JP2721900B2 - 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法 - Google Patents
癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法Info
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- cancer
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、、癌性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マー
カーを生じる癌のための癌診断薬及び上記腫瘍マーカー
の回収方法に関する。
カーを生じる癌のための癌診断薬及び上記腫瘍マーカー
の回収方法に関する。
［従来の技術］ 腫瘍マーカーは腫瘍をスクリーニングする、腫瘍の診
断をする、腫瘍の実態をモニターする等に応用され、大
きな成果をあげている。特に膵癌のマーカーCA19−９、
卵巣癌のマーカーCA125等の癌関連抗原、α−フェトプ
ロテイン（AFP）、癌胎児性抗原（CEA）、塩基性フェト
プロテイン等の胎児性タンパク質等は特異性の優れたモ
ノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の開発があり、
血清診断キットとしても簡便かつ有効な診断法として成
功をおさめている。
断をする、腫瘍の実態をモニターする等に応用され、大
きな成果をあげている。特に膵癌のマーカーCA19−９、
卵巣癌のマーカーCA125等の癌関連抗原、α−フェトプ
ロテイン（AFP）、癌胎児性抗原（CEA）、塩基性フェト
プロテイン等の胎児性タンパク質等は特異性の優れたモ
ノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の開発があり、
血清診断キットとしても簡便かつ有効な診断法として成
功をおさめている。
これらの腫瘍マーカーについては、血中抗原測定用の
RIAキット、次いでEIAキットが開発され、広く普及して
いる。膵癌、胆管系の癌で最も優れた血中マーカーと言
われるCA19−９ではこれらの癌の約80％に高い血中抗原
濃度が検出されるが、胃癌38.6％、大腸癌59.1％、肺腺
癌28.6％、肝細胞癌32.3％等と癌組織に広く分布してお
り、低いとはいえ健常人でも検出される。従って、偽陰
性、偽陽性の出現を低くする手段が必要である。
RIAキット、次いでEIAキットが開発され、広く普及して
いる。膵癌、胆管系の癌で最も優れた血中マーカーと言
われるCA19−９ではこれらの癌の約80％に高い血中抗原
濃度が検出されるが、胃癌38.6％、大腸癌59.1％、肺腺
癌28.6％、肝細胞癌32.3％等と癌組織に広く分布してお
り、低いとはいえ健常人でも検出される。従って、偽陰
性、偽陽性の出現を低くする手段が必要である。
また、これらの腫瘍マーカーを検出するためのモノク
ローナル抗体は、それらの腫瘍マーカーを抗原として用
いて作製されるので、もし、腫瘍マーカーを簡便に回収
することができる方法があれば、癌の診断薬として用い
られるモノクローナル抗体の作製にとって有利である。
ローナル抗体は、それらの腫瘍マーカーを抗原として用
いて作製されるので、もし、腫瘍マーカーを簡便に回収
することができる方法があれば、癌の診断薬として用い
られるモノクローナル抗体の作製にとって有利である。
［発明が解決しようとする問題点］ 従って、この発明の目的は、腫瘍マーカーを検出する
ことによっていくつかの種類の癌の診断に用いることが
できる新規な癌診断薬を提供することである。
ことによっていくつかの種類の癌の診断に用いることが
できる新規な癌診断薬を提供することである。
さらにまた、この発明の目的は、いくつかの種類の腫
瘍マーカーの簡便な回収方法を提供することである。
瘍マーカーの簡便な回収方法を提供することである。
［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、癌性フコシル化糖
鎖を有する腫瘍マーカーが固定化レクチンに吸着される
性質を有することを見出し、この発明を完成した。
鎖を有する腫瘍マーカーが固定化レクチンに吸着される
性質を有することを見出し、この発明を完成した。
すなわち、この発明は、固定化AALレクチンを有効成
分とする、癌性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを
生じる癌のための診断薬を提供する。
分とする、癌性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを
生じる癌のための診断薬を提供する。
さらにまた、この発明は、癌性フコシル化糖鎖を有す
る腫瘍マーカーを含む流体を固定化AALレクチンに作用
させ、固定化AALレクチンに吸着された腫瘍マーカーを
回収することから成る、上記腫瘍マーカーの回収方法を
提供する。
る腫瘍マーカーを含む流体を固定化AALレクチンに作用
させ、固定化AALレクチンに吸着された腫瘍マーカーを
回収することから成る、上記腫瘍マーカーの回収方法を
提供する。
［発明の効果］ この発明により、癌性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マ
ーカーを生じる癌に対する新規な診断薬が提供された。
この発明の癌診断薬は、免疫反応により腫瘍マーカーと
結合するのではなく、全く別の原理により結合するの
で、腫瘍マーカーに対する従来のモノクローナル抗体と
併用することにより、数来の癌診断における偽陽性及び
偽陰性が生じる確率を低下させることができる。
ーカーを生じる癌に対する新規な診断薬が提供された。
この発明の癌診断薬は、免疫反応により腫瘍マーカーと
結合するのではなく、全く別の原理により結合するの
で、腫瘍マーカーに対する従来のモノクローナル抗体と
併用することにより、数来の癌診断における偽陽性及び
偽陰性が生じる確率を低下させることができる。
さらにまた、この発明により、癌性フコシル化糖鎖を
有する腫瘍マーカーの新規な回収方法が提供された。こ
の発明の方法によると、一段階のアフィニティクロマト
グラフィー操作によりフコシル化糖鎖を担っている腫瘍
マーカーを簡便に回収、精製することができ、しかも、
フコシル化糖鎖を担う種々の腫瘍マーカーに適用できる
ので汎用性に優れている。また、固定化AALレクチンは
何回でも繰り返し使用することができる。さらに、AAL
レクチンは界面活性剤の存在下でも活性を有するので例
えば可溶化膜タンパク質の回収にも適用することができ
る。
有する腫瘍マーカーの新規な回収方法が提供された。こ
の発明の方法によると、一段階のアフィニティクロマト
グラフィー操作によりフコシル化糖鎖を担っている腫瘍
マーカーを簡便に回収、精製することができ、しかも、
フコシル化糖鎖を担う種々の腫瘍マーカーに適用できる
ので汎用性に優れている。また、固定化AALレクチンは
何回でも繰り返し使用することができる。さらに、AAL
レクチンは界面活性剤の存在下でも活性を有するので例
えば可溶化膜タンパク質の回収にも適用することができ
る。
［発明の具体的説明］ 上述したように、この発明の癌診断薬は、固定化され
たAALレクチンを（Aleuria aurantia lectin、N.Kochib
e and K.Furukawa,“Biochemistry",19巻pp.2841−2846
（1980））を有効成分とする。AALレクチン自身は公知
であり、その調製方法及び性質も公知であって上記文献
に記載されている。また、AALレクチンの固定化方法も
種々の公知の方法を採用することができ、例えばYamash
ita,Kochibe,Ohkura,Ueda and Kobata,“J,Biological
Chemistry",vol.260.pp.4688−4693（1985）に記載され
ている。好ましい担体としてはセファロースビーズ、ア
ガロースビーズ、セルロースビーズ、ポリアクリルアミ
ドビーズ等を挙げることができ、固相化するレクチンの
濃度は通常20mg/mlないし1mg/ml、好ましくは約3mg/ml
程度である。さらにまた、担体がアガロースゲル（例え
ばセファロース4B、6B（ファルマシア社製）、バイオゲ
ルA0.5m、A1.5m（登録商標）をCNBrで活性化してカプリ
ングする（例えばMarch et al.,Anal.Biochem.60,149−
52,1974）こともできる。また、この方法をCNBr−活性
化ゲル（ファルマシア社製）に適用して固定化すること
もできる。さらにまた、活性化スペーサーを導入したゲ
ル（例えばアフィゲル10、15（バイオラド社製））にAA
Lレクチンを作用させて固定化することもできる。さら
に、ホルミル基を導入したゲル（例えば、フォルミルア
ガロース、AFフォルミルトヨパール（東ソー株式会社
製））にAALレクチンを作用させてカプリングし、これ
をNaCNBH3で還元する方法も用いることができる。さら
に、他のタンパク質（例えばゼラチン）を上記いずれか
の方法により固定化した後、AALレクチンをグルタルア
ルデヒドによって上記タンパク質と架橋する方法も用い
ることができる。上記いずれの方法により固定化する場
合でも、10mM程度のＬ−フコースを加えてフコシル化糖
鎖がAALレクチンに結合する結合部位を保護することが
好ましい。
たAALレクチンを（Aleuria aurantia lectin、N.Kochib
e and K.Furukawa,“Biochemistry",19巻pp.2841−2846
（1980））を有効成分とする。AALレクチン自身は公知
であり、その調製方法及び性質も公知であって上記文献
に記載されている。また、AALレクチンの固定化方法も
種々の公知の方法を採用することができ、例えばYamash
ita,Kochibe,Ohkura,Ueda and Kobata,“J,Biological
Chemistry",vol.260.pp.4688−4693（1985）に記載され
ている。好ましい担体としてはセファロースビーズ、ア
ガロースビーズ、セルロースビーズ、ポリアクリルアミ
ドビーズ等を挙げることができ、固相化するレクチンの
濃度は通常20mg/mlないし1mg/ml、好ましくは約3mg/ml
程度である。さらにまた、担体がアガロースゲル（例え
ばセファロース4B、6B（ファルマシア社製）、バイオゲ
ルA0.5m、A1.5m（登録商標）をCNBrで活性化してカプリ
ングする（例えばMarch et al.,Anal.Biochem.60,149−
52,1974）こともできる。また、この方法をCNBr−活性
化ゲル（ファルマシア社製）に適用して固定化すること
もできる。さらにまた、活性化スペーサーを導入したゲ
ル（例えばアフィゲル10、15（バイオラド社製））にAA
Lレクチンを作用させて固定化することもできる。さら
に、ホルミル基を導入したゲル（例えば、フォルミルア
ガロース、AFフォルミルトヨパール（東ソー株式会社
製））にAALレクチンを作用させてカプリングし、これ
をNaCNBH3で還元する方法も用いることができる。さら
に、他のタンパク質（例えばゼラチン）を上記いずれか
の方法により固定化した後、AALレクチンをグルタルア
ルデヒドによって上記タンパク質と架橋する方法も用い
ることができる。上記いずれの方法により固定化する場
合でも、10mM程度のＬ−フコースを加えてフコシル化糖
鎖がAALレクチンに結合する結合部位を保護することが
好ましい。
この発明の診断薬は、特に限定されないが、カラムに
充填して用いることが操作上簡便で好ましい。この場
合、カラムに充填する固相化AALレクチンの量（担体を
含む）は特に限定されないが約1mlで十分である。
充填して用いることが操作上簡便で好ましい。この場
合、カラムに充填する固相化AALレクチンの量（担体を
含む）は特に限定されないが約1mlで十分である。
この発明の診断薬により診断することができる癌は、
癌によりフコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを生じさ
せるものである。この発明の診断薬に吸着される、癌性
フコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーの例としては、膵
癌に対するCAl9−９、消化器系ガンに対するCEA、膵癌
に対するDU−PAN−２、肺腺癌等に対するシアリル・ル
イス・ｘ−ｉ（文献：「化学と生物」26巻、４号、220
−234、1988）、腺癌に対するLeb、その他卵巣癌に対す
るCA125を挙げることができる。
癌によりフコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを生じさ
せるものである。この発明の診断薬に吸着される、癌性
フコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーの例としては、膵
癌に対するCAl9−９、消化器系ガンに対するCEA、膵癌
に対するDU−PAN−２、肺腺癌等に対するシアリル・ル
イス・ｘ−ｉ（文献：「化学と生物」26巻、４号、220
−234、1988）、腺癌に対するLeb、その他卵巣癌に対す
るCA125を挙げることができる。
この発明の診断薬を用いて癌の診断を行なう場合に
は、患者から得た体液、例えば血清を、固定化AALレク
チン含有カラムにかけ、PBSのような緩衝液で洗浄して
洗浄画分を集め、次いで例えば約20mM程度のフコースを
含む緩衝液で溶出させて溶出画分を集め、洗浄画分及び
溶出画分中に存在する腫瘍マーカーを定量して比較す
る。溶出画分に腫瘍マーカーの多くが存在している場合
には、その患者が癌に罹患している確率が高いので、癌
の診断を行なうことができる。なお、腫瘍マーカーの定
量は、モノクローナル抗体を用いたEIAのような周知の
免疫分析法により行なうことができ、そのためのキット
も種々市販されている。
は、患者から得た体液、例えば血清を、固定化AALレク
チン含有カラムにかけ、PBSのような緩衝液で洗浄して
洗浄画分を集め、次いで例えば約20mM程度のフコースを
含む緩衝液で溶出させて溶出画分を集め、洗浄画分及び
溶出画分中に存在する腫瘍マーカーを定量して比較す
る。溶出画分に腫瘍マーカーの多くが存在している場合
には、その患者が癌に罹患している確率が高いので、癌
の診断を行なうことができる。なお、腫瘍マーカーの定
量は、モノクローナル抗体を用いたEIAのような周知の
免疫分析法により行なうことができ、そのためのキット
も種々市販されている。
また、同様な方法により、溶出画分中に腫瘍マーカー
を溶出させた後、それを回収することができる。溶出画
分中の腫瘍マーカーの回収、精製は、例えば溶出液を透
析チューブに入れ、50〜100倍量のPBSに対して半日毎に
４回PBSを取り替えて透析を行なうことにより腫瘍マー
カーの回収を行なうことができる。
を溶出させた後、それを回収することができる。溶出画
分中の腫瘍マーカーの回収、精製は、例えば溶出液を透
析チューブに入れ、50〜100倍量のPBSに対して半日毎に
４回PBSを取り替えて透析を行なうことにより腫瘍マー
カーの回収を行なうことができる。
なお、AAL固定化ゲルは、フコース含有緩衝液で溶出
した後、PBSで洗浄すれば再生されるので何回でも使用
できる。また、ゲルの保存には0.02％ NaN3を含むPBSを
用いることができる。
した後、PBSで洗浄すれば再生されるので何回でも使用
できる。また、ゲルの保存には0.02％ NaN3を含むPBSを
用いることができる。
［実施例］ 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明す
る。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。
る。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。
固定化AALレクチンカラムの作製 活性化スペーサー（中性の10原子のアーム、 を導入したバイオラド社製Affigel 10に以下のようにし
てAALレクチンを導入し、4.6mg/mlウェットゲルのAALが
導入された固定化AALレクチンを調製した。すなわち、
アフィゲル10を４℃にし、ゲルを均一にして1mlを測り
取り、イソプロパノールを浸したポリプロピレン性エコ
ノカラムに入れた。イソプロパノールを流し出した後10
mlの10mM酢酸ナトリウム（pH4.5）で洗浄した。洗浄後
すぐ２倍量のカップリングバッファーで洗浄し、AAL5mg
を加え混合した。４℃で一夜撹拌しながら反応させ、0.
1mlの1MエタノールアミンHCl（pH8）を加え一時間反応
させた。カラムから反応液を溶出させ、AAL含量を測定
したところ90％が結合していた。その後、カップリング
バッファ10ml、20mlの20mMフコース、0.01 M PBS（pH7.
2）10mlで順次洗浄し、固定化AALレクチンとした。これ
を0.8cm（直径）x 7cmのカラムに充填し、固定化AALカ
ラムを作製した。
てAALレクチンを導入し、4.6mg/mlウェットゲルのAALが
導入された固定化AALレクチンを調製した。すなわち、
アフィゲル10を４℃にし、ゲルを均一にして1mlを測り
取り、イソプロパノールを浸したポリプロピレン性エコ
ノカラムに入れた。イソプロパノールを流し出した後10
mlの10mM酢酸ナトリウム（pH4.5）で洗浄した。洗浄後
すぐ２倍量のカップリングバッファーで洗浄し、AAL5mg
を加え混合した。４℃で一夜撹拌しながら反応させ、0.
1mlの1MエタノールアミンHCl（pH8）を加え一時間反応
させた。カラムから反応液を溶出させ、AAL含量を測定
したところ90％が結合していた。その後、カップリング
バッファ10ml、20mlの20mMフコース、0.01 M PBS（pH7.
2）10mlで順次洗浄し、固定化AALレクチンとした。これ
を0.8cm（直径）x 7cmのカラムに充填し、固定化AALカ
ラムを作製した。
腫瘍マーカーの回収 上記のようにして調製した固定化AALカラムに、CAl9
−９（「エルザ・CA19−９・キット」ミドリ十字社
製）、シアリルLewis X−ｉ（SLX「オーツカ」、大塚製
薬社製）、CEA（「CEA・リアビーズ」、ダイナボット社
製）、DU−PAN−２（「デタミナDUPAN2」、共和メデイ
ックス社製）、Leb（「Lewis リアビーズ」、第一ラジ
オアイソトープ社製）、SCC（「SCC・リアビーズ」、ダ
イナボット社製）、CA125（「セントコアCA125 RIA キ
ット」セントコア社製）又はα−フェトプロテイン
（「α−フェト・リアビーズ」、ダイナボット社製）の
各腫瘍マーカーの標品を含む溶液及び癌患者からの血清
1mlを室温下で流通させ、アフィニティクロマトグラフ
ィーを行なった。洗浄液としては0.01 M PBS（pH7.0）
を用い、溶出液としてはこのPBSに20mMのＬ−フコース
を添加したものを用いた。
−９（「エルザ・CA19−９・キット」ミドリ十字社
製）、シアリルLewis X−ｉ（SLX「オーツカ」、大塚製
薬社製）、CEA（「CEA・リアビーズ」、ダイナボット社
製）、DU−PAN−２（「デタミナDUPAN2」、共和メデイ
ックス社製）、Leb（「Lewis リアビーズ」、第一ラジ
オアイソトープ社製）、SCC（「SCC・リアビーズ」、ダ
イナボット社製）、CA125（「セントコアCA125 RIA キ
ット」セントコア社製）又はα−フェトプロテイン
（「α−フェト・リアビーズ」、ダイナボット社製）の
各腫瘍マーカーの標品を含む溶液及び癌患者からの血清
1mlを室温下で流通させ、アフィニティクロマトグラフ
ィーを行なった。洗浄液としては0.01 M PBS（pH7.0）
を用い、溶出液としてはこのPBSに20mMのＬ−フコース
を添加したものを用いた。
洗浄画分及び溶出画分をそれぞれ回収し、蒸留水に対
して一夜透析し（分子量カットオフ2000）、凍結乾燥
し、上記PBS 1mlに溶解して、各腫瘍マーカーについて
の市販の診断キットを用いて腫瘍マーカーを定量した。
結果を下記表に示す。
して一夜透析し（分子量カットオフ2000）、凍結乾燥
し、上記PBS 1mlに溶解して、各腫瘍マーカーについて
の市販の診断キットを用いて腫瘍マーカーを定量した。
結果を下記表に示す。
上記表より明らかなように、癌性フコシル糖鎖を担持
する腫瘍マーカーであるCA19−９、シアリルLewis X−
ｉ、CEA、DU−PAN−２、Leb、CA125については活性の大
部分が溶出画分に回収され、一方、フコシル糖鎖を有さ
ないSCC及びα−フェトプロテインについてはほとんど
が洗浄画分に回収された。これにより、固定化AALレク
チンを用いて癌性フコシル糖鎖を担持する腫瘍マーカー
の回収及び検出を行なうことができることが明らかにな
った。
する腫瘍マーカーであるCA19−９、シアリルLewis X−
ｉ、CEA、DU−PAN−２、Leb、CA125については活性の大
部分が溶出画分に回収され、一方、フコシル糖鎖を有さ
ないSCC及びα−フェトプロテインについてはほとんど
が洗浄画分に回収された。これにより、固定化AALレク
チンを用いて癌性フコシル糖鎖を担持する腫瘍マーカー
の回収及び検出を行なうことができることが明らかにな
った。
Claims (4)
- 【請求項１】固定化AALレクチンを有効成分とする、癌
性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを生じる癌のた
めの診断薬。 - 【請求項２】上記腫瘍マーカーはCA19−９、シアリルLe
wis X−ｉ、CEA、DU−PAN−２、Leb又はCA125である請
求項１記載の診断薬。 - 【請求項３】癌性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカー
を含む流体を固定化AALレクチンに作用させ、固定化AAL
レクチンに吸着された腫瘍マーカーを回収することから
成る、上記腫瘍マーカーの回収方法。 - 【請求項４】上記腫瘍マーカーはCA19−９、シアリルLe
wis X−ｉ、CEA、DU−PAN−２、Leb又はCA125である請
求項３記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63233314A JP2721900B2 (ja) | 1988-09-18 | 1988-09-18 | 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63233314A JP2721900B2 (ja) | 1988-09-18 | 1988-09-18 | 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0283337A JPH0283337A (ja) | 1990-03-23 |
| JP2721900B2 true JP2721900B2 (ja) | 1998-03-04 |
Family
ID=16953187
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63233314A Expired - Fee Related JP2721900B2 (ja) | 1988-09-18 | 1988-09-18 | 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2721900B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5576305A (en) * | 1990-06-15 | 1996-11-19 | Cytel Corporation | Intercellular adhesion mediators |
| US5753631A (en) * | 1990-06-15 | 1998-05-19 | Cytel Corporation | Intercellular adhesion mediators |
| AU8007791A (en) * | 1990-06-15 | 1992-01-07 | Cytel Corporation | Intercellular adhesion mediators |
| WO1997037682A1 (en) * | 1996-04-10 | 1997-10-16 | Cytel Corporation | Nucleic acids encoding gdp-fucose pyrophosphorylase |
| JP4912894B2 (ja) | 2004-02-19 | 2012-04-11 | イェール ユニバーシティー | プロテオーム技術を使用した癌タンパク質バイオマーカーの同定 |
| CN102105490B (zh) | 2008-07-22 | 2015-08-05 | J-制油株式会社 | L-岩藻糖α1→6特异性凝集素 |
| JP2013100233A (ja) * | 2010-02-26 | 2013-05-23 | Osaka Prefectural Hospital Organization | 腫瘍マーカー、それに対する抗体、その検出キット及びその検出方法 |
-
1988
- 1988-09-18 JP JP63233314A patent/JP2721900B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0283337A (ja) | 1990-03-23 |
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