KR101642587B1 - 바이구아나이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

바이구아나이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 바이구아나이드(biguanide) 유도체 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 바이구아나이드계 유도체 화합물은 염증성 사이토카인인 IL-17 및 TNF-α의 생성을 억제시키며, 면역조절 기능을 갖는 조절 T 세포의 활성을 증대시킬 뿐만 아니라, 면역질환 동물모델에 대해 우수한 치료 효과를 나타낸다. 따라서 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바이구아나이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of immune diseases or inflammatory disease comprising biguanide derivative compounds}
본 발명은 면역질환 또는 염증질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 바이구아나이드(biguanide) 유도체 화합물에 관한 것이다.
면역질환은 면역계의 구성성분들이 병리상태를 야기하거나, 매개 또는 기타 공헌하는 질환을 의미하는데, 특히 염증성 장애는 전 세계적으로 가장 중요한 건강 문제 중 하나이다. 염증은 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극에 의한 숙주 침입에 대한 신체 조직의 국소화된 보호 반응을 말한다. 염증의 원인으로는 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인; 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인; 독소, 약물 또는 산업적 제제와 같은 화학약품; 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역적 반응, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태 등이 있다.
염증은 통증, 적화현상, 부기, 열 및 감염된 영역의 궁극적인 기능 손실 등의 증상을 그 특징으로 한다. 이들 증상은 면역계의 세포 사이에서 일어나는 일련의 복잡한 상호작용의 결과이다. 세포의 반응으로 인해 결과적으로 여러 그룹의 염증 매개자[단백질(예를 들면, 사이토카인, 효소(예를 들면 프로테아제, 퍼옥시다제), 주요 염기성 단백질, 점착 분자(ICAM, VCAM), 지질 매개자(예를 들면, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 류코트라이엔, 혈소판 활성화 인자(PAF)), 반응성 산소 종(예를 들면, 하이드로퍼옥사이드, 슈퍼옥사이드 음이온 O2 -, 산화질소(NO) 등)]의 상호작용 네트워크가 생성된다. 그러나 이들 매개자 중 대부분은 또한 정상적인 세포 활성의 조절자이다. 따라서 염증 반응의 결핍으로 인해 숙주가 제어되지 않으면서 손상(즉, 감염)되고, 따라서 만성 염증으로 인해 부분적으로는 상기 언급된 매개자 중 여럿이 과다 생성됨으로써 매개되는 염증성 질환이 야기된다.
또한, 면역질환 중 하나인 자가면역 질환은 면역 체계가 그 자신의 기관을 공격하여 자발적인 반응을 일으키는 것을 특징으로 한다. 이러한 반응들은 T 림프구에 의한 자가항원(auto-antigen)의 인식에 기인하며, 이로 인하여 체액상(자가항원 생성) 및 세포상(림프구 및 대식세포 세포독성 활성 증가) 면역 반응이 유발된다. 자가면역 질환으로는 류마티스성 질환, 건선, 전신성 피부근염, 다발성 경화증, 홍반성 낭창, 또는 항원에 의한 면역반응 악화, 즉, 천식, 약물 또는 음식에 대한 알레르기 등이 있다. 이러한 질환들은 모두 제한성이고 만성인 질환들이며, 경우에 따라서는 치명적이고, 현재까지 상기 질환들을 치료할 수 있는 효과적인 치료 방법이 존재하지 않는 실정이다. 그러므로 당해 질환의 진행 중에 질환을 경감시키거나 완화시킬 수 있는 약물, 의약 또는 매체라면 환자의 건강을 위해서 중요한 해결 수단이 된다고 할 것이다.
자가면역 질환의 치료방법을 탐색하여 적당한 약물과 방법을 찾고자 집중적인 노력을 해왔다. 오늘날 자가면역 질환의 치료는 주로 면역억제 약물, 예컨대 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitors) 및 증식억제제-대사물 작용 억제제(antiproliferatives-antimetabolites)의 사용을 기반으로 한다. 그러나 이와 같은 약물은 다양한 표적들에 대하여 작용하므로 전체적으로는 면역기능을 저하시킬 수 있다. 또한, 이러한 약리 요법을 장기간 사용할 경우 여러 세포 독성 작용이 나타날 수 있으며, 면역 체계를 비특이적인 방식으로 억제함으로써 환자를 감염증 또는 암에 걸리게 할 수 있다. 칼시뉴린과 글루코코르티코이드는, 그들의 신독성과 당뇨병 유발 특성에 기인하여 또 다른 문제점을 나타내기 때문에, 몇 가지 임상학적 증상의 경우(예: 신기능 부전, 당뇨병 등)에는 그 사용이 제한된다.
따라서 자가면역질환, 염증질환 등과 같은 면역질환을 치료할 수 있는 물질로서, 부작용이 없으면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 인체 부작용이 적으면서 면역질환 또는 염증질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 소재를 모색하던 중, 다양한 종류의 바이구아나이드계 유도체 화합물을 합성하고 그 활성을 확인한 결과, 염증성 사이토카인인 IL-17 및 TNF-α의 생성을 억제시키며; 면역조절 기능을 갖는 조절 T 세포의 활성을 증대시킬 뿐만 아니라; 염증성 장질환 동물모델 및 급성 이식편대숙주질환 동물모델에 본 발명의 바이구아나이드계 유도체 화합물을 적용하는 경우 in vivo 상에서 치료 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2013-0069737호
따라서 본 발명의 목적은 인체 부작용이 적으면서 면역질환 또는 염증질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 바이구아나이드(biguanide) 유도체 화합물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
바이구아나이드 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이구아나이드 유도체 화합물은 1-(3,5-디메톡시페닐)바이구아나이드, 1-(4-(펜틸옥시)바이구아나이드, 1-(4-이소프로필페닐)바이구아나이드, 1-(2-플루오로페닐)바이구아나이드, 1-(3-이소프로필페닐)바이구아나이드, 1-(4-이소프로폭시페닐)바이구아나이드, 1-(3,5-디메톡시페닐)바이구아나이드, 1-(2-클로로페닐)바이구아나이드, 1-(4-플루오로페닐)바이구아나이드, 1-(3-트리플루오로메틸페닐)바이구아나이드, 1-(3-플루오로페닐)바이구아나이드, 1-(2,4-디플루오로페닐)바이구아나이드, 1-(2,3,4-트리풀루오로페닐)바이구아나이드, 1-(2,5-디플루오로페닐)바이구아나이드, 1-페네틸바이구아나이드, 1-사이클로헥실바이구아나이드, 1-알릴바이구아나이드, 1-벤질바이구아나이드, 1-(3,4-디플루오로벤질)바이구아나이드, 1,1-디프로필바이구아나이드, 1-이소프로필바이구아나이드 및 1,1-디에틸바이구아나이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이구아나이드 유도체 화합물은 염증성 사이토카인의 생성을 감소 또는 억제시키는 기작을 통해 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-17 또는 TNF-α일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이구아나이드 유도체 화합물은 조절 T 세포(Regulatory T cell)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 기작을 통해 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이구아나이드 유도체 화합물은 조성물에 1μM ~ 1000μM의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성면역질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증성면역질환은 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이식거부질환은 이식편대숙주질환(Graft versus host disease)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 베체트병, 다발성 근육염, 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염, 이식편대숙주질환 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증질환은 위염, 장염, 신장염, 간염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, PGE 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염 및 습진으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 개체를 대상으로 체중 kg 당 1 ~ 100mg(전임상 마우스 동물모델 기준)의 양으로 투여할 수 있다.
본 발명의 바이구아나이드계 유도체 화합물은 염증성 사이토카인인 IL-17 및 TNF-α의 생성을 억제시키며, 면역조절 기능을 갖는 조절 T 세포의 활성을 증대시킬 뿐만 아니라, 여러 면연질환 동물 모델에 대해 우수한 치료 효과를 나타내므로, 각종 면역반응의 조절 이상으로 인해 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환 또는 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 마우스로부터 분리한 비장세포를 대상으로 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 농도별(2, 20, 200 μM) 처리에 따른 세포 내 IL-17 생성량을 sandwich ELISA 방법으로 분석한 결과이다(A : SD-196, B : SD-216, C : SD-217).
도 2는 마우스로부터 분리한 비장세포를 대상으로 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 농도별(2, 20, 200 μM) 처리에 따른 세포 내 TNF-α 생성량을 sandwich ELISA 방법으로 분석한 결과이다(A : SD-196, B : SD-216, C : SD-217).
도 3은 염증성 장질환 동물모델을 대상으로 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물 투여에 따른 몸무게 변화를 관찰한 결과이다. A 내지 C는 몸무게 g의 변화를 측정한 결과이며(A : SD-196, B : SD-216, C : SD-217), D 내지 F는 몸무게 %의 변화를 측정한 결과이다(D : SD-196, E : SD-216, F : SD-217).
도 4는 염증성 장질환 동물모델을 대상으로 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물 투여에 따른 대장조직 내 염증에 의한 조직 손상 정도를 면역조직화학염색법을 통해 관찰한 결과이다.
도 5는 염증성 장질환 동물모델을 대상으로 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물 투여에 따른 대장조직에서의 세포 내 TNF-α 발현정도를 면역조직화학염색법을 통해 관찰한 결과이다.
도 6은 동종반응(alloresponse)을 유도시킨 비장세포를 대상으로 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 처리하고 T 세포 증식정도를 측정하여 상기 유도체 화합물의 동종반응 억제 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다(A : SD-196 화합물 처리결과, B : SD-216 화합물 처리결과, C : SD-217 화합물 처리결과).
도 7은 동종반응을 유도시킨 비장세포에 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 처리하고 Treg 세포(Foxp3+CD25+ Treg cell)의 발현 정도를 FACS 분석을 통해 확인한 그래프를 나타낸 것(A)이고, Treg 세포(Foxp3+CD25+ Treg cell)수를 그래프로 정량화한 결과를 나타낸 것(B)이다.
도 8은 급성 이식편대숙주질환 동물모델을 대상으로 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 투여한 후 시간 경과에 따른 동물의 생존율을 측정한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 관절염 치료 효과를 평가하기 위하여 류마티스 관절염 동물 모델에서 세포독성(MTT assay)(A), IgG 생성(B), IL-17 및 TNF-α 염증성 사이토카인(C)을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 관절염 치료 효과를 평가하기 위하여 류마티스 관절염 동물 모델에서 조절 T 세포(Treg) 발현을 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 관절염 치료 효과를 평가하기 위하여 류마티스 관절염 동물 모델에서 파골세포 분화(TRAP 염색)를 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 대사증후군을 동반한 류마티스관절염의 치료 효과를 평가하기 위하여 동물모델에서 세포독성(MTT assay)(A), IL-17 염증성 사이토카인(B) 발현을 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 대사증후군을 동반한 류마티스관절염의 치료 효과를 평가하기 위하여 동물모델에서 Th17 및 조절 T 세포(Treg) 발현을 측정한 결과이다.
도 14는 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 루푸스 치료 효과를 평가하기 위하여 루푸스 동물 모델에서 세포독성(MTT assay)(A), IgG 생성(B), IL-17 및 TNF-α 염증성 사이토카인(C) 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 15는 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 루푸스 치료 효과를 평가하기 위하여 루푸스 동물 모델에서 Th17 활성 변화를 측정한 결과이다.
도 16은 정상인 세포에서 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 세포독성(MTT assay)(A) 및 TNF-α 염증성 사이토카인 발현 변화(B)를 측정한 결과이다.
본 발명은 바이구아나이드(biguanide) 유도체 화합물이 면역 조절작용을 통해 면역질환 또는 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있음을 최초로 규명하였으며, 따라서 바이구아나이드 유도체 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명의 상기 바이구아나이드 유도체 화합물은 1-(3,5-디메톡시페닐)바이구아나이드, 1-(4-(펜틸옥시)바이구아나이드, 1-(4-이소프로필페닐)바이구아나이드, 1-(2-플루오로페닐)바이구아나이드, 1-(3-이소프로필페닐)바이구아나이드, 1-(4-이소프로폭시페닐)바이구아나이드, 1-(3,5-디메톡시페닐)바이구아나이드, 1-(2-클로로페닐)바이구아나이드, 1-(4-플루오로페닐)바이구아나이드, 1-(3-트리플루오로메틸페닐)바이구아나이드, 1-(3-플루오로페닐)바이구아나이드, 1-(2,4-디플루오로페닐)바이구아나이드, 1-(2,3,4-트리풀루오로페닐)바이구아나이드, 1-(2,5-디플루오로페닐)바이구아나이드, 1-페네틸바이구아나이드, 1-사이클로헥실바이구아나이드, 1-알릴바이구아나이드, 1-벤질바이구아나이드, 1-(3,4-디플루오로벤질)바이구아나이드, 1,1-디프로필바이구아나이드, 1-이소프로필바이구아나이드 및 1,1-디에틸바이구아나이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 화합물의 화학식은 아래 표 1에서 자세히 나타내었다.
본 발명 바이구아나이드 유도체 화합물의 화학식
유도체
번호		 화학식 유도체
번호		 화학식
1
Figure 112014080646238-pat00001
 12
Figure 112014080646238-pat00002
2
Figure 112014080646238-pat00003
 13
Figure 112014080646238-pat00004
3
Figure 112014080646238-pat00005
 14
Figure 112014080646238-pat00006
4
Figure 112014080646238-pat00007
 15
Figure 112014080646238-pat00008
5
Figure 112014080646238-pat00009
 16
Figure 112014080646238-pat00010
6
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 17
Figure 112014080646238-pat00012
7
Figure 112014080646238-pat00013
 18
Figure 112014080646238-pat00014
8
Figure 112014080646238-pat00015
 19
Figure 112014080646238-pat00016
9
Figure 112014080646238-pat00017
 20
Figure 112014080646238-pat00018
10
Figure 112014080646238-pat00019
 21
Figure 112014080646238-pat00020
11
Figure 112014080646238-pat00021
 22
Figure 112014080646238-pat00022
본 발명자들은 면역질환 치료를 위한 새로운 면역 조절제를 개발하기 위해 바이구아나이드 유도체 화합물에 주목하였으며, 하기 실험을 통해 본 발명의 바이구나이드 유도체 화합물이 면역을 효과적으로 조절할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 하기 실시예 2에서는 바이구아나이드 유도체 화합물이 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 ELISA 분석을 통해 IL-17의 발현 정도를 측정하였으며, 그 결과 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 처리하는 경우 IL-17 생성량이 두드러지게 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
또한, 본 발명의 하기 실시예 3에서는 바이구아나이드 유도체 화합물이 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 ELISA 분석을 통해 TNF-α의 발현 정도를 측정하였으며, 그 결과 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 처리하는 경우 TNF-α의 생성량이 매우 두드러지게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
한편, 염증성 사이토카인인 IL-17 및 TNF-α의 경우 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)에서 크게 증대되는 것으로 알려져 있다.
IBD는 그 원인이 알려지지 않은 만성적이고 재발하기 쉬운 질병으로 백만명 이상의 미국인과 전 세계적으로는 수백만명의 사람들이 이 병을 앓고 있다. IBD는 환자집단의 큰 부분에서 만성적 질환의 일반적인 원인이다. IBD는 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohns disease)의 두 가지 상이한 형태로 나타난다. 이 두 가지 상태는 임상적으로는 매우 유사해 보이지만, 궤양성 대장염은 주로 상부 위장관과 반대되는 결장과 직장의 염증을 수반한다. 한편, 크론병은 상부 내장의 소화관의 더 큰 부위에 영향을 미치므로, 흡수불량과 만성적 비타민 및 영양 결핍을 야기할 가능성이 더 크다. IBD를 앓는 사람들은 만성적인 내장 염증, 설사, 출혈, 복부 통증, 열, 관절 통증, 및 체중감소와 같은 특성을 갖는 증상을 겪는다. 이러한 증상은 경한 것에서부터 중한 것까지 여러 가지이다. IBD는 처음에는 가벼운 불편에서부터 점차적으로 그리고 자신도 모르는 사이에 발전될 수도 있고, 갑자기 급성으로 나타날 수도 있다.
따라서 본 발명자들은 실시예 2 및 실시예 3을 통해, 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물 처리에 따른 염증성 장질환 관련 사이토카인(IL-17 및 TNF-α) 생성량/발현량 감소를 in vitro 상에서 확인하였는바, 실제로 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물이 염증성 장질환을 치료하는 효과가 있는지를 살펴보았다.
본 발명의 하기 실시예 4에서는 DSS(dextran sodiumsulfate)를 이용 염증성 장질환 동물모델을 제작하고, 여기에 바이구아나이드 유도체 화합물을 적용(투여)한 결과 염증성 장질환 동물모델의 몸무게가 유의하게 개선되는 것을 확인하였다(도 3 참조). 이와 더불어 염증성 장질환 동물모델에 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 적용(투여)한 결과, 마우스의 대장조직에서 세포 염증정도가 감소되면서 대장 조직 내의 손상이 적고 세포의 침투가 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
또한, 위 결과를 바탕으로, 다른 면역질환인 류마티스 관절염 및 루푸스 동물 모델에서도 유사한 실험을 진행하여, 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물이 염증성 사이토카인인 IL-17 및 TNF-α의 발현을 현저히 감소시키며, 자가항체(IgG) 생성 억제 효과 등을 나타내는 것을 확인하였다(도 9 내지 15 참조).
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물이 염증성 사이토카인(IL-17 및 TNF-α) 생성량/발현량을 효과적으로 감소시키는 등의 기작을 통해 면역질환을 치료할 수 있음을 입증하였다.
또한, 본 발명의 하기 실시예 5에서는 바이구아나이드 유도체 화합물의 Alloresponse 억제 효과를 살펴보았으며, 그 결과 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 처리하는 경우 Alloresponse가 두드러지게 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
또한, 본 발명의 하기 실시예 6에서는 바이구아나이드 유도체 화합물의 조절 T 세포(regulator T cell, 이하 간략하게 'Treg'로 약칭함)의 활성에 미치는 영향을 살펴보았으며, 그 결과 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 처리하는 경우 Treg 세포의 활성이 두드러지게 증대되는 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
또한, 본 발명의 하기 실시예 7에서는 급성 이식편대숙주질환을 제작하고, 여기에 바이구아나이드 유도체 화합물을 적용(투여)에 따른 실제로 질환의 개선 또는 치료 효과가 있는지 여부를 조사하였으며, 그 결과 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 처리하는 경우 급성 이식편대숙주질환이 유도된 마우스들의 생존이 현저하게 증대되는 것을 확인할 수 있었다(도 8 참조).
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 경우 Alloresponse를 억제시키고 Treg 세포의 활성을 증대시키는 기작을 통해 면역을 조절하는 효과가 우수하여, 면역질환의 한 종류로서 이식편대숙주질환을 치료할 수 있음을 실험을 통해 입증하였다.
또한, 사람의 세포를 대상으로 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 세포독성 및 염증성 사이토카인 억제 효과를 실험한 결과, 상기 결과와 마찬가지로 세포독성은 나타나지 않았으며, 염증성 사이토카인을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 16 참조).
그러므로 본 발명은 바이구아나이드 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물은 상기 표 1에서 나타낸 화학식 1 내지 22로 표시되는 화합물로부터 선택되는 1종 이상의 화합물일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화학식으로 표시되는 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 "면역질환"은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.
또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.
그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 "자가면역질환"이라고 한다.
또한, "염증질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.
한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 주조직적합성분자는 당단백 항원의 종류에 따라 결정되는데, 조직적합항원이 일치하지 않아서 일어나는 면역반응은 성공적인 이식을 가로막는 장애가 되고 있어, 조직적합항원 검사의 정확성과 일치 여부의 조사는 매우 중요한 요소이다.
사람에게는 여러 종류의 조직적합항원이 있는데, 그 중 HLA-A, -B,-C를 포함하는 Class I 항원이 있고, HLA-DR,-DP, -DQ를 포함하는 Class II 항원이 있다. 이들 항원의 생물학적 기능은 T 림프구에게 항원을 전달하며, Class I 항원은 대부분의 유핵세포에서 발현되며 이를 통해 전달되는 항원들은 CD8+ 세포독성 T 림프구에 의해 인식된다. Class II 항원은 항원제시세포로 알려진 수지상세포, B 림프구, 활성화된 T 림프구, 큰포식세포 등에서 발현되며, CD4+ T 림프구에게 항원을 전달하는 기능을 한다. T 림프구에 전달된 항원들은 T 림프구 수용체에 결합함으로써 T 림프구가 항원을 인식하게 되는데 이식하는 과정에서 자신의 것이 아닌 다른 사람으로부터 유래한 조직적합항원을 높은 빈도로 인식하게 된다. 공여자 또는 환자의 전체 T 림프구 중 1~10% 정도가 환자 또는 공여자로부터 유래한 조직적합항원을 인식하여 이에 대한 반응으로 증식하게 되고, 일련의 면역반응을 일으키게 되는데 이를 "동종반응(Alloresponse)"라고 한다. 또한 공여자의 T 림프구가 환자의 조직적합항원에 대하여 면역반응을 일으키는 것을 이식편대숙주질환(GVDH)"라고 하며, 반대로 환자의 T 림프구가 공여자의 조직적합항원에 대하여 일으키는 반응을 이식거부반응(graft rejection)"이라고 한다.
따라서 이식 과정에서 발생하는 면역반응에 의한 비정상적인 반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.
또한, 본 발명에서 상기 면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 베체트병, 다발성 근육염, 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염, 이식편대숙주질환 및 비만 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 염증질환은 위염, 장염, 신장염, 간염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, PGE 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염 및 습진 등을 포함할 수 있다.
그러므로 본 발명에 따른 상기 조성물은 면역질환 또는 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
상기 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,
(3) 면역질환을 경감시킴,
(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및
(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)
본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 화학식1 내지 22로 표시되는 화합물(상기 표 1 참조) 중 1종 이상의 화합물 또는 그의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환 또는 염증질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 바이구아나이드 유도체 화합물 또는 그의 염의 약학적으로 유효한 양은 면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명은 또한, 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 상기 바이구아나이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 바이구아나이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 포유동물에게 치료상 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
본 발명에 따른 바이구아나이드(biguanide) 유도체 화합물의 합성 및 제조
하기 표 1의 화학식으로 표시되는 바이구아나이드(biguanide) 유도체 1 내지 유도체 22를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
1. SD-000170, SD-000179, SD-000180, SD-000181 합성: 해당하는 각 아닐린을 아세토 나이트릴에 녹인 후 1M의 염산을 1당량만큼 첨가하였다. 그리고 다이사이아노 다이아마이드를 첨가한 후에 반응물을 100℃까지 가열 후, 결정상태의 물질을 걸러내었다.
2. SD-000171, SD-000172, SD-000173, SD-000174, SD-000175, SD-000177, SD-000178 합성: 각 아닐린을 아세토 나이트릴에 녹인 후 1M의 염산을 1당량만큼 첨가하였다. 그리고 다이사이아노 다이아마이드를 첨가한 후에 반응물을 100℃까지 가열 후 칼럼크로마토그래피를 통하여 정제하였다.
3. SD-000216, SD-000217, SD-000218, SD-000219 합성: 해당하는 각 아닐린을 아세토 나이트릴에 녹인 후 진한염산을 1당량만큼 첨가하였다. 그리고 다이사이아노 다이아마이드를 첨가한 후, 반응물을 175℃까지 가열 후, 결정상태의물질을 걸러내었다.
4. SD-000176, SD-000196 합성: 해당하는 각 아닐린을 아세토 나이트릴에 녹인 후 진한염산을 1당량만큼 첨가하였다. 다이사이아노 다이아마이드를 첨가 후, 반응물을 170℃까지 가열 결정상태의 물질을 걸러 내었다.
5. SD-000183 SD-000184 SD-000198 합성: 해당하는 각 아닐린을 아세토 나이트릴에 녹인 후 진한염산을 1당량만큼 첨가하였다. 다이사이아노 다이아마이드를 첨가한 후 반응물을 150℃까지 가열 후 남은 결정상태의물질을 걸러내었다.
6. SD-000195 합성: 해당하는 아닐린(아민)을 아세토 나이트릴에 녹인 후 진한염산을 1당량만큼 첨가하였다. 그리고 다이사이아노 다이아마이드를 첨가한 후 반응물을 140℃까지 가열 결정상태의물질을 걸러내었다.
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물 22종
번호 화합물 코드 화합물 구조 화합물 이름
1 SD-000170
Figure 112014080646238-pat00023
 1-(3,4-methylenedioxyphenyl)biguanide
2 SD-000171
Figure 112014080646238-pat00024
 1-(4-(pentyloxy)phenyl)biguanide
3 SD-000172
Figure 112014080646238-pat00025
 1-(4-isopropylphenyl)biguanide
4 SD-000173
Figure 112014080646238-pat00026
 1-(2-Fluorophenyl)biguanide
5 SD-000174
Figure 112014080646238-pat00027
 1-(3-isopropylphenyl)biguanide
6 SD-000175
Figure 112014080646238-pat00028
 1-(4-isopropoxyphenyl)biguanide
7 SD-000177
Figure 112014080646238-pat00029
 1-(3,5-Dimethoxyphenyl)biguanide
8 SD-000178
Figure 112014080646238-pat00030
 1-(2-chlorophenyl)biguanide
9 SD-000179
Figure 112014080646238-pat00031
 1-(4-fluorophenyl)biguanide
10 SD-000180
Figure 112014080646238-pat00032
 1-(3-trifluoromethylphenyl)biguanide
11 SD-000216
Figure 112014080646238-pat00033
 1-(3-fluorophenyl)biguanide
12 SD-000217
Figure 112014080646238-pat00034
 1-(2,4-difluorophenyl)biguanide
13 SD-000218
Figure 112014080646238-pat00035
 1-(2,3,4-trifluorophenyl)biguanide
14 SD-000219
Figure 112014080646238-pat00036
 1-(2,5-difluorophenyl)biguanide
15 SD-000181
Figure 112014080646238-pat00037
 1-phenethylbiguanide
16 SD-000176
Figure 112014080646238-pat00038
 1-cyclohexylbiguanide
17 SD-000182
Figure 112014080646238-pat00039
 1-allylbiguanide
18 SD-000183
Figure 112014080646238-pat00040
 1-benzylbiguanide
19 SD-000184
Figure 112014080646238-pat00041
 1-(3,4-difluorobenzyl)biguanide
20 SD-000195
Figure 112014080646238-pat00042
 1,1-dipropylbiguanide
21 SD-000196
Figure 112014080646238-pat00043
 1-isopropylbiguanide
22 SD-000198
Figure 112014080646238-pat00044
 1,1-diethylbiguanide
< 실시예 2>
본 발명에 따른 바이구아나이드 유도체 화합물들의 IL -17 억제 효과
본 발명의 바이구아나이드(biguanide) 유도체 화합물이 병원성 세포인 Th17세포에서 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 증가시키는 활성이 있는지를 확인하기 위하여, ELISA 분석을 통해 IL-17의 발현 정도를 측정하였다.
<2-1> 세포 준비
C57BL/6(오리엔트社, 한국) 정상마우스부터 비장(spleen)세포를 수득하였다. 즉, 마우스로부터 적출된 비장은 유리 슬라이드를 이용하여(teasing slide) 비장 조직을 잘게 갈은 후 적혈구 용혈 용액으로 비장내의 적혈구를 제거하였다, 이후 PBS 완충 용액을 첨가하고 원심 분리하여 세척함으로써 비장세포를 수득하였다.
<2-2> IL-17 사이토카인 측정
상기 실시예<2-1>을 통해 준비한 마우스로 비장세포 1×106을 anti-CD3 항체가 0.5g/mL로 코팅(coating) 처리된 24 웰 플레이트에 분주하고, Th17세포를 자극시킬 수 있는 조건인 anti-CD28 항체 1μg/mL, TGF-β 2ng/ml, IL-6 20ng/ml, anti-IL-4 2μg/ml, anti-IFNr 2μg/ml를 동시에 함께 처리한 후, 3일 동안 세포를 배양하여 Th17 세포 분화를 유도하였다. 이때, 상기 세포에 본 발명의 바이구아나이드(biguanide) 유도체 화합물(SD-000196: 1-isopropylbiguanide, SD-000216: 1-(3-fluorophenyl)biguanide, SD-000217: 1-(2,4-difluorophenyl)biguanide) 각각을 2μM, 20μM, 200μM의 농도로 처리하여 배양하였다. 양성대조군은 현재 시중에서 당뇨치료제로 사용되고 있는 바이구아나이드계 화합물인 메트포민(metformin)을 본 발명의 화합물 대신 사용하였다.
생성된 IL-17 사이토카인의 양을 측정하기 위하여, 세포가 배양된 상층액을 모아 sandwich ELISA를 이용하여 IL-17 발현 정도를 조사하였다. 이를 위해 먼저 96웰 플레이트에 단클론성 항-IL-17을 2μg/mL으로 4℃에서 밤새 반응시킨 후, 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. IL-17 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 standard로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, biotinylated 항-IL-17을 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4회 세척한 다음, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, PNPP/DEA 용액을 넣고 발색한 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 병원성 세포인 Th17 세포로부터 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-17은 바이구아나이드(biguanide) 유도체 화합물을 200μM의 농도로 처리하는 경우 생성량이 두드러지게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 SD-000196(1-isopropylbiguanide) 화합물의 경우 처리 농도에 의존적으로 IL-17 생성량이 감소되는 것으로 나타났으며, 200μM의 농도에서는 IL-17의 생성을 완전히 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 1A참조).
< 실시예 3>
본 발명에 따른 바이구아나이드 유도체 화합물들의 TNF -α 억제 효과
현재 시중에서 당뇨치료제로 사용되고 있는 메트포민(metformin)은 염증성 사이토카인인 TNF-α를 차단하는 효과가 미미한 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명의 바이구아나이드(biguanide) 유도체 화합물이 TNF-α의 생성을 감소시키는 활성이 있는지를 확인하기 위하여, ELISA 분석을 통해 TNF-α의 발현 정도를 측정하였다.
먼저, 상기 실시예<2-1>을 통해 준비한 마우스 비장세포 1×106에 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물(SD-000196: 1-isopropylbiguanide, SD-000216: 1-(3-fluorophenyl)biguanide, SD-000217: 1-(2,4-difluorophenyl)biguanide)을 2μM, 20μM, 200μM의 농도로 처리하고 이와 함께 LPS(lipopolysaccharide)를 100ng/ml 농도로 처리하여 37℃ 인큐베이터에서 3일 동안 배양하면서 비장세포에서 염증반응을 유도하였다. 양성대조군은 현재 시중에서 당뇨치료제로 사용되고 있는 바이구아나이드계 화합물인 메트포민(metformin)을 본 발명의 화합물 대신 사용하였다.
생성된 TNF-α 사이토카인 양을 측정하기 위하여, 세포가 배양된 상층액을 모아 ELISA를 이용하여 TNF-α의 생성정도를 조사하였다. 96웰 플레이트에 단클론성 anti-TNF-α을 2μg/mL으로 4℃에서 밤새 반응시키며, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. TNF-α recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 standard로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, biotinylated anti-TNF-α를 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4회 세척한 다음, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, PNPP/DEA 용액을 넣고 발색한 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, LPS만을 처리한 경우와 비교하여 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물를 처리한 실험군에서 TNF-α의 생성량이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, SD-000216(1-(3-fluorophenyl)biguanide) 및 SD-000217(1-(2,4-difluorophenyl)biguanide) 화합물을 처리한 실험군에서 TNF-α의 생성량이 매우 두드러지게 감소하는 것으로 나타났다.
<실시예 4>
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 염증성 장질환 치료 효과 분석
<4-1> 염증성 장질환 동물모델에 본 발명의 화합물 적용 후 무게변화 측정
하기 표 3에서 보는 바와 같이, 실험동물(C57BL/6, 6주령)을 4개의 실험군으로 나누고 3.5% DSS(dextran sodiumsulfate)를 4일간 급여하여 염증을 유발한 후, 본 발명에 따른 바이구아나이드 유도체 화합물(SD-000196: 1-isopropylbiguanide, SD-000216: 1-(3-fluorophenyl)biguanide, SD-000217: 1-(2,4-difluorophenyl)biguanide)을 1mg씩 경구 투여하였으며, 이와 함께 2mg씩 직장(rectal)에 투여하였다. 시간 경과에 따른 염증성 장질환의 진행 정도를 매일 마우스를 관찰하면서 무게변화를 매일 측정하였으며, 또한 무게를 %로 환산하여 질환의 치료/개선 효과 정도를 평가하였다. 양성대조군은 현재 시중에서 당뇨치료제로 사용되고 있는 바이구아나이드계 화합물인 메트포민(시그마알드리치, 동물 실험 투여용량: 1mg 경구투여, 2mg 직장 투여 진행)을 본 발명의 화합물 대신 사용하였다.
참고로, DSS는 음용수에 의해 투여되어 결장의 상피세포를 죽이고 결장 염증을 유발하는 화학물질에 해당하며, DSS 대장염 모델은 실험적 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)의 확립된 모델에 해당한다.
4개의 실험군
실험군 실험물질 투여용량 마우스 개수
WT(wild type) 무처리 - 10 마리
IBM 대조군 3.5% DSS 3 mg 10 마리
메트포민 처리군 3.5% DSS+메트포민 3 mg 10 마리
바이구아나이드 유도체 화합물 처리군 3.5% DSS+(SD-000196) 3 mg 10 마리
3.5% DSS+(SD-000216) 3 mg 10 마리
3.5% DSS+(SD-000217) 3 mg 10 마리
그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 바이구아나이드 유도체 화합물을 투여한 실험군의 경우, 염증성 장질환 유도 동물모델(IBM 대조군)에 비하여 몸무게가 유의하게 개선되었으며, 시간이 경과 할수록 정상마우스(WT)의 몸무게와 유사해지는 것을 확인할 수 있었다.
<4-2> 염증성 장질환 동물모델에 본 발명의 화합물 적용 후 조직염증정도 측정
상기 실시예<4-1>의 염증성 장질환 동물모델에 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 투여하였을 경우, 마우스의 대장조직에서 세포 염증정도를 면역조직화학염색법을 통해 조사하였다.
면역조직화학염색법은 다음과 같은 과정으로 실시하였다. 상기 표 1의 마우스 실험군의 대장조직을 분리하여, 10% 중성완충포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 후 관절 조직을 7㎛ 두께의 절편을 만들어 슬라이드에 부착하였다. 기본 염색을 진행하기 전에 자일렌을 이용하여 탈 파라핀 과정을 통과 후, 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수시켰다. 염색과정은 헤마톡실린/에오신(hematoxylin/eosin) 염색을 수행하였으며 광학현미경으로 분석하였다.
그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, DSS을 섭취시킨 염증성 장질환 마우스 실험군의 대장 조직은 손실이 많고 세포가 침투된 것을 관찰할 수 있는 반면, 염증성 장질환 마우스에 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 투여한 실험군의 대장 조직은 손상이 적고 세포의 침투가 낮은 것을 확인할 수 있었다.
<4-3> 염증성 장질환 동물모델에 본 발명의 화합물 적용 후 TNF -α 발현 측정
상기 실시예<4-1>의 염증성 장질환 동물모델에 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 처리하였을 경우, 마우스의 대장조직에서 세포 내 TNF-α 발현정도를 면역조직화학염색법을 통해 조사하였다.
면역조직화학염색법은 상기 실시예<4-2>와 유사하게 진행되었으며, TNF-α 항체를 반응시켜 DAB으로 발색한 후 광학현미경으로 분석하였다.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, DSS을 섭취시킨 염증성 장질환 마우스 실험군에서는 세포 내 염증성 사이토카인인 TNF-α이 매우 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있는 반면, 염증성 장질환 마우스에 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물을 투여한 실험군에서는 세포 내 TNF-α 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 TNF-α 발현 정도는 양성대조군인 메트포민 처리군과 비교하여 더욱 낮은 것을 관찰할 수 있었다.
<실시예 5>
본 발명에 따른 바이구아나이드 유도체 화합물의 동종반응(Alloresponse) 억제 효과
본 실험에서는 바이구아나이드 유도체 화합물들이 동종반응(Alloresponse) 억제할 수 있는 효과가 있는지 살펴보기 위하여, in vitro에서 96-웰(well) 플레이트(round bottom plate) 내 각 웰 당 2×105개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+T cell와 2×105개의 방사선으로 조사시킨 수여자(동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator,동종이형) 유래 T 세포 제거 비장세포를 넣고 혼합 배양시켜 동종반응을 유도하였다. 또한, 이때 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물(SD-000196: 1-isopropylbiguanide, SD-000216: 1-(3-fluorophenyl)biguanide, SD-000217: 1-(2,4-difluorophenyl)biguanide) 또는 메트포민(metformin)을 함께 처리한 후 4일간 배양시킨 다음, 배양된 세포에서 T 세포 증식 반응 정도를 3H incorporation 방법을 이용하여 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물들의 동종반응에 대한 영향을 분석하였다.
그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물를 처리한 실험군에서 동종반응(Alloresponse)이 두드러지게 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 메타포민을 처리한 군에 비해 더 효과적으로 면역반응을 억제하는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물들이 이식 과정에서 발생할 수 있는 동종반응을 효과적으로 억제할 수 있어 동종이식을 성공적으로 유도할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
<실시예 6>
본 발명에 따른 바이구아나이드 유도체 화합물의 조절 T 세포 활성 증대 효과
본 실험에서는 바이구아나이드 유도체 화합물의 조절 T 세포(regulator T cell, 이하 간략하게 'Treg'로 약칭함)의 활성을 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하였다.
Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환과 염증질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 입증하는 실험들이 많이 보고되고 있다. 따라서 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물들이 Treg의 활성을 증대시키는 작용을 통해 면역치료제로서 사용 가능성을 입증하고자 본 실험을 실시하였다.
Treg 세포의 활성 조사는 유세포분석 기법을 이용하였다. 자세하게는, In vitro에서 96well 당 2×105개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+T cell와 2×105개의 방사선으로 조사시킨 수여자(동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator,동종이형) 유래 T 세포 제거 비장세포를 넣고 혼합 배양시킴으로써 동종반응(alloresponse)를 유도하였다. 이때 동종반응에 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물(SD-000196: 1-isopropylbiguanide, SD-000216: 1-(3-fluorophenyl)biguanide, SD-000217: 1-(2,4-difluorophenyl)biguanide) 또는 메트포민(metformin)을 함께 처리한 후 함께 4일간 배양하였고, 분화된 조절 T 세포를 anti-CD4-percp, anti-CD25-APC, anti Foxp3-Pe 형광 항체를 이용하여 유세포 분석기를 통해 분석하였다.
그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물를 처리한 실험군에서 Treg 세포의 활성 및 세포수가 두드러지게 증대되는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 메타포민 만을 처리한 군에 비해 더 현저하게 Treg 세포의 활성을 증가시키는 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물은 Alloresponse 반응 억제와 동시에 Treg 활성을 증대시킬 수 있으므로, 이상적인 면역 조절 기능을 갖는다.
< 실시예 7>
본 발명에 따른 바이구아나이드 유도체 화합물의 급성이식편대숙주질환( acute graft versus host disease: aGVHD ) 치료 효과 분석
상기 실시예 5 및 6을 통해 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물이 동종반응(Alloresponse)의 억제하고 동시에 Treg 활성을 증대시키는 효과가 있음을 확인하였는바, 본 실험에서는 본 발명의 유도체 화합물들이 급성 이식편대숙주질환의 증상을 개선 및 치료할 수 있는지를 조사하였다.
이를 위해 급성 이식편대숙주질환(acute Graft Versus Host Disease: aGVHD) 모델을 제작하였는데, 수여마우스 Balb/c(H-2k/d)를 800cGy로 전신방사선조사(TBI) 하고 공여마우스 C57BL/6(H-2k/b)의 대퇴골과 경골에서 조혈모세포와 비장세포를 분리하여 조혈모세포 5×106과 비장세포 8×106을 수여마우스 Balb/c(H-2k/d)에 이식하였다. 이식 전 비장세포는 메트포민(metformin) 또는 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물(SD-000196: 1-isopropylbiguanide, SD-000216: 1-(3-fluorophenyl)biguanide, SD-000217: 1-(2,4-difluorophenyl)biguanide)을 5mM의 농도로 2시간동안 처리하였으며, 이후 급성 이식편대숙주질환이 유도된 마우스들의 생존 정도를 평가하였다.
그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물를 처리한 실험군이 급성 이식편대숙주질환 마우스 군 및 메트포민을 처리한 급성 이식편대숙주질환 마우스 군에 비해 마우스들의 생존이 현저하게 증대되는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 8>
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 관절염 치료 효과
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 관절염 치료 효과를 평가하기 위하여 류마티스 관절염 동물 모델에서 세포독성, 자가항체 생성, 염증성 사이토카인 및 조절 T 세포(Treg) 발현, 및 파골세포 분화를 측정하였다. 상기 실시예들과 같이 메트포민(metformin)을 대조군으로 사용하였다.
<8-1> MTT 어세이
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 세포독성을 알아보기 위하여 MTT 어세이를 수행하였다. 정상 마우스군의 비장에서 세포를 분리하고, 분리된 세포는 anti-CD3 0.5ug/ml 혹은 LPS 100ng/ml의 농도로 3일 동안 배양하였으며, 이와 함께 메트포민, SD-196, SD-216 또는 SD-217 각각을 농도별로 처리하여 3일간 배양하였다. 하베스트(harvest) 4시간 전에 MTT를 처리하여 세포 독성을 평가한 결과, SD-196, 216 및 217의 세포 독성은 없는 것으로 확인되었다(도 9A).
<8-2> IgG 측정
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 자가항체 생성 억제 효과를 알아보기 위하여, 배양된 상층액을 모아 ELISA를 이용하여 IgG 발현 정도를 조사하였다. 96-웰 플레이트에 단클론성 anti-IgG를 4℃에서 밤새 반응시킨 후 차단용액으로 비 특이적 결합을 차단하였다. Mouse control serum을 1/2씩 연속 희석하여 standard로 사용하며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 HRP-anti-IgG를 2시간 동안 실온에서 반응시키고, 반응 후 4회 세척한 뒤 HRP-conjugate를 희석하여 넣고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 발색 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과, 메트포민 보다 SD-196, 216 및 217가 IgG의 발현을 현저하게 억제시킴을 확인하였다(도 9B).
<8-3> 염증성 사이토카인 측정 및 조절 T 세포( Treg ) 활성 조사
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 평가하기 위하여, 배양된 상층액을 모아 sandwich ELISA를 이용하여 마우스 IL-17 및 TNF-α의 발현 정도를 조사하였다. 96-웰 플레이트에서 단클론성 anti-IL-17 이나 anti-TNFα 2g/mL으로 4℃에서 밤새 반응시켰으며, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비 특이적 결합을 차단하였다. IL-17이나 TNF-α recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 standard로 사용하며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서 biotinylated anti-IL-17 이나 anti-TNF-α를 넣고 2시간 동안 실온에서 반응시켰으며, 반응 후 4회 세척하고, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PNPP/DEA 용액을 넣어 발색시킨 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, IL-17과 TNF-α 염증성 사이토카인은 SD-196, 216 및 217에 의해 현저히 억제된 것을 확인하였다(도 9C).
또한, 본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물이 조절 T 세포(Treg) 발현을 활성화시키는지 알아보기 위하여, 배양된 세포를 anti-CD4-percp, anti-CD25-APC, anti Foxp3-Pe 형광 항체(ab)를 이용하여 유세포 분석한 결과, SD-196, 216 및 217이 Foxp3+ Treg 세포를 활성화시키는 것을 확인하였다(도 10).
<8-4> 파골세포 분화 조절 조사
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물이 파골세포 분화를 억제 조절할 수 있는지 확인하기 위하여, 관절염 동물 모델의 다리에서 뽑은 골수에 MCSF(10ng/ml) 및 RANKL(50ng/ml)을 처리하여 파골세포를 분화시키면서, 메트포민, SD-196, SD-216 및 SD-217 각각을 함께 처리하여 파골세포의 분화 정도를 평가하였다. 평가는 TRAP 염색을 이용하여 수행하였다. 그 결과, SD-196, 216 및 217은 파골세포의 분화를 현저히 억제시킬 수 있음을 확인하였다(도 11).
<8-5> 대사증후군을 동반한 류마티스관절염 질환모델에서의 치료 효과 평가
상기 <8-1> 및 <8-3>에서와 같은 방법으로 대사증후군을 동반한 류마티스관절염 질환모델에서의 세포독성 및 염증성 사이토카인 발현을 측정한 결과, SD-196, 216 및 217은 세포독성을 나타내지 않았으며(도 12A), IL-17의 발현을 억제시켰다(도 12B). 또한, 배양된 세포를 anti-CD4-percp 및 anti IL-17-Pe 형광 항체를 이용하여 유세포 분석한 결과, SD-196, 216 및 217은 Th17의 활성을 억제하는 동시에 조절 T 세포(Treg) 발현을 활성화시키는 것으로 확인되었다(도 13).
< 실시예 9>
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 루푸스 치료 효과
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 루푸스 치료 효과를 평가하기 위하여 루푸스 동물 모델에서 세포독성, 자가항체 생성, 염증성 사이토카인 생성 및 Th17 조절을 상기 실시예 8에서와 같은 방법으로 측정하였다.
그 결과, SD-196, 216 및 217의 세포 독성은 없는 것으로 확인되었고(도 14A), SD-196, 216 및 217이 메트포민 보다 IgG의 발현을 현저하게 억제시키며(도 14B), IL-17 및 TNF-α 염증성 사이토카인의 발현과 Th17의 활성을 억제시키는 것을 확인하였다(도 14C, 15).
< 실시예 10>
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 사람 세포에 대한 활성 평가
본 발명의 바이구아나이드 유도체 화합물의 면역질환 예방 또는 치료제로서의 개발 가능성을 평가하기 위하여, 정상인의 세포를 대상으로 세포독성 및 염증성 사이토카인 생성 조절 효과를 상기 실시예 8에서와 같은 방법으로 측정하였다.
그 결과, SD-216 및 217의 세포 독성은 나타나지 않았고(도 16A), SD-216 및 217 모두 메트포민에 비하여 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현을 억제시키는 것을 확인하였다(도 16B).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

  1. 바이구아나이드(biguanide) 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 바이구아나이드 유도체 화합물은 1-이소프로필바이구아나이드(1-isopropylbiguanide), 1-(3-플루오로페닐)바이구아나이드(1-(3-fluorophenyl)biguanide) 및 1-(2,4-디플루오로페닐)바이구아나이드(1-(2,4-difluorophenyl)buguanide)로 이루어진 군 중에서 선택되고,
    상기 면역질환은 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 이식편대숙주질환, 루프스, 건선 및 다발성 경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 면역질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바이구아나이드 유도체 화합물은 염증성 사이토카인의 생성을 감소 또는 억제시키는 기작을 통해 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 염증성 사이토카인은 IL-17 또는 TNF-α인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 바이구아나이드 유도체 화합물은 조절 T 세포(Regulatory T cell)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 기작을 통해 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 바이구아나이드 유도체 화합물은 조성물에 1μM ~ 1000μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 이를 필요로 하는 개체를 대상으로 체중 kg 당 1 ~ 100mg(전임상 마우스 동물모델 기준)의 양으로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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