JPS591420A - 糖鎖関連抗原およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な癌細胞由来糖鎖関連抗原（以下１’−
ＧＲＡＪと称する）更に詳細には、ＧＲＡをもつ癌細胞
に特異的に作用して、該癌細胞を破壊する癌細胞障害性
リンパ球（以下「キラーセル」と称する）ヲ訪導するこ
とが可能なＧＲＡに関するＯ ０免疫担当細胞、特に細胞性免疫の主役で必るＴリンパ
球は移植免疫の際異種細胞抗原にもとすく拒絶反応を行
うにもかかわらず、Ｉ＆Ｉ細胞に対してはこの免疫抑制
が認められないかあるいは弱い。

従って、癌細胞は破壊されずに生体内で増殖し、ついに
は担癌宿主を死に至らしめる。

本発明者は、＃Ｊ細胞に対する宿主の免疫応答並びに癌
治療への応用について鋭意研究を行っていたところ、分
化した正常細胞には認められない癌ｍ胞特異抗原中に、
宿主に免疫原として作用し、癌細胞と特異的な免疫応答
を成立させる免疫原性が極めて高いＧＲＡが存在するこ
とを見出した０そして、このＧＲＡｉリンパ球に感作さ
せると、ＧＲＡをもつ癌細胞に対し特異的に作用するキ
ラーセルが得られ、これを宿主に投与すると、ＧＲＡを
認識し、（）ＲＡｉもつ癌細胞に作用してそれを破壊す
るた′め、癌の治療及び予防において極めて優れた効果
を奏することを見出し、本発ＢＡを完成した０ 従って、本発明は、ＧＲＡ及びその製造法を提供するも
のである。

上記のキラーセルは、例えば本発明のＧＲＡをリンパ球
に感作させる方法によって製造がする。

この方法において使用されるＧＲＡは、ヒト又は動物の
培養癌訓胞、移植癌細胞、自然発生癌細胞、化学物質・
ウィルス発生癌細胞、手術組織由来癌、細胞等のＧＲＡ
をもつ癌細胞よ９次の如くして得ることができる。すな
わち、まず該癌細胞から細胞膜成分を分離し、次いで末
端ガラクトース又は末端Ｎ−アセチルがラクトサミンと
特異的に結合するレクチンと処理して、該レクチンに結
合させて分離することにより容易に得ることができるＯ 上記末端がラクトースと特異的に結合するレクチンとし
ては、例えばビーナツツレクチン、ひまの実（Ｒｌｃｉ
ｎｕｓ　Ｏｏｍｍｕｎｉｓ　）レクチン、ダイズレクチ
ン（！３．ＥｒＡ）等を挙げることができる０［：　Ｊ
！３．０．２５０．８５１８−８５２３　（１９７５）
：、ｓｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｑｐｈｙｓ　ｈｓｓ、　Ｃ
Ｑｍｍ、　６２．１４４　（１９７５）；Ｚ、工ｍｍｕ
ｎｉｔａｅｔｓｆｏｒｃｈ　ｉ　３８．４２３−４３３
（１９６９）；Ｅｒ、Ｊ、ＥＸｐ、ＰａｔｈＯｌ　　ｌ
　　２７　１　２２８−２３６　（ｌ　　９４６　　）
；　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｈ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　　７　ｂ　　＋　扁５　．２２　１　５−２
２　１　９　　（１９７８）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
７１　３　．１　９６−２０４　　（１９７４）；ｃａ
ｒｂｏｈｙａｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｃｈ、５　１　　＋
　　１　０　７　−　１　１　８（１９７６）） 又、末端Ｎ−アセチルがラクトサミンと特異的に結合す
るレクチンとしては、例えばトリコスマメレクチン（Ｄ
ＢＡ　Ｌオサグ９オレンジレクチン、ヒリツクスボマテ
イアレクチ／、リママメレクテン、ダイズレクチン、バ
ウヒニアマメレクテン等を挙けることができる。

ＮＩｊｍ胞膜成弁膜成分は、例えば小モジネート法、可
溶化剤を用いる可溶化法等の公知の方法によってなし得
る。より有利には例えばガン細胞を生理食塩水又は適当
な緩衝液中でホモジネートした後、沈殿部分を遠心分離
等により採取し、これを生理食塩水又は緩衝液中に可溶
化剤を用いて溶解し、上清部分を遠心分離等により取り
出すことにより笑施できる。用いられる可溶化剤として
は、一般に細胞膜を可溶化できることの知られている各
撫の界面活性剤例えは「トリトンＸ−１００Ｊ（和光紬
薬社製）、ｒＮｐ−４０Ｊ（シェル社製）、ジキトニン
、尿素等の非イオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）等の陰イオン界面活性剤等を例示できる
。

また上記により得られる細胞膜成分からのレクチンと結
合するＧＲＡの分離は、該ＧＲＡの性質を第１用した通
常の物理化学的又は生化学的手段により行ない得る。該
手段としては例えばレクチンを含むカラム担体を利用す
るアフィニティークロマトグラフィー、ＧＲＡ抗体等を
用いる免疫沈殿法、透析法、デル濾過法、電気泳動法、
ポリエチレングリコールやアセトン等の糖蛋白沈殿剤を
用いる物理的沈殿法等又は之等を適宜組み合せた方法を
例示できる。より有利にはレクチンを含むカラム担体全
利用したアフィニティークロマトグラフィーによるのが
よく、該カラム担体は、例えばレクチンを不溶化支持体
上に固定化することにより容易に収得できる。ここでレ
クチンの不俗化支持体上への固定は、従来公知の生体物
質の固定化方法に従い行なうことができる。これらのう
ちでも臭化シアン活性化多糖体法、Ｎ−ヒドロキシサク
シミドエステル法等を使用する固定方法によるのが好適
である。このうち臭化シアン活性化多糖体法は、不溶性
支持体を臭化シアンで処理し、次いで得られる活性化物
をレクチンと緩和条件下にカップリングさせ、レクチン
を固定化する方法である。不溶性支持体を臭化シアンで
処理するに当っては、例えば水酸化ナトリウム、炭酸水
素ナトリウム等の塩基性化合物を用いてｐＨ７，５〜１
２に保ち室温下水、アセトニトリルや０．１　Ｍ炭酸水
素ナトリウム緩衝液（ｐＨ中８．７）、０．０’　Ｉ　
Ｍリン酸緩衝液（Ｐ［１キ７．７）等のｐＨ７，５〜１
２の緩衝液等の溶媒中にて約１〜１２分間程度処理すれ
ばよい０不溶性支持体に対する臭化シアンの使用量とし
ては通常およそ等重量とするのがよい。ここで不溶性支
持体としては、生体物質一般に対する非特異的吸着が低
く、高い多孔性を有し、緩和条件下に生体物質を固定化
し得る官能基を有し、しかも化学的・物理的に十分安定
な従来公知の不溶性支持体をいずれも使用できる。例え
ばアミノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、フロモアセチルセルロース、ｐ−アニリノセルロー
ス等のセルロース系支持体、セファデックス、ＯＭ−セ
ファデックス（ファルマシア社製）等の架橋デキストラ
ン系支持体、セファロース２Ｂ、セファロース４Ｂ１セ
フアロース６Ｂ（ファルマシア社製）等のアガロース系
支持体等を挙げることカニできる０斯くして得られる臭
化シアン活性化支持体全レクチンとカップリングさせる
に際しては、レクチンに対して臭化シアン活性化支持体
を３０〜８０倍ｊｉ葉用い、適幽カ溶媒、例えば０．１
モル炭酸水素ナトリウム（０，５モル塩化ナトリウム含
有、Ｐ日８．４）水溶液中、通常０〜４０℃程度、好ま
しくは２〜８°Ｃにて約１０〜２０時間反応させればよ
い。このようにしてレクチンを含むアフィニティークロ
マトグラフィー用担体が製造される。

上記レクチンを含むアフィニティークロマトグラフィー
用担体を利用したクロマトグラフィーによれば、目的と
するＧＲＡが上紀担体中のレクチンと結合してカラムに
捕集される。次いで該カラムに例えはレクチンと結合す
る物質全通して交換反応を行うか、又は高濃度の堰、チ
オシアン酵力　　　　゛リウム水溶液、硼酸緩衝ｅ、等
の吸着分離剤（溶出液）を通してＧＲＡｉ解離して収得
する。

上記交換反応においてレクチンと結合する物質としては
がラクトース結合性レクチンを担体としで用いた場合に
は、例えばがラクトース、末端にガラクトースを有する
三糖類又はオリゴサツカライド等のガラクトース結合性
レクチンと結合する物質を例示でき、又、Ｎ−アセチル
ガラクトサミン結合性レクチンを担体として用いた場合
には、例えばＮ−アセチルガラクトサミン、末端にＮ−
アセチルガラクトサミンを有する三糖類又はオリゴサツ
カライド等のＮ−アセチルがラクトサミン結合性レクチ
ンと結合する物質を例示できる。

斯くして得られる本発明のＧＲＡは、ガラクトース及び
／又はＮ−アセチルガラクトサミン末端を有する楯タン
パク、糖脂質及び／又はｓｉ類を含むものでめる０かく
して製造されるＧＲＡは、必要ならは凍結乾燥してもよ
く、通常の分離手段によって更にｎ製することもでき、
例えばガラクトース結合性レクチンを用いて分離したＧ
ＲＡを、次いでＮ−アセチルガラクトサミン結合性レク
チンを用いて分離する方法、又はＮ−アセチルガラクト
サミン結合性レクチ／を用いて分離したＧＲＡを、次い
でガラクトース結合性レクチンを用いて分離する方法等
を例示できるＯ また、リンパ球は特に制限はなく、正常あるいは担癌の
ヒト又は動物の９７７９球の何れをも使用でき、具体例
としては、例えば末梢血、骨髄、リンパ節、牌臓、扁桃
腺、胸腺等由来のものめ５挙げられる。これらのリンパ
球は、物理的、化学的方法あるいは表面膜法等によって
単離され、キラーセルの誘導方法に供し得る０ ＧＲＡによるリンパ球の感作は、ＧＲＡを含む培地中で
、リンパ球を１〜１０日間、好ましくは２〜７日間培養
することによって行われる０培地としては、この柚の細
胞′培養に用いられている一般的な各種栄養培地を使用
できるが、例えばＲＰＭ工１６４０培地、イーグルＭ］
１１１Ｍ培地等にヒト血清、ウシ胎児血清（Ｆｏｅ）、
仔ウシ血清、ウマ血清等を加えたものが好ましい。培地
に加えられるＧＲＡは、通常リンパ球ｌＸ１０ｂ個／ｄ
に対し、糖量として１〜１１０００ｎ／Ｔｎｔ、％に１
〜５００　ｎｇ／ゴが好ましい。

培養は常法に従って、例えばｐＨ７，２付近で、６７℃
付近の温度で行われる。

斯くして得られるキラーセルは、ＴＭＩ胞増殖因子（Ｔ
ＧＧＦ、ＩＬ−１）會含む上記培地で、無制限に増殖さ
せることができる。この場合、通常の限界希釈法により
史にキラーセルのりＥ＋−、＝ンの選別培養を行っても
よい。キラーセルは、例、ｔば液体窒素中に保存すれば
、長期間安定に保存することができる。

斯くして製造されるキラーセルは、実質的に正常リンパ
球であｐ　ＧＲＡに特異的な細胞障害活性をＭすること
において特定される。これらのキラーセルは自ら分譲可
能な状態に保持すると共に代表側として後述する製造例
に従って得られるＧＲＡ−１−ＫＴ及びＧＲＡ−￥−１
＋谷Ｔ　＠　Ａ　ｍ　！：Ｊ　、Ｑに寄託申請中である
。

上記の如くして得られる本発明のＧＲＡは抗癌剤として
有用であり、このＧＲＡはそれ単独を有効成分とするこ
とも、また他の抗菌剤、制癌剤と併用することもできる
。本発明のＧＲＡ’ｉｉ有効成分とする抗癌剤は、生薬
であるＧＲＡ７ｉｌ−効果的に含有した状態であれば、
いかなる形態でもよいが通常は、液状溶液、懸濁液又は
乳濁液等として静脈、皮下又は筋肉内に投与される。こ
れらはまた使用前に適当な担体の添加によって液状にな
し得る乾燥品として提供することもできる。このような
液状製剤はメチルセルロースのような懸ｆｆｉ　Ｍ、レ
シチンのような乳化剤、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾ
エートのような防腐剤又はそれ自体でヒトや動物の免疫
機能に悪影響を与えないような安定剤、緩衝剤等を含有
しうる。水性担体としては生理食塩水、非水性担体とし
てはゴマ油等の植物油、パラフィン等の鉱物油、スクワ
レン等の動植更にまた、斯′る液剤は、免疫促進のため
に適当なアジュバントヲ含有させることもできる。アジ
ュバントとしては、例えば、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ
）の完全アジュバント、さらには動物用のサポニン、ヒ
ト用の水酸化アルミニウム等を挙げることができる。

該抗癌剤は、癌患者に１画又は長期に亘って複数回投与
してその治療を行うことも、また癌に罹患のおそれのあ
るものに投与して防御を行うこともできる。

ＧＲＡのＬＤ５ｏ（マウス腹腔内）は糖量として５００
　ｑ／９以上と毒性が低いので、広範囲の量において投
与できる。従って、抗癌剤中のＧＲＡ濃度は特に制限き
れないが、一般にはａ菫として０、００１〜１００　ｐ
ｊｉ／ｒｔｄカ好１　シイ。投４ｍは、疾患の程度、年
令、性別によって異なるが、通常糖量として０．０ｏ１
〜１０００μ、！ｉ’／Ｋｒ／Ｅｌｅｌ〜数回に分けて
投与するのが好ましい。

又、上記の如くして得られるキラーセルも抗癌剤として
有用であり該抗癌剤は、この禎の血液製剤に使用される
７担体と共に注射剤とするのが好ましい。担体は特に限
定されないが、血液と等張であるもの、特に生理食塩水
が好適である。製剤化に当っては、キラーセルは生理食
塩水等で充分に洗浄して上記培地を除去した後、担体中
に浮遊させるのが好ましい。

当該製剤中のキラーセル磯には特に制限されないが、一
般には１０５〜１０°個／ゴが好ましい。

またキラーセルは１０”個／マウス（腹腔内）投与で毒
性は認められない。投与せは、疾患の程度、年令、性別
によって異なるが、通常１０５〜１０１１２個／に２／
日を１〜数回に分けて投与するのが好ましい。

次に、実施例、参考例、試験例及び比較例を挙げて示す
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１（ＧＲＡの局在） ■　Ｆ工ＴＣ標識しクチ７（ＰＮＡ−ＦＩＴＣ）の製造
： ピーナツツレフテン（ＰＮＡ、ＢＹＹ社製１０ｎｉを０
．８５％Ｎａ０ｔの０．０１Ｍ−リン酸塩緩衝液（ｐＨ
＝７．２）２ＷＬ１．に溶解する。ＦＩＴＣ（シグマ社
製）２■を０．５Ｍ−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝９．０）
１ｔｎｔに溶解し、その０．５−を上記ＰＮＡの緩衝液
に加える。室温にて２時間攪拌後セファデックスＧ２５
（１０閣×６ｏＯ簡、ファルマシア社製）にて分離し最
初のピークを採椴する。Ｆ　／　Ｐ比＝１．０ ■　Ｆ工ＴＯ４１ｉ１１１ｚクチン（ＤＢＡ−ＦＩＴＣ
）の製造： ＤＢＡ（Ｂ）Ｙ社製）を使用して、上記■と同様にして
ＤＢＡ−Ｆ：［ＴＯｉ得るｏ　’／　Ｐ比＝　０．９■
　各種癌細胞のＧＲＡ局在： 各種癌細胞Ｉ　Ｘ　１０６個’ｉ　０．８５％Ｎａ０６
（７）　Ｏ−０５Ｍ−）リス塩酸緩衝液（ｐｆ−１＝７
．２）にて６回遠心法にて洗浄後、上記■で得たＰ’　
Ｎ　Ａ　−ＦＩＴＣ又は上記■で得たＤＢＡ−ＦＩＴＯ
又は５ＢＡ−ＦＩＴＣ（ＢＹ社［）（２００，Ｊｉｌ／
ｆｎ！、）をｉｏ。

μを添加し室温にて６０分間靜装反応させる。反応終了
後０．８５％Ｎａ０ｔの０．ＯＩＭ−リン酸塩緩衝１（
ｐＨ＝７．２）にて６回洗浄後、細胞をガラススライド
上にのせ、螢光顕微鏡下に検−を行なう。

結果は第１表のとおりである。尚供試癌細胞は何れも公
知のものであり、新潟大学医学部第−何埋から入手した
。

以下傘臼 ■　各種癌細胞（手術片）のＧＲＡ局在：癌患者の手術
片より得た癌組織をステンレスメツシュ（′４＋１５０
）に通し、細胞浮遊液を得、これｆ　２ｍＭ　０ａＯ４
２、２ｍｕ　Ｍｇ０Ｌ２及び０．８５　％　ＮａＯ４の
０．０１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）にて２
回洗浄する。この５　Ｘ　１０５個を上記緩衝液１００
μｔに浮遊し、ＰＮＡ−Ｆ工Ｔｏ又はＤＢＡ−Ｆ工ＴＯ
（２００μｇ／−）を１００μを添加し、室温にて２０
分間インキュベートする。反応終了後０．　Ｂ　５　％
　ＮａＣ！ｔの０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（−＝　７．
２　）　（以下「ＰＢｓＪとする）にて６回洗浄後、細
胞をガラススライド上にのせ、螢光顕微説下に検鏡を行
った。結果を下記第２表に示すＯ尚、癌患者の手術片は
、いずれも関西医科大学より得た０第２表中、ＧＲＡの
局在は以下に示す０十；細胞表面にＧＲＡが表現されて
いる０−；細胞表面にＧＲＡが表現されていない。

第　　２　　表 参考例２ ■　不溶化レクチン（ＰＮＡ−セファロース）の製造： ＣＮＢｒ−ｆｔ１性化セフアロース４Ｂ（ファルマシア
社製）５ｇを１ｍＭ−Ｈｃｌｌで充分に洗浄後、０．１
Ｍ−炭酸水素ナトリウム（ｐｉ（＝８．５）２００ｍｌ
に懸濁し、ｐＮＡ２０１１１９を含む０．０１Ｍ−ＩＪ
ン酸塩緩＠液（Ｐｌ（＝　７．７　）　５ゴを加え、２
５°Ｃで時々攪拌しながら２時間反応させてＰＮＡ−セ
ファロースを得る◎ ■　上記■において、ＰＮＡの替わりにＤＢＡを使用し
て同様の操作によりＤＢＡ−セファロースを得る・ 実施例１ ＢＴ−１（パーキットリンノ々腫）細胞１．３×１０８
個を生理食塩水で３回洗浄し、２４ｒト’ＪトンＸ−１
００Ｊ　（和光純薬社夷）、０．８５チＮａＣｌ、　２
　ｍＭ−Ｃａ（Ｖｚ、２ｍＭ−ＭｇＣ１２のＱ、ＱｌＭ
−ｔリス塩酸酸ＨＫ　（ＰＨ＝　７．４　）　５０ｍｌ
を刀１え、４′（で１５分間攪拌する。その後１００．
０００Ｘ、Ｖ１２時間超遠心した。超遠心上清２８ゴの
うち、１　４　ｍｌ　を　０．１．、％　　　ト　　リ
　　ト　ン　Ｘ−１００、０，８５ｃｌＩＮａＣｅ　、
２ｍＭ−ＣａＣ１２，２ｍＭ−Ｍｇ０７２のトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）で平衡化したＰＮＡ−アガロ
ースビーズ（丸善社製）のアフイニテイクロマト（φ０
・５Ｘ１ｃＩＩＬ）Ｋ付す。同緩衝液で洗浄後、０．１
Ｍ−ラクトース、私８５　％　ＮａＣｌ、２ｍＭ−Ｃａ
Ｃｊ？Ｂ、２ｍＭ−ＭｇＣ１２、０，１％　ト　リ　ト
　ン　Ｘ−１００の　０．０１Ｍ−）リス−塩酸後’Ｉ
＃ｇ（ｐＨ＝　７．４　）で溶出し、溶出部をＯ−８５
’Ｘｌ　ｋｈｘｃｌ　、　２１１１Ｍ−ＭｇＣ１２、２
ｍＭＣａＣ６゜のＤ−０１Ｍ−トリス−塩酸緩衝液で４
８時間透析して（）ＲＡ溶ｇ１７７ｎｌ得る。このもの
のタンパク冴及び糖量をＦｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ法及び
フ？／−ル硫酸法で測定した結果タンパク量は６４４μ
、ｐｍｔは１２０μｇであった。以下これを「ａＲＡ−
１，１と称する。

実施例２ Ｃ，Ｈマウス乳癌細胞（ＭＭ’Ｉ’　）　Ｉ　Ｘ　１０
１Ｏ個を〕　　生理食塩水で３回洗浄後、２　％　トＩ
７　トンＸ　７１００、’：０．８５　％　ＮａＣＮ　
、　２ｍＭ−ＣａＣ／２．２ｍＭ−ＭｇＣＡ’　２００
．０１Ｍ−トリス−塩酸緩衝液（ｐ）ｌ＝　７．４　）
　３０ゴを加え、４°Ｃで３０分間攪拌する。その後１
００．０００ｘｉで２時間超遠心し、その上清を０．８
５％Ｎａ（Ｖ、２ｍＭ　　−Ｃａ０ｇ２　　、　２ｍＭ
　　−λ、ｒｇＣ１２の　０．０　１　　Ｍ　　−ト　
リ　スー塩＃ｉ！緩衝液（ｐＨ＝７．４）で１晩透析す
る。この透析内液’？：　Ｉｍｍｅｒｓｉｂｌａ　−Ｃ
Ｘ　ｕｌｔｒａ−ｆｉｌｔｅｒｓ　（ミリポア社Ｒ）で
３　ｒｎｌに濃縮し、このうち１ｍｌを０．０　０　５
　　％　ト　リ　ト　ン　ｘ−１００、０，８５９ｂ　
　ＮａＣ７。

２ｍＭ−ＣａＣ１２，２ｍＭ−ＭｇＣ７２のトリス−塩
酸緩衝液（ｐ）ｌ＝７．４）で平衡化した前記参考例２
−■のＰＮＡ−セファロースの了フイニテイクロマト（
φ０．５Ｘ２ｃｍ）に付す。同緩ａＩｉ液で充分に洗浄
後、０．１Ｍ−ラクトース、ＣＪ−８５９６ＮｔｘＣｌ
ｊ　、　２ｍＭ−ＣａＣｌｇ　　、　　２ｍＭ−ＭｇＣ
ｄ２　　、　０．０　０　５　　％　　）　　リ　ト　
ン　ｘ　−１００の０．０１Ｍ−トリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ＝７．４　）で浴出し、溶出部を０．８５　％　Ｎ
ａＣｌ、　２ｍＭ−ＣａＣｅ２．２ｍＭ−ＭｇＣ１Ｂの
０．［］　Ｉ　Ｍ−トリス−塩酸緩衝液（ｐ！（＝　７
−４　）にて二８時間透析して（）ＲＡ溶液２　ｔｎｌ
を得る。このもののタンパク量は１５６μｇ１糖曽は９
４μＩであった。これを以下［）ＲＡ−Ｍ実施例６ ＫＡＴＯ−１１ｍ　胞、約１２０．！ｉｉ’（湿重ｔ　
）　ヲＰＢＳ１ＤＯｍｅ中、粉砕機＜　Ｗａｒｉｎｇ　
ｂｌｅｎｄｅｒ　；日本精機社製）を使用してホモジナ
イズする。遠心分離（１００，０００ｇｘ１時間）した
沈渣を、２チドリトンＸ−１００、Ｃ３，１５Ｍ　Ｎａ
Ｃ６の０．０１　Ｍ　トリス・塩酸緩ｍｇ（ｐＨ＝　７
−６　）　１００　ｒｎｌに加え、攪拌する。遠心分離
＜　ｉ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ　、ｐ　ｘ　ｉ時間）しだ
上清を、０．０１５％トリトンＸ−１００，０−１５Ｍ
　ＮａＣｄの０．０１Ｍトリス、塩酸緩衝液（ｐ）ｌ＝
　７．６　）で平衡化したＰＮＡ−セファロースのアフ
イニテイクロマト（φＤ、ＢＸ’Ｉ５Ｃｍ）に付す。

同緩衝液５０ｒｔｔｌで洗浄後、０．１Ｍラクトースを
含む同緩衝液で溶出し、これを０．８５　’１６　Ｎａ
Ｃ１１水溶液にて透析してＧＲＡ溶液を得る。これはセ
フ了デックス（ファルマシア社製）にて濃縮後−２０℃
に保存した。蛋白ｉ　２．０ＩＩ’ｉｉ？、糖ｔ　Ｏ，
８ηこれを「ＧＲＡ−２Ｊ　とする。

実施例４ 上記実施例６と同様にして下記第５表のＧＲＡを夫々得
た。

第６表 実施例５ 上記実施例３において、ＫＡＴＯ−川に変えてＭＫＮ−
４５を約２９／％ＰＮＡ−セファロースカラムに変えて
ＤＢＡ−セファロースカラムを使用して、ラクトースの
変わりにＮ−アセチルガラクトサミンで溶出した以外は
同様の操作により、ＧＲＡを得る。蛋白ｉ１０．０３ｍ
９糖量０．０１＃％’。これをｇ　ａ　ＲＡ　−８−１
とする。

実施例６ 上記実施例４で得たＧＲＡ−３の５　ｍｌをＤＢＡ−セ
ファロースカラムに付し、０．０１５％トリドア　Ｘ　
　１００　、２ｍＭ　ＭｇＣ／（２，２ｍ）Ｊｉ　Ｃａ
Ｃｌ２．０．８５％ＮａＣｌの０．０１ＭＩＪス・塩酸
緩衝液で溶出して４　ｍｌずつのフラクションを得る。

次いでＱ、Ｉ　ＭＮ−アセチルガラクトサミンを含む上
記緩衝液で溶出して（）ＲＡ浴溶液得る。これを（）Ｒ
Ａ−３−Ｃとする。父上記フラクションＡｌ〜３Ｙ（）
ＲＡ−５−Ａ１フラクションＡ４〜１２をＧＲＡ−３−
Ｂとする。

試験例１ 前記実施例で得た各ＧＲＡＯ８ＤＳケ９ル電気泳動ｔ７
　Ｆａｉｒｂａｎｋｓ等の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　、　Ｖｏｌ。

１０、ｐ２６０６、（１９７１）］に準じて行った。結
果を第１８〜２２南に示す。

同、図中、各番号は夫々以下に示すとおりであるＯ 第１８及び第１９図中 １・・・スタンダード ２・・（）ＲＡ−Ｍ−３ ３・・・ＧＲＡ−７ ４・・ＧＲＡ−１ ５・・・ＧＲＡ−２ 第２０図中 １・・・スタンダード ２・・・ＧＲＡ−Ｍ−２ ３１，・ＧＲＡ−６ ４・・・ＧＲＡ−５ 第２１図中 １・・・ＧＲＡ−Ｍ−４ ２・・ＧＲＡ−Ｍ−５ ３・・・スタンダード 第２２図中 １・・ＧＲＡ−３ ２・・・ＧＲＡ−３−Ａ ４・・・ＧＲ状−３−Ｃ 同、第１８図はＣ，Ｂ、Ｂ、法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　＊Ｖｏ１．１０．ｐ２６０６、（１９７，１）　
）により蛋白の染色反応により、又第１９〜２１図はＰ
ａｓ法（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　Ｖｏｌ、
　５０．１４８　（１９６２））による糖の染色反応に
より検出した図面を示すＯ第２２図は上記Ｃ，Ｂ、Ｂ、
法による染色結果を図式化したものである。父、各図に
おいてスタンダードはいずれもＢｉｏｒａｄ　Ｌａｂ、
社（Ｕ、Ｓ、Ａ、）の下記標準物質を使用した。

２００　（Ｋダルトン）；ミオシン １１６　　　〃　　　；β−グルコシダーゼ９２．５　
　　　１／　　　　　；フォスフォリラーゼ６６．２　
　　　　ｔｔ　　　　　；ＢＡＡ４５　　　〃　　　；
オプアルプミン ２１・５　　　〃　　　；ソイビーントＩＪデシンイン
ヒビター 参考例３　　（ＴＣＧＦの調製） ■　日本ずル（日本ゾライメイツ社より入手）４にｇの
牌臓を摘出し％ｉ、　ＲＰＭＩ　−１６４０Ｊ＠地（フ
ローラがラトリー社裂・）にて２回洗浄する。メツシュ
（ミリボア社製、１５０メツシユ）にて細胞を濾過し、
比重遠心法（比１１．０７６）により２ｘ１０’／ｍｌ
のリンパ球２１を得る。このリンパ球をＲＰＭＩ　−１
６４０培地で６回洗浄し、２０８１０％の上記培地で５
　Ｘ　１０７個／　ｍｌに調整し、炭酸ガス培養器中で
、６７℃にて１時間静置する。

上清リンパ球を回収し、Ｆｅ２１％の上記培地でＩ　Ｘ
　１０’個／　ｍｌに祠祭する。インドメサシン（シグ
マ社製）１μｇ１ｍｌ、　　　　　　　−−、ｐＨＡ−
ｐ（ディフコ社裂） ０．２　％を添加し、炭酸ガス培養器中で６７℃にて４
８時間培養する。遠心分１１１（３０００Ｘｇ、１０分
）し、上溝を回収し、ミＩＪボアフィルター（０，２μ
ｍ、ミリボア社製）にて濾過滅菌してＴＣＧＦ　２　Ａ
を得る。

■　１０人の健康成人より採血した血液を「コンレイ・
フィコール」（日本抗体研究新製）で遠心分離して得た
末梢血リンパ球をプラスチックディシュに吸−！　（３
７”Ｃ１１時間）し、非付着性細胞得る。これを１チＦ
Ｃ８のＲＰＭＩ　−１６４０培地に浮遊しく　１，５　
ｘ　１０６（固／ｍｌ）、０．２４　Ｐ　ＨＡ　−Ｐ、
１μｇ／１ｎｅ−インドメサシン、マイトマイシンｃ４
１１１（５０μｇ／ｍｇ）ＢＴ−１（１−５ｘ１０５個
／ｍｌ）の存在下に培養し、４８時間後、上清を採取し
てヒトＴＣＧＦ　’＆得る。［５ｅｃｏｎｄ、　Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１２、ｐ１４９−１５４、（１９８０）診照〕、参考例
４　（リンパ球の調製） ■　ヒト末梢血９７７９球（ヒトＰＢＬ）健康な成人及
び種々の癌患者よりヘノヤリン採血して得た血液５ｏｍ
１ｗｒフイコールノｆ′ンク」（ファルマシアゾアパン
社製）で遠心分離し、末梢血リンパ球５　ｘ　１０７個
を得る。

■　マウス牌臓リンパ球 Ｃ３Ｉ（／Ｈｅ　マウス（８６Ｗ）の牌臓を摘出し、Ｒ
ＰＭＩ　−１６４０培地にて２回洗浄する。注射針にて
ほぐした後ステンレスメツシュ（１００号）にて濾過し
、大きい砕片を除く。濾過した細胞を上記培地にて２回
洗浄陵、１２００Ｘｇ１０分間遠心して４　Ｘ　１０７
個の牌リンパ球を得る。

参考例５ ■　実施例１で侍たＧＲＡ−１（タンパク量４０１ｔ、
？／ｍ）、砧＠　７．５　μｆＪ　／　ｒｎｌ　）　’
ｒ：　最終１，０００倍になるようにＦＣ８１５％のＲ
ＰＭＩ　−１６４０培地で希釈して感作培地とする。

この感作瑞地５　ｔａｌのシャーレに参考例４−■で得
た正常ヒト末梢面リンパ球５ｘ１０’＋固／　５　ｍｌ
を茄え、３７゛Ｃで２日間培養する。これを参考例ろ−
■で得たＴＣＧＦ　２　Ｑ％、ＦＣ８１５％含有ＲＰＭ
Ｉ　−１６４０培地で更に５日間培養して、１×１０６
個／ｍｌのキラー５セル２Ｑｒｎｌを得る。以下これを
［ＧＲＡ−１−に−Ｔｊと称する。

参考例６ 参考例４−■で得たマウス牌臓リンパ球をＦＣ８１５％
のＲＰＭＩ　−１６４０培地で５ｘ１０’／ｍＡ！に調
製し、前記実施例　２で得たＧＲＡ−Ｍ−１を岐路濃度
タンパクｉｔ　１−５　ｔｔｇ／　ｍｌ、糖量０．９ｔ
４／ｍｅとなるように刃口えて、その５　ｍｌを６７６
Ｃにて２日間シャーレ（６０Ｘ１５１ａ１１Ｌ　　ファ
ルコン社）にて培養する。クローン形成乞確認し、更に
ＴＣＧＦ（日本抗体研究所社製）　２０　Ｖ／Ｖ％を含
′むＦＣ８１５％のＲＰＭＩ　−１６４０培地にて４日
間培養して１　ｘ　１１６／ｍｌのキラ−１セル　５０
ｍ１を得る。

以下これを［ＧＲＡ−Ｍ−１−に−ＴＪと称する。

参考例　７ １１Ｉ！康人のＰＢＬ５Ｘ１［１６をＧＲＡ−２５Ｏｎ
、９／厩、１５％ＦｃｓのＲＰＭＩ　−１６４０培地で
６７°Ｃ下にインキュベートする。２日目に、前記で得
たヒトＴＣＧＦを２０％となる様に塀え、更に３日間培
養してキラーセルを得た。これ’４０ＲＡ−２−に−Ｔ
とする。

参考例　８ ＧＲＡ−８、ＧａＡ−ｓ−ｈ又はＧＲＡ−３−Ｃの５０
　ｎ！ｑ／　ｒｎｌ　（蛋白量）及び前記で得たヒトＴ
Ｃ（）Ｆ’　ｙ使用して前記参考例５と同様にしてキラ
ー　セｊＬ／を傅た。ＧＲＡ−８で感作し、て傅たキラ
ーセルをＧＲＡ−８−に−Ｔ％（）ＲＡ−３−Ａで感作
して得たキラー５ルンＧＲＡ−３−Ａ−に−Ｔ。

ＧＲＡ−３−Ｃで感作して傅たキラーセルｋ　ＧＲＡ−
３”Ｃ−に−Ｔとする。

参考例　９ ０３　Ｈ／　Ｈｅ　マウス（♀、８Ｗ）に、同系由来の
Ｘ５５６３骨髄腫細胞１０６を皮肉に移植し、７日後に
、腫瘍を外科的に切除した。更に７日後、１０５のＸ５
５６３の接種に抵抗性を示したマウス’ｒｘ５５６３免
疫マウスとする。上記Ｘ５５６３免疫マウス及びＣ３Ｈ
／　Ｈｅ正常マウスの牌細胞を常法通りに調製した。各
々の１岸？ｆｌＥ＠５Ｘ１０’／ウエルをＲＰＭＩ　−
１６４０＋　１５％ＦＯ８培地でＣ）ＲＡ−Ｍ−５，４
０ｎ！ｊ／　ｍ１３　（蛋白量）の存在下に５日間感作
して、キラーセルを得た。

正常牌細胞より得たキラーセルをＧＲＡ−Ｍ−５−に−
Ｔ−１、Ｘ５５６３免疫牌細胞より得たキラーセルをＧ
ＲＡ−Ｍ−５−に−Ｔ−２とする。

参考例１０ ＧＲＡ−１５０ｎ、９／ｉｌ（蛋白量）のＲＰＭＩ　−
１６４０培地５ｍｌ中、正常ヒトＰＢＬ５Ｘ１０６乞３
７°Ｃ１２日間培養する。６日目に、上記ＰＢＬの提供
者の血清１０チ及びＧＲＡ−ｉｖｏ〜１ｏ。

ｎｐ　／　ｍｌ　＠有するＲＰＭＩ　−１６４０培地に
変えて、更に５日間培養してキラーセル乞得た。得られ
たキラーセル？第４表に示す。

第４表 参考例　１１ ｆａｔ　　各憧漕患者の術後のｐＢＬｙｏＲＡ−３で感
作してキラーセルを傅た。すなわち、癌患者のＰＢＬ５
Ｘ１０６Ｙ、ＧＲＡ−３５０−ｄ／ｍｌ（蛋白量）のＲ
ｐＭｒ　−１６４０培地テ２　ｆ３、ｙに前記で得たヒ
）　ＴＣＧＦ’　２　Ｑ％及びＦＣ’Ｓ　ｉ５％のＲＰ
ＭＩ　−１６４０培地で５日間培養してキラーセルを得
た。得られたキラーセルを第５衣に示す。

第５表 同、第５表中、Ｐ−ＧＲＡ及びＤ−ＧＲＡは、ＰＢＬン
採取した尚患者の癌組織（手術片）に表曳されているＧ
ＲＡの局在を、前記参考例１−■と同様にして試験した
結果を示し、Ｐ　−ａ、　ＲＡはＦＩＴＣ−ＰＮＡ　、
　Ｄ　−Ｇ　ＲＡは、ＦＩＴＣ’−ＤＢＡを便用して測
定し１こものである。術後経過日は、Ｐ　Ｂ　Ｌの採取
日ケ示す。

（ｂｌ　　乳層の患者の手術後２１日目に侍たＰＢＬ５
Ｘ　Ｉ　Ｄ”ａ：５０ｎ９／ｍｌ＜蛋白量）のＧ　ＲＡ
、　−３及び該患者の血イＩｉｕ％馨官有するＲＰＭＩ
−１６４０培地で７日間培養して感作しキラーセルを得
に０これをＧＲＡ−３−に−Ｔ−７とする。

参考例１２ ■　参考例５で侍たＧＲＡ−１−に−Ｔ　１０８個乞生
理食塩水１Ｑ＋＋＋Ｊにとかして注射剤とした。

■　実施例２で得１こＧＲＡ−Ｍ−１を生理食塩水で希
釈して、糖量１．０μｇ／　ｍｌ　１　タンパク量１．
６μ９７ｍ１となるようにａｌｌｉＩ製して、抗癌剤屋
１としたＯ 試験例２ ０３Ｈ／Ｈｅ自然発生乳癌の腫瘍塊を無繭的に５朋肉の
大きさとなし、同系のＣ３Ｈ、／　Ｈｅマウス（７瀘金
、♂）１０匹の背面皮下にそれぞれ移植し、７日月に腫
瘍の電層及び増殖を確認した。

この５匹に、上記参考例１２−■で調製した抗癌剤屋１
を１日３００μｅずつ２目間隔で皮下投与した。残りの
５匹は無処理コントロールとした。

最初の投与から１０日後に、手術によって腫瘍を摘出し
、平均体ｌＩｔ乞求めると共に病理組織学的観察？行っ
た。

腫瘍体潰：投与群　　　　２２．３臘ＩＬ３（第１４図
）コントロール　１６２．７　＃扉’（＠１５図）これ
は８６．３％の＠瘍縮少があったこと？意味する。

病理組織学的観察： コントロール群（第１６図）は癌胞巣ン形成し、組織型
は髄様腺菅癌の像ぞ呈し、腫瘍細胞の増殖が組織全体に
見られる。これに対して薬剤投与群（第１７図）は、か
ってＮｈＩ￥ＩＢ胞の構築していた部位において、癌細
胞が融解・壊死におちいり、石灰化及び繊維化が起って
おり、一部わずかに癌細胞を残すのみであり、本発明の
抗癌剤の抗腫瘍性が認められた。

試験例６ 参考例５で侍たＧＲＡ−１−に−Ｔの１μｌマイクロプ
レート（ファルコン社製）にのせ室温１５分間靜装する
。これにＦｅ２（ギプコ社製）４μｅを加え、室温３０
分間靜装する。ｉ　ｘ　ｉ　ｏ９個／　ｍｌに５１２し
Ｔこ／イラミンダーゼ処理ヒツジ赤血ｇ　（５ＲＢＣＮ
）の０．８５　％　ＮａＣｊ？加［Ｊ、ＯＩＭ−リフｆ
ｌｌ緩衝液（ｐＨ＝　７−２　、）　５　μｌｊ　ｗ加
え、６　［Ｊ　Ｏｒｐｍで５分間プレートを遠心する。

プレート乞反転し、未反応の５ＲＢＣ”ｉ＜除き、染色
液（デＩＪ　ＩＪアント・クレツシルプルー、メルク社
製）乞加え、リンパ球を染色してロゼツト形成陽性を調
べた◎その結果、９８％以上がロゼツト形成陽性（Ｔ−
セル）を示した。

試験例４ 特異的癌細胞障害活性 （イ）標的ヒト癌細胞として参考例第１衣の細胞の中で
（）ＲＡ陽性率の異なる下記の５細胞株な用いた。

標的癌細胞扁 ｌ、ＢＴ−ｉ（バーキットリンパ腫） ２．　　Ｄａｕｄｉ　　（ｔｔ　　　　　　）３、　　
ＫＡＴＯ−１１１（胃癌） ４、　　ＭＫＮ−４５（ｔｔ　　） ５、　　ＭＯＬＴ　　　（Ｔ細胞性白血病）標的癌細１
＠５Ｘ１０’個／ウェル馨マイクロプレート（ファルコ
ン社製）に８０Ｏｒｐｍ、５分間遠心して＠層する。次
いで参考例５で得たＧＲＡ−１−に−Ｔ４ｘ１（ＩＪ固
／ウェル乞静かに添加して１時間インキュベートスル。

障害活性をゾターク形成の度合で下記により判定した◎ −１＋：障害活性が著しく認められる。

十二　　〃　　ン認める。

土：　　〃　　がわずかに認められる。

−：〃　　　が認められない。

同、コントロールとして前記参考例５においてＧＲＡを
一用いない以外は全く同様にして得た未感作ヒト末梢血
リンパ球を用いて行なった。結果を第６表に示す。

第６表により本発明方法により製造されるキラーセルの
ＧＲＡ特異的な強い細胞障害活性が明らかである。

第６表 （ロ）　前記（イ）と同じ標的癌細１＠３．２　Ｘ　１
０’個に対してＧＲＡ−１−に−Ｔ８Ｘ　１０５１固（
細胞比５：１）の計４　Ｘ　１０６ＩＩｉ５の細胞、を
、ＦＣ８１５％のＲＰＭＩ−１６４０培池で混合培養す
る。１時間後に残存細胞数Ｙカウントし障害率暑下記式
により痒定した。

結果Ｙ第７表に示す。

第７表 （ハ）（ロ）においてＧＲＡ−ｉ−に−Ｔと標的癌細胞
の比率′！ａｌ−５：３にする以外は同様にして障害率
を求めた。結果を第８表に示す。

以下余白 第８表 同、上記において、ｏＲＡ−１−に−ＴはＤａｕｄ　ｉ
、ＫＡＴＯ−１１１及びＢＴ−１に対し高い結合性を示
し、ＭＫＮ−４５及びＭＯＬＴには結合性の弱いことが
観察された。

試験例５ Ｃ３Ｈ／　Ｈｅ自然発生乳癌の担癌マウスに参考例６で
得たＧＲＡ−Ｍ−１−に−Ｔの３　Ｘ　１０’７０．５
ｍｅ／匹を経皮丁に６回／Ｗ隔日投与した。

１０日目上病巣を摘出し以下の病理所見ケ得た。

第１２図に示す様に、癌胞内にリンパ球が浸潤し、腫瘍
部の破壊が見られ、父第１６図からは、腫瘍部の石灰化
も見られ、本発明のキラーセルの抗腫瘍性が明らかに認
められた〇 比較例１ 本発明方法におけるＧＲＡの使用に替えて癌細胞自体を
特異抗原として用いた場合ケ以下に示す。

前記参考例５においてＧＲＡＯ替わりにＢ’ｌ’−１、
Ｄａｕｄｉ、ＫＡＴＯ−川及びＭＫＮ−４５１ｉ　１　
ｘ　１０５個／シャーレ用いる以外は全く同僚にして癌
細胞感作リンパ球馨得た。

このリンパ球の細胞障害活性を前記試験例４−（イ）と
同様にして調べた。結果を第９表に示す。

第９表より得られたリンパ球には全く細胞障害活性が認
められなかった。

以下余白 第９表 ゛試験例６ 前記参考例８で得た（）ＲＡ−８−に−Ｔ、ＧＲＡ−３
−Ａ−に−Ｔ及びＧＲＡ−３−Ｃ−に−’ｒの癌細胞障
傅活性を前記試験例４−（ロ）と同様にして試験した。

結果ケ第１０表に示す。

第１０表 試験例７ （ａ）　　前記参考例１０で得た各キラーセル乞５１Ｃ
ｒｌＪリーズテストにより細胞障害活性試験を行ツｒｔ
：　（Ｊ、　Ｉｍｎｎｕｎｏｌ、　１２２．２５２７−
２５３３）。

すなわち、放射性５１Ｃｒ（日本アイソトープ協会）　
５０　μｃｉ　Ｙ　ＫＡＴＯ−１ｌｌ　２　Ｘ　１０７
”＋’ｌＡに加え、３Ｔ０゜１時間培養した後、ＲＰＭ
Ｉ　−’ｖ６４０培地で十分に遠心洗浄して５１Ｃｒ標
識標的細胞（Ｔ１　Ｆ！：得る。該標的＋ＮｆｌＩＪ［
１ｌｌＸＩＣ１凸に上記キラーセル（エフェクターセル
：　Ｅ）　２　Ｘ　１０６個を加え（ｒ　＝　２０／１
）、３７℃にて４時間、ＲＰＭＩ　−１６４０培地中で
培養する。遠心して上清を採取して、その放射活性ケ液
体シンチレーションカウンターにて測定した。

エフェクターセルの細胞障害活性に相当するスペシフィ
ック５１Ｃｒリリーフ：″（鉤ヲ下記式にて算出したＯ スペシフィック５　ｌＣｒＣクリズ（＠＝（添加時の放
射活性）−（無添〃目時の放射活性）尚最大放射活性は
全細胞溶解時の放射活性ン示す。

結果を第１１表に示す。

第１１表 第１１衣よりキラーセルの誘導においては、ＴＣＧＦ或
はＦｅ２は無関係であることが判る。

（ｂｌ　　前記参考例７で傅たＧＲＡ−２−に−’Ｉ’
を上記１ａｌと同様にして５１Ｃｒリリーズテストによ
り試験した。標的細鴫’４”Ｃｒ−標ＲＫＡＴＯ−１１
１，１＝２０ハにて、スペシフィック５１Ｃｒリリーズ
が１４．６チであった。

試験例８ （ａ）　　前記参考例１ｌ−（ａｌで得た各キラーセル
の細胞障害活性試験を前記試験例４−（ロ）と同様にし
て、標的細＠ｙ　ＫＡＴＯ−１１１、Ｅ／Ｔ　＝　２０
　Ｋ　Ｌテｘ験した。

結果を第１２表に示す。

第１２辰 （ｂｌ　　前記参考例１ｌ−（ｂ）で得たＧＲＡ−３−
に−’ｒ−７’ａ＝前記試験例７と同様にして、（標的
細胞＝　”Ｏｒ　−ＫＡＴＯ−Ｉｌｌ、Ｂｙｚ２０／１
）試験した。

結果：スペシフイック５］、ＣＩＩリ−では２５．５チ
試験例９ 前記参考例９で得たキラーセルン前記試験例７と同様の
”Ｃｒ　’Ｊ　ＩＪ−ズテストにより試験した〇同、標
的細胞は同様にして５１ＣｒラベルしたＸ５５６３セル
を使用した。コントロールとして、前記参考例９におい
て、ＧＲＡ−Ｍ−５の替わりに？イトマイシｙｃ−処ｍ
ｘ５５６３１ａＩ＠（Ｘ５５６６セルの５Ｘ１０’／Ｌ
ｎ／にＭ　Ｍ　Ｃ５０μｇ／ｍｌｓ　６０　ｍｉｎ処理
）ＩＸ１０５／ウェル馨用いて、同様に感作して傅たリ
ンパ球馨おいた。

結果を第１３茨に示す。

第１６表 スペシフィック５１Ｃｒリリーズ帳） 試験例１０ 前記実施例２及び４モ得たＧＲＡ−Ｍ−１、（）ＲＡ−
Ｍ−３及びＧＲＡ−Ｍ−４馨夫々ＰＢＳ（０，８５％Ｎ
ａＣ１）で希釈して、希釈系列（サンプル）乞作成する
。標的細胞としてＢ　１０　（Ｈ−２ｂ　）及びＢ１０
・Ｂ　Ｒ（Ｈ−２ｋ）マウスより常法に従って得た牌細
胞又はリンパ腺細胞？使用する。仇−Ｈ−２血清（国立
遺伝学研究所より入手）と上記サンプル？混合し、４℃
で２時間培養する。

これに、使用した抗−Ｈ−２血清に対応する標的細＠を
卯える。細胞乞ＰＢＳで洗浄後、補体（ウサギ）乞加え
、６７℃で１時間培養し、０．２％トリバンプルーのＰ
ＢＳで染色して障害率（％）？測定した。

同、−上記において、仇−Ｈ−２血清はＧＲＡ不存在下
で９５％以上の障害率（％）を示す最高希釈培となる様
に使用しに０ このＧＲＡによる１１１（ヒ効来は、下記第１４表の系
について行った。

第１４表 以ト余白 上記第１５表より、ＧＲＡ−Ｍ−１、（）　ＲＡ、　−
Ｍ−３、及び、ＤＲＡ　−Ｍ　−４にはＨ−２がない事
がわかる。

試験例１１ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに同系由来のＬＬＣ２Ｘ１０６個
を皮肉移植して、６日後に前記実施例４で得７ＣＧ　Ｒ
Ａ　−Ｍ　−３，１ｎｇ（蛋白量）皮下投与し、以後１
日１回、４日間問責投与しＫ。最終投与の翌日に腫瘍細
胞乞摘出してその重量を測定した。コントロールとして
、生理食塩水投与群ケおき、％抑５匹試験した。

結果： コントロール群の平均腫瘍重量は約５００雫であった。

ＧＲＡ−Ｍ−３投与群においては６例が腫瘍の消失、２
例が平均約１００Ｉｎ９の腫瘍重量を示した◇ 試・喚例１２ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに前記実施例４で得几Ｇ　ＲＡ　
−Ｍ−ろ、１ｎ、ｇ（蛋白歇）　ｖ　ｉ日１回、６日間
皮下免疫し、５８目に牌細胞を採取してエフェクターセ
ルとする。Ｅ／Ｔ　（ＬＬＣ）：５０／１にして、その
ｌＸ１０”Ｙ同系マウスに移植してＷｊ、ｎｎ　ａｓｓ
ａｙ　’１行つ１．Ｈ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９
６１．８６．２２８−２３９） 結果を下記第１６表に示す。

第１６表 胞 ３群は正常マウスの牌細胞 ０群はＬ　Ｉ、　Ｃをｉ　ｘ　Ｉ　Ｑ６移植し定マウス
の１０日後の牌細胞 腫瘍増殖率（％）は下記式によって算出しに０×１００ 試験例１６ Ｃ３Ｈ／　Ｈｅマウスに前記実施例４で得たＧＲＡ−Ｍ
−４，５μｙ（蛋白量）をコンプリートフロインドアシ
ュパント０．１ｍｌと共に仙尾部に免疫した。２週間後
に常法により得たリンパ練絹＠を応答細胞としてＧ　Ｒ
Ａ　−Ｍ　−４による分裂状態を試験した。応答細胞４
　Ｘ　１０５個をＲＰＭＩ　−１６４０＋１５係ＦＣ８
培地でＧＲＡ−Ｍ−４の存在下に５日間培養した。培養
の最後の１８時間に１μＣ１の３Ｈ−チミジン（３Ｈ−
ＴｄＲ）を加え、その細胞内取り込みを調べた。

結果を下記第１７表に示す。

ｉ＾Ｌ　ｆｆ中、ステイミュレイションインデックス（
Ｓ、Ｉ　）は添２１１１群／無添刀０＃を示す。

第１７表 試験例１４ ０１７記試験例１３と同様にして得たＧＲＡ−Ｍ−４免
疫マウス及びＧ　ＲＡ、　−Ｍ　−５免疫マウスビ夫々
用いて、足跡反応（ＦＰＲ）により遅延型過敏症（ＤＴ
Ｈ）反応ンテストした。すなわち、ＧＲＡ又は前記試験
例９で説明したと同様にして得たＭＭＣ−処理−腫瘍細
胞を前記動物の後岐足植皮肉に接種ｌ−１接傭２４時間
後の足蹴の腫脹を測定し、接種前の測定直を引き１０−
２非単位で示して、ＤＴＨ反応の度合とし１こ。

結果２第１８〜２２衣に示す。

第１８表 １；同系正常牌細＠　１　ｘ　１０’　／　２０　μｌ
１Ｍ　（Ｈａｎｋｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）２；ＭＨ１
３４セル１ｘ１０６／２０μｌ液３；ｇ２０μｇ ４　　；　　ＧＲＡ−Ｍ−４，０，８μ！？（蛋白量）
／２０μｌ液５；　　　Ｉ／　　　　０．４μｙ　　　
　〃第１９表 １；溶Ｑ　（Ｈａｎｋｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）　２０
μ１２　；　ＧＲＡ−Ｍ−４，４μｇ（蛋白量）／２０
μｍ！！液３　＊　Ｇ　ＲＡ　−Ｍ　−５、〃 第２０表 １；溶７１１　（Ｈａｎｋｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）　
２０　μｌ２　；　ＧＲＡ−Ｍ−４，４μｙ（蛋白量）
／２０μｌ液第２１表 １；溶液（Ｈａｎｋｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）　２０μ
１２　；　ＧＲＡ−Ｍ−４，４μｇ（蛋白量）／２０μ
Ｉ’Ｑ３　；　ＧＲＡ−Ｍ−４製造時において、ＰＮＡ
−カラム暑素通りしたフラクション（以下１’−ｃ、ｐ
、Ｊと略す）の４μｇ（蛋白量）／２０μｅ液第２２表 ７；溶液（ＨＨｎｋｓ　５ｏｌｕｔｆｏｎ　）　２０　
ＡＩ！２　；　ＧＲＡ−Ｍ−４，５，８ｔｔｇＣｈ白ｃ
ｋ）／２０μｌｅ。

６；前記［ｃ、ｐ、Ｊ　３．８　μｇ（ｍ白ｔ）　／２
０　μｌｌ液４　；　ＧＲＡ−Ｍ−４，３，８μ９（蛋
白鎗）及びｒＣ，Ｐ、Ｊ　３．８１ｔｇ（蛋白ｔ）／２
ｏｌｔｍｇする。この免疫マウスより得た牌細胞馨エフ
ェクターセルとして、エフェクターセル１０７１１ｆｆ
ｉ、標的細！（ｘ５５６３）１ｏ５個’＜、−緒Ｋ　同
系−ｒウスに移植してＷｉｎｎ　ａｓｓａｙ　Ｙ行った
。結果２第２６図に示す。図中、タテ軸は平均腫脹サイ
ズ（Ｃｍ２　）±８．Ｅ、ヨコ軸は日ｅン、各マークは
次のとおりである。

←→；エフェクターセルを加えない群 ←−；エフェクターセル、無処置の群 Δ−Ｌ；エフェクターセル、補体（ウサｆ　）　処理群 ｘ−ｘ　；エフェクターセル、ｆｆ、　−Ｔｈｙ　１　
（ＮＥＷ　。

ＵＳＡ）及び補体処理群 ロー０；エフェクターセル、抗−Ｌｙｔ　１　（ＮＥＮ
　。

ＵＳＡ）及び補体処理群 ｌ−厘；エフェクターセル、抗−Ｌｙｔ　２　（ＮＥＷ
　。

ＵＳＡ　）及び補体処ｍ群 第２６図より、腫瘍免疫の生体内機構におけるＬｙｔ　
−１ｆＪのＴ〜セルの重要性がわかる。

同、ＤＴＨ反応は、Ｌｙｔ　−１−Ｔ−セルにより介在
される。（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１９７６、Ｖｏ
ｌ。

１４６、ｐ１５３４−３９］。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤａｕｄ　ｉ癌細胞の写真、第２図は同癌細胞
のＧＲＡ−１−に−Ｔによるゾターク形成ケ示す写真、
第６図はＫＡＴＯ−ＩＩＩ　Ｓ細胞の写真、第４図は同
癌細胞）のＧＲＡ−１−に−Ｔによるプラーク形成な示
す写真、第５図はＥＴ−１癌細胞の写真、第６図は同癌
細胞のＧＲＡ−１−に−Ｔによるプラーク形成を示す写
真、第７図はＭＫＮ−４５癌細胞の写真、第８図は同癌
細胞のＧＲＡ−１−に−Ｔによるプラーク形成乞示す写
真、第９図はＭＯＬ’ｌ’癌細胞の写真、第１０図は同
癌細胞のＧｉＡ−１−に−Ｔによるプラーク形成乞示す
写真、第１１図は未感作ヒト末梢血リンパ球の混合物で
処理したＢＴ−１癌細胞の写真、第１２図及び第１３肉
は担癌マウスにＧＲＡ−Ｍ−１−に−Ｔン投与したとき
の癌細胞組織の写真である。 第１４図は担癌マウスのＧＲＡ−Ｍ−１投与群の尚の状
態を示す写真、第１５図は担癌マウスの無投与群の癌の
状態２示す写真、第１６図は同無投与群の癌細胞組織の
写真、第１７図は同投与群の癌細胞組織の写真である。 第１８及び１９図は、ＧＲＡ−Ｍ−３、ＧＲＡ−７、Ｇ
ＲＡ−１及びＧＲＡ−２のＳＤ８／７”／Ｌ／電気泳動
を示す写真、第２０図はＧＲＡ、−Ｍ−２、ＧＲＡ−６
、及びＧＲＡ−５０ＳＤＳ’ｙ”ルｌｌ気泳動ン示す写
真、第２１図はＧＲＡ−Ｍ−４及びａＲＡ−Ｍ−５０Ｓ
Ｄｓｒ）Ｌ／電気泳動乞示す写真、第２２図は、ＧＲＡ
−３、ＧＲＡ−３−Ａ、ＧＦｔＡ−３−Ｂ及びＧＲＡ−
３−Ｃ’のＳＤＳデル電気泳動Ｙ示す図面である。第２
３図はＸ５５６３免疫マウスの牌細胞をエフェクター細
胞とするＷｉｎｎａｓ　ｓａｙの結果を示す図面である
。 以上 出願人　株式会社　日本抗体研究所 第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 第７図 第８図 旭９図 第１１図 第１２図 第１３図 第１４図 第１６図 第１７図 第１８図　　　　第１９図 第２０図 第２１図 １　　２　　　　　　５ 第２２図 １２３４ 第２３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　Ｎｈ屏１１胞膜成分から単離されかつ末端ガラ
   クト一ス又は末端Ｎ−アセチルガラクトサミンと特異的
   に結合するレクチンと結合する性質を有する癌細胞由来
   糖鎖関連抗原。 ２、癌細胞膜成分から、末端ガラクトース又は末端Ｎ−
   アセチルガラクトサミンと特異的に結合するレクチンと
   結合する性質を有する癌細胞・由来糖知関連抗原を単離
   することを特命とする癌剥１胞由来糖鎖関連抗原の製造
   法。