JPS6193A - 特異性がん関連抗原、フコシルシアロシルガングリオテトラオースおよびヒトの肺がんに関連する診断または治療処置におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 に関連する抗原／・・ゲランであるフコシルンアロシル
ガングリオテトラオース−１ｖαＦｕｃ１１３αＮｅｕ
ＡｃＧｇＯｓｅ４−Ｃ国際純正および応用化学連合一国
際生化学連合編脂質に関する資料、１９７７）参照〕を
ヒトの肺がん（小細胞がん）に関連する診断および治療
処置に使用することに関する。

正常な組繊細胞から腫瘍細胞へのトランスフォーメーシ
ョンは、細胞表面における糖質構造（複合糖質）の変化
に関連していることはよく知られている。これらの新し
い１′だけ修飾された複合糖質は、抗原として作用する
ことがあり、更に捷だ一種のいわゆる腫瘍関連抗原に該
当することがある。細胞表面の糖質は、脂質部分に結合
しているか（この場合それらは糖脂質と呼ばれる）、ま
たはペプチド（タンパク質）に結合している（この場合
にはそれらは糖ペプチド（糖タンパク質）と呼ばれる）
。

腫瘍に関連する複合糖質抗原は、従来はヒトのかん疾患
に関連して知られている。黒色腫においては、糖質構造
であるジ／アロンルガングリオテトラオースおよびジシ
アΩシルラクトースは、脂質部分に結合していることが
確認されている。２種のがん関連抗原ＣＥＡ　（がん胎
児性抗原（　ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎａｌ　ａｎ
ｔｉｇｅｎ）　〕およびＧＩＣＡ　［：消化管がん抗原
（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｃａｎｃｅｒ　
ａｎｔｉｇｅｎ））は、特に消化管のがんにおいて証明
されだが、−実弟３の抗原ＣＡ−５０がより一般的に分
布しているものと思われる。これらの抗原は、すべて細
胞から分泌されるので、免疫学的方法によって血清中か
ら証明されうる。

本発明は、ある種の型の肺がん（小細胞がん捷たはオー
ト−細胞がん）をもった患者は、原発性肺腫瘍およびそ
の転移部に、正常な肺の組織中では発出しない酸性の糖
脂質を発出するという発見に基づいている。この糖脂質
抗原は、完全な化学構造Ｆｕｃ　ａ　１−２Ｇａｌβ１
−８ＧａｌＮＡｃβ１−４（ＮｅｕＡｃα２−３　）Ｇ
ａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ　’ｌだはｌＶ２αＦｕｃ
ｌ１６Ｑ’ＮｅｕＡｃＧｇＯｓｅ４　Ｃｅｒ　を短縮記
号Ｆｕｃ−ＧＭＩと共に有するガングリオシドである（
　ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ編脂質資料、１９７７年参照）。

このガングリオシドは、捷ずウシの脳から単離された〔
ギドニら（Ｇｈｉｄｏｎｉ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナ
ル・オブｅニューロケミストリー（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃ
ｈｅｍ。）第２７巻第５１１−５１５頁、１９７６年、
参照〕が、脂肪組織、牌臓および精巣のような他の哨乳
類の器官に発生する徴候も壕だ現われた。ノ・コモリと
その協力者は〔バウマンラ（Ｂａｕｍａｎｎ　ｅｔ　ａ
ｌ。）、キャンプ−・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ
。）第３９巻第２６３７−２６４３頁、１９７９年、参
照〕、ラットの肝がんからガングリオシドを単離し、こ
のものを仮にＦｕｃ−ＧＭＩとして同定した。このガン
グリオシドの化学構造の最終的な確定は、ブタの神経組
織から単離されたガングリオシドについてスベナーホ、
＋１／　ム（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ）とその協力者〔
フレッド−ｙ７ら（Ｆｒｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　
ニーｏピアン・ジャーナルミオブーバイオケミストリ−
（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ。）第１１６巻第５
５３−５６４頁、参照〕によって行々われだ。かれらは
捷だ、ブタの長期的なりロロキンによる治療は、神経組
織におけるＦｕｃ−ＧＭＩのリソソーム蓄積の増大を惹
起し〔クリングノ・ルトら（Ｋｌｉｎｇｈａｒｄｔ　ｅ
ｔ　ａｌ、　）、ジャーナル−７１−７’　、　＝ニー
ロケミスドリー（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ　、　）第
３７巻第８９７−９０８頁、１９８１年参照〕、１だ若
干の他の器官にもそれを起すことを示した〔フレッドマ
ンら（Ｆｒｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　）、バイオケミ
ストリー・リサーチ／Ｉ／　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、
）第２０１巻第５８１−５８８頁、１９８２年、参照〕
。このガングリオシドは、ブタに広く分布しているが、
それが正常のヒトの肺組織中に、または多数のヒト器官
のガン中に生ずることを本発明者らは、示すことができ
なかった。肺の小細胞のがんで死亡した患者におイテハ
、スヘての肺腫瘍は、Ｆｕｃ−ＧＭｌガングリオシドを
含み、そして他の患者においてはｐｕｃ−ＧＭＩは、血
清に放出された。本発明者によって開発されだＦｕｃ−
ＧＭＩの試験法によれば、腫瘍抗原は、肺の小細胞がん
の患者の血清中には検出されたが、対照集団または他の
型のがんをもった患者の血清中には検出されなかった。

上記の腫瘍に関連する糖脂質、フコシルシアロンルガン
グリオテトラオシルセラミド、短縮記号ガングリオシド
Ｆｕｃ−ＧＭＩをヒトのかん組織および動物の器官から
純粋な形で単離するだめの手法が本発明の範囲において
検討された。特殊な考案によって、免疫原性活性を有す
る純化ガングリオシドが得られ、次にモノクローナル抗
体の産生に使用された。本発明の範囲内において、組織
、組織の部分、細胞学的調製物および各種体液における
同定および定量のだめの手法が開発された。診断の目的
のだめのこれらの方法のすべては、この抗原は、純粋な
ガングリオシド抗原、Ｆｕｃ−ＧＭＩに対して産生され
る特異な抗体と反応することによシ検出されそして定量
的に決定されうる。

下記の非限定的な例は、ガングリオシド抗原が測定され
うる各種源泉：すなわち肺、肝臓、脳または類似の器官
の手術または剖検による資料、がんの転移の徴候が疑わ
れる肺またはその他の器官の生検によって得られる細胞
学的資料、呼吸器系の吸引、喀出により、あるいは胸膜
腔捷たは腹腔の穿刺によって得られた細胞、生物学的液
体、例えば全血液、血漿捷たは血清、リンパ液、脳を髄
液、尿、唾液または類似物、を例示するものである。

本発明において使用される抗原は、フコンルシアロンル
ガングリオテトラオース （ｆｕｃｏｓｙｌｓｉａｌｏｓｙｌｇａｎｇｌｉｏｔｅ
ｔｒａｏｓｅ）と呼ばれ、次の化学構造を有する：　Ｆ
ｕｃαｌ−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｎ
ｅｕＡｃα２−３　）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ　または１
■２αＦｕｃ１１３αＮｅｕＡｃＧｇ−Ｏｓｅ　４　（
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　編脂質資料、１９７７年参照）。

末端のグルコース部分の除去により、またはシアル酸（
Ｎｅｕ　Ａｃ）部分の、ガラクトース（Ｇａｌ）部分へ
の代シにＮ−アセチルガラク）　−スアミン（Ｇａｌ　
ＮＡｃ）　　部分への置換によって変性されたすべての
抗原が本発明の範囲内に包含される。本発明において言
及されるモノクローナル抗体は、すべて脂質群（アシル
スフィンゴシン）に結合した抗原から産生されたもので
あるが、本発明は１だ抗原基の他のすべての化合物に対
する結合をも包含する。

本発明において使用された抗原は、肺の小細胞がんの患
者の手術または生検によって得られた腫瘍組織から単離
されうる。腫瘍組織中の抗原の濃度は、一般に比較的低
く、特に患者が静細胞薬（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ　ｄｒ
ｕｇｓ）　　で処置されており、抗原の呻離が従って困
難な場合には殊にそうである。本発明者は、またがん抗
原の単離のだめに使用されうるもう一つの生物学的資料
を見出した。ある系統のミニ豚を飼料中にクロロキンを
混入して３〜６月間飼育した場合、この豚の中枢神経系
中に、特に背板神経節中に、高濃度のガングリオシド抗
原が生成される。次いで、仁のがんに関連するガングリ
オシド抗原は、脳および背板神経節から比較的簡単に単
離されうる。

この手段により、抗原の単離のためには、手術または生
検の資料に限定されず、また多くの実際上および倫理上
の困難が回避されうる。

すでにガングリオシド−それはシアル酸を含有する糖脂
質を意味する−は、抗原性が弱いことが見出されており
、そして高い親和性およびそれらに対する特異性を有す
る抗体を産生ずることが困難であった。この困難性は、
本発明によりガングリオシド抗原を公知の高い抗原活性
を有する細菌膜に吸着させることによって回避された。

この手段によってがん抗原に対する高い特異性および親
和性を有する多数のモノクローナル抗体が産生される。

従って、本発明は、がんに関連する抗原フコシルシアロ
シルガングリオテトラオースを特殊な種類のミニ豚の神
経系中に導入し、クロマトグラフィー法を用いて抗原を
単離しそしである種の細菌膜に吸着された純化抗原に対
するモノクローナル抗体を産生させる方法に関する。本
発明１ｄ、　、”！　’ｋ　化合物フコシルシアロシル
ガングリオテトラオースおよびこの物質のすべての誘導
体およびそれらに対するすべての型の抗体を、種々の形
態のがん、特にある種の形態の肺がんの診断に、そして
がん腫患者の治療に使用することを包含する。

例Ｉ Ｆｕｃ−ＧＭＩ　カンクリオシドの形の７コンルシアロ
シルガングリオテトラオース抗原の、ゲッチンゲン型の
小型ブタよりの単離 ブタのクロロキン治療 体重２０〜３０ｋｇのゲッチンゲン型 （ｔｙｐｅ　Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）の小型ブタに、飼料
１ｋｇ　ｐリクロロキンジホスフェー）　３０ｇを通常
の飼料に添加した飼料を投与した。各種成分を水の添加
の下に混合し、慎重に混合した後に飼料をペレット状と
なしそしそ乾燥した。この飼料をブタに２ケ月間与え、
次いで畜殺した（麻酔下の放血）。

網膜および背板神経節を含む全神経系を回収した。脳お
よび背根神経節＋網膜を別々に処理した。伺故ならば、
背板神経節および網膜は、脳よりも約２０倍も高い濃度
のＦｕｃ−ＧＭｌを含有しにコ（７）組織を均質化した
。ナイフポモゲナイザーを用いて１５００ｒｐｍにおい
て３分間均質化した後に、メタノール１０容を連続的攪
拌下に添加した。次に、り０ロホルム５容を加えた。１
時間抽出した後、透明な浮遊物を２００Ｏｒｐｍで遠心
分離することにより単離した。この浮遊物に水を添加す
ることにょシ最終的なりロロポルムーメタノールー水の
比４：８：５．６（容積比）を得た。分離漏斗で混合し
た後、２つの別々の相が現われた。上方の相を集め、そ
して泡立ちを防ぐためにブタノール０１容を添加した後
に、蒸発乾固した。蒸発は、水浴上で温度が５０℃を超
えないように温和に加温しながら回転式蒸発器を用いて
実施された。残渣に元の組織１容当９メタノール約０．
５容および１．ＯＭの水酸化カリウム０．５容を加え、
そして室温において一夜放置した。このアルカリ性の溶
液を１．ＧＭの塩酸を用いてｐＨ８４で中和し、次いで
流下する水道水に対して４８時間透析せしめた。

陰イオン交換クロマトグラフィーによるモノ７アロガン
グリオシド部分の単離 透析された粗ガングリオ７ド部分を蒸発しく凍結乾燥）
そしてクロロホルム−メタノール−水１容を元の組織１
容当り６０：３０：４．５の容量比で溶解した。カラム
（内径２０ｍｍ）にスフエｏ　シル（Ｓｐｈｅｒｏｓｉ
ｌ）−ＤＥＡＥ−デキストランを、元の組織１容当り樹
脂０．２容の割合で充填した。とのカラムに透析された
ガングリオシド抽出物を徐々に加え、次いでこのカラム
を１０床容量のクロロホルム−メタノール−水（６０：
３０：４．５容量で）を用いて溶離した。モノ／アロガ
ングリオシド部分は、メタノール中酢酸カリウム０．０
２Ｍの１０床容積で溶出された。モノ／アロガングリオ
シド部分を蒸発しそして蒸留水を用いる透析により脱塩
した。

ソリ力ゲルクロマトグラフイーによるＦｕｃ　−ＧＭ　
１の精製 クロマトグラフィー用に元の神経組織１ｇ当りンリカゲ
ル〔ラトロビーズ■（Ｌａｔｒｏｂｅａｄｓ■）〕１ｇ
を使用した。ソリ力ゲルをクロロホルム−メタノール（
容量比４：１）中に懸濁し、そして焼結ガラスフィルタ
ーを充填されゲルの量に応じて１５−２０ｍｍの直径を
有するガラスのカラムに注入した。ガングリオシド部分
ヲクロロホルムーメタノールー水（容量で６５：２５：
４　）　１０ｍ１ｌ中に溶解しそしてカラムに適用した
。それ゛　をまずゲル１ｇ（重量／容量）Ｉｇ当Ｊ１５
ｍｌのクロロホルム−メタノール−水（容量で６５：２
５：４）で溶出し、それを１つの部分に集めた。

それからクロロホルム−メタノール−２，５Ｍアンモニ
ア（容量で６０：４０：９）　　を用いて溶離を続け、
そしてフラクションコレクターテ５ｍ１ｔＤ　分画を採
取した。溶離は、カラムクロマトグラフィーに使用した
ものと同じ溶媒を用いた高性能の薄層クロマトグラフィ
ーによって各分画のｌＯμｌを試験することによりモニ
ターし、クロｏ　ホルム−１１ノール−２Ｍアンモニア
（６０：４０：９）およびガングリオシドをレゾルシノ
ール試薬を用いて検出した。Ｆｕｃ−ＧＭｌを含有する
分画をプールしそして蒸発乾燥する。

Ｆｕｃ−ＧＭＩの最終的な精製は、分離用薄層クロマト
グラフィーによって行なった。ガングリオシド（５μモ
ル）′を薄層板（２０Ｘ　２０ｃｍ、厚さ０．２５何、
メルク社（Ｍｅｒｃｋ　ＡＧ、　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）
製）上に適用シ、クロロホルム−メタノール−２，５Ｍ
アンモニアを用いて２１℃において６０分間展開した。

クロマトグラフィーの終了後、薄層板を水中のブロムチ
モール０．０１％でスプレーしそしてＦｕｃ−ＧＭＩ　
帯を掻取った。クロロホルム−メタノール−水（容量で
３０：６０：２０）を用いてゲルからガングリオシドを
溶離し、そしてメタノール中に溶解された水酸化カリウ
ム０．１Ｍの１滴を加え、蒸発乾燥した。純ガングリオ
シドＦｕｃ−ＧＭＩは、真空チンケータ−中で乾燥状態
に保たれるかまたは少量のクロロホルム−メタノール（
容量で２：１）中に溶解されそしてテフロンで栓をされ
た管に入れて＋４℃において暗所に保存された。

例２ フコンルシアロンルガングリオテトラオ−スに対するモ
ノクローナル抗体の、ガングリオシドＦｕｃ　−ＭＧ　
１による産生 例１による精製ガングリオシドｌ’ｉ’ｕｃ−ＧＭＩを
、ヤング（Ｙｏｕｎｇ、ＷＷ、　）およびその協力者に
より記載された（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５０　
、１００８−１０１９　、１９７９参照）原理による免
疫化の前に、酸で洗ったサルモネラ拳ミネソタ（Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）　　菌に吸着せ
しめた。

酸で洗ったサルモ坏う・ミネソタ菌の細菌膜５０μｇに
吸着され、ホスフェートで緩衝された生理的食塩水（ｐ
）Ｔ７．４）　１００μｌ中に懸濁されたガングリオシ
ドＦｕｃ−ＧＭ１５μｇを用いて、６〜８週間目のＢａ
１ｂ／ｃマウスに静脈的に免疫処置を行なった。２週間
後に同一条件下に同量の免疫原を用いて新たな免疫処置
を行なった（追加免疫）。

追加免疫化の３日後に、免疫処置されたマウスから取出
した牌臓の細胞をマウスのｓｐ　２１０骨髄腫の一細胞
と融合せしめた。得られた・・イブリドーマをセントク
ロス（Ｓｔ、　Ｇｒｏｔｂ）およびンヤイデツガ−（Ｓ
ｃｈｅ　ｉｄｅｇｇｅｒ）によって考案された調書〔ジ
ャーナル・オプ・イムノロジカル・メノッズ（Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　）’１１−２１　
＋　１９８０参照〕に従って増殖させ、試験しそしてク
ローニングを行なった。Ｆｕｃ−ＧＭＩに対して特異性
の分易抗体を測定するために増殖ハイブリドーマを有す
る各マイクロタイターウェルから培地を採取した。

測定は、エリザ（ＥＬＩＳＡ）系において次の手順に従
って行なわれた：メタノール５０μβ中に溶解されだＦ
ｕｃ−ＧＭ　１５０　ｐｍｏｌ　　をポリビニルマイク
ロタイタープレートのウェルに添加しそして蒸発乾燥さ
せた。これらのウェルを、００１Ｍホスフェート緩衝食
塩水（０，１４ＭＸＰＢＳ）、、　ｐＨ７，５で１：２
に希釈された培地１００μｌと共に一夜培養した。

ＰＢＳで充分に洗った後１．これらのウェルを、ＰＰＢ
５−１％のウソ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１’／２０
０に希釈されたベルオキンダーゼ（ＨＲＰ）　−抱合ウ
サギ抗マウス免疫グロブリン１００μｌと共に４時間保
温した。基質（クエン酸塩緩衝液、ｐＨ４，５の０．１
Ｍ中の０．１％オルトフェニルジアミンＨ２Ｏ２　０．
３％と混合）５０１１１と共に５分間保温した後、クイ
ターチック■（Ｔｉｔｅｒ−ｔｅｋ■）マイクロタイタ
ースキャンナ−（フロー−ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　＋ＵＳＡ）社製）を用いて
４　５　０　ｎｍにおける吸光度を測定した。・・イブ
リッドは、吸光度が平均の培地ブランクのそれを２倍ま
たはそれ以上超えておれば、陽性とみなさされた。陽性
・・イブリッドよりの培地を更にスクリーニングするた
めに採集し、そしてノ・イブリッドを液体窒素中に冷凍
した。

最初のエリザによるスクリーニングにおいてＦｕｃ−Ｇ
ＭＩに対して陽性のハイブリットよりの培地を正常のヒ
トリンパ球に対して交叉反応性について試験した。ヒト
のリンパ球（ＨｕＬｙ−　ｃ　）　Ｖｒ．、リントホル
ムら（Ｉ，ｉｎｄｈｏｌｍ　ｅｔ　ａｌ．　）　　によ
ッテ記載されたように（　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ．
　４０，５７０−５７６、１９８３参照）、全員ＡＢＭ
型の血液型の５人の提供者からの血液をリンホブレップ
■（　Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ■）で遠心分離することに
よって単離された。ＨｕＬｙ−Ｃと交叉反応する抗体を
産生ずるハイブリッドは、それ以上増殖されなかった。

Ｆｕｃ−ＧＭＩ陽性／ＨｕＬｙ−ｃ陰性のハイブリット
を限界希釈によりクローニングしそして増殖せしめた。

培地を採集しそして更に処理することなく更に試験する
ために使用した。各クローンによって産生された抗体の
アイソタイプは、アイツタイブ特異性抗マウス免疫グロ
ブリンを含有するアガロース中で単純放射免疫拡散法に
よって測定された。

Ｆｕｃ　−ＧＭ　１陽性／ＨｕＬｙ−ｃ陰性のハイブリ
ドーマをＦｕｃ−ＧＭＩに対して特異性の分泌抗体を測
定するためにクローニングしそしてスクリーニングした
。測定は、二抗体固相う／オイムノアソセイによって行
なわれた。ｐｕｃ−ＧＭＩおよび多数の異なった中性の
糖脂質およびガングリオ７ドをメタノール中に溶解し、
マイクロタイタープレートのウェルにピペットで注入し
た。溶媒を蒸発させた後、抗体で覆われたウェルをモノ
クローナル抗体と共に培養した。結合された抗体を１２
５１標識抗マウス免疫グロブリン、　　＋２５１−抗マ
ウスＩｇＭｔたは　　■ー抗マウス■ｇａＦ（ａｂ）２
フラグメントを用いて検出した。各モノクローナル抗体
をＦｕｃ−ＧＭＩ　：ヒトの脳カングリオシト、正常の
肺細胞、中性の糖脂質およびガングリオシドの標準混合
物に対して試験した。

上記のモノクローナル抗体の特異性は、糖脂質抗体の薄
層クロマトグラフィー免疫染色法にによっても測定され
た。多数の器官よシの中性および酸性の糖脂質の全分画
をアルミニアーバツク高性能薄層板（Ｉ（ＰＴＬＣ）上
で分離し、そしてト　リ　ス緩衝　−１％　ＢＳＡ　　
（）　　リ　ス　０．０５　　Ｍ　’Ｉ　　ＮａＣ４０
，１４Ｍ１ｐＨ７，８、ラン血清アルブミン１０ｇ／ｌ
およびメルチオレー）　１００ｍｇＡを含有）で希釈さ
れｒｔ　Ｆｕｃ−ＧＭｌ陽性ハイブリドーマのモノクロ
ルナル抗体と共に培養した。結合されたモノクローナル
抗体を　１２５■−標識抗マウス免疫グロブリンで検出
し、次いでそれをＸ線フィルムに１２〜２４時間露出せ
しめた。異なったモノクローナル抗体を同じＩ（ＰＴＬ
Ｃ−プレート上で試験する場合には、抗体溶液中に酢酸
セルロースのストリップを浸しそしてＨＰＴＬＣ−プレ
ートの１つのレーンをこのストリップで覆うことによっ
て抗体を適用した。

Ｆｕｃ−ＧＭＩに対する排他的特異性を示す抗体のみが
次の検討に使用された。

例３ 肺の小細胞がんにおけるフコシルシアロシルガングリオ
ソルテトラオース抗原の測定 例１において記載された方法と同じ原則的方法が採用さ
れたが、小さな組織の試料に最適と々るように修正され
た。約０．１ｇの組織を、水浴中にテフロンの乳棒を有
する小円錐管組織グラインダーで水０．５　ｍｌと一緒
に均質化した。均質イビの完了後、メタノール１．６ｍ
ｌおよびクロロホルム０．８ｍｌを添加した。充分に混
合した後、管をｓｏｏ　ｘ　ｇにおいて１０分間遠心分
離した。透明な表面浮遊物をテフロンキャップを有する
キマソクス（Ｋｉｍａｘ）管に移した。沈降物を水０５
ｍ１中に懸濁し、次いでメタ／“−ル１．６ｍｌおよび
クロロホルム０．８　ｍｌＪを添加した。混合および遠
心分離は、前記と同様に行なつ１ｔｏ２つの表面浮遊物
を一緒にし、４：８：５．６　（容量比）の最終クロロ
ホルム−メタノール−水の比となるように水を添加した
。混合後、管を１００　Ｘ　ｇにおいて５分間遠心分離
した。上層を丸首をもった小さな丸形フラスコに移し、
インブタノール０１容を添加した後、表面浮遊物を蒸発
させた。残渣をメタノール中の水酸化ナトリウム０．１
Ｍと共に室温において１時間加熱した。

エステル交換の終了後、クロロホルム４ｒｎｌおよびメ
タノール１ｍｌを添加し、そして内容物を、セファデッ
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　２５１　ｇ　　をりＤ
ｏホルム−メタノール−水６０：８０：４．５　（容量
比）中に充填した小カラムに注入した。溶離液を酢酸形
においてテアエ＝セファロース■（ＤＥＡＥ−８ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ■）（ファーマノア・ファイン・ケミカルズ
社（スエーデン）　（ｐＨａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈ
ｅｍ　１ｃａｌｓ　、Ｕｐｐｓａｌａ　、　Ｓｗｅｄｅ
ｎ）製）１０ｇと共にカラムに徐々に加えた。このカラ
ムをメタノール１０ｍ１ですすいだ後、腫瘍の抗原をメ
タノール中の酢酸カワウＡ０．０２Ｍを用いて溶出せし
めた。蒸発ジクロロホルム−メタノール−水６５：２５
：４（容量比）中で分割した後、単純モノ／アロガング
リオシドを、６５：２５：４（容量比）の１５カラム容
を有する溶離により抗原分画から分離し、その後で抗原
分画をクロロホルム−メタノール−水５０：４（１：１
０　（容量比）１０容を用いて溶離した。

抗原分画の一部をメタノール中に溶解し、抽出物５０μ
ｌをポリビニルマイクロタイタープレートのウェルの中
にピペットで注入した。メタノール中綿Ｆｕｃ　−ＧＭ
　１の０５ないし５　ｐｍｏｌの標準溶液を他のウェル
に加えた。溶媒を窒素流下に蒸発させた。未知の試料お
よび標準に、Ｆｕｃ−ＭＣＩに対して特異性であり、そ
して例２に記載のように産生され、ＰＢＳ／ＢＳＡ中に
溶解されたモノクローナル抗体１０〜１００μｇ　を添
加した。

これらの試料を室温において１時間培養した。

ウェルをＰＢＳ溶液で８回洗い、次いで１２，５　■−
標識抗マウスー免疫グロブリンを加えそして３時間反応
せしめた。ＰＢＳでの洗滌を繰返した後、未知試料およ
び標準試料を有するウェルをマイクロタイタープレート
から切除し、ガンマーカｆｙ　７　ター　ｆ　ｉｌ数し
た。未知のフコンルゾアｏシルガングリオテトラオシル
抗原の濃度は、純Ｆｕｃ−ＧＭＩの標準曲線から言」算
された。

上記の条件下でＦｕｃ−ＧＭＩは、１９／２０肺小細胞
がん中に検出された。この抗原は、他の型の肺がん（扁
平上皮がん、大細胞がんまたは腺がん）においても寸だ
乳腺、胃、結腸直腸粘膜、膀胱寸たは子宮のがんにおい
ても確認されなかった。

この抗原の痕跡は、正常およびがん性の膵臓組織に示さ
れた。

例４ 肺の小細胞がんをもつ患者の血清中のフコシルシアロシ
ルガングリオテトラオース抗原の検出下記の手続は、血
清または血漿中におけるフコシルシアロシルガングリオ
テトラオース抗原を示すために使用された。メタノール
４ｍｌを入れた小さな試験管の中に血清１．０　ｍｌＪ
を連続的攪拌下に徐々に滴加した。次にクロロホルム２
ｍｌを添加し、内容物を充分に混合し、そして８００　
Ｘ　ｇにおいて１０分間遠心分離した。透明な表面浮遊
物を新しい試験管に移し、そして４０℃の水浴上で温和
に温めながら窒素気流中で溶媒を蒸発させた。残渣をク
ロロホルム−メタノール−水６０：２５：４　（容量比
）の５ｍｌ中に溶解しそしてシリカゲル〔メルク社（Ｍ
ｅｒｃｋ　ＡＧ。

１）ａｒｍｓｔａｄｔ　、ＦＲＧ）製のシリカゲル６０
．２３０−４００メツシュ〕１ｇを入れた小さなカラム
（内径８−１０ｍｍ　）に装入した。このカラムをクロ
ロホルム−メタノール−水６５：２５：４　（容量比）
の２０ｍ１を用いて溶離し、そして次に腫瘍の抗原ヲク
ロロホルムーメタノールー水５０：４０：１　（容量比
）の１０ｍ１を用いて溶離した。蒸発、水に対する２日
間の透析および凍結乾燥の後、残渣をクロロホルム−メ
タノール−水６０：３０：４．５（容量比）の５１ｍｊ
？中に溶解し、そして酢酸の形でデアニーセファロース
１ｇを入れた小さなカラムに徐々に加えた。このカラム
をメタノール１０ｍ１を用いて溶離し、そして次に腫瘍
の抗原をメタノール中酢酸カリウム０．０２　Ｍ　１０
ｍ１ｌを用いて溶離した。塩を透析によシ除去し、そし
て蒸発後に残渣を小容量のメタノール中に溶解させた。

腫瘍の抗原の濃度を固相二抗体法を用いて測定し、その
際抗原を固体相に吸着させそして特異性モノクローナル
抗体（例２）および抗マウス−免疫グロブリンを用いて
測定した。Ｆｕｃ−ＧＭＩ　（２０ｐｍｏ、６）および
未知の血清試料の純化された抗原分画をメタノール中に
溶解し、そしてそれらの一連の希釈物（１／２〜１／２
０４８）をポリビニルマイクロタイタープレート〔フロ
ー〇ラバラ　−トリーズ社（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）製のａｒｔ、　ｎｒ、　７７−１７３−０
５）〕　　のウェル中にピペットで注入し、そして蒸発
せしめた。ウェルの非特異性結合物をＰＢＳ中の１％Ｂ
５Ａ２０μ！でブロックし、次いでＰＢＳ中の１％ＢＳ
Ａで希釈された特異性モノクローナル抗体５０μｌを添
加した。４時間培養した後、ウェルをＰＢＳ　２００μ
ｅで３回すすいだ。すすぎの終った後、　　　■、ヘル
オキシダーゼ捷たはβ−ガラクトシダーゼで標識された
ウサギの抗マウス免疫グロブリンを加えた。抗原の量の
測定は、ガンマカウンターで、または酵素基質（オルト
フェニルジアミン、例２参照、捷たけクエン酸塩緩衝液
、ｐＨ４，２中のメチルウンベリフェリル−β−ガラク
トシド）を添加した後に、それぞれ分光計または分光螢
光光度計で吸光度の読みによって行なわれる。血清中に
おけるがん抗原の濃度は、ＦｌｊＣ−ＧＭＩの標準曲線
から計算された。

上に規定された諸条件の下で、抗原は、肺の小細胞がん
をもった患者の血清中にのみ検出された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 特許請求の範囲 １、がんの診断、管理、処置または予防用の、糖質の性
   質を有する特異性がん関連抗原（ハプテン）、フコシル
   シアロシルガングリオテトラオース（Ｆｕｃα１−２−
   Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（α２−３Ｎｅｕ
   Ａｃ）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）およびその誘導体。 ２、抗原が糖脂質の形の脂質部分に結合しているか、糖
   タンパク質または糖ペプチドの形のペプチドまたはタン
   パク質に結合しているかまたはいずれかの他の化合物に
   結合していることを特徴とする、がんの診断、管理、処
   置または予防用の、糖質の性質を有する特異性がん関連
   抗原（ハプテン）、フコシルシアロシルガングリオテト
   ラオース（Ｆｕｃα１−２−Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡ
   ｃβ１−４（α２−３ＮｅｕＡｃ）Ｇａｌβ１−４Ｇｌ
   ｃ）およびその誘導体の使用。 ３、抗原およびその誘導体の検出、測定および局部の決
   定のためにこの抗原に対する特異性抗体（モノクローナ
   ルまたはポリクローナル）を産生するための特許請求の
   範囲第１項記載の抗原の使用。 ４、抗原が特殊な型の肺がん、小細胞がん（オート−細
   胞がん）またはその転移からフコシルシアロシルガング
   リオテトラオシルセラミンド（Ｆｕｃ−ＧＭ１）の形で
   単離されたものである特許請求の範囲第１項または第２
   項による抗原の使用。 ５、抗原が正常な動物の組織から、特にブタから、特に
   その動物がリソソーム刺戟剤で処理された場合に、Ｆｕ
   ｃ−ＧＭ１ガングリオシドの形で単離されたものである
   特許請求の範囲第１項または第２項による使用。 ６、抗原がその抗原に特異的に向けられた抗体の産生に
   使用される前にその免疫原性を増大させるために特定の
   細菌膜に吸着されたものである特許請求の範囲第１項、
   第２項、第４項または第５項による使用。 ７、ヒトの小細胞がんまたはがん組織から誘導された抗
   原に結合するモノクローナル抗体の産生方法において、 −脾臓細胞（特許請求の範囲第１項による抗原で高度免
   疫状態にされたマウスよりのもの）を適当なマウスの骨
   髄腫細胞系と融合し、 −特許請求の範囲第１項による抗原に結合する抗体を分
   泌するハイブリツドについてスクリーニングを行ない、 −エピトープ特異性を決定するハイブリツドによつて産
   生される抗体を分離する抗体−産生ハイブリツドを、固
   相免疫親和法によつてクローニングを行ないそして完全
   な特異性のみを有する抗体のみを選択する、 ことを特徴とする上記モノクローナル抗体の産生方法。 ８、抗原が＾１＾２＾５Ｉまたは酵素またはフルオルク
   ロームで標識された第二抗体によつて結合された特異性
   抗体の同定によつて示されたものである特許請求の範囲
   第１項、第６項または第７項による使用。 ９、抗原が組織物質中において脂質の抽出および固体相
   への結合によるクロマトグラフィー的精製および特異性
   抗体への結合による培養の後に決定されたものである特
   許請求の範囲第１項または第７項による使用。 １０、抗原が個体からの体液中において、脂質の抽出お
   よび固体相への結合によるクロマトグラフィー的精製お
   よび特異性抗体を用いる培養および上記表面に結合され
   た抗体の量の測定後に決定されたものであり、抗体が標
   識付けされまたは標識付けされずに、次いで放射性同位
   体、酵素、螢光プローブまたはその他の標識で標識付け
   された抗マウス免疫グロブリンによつて標識付けされる
   特許請求の範囲第１項または第７項による使用。 １１、放射性同位体によつて標識付けされ、またはその
   他の手段によつて標識付けされた特異性抗体が、腫瘍お
   よび／または腫瘍の転移を検出しおよび／または場所を
   特定するためにヒトに注射される特許請求の範囲第１項
   または第７項による使用。 １２、特異性抗体が個体の小細胞がんの処置のために使
   用される特許請求の範囲第１項または第７項による使用
   。 １３、抗原が個体中において保護的な抗腫瘍免疫の形成
   を刺戟することにより腫瘍の増殖を防止しまたは抑制す
   るために使用される特許許請求の範囲第１項による使用
   。