FI80711C - Foerfarande foer framstaellning av en terapeutiskt anvaendbar termiskt denaturerad, till en glykosidbindning ansluten antigen (gra), som haerroer sig fraon cancerceller. - Google Patents

Description

1 80711

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen termisesti denaturoidun, glykosidisidokseen liittyvän, syöpäsoluista johdetun antigeenin (GRA:n) valmistamiseksi 5 Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen termisesti denaturoidun, glykosidisidokseen liittyvän, syöpäsoluista, johdetun antigeenin (GRA:n) valmistamiseksi, jossa erotetaan syöpäsoluista solumembraanikomponentti pääteasemassa olevaa galaktoosia 10 ja/tai pääteasemassa olevaa N-asetyyligalaktosamiinia sitovalla lektiinillä, lektiinireseptorin saamiseksi, tai vasta-aineella, joka pystyy kiinnittymään lektiiniresep-toriin, joka on saatu syöpäsolumembraanista ja joka voi kiinnittyä pääteasemassa olevaa galaktoosia ja/tai pääte-15 asemassa olevaa N-asetyyligalaktosamiinia sitovaan lek- tiiniin, fraktion saamiseksi, jolla on sitomiskyky pääteasemassa olevaa galaktoosia ja/tai pääteasemassa olevan N-asetyyligalaktosamiinia sitovaan reagenssiin nähden, erotetaan liittyvän antigeenin saamiseksi. Glykosidisi-20 dokseen liittyvää, syöpäsoluista johdettua antigeeniä (näitä kutsutaan seuraavassa nimellä "GRA") ja tarkemmin sanoen GRA:ta, joka vaikuttaa erityisesti GRA:ta sisältäviin syöpäsoluihin saaden helposti aikaan syöpäsoluihin nähden sytotoksisia lymfosyyttejä, jotka tuhoavat syöpä-25 soluja (näitä lymfosyyttejä kutsutaan seuraavassa "tappajasoluiksi" ).

On tunnettua, että solut, jotka aikaan saavat immuunivasteen, erityisesti soluvälitteisessä immuunivasteessa pääosaa esittävät T-lymfosyytit, aiheuttavat vie-30 raan solun antigeenien vaikutuksesta siirrännäisten hylkimistä, mutta ne eivät immunoinhiboi merkittävästi tai inhiboivat hyvin rajoitetusti syöpäsoluja. Siten syöpäsolut eivät tuhoudu ja moninkertaistuvat in vivo aiheuttaen lopulta syövän kantajan kuoleman.

35 Aikaisemmat tutkimukset, joita on tehty syövän kantajan immuunivasteesta syöpäsoluihin ja tämän hyväksi- 2 80711 käytöstä syövän hoidossa, ovat osoittaneet, että syöpäsolulle ominaisessa antigeenissä, jota ei ole todettu eristetyissä normaalisoluissa, on GRA:ta, joka toimii im-munogeenina kantajalle ja jolla on hyvin suuri immuni-5 sointikyky, joka aiheuttaa syöpäsoluille spesifisen immuunivasteen ja että käytettäessä GRA:ta lymfosyyttien herkistämiseen, voidaan saada tappajasoluja, jotka vaikuttavat spesifisesti GRA:ta sisältäviin syöpäsoluihin, ja jos tappajasoluja annetaan syövän kantajalle, ne tun-10 nistavat GRA:n ja vaikuttavat GRA:ta sisältäviin syöpäsoluihin tuhoten niitä, ja että niillä siten on erinomainen teho syövän hoidossa ja ehkäisyssä.

Yllä kuvattu GRA, joka on GRA:ta sisältävien syöpäsolujen syöpäsolun membraanin aineosa, on komponentti, 15 joka voi sitoa lektiiniä, joka pystyy sitomaan pääteasemassa olevan galaktoosin ja/tai pääteasemassa olevan N-asetyyligalaktosamiinin (seuraavassa nimitetty "lektiini-reseptoriksi").

Tutkimusten seuraavassa vaiheessa on todettu, että 20 syöpäsolujen membraanin aineosiin sisältyy komponentti, jonka ominaisuutena on kyky sitoa vasta-ainetta, joka puolestaan pystyy sitomaan yllä kuvattua lektiiniresepto-ria (kutsutaan seuraavassa nimellä "GRA-vasta-aine"), tätä membraanin komponenttia kutsutaan seuraavassa nimellä 25 "A-GRA". On myös todettu, että tämä A-GRA on uusi GRA, jolla on samankaltaisia vaikutuksia kuin edellä kuvatulla lektiinireseptorilla.

Toisaalta on tunnettua, että koska syöpiin kohdistuva immuunireaktio (kasvaimen hylkiminen) perustuu pää-30 asiassa soluvälitteiseen immuniteettiin kun taas humoraa-linen immuniteetti, jonka aiheuttaa syöpään liittyvän antigeenin vasta-aine naamioimalla antigeenin ja vaikuttamalla immuunireaktiolle inhiboivana tekijänä (salpaava vasta-aine) sellaisenaan tai muodostamalla immuunikom-35 pieksin tai muuttamalla antigeenin jakaantumista (antigeenin modulaatio), on seurauksena joskus elävän olennon 3 80711 immunologisen puolustusmekanismin tuhoutumisen lisäksi myös kasvun kiihtyminen, mikä vaikuttaa kantajaan vahingollisesti .

Laajoja tutkimuksia on tehty, jotta saataisiin 5 syöpäsoluun liittyviä antigeenejä, jotka pystyvät aikaan saamaan voimakkaan soluvälitteisen immuniteetin, joka on spesifinen syöpäsoluille ja joka estää humoraalisen immuniteetin esiintymisen syövän kantajissa (alhainen vasta-aineiden muodostamiskyky), ja näiden tuloksena on havait-10 tu, että termisesti denaturoitu antigeeni, joka saadaan lämpökäsittelemällä GRA:ta, joka koostuu yllä kuvatusta lektiinireseptorista ja/tai A-GRA:sta (seuraavassa kutsuttu nimellä "termisesti denaturoitu GRA"), täyttää edellä esitetyt vaatimukset ja termisesti denaturoitua 15 GRA:ta voidaan käyttää syöpien lääkehoitoon ja ehkäisyyn laajalla annosalueella, koska sen riippuvuus pitoisuudesta on pieni.

Tämä keksintö perustuu yllä mainittuihin havaintoihin ja kohdistuu yllä kuvatun termisesti denaturoidun 20 GRA:n valmistusmenetelmään. Menetelmälle on tunnusomaista, että tässä kuvatulla tavalla saatu glykosidisidokseen liittyvä antigeeni kuumennetaan.

Koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana yllä kuvattua A-GRA:ta tai termisesti denaturoitua GRA:ta, 25 voidaan käyttää syövänvastäisenä lääkkeenä.

A-GRA:ta voidaan saada GRA:ta sisältävistä syöpäsoluista kuten viljellyistä ihmis- tai eläinsyöpäsoluis-ta, siirrostetuista syöpäsoluista, spontaaneista syöpäsoluista, kemiallisesti tai virusten avulla aikaan saaduis-30 ta syöpäsoluista tai syöpäsoluista, jotka ovat peräisin kudosleikkauksista, jne kuten seuraavassa esitetään. Tarkemmin sanottuna solumembraanin komponentti eristetään ensin yllä kuvatuista syöpäsoluista ja käsitellään sen jälkeen GRA-vasta-aineella A-GRA:n sitomiseksi ja A-GRA-35 GRA-vasta-ainekompleksin eristämiseksi. Edelleen A-GRA voidaan erottaa käsittelemällä sitä lektiinillä, joka pystyy kiinnittymään pääteasemassa olevaan galaktoosiin 4 80711 ja/tai N-asetyyligalaktosamiiniin, jolloin se kiinnittyy lektiiniin.

Esimerkkejä lektiinistä, joka voi spesifisesti kiinnittyä pääteasemassa olevaan galaktoosiin, ovat maa-5 pähkinälektiini (PNA), risiinipavun (Ricinus sommunis) lektiini ja soijapapulektiini (SBA) jne (JBS 250, 8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm., 62, 144 (1975); Z. Xmmunitätsforch. 138, 423-433 (1969); Br. J. Exp. Pathol. 27, 228-236 (1946); Proc.Nat.Acad.Sei. USA., 10 75, nro 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry 13, 196-204 (1974); ja Carbohydrate Research, 51. 107-118 (1976).

Esimerkkejä lektiinistä, joka voi sitoa spesifisesti pääteasemassa olevaa N-asetyyligalaktosamiinia, ovat Dolichos-pavun lektiini (DBA), braid-appelsiinin 15 lektiini, Hilix pomatia-lektiini, Lima-pavun lektiini, SBA, Bauhiniapavun lektiini, jne.

GRA-vasta-aineena voidaan käyttää mitä tahansa materiaalia, jos sillä on se ominaisuus, että se sitoo lek-tiinireseptorin. On mahdollista käyttää esimerkiksi syö-20 päpotilaan autovasta-aineita, eläimistä saatuja antiseerumeja, joita saadaan immunisoimalla eläimet käyttäen antigeeninä lektiinireseptoria tavanomaiseen tapaan, ja mo-noklonaalisia vasta-aineita, joita saadaan tunnetulla menetelmällä (esimerkiksi menetelmällä, joka on kuvattu 25 julkaisussa Nature, 256, 495-497 (1975)) pernasoluista, jotka on immunisoitu käyttäen antigeeninä lektiiniresep-torin suhteen positiivisia syöpäsoluja, näiden solumem-braanikomponentteja tai lektiinireseptoria.

Syöpäpotilaiden autovasta-aineita voidaan saada 30 antiseerumina, joka otetaan talteen tavanomaisella menetelmällä GRA-vasta-aineen suhteen positiivisista potilaista ja voidaan käyttää sellaisenaan tai immunoglobu-liinifraktiona, joka saadaan puhdistamalla se suolanmuo-dostuksella jne.

35 Lektiinireseptorina on mahdollista käyttää ainei ta, joita saadaan erottamalla komponentti, jolla on kyky sitoa lektiiniä, joka pystyy sitomaan pääteasemassa ole- 5 80711 van galaktoosin ja/tai pääteasemassa olevan N-asetyyliga-laktosamlinin syöpäsolun membraanikomponentista, menetelmällä, jolla saadaan tässä kuvattua A-GRA:ta. Nisäkkäitä, jotka voidaan immunisoida, ei ole erityisesti rajoitettu.

5 Yleensä käytetään kaniineja, hiiriä, rottia ja senkaltaisia, ja immunisointi voidaan suorittaa tavanomaisella menetelmällä. Esimerkiksi yllä kuvattu lektiinireseptori laimennetaan fysiologisella suolaliuoksella jne., niin että saadaan sopiva pitoisuus ja sitä annetaan eläimelle 10 ruiskeena ihoon suspensiona yhdessä Freundin adjuvantin kanssa. On edullista suorittaa anto useita kertoja joka viikko tai joka toinen viikko siten että kokonaisannokseksi tulee 1-20 pg tai niillä main esimerkiksi kaniinien ollessa kyseessä ja GRA-vasta-aine otetaan talteen seeru-15 minä.

Monoklonaalisena vasta-aineena on mahdollista käyttää aineita, joita saadaan menetelmällä, jossa seulotaan haluttua vasta-ainetta tuottava hybridoma-solulinja hybridomasoluista, jotka on saatu yhdistämällä yllä kuva-20 tulla tavalla immunisoidun eläimen pernasoluja tunnettuihin myeloomasoluihin kuten NS-1, P3, P3-U1, MPC-11, SP2, X63.6.5.3, jne. ja erottamalla emäliuoksena viljelyväli-aineesta, jossa yllä kuvattuja hybridoma soluja on viljelty tai moninkertaistamalla hybridomasolujen määrä an-25 tamalla niitä tähän soveltuvalle eläimelle ja erottamalla mahaonteloon kerääntyneestä nesteestä.

Syöpäsolun membraanikomponentin erottaminen voidaan suorittaa tunnetuilla menetelmillä kuten esimerkiksi homogenointimenetelmällä tai liuotusmenetelmällä käyttäen 30 liuotusapuainetta. Edullisesti se voidaan toteuttaa menetelmällä, jossa syöpäsolut homogenoidaan fysiologiseen suolaliuokseen tai sopivaan puskuriliuokseen, erotetaan sakka linkoamalla jne, liuotetaan se fysiologiseen suolaliuokseen tai puskuriliuokseen liuotinapuaineen läsnäol-35 lessa ja erotetaan emäliuos linkoamalla jne.

Liuotinapuaineina voidaan käyttää lukuisia pinta-aktiivisia aineita, joiden tiedetään tekevän solumembraa- 6 80711 ni liukenevaksi, esimerkiksi ionittomia pinta-aktiivisia aineita kuten Tritoi$ X-100" (valmistaja Wako Pure Chemical Industries, Ltd), "NP-40" (valmistaja Shell Co), digitoniinia tai ureaa jne ja anionisia pinta-aktiivisia 5 aineita kuten natriumdodekyylisulfaattia (SDS) jne.

GRA-vasta-ainetta sitomaan pystyvä A-GRA voidaan erottaa solumembraanin komponentista tavanomaisilla fysi-kokemiallisilla tai biokemiallisilla keinoilla käyttäen hyväksi A-GRA:n ominaisuuksia. Esimerkkejä tällaisista 10 keinoista ovat affiniteettikromatografia, jossa käytetään yllä kuvattua vasta-ainetta sisältävää pylväskantajaa, immunosaostusmenetelmä, geelisuodatusmenetelmä, elektro-foreesimenetelmä, fysikaalinen saostusmenetelmä, jossa käytetään glukoproteiinisaostinta kuten polyetyleenigly-15 kolia tai asetonia, jne sekä näiden sopivien yhdistelmien muodostamat menetelmät. Edullisena suositellaan käytettäväksi affiniteettikromatografiaa, jossa käytetään vasta-ainetta sisältävää pylväskantajaa. Pylväskantaja voidaan saada helposti kiinnittämällä yllä mainittu vasta-aine 20 liukenemattomaan alustaan. Vasta-aineen kiinnittäminen liukenemattomaan alustaan voidaan toteuttaa menetelmillä, joita tunnetaan elävien materiaalien kiinnittämiseksi. Näistä on edullinen kiinnitysmenetelmä, jossa käytetään syaanibromidilla aktivoitua polysakkaridia, ja menetelmä, 25 jossa käytetään N-hydroksisukkinimidiesteriä. Menetelmäs sä, jossa käytetään syaanibromidilla aktivoitua polysakkaridia, käsitellään liukenematonta alustaa syaanibromidilla ja kytketään saatuun aktivoituun ainekseen GRA-vasta-aine miedoissa olosuhteissa GRA-vasta-aineen kiinnit-* : 30 tämiseksi alustaan. Kun liukenematonta alustaa käsitel- lään syaanibromidilla, sitä voidaan käsitellä vedessä tai asetonitriilissä huoneen lämmössä samalla kun pH pidetään Γ. alueella 7,5-12 emäksisen yhdisteen kuten natriumhydrok- sidin tai natriumbikarbonaatin jne avulla tai puskuri-35 liuoksessa, jonka pH on 7,5-12, kuten 0,1M natriumbikar-bonaattipuskuriliuoksessa, jonka pH on noin 8,7 tai 0,01M fosforihappopuskuriliuoksessa, jonka pH on noin 7,7 jne 7 80711 noin 1-12 minuutin ajan. Käytetty syaanibromidimäärä on yleensä painoltaan lähes sama määrä kuin liukenemattoman alustan paino. Liukenemattomana alustana on mahdollista käyttää mitä tahansa tunnettua alustaa, joka adsorboi 5 heikosti ja epäspesifisesti eläviä materiaaleja yleensä ja jolla on suuri huokoisuus ja jossa on funktionaalisia ryhmiä, jotka pystyvät sitomaan eläviä materiaaleja lievissä olosuhteissa ja ovat riittävän stabiileja kemiallisesti ja fysikaalisesti. Esimerkkejä liukenemattomista 10 alustoista ovat selluloosa-alustat kuten aminoetyylisel-luloosa, karboksimetyyliselluloosa, bromiasetyylisellu-loosa tai p-anilinoselluloosa jne, verkkoutuneet deks-traanialustat kuten Sephadea^ tai CM-SephadexP (valmistaja Pharmacia Co), jne ja agaralustat kuten SepharoseP 2B, 15 Sepharosd® 4B tai Sepharos^® 6B (valmistaja Pharmacia Co), jne. Kun saatu syaanibromidilla aktivoitu alusta kytketään GRA-vasta-aineeseen, käytetään syaanibromidilla aktivoitua alustaa 30-80 kertainen painomäärä GRA-vasta-paineeseen verrattuna ja reaktio saatetaan tapahtumaan 20 yleensä lämpötilassa 0-40°C, edullisesti 2-8°C noin 10-20 tunnin ajan sopivassa liuottimessa, esimerkiksi 0,1M natriumbikarbonaatin vesiliuoksessa (joka sisältää 0,5M nat-riumkloridia, pH 8,4). Näin voidaan valmistaa kantaja af-finiteettikromatografiaa varten.

25 Kromatografiällä, jossa käytetään yllä kuvattua, GRA-vasta-ainetta sisältävää kantajaa affiniteettikroma tografiaa varten, voidaan haluttu A-GRA saada jäämään pylvääseen yllä kuvatussa kantajassa olevaan GRA-vasta-aineeseen sitoutuneena. Sitten A-GRA saadaan suoritta-30 maila vaihtoreaktio ajamalla pylvään läpi GRA-vasta-ai-netta sitomaan pystyvä aine tai adsorptioerottaja (eluointiliuos) kuten suolaliuos, jonka pitoisuus on suuri, kaliumtiosyanaatin vesiliuos, boorihappopuskuriliuos tai suolahappo glysiinipuskuriliuos (pH = 2,7) A-GRA:n 35 erottamiseksi.

Aineina, jotka pystyvät sitomaan GRA-vasta-aineen yllä kuvatussa vaihtoreaktiossa, tulevat kysymykseen ai- β 80711 neet, jotka kiinnittyvät lektiiniin, joka pystyy sitoutumaan galaktoosiin, kuten galaktoosi, disakkaridit, joiden pääteasemassa on galaktoosi, tai oligosakkaridit, joiden pääteasemassa on galaktoosi, jne, ja aineet, jotka kiin-5 nittyvät lektiiniin, joka pystyy sitoutumaan N-asetyyli-galaktosamiiniin, kuten N-asetyyligalaktosamiini, disakkaridit, joiden pääteasemassa on N-asetyyligalaktosamiini tai oligosakkaridit, joiden pääteasemassa on N-asetyyligalaktosamiini .

10 Muodostuva A-GRA voidaan erottaa käsittelemällä lektiinillä, joka pystyy kiinnittymään pääteasemassa olevaan galaktoosiin ja/tai pääteasemassa olevaan N-asetyy-ligalaktosamiiniin, jolloin se kiinnittyy tähän lektiiniin. Lektiinikäsittely voidaan toteuttaa yllä kuvatun 15 affiniteettikromatografian mukaisesti käyttäen lektiiniä sisältävää pylväskantajaa. Pylväskantajina tulevat kysymykseen kaupallisesti saatavat kantajat sekä sellaiset, jotka saadaan samalla menetelmällä kuin edellä kuvattu menetelmä GRA-vasta-aineen kiinnittämiseksi liukenematto-20 malle alustalle. Edelleen voidaan kromatogra£ia, jossa käytetään lektiiniä sisältävää affiniteettikromatografia-kantajaa, toteuttaa samoin kuin edellä kuvattu GRA-vasta-aineen affiniteettikromatografia.

Kantajaan adsorboitu A-GRA irrotetaan vaihtoreak-25 tiolla tai adsorboivalla erottimella. Valhtoreaktio toteutetaan käyttäen yllä kuvattuja aineita, jotka voivat kiinnittyä lektiiniin, joka pystyy sitomaan galaktoosin, kun kantajana käytetään galaktoosia sitomaan pystyvää lektiiniä, ja se toteutetaan käyttäen yllä kuvattuja 30 aineita, jotka voivat kiinnittyä lektiiniin, joka pystyy sitomaan N-asetyyli-galaktosamiinin, kun kantajana käytetään N-asetyyligalaktosamiinia sitomaan pystyvää lektiiniä. Valmistettaessa yllä kuvattua A-GRA:ta saadaan lektiiniä sitomaan pystyvä komponentti (lektiinireseptori) 35 syöpäsolujen membraanista yllä kuvatulla lektiinikäsitte-lyllä ja alistetaan sen jälkeen edellä kuvattuun käsitte- 9 80711 lyyn GRA-vasta-aineella, millä voidaan saada haluttu A-GRA.

Yllä kuvatulla tavalla saatu A-GRA sisältää glyko-proteiineja, glykolipidejä ja/tai sakkarideja, joista jo-5 kaisessa on pääteasemassa galaktoosi ja/tai N-asetyyliga-laktosamiini. Tämä A-GRA voidaan tarvittaessa puhdistaa tai lyofilisoida tavanomaisella menetelmällä.

Lektiinireseptori voidaan saada erottamalla yllä kuvattu komponentti, jolle on ominaista, että se on kiin-10 nittynyt lektiiniin, joka pystyy sitomaan pääteasemassa olevan galaktoosin ja/tai pääteasemassa olevan N-asetyy-ligalaktosamiinin, yllä kuvatusta syöpäsolun membraani-komponentista menetelmällä, joka on kuvattu edellä A-GRA:n valmistamiseksi, edullisesti affiniteettikroma-15 tografialla käyttäen yllä kuvattua pylväskantajaa, joka sisältää tällaista lektiinia. Tämä lektiinireseptori sisältää glykoproteiineja, glykolipidejä ja/tai sakkarideja, joista jokaisessa on pääteasemassa oleva galaktoosi ja/tai N-asetyyligalaktosamiini, ja se voidaan tarvit-20 taessa lyofilisoida tai puhdistaa edelleen tavanomaisin erotuskeinoin. On esimerkiksi menetelmä, jossa erotetaan N-asetyyligalaktosamiinia sitomaan pystyvän lektiinin avulla lektiinireseptori, joka on erotettu galaktoosia sitomaan pystyvän lektiinin avulla, tai menetelmä, jossa 25 erotetaan galaktoosia sitomaan pystyvän lektiinin avulla lektiinireseptori, joka on erotettu N-asetyyliglukosamii-nia sitomaan pystyvän lektiinin avulla.

Edelleen GRA-vasta-aineesta on ensi kertaa todettu, että yllä kuvattua vasta-ainetta on läsnä syöpäpoti-30 laiden kehonesteissä autovasta-aineena. Tämä vasta-aine on varmistettu (mitattu) seuraavassa kuvatulla menetelmällä ja se on otettu talteen vasta-ainepositiivisista potilaista kuten edellä on kuvattu.

Yllä kuvattu GRA-vasta-aine voidaan määrittää.

35 Määritysmenetelmä on käyttökelpoinen syövän diagnosoinnissa, lääkehoidon sietokyvyssä ja arvioitaessa ennustetta.

10 8071 1

Edellä kuvattu määritysmenetelmä voidaan toteuttaa havaitsemalla vasta-aine, joka voi kiinnittyä lektiinire-septorin suhteen positiivisiin syöpäsoluihin, epäsuoralla rosettimenetelmällä käyttäen lektiinireseptorin suhteen 5 positiivisia syöpäsoluja, edullisesti samoja syöpäsoluja, joissa ei esiinny merkittävää histokompoatibiliteetti-kompleksia (MHC). Tarkemmin sanoen yllä kuvatut syöpäsolut suspendoidaan väliaineeseen, jota käytetään tavanomaiseen solujen viljelyyn, kuten RPMI-1640-väliaineeseen 10 jne, niin että saadaan sopiva pitoisuus, yleensä 3 x 106 solua/ml väliainetta, ja muodostuvaan solususpensioon lisätään syöpäpotilaan seerumia ja reaktion annetaan tapahtua 4-37eC:ssa 30 minuutista 4 tuntiin. Kun syöpäsolut on pesty riittävän hyvin yllä kuvatulla väliaineella, lisä-15 tään veren punasoluja kuten härän veren punasoluja (ORBC) jne, polystyreenialustaan tai lateksiin sidottua proteiini Asta tai polystyreenialustaan tai lateksiin sidottua immunoglobuliinivasta-ainetta, joka ei ole ihmisestä, ja annetaan reagoida 4-37°C:ssa muutamista minuuteista 30 20 minuuttiin lingoten (noin 1000 kierrosta minuutissa). Solut kiinnitetään ja värjätään tavanomaiseen tapaan ja rosette ja muodostaneet solut tutkitaan havainnoimalla visuaalisesti, millä menettelyllä voidaan varmistaa GRA-vasta-aineen esiintyminen potilaan seerumissa. Nimittäin 25 käytettäessä GRA-vasta-aineen suhteen positiivisten potilaiden seerumia havaitaan syöpäsoluissa rosettien muodostusta ja muodostumisnopeus arvostellaan GRA-vasta-ainear-vona.

Yllä kuvatussa menetelmässä A-GRA:n valmistamisek-30 si käytetty GRA-vasta-aine on edullisesti vasta-aine, joka on otettu talteen suuren vasta-ainearvon omaavan potilaan seerumista.

Muodostuva GRA, joka koostuu A-GRA:sta ja/tai lek-tiinireseptorista, denaturoidaan termisesti olosuhteissa, 35 jotka ovat tavanomaiset proteiinien denaturoinnissa. De-naturointi toteutetaan esimerkiksi kuumentamalla GRA:ta liuottimessa kuten vedessä, fysiologisessa suolaliuokses- il 8071 1 sa tai fosforihappopuskuriliuoksessa noin 60-120°C:ssa, edullisesti noin 90-110°C:ssa 5-60 minuuttia, edullisesti 10-20 minuuttia.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettu termisesti 5 denaturoitu GRA on glykoproteiini, joka koostuu sakkari-dista, jossa on pääterakenteena galaktoosi ja/tai N-ase-tyyligalaktosamiini, ja termisesti denaturoidusta proteiinista.

Kun lymfosyytit herkistetään A-GRA:lla tai termi-10 sesti denaturoidulla GRA:11a, muodostuu tappajasoluja.

Tässä käytetyt lymfosyytit eivät ole erityisesti rajattuja ja voidaan käyttää mitä tahansa normaalien tai syöpää sairastavien ihmisten tai eläinten lymfosyyttejä. Esimerkkejä näistä ovat lymfosyytit, jotka ovat peräisin 15 ääreisverenkierrosta, luuytimestä, imusolmukkeista, per nasta, kitarisoista ja kateenkorvarauhasesta jne. Nämä lymfosyytit voidaan eristää esimerkiksi fysikaalisella tai kemiallisella menetelmällä tai pintamembraanimenetel-mällä Ja niitä voidaan käyttää menetelmässä tappajasolu-20 jen tuottamiseksi.

Lymfosyyttien herkistys A-GRA:lla voidaan toteuttaa viljelemällä lymfosyyttejä väliaineessa, joka sisältää A-GRA:ta, 1-3 vuorokautta, edullisesti 2 vuorokautta.

Lymfosyyttien herkistys termisesti denaturoidulla 25 GRAtlla voidaan samoin toteuttaa inkuboimalla niitä useista tunneista 10 vuorokauteen, edullisesti 1-5 vuorokautta.

Väliaineena voidaan käyttää erilaisia tämän tyyppisten solujen inkuboinnissa tavanomaisesti käytettyjä 30 väliaineita, mutta on edullista käyttää esimerkiksi RPMI-1640-väliainetta ja Eagle MEM-väliainetta, johon lisätään ihmisseerumia, sikiöasteisen vasikan seerumia (FCS), vasikan seerumia tai hevosen seerumia jne. Väliaineeseen lisättävää A-GRA:ta tai termisesti denaturoitua GRA:ta on 35 edullisesti määrä 0,1-1000 ng/ml, edullisesti 1-500 ng/ml proteiinina, joka perustuu pitoisuuteen 1 x 106 lymfo- 12 8071 1 syyttiä/ml, käytettäessä A-GRA:ta; ja 1-2000 ng/ml, edullisesti 50-500 ng/ml sakkaridina käytettäessä termisesti denaturoitua GRA:ta.

Inkubointi suoritetaan esimerkiksi 37°C:n lämpöti-5 lassa ja pH:ssa 7,2 tai näillä main, tavanomaisen menetelmän mukaisesti.

Näin saatujen tappajasolujen määrä voidaan moninkertaistaa ilman mitään rajoituksia yllä kuvatussa väliaineessa, joka sisältää T-solun kasvutekijän (TCGF IL-2). 10 Tässä tapauksessa tappajasolujen kloonaukselle selektiivinen inkubointi voidaan suorittaa tavanomaisella rajoittavalla laimennusmenetelmällä. Tappajasolut voidaan säilyttää stabiilisti pitkä ajanjakso, jos ne säilytetään esimerkiksi nestetypessä.

15 Muodostuvat tappajasolut ovat olennaisesti normaa leja lymfosyyttejä, joille on ominaista GRA-spesifinen sytotoksisuus. Näitä tappajasoluja pidetään tilassa, josta ne ovat hakijan saatavissa.

Edellä kuvatulla tavalla saatu tässä kuvattu A-GRA 20 ja termisesti denaturoitu GRA ovat käyttökelpoisia syövän vastaisena lääkkeenä. A-GRA:ta ja termisesti denaturoitua GRA:ta voidaan käyttää yksinään aktiivisena aineosana. Niitä voidaan käyttää yhdessä muiden antimikrobisten aineiden ja/tai syövänvastaisten aineiden kanssa. Tässä ku-25 vattua A-GRA:ta tai termisesti denaturoitua GRA:ta aktiivisena aineosana sisältävä syövänvastainen lääke voi olla missä muodossa tahansa, jos se on tilassa, jossa se sisältää tehokkaan määrän A-GRA:ta tai termisesti denaturoitua GRA:ta pääasiallisena aktiivisena aineosanaan. Se 30 annetaan kuitenkin yleensä ruiskeena laskimoon, ruiskeena ihon alle tai ruiskeena lihakseen liuoksena, suspensiona tai emulsiona jne. Se voi olla kuivattuna aineena, josta valmistetaan nestemäinen tuote lisäämällä sopivaa kanto-ainetta ennen käyttöä. Tällaiset nestemäiset aineet voi-35 vat sisältää suspendointiaineita kuten metyyliselluloo-saa, emulgaattoreita kuten lesitiiniä, antiseptejä kuten 13 8071 1 metyyli-p-hydroksibentsoaattia ja stabilisaattoreita tai puskureita, joilla ei ole vastakkaista vaikutusta ihmisten ja eläinten immuunireaktioon, jne. On mahdollista käyttää fysiologista suolaliuosta vesipitoisena väliai-5 neena ja kasvisöljyjä kuten seesamiöljyä jne, mineraali-öljyjä kuten parafiilia jne, kasvis- ja eläinöljyjä kuten skvaleenia jne ja propyleeniglykolia jne vedettömänä väliaineena. Edelleen tällaiset nestemäiset aineet voivat sisältää sopivia adjuvantteja immuuniteetin parantamisek-10 si. Tällaisia ovat esimerkiksi Freundin complete adjuvant, saponiini eläimille ja alumiinihydroksidi ihmisille jne.

Yllä kuvattua syövänvastaista lääkettä voidaan antaa syöpäpotilaille yhden kerran tai useita kertoja pit-15 kän ajanjakson kuluessa sairauden parantamiseksi ja sitä voidaan antaa henkilöille, jotka ovat vaarassa saada syöpä, syövän kehittymisen estämiseksi.

Koska sekä A-GRA:lla että termisesti denaturoidulla GRA:lla on alhainen toksisuus niin että LDS0 (annet-20 tuna intraperitoneaalisesti hiirelle) on 500 mg/kg tai tätä suurempi sakkaridina mitattuna, niitä voidaan antaa laajalla annosalueella. Tämän mukaisesti A-GRA:n tai termisesti denaturoidun GRA:n määrä syövänvastaisessa lääkkeessä ei ole erityisen rajattu, mutta se on yleensä 25 edullisesti alueella 0,001-100 pg/ml mitattuna sakkaridina. Annettava määrä riippuu sairaustilasta, iästä ja sukupuolesta, mutta on suositeltavaa antaa sitä yhdestä kerrasta useihin kertoihin määränä 0,001-1000 pg/kg/vuo-rokausi.

30 Lisäksi ovat myös yllä kuvatulla tavalla saadut tappajasolut käyttökelpoisia syövänvastaisinä lääkkeinä. Tällaista syöpälääkettä käytetään edullisesti ruiskeval-misteena yhdessä tämän tyyppisissä verilääkkeissä käytetyn kantoaineen kanssa. Vaikka kantoainetta ei ole eri-35 tyisesti rajoitettu, on edullista käyttää kantoaineita, joiden toksisuus on sama kuin veren, edullisesti fysiolo- 14 8071 1 gista suolaliuosta. Valmistettaessa lääkettä on edullista, että sen jälkeen kun tappajasoluja on pesty fysiologisella suolaliuoksella riittävästi yllä kuvatun väliaineen poistamiseksi, ne suspendoidaan kantoaineeseen.

5 Tappajasolujen pitoisuutta yllä kuvatussa lääk keessä ei ole erityisesti rajoitettu, mutta se on yleensä edullisesti alueella 105-109 solua/ml. Edelleen tappajasoluilla ei ole havaittu myrkyllisyyttä, kun niitä on annettu määränä 108 solua/hiiri (intraperitoneaalisesti).

10 Annos riippuu sairaustilasta, iästä ja sukupuolesta, mutta on suositeltavaa antaa lääkettä yhdestä kerrasta useihin kertoihin määrinä 105-1012 solua/kg/vuorokausi. Seu-raavassa tätä keksintöä havainnollistetaan esimerkein, perusesimerkein, koe-esimerkein ja vertailuesimerkein.

15 Perusesimerkki 1 (GRA:n paikallistuminen) 1) FITC-merkityn lektiinin valmistus (PNA-FITC): 10 mg maapähkinälektiiniä (PNA, valmistaja EY Co.) liuotettiin 2 ml:aan 0,01M fosfaattipuskuriliuosta (pH * 20 7,2), joka sisälsi 0,85 % NaCl. 2 mg FITC (valmistaja

Sigma Co.) liuotettiin 1 ml:aan 0,5M bikarbonaattipusku-riliuosta (pH 9,0) ja 0,5 ml muodostunutta liuosta lisättiin edellä kuvattuun puskuriliuokseen, joka sisälsi PNA:ta. Kun oli sekoitettu huoneen lämmössä 2 tunnin 25 ajan, suoritettiin erotus käyttäen Sephadea^ G25 (10 mm x 300 mm, valmistaja Pharmacia Co.) ottaen talteen ensimmäinen huippu. Suhde F/P = 1,0.

2) FITC-merkityn lektiinin valmistus (DBA-FITC): DBA-FITC saatiin käyttäen DBA (valmistaja EY Co.) 30 samalla tavoin kuin edellä kohdassa (1). Suhde F/P = 0,9.

3) GRA:n paikallistuminen erilaisissa syöpäsoluissa:

Sen jälkeen kun 1 x 106 solua eri tyyppisiä syöpäsoluja oli pesty kolmesti 0,05M tris-suolahappopuskuri-35 liuoksella (pH « 7,2), joka sisälsi 0,85 % NaCl, linkous-menetelmällä, yllä kohdassa (1) saatua PNA-FITC tai yllä is 8071 1 kohdassa (2) saatua DBA-FITC tai SBA-FITC (valmistaja EY Co.) (200 yug/ml) lisättiin siihen määrä 100 ^ul ja saadun seoksen annettiin seistä huoneen lämmössä 30 minuuttia, jotta reaktio voi tapahtua. Kun reaktio oli päätty-5 nyt, solut pestiin kolmesti 0,01M fosfaattipuskuriliuok-sella (pH = 7,2), joka sisälsi 0,35 % NaCl. Solut pantiin objektilasille ja tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla.

Saadut tulokset on esitetty taulukossa 1. Syöpä-solulajit olivat kaikki tunnettuja ja ne olivat saatavis-10 sa laitoksesta First Pathology Section, Medical Department, Niigata University.

Taulukko 1

Syöpäsolulaji GRA-positiivisuus (%)

15 DBA-FITC

PNA-FITC (SBA-FITC) _____ - - ... -------------- I ✓

Raji (Burkitt lymphoma) 98,3 1,4

Daudi (Burkitt lymphoma) 93,1 5,2 BT-1 (Burkitt lymphoma) 50,1 0 20 P-12 (T-solulymfooma) 44,3 6,7 MOLT (T-soluleukemia) 0,4 4,8

Fujimaki (B-solulymfooma) 19,1 5,3

Oda (IgD-myelooma) 0,6 10,0 QG-56 (keuhkosyöpä sq.) 70,4 2,0 25 PC-1 (keuhkosyöpä, sq) 78,4 0,4 PC-3 (keuhkosyöpä, adeno) 77,1 0 QG-90 (keuhkosyöpä, pienisoluinen) 68,0 0 PC-13 (keuhkosyöpä, isosoluinen) 17,0 0 MK-2 (mahasyöpä, por) 63,7 0,1 30 KATO-III (mahasyöpä, sig) 57,3 0 MKN-45 (mahasyöpä, por) 1,0 40,3 MKN-1 (mahasyöpä, adsq) 4,6 0,4 MKN-28 (mahasyöpä, tubi) 0,4 0,1 MKN-74 (mahasyöpä, tubi) 0,5 0 35 MGH-U1 (virtsarakon syöpä) 37,4 0 KU-2 (virtsarakon syöpä ca) 4,5 21,4 ie 80711

Syöpäsolulaj i PNA-FITC DBA-FITC

_(SBA-FITC) T-24 (virtsarakon syöpä, ca) 14,5 0 NBT-2 (virtsarakon syöpä ca) 13,1 1,0 ^ NRC-12 (munuaissyöpä) 23,9 0 KU-1 (munuaissyöpä) 3,3 0,6

Kuramochi (munasarjasyöpä) 80,0 0 NB-1 (neuroblastoma) 50,9 1,7 YT-nu (neurohlastoma) 3,6 0,5 TGW-nu-I (neuroblastoma) 4,1 0 TGW-nu-II (neuroblastoma) 2,0 1,0 GOTO (neuroblastoma) 0f5 0 ITO (embryokarsinooma) 96,9 12,3 NEC-8 (embryokarsinooma) 44,6 0 ,ς SCH (kriokarsinooma, maha- 14,6 3,1 laukku) GCH (kriokarsinooma, kohtu) 5,4 0 YN-1 (rhabdomyosarcoma) 5,7 1,7 X5563 (hiiren myelooma) 92,0 0 (90,6) 2Q MH134 (hiiren askiitti maksasyöpä) 18,6 0 (6,4) ‘ 4) GRA:n paikallistuminen erilaisissa syöpäsoluis sa (leikkausnäyte):

Syöpäkudos, joka oli saatu syöpäpotilaan leikkaus-25 näytteestä, ajettiin ruostumatonta terästä olevan seulan läpi 150) solususpension saamiseksi. Se pestiin kahdesti 0,01M tris-suolahappopuskuriliuoksella (pH = 7,4), joka sisälsi 2 mM CaCl-, 2 mM MgCl ja 0,85 % NaCl.

5 z 5 x 10 solua suspendoitiin 100 ^ulraan yllä kuvattua pus-30 kuriliuosta ja 100 ^ul PNA-FITC tai DBA-FITC (200 ^ug/ml) lisättiin siihen ja sen jälkeen inkuboitiin huoneen lämmössä 20 minuuttia. Kun reaktio oli päättynyt, solut pestiin kolmesti 0,01M fosfaattipuskuriliuoksella (pH = 7,2), joka sisälsi 0,85 % NaCl (kutsuttu tästä lähtien nimellä 35 "PBS") . Sen jälkeen ne siirrettiin ojbektilasille ja tutkit- 17 8071 1 tiin fluoresenssimikroskoopilla. Tulokset on esitetty taulukossa 2. Syöpäpotilaiden leikkausnäytteet olivat saatavissa Kansei Medical Collegesta. Taulukossa 2 on esitetty GRA:n paikallistuminen seuraavasti.

5 +: GRA esiintyy solujen pinnalla -: GRA:ta ei esiinny solujen pinnalla.

Taulgjdj^o^

Syöpäkudoslaji GRA:n paikallistuminen

10 _PNA-FITC DBA-FITC

Mahalaukun syöpä + + " + +

Il e " + 15 " + + " +

Mastocarcinoma + " + " + 20 " + +

Paksusuolen syöpä + + " - +

Ruokatorven syöpä +

Maksasyöpä - + 25

Perusesimerkki 2 Lektiinireseptorin valmistus 1) Liukenemattoman lektiinin valmistus (PNA-Sepha- rose®) : 30 Kun 3 g CNBr-aktivoitua Sepharose® 4B (valmistaja

Pharmacia Co) oli pesty riittävästi 1 mM HCl:lla, se sus-pendoitiin 200 ml:aan Q,1M natriumbikarbonaattia (pH = 8,5). Siihen lisättiin 5 ml 0,01M fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7,7), joka sisälsi 20 mg PNA, ja reaktion annet-35 tiin tapahtua 25°C:ssa 2 tuntia sekoittaen silloin tällöin, jolloin saatiin PNA-Sepharose® .

18 8071 1 2) DBA-Sepharose® saatiin samoin toimenpitein kuin kohdassa (1) yllä, paitsi että PNA:n sijasta käytettiin DBA:ta.

O

3) 1,3 x 10 BT-l-solua (Burkittin lymfooma) 5 pestiin kolmesti fysiologisella suolaliuoksella ja lisättiin 30 ml 0,0111 tris-suolahappopuskuriliuosta (pH = 7,4), joka sisälsi 2 % Triton X-100® (valmistaja Wako Pure Chemical Industries, Ltd), 0,85 % NaCl, 2 mM CaC^ ja 2 mM MgC^. Muodostunutta seosta sekoitettiin 10 4°C:ssa 15 minuuttia. Sen jälkeen se ultrasentrifugoitiin voimalla 100 000 x g kahden tunnin ajan. Ultralinkousemä-liuoksen 28 mlrsta 14 ml:n erälle suoritettiin affiniteet-tikromatografia (halkaisija: 0,5 cm; pituus: 1 cm) käyttäen PNA-Agarose beads (valmistaja Maruzen Co), joka oli 15 tasapainotettu tris-suolahappopuskuriliuoksella (pH = 7,4), joka sisälsi 0,1 % Triton X-100®, 0,85 % NaCl, 2mM CaC^ ja 2 mM MgC^· Kun oli pesty yllä kuvatulla puskuriliuoksella, eluoitiin 0,01M tris-suolaha-popuskuriliuok-sella (pH = 7,4), joka sisälsi Q,lM laktoosia, 0,5 % - 20 NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 ja 0,1 % Triton X-100®, ja », eluoitunutta osaa dialysoitiin 0,01M tris-suolahappopus-

: kuriliuosta vastaan, joka liuos sisälsi 0,85 % NaCl, 2 mM

* MgCl2 ja 2 mM CaC^ 48 tuntia, jolloin saatiin 17 ml lek- : tiinireseptoriliuosta. Mitattaessa sen proteiinimäärä 25 Folin-Lowry-menetelmällä ja sakkaridimäärä fenolisulfaat-timenetelmällä saatiin tulokseksi, että proteiinimäärä oli 644 yug ja sakkaridimäärä 120 ^ug. Tästä lähtien sitä kutsutaan nimellä "reseptori 1".

4) 1 x 1010 solua C^H-hiiren mastokarsinoomasta ; 30 (MMT) pestiin kolmesti fysiologisella suolaliuoksella.

' * Sitten lisättiin 30 ml 0,01M tris-suolahappopuskuriliuos- ta (pH = 7,4), joka sisälsi 2 % Triton X-100®, 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 ja 2 mM MgC^/ ja seosta sekoitettiin 4°C:ssa V 30 minuuttia. Sen jälkeen sitä ultralingottiin voimalla « * -·’ 35 100 000 x g 2 tuntia, ja saatua emäliuosta dialysoitiin < » 19 8071 1 yli yön Ο,ΟΙΜ tris-suolahappopuskuriliuosta vastaan (pH = 7,4), joka liuos sisälsi 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 ja 2 mM MgCl2- Saatu dialysaatti väkevöitiin 3 ml:ksi käyttäen Immersible-CX-ultrasuotimia (val-5 mistaja Millipore Co) ja 1 ml:lie sitä suoritettiin affiniteettikromatografia PNA-Sepharosella®, joka oli tasapainotettu tris-suolahappopuskuriliuoksella (pH = 7,4), joka sisälsi 0,005 % Triton X-100®, 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 ja 2 mM MgCl2 (halkaisija: 0,5 cm; pituus: 2 cm). Kun oli 10 pesty riittävästi samalla puskuriliuoksella, eluoitiin 0,01M tris-suolahappopuskuriliuoksella (pH = 7,4), joka sisälsi 0,1M laktoosia, 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 2 mM MgCl2 ja 0,005 % Triton X-100®, ja eluoitunutta osaa di-alysoitiin 48 tuntia käyttäen 0,01M tris-suolahappopusku-15 riliuosta (pH = 7,4), joka sisälsi 0,85 % NaCl, 2 mM CaCl2 ja 2 mM MgCl2, jolloin saatiin 2 ml lektiinireseptori-liuosta. Sen proteiinimäärä oli 156 ^,ug ja sen sakkaridi-määrä oli 94 ^ug. Tästä lähtien sitä kutsutaan nimellä "reseptori M-l".

20 5) Noin 120 g (märkäpaino) KATO-III-soluja homo genoitiin 100 ml:aan PBS:ää myllyn avulla (Waring blender: valmistaja Nippon Seiki Co, Ltd). Linkoamalla (100 000 g x 1 tunti) erotettu sakka lisättiin sekoittaen 100 ml:aan 0,01M tris-suolahappopuskuriliuosta (pH = 7,6), joka si-25 sälsi 2 % Triton X-100 ja 0,15 M NaCl. Linkoamiserotuk-sessa (100 000 g x 1 tunti) saatu emäliemi alistettiin affiniteettikromatografiaan (halkaisija: 0,8 cm; pituus 15 cm) käyttäen PNA-Sepharosea®, joka oli tasapainotettu 0,01M tris-suolahappopuskuriliuoksella (pH = 7,6) , joka 30 sisälsi 0,015 % Triton X-100® ja 0,15M NaCl. Kun oli pesty 50 ml :11a samaa puskuriliuosta, eluoitiin samalla puskuriliuoksella, joka sisälsi Q,1M laktoosia, ja eluoitunutta tuotetta dialysoitiin 0,85-prosenttista NaClrn vesi-liuosta vastaan lektiinireseptoriliuoksen saamiseksi. Se 35 väkevöitiin Sephadexilla® (valmistaja Pharmacia Co) ja 20 8071 1 säilytettiin -2Q°C:ssa. Proteiinimäärä: 2,0 mg. Sakka-ridimäärä: 0,8 mg. Tästä lähtien sitä kutsutaan nimellä "reseptori 2".

6) Taulukossa 3 esitetyt lektiinireseptorit saatiin 5 samalla tavalla kuin edellä kohdassa (5) vastaavasti.

Taulukko 3

Reseptori Raaka-aine Proteiini- Sakkaridi- määrä (mg) määrä (mg) 1 BT-1, 33 g ÖTi 0,09 4 Mastocarcinoma (leikkausnäyte) 5 g 0,24 0,5 5 QG-56, 24 g 0,6 0,38 6 QG-90, 26 g 1,0 0,54 7 Raji, 29 g 0,78 0,45 15 M-2 MMT, 200 g 11,3 28,4 M-3 Lewis-keuhkosyöpä (LLC), 14,4 g 0,06 0,07 M-4 Askiittimaksasyöpä (MH134), 85 g 0,65 0,35 M-5 Myeloma (X5563) , 25 g 0,56 0,23 ; 20 7) Lektiinireseptori saatiin samalla menettelyllä kuin edellä kohdassa (5) paitsi että KATO-III:n sijasta käytettiin 29 g MKN-45, PNA-Sepharose®-pylvään sijasta käytettiin DBA-Sepharose®-pylvästä ja eluointi suoritet- 25 tiin N-asetyyligalaktosamiinilla laktoosin sijasta. Proteiinimäärä: 0,03 mg. Sakkaridimäärä: 0,01 mg. Tästä lähtien sitä kutsutaan nimellä "reseptori 8”.

8) 5 ml edellä kohdassa (6) saatua reseptori 3:a *: käsiteltiin DGA-Sepharose®-pylväässä ja eluointi suoritet- 30 tiin 0,01M tris-suolahappopuskuriliuoksella, joka sisälsi 0,015 % Triton x-100®, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 ja 0,85 %

NaCl kulloinkin 4 ml:n fraktioiden saamiseksi. Sitten suoritettiin eluointi yllä kuvatulla puskuriliuoksella, joka sisälsi 0,1 M N-asetyyligalaktosamiinia, jolloin saatiin 35 leksiinireseptori. Tästä lähtien sitä kutsutaan nimellä 2i 8071 1 "reseptori 3-C". Edelleen yllä kuvattuja fraktioita nro l:stä nro 3reen kutsutaan nimellä "reseptori 3-A" ja fraktioita nro 4-12 kutsutaan nimellä "reseptori 3-B".

9) Kullekin yllä kuvatulla tavalla saadulle lek-5 tiinireseptorille suoritettiin SDS-geelielektroforeesi menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Fairbanks et a].. (Biochemistry, Voi. 10, s. 2606 (1971)). Tulokset on esitetty kuvioissa 1-5. Kuvioissa kukin numero tarkoittaa seuraavaa:

Kuvio 1 ja 2 10 1 = standardi 2 = reseptori M-3 3 = reseptori 7 4 = reseptori 1 5 = reseptori 2 15 Kuvio 3 1 - standardi 2 = reseptori M-2 3 = reseptori 6 4 = reseptori 5 20 Kuvio 4 1 = reseptori M-4 2 = reseptori M-5 3 = standardi

Kuvio 5 25 1 = reseptori 3

2 = reseptori 3-A

3 = reseptori 3-B

4 = reseptori 3-C

Edelleen kuviot 1 ja 5 ovat piirroksia, jotka 30 esittävät elektroforeesidiagrammia, joka on saatu esiin proteiinin värjäysreaktiolla CBB-menetelmän avulla (Biochemistry, Voi. 10, s. 2606 (1971)) ja kuviot 2-4 esittävät elektroforeesidiagrammeja, jotka on saatu sakkaridin värjäysreaktiolla Pas-menetelmän avulla (Anal.Biochem., 35 Voi. 30, 148 (1962)).

22 8071 1

Kussakin, jossa käytettiin standardina seuraa-via standardimateriaaleja, joiden valmistaja on Biorad Lab. Co. (USA) .

200 (k daltonia): Myosiini 5 116 ( " ): Glukosidaasi 925 ( " ): Posforylaasi

662 ( " ): BSA

45 ( " ): Ovalbumiini 215 ( " ): Soijapavun trypsiini-inhibiittori 10 Lisäksi on kuvioita 1-4 vastaavat valokuvat esi tetty kuvioina 1A-4A.

Perusesimerkki 3 (ORBC-proteiini A) ORBC pestiin kolmesti linkoamismenetelmällä 15 (2000 kierrosta minuutissa, 10 minuuttia) 0,01M fos- faattiliuoksella (pH = 7,2), joka sisälsi 0,85 % NaCl, g jolloin saatiin 5 x 10 solua saostamalla. Näihin lisättiin 1 mg/ml fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 0,45 ml Proteiini A:ta (Pharmacia Co) ja 1 mg/ml fysiologis-20 ta suolaliuosta, joka sisälsi 0,05 ml CrCl2*6H20 ja seos-; ta sekoitettiin huoneen lämmössä 10 minuuttia. Kun solut : oli pesty kahdesti tai kolmesti RPMI-1640-väliaineella, 8 ne suspendoitiin 25 ml:aan samaa väliainetta (2 x 10 i Ö solua/ml) ja säilytettiin 4 C:ssa.

' 25 Perusesimerkki 4 (GRA-vasta-aineen määrittäminen)

Sen jälkeen kun syöpäsolua, Daudi, oli inkuboitu, se pestiin kahdesti linkoamalla (1000 kierrosta minuutissa, 10 minuuttia) väliaineella RPMI-1640, näyte valmis-30 tettiin niin, että se sisälsi 3 x 10^ solua/ml samaa väli-: ainetta. 100 yUl siitä pantiin koeputkeen ja siihen li- [ sättiin 100 ^ul syöpäpotilaan seerumia ja reaktion annet tiin tapahtua 4°C:ssa 1 tunti. Kun solut oli pesty kahdesti samalla väliaineella, lisättiin sakkaan 100 yul pe-35 rusesimerkissä 3 saatua ORBC-proteiini A:ta. Sekoittamisen 23 8071 1 jälkeen lingottiin nopeudella 1000 kierr/min viiden minuutin ajan. Sen jälkeen sekoitettiin kevyesti ja kiinnitettiin ja värjättiin glutaarialdehydillä ja Coomassie Brilliant Bluella (CBB). Sitten mitattiin ORBC-proteii-5 ni A:n rosettien muodostus inkuboiduille soluille. Tulokset on esitetty taulukossa 4.

Taulukko 4 Näyte nro Syöpä Rosettien muodostus 10__[11_ 1 Ruokatorven syöpä 76 2 Mastocarcinoma 28 3 " 10 4 " 1 15 5 " 10 6 " 90 7 " 85 8 Peräsuolen syöpä 50 9 " 15 20 10 " 97 11 Mahalaukku 65 12 " 45 13 " 45 14 " 20 25 15 " 5 16 " 35 17 Paksusuolen syöpä 20

Normaalisolut (10 miestä) 0

Perusesimerkki 5 30 Rosettien muodostus mitattiin samalla tavalla kuin perusesimerkissä 4 paitsi että Daudi'n sijasta käytettiin erilaisia syöpäsoluja,joista kullakin oli erilainen kyky kiinnittyä lektiiniin. Potilaan seerumina käytettiin taulukon 4 numeron 11 seerumia. Tulokset on 35 esitetty kuviossa 6. Tästä on ymmärrettävissä, että vasta-aine reagoi voimakkaasti ΡΝΔ-reseptorien kanssa.

24 8071 1

Perusesimerkki 6

Perusesimerkissä 2 saatua reseptoria 1 annettiin määrä, joka proteiinina oli 5 yUg, yhdessä Freun-din complete adjuvantin kanssa ihonalaisesti kaniinille 5 (2,3 kg) kerran joka toinen viikko eläimen immunisoimi- seksi. Kun eläin oli immunisoitu kolmesti, veri otettiin talteen ja seerumi erotettiin linkoamalla GRA-vasta-aineen (vasta-aine-I) saamiseksi.

Perusesimerkki 7 10 1) Potilaasta nro 10 otettiin verta, jossa esiin tyi suuri rosettien muodostus perusesimerkissä 4, ja antiseerumi otettiin talteen linkoamalla GRA-vasta-aineen saamiseksi (vasta-aine-II).

2) 9 m3:aan edellä kohdassa (1) saatua vasta-aine-15 II:ta lisättiin tipoittain 6 ml kyllästettyä ammoniumsul-faattiliuosta. Kun seosta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 1 tunti, sille suoritettiin linkouserotus (3000 kierrosta minuutissa, 30 minuuttia), jolloin saatiin : sakka. Kun sakka oli liuotettu 6 ml saan PBS, sitä dialy- 20 soitiin 5 litralla PBS 4°C:ssa 24 tuntia, jolloin saatiin GRA-vasta-aine (vasta-aine-III), joka sisälsi 12 mg proteiinia/ml.

I Perusesimerkki 8 (GRA-vasta-aineen reaktiivisuus) 25 a) Käyttäen edellä perusesimerkissä 2 saatua re septori 2:ta antigeeninä tutkittiin sen reaktiivisuutta perusesimerkissä 7 saadun GRA-vasta-aineen (vasta-aine-II) kanssa immuno-elektroforeesimenetelmällä. Tällöin 15 /Ui antigeeniä (160 ^ug proteiinia/ml) pantiin 1-prosentti-30 sen Agarose-levyn reikään elektroforeesin suorittamiseksi ' ‘ 70 V:n jännitteellä 60 minuutin ajan. 200 ^ul vasta-aine- II: ta pantiin uraan ja annettiin reagoida huoneen lämpö-*] tilassa ja huoneen kosteudessa 24 tuntia. Tulos oli, ku- : : ten kuvassa 7 on esitetty, jolloin havaittiin sedimentaa- 35 tiolinja. Kuvassa 7 numero 1 on reikä ja numero 2 on ura.

25 8071 1 b) Tutkittiin saman antigeenin reaktiivisuutta kuin kohdassa (a) vasta-aineen kanssa saostusmenetel-mällä käyttäen kapillaaria (katso "Hyojun Rinsho Kensaho" Igakushoin, 2nd edition, s- 342-345 (1967)). Tällöin re- 5 septori 2:ta pantiin kapillaariin ja sen päälle lisättiin vasta-aine-II:ta. Niiden annettiin seistä huoneen lämmössä 24 tuntia. Tuloksena havaittiin sakka antigeenin ja vasta-aineen välisellä rajapinnalla. Kun vasta-aineen sijasta käytettiin normaalin henkilön seerumia, 10 sakkaa ei havaittu.

c) Estokoe (PNA) 100 ,ul PNA:n PBS-liuosta, jolla oli sopiva pi- ' 5 toisuus, pantiin koeputkeen, joka sisälsi BI-1 (3 x 10 solua/ml RPMI-1640) inkuboitavaksi 4°C:ssa 20 minuutin 15 ajan. Kun solut oli pesty kahdesti linkoamalla RPMI-1640-väliaineen kanssa (1000 1/min, 10 minuuttia),ne suspendoi-tiin uudelleen 100 ^uljaan yllä kuvattua väliainetta.

Kun suspensioon oli lisätty 100 ^.ul perusesimerkissä 7 saadun vasta-aine-II:n 10-kertaisesti laimennettua PBS-20 liuosta ja inkuboitu 4°C:ssa 1 tunti, se pestiin kolmesti yllä kuvatulla väliaineella. Solut suspendoitiin taas 100 ^,ul:aan yllä kuvattua väliainetta ja suspensioon lisättiin 100 ^,ul ORBC-proteiini A:ta. Sitten mitattiin rosettien muodostus samalla tavalla kuin perusesimer-25 kissa 4. Tulokset on esitetty taulukossa 5, jolloin havaittiin PNA:n sitoutumista estävä vaikutus.

Taulukko 5.

PNA:n pitoisuus (^,ug/ml) 0 250 500 1000 30 Rosettien muodostus (%) 78,5 62,3 42,4 23,3 d) Estokoe (lektiinireseptori) 0,1 mooliin perusesimerkissä 2 saadun reseptori l:n PBS-liuosta, jolla oli sopiva pitoisuus, lisättiin 0,1 ml PBS:llä laimennettua liuosta, joka sisälsi 10 yUg/ 35 ml perusesimerkissä 7 saatua vasta-aine-III:a. Kun reak- 26 8071 1 tion oli annettu tapahtua 37°C:ssa 1 tunti, lisättiin 5 3 x 10 Daudi-solua/0,1 mol RPMI-164Q ja inkuboitiin

O

4 C:ssa 1 tunti. Solut pestiin linkoamalla kolmesti (1000 1/min, 10 minuuttia) RPMI-1640:n kanssa. Saadut 5 solut suspendoitiin taas 100 ^ul:aan yllä kuvattua väliainetta ja rosettien muodostus mitattiin samalla tavalla kuin perusesimerkissä 4. Tulokset olivat taulukossa 6 esitetyt, jolloin havaittiin lektiinireseptorin sitoutumista estävä vaikutus.

10

Taulukko 6

Lektiinireseptorin pitoisuus (yug/ml) 0 2,2 4,4 8,8

Rosettien muodostus (%) 43,5 4,0 1,9 0,2 15 e) Käyttäen perusesimerkissä 2 saatua reseptori l:tä antigeeninä, tutkittiin vasta-aine-I:n reaktiivisuus samalla tavalla kuin yllä kohdassa (a). Tulokset on esitetty kuvassa 8. Kuvassa numero 1 on reikä, 2 on ura ; vasta-aine-I:lie ja 3 on ura normaalin kaniinin seeru- 20 mille. Kuten kuvasta ilmenee, havaittiin sedimentaatiolin-ja vain vasta-aine-I:lie.

f) Rosettien muodostus mitattiin samoin kuin perusesimerkissä 4 paitsi että potilaan seerumin sijasta käy-tettiin 100 ^ul vasta-aine-I:tä, joka oli laimennettu ne- / 25 linkertaisesti PBS:llä. Saadut tulokset on esitetty ku viossa 9.

g) 100 ^ul:aan perusesimerkissä 2 saadun reseptori l:n PBS-liuosta, jonka pitoisuus oli sopiva, lisättiin 100 ,ul PBSrllä 700-kertaisesti laimennettua vasta-aine-I-

/ Q

30 liuosta. Kun reaktion oli annettu tapahtua 37 C:ssa 90 mi-. . nuuttia, lisättiin 3 x 1Q~* Daudi-solua/0,1 ml RPMI-164Q- väliainetta ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 60 mi-nuuttia. Solut pestiin linkoamalla kolmesti (1000 1/min, 10 minuuttia) väliaineella RPMI-1640. Solut suspendoitiin "**- 35 taas 100 ^ul:aan yllä kuvattua väliainetta ja rosettien 27 8071 1 muodostus mitattiin samalla tavoin kuin perusesimerkissä 4. Tulokset olivat kuvassa 10 esitetyt, jolloin havaittiin lektiinireseptorin sitoutumista estävä vaikutus.

Perusesimerkki 9 5 a) 2 ml:aan perusesimerkissä 7 saatua vasta-aine- III:a lisättiin natriumbikarbonaatin 0,1 M vesiliuosta, joka sisälsi Bromocyan Sepharosea® (Pharmacia Co) 5 g/15 ml ja 0,5M NaCl (pH = 8,3) ja saatua seosta sekoitettiin 2 tuntia, jolloin saatiin liukenematon GRA-vasta-aineen kan-10 ta j a.

b) Liukenematon GRA-vasta-aineen kantaja saatiin samalla tavoin kuin yllä kohdassa (a) käyttäen perusesimerkissä 6 saatua vasta-aine-I:tä.

Esimerkki 1 15 1) Noin 40 g (märkäpaino) KATO-III-soluja homo genoitiin 50 ml:aan PBS myllyn (Waring blender) avulla. Sakka, joka saatiin erottamalla linkoamalla (100 000 g x 1 tunti), lisättiin 50 ml:aan 0,01M tris-suolahappopus-kuriliuosta (pH = 7,6) joka sisälsi 2 % Triton X-100® ja 20 0,5M NaCl, sekoittaen. Emäliuos, joka saatiin erottaen linkoamalla (100 000 x g, 1 tunti) vietiin pylvääseen (halkaisija: 0,8 cm; pituus: 15 cm), joka oli täytetty GRA-vasta-aine-Sepharosei® 11a (Perusesimerkissä 9-(2) saatu kantaja) ja tasapainotettu 0,01M tris-soluhappopuskuri-25 liuoksella (pH = 7,6), joka sisälsi 0,015 % Triton X-10tf® ja 0,15M NaCl. Kun oli pesty samalla puskuriliuoksella, eluoitiin samalla puskuriliuoksella, joka sisälsi 0,1M laktoosia, ja eluoitunut tuote dialysoitiin 0,85-prosent-tisella NaCl:n vesiliuoksella, jolloin saatiin A-GRA:n 30 liuos. Proteiinimäärä: 0,45 mg. Sakkaridimäärä: 0,12 mg. Tästä lähtien sitä kutsutaan nimellä "GRA-1".

2) A-GRA-liuos saatiin samalla menetelmällä kuin kohdassa (1) yllä paitsi että KATO-III-solujen sijasta käytettiin 20 g BT-l-soluja ja GRA-vasta-aine-sepharose- 28 8071 1 pylväänä käytettiin perusesimerkissä 9-(b) saatua kantajaa. Proteiinimäärä: 230 yug. Sakkaridimäärä: 40 /Ug. Tästä lähtien sitä kutsutaan nimellä "GRA-2".

3) Kun pylväs, joka sisälsi 5 ml perusesimer-5 kissä 9-(a) saatua kantajaa, oli pesty 0,01M tris-suola-happopuskuriliuoksella (pesuliuoksen pH:n ollessa 7,6), joka sisälsi 0,015 % Triton X-100®, annettiin perusesimerkissä saadun reseptori 2:n virrata pylvään läpi määränä, joka vastaa 350 ^ug proteiinia, affiniteetti-10 kromatografiän suorittamiseksi. Kun oli pesty pesuliuok-sella, annettiin 30 ml:n laktoosia virrata pylvään läpi. Eluoitunutta fraktiota kutsutaan tästä lähtien nimellä GRA-3 (proteiinimäärä: 164 g). Kun oli pesty uudelleen, eluoitiin käyttäen 0,2M suolahappo-glysiinipuskuriliuos-15 ta (pH = 2,7). Eluoitunutta fraktiota kutsutaan tästä nimellä GRA-4 (proteiinimäärä: 97 ^g).

Jokaisesta yllä kuvatulla tavalla saadusta fraktiosta saadut SDS-elektroforeesijuovat, jotka saatiin ; samalla tavalla kuin perusesimerkeissä 2-9, on esitetty 20 kuvassa 11.

Kuvassa 11 on esitetty C.B.B.-menetelmällä värjätyt juovat, jolloin numeroilla on seuraavat merkitykset.

1 = reseptori 2 2 = GRA-3 25 3 = GRA-4

Esimerkki 2

Fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi proteiinina ilmoitettuna 100 ,ug perusesimerkissä 2 saatua

* O

reseptori M-3:a, kuumennettiin 100 C:ssa 10 minuuttia 30 kiehuvassa vesihauteessa, jolloin saatiin termisesti denaturoitu antigeeni. Tästä lähtien sitä kutsutaan nimellä "GRA-M-3-H. Sen pitoisuudeksi säädettiin 10 ,ug O / proteiinia/ml ja sitä säilytettiin 4 C:ssa.

Esimerkit 3-13 35 Seuraavassa taulukossa esitetyt termisesti denatu roidut GRA:t saatiin samalla tavalla kuin esimerkissä 2 29 8071 1 paitsi että reseptori-M-3:n sijasta käytettiin perusesimerkissä 2 saatuja lektiinireseptoreja ja esimerkissä 1 saatua A-GRA:ta.

5 Taulukko 7

Esimerkki Raaka-aine Kuumennus- min. Termisesti olosuhteet denaturoitu oc antigeeni 3 Reseptori 1 100 20 GRA-l-H-1 4 "1 100 10 GRA-l-H-2

10 5 ” 2 90 20 GRA-2-H

6 " 4 120 5 GRA-4-H

7 "6 100 10 GRA-6-H

8 "8 100 10 GRA-8-H

9 " 3-C 110 10 GRA-3-C-H

15 10 GRA-1 100 10 GRA-l-HA

11 GRA-2 100 10 GRA-2-HA

12 GRA-3 100 10 GRA-3-HA

13 GRA-4 120 5 GRA-4-HA

20 Perusesimerkki 10 (Lymfosyytin valmistus) ].) Ihmisen ääreisveren lymfosyytti (ihmisen PBL) Verinäytteet, joista kukin oli 50 ml ja jotka oli saatu ottamalla talteen hepariinin avulla tervees-25 tä henkilöstä tai eri tyyppisiä syöpiä omaavista potilaista, lingottiin "Ficollpackin" (valmistaja Pharmacia Japan Co) kanssa, jolloin saatiin 5 x 10^ solua ääreisveren lymfosyyttejä.

2) Hiiren pernan lymfosyytti 30 C57BL/6-hiiren (uros, 6 viikkoa) perna irrotettiin ja pestiin kahdesti väliaineella RPMI-164Q. Kun se oli rikottu injektioneulalla, se suodatettiin ruostumatonta terästä olevalla seulalla (nro 100) suurikokoisten palasten poistamiseksi. Kun pois suodatetut solut oli pesty 35 kahdesti yllä kuvatulla väliaineella, ne lingottiin voi- 7 30 8071 1 maila 1200 x g 10 minuutin ajan, jolloin saatiin 4 x 10 pernalymfosyyttejä.

Perusesimerkki 11 1) Perusesimerkissä 10-(2) saadut hiiren pernalym-5 fosyytit laimennettiin väliaineella RPMI-1640, joka si-

C

saisi 15 % FCS, niin että pitoisuudeksi tuli 2 x 10 solua/ml, ja siihen lisättiin esimerkissä 2 saatua GRA-M-3-H, niin että lopulliseksi proteiinipitoisuudeksi tuli 5, 25, 50, JOO, 250, 500 tai 1000 ng/ml. Kun näyt-10 teitä oli inkuboitu 37°C:ssa hiilidioksidi-inkubaattoris-sa 24 tuntia, ne pestiin kahdesti yllä kuvatulla väliaineella tappajasolujen saamiseksi. Nämä säädettiin yllä kuvatulla väliaineella pitoisuuteen 2 x 10° solua/ml.

2) Edellä kohdassa (1) saatujen tappajasolujen 15 sytotoksisuus syöpäsoluihin nähden mitattiin menetelmän

Single Cell Cytotoxic Assay (The Journal of Immunology, Vol. 128, nro 6, s. 2514-2521 (1982)) mukaisesti. Tällöin LLC-soluja käytettiin kohdesoluina. Pesemisen jäl-4 5 . keen 5 x 10 solua näitä ja 2,5 x 10 solua yllä kuvat- 2Q tuja tappajasoluja (E/T = 5) sekoitettiin 0,2 mlraan vä-• liainetta RPMI-1640, joka sisälsi 10 % FCS. Kun seosta oli inkuboitu huoneen lämmössä 5 minuuttia, sitä lingot-- tiin nopeudella 1000 1/min 5 minuuttia ja siihen lisät- tiin 1-prosenttista agarosea, niin että sen loppupitoi-25 suudeksi tuli 0,5 %. Petri-maljaan, johon oli aikaisemmin pantu 1 % agarosea, siirrettiin yllä kuvatut solut ja sekoitettiin kevyesti ja inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunti.

Kun oli lisätty 0,5 ml 0,2-prosenttista Tryptan Blueta, niiden annettiin seistä 10 minuuttia. Sen jälkeen ne pes-30 tiin kahdesti fysiologisella suolaliuoksella. Käänteis-faasi-kontrastimikroskopialla mitattiin niiden kuolleiden kohdesolujen lukumäärä, joihin oli kiinnittynyt tappajasolu (A), ja tappajasolujen sytotoksisuus syöpäsoluihin nähden laskettiin seuraavasta kaavasta.

35 3i 8071 1

Sytotoksisuus (%) = —ft x -

Kohdesolujen kokonaismäärä

Tulokset on esitetty kuvassa 12. Kuvassa 12 ordinaa-5 taita nähdään sytotoksisuus ja abskissalta nähdään tappajasolujen muodostamiseen käytetyn GRA-M-3-H:n pro-teiinimäärä (pitoisuus). Edelleen on vertailuna esitetty tulokset, jotka saatiin määrityksessä käytettäessä lymfosyyttejä, jotka oli saatu samalla menetelmällä kuin 10 kohdassa (1) ilman GRA-M-3-H:ta. Sytotoksisuus vertailu-kokeessa oli 10,7 %.

Kuten kuvasta 12 ilmenee, on tämän keksinnön mukainen termisesti denaturoitu antigeeni tehokas laajalla alueella, koska sen riippuvuus pitoisuudesta on vähäinen 15 soluvälitteisen immuniteetin muodostuksessa (tappajasolu-jen muodostumisessa) ja on ymmärrettävää, että sillä on suuri vaikutus.

Perusesimerkki 12 1) Esimerkissä 2 saatu GRA-M-3-H säädettiin fysio-20 logisella suolaliuoksella pitoisuuteen, jossa proteiinipitoisuus oli 100 ng/ml.Tätä kutsutaan tästä lähtien nimellä "syövänvastainen aine nro 1”.

2) 1 x 10^ LLC-solua, jotka olivat C57BL/6-hiires-tä, injektoitiin C57BL/6-hiireen (Charles liver, uros, 25 5 viikkoa) hännän suoneen. 3 vuorokauden, 6 vuorokauden tai 9 vuorokauden kuluttua injektoinnista annettiin eläimelle yllä kuvattua syövänvastaista ainetta nro 1 määränä 1 ml/hiiri vuorokaudessa kolmen päivän ajan hännän suoneen. 22 vuorokauden kuluttua LLC-solujen injektoinnista keuhko 30 irrotettiin ja keuhkoon siirrostuneen LLC:n läsnäolo tai puuttuminen havaittiin visuaalisesti ja keuhkon paino mitattiin. Verrokkeina käytettiin ryhmää, jolle ei annettu syövänvastaista ainetta, ja normaaleja hiiriä. Tulokset on esitetty taulukossa 8. Taulukko 8 osoittaa, 35 että tämän keksinnön mukaisesti valmistetun termisesti denaturoidun antigeenin antaminen selvästi aiheuttaa kas- 32 8071 1 vaimen hylkimistä tai kasvaimen kasvun vaimenemisen.

Taulukko 8

Laakeanto- Hiiri Keuhkon Siirrännäisen päivä nro paino läsnäolo tai (vrk) (g) tai puuttuminen

Ei annettu 1 0,423 + 2 0,305 + 3 0,215 + 10 4 0,239 + 5 0,571 + 3, 4, 5 1 0,194 2 0,182 3 0,177 15 4 0,359 + 5 0,176 6, 7, 8 1 0,273 2 0,319 + : 3 0,238 : 20 4 0,199 : 5 0,225 + 9, 10, 11 1 0,203 2 0,174 : 3 0,185 25 4 0,200 5 0,192

Normaali 1 0,181 2 0,183 3 0,170 30 4 0,177 5 0,175

Perusesimerkki 13 1) Ääreisveren lymfosyytit, jotka oli saatu sa-35 maila tavalla kuin perusesimerkissä 10-(1) potilaasta, 33 8071 1 jolla oli pienisoluinen keuhkosyöpä (mies, 67 vuotta vanha), laimennettiin väliaineella RPMI-164Q, joka sisälsi 15 % FCS, niin että pitoisuudeksi tuli 2 x 10^ solua/ml ja tähän lisättiin esimerkissä 7 saatua GRA-6-H: 5 ta, niin että lopulliseksi proteiinipitoisuudeksi tuli 100 ng/ml. Kun lymfosyyttejä oli inkuboitu 37°C:ssa hiili-dioksidi-inkubaattorissa 24 tuntia, ne pestiin kahdesti yllä kuvatulla väliaineella tappajasolujen saamiseksi.

Ne laimennettiin yllä kuvatulla väliaineella, niin että g 10 pitoisuudeksi tuli 2 x 10 solua/ml.

2) Yllä kuvattujen tappajasolujen sytotoksisuus syöpäsoluihin nähden tutkittiin käyttäen kohdesoluina QG90, joka oli inkuboitu kanta saman tyyppisestä pienisoluisesta keuhkosyövästä kuin potilaalla oli. Tällöin lb QG90 inkuboitiin 96-reikäisellä tasapohjaisella mikro-levyllä solujen lisäämiseksi niin, että ne muodostivat yksisolukerroksen (monolayer), jota käytettiin kohdesoluina. Soluihin lisättiin 100 yUl yllä kuvattuja tappajasoluja tipoittain hitaasti, ja inkuboitiin 1 tunti.

2Q Kun emäliuos oli poistettu, lisättiin kuiviin soluihin 5 ^ul 5-prosenttista eosiiniliuosta ja annettiin niiden sen jälkeen seistä 3 minuuttia. Värjäämisen jälkeen solut pestiin 5 kertaa väliaineella RPMI-1640, joka sisälsi 10 % FCS. Sitten kuolleiden syöpäsolujen määrä syvennystä 25 kohti määritettiin mikroskooppihavainnoin. Saadut tulokset on esitetty kuvassa 13. Kuvassa 13 ordinaatta ilmoittaa kuolleiden syöpäsolujen lukumäärän. Lisäksi käytettiin vertailuna lymfosyyttejä, jotka oli saatu samalla menetelmällä kuin edellä kohdassa (1) käyttämättä GRA-6-H: 30 ta.

Kuvasta 13 nähdään, että tämän keksinnön mukaisesti valmistetulla denaturoidulla antigeenillä on hyvin suuri tappajasoluja synnyttävä aktiivisuus.

Perusesimerkki 14 35 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetun termisesti de- 34 8071 1 naturoidun antigeenin kykyä aikaansaada soluvälitteistä immuniteettia (muodostaa tappajasoluja) elävässä kehossa tutkittiin käyttäen lajia Macaca fuscata, joka on Homo sapiensia lähimpänä oleva kädellisiäji.

5 Tällöin GRA-6-H:ta annettiin Macaca fuscat.a-lajin apinalle (Nippon Primates Co) ihonsisäisenä antona annoksena 200 ng proteiinia/apina. 3, 6, 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua annosta apinan reisilaskimosta otettiin 5 ml verta käyttäen hepariinilla käsiteltyä ruiskua. Sitten 1Q lymfosyytit erotettiin ominaispainoeron perusteella käyttäen ominaispainoerotusiiuosta SMF (valmistaja JIMRO), ja ne säädettiin väliaineella RPMI-1640 pitoisuuteen g 2 x 10 solua/ml. Sen jälkeen määritettiin lymfosyyttien sytotoksisuus syöpäsoluihin nähden. Tämä aktiivisuuskoe 15 suoritettiin käyttäen kohdesoluja (QG90), jotka oli saa-.; tu samalla tavalla kuin perusesimerkissä 13-(2). Samalla tavalla lisättiin 2QQ ^,ul kutakin lymfosyyttiliuosta ti-poittain. Kun oli inkuboitu 37°C:ssa niiiidioksidi-inku-" baattorissa y0 minuutin ajan, värjättiin eosiinilla ja 20 määritettiin kuolleiden solujen lukumäärä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 9. Taulukossa 9 on kuol-·'.* leiden solujen lukumäärä esitetty keskiarvona + SD syven nystä kortti. Edelleen, kulunut aika: 0 tuntia tarkoittaa vertailuarvoa, jolloin käytettiin lymfosyyttejä, jotka oli 25 otettu juuri ennen GRA-6-H:n antamista.

Taulukko 9

Kulunut aika Kuolleiden solujen luku- Syvennysten lu- (tuntia) määrä kumäärä_ ' 0 0 3 30 3 0 3 6 37,6 + 10,4 6 24 60,5+13,7 b 48 13,0 + 8,8 4 72 15,5 + 4,6 6 35 Taulukosta 9 nähdään, että voimakas soluvälitteinen immu- 35 8071 1 niteetti muodostuu elävässä kenossa herkistettäessä tämän keksinnön mukaisesti valmistetulla termisesti denaturoidulla antigeenillä.

Perusesimerkki 15 5 Perusesimerkissä li-(l) käytettiin GRA-M-3-H:n sijasta GRA-8-H, GRA-l-HA, GRA-2-hA, GRA-3-HA tai GkA-4-Ha siten, että lopullinen proteiinimäärä oli 2b0 ng/ml vastaavien tappajasolujen tuottamiseksi.

Niille suoritettiin Single Cell cytotoxic Assay-koe 10 samalla tavalla kuin perusesimerkissä 11-(2) sytotoksi-suuden mittaamiseksi syöpäsoluihin nähden. Tulokset on esitetty taulukossa 10.

Taulukko 10

Ib Tappajasolu Sytotoksisuus (%)

Herkistimenä käytetty GRA-8-H 21,5 -"- GRA-l-HA 25,4 -”- GKA-2-HA 20,3 -"- GRA-3-HA 22,0 20 GKA-4-HA 18,9

Vertailu 10,7

Perusesimerkki 16 i) Ääreisverilymtosyytit, jotKa oli saatu ter-veestä aikuisesta linkouserotuksella "Ficllpackin" avulla (Pnarmacia Co) säädettiin väliaineella RPMI-1640, joka sisälsi 10 % FCS, pitoisuuteen 1,5 x 10° solua/ml.

10 ml:aan tätä lisättiin GRA-3, niin että saatiin pitoisuudeksi 5, 25 tai 50 ng proteiinia/ml, ja inkuboitiin 30 3/°C:ssa hiilidioksidi-inkubaattorissa 48 tuntia tappajasolujen saamiseksi.

Käyttäen GRA-3:n sijasta GRA-4 tai reseptori 2:ta valmistettiin samoin tappajasoluja. Tappajasoluja valmistettiin myös käyttämättä GKA:ta (vertailu).

35 2) senjälkeen kun edellä kondassa (1) saadut tappa jasolut oli pesty kahdesti väliaineella RPMI-1640 (1000 36 8 0 71 1 Ι/min, 10 minuuttia), ne säädettiin samalla väliaineella, joka sisälsi 10 % FCS, pitoisuuteen 1,5 x 10^ solua/ml, mitä kutsutaan nimellä "vaikuttajasolut" (E). Kohdesolui-na (T) käytettiin soluja, jotka oli saatu säätämällä 5 Daudi-solut, jotka oli pesty kahdesti yllä kuvatulla vä-liaineella, pitoisuuteen 1,5 x 10 solua/ml samalla väliaineella, joka sisälsi 10 % FCS.

100 -ui yllä kuvattua seosta E ja 100 ,ul seosta T sekoitettiin keskenään. Kun seosta oli inkuboitu 37 C:ssa 10 1 tunti, pantiin seosta sisältävä koeputki jääveteen reak tion pysäyttämiseksi ja eloonjääneiden solujen lukumäärä mitattiin värjäämällä 0,2-prosenttisella Trypan Bluella. Seoksen E tappoteho laskettiin seuraavasta kaavasta.

15 Tappoteho (%) = JjSolujen lukumäärä käytettäessä vertailukokeen seosta E) -(Tutkittujen solujen lukumäärä)""| / (E‘ +T') ‘ 20 jossa E’ on henkiinjääneiden solujen lukumäärä, kun 100 ^rUi E:tä on inkuboitu 37°C:ssa 1 tunti. Τ’ tarkoittaa henkiinjääneiden solujen lukumäärää, kun 100 ^,ul T:tä on inkuboitu 37°C:ssa 1 tunti. Tulokset on esitetty taulukossa il.

^ Taulukko 11

Tappoteho (%)

Pitoisuus mg proteiinia/ml) Vaikuttajasolu 50 25 5 Keskiarvo GRA-3-ryhmä 10,7 20,4 29,5 20,2 30 GRA-4-ryhmä 18,5 13,1 2,4 11,3

Reseptori-2- ryhmä 15,0 10,3 14,3 13,2 3) Kun määritettiin tappoteho tappajasoluille, jotka oli aikaansaatu GRA-l:llä ja GRA-2:lla samalla ta-35 valla kuin edellä kohdissa (1) ja (2), havaittiin lähes sama teho kuin yllä.

37 8071 1

Perusesimerkki 17 1) Esimerkissä l-(l) saatu GRA-J laimennettiin fysiologisella suolaliuoksella pitoisuuteen 15 ^ug proteiinia/mi; tätä kutsutaan nimellä "syövänvastainen 5 aine nro 2".

2) MMT-kasvainmassa leikattiin aseptisissa olosuhteissa niin että saatiin 5 mm:n kuutioita. Nämä siir-rostettiin kymmenen C3H/He-hiiren (uroksia, 7 viikkoa) selän ihon alle. 7 päivän kuluttua havainnoitiin kasvai- 10 men kasvu ja kiinnittyminen. Viidelle hiirelle annettiin edellä kohdassa (1) saatua syövänvastaista ainetta nro 2 ihon alaisesti määrä 300 ^u.1 vuorokaudessa kahden päivän välein. Muita viittä hiirtä käytettiin käsittelemättöminä vertaiiueläiminä. lu vuorokauden kuluttua ensimmäi- 15 sestä lääkeannoksesta kasvaimet poistettiin leikkauksella ja niiden keskimääräinen tilavuus mitattiin. Tulokseksi saatiin keskimääräinen tilavuus 142,5 mm^ vertailueläin-ten ryhmässä, kun taas ryhmässä,jota oli lääkitty, keski- 3 määräinen tilavuus oli 18,7 mm , mikä varmisti kasvai- 20 mia vähentävän tehon.

Claims (13)

1. 38 8071 1
2. 1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen termisesti denaturoidun, glykosidisidokseen liittyvän, syöpäso- 5 luista johdetun antigeenin (GRA:n) valmistamiseksi, jossa erotetaan syöpäsoluista solumerabraanikomponentti pääteasemassa olevaa galaktoosia ja/tai pääteasemassa olevaa N-ase-tyyligalaktosamiinia sitovalla lektiinillä, lektiiniresep-torin saamiseksi, tai vasta-aineella, joka pystyy kiinnitit) tymään lektiinireseptoriin, joka on saatu syöpäsolumembraa-nista ja joka voi kiinnittyä pääteasemassa olevaa galaktoosia ja/tai pääteasemassa olevaa N-asetyyligalaktosamiinia sitovaan lektiiniin, fraktion saamiseksi, jolla on sitomis-kyky pääteasemassa olevaa galaktoosia ja/tai pääteasemassa 15 olevaa N-asetyyligalaktosamiinia sitovaan reagenssiin nähden, erotetaan lektiinireseptori ja/tai fraktio glykosidisidokseen liittyvän antigeenin saamiseksi, tunnettu siitä, että kuumennetaan näin saatua glykosidisidokseen l/- liittyvää antigeeniä. ': 20 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- n e t t u siitä, että terminen denaturaatio suoritetaan kuumentamalla GRA noin 60 - 120°C:ssa, 5-60 minuutin ajan.
3. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että GRA saadaan valmistamalla syöpäsolu- 25 jen solumembraanikomponentti homogenoimalla tai liuottamalla, solumembraanikomponentti käsitellään lektiinillä lektiinisolumembraanikomponenttikompleksin muodostamiseksi, ' ' muodostunut kompleksi kerätään, lektiini erotetaan komplek- :*·: sista ja lektiinivapaa membraanikomponentti kerätään tal- 30 teen. i ·
4. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, t u n-n e t t u siitä, että GRA on ihmisen syöpäsolun solumemb- f·»» raanikomponentti.
5. 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, t u n-35 n e t t u siitä, että lektiini on maapähkinälektiini. 39 8071 1
6. 6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lektiini on Dolichos-pavun aggluti-niini.
7. 7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, t u n-5 n e t t u siitä, että GRA on ihmisen syöpäsolun solumemb- raanikomponentti.
8. 8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lektiini on maapähkinälektiini.
9. 9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, t u n-10 n e t t u siitä, että lektiini on Dolichos-pavun aggluti- niini.
10. 10. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että GRA saadaan valmistamalla syöpäsolujen solumembraanikomponentti homogenoimalla tai liuottamal- 15 la, solumembraanikomponentti käsitellään GRA-vasta-aineella vasta-ainesolumembraanikomponenttikompleksin muodostamiseksi, muodostunut kompleksi kerätään, vasta-aine erotetaan kompleksista ja vasta-ainevapaa solumembraanikomponentti kerätään talteen.
11. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että GRA-vasta-aine on vasta-aine, jolla on kyky sitoutua GRA:hän, joka on syöpäsolun solumembraanikomponentti, joka pystyy liittymään maapähkinä-lektiiniin ja jota saadaan affiniteettikromatografialla 25 käyttäen kyseistä lektiiniä.
12. 12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että GRA-vasta-aine on syöpäpotilaan antivasta-aine.
13. 13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-30 n e t t u siitä, että valmistetaan lämpödenaturoitu glyko-sidisidokseen liittyvä syöpäsoluista johdettu antigeeni (lämpödenaturoitu GRA), joka sisältää glykoproteiinin, joka koostuu sakkaridista, jolla on pääteasemassa galaktoosi ja/tai N-asetyyligalaktoosiamiini ja termisesti denaturoi-35 dusta proteiinista. 40 8071 1