszuszpenzióhoz. A hatóanyag mennyisége az oldatban általában 10-100 mg/ml pufferolt sóoldatban. Az irányító SLX molekula vagy utánzó molekula, amely a szelektinhez kötődik, koncentrációja általában 0,1-20 m/ml.
A liposzóma előállítását követően a liposzómákat a megfelelő méretű és relatíve szűk méreteloszlású méretre hozzuk. Egy előnyös mérettartomány a 0,2-0,4 mikron közötti, amely lehetővé teszi a liposzómaszuszpenzió szűréssel való sterilizálását a szokásos szűrőkön keresztül, amelyek 0,22 mikronosak általában. A szűréssel való sterilizálást nagy teljesítménnyel tudjuk elvégezni, ha a liposzómák méretét 0,2-0,4 közötti mikronra állítjuk be. Különböző eljárások ismertek arra, hogy a liposzómák méretét hogyan állítsuk be a kívánt méretre. Az egyik ilyen eljárást az US 4737 323 számú szabadalmi leírásban ismertetik. A liposzómaszuszpenziót ultrahanggal kezelik vagy fürdőben, vagy külön mintánként és így fokozott méretcsökkenést lehet elérni, a kis, egyrétegű hólyagocskák méretét 0,05 mikron alá csökkentve. A homogenizálás egy másik módszer, amely azon alapszik, hogy nyíróenergiával a nagy liposzómákat kisebbekké fragmentálja. Egy tipikus homogenizálási eljárásnál a többrétegű hólyagocskákat egy standard emulzió-homogenizálón keresztül cirkuláltatjuk addig, amíg a választott liposzómaméreteket, általában 0,1-0,5 mikron közötti értékeket elérjük. Mindegyik módszernél a részecskeméret eloszlást ismert lézersugaras részecskeméret meghatározóval tudjuk ellenőrizni.
A liposzómaméretek csökkentésére és egy relatíve jól meghatározott méreteloszlás biztosítására egy igen jó módszer továbbá a liposzóma extrudálása egy kis pórusú polikarbonátmembránon vagy egy aszimmetriás kerámiamembránon keresztül. A szuszpenziót általában egyszer vagy többször engedjük át a membránon egészen addig, amíg a kívánt liposzóma méreteloszlást elérjük. A liposzómákat egymást követően kisebb pórusú membránokon is keresztülextrudálhatjuk és így a liposzómaméret graduális redukcióját biztosítjuk.
Még a leghatásosabb befoglalási módszernél is a kezdeti, osztályozott liposzómaszuszpenzió max. 50% vagy több hatóanyagot és irányítószert tartalmaz szabad (nem befoglalt) formában. Ezért, annak érdekében, hogy a liposzómásan irányított hatóanyag előnyeit maximalizáljuk, igen fontos a szabad hatóanyagot és irányítószert a végső injekciózható szuszpenzióból eltávolítani.
A nem befoglalt vegyületek eltávolítására a liposzómaszuszpenzióból különböző módszerek ismertek. Az egyik ilyen módszernél a szuszpenzióban lévő liposzómákat nagy sebességű centrifugálással pelletezzük, amikor is a szabad vegyület és egy kis mennyiségű liposzóma a felülúszóban marad. Egy másik módszernél a szuszpenziót ultraszűréssel betöményítjük, ezután a koncentrált liposzómákat ismételten szuszpendáljuk egy hatóanyagmentes helyettesítő közegben. Más módszer szerint gélszűrést alkalmazunk a nagy liposzómarészecskék és az oldott molekulák elválasztására.
A szabad hatóanyag és/vagy irányítószer eltávolítása után a liposzómaszuszpenziót a kívánt koncentrációra hozzuk, amely szükséges intravénás adagoláshoz. Ennél a liposzómákat alkalmas mennyiségű injekciós közegben reszuszpendáljuk, ha a liposzómákat előzőleg betöményítettük, például centrifugálással vagy ultraszűréssel, és betöményítjük a szuszpenziót, ha a hatóanyag-eltávolítási lépésnél az ossz szuszpenziótérfogat megnövekedett. A szuszpenziót ezután a fentiek szerint szűréssel sterilizáljuk. A liposzóma-ligandum készítményt adagolhatjuk parenterálisan vagy lokálisan olyan dózisban, amely változhat például az adagolás módjától, a szállítani kívánt hatóanyagtól és a betegségtől, amelyet kezelni kívánunk stb.
A találmány szerinti gyógyszerkészítményeknél, amelyek az SLX ligandumot, és/vagy SLX utánzót tartalmazzák, amelyek a szelektinreceptorokhoz kötődnek, a vegyületek dózisa változik például az adott vegyület, az adagolás módja, a kezelendő betegség, valamint annak komolysága, a beteg általános egészségi állapota, valamint a gyógyszert felíró orvos függvényében. így például reperfűziós betegségek kezelésére a dózis értéke általában 50 pg és 2000 mg/nap közötti érték egy 70kgos beteg esetén. Ideális esetben a terápiás adagolást olyan hamar kell elkezdeni, amennyire csak lehet a miokardiális infarktust vagy más károsodást követően. A találmány szerinti gyógyszerkészítménynek lehetnek parenterális, topikális, orális vagy lokális adagolásúak, így például lehetnek aeroszolok vagy transzdermális adagolásúak, profilaktikus és/vagy terápiás kezelés céljára. A gyógyszerkészítményeket különböző egységdózisok formájában adagolhatjuk, függően az adagolás módjától, így például az orális adagolásra alkalmas dózisegységek lehetnek porok, tabletták, pirulák, kapszulák vagy drazsék.
A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket előnyösen intravénásán adagoljuk. így a találmány vonatkozik egy intravénás adagolásra alkalmas készítményre, amely a vegyület oldatát tartalmazza gyógyszerészetileg elfogadható, előnyösen vizes hordozóanyagban szuszpendálva vagy oldva. Erre a célra különböző vizes hordozóanyagokat alkalmazhatunk, így például vizet, pufferolt vizet, 0,4%-os sóoldatot stb. Ezeket a készítményeket ismert módon, ismert sterilizálási eljárásokkal sterilizálhatjuk vagy sterilen szűrhetjük. A kapott vizes oldatokat közvetlenül is csomagolhatjuk felhasználásra vagy liofilizálhatjuk, amely liofilizált készítményeket közvetlen az adagolás előtt steril vizes oldattal hozunk adagolásra alkalmas formára. A készítmények tartalmazhatnak gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagokat, amelyek szükségesek a fiziológiai körülmények, így például a pH beállítására, továbbá tartalmazhatnak pufferanyagokat, tonicitást beállító anyagokat, nedvesítőszereket és más hasonlókat, így például nátrium-acetátot, nátrium-laktátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot, kalcium-kloridot, szorbitán-monolaurátot, trietanol-amin-oleátot stb.
Az SLX ligandum vagy ennek utánzójának mennyisége, amelyet más SLX ligandumokkal vagy utánzókkal is kombinálhatunk, úgynevezett „koktél” formák
HU 216 312 Β előállításához a gyógyszer hatásosságának növelése érdekében, széles határok között változhat, így például kevesebb, mint 0,5% értéktől általában kevesebb, mint 1% értéktől 10-30% értékig, a konkrét értéket elsődlegesen a folyadéktérfogat, a viszkozitás stb. alapján választják meg az adagolási módnak megfelelően. A koktél tartalmazhat még egy monoklonális antitestet, amely a szelektinreceptorhoz kötődik, ez lehet például egy ELAM-1 vagy GMP-140 elleni monoklonális antitest, továbbá egy SLX ligandumot, egy ligandum utánzót vagy a ligandummal szembeni monoklón antitestet, annak érdekében, hogy hatásosan gátolja a ligandum-receptor kölcsönhatást. Mint már azt a fentiekben említettük, a koktél komponenseket liposzómakészítmények formájában lehet bejuttatni.
így például egy intravénás infúzió céljára alkalmas tipikus gyógyszerkészítmény tartalmazhat maximum 250 ml steril Ringer-féle oldatot és 25 mg vegyületet. A parenterálisan adagolható készítmények előállítására szolgáló eljárás a szakember számára ismert és például részletesebben a következő irodalmi helyen van ismertetve: (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, PA [1985]).
A szilárd készítmények előállításánál a szokásos, nem toxikus hordozóanyagokat alkalmazzuk, ezek közé tartoznak például a következők: gyógyszerészeti minőségű mannit, laktóz, keményítő, magnézium-sztearát, nátrium-szacharin, talkum, cellulóz, glükóz, szacharóz, magnézium-karbonát stb. Orális adagolás esetén a készítmények általában 10-95% hatóanyagot, azaz egy vagy több SLX ligandumot vagy utánzót, előnyösen 20% hatóanyagot tartalmaznak valamely fenti, gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus vivőanyag mellett (lásd Remington’s, supra).
Aeroszolos adagoláshoz a vegyületeket előnyösen finom eloszlású formában felületaktív anyagokkal és hajtóanyagokkal együtt formulázzuk. Az SLX oligoszacharid ligandumok vagy utánzók mennyisége általában 0,05-30 tömeg%, előnyösen 1-10 tömeg%. A felületaktív anyag természetesen nem toxikus kell, hogy legyen és előnyös, ha oldható a hajtóanyagban. Az ilyen szerek lehetnek például a következők: 22 szénatomos zsírsavak észterei vagy parciális észterei, így például kapronsav, oktánsav, laurinsav, palmitinsav, sztearinsav, linolsav, linolénsav, oleszterinsav és oleinsav alifás, többértékű alkoholokkal vagy ciklusos savanhidridekkel, így például etilén-glikollal, glicerinnel, eritritollal, arabitollal, mannittal, szorbittal, szorbitból származó hexitolanhidridekkel és poli(etilén-oxi)- és poli(propilén-oxi)-származékokkal alkotott észterei. Kevert észterek, így például kevert vagy természetes gliceridek szintén alkalmazhatók. A felületaktív anyag mennyisége általában 0,1-20 tömeg%, előnyösen 0,25-5 tömeg%. A készítmény kiegészítő mennyisége rendszerint hajtóanyag. A folyósított hajtóanyagok általában környezeti körülmények között gázok és nyomás alatt kondenzálódnak. Az alkalmas folyósított hajtóanyagok rövid, maximum 5 szénatomos alkánok, így például bután és propán, előnyösen fluorozott vagy fluor-klórozott alkánok. Ezek keveréke szintén alkalmazható. Az aeroszolok előállításánál a megfelelő szeleppel ellátott tartályt megtöltjük a megfelelő hajtóanyaggal, amely a finom eloszlású vegyületeket és a felületaktív anyagot tartalmazza. Az alkotókat így emelt nyomáson tartjuk egészen addig, amíg a szelepet működésbe nem hozzuk.
A vegyületeket tartalmazó készítményeket profilaktikus és/vagy terápiás célból egyaránt adagolhatjuk. Terápiás adagolás esetén a készítményeket a már a fenti betegségben szenvedő betegeknek adagoljuk olyan mennyiségben, amely alkalmas a gyógyításhoz vagy legalábbis a betegség szimptómáinak részletes csökkentéséhez. Ezen céloknak megfelelő alkalmas mennyiségeket nevezzük „terápiásán hatásos dózisnak”. Ez a mennyiség függ a betegség komolyságától, a beteg tömegétől és általános állapotától, de a mennyiség általában 0,5 mg és 2000 mg SLX oligoszacharid vagy SLX utánzó naponként 70 kg tömegű beteg esetében, a legáltalánosabban alkalmazott napi dózis 5 mg és 200 mg közötti vegyületmennyiség.
Profilaktikus célú adagolásnál a találmány szerinti vegyületeket tartalmazó készítményeket azon betegeknek adagoljuk, amelyek érzékenyek vagy nagy a rizikófaktoruk az adott betegségekkel szemben. Az ilyen mennyiségeket „profilaktikusan hatásos dózisnak” nevezzük. Ennél az alkalmazásnál a pontos mennyiség ismételten csak függ a beteg egészségi állapotától és tömegétől, értéke általában 0,5-1000 mg 70 kg-os beteg esetén, még általánosabban 50-200 mg/70 kg testtömeg.
A találmány szerinti készítmények egyszeri vagy többszöri adagolását a kezelőorvos által meghatározott dózisokban és eloszlás szerint végezhetjük. Mindenesetre a gyógyszerkészítményekkel olyan mennyiségű SLX oligoszacharidot vagy SLX utánzót kell biztosítani, amely elegendő mennyiségű a beteg hatásos kezeléséhez.
A találmány szerinti vegyületek diagnosztikai reagensként is alkalmazhatók. így például a jelzett vegyületeket felhasználhatjuk a gyulladás vagy tumor-áttét helyének meghatározására a gyulladásos tünetekkel rendelkező beteg esetében. Éne a célra a vegyületeket l251,14C vagy trícium felhasználásával tesszük jelzetté.
A következő példákkal a találmány szerinti megoldást kívánjuk közelebbről illusztrálni a korlátozás szándéka nélkül.
I. példa al ,3-Fukozil-transzferáz I izolálása a Golgi-rendszerből
A LEC11, HL-60, HT-29, bizonyos adenokarcinomák (különösen a colo 205 sejtek) és a polimorf magú leukociták (PMN, neutrofilek) egy igen specifikus a 1,3fukozil-transzferáz I-et tartalmaznak, amely képes a fukózt a GDP-fukózból átszállítani a NeuAca2,3Gal Bl,4GlcNAc vagy NeuGca2,3GalBl,4GlcNAc szialilezett szubsztrátumokhoz.
A szakterületen ismert, hogy a fukóz az oligoszacharid láncokhoz a Golgi-rendszer üregeiben egy specifikus íukozil-transzferáz segítségével kerül átszállításra (Schater és Roseman, The Biochemistry of
Glycoproteins and Proteoglycans, W. Lennarz, kiadó Plenum Press, New York, 85-160 [1980]). Mivel a fukozil-transzferáz szubcelluláris lokalizációja a Golgi-rendszerben van, az első lépés ezen enzimek izolálásánál a Golgi-rendszer frakció izolálása a sejtvonalból, amely expresszálja az új és specifikus al,3-fukoziltranszferázt.
A Golgi-rendszerből származtatott hólyagfrakciókat Balch és munkatársainak módosított módszere szerint nyerjük (Balch és munkatársai, Cell, 39:405 [1984]). Az LEC11, HL-60, HT-29, PMN, colo 205 vagy más sejtvonalakat, amelyek az α 1,3-fukozil-transzferáz I-et tartalmazzák szuszpenzióban, tenyésztjük, amíg körülbelül 5xl05 sejt/ml sűrűséget érünk el. A sejteket ezután a szuszpenzió tenyészetből begyűjtjük, 2000 xg melletti centrifugálással. A 12 1 szuszpenzióból (6χ 109 sejt) kapott sejtpelletet 3 térfogatnyi (töltött sejttérfogat) jéghideg 0,25 mólos szacharóz (t/tf) oldatban reszuszpendáljuk, amely oldat még 10 mmol trisz-Cl-t, 7% hővel inaktivált borjú csecsemőszérumot és 10pg/ml Aprotinint (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) tartalmaz és a pH értéke 7.
A sejteket összetörjük (körülbelül 60 ütéssel) egy szoros illeszkedésű Wheaton-üveghomogenizátorban A mozsártörő alkalmazásával. A homogenizátumot ezután 5 percig 500 χ g mellett centrifugáljuk egy asztali kivitelű klinikai centrifugában. A centrifugálócsőben lévő oldat tetején maradó lipidet és oldhatatlan anyagot eldobjuk. A zavaros felülúszót átvisszük egy tiszta csőbe és a felülúszó frakció szacharózkoncentrációját ezután 40 t/tf% értékre állítjuk be, ezt 20 mmol trisz-Clben adagoljuk, pH=7,5, a beállítást refraktométer segítségével végezzük. Az így kapott szuszpenzióból 5 ml-t ezután egy ultracentrifugáló csőbe viszünk át és egymást követően rárétegezünk 2,5 ml 35 t/tf%-os szacharózoldatot 10 mmol trisz-Cl-ben (pH=7) és 2 ml 29 t/tf%-os szacharózt 10 mmol trisz-Cl pufferban. A gradienst ezután 1 órán át 10000xg mellett centrifugáljuk SW-41 rotorban (Beckman) 5 °C hőmérsékleten. A Golgi-rendszerben gazdagított hólyagokat ezután elválasztjuk a 29-35%-os szacharóz közti fázistól. A gradiensben más szubcelluláris frakciókat is találunk másik közti fázisokban, például a Golgi-származású hólyagok alatti durva és sima endoplazmikus retikulum sávból származó hólyagok stb. A 29-35%-os közti fázisból eltávolított sávot analizáljuk a szialil-transzferáz aktivitás jelenlétére és mennyiségére.
A szialil-transzferáz enzimről csak az tudott, hogy a Golgi-rendszerből származó hólyagocskákon belül található és a szakterületen jártas emberek ezt jelzőként használják a 29-35%-os közti fázisból származó sáv valódiságának meghatározására. A szialil-transzferáz vizsgálatot akceptorként asialofetuin alkalmazásával végezzük Briles és munkatársai módszere szerint (Briles és munkatársai, J. Bioi. Chem., 252:1107 [1977]). Egy jó, Golgirendszerből származó hólyag készítmény LÉC sejtekből, általában 3 mol/mg protein/óra szialil-transzferáz specifikus aktivitású.
Az így kapott Golgi-rendszer készítményt alkalmazzuk ezután forrásként az al,3-fukozil-transzferázhoz, amelyet a fentiekben leírt enzimatikus szintézisnél alkalmazunk.
II. példa
Intercelluláris adhézió kimutatása SLX-et expresszáló sejtek alkalmazásával
Az LEC11 sejtek (amelyek az SLX-et expresszálják) azon képességét, hogy az ELAM-l-et expresszáló aktivált endoteiiális sejtekhez kötődnek, összehasonlítottuk a CHO sejtekével és más glükozilációs mutánsokéval, LEC12-vel, amely az Lex szerkezetet expresszálja, ez az SLX nem szializált formája.
Anyagok
Endoteiiális sejtforrásként humán umbilicális véna endoteiiális sejtek (HUVEC, Clonetics) 5. passzálását alkalmaztuk, amelyet zselatinnal burkolt 48 lyukú vizsgálólemezen tenyésztettünk. A sejteket IL-1B (Genzyme) 30 μΐ/ml koncentrációban való adagolásával stimuláltuk. A sejtek stimulálását 4 órán át végeztük. A kontroll ligandumhordozó sejtekhez forrásként az American Type Culture Collection-ból származó HL-60 sejteket alkalmaztunk (ATCC No. CCL 240). Ezeket a tenyészetből RPMI 1640-be gyűjtöttük össze (Gibco), amely a következőket tartalmazta: 100 egység/ml penicillin, 100 mcg/ml sztreptomicin (Irvine Scientifíc), 2 mmol L-glutamin (Irvine Scientifíc) és 10% magzati szarvasmarha szérum (Hazleton) (ezt a továbbiakban CRPMI-ként említjük). Az LEC11, LEC12 és CHO-K1 sejteket Dr. P. Stanley-től szereztük be (Stanley és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263:11374-11381, [1988]). Ezeket szuszpenzió tenyészetben tenyésztettük komplett alfa MÉM közegben, amely ribonukleozidokat és dezoxiribonukleozidokat (Gibco), 100 egység/ml penicillint, 100 pg/ml sztreptomicint (Irvine Scientifíc), 2 mmol L-glutamint (Irvine Scientifíc) és 10% magzati szarvasmarha szérumot (Hazleton) tartalmazott.
Eljárás
1. A HL-60, LEC11, LEC12, és CHO-K1 sejteket begyűjtöttük és CRPMI-ben mostuk. Az élő sejteket megszámoltuk, trypan blue alkalmazásával. Mindegyik típusból 3χ 106 sejtet pelleteztünk egy 10 ml-es vizsgálócsőben és mindegyik pellethez 300 μΐ 51Cr oldatot (450 μθ) (New England Nuclear) adagoltunk. A csöveket ezután 1 órán át 37 °C hőmérsékleten enyhe keverés közben inkubáltuk.
2. A jelzett sejteket háromszor a tápközeggel átmostuk, majd reszuszpendáltuk 2 χ 105/400 μΐ (6 ml) töménységben. A csöveket ezután 4 °C hőmérsékleten jégfürdőn tartottuk.
3. 4 órás IL-lB-val végzett inkubálás után a vizsgálólemezeket, amelyek az aktivált HUVEC-et tartalmazták, az inkubátorból eltávolítottuk és 15 percig hűtöttük 4 °C hőmérsékletű jégfürdőn elhelyezett lemezre való helyezéssel.
4. Ha a hőmérséklet mindegyik mintában kiegyenlítődött, a tápközeget a vizsgálólyukakból Pasteur-pipettával eltávolítottuk, néhány lyukból egyidejűleg.
5. Ezután a jelzett sejteket 400 μΐ térfogatban, ez megfelel 2xl05 sejt/lyuk mennyiségnek, a lyukakba adagoltuk. 3 χ 400 μΐ alikvot részt vettünk ki mindegyik sejtszuszpenzióból és üvegcsőbe helyeztük a bevitt CPM mennyiségének meghatározására.
6. A lemezeket jeges vízfürdőn 30 percen át inkubáltuk.
7. A nem megkötött sejteket a lyukakból eltávolítottuk, majd ismételten szuszpendáltuk Pasteur-pipetta alkalmazásával, majd ezt követően hozzáadtunk, majd elvettünk 0,7 ml tápközeget.
8. Az összes tápközeget a lyukakból eltávolítottuk és 0,125 mól triszt, 2% SDS-t és 10% glicerint tartalmazó oldatot adagolunk 0,3 mennyiségben. A lemezt 30 percen át állni hagytuk, majd 0,5 ml dH2O-t adagoltunk mindegyik lyukba.
9. A lyukakban lévő folyadékot Pl000 pipettával reszuszpendáltuk, majd egy üveg vizsgálócsőbe vittük át. A Pl000 hegyét beráztuk a csőbe.
10. A csöveket, beleértve azokat is, amelyek a bevitt CPM mintákat tartalmazták, gamma-számlálóval számláltuk.
11. Mindegyik lyukban a CPM kötéseket elosztottuk a bevitt CPM mennyiségekkel, a százalékos kötés meghatározására. Az átlagot és a standard eltérést három párhuzamos mérésben ábrázoltuk.
A kapott eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be, ezek jelzik, hogy az SLX-et expresszáló sejtek képesek hatásosan kötődni az ELAM-1-et expresszáló aktivált vaszkuláris endoteliális sejtekhez. Ezek az adatok mutatják, hogy az LÉC 11 sejtek, amelyek nagy mennyiségben expresszálják az egyedül álló szénhidrát SLX kötést, kivételesen jól kötődnek az IL-lB-aktivált HUVEC-hez, míg az LÉC 12 és a CHO-K1, amelyben nincs szignifikáns mennyiség ebből a szénhidrátból, gyenge kötést jelentenek az aktivált HUVEC számára. Ezt a konklúziót támasztja alá az a megfigyelés is, hogy a kötés 4 °C hőmérsékleten következik be, ez jellemző az ELAM-1 közvetített kötésre.
III. példa
Intercelluláris adhézió gátlása SLX-re specifikus monoklonális antitestekkel
Két kísérletet ismertetünk, amelyekkel igazoljuk, hogy az ELAM-1 neutrofiljein lévő ligandum egy oligoszacharidot tartalmaz, amelynek terminális cukrai a következők: NeuAca2,3GalBl,4(Fucal,3)GlcNAc (SLX).
A kísérleteknél vizsgáltuk a szialilezett Lex-re és ennek nem szialilezett formájára specifikus monoklonális antitestek azon képességét, hogy blokkolják a HL-60 sejtek ELAM-1 által közvetített adhézióját az IL-1B stimulált HUVEC-hez.
A) Monoklonális antitest I
Anyagok
A jelen kísérlethez készített HUVEC tenyészet harmadik passzálását alkalmaztuk a kísérletnél a fentiekben leírtak szerint. Két 2x3 lyukat nem stimuláltunk kontroll céljára. Négy-négy párhuzamost stimulálunk IL-lB-val (Genzym) 10 pg/ml, illetve 20 pg/ml mennyiségben. A sejtek stimulálását pontosan 4 órán át végeztük. Ligandumhordozó sejtként az American Type
Culture Collectiontől beszerzett HL-60 sejteket (ATCC No. CCL 240) alkalmaztuk.
Ezeket a sejttenyészetből RPMI-1640-be (Gibco) gyűjtöttük össze, amely 100 egység/ml penicillint, 100 pg/ml sztreptomicint (Irvine Scientific), 2 mmol Lglutamint (Irvine Scientific) és 10% magzati szarvasmarha szérumot (Hazleton) tartalmazott (ezt a továbbiakban cRPMI-nek jelöljük).
A monoklón antitest készítmények 20 pg/ml mennyiségben SNH3-at (IgM) és 10 pg/ml mennyiségben SH1et (Ig3) tartalmaztak. Az NH3 specifikus az SLX-re, míg az SH1 felismeri a nem szialilezett szerkezetet.
Eljárás
1. A HL-60 sejteket elválasztottuk és CRPMI-vel mostuk. Az életképes sejteket megszámláltuk trypan blue alkalmazásával. 3xl06 mennyiségű sejtet 2, 10 ml-es vizsgálócsövekbe helyeztük és mindegyik csőhöz 300 μΐ 5lCr (450 pCi) (New England Nuclear) jelzőanyagot adagoltunk. A csöveket 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk enyhe keverés közben.
2. Az antitesteket hibridóma tenyészet felülúszójaként alkalmaztuk, amely 0,01% NaN3-at és 0,05% timerozalt tartalmazott. A konzerválószer eltávolítására mindegyik antitestből 5 ml-t dializáltunk 3 cserében 500-500 ml használaton kívüli szövettenyészet közeggel szemben 72 óráig.
3. Az antitesteket a dialízis után elválasztottuk és
3,5 ml mennyiségben 10 ml-es csőbe helyeztük. A visszamaradó mennyiséget ELISA analízishez alkalmaztuk a HL-60 kötések meghatározásához. 7 ml RPMI 1640 5% FCS oldatot helyeztünk a 4. csőbe kontroll céljára.
4. A jelzett HL-60 sejteket háromszor CRPMI-vel mostuk és egyesítve egy csőbe helyeztük. A csöveket centrifugáltuk és 1 ml tápközegben reszuszpendáltuk.
5. 200 μΐ sejtszuszpenziót adagoltunk mindegyik antitestet tartalmazó csőhöz és 400 μΐ-t a kontroll csövekhez. A csöveket ezután 20 percen át 37 °C-on enyhe keveréssel inkubáltuk.
6. A stimulált HUVEC vizsgálólemezeket eltávolítottuk az inkubátorból, a tápközeget a lyukakból eltávolítottuk Pasteur-pipettával, néhány lyukból egyidejűleg.
7. 0,5 ml sejtszuszpenziót adagoltunk a három párhuzamos lyuk mindegyikébe. A kontrollsejteket a nem stimulált és stimulált HUVEC-re rétegeltük, mindegyiket IL-1B koncentrációban. A vizsgálati sejteket csak a stimulált lyukakba adagoltuk.
8. 0,5 ml alikvot részt adagoltunk a sejtszuszpenzióból a bevitt CPM meghatározásához felhasználásra kerülő üvegcsőbe.
9. A vizsgálati lemezt visszatettük az inkubátorba (5% CO2, 37 °C) 30 percre.
10. A sejtszuszpenziókból egy alikvot részt elkevertünk azonos térfogatú trypan blue-val és a sejteket mikroszkóppal vizsgáltuk az életképességre. Az eredmény: kontroll=98%, SH1 =92% és SNH3=99%.
11. A nem megkötött sejteket a lyukakból eltávolítottuk szisztematikus reszuszpenzióval Pasteur-pipetta alkalmazásával, majd 0,7 ml tápközeg adagolásával és eltávolításával.
12. A lyukakból az összes tápközeget eltávolítottuk és 0,3 ml 0,125 mól triszt, 2% SDS-t (Bio-Rad) és 10% glicerint (Fisher) tartalmazó oldatot adagoltunk a helyére. A lemezeket 30 percen át állni hagytuk, majd ezután mindegyik lyukba 0,6 ml dH2O-t adagoltunk.
13. Mindegyik lyukban lévő folyadékot Pl000 pipettával reszuszpendáltuk és egy üveg vizsgálócsőbe vittük át. A Pl000 hegyét beleráztuk a csőbe.
14. A csöveket, beleértve a kezdeti szám/perc (counts per minute) (CPM) mintákat is, gamma-számlálóval vizsgáltuk.
15. A CPM kötéseket mindegyik lyukban elosztottuk a bevitt CPM értékkel a %-os kötés meghatározására. Az átlag és standard eltéréseket a három párhuzamos vizsgálatnál grafikusan ábrázoltuk.
Az ismétlődéseket legjobbnak ítéltük azon kísérleteknél, amelynél nagy mennyiségű IL-lB-t alkalmaztunk az endoteliális sejtek indukálására.
A kapott eredmények azt mutatják, hogy az SNH3 monoklón antitest blokkolja a HL-60 sejtek IL-IB stimulált HUVEC sejtekhez való kötődését az ELAM1 receptoron keresztül. A kontroll SH1 antitest, amely nem kötődik az SLX determinánshoz, nem blokkolja a HL-60 sejtek kötődését az ELAM-1-hez. Ez azt jelenti, hogy a ligandumon a terminális szialsav jelenléte szükséges az ELAM-1-hez való kötődéshez.
B) Monoklonális antitest 2
Anyagok
HUVEC 3 passzálást, amelyet zselatin borítású, 48 lyukú vizsgálólemezen (Costar) tenyésztettünk, alkalmaztunk endoteliális sejtforrásként. A lemezeket az előzőekben leírtak szerint készítettük. Kétszer három lyukat stimulálás nélkül hagytunk kontroll céljára. Hét párhuzamost mindegyik lemezen 30 pg/ml 0,5 ml EGM-UVben adagolt IL-lB-val stimuláltunk. A sejteket pontosan 4 órán át stimuláltuk. Ligandumhordozó sejtforrásként HL-60 sejteket (ATCC) alkalmaztunk. Ezeket a tenyészetből CRPMI-be gyűjtöttük össze. A monoklón antitesteket tartalmazó friss hibridóma felülúszók összetétele a következő volt: FH6 (IgM), alacsony affinitású mAb; SNH-3 (IgM) (20 pg/ml); SH-1 (IgG3) 10 pg/ml; FH-2 (IgM), Lex reaktív mAb; SNH-4 (IgG3), nagy affinitású antitest; és CSLEX-1 (IgM) (Dr. P. Terasakitől beszerezve, UCLA mint tisztított immunoglobulin 2,8 mg/ml, hígítva 2 pg/ml koncentrációra Dulbecco’s Modified Eagles Médium (DMEM), amely 5% FCS-t is tartalmaz ezen vizsgálatnál való felhasználásra). A következő antitesteket alkalmaztuk: FH6, SNH-4, SNH3 és CSLEX-1, ezek SLX-re specifikusak; FH2 és SH1, ezek a nem szialilezett Lex-re specifikusak.
Eljárás
1. A HL-60 sejteket begyűjtöttük és CRPMI-vel mostuk. Az életképes sejteket trypan blue alkalmazásával megszámláltuk. 3xl06 sejtet 2,10 ml-es vizsgálócsövekbe helyeztünk és 300 μΐ 51Cr (450 μθ) (New England Nuclear) jelző anyagot adagoltunk mindegyik csőbe. A csöveket ezután 1 órán át 37 °C-on gyenge keverés közben inkubáltuk.
2. A jelzett HL-60 sejteket háromszor DMEM oldattal átmostuk, amely 5% FCS-t is tartalmazott (ezt a továbbiakban cDMEM-ként jelöljük), majd egyesítés után egy csőbe adagoltuk. Ezt a csövet centrifugáltuk, majd reszuszpendáltuk 4χ 106 sejtmennyiségben ugyanabban a tápközegben.
3. 3,2 ml-t mindegyik monoklón antitest felülúszóból és 3,2 ml tisztított CSLEX-l-et (29 pg) külön vizsgálócsőbe adagoltunk; a kontroll csőbe 6,4 ml tápközeget adagoltunk.
4. 400 μΐ sejtszuszpenziót (megfelel 8χ 105 sejtnek) adagoltunk a monoklón antitesteket tartalmazó csövekbe és 400 μΐ-t a kontroll csőbe. A csöveket ezután 20 percen át 37 °C-on enyhe keverés közben inkubáltuk.
5. A stimulált HUVEC vizsgálólemezeket eltávolítottuk az inkubátorból, a lyukakat egyszer cDMEM oldattal átmostuk, a tápközeget a lyukakból eltávolítottuk Pasteur-pipettával, egyidejűleg néhány lyukból.
6. 0,4 ml sejtszuszpenziót adagoltunk a két lemez közül az egyik mindegyik lyukába. A kontroll sejteket stimulált és nem stimulált HUVEC-ra rétegeztük. Az antitesttel kezelt sejteket csak a stimulált lyukakba adagoltuk.
7. 0,4 ml alikvot részt vettünk ki mindegyik sejt szuszpenzióból és egy üvegcsőbe adagoltuk a bevitt CPM mennyiségek meghatározására.
8. A vizsgáló lemezeket 37 °C-on 30 percig inkubáltuk.
9. A sejtszuszpenziók megmaradó részét, valamint a vizsgálólemezt jégfurdőre helyeztük és hűtöttük 20 percen át.
10. A sejtszuszpenziót a hűtött lemezre rétegeztük a fentiekben a 37 °C hőmérsékletű lemezeknél leírtak szerint. Ezt a lemezt 30 percig 40 °C-on inkubáltuk.
A vizsgálat további lépéseit a fentiekben az A) pontnál a 11-15 lépéseknél leírtak szerint végeztük, kivéve, hogy a 12. lépésnél a lemezeket 15 percig hagytuk állni az ott megadott 30 perc helyett.
A kapott eredményeket a 2A ábrán mutatjuk be, ezekből kitűnik, hogy az SNH-3, FH6, SN-4 és a CSLEX-1, SLX-re specifikus monoklón antitestek szignifikánsan blokkolják a HL-60 sejtek kötődését az IL1B stimulált HUVEC-hez az ELAM-1 receptoron keresztül, ha az inkubálás 37 °C-on történt, az Lex-re specifikus monoklón antitestek (FH2 és SH1) nem hatásos inhibitorok. így az ELAM-1 liganduma tartalmazza a szialilezett Lex antigént vagy más hasonló, a sejtfelületi glükoproteinekben vagy glükolipidekben található szerkezetet.
Ha az inkubálást 4 °C hőmérsékleten végezzük (2B ábra), az FH6 és SNH3 (mindegyik IgM) antitestek növelték a kötést. Ennél a vizsgálatnál a HL-60 sejtek szignifikáns agglutinációja volt megfigyelhető a lyukakban, ez indokolja ezt a megfigyelést.
C) A monoklón antitestek blokkolják az LÉCII sejtek adhézióját az ELAM-l-et expresszáló sejtekhez
Ennél a kísérletnél vizsgáltuk az SLX-re specifikus antitestek és a nem szialilezett Lex-re specifikus antitestek képességét arra, hogy blokkolják az LÉC 11 sejtek (amelyek expresszálják az SLX-et) és az LÉC 12 sejtek (amelyek expresszálják az Lex-et) ELAM-1-közvetített adhézióját az IL-1B stimulált HUVEC-hez.
Anyagok
Endoteliális sejtként a HUVEC 4. passzátumát alkalmaztuk. A lemezeket az előzőekben leírtak szerint készítettük. Kétszer három párhuzamos lyukat stimulálás nélkül hagytunk kontrollként. Mindegyik lemezen 7 párhuzamost stimuláltunk 30 pg/ml 0,5 ml EGM-UV-ban adagolt IL-lB-val. A sejteket pontosan 4 órán át stimuláltuk. Az LEC11 és LÉC 12 sejteket (ezeket a következő publikációkban ismertetik: Stanley és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263:11374 [1988]) Dr. P. Stanleytől szereztük be. A sejteket szuszpenzió tenyészetben tenyésztettük komplett alfa MÉM közegben, amely a következőket tartalmazza: ribonukleotidok és dezoxiribonukleotidok (Gibco), penicillin (100 egység/ml), sztreptomicin (100 pg/ml) (Irvine Scientific), L-glutamin (2 mmol) (Irvine Scientific) és 10% FBS. A kísérletnél vizsgált monoklón antitestek ugyanazok voltak, mint amelyeket a B) pontban említettünk, ezek: FH6, SNH-3, SH-1, FH-2, SNH-4 és CSLEX-1.
Eljárás
1. Az LÉC 11 és LÉC 12 sejteket begyűjtöttük és CRPMI-vel mostuk. Az életképes sejteket megszámláltuk trypan blue alkalmazásával. 3 χ 106 sejtet helyeztünk 2,10 ml-es vizsgálócsövekbe mindegyik sejtvonalból és 300 μΐ 5lCr (450 pCi) (New England Nuclear) jelzőanyagot adagoltunk mindegyik csőbe. A csöveket 1 órán át 37 °C-on enyhe keverés közben inkubáltuk.
2. A radiojelzett sejteket háromszor cDMEM közeggel átmostuk és összesítés után egy csőbe adagoltuk. A csöveket centrifugáltuk és 4 χ 106 sejt/ml mennyiségre ugyanazon közeg felhasználásával reszuszpendáltuk.
3. 1,6 ml monoklón antitest felülúszót és 1,6 ml tisztított CSLEX-1-et (15 pg) adagoltunk külön csövekbe, a kontroll csövekbe 3,2 ml tápközeget adtunk.
4. 200 μΐ sejtszuszpenziót, amely megfelel 2xl05 LÉC 11 vagy LÉC 12 sejtnek, adagoltunk a monoklón antitesteket tartalmazó csövekbe és 400 μΐ-t a kontroll csövekbe. A csöveket 20 percen át 37 °C-on inkubáltuk enyhe keverés közben.
5. A stimulált HUVEC vizsgáló lemezeket eltávolítottuk az inkubátorból és a sejteket egyszer átmostuk cDMEM folyadékkal, majd a tápközeget eltávolítottuk a lyukakból Pasteur-pipetta alkalmazásával, néhány lyukból egyszerre.
6. A sejtszuszpenziót és a vizsgálólemezt jégfürdőbe helyeztük és 20 percen át hűtöttük.
7. 0,4 ml sejtszuszpenziót adagoltunk mindegyik, a fentiekben ismertetett vizsgálólemez lyukába. A kontroll sejteket stimulált és nem stimulált HUVEC-ra rétegeztük. Az antitesttel kezelt sejteket csak a stimulált lyukakba adagoltuk. Mindegyik vizsgálatot három párhuzamosban végeztük.
8. 0,4 ml alikvot részt adagoltunk mindegyik sejtszuszpenzióból egy üvegcsőbe a bevitt CPM meghatározására.
9. A vizsgálólemezeket 30 percen át 4 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
A további lépéseket az előző A) pont 11-12. lépése szerint végeztük, kivéve, hogy a 12. lépésnél a lemezeket 15 percig hagytuk állni.
A kapott eredményeket a 3A és 3B ábrán mutatjuk be, ezekből kitűnik, hogy az SNH-3, FH6, SNH-4 és CSLEX-1 (ezek SLX-re specifikusak) monoklón antitestek szignifikáns mértékben blokkolják az FC11 sejtek IL-1B stimulált HUVEC-hez való kötődését ELAM1 receptoron keresztül. Az LÉC 12 sejtek, amelyek nem expresszálják az SLX epitópot, nem kötődnek az aktivált endotheliumhoz. Az Lex-re specifikus monoklón antitestek (FH2 és SH1) kismértékű gátlást eredményeznek az LÉC 11 kötődésében.
További bizonyítékot is adtunk arra, hogy a SLX az ELAM-1 receptor primer liganduma, ennél a szialsavat eltávolítottuk az LEC11 és HL-60 sejtekről. Ennél a kísérletnél az LEC11 és HL-60 sejteket az adhéziós vizsgálatot megelőzően Clostridium perfringens neuraminidas-zal (szialidáz) kezeltük 1,6 U/ml mennyiségben (Type X, Sigma Chem. Co.) 90 percen át 37 °C hőmérsékleten 51Cr-jelzéssel. A kapott eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be, ezek igazolják, hogy a szialidáz lényegesen csökkentette az LÉC 11 és HL-60 sejtek aktivált endoteliális sejtekhez való adhézióját, a csökkenés 70-80%.
IV. példa
Glükoszfingolipidet tartalmazó liposzómák, amelyek blokkolják az SLX-expresszáló sejtek kötődését az aktivált endoteliális sejtekhez
Ebben a példában ismertetjük a liposzómák előállítását, amelyek különböző bioszintetikus úton előállított glükoszfingolipideket tartalmaznak, amelyekben a terminális szénhidrát egység vagy SLX, Lex, vagy más hasonló, de nem azonos vegyület. Bemutatjuk a liposzómák képességét arra, hogy blokkolják az SLX-expresszáló HL-60 sejtek és LEC11 sejtek endoteliális sejtekhez való kötődését, amelyet az ELAM-1 expresszálására stimuláltunk IL-lB-val való kezeléssel, amely liposzómák SLX-et vagy SLX utánzó tartalmaznak.
Anyagok
A felhasznált glükoszfingolipideket az I. táblázatban foglaljuk össze, ezeket a Biomembrane Institute, Seattle, WA cégtől szereztünk be, ezek vagy tisztítottak, vagy bioszintetikus úton előállítottak, jellemzésüket NMR-rel vagy tömegspektometriával végeztük a következő irodalmi helyeken leírtak szerint: (Hakomori S. I. és munkatársai, J. Bioi. Chem., 259:4672 [1984] és Fukushi Y. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 259:10511 [1984]). Az SdiLex (SLX) anyagot enzimatikusan szintetizáltuk fükozilcsoportok adagolásával, ehhez colo 205 sejtvonalat alkalmaztunk enzimforrásként és SH-t szubsztrátumként. A nem szialilezett diLex-et hasonlóképpen szintetizáltuk nLca szubsztrátumként való és NCIH-69 sejtvonal alkalmazásával (Holmes és munkatársai, J. Bioi. Chem. 260:7619 [1985]). Az SPG-t és SH-t szarvasmarha vörösvérsejtekből nyertük ki, az nLca-ot SH-ból nyertük a terminális szialozilcsoport kémiai eltávolításával.
A glükoszfingolipideket tartalmazó liposzómákat a következőképpen nyertük: 10 pg mikrolipidet adagol21
HU 216 312 Β tünk 300 pg foszfatidil-kolinhoz (Sigma, tojássárgája) és 500 pg koleszterinhez (Sigma) kloroform/metanol=2/l elegyben, majd az így kapott oldatot nitrogénatmoszférában szárazra pároltuk 15 ml-es csavaros tetejű csőben.
Endotéliális sejtforrásként HUVEC 3. passzátumot alkalmaztunk, amelyet összefolyásig tenyésztettünk zselatin bevonatú 48 lyukú vizsgálólemezen (Costar). A lemezeket az előzőekben leírtak szerint állítottuk elő. Kétszer három párhuzamos lyukat stimulálás nélkül hagytunk kontrollnak. 14-szer három párhuzamost ILΙΒ-val stimuláltunk 30 pg/ml mennyiségben 0,5 ml EGM-UV-ben. A sejteket pontosan 4 órán át stimuláltuk. A HL-60 sejteket és LÉC 11 sejteket a fentiekben leírtak szerint tenyésztettük.
Eljárás
1. Egy 48 lyukú Costar lemezt, amely a zselatinon összefolyásig tenyésztett HUVEC-et tartalmazta, eltávolítottuk az inkubátorból és mindegyik lyukban a tápközeget Pasteur-pipettával kiszippantottuk és vagy 0,5 ml friss EGM-UV tápközeggel, vagy ugyanazon tápközeggel, amely még 30 pg/ml IL-lB-t tartalmazott, helyettesítettük és a lemezeket további 4 órán át inkubáltuk.
2. A HL-60 sejteket és LEC11 sejteket begyűjtöttük és CRPMI-vel mostuk. Az életképes sejteket megszámláltuk trypan blue alkalmazásával. Mindegyik sejttípusból 6χ 106 sejtmennyiséget radiojeleztünk a következőképpen: 3χ 106 sejtet 2,10 ml-es vizsgálócsőbe helyeztük és hozzáadtunk mindegyikhez 300 pl 51Cr (450 pCi) (New England Nuclear) jelzőanyagot. A csöveket 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk enyhe keverés közben.
3. A radiojelzett HL-60 és LÉC 11 sejteket háromszor CRPMI-vel átmostuk és egyesítve egy csőbe adagoltuk. A csöveket centrifugáltuk és 2xl06 sejt/ml mennyiségre ugyanazon tápközeggel reszuszpendáltuk.
4. A stimulált HUVEC vizsgálólemezeket az inkubátorból eltávolítottuk, a lyukakat kétszer RPMI 1640 oldattal átmostuk, amely még 5 mg/ml szarvasmarha szérumalbumint tartalmazott (BSA).
5. A liposzómákat a következőképpen készítettük: a betöményített pelleteket feloldottuk 100 pl abszolút etanolban, majd 2 percen át ultrahanggal kezeltük. 2 ml PBS-t adagoltunk lassan a csövekbe 2 perc alatt, miközben az ultrahangos kezelést folytattuk. Ezt a törzsoldatot 1:10 arányban RPMI 1640 tápközeggel hígítottuk közvetlen a felhasználás előtt és 50 pl BSA törzsoldatot adagoltunk 100 mg/ml koncentrációban minden 1 ml hígított liposzómához, és így a végső koncentrációt 5 mg/ml BSA-ra állítottuk be.
6. A tápközeget mindegyik lyukból eltávolítottuk Pasteur-pipettával, néhány lyukból egyidejűleg, és 0,3 ml liposzómaszuszpenziót adtunk mindegyik IL-1B stimulált lyukhoz. A kontroli-lyukba liposzóma puffért adagoltunk, amely etanolt, RPMI 1640-et és BSA-t tartalmazott azonos koncentrációban, mint a liposzómát tartalmazó lyukakban. A kontrollpuffert nem stimulált és stimulált HUVEC-kal rétegeztük. A liposzómát tartalmazó mintákat csak a stimulált lyukakba adagoltuk.
7. A lemezeket 40 percen át 37 °C-on inkubáltuk, majd 50 pl 51Cr jelzett HL-60 vagy LEC11 sejteket adagoltunk a vizsgálati lyukakba. Mindegyik sejtvonalat három párhuzamosban vizsgáltuk mindegyik liposzómakészítménnyel. A végső sejtkoncentráció 105/350 pl/lyuk érték volt. Háromszor 50 pl alikvot sejtszuszpenziót adagoltunk üvegcsőbe a bevitt CPM meghatározására és a vizsgálólemezt 37 °C-on 30 percen át inkubáltuk.
8. A nem kötött sejteket eltávolítottuk a lyukakból szisztematikus reszuszpenzióval, amelyhez Pasteur-pipettát alkalmaztunk, majd 0,7 ml tápközeg adagolásával és eltávolításával. A lyukakból az összes tápközeget eltávolítottuk és helyére 0,3 ml 0,125 mól triszt, 2% SDS-t és 10% glicerint tartalmazó oldatot adagoltunk. A lemezeket 15 percig állni hagytuk, majd 0,5 ml dH2O-t adagoltunk mindegyik lyukba.
9. A folyadékot mindegyik lyukban reszuszpendáltuk és üvegcsőbe vittük át. A pipetta hegyét beleráztuk a csőbe. A csöveket, beleértve azokat is, amelyek a kezdeti CPM mintákat tartalmazták, gammaszámlálóval számláltuk. A CPM kötéseket mindegyik lyukban elosztottuk a bevitt CPM mennyiségével a százalékos kötés meghatározására. Az átlagot és a standard hibát a három párhuzamos vizsgálat esetén grafikusan ábrázoltuk.
Mint az az 5. ábrából látható, a liposzómák, amelyek olyan glükolipideket tartalmaztak, amelyeknél a terminális szekvencia SLX-et tartalmazott (S-diLex, 1. táblázat) igen jelentős mértékben gátolják a HL-60 sejtek adhézióját az aktivált endotéliális sejtekhez 4 °C hőmérsékleten. Azok a liposzómák, amelyek Lex (diLex) vagy más, hasonló szénhidrát szerkezetű glükolipidet tartalmaztak, minimális inhibíciót mutattak, és ez független volt a szénhidrátcsoport szerkezetétől. Hasonló eredményt kaptunk az LÉC 11 sejtadhézióval kapcsolatban is. Ha a kísérletet 37 °C hőmérsékleten végeztük, a HL60 sejtadhéziót csökkentették a liposzómák, amelyek SLX-szerkezetet tartalmazó glükolipideket tartalmaztak, és kisebb mértékben csökkentették az Lex (diLex, 40%) tartalmú liposzómát, jelezve, hogy az Lex ugyancsak kölcsönhatásba léphet az ELAM-l-el, de kisebb affinitással. Ezek a kísérletek mutatták, hogy a bioszintetikus úton előállított SLX vagy más hasonló SLX utánzó vegyület liposzómakészítmény formájában terápiás anyagként szolgálhat például a leukociták gyulladásos helyekre való infiltrációjának csökkentésére.
A Jurkat-sejtek az IL-1 aktivált endotéliális sejtekhez túlnyomó részt a V-CAM (endotéliális sejt) - VLA-4 (Jurkat-sejt) adhéziós páron keresztül kötődnek (Wayner és munkatársai, J. Cell Bioi. 109:1321) szemben a HL60 és LÉC 11 sejtek aktivált endotéliális sejtekhez az ELAM-1 receptorokon keresztül történő adhéziójával. A Jurkat-sejtadhéziót az SLX-tartalmú liposzómák nem gátolták, de tökéletesen gátolták a VLA-4 intermolekula alfa-alegysége elleni monoklón antitestek. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a HL-60 és LEC11 sejtek SLX liposzómákkal való gátlása nem sztérikus hatás, ami nem a liposzómák endotéliális sejtekhez való kötődésének tulajdonítható, hanem alátámasztja azt a következtetést, hogy az SLX liposzómák az adhézió gátlását az ELAM-1 ligandum kötőhelyénél való közvetlen verseny révén hozzák létre.
V. példa
SLX elleni antitestek, amelyek gátolják a GMP-140 közvetített kötést aktivált humán vérlemezkéknél Ennél a kísérletnél vizsgáltuk az SLX-re és a nem szialilezett Lex-re specifikus monoklón antitestek azon képességét, hogy blokkolják a GMP-140 közvetített adhézióját a HL-60 sejteknek aktivált humán vérlemezkékhez.
Anyagok
A fentiekben ismertetett HL-60 sejteket alkalmaztuk ligandumhordozó sejtforrásként. Nem ligandumhordozó kontrollként Jurkat sejteket alkalmaztunk. A monoklón antitestek a következők voltak: SH-1, FH-2, SNH-4, CSLEX-1.
Eljárás
1. Normál humán donortól vért vettünk ACD antikoagulánst tartalmazó fecskendőbe, a vér és az antikoaguláns közötti arány 6/1 volt, az antikoaguláns összetétele a következő: 2 g dextróz, 2,49 g nátriumnitrát, 1,25 g citromsav, 100 ml dH2O-ban.
A vérlemezkéket differenciális centrifugálással elválasztottuk a következőképpen: a vért 800 fordulat/perc mellett (körülbelül 90 g) 15 percen át centrifugáltuk szobahőmérsékleten. A felülúszót összegyűjtöttük és 1200 fordulat/perc mellett (körülbelül 400 g) 6 percig centrifugáltuk. A felületúszót elválasztottuk és 2000 fordulat/perc mellett (1200 g) körülbelül 10 percen át centrifugáltuk a vérlemezkék pelletezésére. A vérlemezkék alját Tyrode-HEPES pufferral pH=6,5 mostuk (8 g NaCl, 0,2 g KC1, 0,057 g NaH2PO4 H2O, 0,184 g MgCl2 H2O, 0,1 g NaHCO3, 1 g dextróz, 1,383 g HEPES, 1 1-re Dl vízzel kiegészítve és a pH 6,5-re beállítva 1 n NaOH-val), majd ezt követően PBS-sel mostuk. A vérlemezkéket 108/ml koncentráció mellett PBS-ben szuszpendáltuk.
2. Körülbelül 20 perccel azelőtt, mielőtt a vérlemezkékhez utoljára reszuszpendálnánk, 48 lyukú lemezeket bevontunk 0,1% zselatinnal és 15 percen át 37 °C-on inkubáltuk. A felesleges zselatint pipettával eltávolítottuk, mielőtt a vérlemezke szuszpenziót beadagoltuk. A vérlemezkéket 0,25 egység trombin/ml (Sigma T-6759) vérlemezke szuszpenzió adagolásával aktiváltuk. A vérlemezkéket szobahőmérsékleten 20 percen át állni hagytuk.
3. A kötések kialakítására aktivált lemezkéket, 300 μΐ vérlemezke szuszpenziót adagoltunk a géllel beborított lemez mindegyik lyukába. A lemezt 37 °C-on 15 percig inkubáltuk, majd 800 fordulat/perc mellett (90 g) forgattuk. A nem kötött lemezkéket PBS-sel végzett háromszori mosással eltávolítottuk.
4. Mivel a vérlemezkék igen reakcióképes Fc receptorokat tartalmaznak, bármilyen aggregált IgG felvételét az antitestkészítményből megakadályozandó, a lemezkék Fc receptorait a következőképpen blokkoltuk: tisztított egér IgG W6/32 (IgG2a) készítményt 27 mg/ml mennyiségben 63 °C-on 5 percen át melegítéssel aggregáltunk. 300 μΐ melegített készítményt 20 pg/ml mennyiségben PBS-ben adagoltunk minden lyukhoz, majd a lemezt 37 °C-on 15 percen át inkubáltuk, majd PBS-sel mostuk.
5. A HL-60 és Jurkat-sejteket begyűjtöttük és CRPMI oldattal mostuk. Az életképes sejteket trypan blue alkalmazásával megszámoltuk, 3xl06 sejtet helyeztünk mindegyik típusból 2,10 ml-es vizsgálócsövekbe és mindegyik csőhöz 300 μΐ 51Cr (450 pCi) (New England Nuclear) jelzőanyagot adagoltunk. A csöveket 1 órán át 37 °C-on gyenge keverés közben inkubáltuk.
6. A radiojelzett sejteket ezután háromszor CRPMIvel mostuk és egy csőbe összeöntöttük, majd a csöveket centrifugáltuk és 4χ 1016 sejt/ml mennyiségben ugyanazon tápközegben reszuszpendáltuk.
7. 1,6 ml monoklón antitest tenyészet felülúszót és
1,6 ml tisztított CSLEX-1-et (15 pg/ adagoltunk különkülön a vizsgálócsövekbe, a kontrollcsövekbe csupán
1,6 ml tápközeget adtunk.
8. 100 μΐ jelzett HL-60 Jurkat-sejtszuszpenziót (4χ 105 sejt) adagoltunk mindegyik csőbe, amelyek monoklón antitestet tartalmaztak. Ezeket a csöveket 20 percig 37 °C-on enyhe keverés közben inkubáltunk. Ezután 0,3 ml sejt szuszpenziót adagoltunk (7,5 xlO4 sejt) mindegyik lyukba, amely a kötött aktivált vérlemezkéket tartalmazta. Mindegyik vizsgálatot három párhuzamossal végeztük.
9. A vizsgálólemezeket 90 g mellett 2 percig centrifugáltuk, majd 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A nem kötött sejteket a lyukakból eltávolítottuk úgy, hogy a lemezt egy radioaktív hulladékgyűjtőbe fordítottuk és a lemezt töröközővel felitattuk. A lyukakat háromszor óvatosan 300 μΐ PBS-sel lyukanként átmostuk és a lemezeket megforgattuk, majd felitattuk. A tápközeg teljes mennyiségét a lyukakból eltávolítottuk, majd helyére 0,3 ml (0,125 mól) trisz, 2% SDS-t és 10% glicerint tartalmazó oldatot adagoltunk. A lemezeket 15 percig állni hagytuk, majd 0,6 ml dH2O-t adagoltunk mindegyik lyukba.
10. A folyadékot mindegyik lyukban reszuszpendáltuk pipettával, majd üvegcsőbe átvittük. A pipetta hegyét a csőbe beleráztuk. A csöveket, beleértve azokat is, amelyek a kiindulási mintákat tartalmazták, gammaszámlálóval számláltuk. A CPM kötéseket mindegyik lyukban elosztottuk a bevitt CPM mennyiséggel a százalékos kötés meghatározására. A bevitt CPM mennyiséget 0,3 ml sejtszuszpenzió számlálásával határoztuk meg a 8. lépésben ismertetett módon.
A kapott eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be, ezekből kitűnik, hogy az SLX-re specifikus SNH4 és CSLEX-1 monoklón antitestek blokkolják a HL-60 sejtek kötődését az aktivált vérlemezkéken lévő GMP140-hez Az Lex-re specifikus monoklón antitestek (FH2 és SH-1) szintén blokkolják ezt a kötődést, de kisebb mértékben. Ezekből az eredményekből kitűnik, hogy mind az SLX, mind az Lex ligandum lehet a GMP-140 számára, de az SLX szerkezet nagyobb affinitású a GMP-140-hez, mint az Lex szerkezet.
VI. példa
Glükoszfingolipideket tartalmazó liposzómák, amelyek blokkolják az SLX sejtek kötődését az aktivált vérlemezkékhez
Ebben a példában bemutatjuk az SLX-et vagy SLX utánzót tartalmazó liposzómák azon képességét, hogy blokkolják az SLX-expresszáló HL-60 sejtek, valamint a PMN kötődését a vérlemezkékhez, amelyeket stimuláltunk trombinnal való kezeléssel, hogy a GMP-140-et expresszálják. A vizsgálatnál a következő irodalmi helyen leírtak szerint jártunk el: (Larsen és munkatársai, Cell, 63: 467-474 [1990]).
Anyagok
A glükoszfingolipideket a IV. példában leírtak szerint készítettük, a vér lemezkéket az 5. példában leírtak szerint készítettük, kivéve, hogy az Fc receptorok blokkolását nem végeztük el. A HL-60 sejteket a fentiek szerint állítottuk elő.
A MPN-eket 50 ml teljes vérből nyertük, amelyeket önkéntes donoroktól vettünk le heparinizált vacutainer csövekbe, amelyeket megforgattunk, hogy a vért összekeverjük. Mindegyik lépést 22-24 °C hőmérsékleten végeztük. Mindegyik 25 ml mennyiségű vérmintára 15 ml Mono-Poli Resolving Médiumot (Flow Labs) rétegeztünk. A csöveket 800 g mellett 25 percig, majd 130 g mellett 25 percig centrifugáltuk. A PMN réteget ezután eltávolítottuk és tiszta 50 ml-es centrifugálócsőbe helyeztük, majd mindegyik csőhöz 30 ml Hanks Balanced Slat Solution-t (Gibco) adagoltunk, amely 20 mmol HEPES-t (Gibco) és 0,2% glükózt (Fisher) tartalmazott, majd a csöveket 1900 g mellett 3 percig centrifugáltuk. A PMN-eket ezután háromszor ugyanazon pufferral átmostuk, majd 1900 g mellett 3 percig centrifugáltuk. A PMN-t hematométerrel számláltuk, majd 2x 106/ml mennyiségben reszuszpendáltuk és felhasználásig szobahőmérsékleten tartottuk.
Eljárás
1. 20 μΐ aktivált vérlemezke-készítményt 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe helyeztünk (28 db cső, 14 párhuzamos).
2. 20 μΐ hígított liposzómát 10 pg, 5 pg vagy 2 pg mennyiségben, illetve kontrollként puffért alkalmazva a megfelelő csőbe adagoltuk mindegyik párhuzamoshoz.
3. A vérlemezkéket a liposzómakészítményekkel 20 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk.
4. A neutrofileket vagy a sejteket 2x16 sejt/ml mennyiségben adagoltuk az egyik sorozat liposzómával kezelt vérlemezkemíntához. 20 pl sejtszuszpenziót adagoltunk mindegyik csőbe.
5. A csöveket összekevertük és szobahőmérsékleten 20 percen át állni hagytuk. Ezután hemacitométerbe adagoltuk és a sejteket pozitívként (2 vagy több kapcsolt vérlemezke/sejt) vagy negatívként (kevesebb, mint 2 kapcsolt vérlemezke/sejt) értékeltük.
Mint az a 7. ábrából látható, az SLX (S-diLex,
1. táblázat), terminális szekvenciát tartalmazó glükolipidtartalmú liposzómák jelentős mértékben gátolják a HL-60 sejtek aktivált vérlemezkékhez való adhézióját. Az Lex (diLex) vagy hasonló szénhidrát szerkezetet tartalmazó glükolipidtartalmú liposzómák minimális inhibíciót mutatnak és ez független a szénhidrátcsoport szerkezetétől. Hasonló eredményt mutattak a PMN sejtadhézióval kapcsolatban is (8. ábra). Ezen kísérletek mutatják, hogy a bioszintetikus úton előállított SLX vagy hasonló SLX utánzó vegyületek liposzómakészítmények formájában terápiás célra alkalmazhatók, azaz csökkentik a leukociták kötődését a vérlemezkékhez a gyulladásos helyen.
VII. példa
SLX-tartalmú oligoszacharid, amely blokkolja a neutrofilek kötődését a vérlemezkékhez
Ebben a példában a minimális tetraszacharid SLX
GMP-140-hez való adhéziójának gátlását hasonlítjuk össze az SLX-tartalmú penta- és hexaszacharidokéval. A vérlemezkéket és a neutrofileket a fentiekben ismert módon izoláltuk. A vérlemezkéket trombinnal aktiváltuk, majd inkubáltuk különböző oligoszacharidok jelenlétében. A neutrofileket adagoltuk és meghatároztuk a különböző szacharidok hatását a neutrofileknek az aktivált vérlemezkékhez való adhéziójára. Oligoszacharidként a következőket alkalmaztuk: SLX(hexa), NeuAca2,3GalBl,4(Fucal,3)GlcNacBl,3 GalB l,4Glc-OCH2CH2SiMe3 (Professzor Hasegawa nagyvonalú ajándéka, Gifu University, Japán), SLX(penta), NauAca2,3GalBl,4(Fucal,3)GlcNacBl,3GalBl, és SLX(tetra), NeuAca2,3GalBl ,4 (Fucal ,3)GlcNac.
Eljárás
1. A vérlemezkéket a fentiekben leírtak szerint izoláltuk és 2x 108/ml mennyiségben aktiváltuk 20 percig szobahőmérsékleten végzett 0,25 U/ml végső koncentrációban adagolt trombin jelenlétében.
2. A neutrofileket elválasztottuk úgy, hogy heparinizált vért Mono-Poli Resolving Médium (Ficoll-hypayue-Flow Laboratories) médiumra rétegeztünk, majd 25 percig 200 fordulat/perc mellett centrifugáltuk, majd további centrifugálást végeztünk 2500 fordulat/percnél 25 percig.
3. A vizsgálathoz 20 pl vérlemezke szuszpenzió (2xl08/ml) Eppendorf-centrifügálócsőbe helyeztünk, majd hozzáadagoltunk azonos térfogatú oligoszacharidkészítményt 200 pg/ml-0,3 pg/ml koncentrációkban vagy glükolipid-liposzómakészítményt (a fentiek szerint előállítva) 2 pg/ml-0,25 pg/ml közötti koncentrációkban, majd a csöveket szobahőmérsékleten 20 percig állni hagytuk. Ezután 20 pl neutrofil készítményt adagoltunk a csövekhez (2xl06/ml), majd a csöveket további 20 percen át szobahőmérsékleten állni hagytuk.
4. Az aktivált vérlemezkék adhézióját a neutrofilekhez mikroszkopikusan vizsgáltuk, 100 neutrofilt értékeltünk. Ezeket pozitívnak minősítettük, ha kettő vagy több vérlemezke kapcsolódott, és negatívnak, ha kevesebb, mint 2 vérlemezke kötődött. Számoltuk a sejtek százalékát, amelyek kettő vagy több vérlemezkét kötöttek meg.
A kapott eredményeket három párhuzamos kísérlet átlagaként a 2. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat
Oligoszacharid 50%-os gátláshoz szükséges mennyiség (pmol)
SLX (hexa) 1,8
SLX (penta) 2,2
SLX (tetra) 54,0
Lex 43,0
Mint az a 2. táblázatból látható, körülbelül húszszor több SLX-tetraszacharid szükséges a trombinnal aktivált vérlemezkékhez történő GMP-140 közvetített neutrofil kötődés 50%-os gátlásához, mint az SLX-hexaszacharidból. A tetraszacharid szükséges mennyisége körülbelül az a mennyiség, amely szükséges hasonló mértékű gátlás biztosításához, ha nem szializált Lex-et alkalmazunk. A pentaszacharid esetén az 50%-os gátláshoz szükséges koncentráció hasonló a hexaszacharid esetén mért koncentrációhoz, ami jelzi, hogy a minimális szerkezet a maximális gátláshoz közelebb van a pentaszacharidhoz.
VIII. példa
Adhézió blokkolása különböző SLX szerkezetek alkalmazásával
Ebben a példában ismertetjük kísérleteinket a liposzómákban alkalmazott különböző glükolipid szerkezetekkel kapcsolatban. A kísérletnél SY2-t vizsgáltuk, amely egy szializált poliszacharid, amelyben a fukóz ahelyett, hogy a végső GlcNAc-hez lenne kapcsolva, mint az az SLX-ben van, az utolsó előtti GlcNAc-hez volt kapcsolva. A vérlemezkéket és a neutrofileket a fentiekben ismertetett módszer szerint izoláltuk. A vérlemezkéket trombinnal aktiváltuk, majd különböző glükolipideket tartalmazó liposzómák hígításaival inkubáltuk a fentiek szerint. A neutrofileket adagoltuk, majd meghatároztuk a glükolipidek hatását a neutrofilek aktivált vérlemezkékhez való adhéziójára.
A kísérletnél a következő különböző glükolipid szerkezeteket vizsgáltuk: SdiY2, NeuGca2,3GalBl,4(Fucal,3) GlcNAcBl,3GalBl,4 (Fucdl,3)GlcNAcBl,3GalBlCer; SLX, NeuGca2,3GalBl,4(Fucal,3)GlcNAcBl,3GalBl,4GlcBl,Cer, SY2, NeuGca2,3GalBl,4 GlcNAcB 1,3GalB 1,4 (Fuca 1,3) GlcNAcB 1,3 GalB 1,4GlcBl,lCer; SH, NeuGca2,3GalBl,4GlcNAcBl,3GalB 11,4GlcNAcB 1,3GalB 1,4GlcB 1,1 Cer; SPG, NeuGca2,3GalB 1,4GlcNAcB 1,3GalBl ,4GlcB 1,1 Cer.
A kapott eredményeket két azonos kísérlet átlagaként a 3. táblázatban foglaljuk össze.
3. táblázat
Glükolipid 50%-os gátláshoz szükséges mennyiség (pmol)
SY2 (1. példa) 0,325
SY2 (2. példa) 0,345
SLX (hexa) 0,30
SDÍY2 0,36
SPG nincs gátlás
SH nincs gátlás
A kapott eredmények mutatják, hogy az SY2 azonos mértékben gátolja a GMP-140 közvetített adhézióját a neutrofileknek a trombinnal aktivált vérlemezkékhez, mint az SLX és az SDÍY2.
IX. példa
Adhézió blokkolása további SLX variánsokkal
Ebben a példában bemutatjuk, hogy a szialilezett Lex (SLX) affinitása a GPM-140-hez azonos, függetlenül attól, hogy a terminális szialsav az N-acetil-neuraminát (NeuAc) vagy N-glikol-neuraminát (NeuGc) formában van jelen. Mindegyik anyagot a fentiekben leírtak szerint állítottuk elő. A vérlemezkéket és neurofileket az ismertetett módszerrel izoláltuk. A vérlemezkéket trombinnal aktiváltuk, majd különböző, glükolipideket tartalmazó liposzómahígításokkal inkubáltuk. A neutrofileket adagoltuk, majd meghatároztuk a glükolipidek hatását a neutrofilek aktivált vérlemezkékhez való adhéziójára.
A kísérletek eredményeit, amelyben szintetikus SLX-et (NeuAc) hasonlítottunk össze egy SLX készítménnyel, amelyet szarvasmarha eritrocitákból nyert szilalil-paraglobozid enzimatikus fukozilálásával nyertünk [SLX(NeuGc)], a következő 4. táblázatban foglaljuk össze.
4. táblázat
Glükolipid Forrás 50%-os gátláshoz szükséges mennyiség (pmol)
SLX NeuGc (szarvasmarha eritrocita) 0,74
SLX NeuAc (Szintetikus) 0,67
A fenti eredmények mutatják, hogy az SLX-hexaszachariddal gátolt GMP-140 közvetített adhéziója a neutrofileknek trombinnal aktivált vérlemezkékhez azonos, függetlenül attól, hogy a szialsav NeuAc vagy NeuGc. Ez az eredmény azt mutatja, hogy GMP-140 felismeri akár az Ν-cetil-, akár az N-glikolil-szialsav-származékot. Hasonló eredményt kaptunk ELAM-1 alkalmazásával is.
Hasonlóképpen vizsgáltunk különböző más glükolipideket is. A vizsgált glükolipidek szerkezete a következő volt: SLX(hexa), NeuGca2,3GalBl,3GalBl,4(Fucal,3), GlcNAcBl,3GalBl,4, 4GlcBl,l ceramid; ct2,3 SLX cer, NeuAca2,3GalBl,4 (Fucal,3) GlcNAcBl,3Gal,4GlcBl,l ceramid; a2,6 SLX cer, NeuAca2,6GalBl,4(Fucal,3)GlcNAcBl,3GalBl,4GlcBl,l ceramid; SH, NeuGca2,3GalBl,4 GlcNAcB 1,3 GalB 1,4GlcNAcBl,3GalBl,4GlcBl,l ceramid.
X. példa
Adhézió blokkolása szintetikus SLX alkalmazásával
Ebben a példában bemutatjuk, hogy a szintetikus SLX megköti az ELAM-1-et és gátolja a neutrofil adhézióját az aktivált endotheliumhoz. A kísérlettel bemutatjuk azt is, hogy a szialsavkötés befolyásolja az ELAM-1 hez való kötődést.
Két szintetikus vegyületet készítettünk. Az egyik szialsavat tartalmaz az a2,3-kötésben, ugyanúgy, mint a természetben előforduló SLX. A második vegyület egy a2,6 kötésben lévő szialsavat tartalmaz, ezzel vizs25 gálni kívántuk a receptorokhoz való kötések természetének fontosságát.
Liposzómakészítményeket állítottunk elő úgy, hogy 12 μΐ abszolút etanolt adagoltunk mindegyik csőbe, ezeket rövid ideig 50 °C-os vízfürdőn melegítettük, majd 2 percig ultrahanggal kezeltük. Ezután mindegyik csőhöz lassan 200 μΐ meleg foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS) adagoltunk ultrahangos kezelés közben és ezt a kezelést további 10 percen át folytattuk. A törzsoldat liposzómák végső koncentrációja 400 pg glükolipid/ml volt 5%-os ETOH/PBS oldatban.
Eljárás
1. HUVEC, PMN és liposzómakészítményeket készítettünk a fentiekben leírtak szerint.
2. A stimulált HUVEC lemezt eltávolítottuk az inkubátorból, a lyukakat kétszer RPMI 1640 oldattal átmostuk, amely 5 mg/ml szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) tartalmazott.
3. A liposzóma törzsoldatokat a HBSS/BSA pufferban hígítottuk a következő koncentrációkra: 40 pg/ml, 30pg/ml, 15 pg/ml, 7,5 pg/ml, 3,75 pg/ml és 1,87 pg/ml. Hasonló hígításokat készítettünk a PBS-5% ETOH tartalmú kontroll törzsoldatokból is.
4. A tápközeget eltávolítottuk a vizsgálólemez lyukaiból Pasteur-pipettával, egyidejűleg néhány lyukból.
5. 0,05 ml liposzómaszuszpenziót adagoltunk két párhuzamosban a stimulált vizsgálólemezen lévő lyukakba. A kontroli-lyukakba liposzóma puffért adagoltunk, amely etanol HBSS-t és BSA-t tartalmazott azonos koncentrációban, mint a liposzómát tartalmazó lyukakban. Kontrollpuffert rétegeztünk a nem stimulált és stimulált HUVEC-ra. A liposzómát tartalmazó mintákat csak a stimulált lyukakba adagoltuk.
6. A lemezeket 40 percen át 37 °C-on inkubáltuk, majd 50 μΐ PMN-t adagoltunk a vizsgálati lyukakba. A végső sejtkoncentráció minden lyukban 5χ 105 érték 100 μΐ-ben.
7. A vizsgálólemezeket visszahelyeztük az inkubátorba (5% CO2,37 °C-on 8 perc).
8. A nem megkötött sejteket eltávolítottuk a lyukakból szisztematikus reszuszpenzióval, amelyhez P200 többcsatornás pipettát alkalmaztunk, majd 0,2 ml tápközeget adagoltunk és el is távolítottuk.
9. Az összes tápközeget eltávolítottuk a lyukakból és 50 μΐ szolubilizált puffért adagoltunk. Ez a következőket tartalmazza: citrátpuffer (24,3 ml 0,1 mólos citromsav, 0,5 g/500 ml + 25,7 ml 0,2 mólos kétbázisú nátrium-foszfát, 14,2 g/500 ml és H2O 100 ml-ig szükséges mennyiségben), valamint 0,1% NO-40 detergens.
10. A lemezeket forgó rázóberendezésen 10 percen át inkubáltuk, majd 0,05 ml OPDA oldatot adagoltunk [8 mg o-fenilén-diamin, Sigma, cat# P-1526, 8 μΐ 30%os H2O2, 10 ml citrátpuffer (lásd fent)} minden lyukba. A reakciót 15 percig hagytuk végbemenni, majd 25 μΐ 4 n H2SO4-et adagoltunk minden lyukba a reakció leállítására.
11. Reagens keveréket készítettünk úgy, hogy 100 μΐ térfogatú szolubilizált puffért és a fenti OPDA oldatot elkevertük 50 μΐ 4 n kénsavval.
12. 100 μΐ felülúszót eltávolítottuk a két lyuk mindegyikéből és egy flexibilis ELISA lemezre (Falcon) vittük át. A lemezt spektrofotometrikusan vizsgáltuk 492 nm-nél 30 peren belül.
A fenti két kísérlet eredményét a következő 5. táblázatban foglaljuk össze.
5. táblázat
Koncentráció (2,6) SLX Átlag (2,3) SLX Átlag
1 20 pg/ml 0,663 0,156
2 15 pg/ml 0,636 0,270
3 7,5 pg/ml 0,602 0,359
4 3,75 pg/ml 0,655 0,483
5 1,87 pg/ml 0,690 0,580
6 0,47 ttg/ml 0,695 0,642
7 0 pg/ml 0,710 0,716
Koncentráció Kontroll+ IL-1B Átlag Kontroll+ IL-1B Átlag
1 20 pg/ml 0,657 0,010
2 15 pg/ml 0,740 0,010
3 7,5 pg/ml 0,658 0,013
4 3,75 pg/ml 0,698 0,009
5 1,87 pg/ml 0,725 0,014
6 0,47 pg/ml 0,782 0,018
7 0 pg/ml 0,708 0,016
A fenti eredmények mutatják, hogy a szintetikus cc(2,3)szialil Lex-et, de nem a(2,6)szialil Lex-et tartalmazó liposzómák gátolják a neutrofil adhézióját az aktivált endotheliumhoz egy ELAM-1-függő kötési vizsgálatnál. így az a2,3 kötése a szialsavnak úgy tűnik szükséges ahhoz, hogy az ELAM-1 felismerje. Továbbá, az eredmények azt is mutatják, hogy a szintetikusan előállított oligoszacharid, az a(2,3)szialil Lex kötődik az EL AM-1-hez és blokkolja a neutrofilek kötődését az aktivált endotheliumhoz. Hasonló eredményeket találtunk a GMP-140 esetén is és ezeket a 9. ábrán mutatjuk be. Ezen vegyület vagy ezek származékai ily módon hatásos gyulladásgátló szemek tűnnek.
XI. példa
HL-60 sejtek kezelése endo-fi-galaktozidázzal
Ennél a kísérletnél vizsgáltuk, hogy vajon a HL60 sejtek szializált Lex belső-B-galaktóz-vázcukor-kötése érzékeny-e az endo-B-galaktozidázzal való hasításra, amely egy enzim, amelyről ismert, hogy hasítja a belső B-galaktóz kötést polilaktózaminil-szerkezetekben, de nem hasítja, ha a GlaNAc mannózhoz kapcsolódik (mag típusú szerkezetek).
Eljárások
A vérlemezkéket a fentiekben leírt módszerek szerint izoláltuk és aktiváltuk trombinnal. Az IL-1B aktivált HUVEC-et szintén a fentiek szerint állítottuk elő. Tenyésztett HL-60 sejteket endo-B-galaktozidázzal ke26 zeltünk az alábbiakban leírtak szerint és meghatároztuk az enzimes kezelés hatását a HL-60 sejtek GMP140 közvetített adhéziójára az aktivált vérlemezkékhez.
A HL-60 sejtek enzimes kezelését a következőképpen végeztük: 12,4χ 106 sejtet kétszer Hanks Balanced Salt Solutionnal mostunk, amely 20 mmol HEPES-t és 0,2% glükózt tartalmazott, majd ezt követően egyetlen mosási lépést végeztünk normál sóoldattal. Az endo-Bgalaktozidázt (0,1 egység, ICN Chemicals, Inc. Irvine, CA) 200 ml normál sóoldatban és 200 μΐ nátrium-acetátban oldottuk, pH = 6,01. Ezután 200 μΐ oldatot (0,05 U enzim) adagoltunk 3 χ 106 HL-60 sejthez, majd 200 μΐ acetátpuffert adagoltunk azonos számú sejthez, ez volt a pufferkontroll. Mindegyik csövet 37 °C-on 60 percen át inkubáltuk enyhe rázás közben. A csöveket ezután jéggel lehűtöttük, majd a sejteket háromszor HEPES-t és glükózt tartalmazó HBSS oldattal háromszor mostuk, majd számláltuk és 2x 106/ml koncentrációban szuszpendáltuk.
A GMP-140 vizsgálathoz 20 μΐ Tyrode-HEPES puffért, pH = 7,2, Eppendorf-csőbe mértünk, majd hozzáadtunk azonos térfogatú aktivált vérlemezkéket (2x 108/ml) és HL-60 sejteket (2x 106/ml), majd keverés után a csöveket szobahőmérsékleten 20 percen át állni hagytuk. A HL-60 sejtek vérlemezkékhez való adhézióját mikroszkopikusan értékeltük a fentiekben a neutrofílek és aktivált vérlemezkék adhéziójánál leírtak szerint.
Az ELAM-1 vizsgálathoz a HL-60 sejtek enzimes kezelését a fentiekhez hasonlóan végeztük, kivéve, hogy a sejteket egyidejűleg szintén a már ismertetett módon 5lCr anyaggal jelöltük. Az ELAM-1 közvetített adhéziót úgy állítottuk meg, hogy 2xl05 kezelt vagy kezeletlen sejtet IL-1 aktivált HUVEC-kal 20 percen át 4 °C hőmérsékleten inkubáltunk, majd a lemezeket Pasteur-pipettával mostuk.
A kapott eredmények azt mutatják, hogy a HL60 sejtek endo-B-galaktozidázzal való kezelése gátolja a képességüket, hogy 1) trombinnal aktivált vérlemezkékhez kötődjenek (87,5%) és 2) IL-1B aktivált HUVEC-hez kötődjenek 4 °C hőmérsékleten, (70%). így a GMP-140 minimál SLX-tartalmú tetraszacharid ligandumja valószínűleg a laktózhoz vagy a polilaktózaminil-szerkezethez kötődik inkább, mint a mannózhoz.
XII. példa
Fukozilált poliszacharid blokkolja a neutrofdek vérlemezkékhez való kötődését
Ebben a példában összehasonlítottuk a fükozilált poliszacharid képességét a GMP-140 közvetített adhézió gátlására a nem fukozilált poliszacharidéval, a hexaszacharid SLX-ével és a Lex-ével. A vérlemezkéket és a neutrofileket a fentiek szerinti eljárással izoláltuk, majd a vérlemezkéket trombinnal aktiváltuk, majd különböző oligoszacharidok hígításaival inkubáltuk. A neutrofileket adagoltuk és meghatároztuk a szacharidok hatását a neutrofileknek az aktivált vérlemezkékhez való adhéziójára. A felhasznált oligoszacharidok a következők voltak: natív poliszacharid és fükozilált származéka (ezek előállítását az alábbiakban ismertetjük); SLX hexaszacharid, LNF III (Lex) és LNF I (a szerkezeteket a későbbiekben ismertetjük).
A lineáris magszerkezetű SLX-et tartalmazó poliszacharidok átalakítását többértékű SLX-et tartalmazó poliszachariddá enzimatikus fükozilálással végeztük. Az la típusú natív poliszacharidokat a Streptococcus B csoportjából nyertük Jennings és munkatársai módszere szerint (Jennings és munkatársai, Biochem. 22 1258-1263 [1983]). A megfelelő bakteriális törzseket az American Type Culture Collectionnál helyeztük letétbe 12400, 31574, 12401 és 31575 deponálási számokon sorrendben a következő időpontokban: 1955. november 28., 1979. október 1., 1955. november 28., 1979. október 1.
A fükozilált poliszacharidok előállításához az la típusú natív poliszacharidból 1 mg-ot feloldottunk a következő keverékben: 6 μΐ 1 mólos mangán-klorid, guanizon 5’-difoszfát-B-L-fükóz radiojelzéssel ellátva (specifikus aktivitás 1,82 χ 106 cpm/mmol), 0,9 pmol 90 μΐ vízben, valamint 137 μΐ víz. Ezen keverékhez 100 μΐ 3/4 fukozil transzferázt adagolunk, amelyet humán tejből izoláltunk Prieels és munkatársai módszere szerint (Prieels és munkatársai, J. Bioi. Chem. 256 10456-10463 [1981]).
A reakciókeveréket ezután membránnal szemben betöményítettük (100 K cut off érték) többször vízzel és az elfolyó anyagot liofílizáltuk, így poranyagot nyertünk. Ezt a szilárd anyagot ezután vízben feloldottuk és gyenge kationcserélő oszlopon átengedtük a visszamaradó protein eltávolítására. A radioaktív frakciókat, amely a fükozilált poliszacharidot tartalmazta, összegyűjtöttük és liofílizáltuk. Körülbelül a hozzáférhető oldalláncokból 50 lett fükozilálva és beépített radiojelzés alapján végzett mérések szerint.
Eljárás
A vérlemezkék izolálását a fentiek szerint végeztük, majd 2xl08/ml mennyiséget trombinnal való inkubálással aktiváltunk 20 percig szobahőmérsékleten, a trombin végső koncentráció 0,25 U/ml.
A neutrofileket elválasztottuk úgy, hogy heparinizált vért Mono-Poly Resolving médiumra rétegeztünk (Ficoll-Hypaque, Flow Laboratories), majd 25 percig 2000 fordulat/percnél centrifugáltuk, majd további 25 percen át 2500 fordulat/percnél végeztük a centrifugálást.
A vizsgálat céljára 20 μΐ vérlemezke szuszpenziót (2xl08/ml) Eppendorf-centrifugacsőbe helyeztünk, majd azonos térfogatú oligoszacharid készítményt adagoltunk hozzá 500 μg/ml-2 pg/ml koncentrációban és a csöveket szobahőmérsékleten 20 percen át állni hagytuk. Ezután 20 μΐ neutrofil készítményt (2 χ 106/ml) adagoltunk és a csöveket további 20 percen szobahőmérsékleten állni hagytuk.
Az aktivált vérlemezkék neutrofilekhez való adhézióját mikroszkopikusan értékeltük. 100 neutrofilt vizsgáltunk, pozitívnak értékeltük, ha kettő vagy több vérlemezke kapcsolódott és negatívnak, ha kettőnél kevesebb. Számoltuk a sejtek százalékos mennyiségét, amelyek kettő vagy több vérlemezkét kötöttek meg.
Mint az a 6. táblázatból kitűnik, a fükozilált poliszacharid igen hatásosan gátolta a neutrofílek GMP27
HU 216 312 Β
140 közvetített kötődését a trombinnal aktivált vérlemezkékhez. Az 50%-os gátlást kevesebb, mint 1 pg/ml koncentrációval lehetett elérni. Ezt hasonlítjuk össze a 20 pg/ml értékkel, amely szükséges a natív poliszacharidból és a 8 pg/ml értékkel, amely szükséges az SLX hexaszacharidból hasonló mértékű gátlás biztosításához.
6. táblázat
Oligoszacharid 50%-os gátláshoz szükséges mennyiség (pmol)
Natív poliszacharid 15
Fukozilált poliszacharid 0,7
Slex hexaszacharid 8
LNF III (Lex) 35
LNFI nincs gátlás
XIII. példa
Patkányok védelme endotoxikus sokkal szemben (letalitás) LAM-2-vel szembeni monoklón antitesttel
Ebben a példában bemutatjuk az mAb P6E2 (ez egér IgG3k, funkcionális antihumán ELAN-1 mAb, leírása a 07/645 878 számú függő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben) hatásosságát lipopoliszacharid-indukált halálozásos állatkísérletben. A kísérlethez patkány rendszert választottunk, mivel kimutatták, hogy a P6E2 keresztreakcióba lép az ELAM-l-gyel szembeni patkány ekvivalenssel.
Anyagok és eljárások
E. coli 0111 :B4 (Sigma) törzsből LPS-t készítettünk frissen, egyetlen nappal a felhasználás előtt úgy, hogy 5 mg/ml koncentrációban steril, nem lázkeltő sóoldatban oldottuk. Az oldatot ultrahanggal jégen 30 percen át kezeltük, Tekmark Sonic berendezés felhasználásával. A felhasználás előtt anyagot 30 másodpercig ultrahangoztuk.
Nőstény Lewis patkányokat (200 g±10 g) szereztünk be a Charles River Breeding Labs-tól és legalább 7 napon át tartottuk őket adaptálás céljából. 10 állatból álló csoportot alkalmaztunk, hacsak másképp nem jelöljük. Mindegyik reagenst parenterálisan, a farokvénán keresztül adagoltuk. Negatív kontrollként az állatok vagy steril, LPS-mentes sóoldatot vagy egér lgG3k myeloma proteint kaptak (J606, alacsony pirogenitás, <2 ng/mg protein).
Eredmények
A P6E2 dózis protokollt empirikusan állapítottuk meg a patkányoknak profilaktikusan adagolt P6E2 farmakokinetikai adataiból. A „minimális” LD100 dózist empirikusan 7,5 mg/kg értékben határoztuk meg ezeknél a patkányoknál.
Az egyik kísérletnél a patkányokat 10 mg/kg mennyiségben 1 órával az LPS kezelés előtt kezeltük. Emlékeztető oltást adagoltunk 3 órával az LPS kezelés után. 10 állat közül 4 túlélte az LPS fertőzést. Ezzel szemben mind a 10 kontroll (sóoldattal injekciózott) kísérleti állat elpusztult. A 24 órás megfigyelési periódusnál a túlélő állatok az LPS-kezelt állatokra jellemző néhány klinikai tünetet mutattak.
A következő P6E2 dózisok a következők voltak: 1) 2-szer nagyobb dózis, 2) egy nagyságrenddel alacsonyabb dózis, mint az első kísérletnél alkalmazott 10 mg/kg érték. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a P6E2 hatása szignifikáns: 80%-a az állatoknak túlélte a kezelést 10 mg/kg dózisnál (10. ábra). Megjegyezzük, hogy a kontroll csoportban is 1 állat túlélő volt.
Egy másik vizsgálatnál a P6E2 terápiás értékét mutattuk ki. Az állatoknak 10 mg/kg mennyiségben iv bolus dózisban P6E2-t adagoltunk 1 órával az LPS fertőzés előtt, vagy 2, 4 vagy 6 órával utána.
Ismételten a 10 állat közül 1 túlélő volt a sóoldatos kontrollcsoportból, valamint a 10 mg/kg mennyiségben J606 myeloma proteinnel kezelt csoportból T= -60 percnél (11. ábra). A P6E2 protektív hatású akkor is, ha az adagolást 2 vagy 4 órával az LPS fertőzés után végezzük.
Következtetés
A Cytel mAb P6E2 antitesttel való védelem mutatja az ELAM-1 fontosságát egy halálos kimenetelű állatkísérlet esetén.
XIV. példa
SLX liposzömák tekeredése az IL-1 aktivált nyúl endoteliális sejtekre
Célkitűzés
Ebben a példában demonstráljuk, hogy a szialilezett Lewis x (SLX) és a szialoparaglobozid (SPG), amelyeket biológiai forrásokból izoláltunk és liposzómákba építettünk be, az aktivált nyúl venulákra „tekeredik”.
A „tekeredés” egy korai intercelluláris kölcsönhatás a leukociták és az endoteliális sejtfal között. A leukocita „feltekeredik” az endoteliális sejtekre. A leukocita ezután vagy 1) visszakerül felszabadulással a keringésbe, vagy 2) az endoteliális sejthez tapad, és megindul a korai folyamat, ami gyulladásban kulminál. A szelektinek részt vesznek ebben a „feltekeredési” sejt-sejt kölcsönhatásban (Adrián és munkatársai, Proc.Bat’l Acad. Sci. —:—[1991]).
Anyagok
Glükoszpingolipideket tartalmazó liposzómákat készítettünk a következőképpen: 50 pg glükolipidet elkevertünk 150 pg foszfatidil-kolinnal (Sigma, tojássárga), 250 pg koleszterinnel (Sigma) és 1 mmol karboxifluoreszceinnel (Sigma) kloroform/metanol=2/l elegyben és az egész oldatot csavaros tetejű üvegcsőben szárazra pároltuk. A liposzómák előállításához 12,5 pl abszolút etanolt adagoltunk mindegyik csőbe, rövid ideig vízfürdőn melegítettük, majd 2 percig ultrahangoztuk és 238 pl meleg PBS-t adagoltunk lassan mindegyik csőbe, miközben ultrahangos kezelést végeztünk és ezt még összesen 10 percig tovább folytattuk. A liposzómák térfogatát 1 ml-re egészítettük ki PBS-sel és 14000 fordulat/perc mellett 2 percig centrifugáltuk a felesleg EtOH és karboxi-fluoreszcein eltávolítására. A felülúszót eldobtuk, a liposzómát ismételten 1 ml
HU 216 312 Β
PBS-ben szuszpendáltuk, hemacitométeren számoltuk és 5χ 106 liposzóma/ml értékre beállítottuk. 1 ml-t injekcióztunk a nyulakba, amelyeket ezt megelőzően 4 órán át IL-l-gyel aktiváltunk.
A feltekeredést intravital mikroszkóp alkalmazásával figyeltük Adrián és munkatársai leírása szerint. Az IL1 aktivált nyúl bélfodrot exteriorizáltuk és 37 °C hőmérsékletű tárgylemezen eloszlattuk a mikroszkóp tárgyasztalán. A bélfodrot 36,5 °C hőmérsékletű sóoldatba merítettük és 5% CO2 tartalmú N2-vel kiegyensúlyoztuk. A liposzóma-endothelium kölcsönhatást intravitál mikroszkóppal 50X só-víz immerziós objektívvei figyeltük meg. A liposzómákat fluoreszcensz fénnyel való megvilágítással vizualizáltuk. A liposzómákat egy kiválasztott bélfodor venula szegmensnél (20-40 μτη átmérőben) 1 percen át számoltuk.
Eredmények
Liposzómafeltekeredés IL-1 aktivált nyúl sejtekre
Beadagolt anyag: feltekeredés humán neutrofilek 4 (maximális mennyiség)
Slex liposzómák 2
SPG liposzómák 0 (nincs tekeredés)
Következtetés
Az LAM-1 mellett (Adrián és munkatársai) az ELAM-1 és liganduma szintén úgy tűnik, hogy részt vesz a leukocita marginációs vagy „feltekeredéses” folyamatban.
Meg kívánjuk jegyezni, hogy bár a találmányt részletesen az előző példákkal kívántuk illusztrálni az érthetőség kedvéért, nyilvánvaló, hogy ezen túlmenően bizonyos változások és módosítások szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Claims (64)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy gyógyászatiig elfogadható hordozott, valamint (I) általános képletű, szelektinreceptorhoz szelektíven kötődni képes molekularészt tartalmazó vegyületet összekeverünk: - a képletben
    R] jelentése egy oligoszacharid vagy egy (II) általános képletű csoport, amelynek képletében
    R3 és R4 jelentése azonos vagy különböző, és lehet 1-8 szénatomos alkil-, hidroxil-1-8 szénatomos alkilvagy alkoxi-1-8 szénatomos alkilcsoport,
    R2 jelentése Bl,3Gal, al,2Man vagy l,6GalNAc, és 5 a értéke 0 vagy 2.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű molekularészt tartalmazó vegyületként egy oligoszacharidot, vagy oligopeptidet
    10 vagy egy lipidet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan molekularészt tartalmazó vegyületet alkalmazunk, amelynek (I) általános képletében R3 és R4
    15 együttesen egy 4-8 tagú gyűrűt képez.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan molekularészt tartalmazó vegyületet alkalmazunk, amelyben a 4-8 tagú gyűrű egy monosza20 charid.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  5. 5. A 4. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan molekularészt tartalmazó vegyületet alkalmazunk, amelyben a monoszacharid
    25 egy sziálsav.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  6. 6. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan molekularészt tartalmazó vegyületet alkalmazunk, amelyben a sziálsav NeuAca2,3 vagy NeuGca2,3.
    30 (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan molekularészt tartalmazó vegyületet alkalmazunk, amelyben az oligoszacharid NeuAca2,3GalBl,4GlcNAcBl ,3 vagy NeuGcot2,3GalB,4GlcNAcB 1,3.
    35 (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű molekularészletet tartalmazó vegyületként poliszacharidot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
    40
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliszacharidként a következő képletnek megfelelő ismétlődő egységet tartalmazó poliszacharidot alkalmazunk:
    NeuAca2,3GalBl,4 (Fucal,3)GlcNAcBl,3Gal Bl,4->
    IBI,4
    Glc
    T (Elsőbbsége: 1990. június 15.) lő ismétlődő egységet tartalmazó poliszacharidot alkal
  10. 10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, mázunk:
    hogy poliszacharidként a következő képletnek megfeleI
    NeuAca2,3GalB 1,4 (Fuca 1,3)GlcNAcB 1,3GalB 1 ,GlcB 1,3GlcB 1,2-4 |B1,6 Gál (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  11. 11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, lő ismétlődő egységet tartalmazó poliszacharidot alkalhogy poliszacharidként a következő képletnek megfele- mázunk:
    I
    Glc | Bl,6
    NeuAca2,3GalB 1,4(Fucal ,3)GlcNAcB 1,3 GalB 1,4-» (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  12. 12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliszacharidként egy, a Streptococcus-B csoportba tartozó fukozilált, la típusú poliszacharidot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  13. 13. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliszacharidként egy, a Streptococcus-B csoportba tartozó II. vagy III. típusú poliszacharidot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  14. 14. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliszacharidként egy, mintegy 5000 dalton és mintegy 300000 dalton közötti molekulatömegű poliszacharidot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  15. 15. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliszacharidként egy, mintegy 5 és mintegy 200 közötti fukozilált, ismétlődő egységet tartalmazó poliszacharidot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poliszacharidként egy, mintegy 25 és mintegy 100 közötti fukozilált, ismétlődő egységet tartalmazó poliszacharidot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  17. 17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű molekularészt tartalmazó 35 vegyületként szfingolipidet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű molekularészt tartalmazó vegyületként gangliozidot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  19. 19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű molekularészt tartalmazó vegyületként egy, vaszkuláris endoteliális sejten vagy egy vérlemezkén expresszálódó szelektinreceptorhoz szelektíven kötődni képes molekularészt tartalmazó vegyületet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. november 28.)
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű molekularészt tartalmazó vegyületként egy, szelektinreceptorként ELAM-1-hez vagy GMP-140-hez szelektíven kötődni képes molekularészt tartalmazó vegyületet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. november 28.)
  21. 21. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy gyógyászatiig elfogadható hordozóanyagot és egy, a szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő vegyületet tartalmazó liposzómát összekeverünk.
    (Elsőbbsége: 1990. november 28.) 60
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez10 ve, hogy liposzómaként gyulladásgátló kemoterápiás szert tartalmazó liposzómát alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. november 28.)
  23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyulladásgátló szerként ciklosporin A-t, indo15 metacint, naproxent, FK-506-ot vagy mikofenolsavat alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. november28.)
  24. 24. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő ve20 gyületként a (VIII) általános képletnek megfelelő vegyületet alkalmazunk - a képletben R, jelentése az alábbi csoportok bármelyike: NeuAca2,3,NeuGca2,3, NeuAca2,3GalBl,4GlcNAcBl,3 vagy NeuGca2,3GalBl,4GlcNAcBl,3;
  25. 25 R2 jelentése Bl,3Gal, al,2Man vagy ctl,6GalNac a értéke 0 vagy 1, és X jelentése glükoprotein vagy lipid.
    (Elsőbbsége: 1990. november 28.)
    25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez30 ve, hogy (VIII) általános képletű vegyületként olyan vegyületet alkalmazunk, amelynek (VIII) képletében X jelentése 40 000 dalton és mintegy 250 000 dalton közötti molekulatömegű glükoprotein.
    (Elsőbbsége: 1990. november 28.)
  26. 26. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (VIII) általános képletű vegyületként olyan vegyületet alkalmazunk, amelynek (VIII) képletében X jelentése egy, mintegy 600 dalton és mintegy 4000 dalton közötti molekulatömegű glükolipid.
    40 (Elsőbbsége: 1990. november 28.)
  27. 27. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő vegyületként a következő, (IX), (X) és (XI) általános képletek bármelyikének megfelelő molekularészt tartalma45 zó vegyületet alkalmazunk: a képletekben
    R jelentése Bl,3Gal, al,2Man vagy al,6GalNac, és a értéke 0 vagy 1.
  28. 28. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő ve50 gyületként vaszkuláris endoteliális sejten vagy vérlemezkén expresszálódó szelektinreceptorhoz kötődő vegyületet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  29. 29. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, az55 zal jellemezve, hogy egy gyógyászatiig elfogadható hordozóanyagot és egy, szelektinreceptorhoz szelektíven kötődni képes, (VIII) általános képletű vegyületet összekeverünk - a képletben
    R[ jelentése egy oligoszacharid vagy egy (II) általános képletű csoport, amely képletében R3 és R4 jelentése
    HU 216 312 Β azonos vagy különböző, és lehet 1-8 szénatomos alkil-, hidroxil-1-8 szénatomos alkil-, vagy alkoxialkil-csoport,
    R2 jelentése Bl,3Gal, al,2Man vagy al,6GalNac, és a értéke 0 vagy 1, és
    X jelentése -OH, -NH3, -NHR3, -NR3R4, -OR3,
    -R3, amely képletekben R3 és R4 jelentése azonos vagy különböző, 1 -20 szénatomos alkilcsoport. (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő vegyületként a következő, (IX), (X) és (XI) általános képletek bármelyikének megfelelő molekularészt tartalmazó vegyületet alkalmazunk: a képletekben
    R jelentése Bl,3Gal, al,2Man vagy ccl,6GalNac, és a értéke 0 vagy 1.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  31. 31. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és egy, két vagy több - a szelektinreceptorhoz szelektíven kötődni képes, egy szelektinkötő csoportot tartalmazó, kapcsoló molekularészen keresztül kapcsolódó és (VIII) általános képletnek megfelelő - ismétlődő egységet tartalmazó vegyületet összekeverünk - a képletben
    R, jelentése egy oligoszacharid vagy egy (II) általános képletű csoport, amely képletben R3 és R4 jelentése azonos vagy különböző, és lehet 1-8 szénatomos alkil-, hidroxi-1-8 szénatomos alkil- vagy alkoxi1-8 szénatomos alkil-csoport,
    R2 jelentése Bl,3Gal, al,2Man vagy al,6GalNac, a értéke 0 vagy 1, és X jelentése egy kapcsoló molekularész.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kapcsoló molekularészként (V) vagy (VI) általános képletű molekularészt tartalmazó vegyületet keverünk össze gyógyászatilag elfogadható hordozóval a képletben m és n értéke azonos vagy különböző, és értékük 2 és
    12 közötti egész szám,
    Y jelentése O vagy S,
    W jelentése O, S vagy NH.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  33. 33. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kapcsoló molekularészként egy 5-14 tagú gyűrűt alkalmazunk, amely két, (VII) általános képletű szubsztituenst tartalmaz - a képletben
    Y jelentése O vagy S, és a szubsztituensek cisz-, vagy transz-helyzetben vannak.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  34. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kapcsoló molekularészként egy olyan 5 -14 tagú gyűrűt alkalmazunk, amelyben a szubsztituensek helyzete az l,2-l,(p/2)+1 elrendezésnek felel meg, ahol p jelentése 5-14 közötti egész szám, amely megfelel a gyűrű méretének.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  35. 35. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, valamint két nitrogénatomot és két, egyenként a nitrogénatomok egyikéhez kapcsolódó, szelektin-megkötő - (I) általános képletű - molekularészt tartalmazó heterociklusos vegyületet összekeverünk - a képletben
    R[ jelentése egy oligoszacharid vagy egy (II) általános képletű csoport, amelynek képletében R3 és R, jelentése azonos vagy különböző, és lehet 1-8 szénatomos alkil-, hidroxil-1-8 szénatomos alkil- vagy -alkoxi-1-8 szénatomos alkil-csoport,
    R2 jelentése Bl,3Gal, al,2Man vagy l,6GalNac, és a értéke 0 vagy 1.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  36. 36. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterociklusos vegyületként piperazint vagy homopiperazint alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  37. 37. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, valamint egy, a következő, (IX), (X) és (XI) általános képletek bármelyikének megfelelő szelektinmegkötő oligoszacharid molekularészhez kötött aminosavat vagy oligopeptidet alkalmazunk - a képletekben R jelentése Bl,3Gal, al,2Man vagy al,6GalNac, és a értéke 0 vagy 1.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  38. 38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aminosavként lizint, homolizint, omitint, diamino-vajsavat, aszparagint vagy diamino-propionsavat alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  39. 39. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oligopeptidként az aminosavat tartalmazó oligopeptidet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  40. 40. A 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oligopeptidként a következő aminosavak közül egyet vagy többet tartalmazó oligopeptidet alkalmazunk: lizin, homolizin, omitin, diamino-vajsav, aszparagin, diamino-propionsav.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  41. 41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligopeptidként a fenti aminosavak mellett az alábbi aminosavak közül egyet vagy többet tartalmazó oligopeptidet alkalmazunk: alanin, tirozin vagy radiojódozott tirozin.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  42. 42. A 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oligopeptidként a (XII) vagy (XIII) általános képletű molekularészt az N-terminális rész felől a Cterminális rész felé irányított formában tartalmazó oligopeptidet alkalmazunk - a képletekben
    R, és R2 jelentése azonos vagy különböző, és jelentésük lehet bármely aminosav, és
    L jelentése egy oligoszacharid molekularész.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  43. 43. Eljárás gyulladásos állapot kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és egy, szelektin sejtfelszíni receptor által felismerhető oligosza31
    HU 216 312 Β charid-ligandumhoz szelektíven kötődni képes immunoglobulint összekeverünk úgy, hogy az immunoglobulint a gyulladásos állapot kezeléséhez elegendő mennyiségben alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  44. 44. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligoszacharid-ligandumhoz szelektíven kötődni képes immunoglobulinként a következő, (IX), (X) és (XI) általános képletek bármelyikének megfelelő oligoszacharid-ligandumot tartalmazó immunoglobulint alkalmazunk - a képletekben
    R jelentése Bl,3Gal, al,2Man vagy al,6GalNac, és a értéke 0 vagy 1.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  45. 45. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligoszacharid molekularészhez szelektíven kötődni képes immunoglobulinként leukocita által expresszált oligoszacharid molekularészhez szelektíven kötődni képes immunoglobulint alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. júniusl5.)
  46. 46. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immunoglobulinként egy vaszkuláris endoteliális sejt vagy egy vérlemezke által expresszált szelektinreceptor által felismerhető oligoszacharid-ligandumhoz szelektíven kötődni képes immunoglobulint alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  47. 47. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immunoglobulinként ELAM-1- vagy GMP140-szelektinreceptorok által felismerhető oligoszacharid-ligandumhoz szelektíven kötődni képes immunoglobulint alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  48. 48. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egységnyi adagos kiszerelésű gyógyászati készítményt állítunk elő.
    (Elsőbbsége: 1990. december 21.)
  49. 49. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és egy, szelektinreceptorhoz szelektíven kötődni képes, (XIV) általános képletű molekularészt tartalmazó vegyületet összekeverünk - a képletben
    R, jelentése NeuAca2,3, NeuGca2,3, NeuAca2,3,
    GalBl,4GlcNAcBl,3 vagy NeuGcB2,3GalBl,4GlcNAcBl,3
    R2 jelentéseFucal,3 Araal,3, (R,S)-5-alkil-Araal,4és R3 jelentése 1,3BGal, 1,2aMan vagy 1,6BGalNAc, és a értéke 0 vagy 1.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  50. 50. A 49. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (XIV) általános képletű molekularészt tartalmazó vegyületként vaszkuláris endoteliális sejten vagy egy vérlemezkén expresszálódó szelektinreceptorhoz kötődő molekularészt tartalmazó vegyületet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  51. 51. A 49. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelektinreceptorhoz szelektíven kötődni képes vegyületként ELAM-1 vagy GMP-140-szelektinreceptorokhoz szelektíven kötődni képes vegyületet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
    51. Eljárás vizsgálandó vegyület szelektin-közvetített sejtadhéziót gátló hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó vegyületet egy szelektinreceptorral és (I) általános képletű, szelektinreceptorhoz szelektíven kötődni képes molekularészt tartalmazó szelektinkötő anyaggal érintkeztetjük, önmagában ismert eljárással kimutatjuk a vizsgálandó vegyületnek a receptor és a szelektinkötő anyag közötti kötés kialakulását gátló képességét.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  52. 52. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelektinkötő anyagként SLX vagy SLX utánzó molekularészt tartalmazó anyagot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  53. 53. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a receptort vagy a szelektinkötő anyagot szilárd felületen immobilizált formában alkalmazzuk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  54. 54. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálandó vegyületként glükokonjugátum sejtadhéziót gátló hatását vizsgáljuk.
    (Elsőbbsége: 1990. december 21.)
  55. 55. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálandó vegyületként oligoszacharid sejtadhéziót gátló hatását vizsgáljuk.
    (Elsőbbsége: 1990. május 22.)
  56. 56. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és egy, az 52. igénypont szerinti vizsgálati eljárással vizsgálva szelektin-közvetített sejtadhézió gátlására képesnek bizonyult vegyületet összekeverünk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  57. 57. Eljárás szelektinreceptorhoz szelektíven kötődni képes, fukozilált oligoszacharid molekularészt tartalmazó vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (XV) általános képletű szekvenciát tartalmazó poliszacharidot fukozilálunk, amely képletben R jelentése sziálsav.
    R-GalBl,4GlcNAc- (XV) (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  58. 58. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fukozilálást al,3-fukozil-transzferázzal végezzük.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  59. 59. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliszacharidként egy, a Streptococcus-B csoportba tartozó, la típusú poliszacharidot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  60. 60. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliszacharidként egy, a Streptococcus-B csoportba tartozó, II. vagy III. típusú poliszacharidot alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  61. 61. Eljárás szelektinreceptorhoz szelektíven kötődni képes molekularészből többet is tartalmazó vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletnek megfelelő molekularész(eke)t egy kapcsoló molekularésszel kötjük össze - a képletben
    R( jelentése egy oligoszacharid vagy egy (II) általános képletű csoport, amelynek képletében R3 és R4 je32
    HU 216 312 Β lentése azonos vagy különböző, és lehet 1—8 szénatomos alkil-, hidroxil-1-8 szénatomos alkil- vagy -alkoxi-1-8 szénatomos alkil-csoport,
    R2 jelentése Bl,3Gal, al,2Man vagy l,6GalNac, és a értéke 0 vagy 1.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  62. 62. A 61. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kapcsoló molekularészként (V) vagy (VI) általános képletű molekularészt alkalmazzuk - a képletben m és n értéke azonos vagy különböző, és értékük 2 és 12 közötti egész szám, jelentése O vagy S, jelentése O, S vagy NH.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  63. 63. A 61. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kapcsoló molekularészként egy 5—14 tagú gyűrűt alkalmazunk, amely két, (VII) általános képletű szubsztituenst tartalmaz - a képletben
    5 Y jelentése O vagy S, és a szubsztituensek cisz- vagy transz-helyzetben vannak.
    (Elsőbbsége: 1990. június 15.)
  64. 64. A 61. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kapcsoló molekularészként egy olyan 5 -14 ta10 gú gyűrűt alkalmazunk, amelyben a szubsztituensek helyzete az 1,2-1 ,(p/2)+1 elrendezésnek felel meg, ahol p jelentése 5-14 közötti egész szám, amely megfelel a gyűrű méretének.
HU9204091A 1990-06-15 1991-06-14 Eljárás szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására HU216312B (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53885390A 1990-06-15 1990-06-15
US61931990A 1990-11-28 1990-11-28
US63239090A 1990-12-21 1990-12-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9204091D0 HU9204091D0 (en) 1993-11-29
HUT69652A HUT69652A (en) 1995-09-28
HU216312B true HU216312B (hu) 1999-06-28

Family

ID=27415280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9204091A HU216312B (hu) 1990-06-15 1991-06-14 Eljárás szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0533834A1 (hu)
AU (2) AU8007791A (hu)
BR (1) BR9106556A (hu)
CA (1) CA2084888A1 (hu)
FI (1) FI925668A (hu)
HU (1) HU216312B (hu)
IE (1) IE912048A1 (hu)
IL (1) IL98493A (hu)
NO (1) NO924830L (hu)
NZ (1) NZ238556A (hu)
SG (1) SG52563A1 (hu)
WO (2) WO1991019501A1 (hu)

Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5576305A (en) * 1990-06-15 1996-11-19 Cytel Corporation Intercellular adhesion mediators
US5753631A (en) * 1990-06-15 1998-05-19 Cytel Corporation Intercellular adhesion mediators
US6387884B1 (en) 1990-06-18 2002-05-14 Stanford University Leukocyte homing modulation
US6391857B1 (en) 1990-06-18 2002-05-21 Stanford University Methods and compositions for endothelial binding
US5211936A (en) * 1990-07-30 1993-05-18 Glycomed Incorporated Method of determining a cite of inflammation utilizing elam-1 ligands site
US5211937A (en) * 1990-07-30 1993-05-18 Glycomed Incorporated Method of determining a site of inflammation utilizing elam-1 ligands
US5648344A (en) * 1990-07-30 1997-07-15 Glycomed Incorporated Methods of treating inflammation using selection binding compounds
US6309639B1 (en) 1991-02-05 2001-10-30 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Method for inhibiting an inflammatory response using antibodies to P-selectin glycoprotein ligand
US6124267A (en) * 1991-02-05 2000-09-26 Southpac Trust Internationals, Inc. O-glycan inhibitors of selectin mediated inflammation derived from PSGL-1
US5807745A (en) * 1991-03-11 1998-09-15 New England Medical Center Hospitals, Inc. Method of inhibiting PADGEM-mediated or ELAM-1-mediated leukocyte adhesion using an inhibitor comprising a Lex core component
DE69233654D1 (de) * 1991-04-19 2006-10-19 Univ Leland Stanford Junior Zusammensetzungen und methoden für die verknüpfung von endothelzellen
US6121233A (en) 1991-04-19 2000-09-19 John L. Magnani Methods for the inhibition of cancer metastasis mediated by endothelial adhesion molecules
JPH07502011A (ja) * 1991-06-10 1995-03-02 グライカムド　インコーポレイテッド 免疫抑制性および寛容原性のオリゴ糖誘導体
US5646123A (en) * 1991-06-10 1997-07-08 Alberta Research Council Time dependent administration of oligosaccharide glycosides related to blood group determinants having a type I or type II core structure in reducing inflammation in a sensitized mammal arising form exposure to an antigen
GB9114657D0 (en) * 1991-07-06 1991-08-21 Antisoma Ltd Diagnostic compounds
WO1993005803A1 (en) * 1991-09-25 1993-04-01 Genetics Institute, Inc. Anti-inflammatory selectin inhibitors
DE69230541T2 (de) * 1991-10-31 2000-08-24 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Liposompräparat enthaltend eine tricyclische Verbindung
GB9208339D0 (en) * 1992-04-15 1992-06-03 Unilever Plc Treatment composition
US5728802A (en) * 1992-05-06 1998-03-17 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind selectins including endothelium leukocyte adhesion molecule 1 (ELAM-1)
US5648458A (en) * 1992-05-06 1997-07-15 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to ELAM-1
US5643873A (en) * 1992-05-06 1997-07-01 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind selectins including endothelial leukocyte adhesion molecule 1
CA2136428A1 (en) * 1992-05-28 1993-12-09 George A. Heavner Peptide inhibitors of selectin binding
CA2136844A1 (en) * 1992-05-28 1993-12-09 George A. Heavner Peptide inhibitors of selectin binding
CA2100412A1 (en) * 1992-07-15 1994-01-16 Yutaka Yamada Glycolipid derivatives
EP0652775B1 (en) * 1992-07-27 2000-04-19 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Targeting of liposomes to the blood-brain barrier
CA2144180A1 (en) * 1992-09-08 1994-03-17 George A. Heavner Peptide inhibitors of cellular adhesion
WO1994005314A1 (en) * 1992-09-08 1994-03-17 Centocor, Inc. Peptide inhibitors of leukocyte adhesion
US5453272A (en) * 1992-10-02 1995-09-26 Alberta Research Council Lectin derived carbohydrate binding-peptide
JPH08501569A (ja) * 1992-10-02 1996-02-20 アルバータ リサーチ カウンスル 糖質結合ペプチドの抗炎症性、免疫寛容原性、および免疫阻害性
EP0601417A3 (de) * 1992-12-11 1998-07-01 Hoechst Aktiengesellschaft Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US6406894B1 (en) 1992-12-11 2002-06-18 Glycorex Ab Process for preparing polyvalent and physiologically degradable carbohydrate-containing polymers by enzymatic glycosylation reactions and the use thereof for preparing carbohydrate building blocks
US5710123A (en) * 1992-12-18 1998-01-20 Centocor, Inc. Peptide inhibitors of selectin binding
CA2157388C (en) * 1993-03-01 1998-12-15 Daniel P. Witt Analogs for specific oligosaccharide-protein interactions and uses thereof
CA2157489A1 (en) * 1993-03-04 1994-09-15 Masaaki Numata Lewis-associated compound, process for producing the same, and anti-inflammatory
US5811404A (en) * 1993-05-14 1998-09-22 Cytel Corporation Sialyl Lex analogues as inhibitors of cellular adhesion
US5854218A (en) * 1993-05-14 1998-12-29 Cytel Corporation Sialyl Lex analogues as inhibitors of cellular adhesion
US5976540A (en) * 1993-05-17 1999-11-02 T Cell Sciences, Inc. Compositions comprising complement related proteins and carbohydrates, and methods for producing and using said compositions
US5856300A (en) * 1994-05-12 1999-01-05 T Cell Sciences, Inc. Compositions comprising complement related proteins and carbohydrates, and methods for producing and using said compositions
PT730608E (pt) 1993-05-17 2002-09-30 Avant Immunotherapeutics Inc Composicoes compreendendo hidratos de carbono e proeinas relacionadas pelo complemento e metodos para produzir e utilizar as referidas composicoes
US5658880A (en) * 1993-06-16 1997-08-19 Glycomed Incorporated Sialic acid/fucose based medicaments
US5750508A (en) * 1993-06-16 1998-05-12 Glycomed Incorporated Sialic acid/fucose based medicaments
US5789385A (en) * 1993-06-16 1998-08-04 Glycomed Incorporated Sialyl Lewisx mimetics containing phenyl backbones
US5837689A (en) * 1993-06-16 1998-11-17 Glycomed Incorporated Sialyl lewis-x mimetics containing naphthyl backbones
US5679321A (en) * 1993-06-17 1997-10-21 Glycomed Incorporated Sialic acid/fucose based medicaments
US5559103A (en) * 1993-07-21 1996-09-24 Cytel Corporation Bivalent sialyl X saccharides
US5783693A (en) * 1993-11-19 1998-07-21 The Regents Of The University Of California Methods for synthesizing sulfated disaccharide inhibitors of selectins
WO1995013819A1 (en) * 1993-11-19 1995-05-26 The Regents Of The University Of California Sulfated ligands for l-selectin and methods of preventing sulfate addition
WO1995014787A1 (en) * 1993-11-22 1995-06-01 Centocor, Inc. Peptide inhibitors of selecting binding
DE4408248A1 (de) * 1994-03-11 1995-09-14 Hoechst Ag Physiologisch verträgliche und physiologisch abbaubare Kohlenhydrat-Mimetika, ein Verfahren zur Herstellung und ihre Verwendung
DE4431280A1 (de) 1994-09-02 1996-03-07 Hoechst Ag Verfahren zur Isolierung und Reinigung von nukleotidaktivierten Zuckern aus biologischen Quellen
EP0783508A1 (en) * 1994-09-20 1997-07-16 PHARMACIA &amp; UPJOHN COMPANY The oligosaccharide structure of a ligand for e and p selectin
DE4436164A1 (de) * 1994-10-10 1996-04-11 Hoechst Ag Neue Kohlenhydratkonjugate als Inhibitoren der Zelladhäsion
US5614615A (en) * 1995-03-21 1997-03-25 The Scripps Research Institute Sialyl Lewis X mimetics incorporating fucopeptides
US5599915A (en) * 1995-03-21 1997-02-04 The Scripps Research Institute Sialyl Lewis X mimetics
EP1428832A3 (en) * 1995-08-03 2004-09-22 The Board of Regents for the University of Oklahoma Peptide and O-glycan inhibitors of selectin mediated inflammation
EP0765884B1 (en) * 1995-08-17 2004-04-14 The Biomembrane Institute Anti-inflammatory compound
US5876715A (en) * 1995-08-17 1999-03-02 The Biomembrane Institute Antibodies that bind novel carbohydrate ligands (myelorollins) that cause E-selectin dependent cell rolling, and uses thereof
CA2231073A1 (en) * 1995-09-29 1997-04-10 Ossi Renkonen Synthetic multivalent slex containing polylactosamines and methods for use
WO1997014707A1 (en) * 1995-10-18 1997-04-24 Cytel Corporation SIALYL Lex ANALOGUES AS INHIBITORS OF CELLULAR ADHESION
AU1122897A (en) * 1995-11-13 1997-06-05 Glycomed Incorporated Novel oligosaccharide glycosides having mammalian immunosuppressive and tolerogenic properties
CA2247115C (en) * 1996-03-01 2008-11-18 The Regents Of The University Of California Inhibition of selectin binding
US6033663A (en) * 1996-04-10 2000-03-07 Neose Technologies, Inc. Nucleic acids encoding GDP-Fucose pyrophosphorylase
US5830871A (en) * 1996-10-28 1998-11-03 The Scripps Research Institute Inhibitors of E-, P- and L-selectin binding
EP0834572A3 (en) * 1996-10-02 1999-08-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Alpha, gamma-diaminobutyric acid (DAB) containing oligopeptide derivatives
JP2001515912A (ja) 1997-09-05 2001-09-25 グリシム オサケ ユキチュア 合成二価ｓＬｅｘ含有ポリラクトサミン類および使用法
EP2275541B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
GB0015923D0 (en) * 2000-06-30 2000-08-23 Astrazeneca Ab Methods
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7127357B1 (en) 2000-12-08 2006-10-24 The Salk Institute For Biological Studies Crystal structure of WW domains and methods of use thereof
CN101979095A (zh) 2001-05-02 2011-02-23 普渡研究基金会 巨噬细胞介导的疾病的治疗和诊断
WO2002089819A1 (en) * 2001-05-07 2002-11-14 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Glycoconjugates and uses thereof
US8043603B2 (en) 2002-02-07 2011-10-25 Endocyte, Inc. Folate targeted enhanced tumor and folate receptor positive tissue optical imaging technology
US8043602B2 (en) 2002-02-07 2011-10-25 Endocyte, Inc. Folate targeted enhanced tumor and folate receptor positive tissue optical imaging technology
JP4680185B2 (ja) 2003-05-30 2011-05-11 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション アテローム性動脈硬化症の診断法
EP1655022A4 (en) * 2003-08-01 2010-04-07 Nat Inst Of Advanced Ind Scien MEANS FOR THE TREATMENT OR DIAGNOSIS OF INFLAMMATORY DISEASES WITH A TARGETED LIPOSOM
US7691810B2 (en) 2003-10-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method of producing recombinant antithrombin III composition
EP1904183B1 (en) 2005-07-05 2014-10-15 Purdue Research Foundation Pharmaceutical composition for the treatment of osteoarthritis
JP5209476B2 (ja) 2005-09-02 2013-06-12 グリコミメティクス， インコーポレイテッド ヘテロ二官能性全セレクチン阻害剤
WO2007038346A2 (en) 2005-09-23 2007-04-05 Purdue Research Foundation Multiphoton in vivo flow cytometry method and device
US8685752B2 (en) 2006-11-03 2014-04-01 Purdue Research Foundation Ex vivo flow cytometry method and device
US8586595B2 (en) 2007-02-07 2013-11-19 Purdue Research Foundation Positron emission tomography imaging method
CA2688308A1 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Purdue Research Foundation Method of imaging localized infections
US8895510B2 (en) 2008-04-08 2014-11-25 Glycomimetics, Inc. Pan-selectin inhibitor with enhanced pharmacokinetic activity
AU2009338190C1 (en) 2009-01-22 2014-07-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Galactose-alpha-1, 3-galactose-containing N-glycans in glycoprotein products derived from CHO cells
WO2012037034A1 (en) 2010-09-14 2012-03-22 Glycomimetics, Inc. E-selectin antagonists
AU2012358150B2 (en) 2011-12-22 2017-07-20 Glycomimetics, Inc. E-selectin antagonist compounds, compositions, and methods of use
CA2891514C (en) 2012-12-07 2020-08-25 Glycomimetics, Inc. Compounds, compositions and methods using e-selectin antagonists for mobilization of hematopoietic cells
CA2968391C (en) 2014-12-03 2022-04-26 Glycomimetics, Inc. Heterobifunctional inhibitors of e-selectins and cxcr4 chemokine receptors
WO2017127422A1 (en) 2016-01-22 2017-07-27 Glycomimetics, Inc. Glycomimetic inhibitors of pa-il and pa-iil lectins
US11291678B2 (en) 2016-03-02 2022-04-05 Glycomimetics, Inc Methods for the treatment and/or prevention of cardiovascular disease by inhibition of E-selectin
EP3497131B1 (en) 2016-08-08 2022-03-09 GlycoMimetics, Inc. Combination of t-cell checkpoint inhibitors with inhibitors of e-selectin or cxcr4, or with heterobifunctional inhibitors of both e-selectin and cxcr4.
JP7069136B2 (ja) 2016-10-07 2022-05-17 グリコミメティクス， インコーポレイテッド 極めて強力な多量体ｅ－セレクチンアンタゴニスト
US11197877B2 (en) 2017-03-15 2021-12-14 Glycomimetics. Inc. Galactopyranosyl-cyclohexyl derivauves as E-selectin antagonists
US11712446B2 (en) 2017-11-30 2023-08-01 Glycomimetics, Inc. Methods of mobilizing marrow infiltrating lymphocytes and uses thereof
EP3732186A1 (en) 2017-12-29 2020-11-04 GlycoMimetics, Inc. Heterobifunctional inhibitors of e-selectin and galectin-3
CN111867601A (zh) 2018-03-05 2020-10-30 糖模拟物有限公司 用于治疗急性髓系白血病及相关病症的方法
CN110317274A (zh) * 2018-03-30 2019-10-11 积水医疗株式会社 与ncc-st-439抗原特异性反应的单克隆抗体及其制造方法
US11845771B2 (en) 2018-12-27 2023-12-19 Glycomimetics, Inc. Heterobifunctional inhibitors of E-selectin and galectin-3

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2721900B2 (ja) * 1988-09-18 1998-03-04 株式会社ニチレイ 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法
US5272263A (en) * 1989-04-28 1993-12-21 Biogen, Inc. DNA sequences encoding vascular cell adhesion molecules (VCAMS)
NZ240316A (en) * 1990-10-25 1996-12-20 Univ Michigan Compound for treating disease mediated by the elaboration of elam-1 on endothelial cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP0533834A1 (en) 1993-03-31
WO1991019502A1 (en) 1991-12-26
AU8007791A (en) 1992-01-07
AU660931B2 (en) 1995-07-13
NZ238556A (en) 1994-01-26
AU8102991A (en) 1992-01-07
NO924830L (no) 1993-02-08
FI925668A0 (fi) 1992-12-14
BR9106556A (pt) 1991-12-26
IE912048A1 (en) 1991-12-18
HUT69652A (en) 1995-09-28
HU9204091D0 (en) 1993-11-29
CA2084888A1 (en) 1991-12-16
NO924830D0 (no) 1992-12-14
EP0533834A4 (hu) 1995-04-19
FI925668A (fi) 1992-12-14
WO1991019501A1 (en) 1991-12-26
IL98493A (en) 1998-12-06
SG52563A1 (en) 1998-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU216312B (hu) Eljárás szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
US5753631A (en) Intercellular adhesion mediators
US5576305A (en) Intercellular adhesion mediators
EP0730608B1 (en) Compositions comprising complement related proteins and carbohydrates, and methods for producing and using said compositions
JPH09500683A (ja) 二価のシアリルルイスｘサッカリド
Aigner et al. Heat stable antigen (mouse CD24) supports myeloid cell binding to endothelial and platelet P-selectin
US5318890A (en) Assays for inhibitors of leukocyte adhesion
US5648344A (en) Methods of treating inflammation using selection binding compounds
AU658383B2 (en) Agents and methods for binding to elam-1
US5976540A (en) Compositions comprising complement related proteins and carbohydrates, and methods for producing and using said compositions
US5856300A (en) Compositions comprising complement related proteins and carbohydrates, and methods for producing and using said compositions
EP0580763B1 (en) Compositions and methods for endothelial binding
RU2123338C1 (ru) Фармацевтическая композиция на основе медиатора межклеточной адгезии (варианты), способ ингибирования межклеточной адгезии, способ лечения воспалительного заболевания, способ анализа тестируемого соединения на способность ингибировать клеточную адгезию, способ получения соединения
WO1992016612A2 (en) Method of inhibiting padgem-mediated interactions using an inhibitor comprising a 2,6 sialic acid component
Unger The chemistry of oligosaccharide ligands of selectins: significance for the development of new immunomodulatory medicines
CZ89098A3 (cs) Syntetické polylaktosaminy obsahující až multivalentní sLEX a metody pro jejich použití
US5972625A (en) Assays for inhibitors of leukocyte adhesion
Zhou et al. Animal lectins: a distinct group of carbohydrate-binding proteins involved in cell adhesion, molecular recognition, and development
WO1995021618A1 (en) Immunomodulation using nkr-p1, cd69 and ligands therefor
JPH05507519A (ja) 細胞間付着仲介因子
JPH05507923A (ja) 細胞間付着仲介因子
AU678486C (en) Compositions comprising complement related proteins and carbohydrates, and methods for producing and using said compositions
Thomas Synthesis and utilization of multivalent sialyl-Lewis X N-linked oligosaccharides in probing selectin valency
IE912650A1 (en) Inhibitors of fucosyltransferase and their uses
Thall The expression of the alpha-galactosyl epitope in mammalian tissues

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee