KR101432246B1

KR101432246B1 - 메포민을 포함하는 자가면역질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101432246B1
Application number: KR1020120104603A
Authority: KR
Inventors: 주지현; 김영균; 강귀영
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2014-08-21
Also published as: KR20130031229A

Abstract

본 발명은 메포민의 신규한 의약 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 메포민이 Th17 세포의 분화를 억제함으로써 Th17 세포에 의해 유발되는 자가면역질환을 예방 및 치료하는 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 자가면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

메포민을 포함하는 자가면역질환 예방 및 치료용 조성물 {Composition for preventing and treating autoimmune diseases comprising metformin}

본 발명은 메포민의 신규한 의약 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 메포민이 Th17 세포의 분화를 억제함으로써 Th17 세포에 의해 유발되는 자가면역질환을 예방 및 치료하는 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 자가면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

인간의 면역계는 인체에 침입한 외부 항원으로부터 신체를 보호하는 역할을 하나, 자기 관용성(self tolerance)이 있어서 자기 조직을 공격하지는 않는다. 그러나 면역계의 자기 관용성이 파괴되어 자신의 유전자에 의해 정상적으로 발현되는 단백질을 면역세포가 공격대상으로 인식하여 항체를 만들거나 T 세포 반응을 일으켜서 정상조직을 파괴하는 경우를 자가 면역이라 부르며 구체적인 증상이 나타나면 자가면역질환이라고 한다.

1980년대 중반 Mosmann 등은 보조 T 림프구(helper T lymphocyte, Th)를 사이토카인 분비 양상에 따라 Th1 과 Th2 라는 두 세포집단으로 나눌 수 있다고 제안하였다 (Mosmann TR, et al., J Immunol., 136:2348-2357, 1986). 이후 Th1 세포는 IFN-γ 를 분비하며 대식세포 등을 활성화하여 세포성 면역반응을 유도하고, Th2 세포는 IL-4, IL-5 등을 분비하며 체액성 면역반응에 관여하는 것으로 알려졌다. 또한, Th1 세포와 Th2 세포의 불균형으로 인해 Th1 으로의 분화가 과도하게 진행되면 염증성 자가면역질환이 유발된다고 알려졌다. 그러나, IFN-γ나 IFN 수용체가 결핍된 생쥐가 류마티스 관절염과 다발성 경화증과 같은 자가면역질환을 일으킨다는 것이 보고되면서 Th1/Th2 패러다임에 대한 의문이 제기되었으며(Infante-Duarte C, et al., J Immunol., 165: 6107- 6115, 2000), IL-12와 IL-23에 관한 연구에서, 자가면역질환을 일으키는데 Th1 세포보다 IL-23 에 의해 유도되는 Th17 세포가 더 중요하다는 것이 밝혀졌다 (Murphy KM, et al., Nat Rev Immunol 2(12):933-44, 2002; Cua DJ, et al., 421(6924):744-8, 2003; Langrish CL, et al., J Exp Med 201(2):233-40, 2005)

Th17 세포는 IL-23 에 의해 유도되는 T 세포군이 IL-17 사이토카인을 분비하기 때문에 그렇게 명명되었으며, Th1 또는 Th2 와는 독립적인 세포라는 것이 밝혀졌다. 최근에는 RORγt 라는 Th17세포의 전사인자가 밝혀져서 Th17 세포의 신호전달체계나 전사과정 등이 규명되었다. 또한, Th17 세포가 Th1, Th2, Treg(regulatory T cell) 세포와는 달리 자가면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 이에 따라, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

구체적으로, Th17 은 건선(Wilson, N.J., et al., Nat Immunol, 8(9):950-957, 2007; Arican, O., et al., Mediators Inflamm, 2005(5):273-279, 2005; Wolk, K., et al., Eur J Immunol, 36(5):1309-1323, 2006; Chan, J.R., et al., J Exp Med, 203(12):2577-2587, 2006), 류마티스성 관절염(Lee, H.S., et al., 13(9-10):455-460, 2007; Remmers, E.F., et al., N Engl J Med, 357(10):977-986, 2007; Mathur, A.N., et al., J Immunol, 178(8): 4901-4907, 2007), 전신성 경화증(Zhou, L., et al., 8(9): 967-974, 2007; Distler, J.H., et al., 52(3): 856-864, 2005), 전신성 홍반성 루푸스(Wong, C.K., et al., Lupus, 9(8): 589-593, 2000; Kang, H.K., et al., J Immunol, 178(12): 7849-7858, 2007), 다발성 경화증(Matusevicius, D., et al., Mult Scler, 5(2): 101-104, 1999; Vaknin-Dembinsky, A., et al., J Immunol, 176(12): 7768-7774, 2006), 자가면역 심근염(Rangachari, M., et al., J Exp Med, 203(8): 2009-2019, 2006; Sonderegger, I., et al., Eur J Immunol, 36(11): 2849-2856, 2006), 천식(Molet, S., et al., J Allergy Clin Immunol,108(3):430-438, 2001; Barczyk, A., et al., Respir Med, 97(6): 726-733, 2003; Bullens, D.M., et al., Respir Res, 7:135, 2006; Wong, C.K., et al., Clin Exp Immunol, 125(2): 177-183, 2001), 아토피성 피부염과 접촉 과민증(van Beelen, A.J., et al., Curr Opin Allergy Clin Immunol, 7(5): 374-381, 2007; Nakae, S., et al., Immunity, 17(3): 375-387, 2002; He, D., et al., J Immunol, 177(10): 6852-6858, 2006), 염증성 장질환(Burakoff, R., et al., Inflamm Bowel Dis, 12(7): 558-565, 2006; Billich, A., IDrugs, 10(1): 53-59, 2007; Caviglia, R., et al., World J Gastroenterol, 13(39): 5238-5244, 2007; Wada, Y., et al., Blood, 109(3): 1156-1164, 2007) 및 치주 질환(Oda, T., et al., Oral Microbiol Immunol,18(1): 30-36, 2003; Johnson, R.B., et al., J Periodontol, 75(1): 37-43. 2004; Takahashi, K., et al., J Clin Periodontol, 32(4): 369-374, 2005; Vernal, R., et al., J Clin Periodontol, 32(4): 383-389, 2005)과 관련이 있으며 이들 자가면역질환의 치료 타겟으로 보고되었다.

현재 자가면역질환 치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있으나, 이러한 면역 억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 따라서, 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 메포민은 인슐린 비의존형 당뇨병 치료제로 상용화된 비구아니드계 약물이다. 메포민의 화합물명은 N,N-디메틸 이미도디카르본이미딕 디아미드(Ｎ,Ｎ-dimethyl imidodicarbonimidic diamide)이며, 하기 화학식 1의 구조를 가진다:

[화학식 1]

메포민과 관련하여, 펜실바니아 의대 암 연구소(Abramson Cancer Center)는 메포민이 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시켜 p53 유전자가 결여된 암의 예방과 치료에 효과가 있다고 보고하였고(Monica Buzzai, et al., Cancer Res 67:(14), 2007), 미국 보스턴 소재 메디컬센터(Beth Israel Deaconess Medical center)는 메포민이 PGC-1α 전사인자를 활성화시켜 근육통, 근육세포 손상, 횡문근융해증 (rhabdomyolysis)과 같은 심각한 부작용을 예방하는데 효과적임을 보고하였으며(Jun-ichi Hanai, et al., J. Clin. Invest. 117:3940-3951, 2007), 영국 당뇨병 전향 연구 그룹(UKPDS group)은 메포민이 항산화 효과로 인하여 당뇨 환자의 심혈관 질환을 개선하고, 트리글리세라이드, 저밀도지단백, 콜레스테롤 수치를 낮추는 효과가 있다고 보고하였다(UKPDS group., Lancet 1998:352:854-865). 또한, 국내공개특허 제10-2011-0071586 은 메포민을 천식, 기관지염, 후두 알레르기, 부비강염 또는 만성폐쇄성폐질환(COPD) 등의 염증성 또는 폐쇄성 기도 질환의 치료제로 제공하고 있다.

그러나, 메포민이 자가면역질환의 원인인 Th17 세포의 분화를 억제한다거나, 자가면역질환의 치료에 적용할 수 있다는 것은 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 Th17 세포와 관련된 자가면역질환에 효과적인 새로운 치료제를 개발하고자 연구한 결과, 기존에 인슐린 비의존형 당뇨병 치료제로 사용되던 메포민이 놀랍게도 Th17 세포와 관련된 자가면역질환의 치료에 우수한 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 자가면역질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 자가면역질환 치료 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로, 본 발명은 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 자가면역질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

메포민은 화합물명이 N,N-디메틸 이미도디카르본이미딕 디아미드(Ｎ,Ｎ-dimethyl imidodicarbonimidic diamide)이며, 하기 화학식 1의 구조를 가지는 화합물을 말한다:

[화학식 1]

본 발명에서 메포민은 상기 화학식의 메포민 뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 라세미체, 에난티오머, 동질이상체, 무수물, 수화물(반수화물, 일수화물, 이수화물, 삼수화물 등) 및 용매화물을 모두 포함한다.

약학적으로 허용 가능한 염에는 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함하며, 무기산으로부터 유도된 염이 바람직하다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 아세틸살리신산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산, 엽산, 클로피브린산 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는 본 발명에서는 메포민 염산염을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

메포민은 당업계에 알려진 화학적 합성방법에 의하여 제조할 수 있으며, 예를 들어 독일 등록특허 제1023757호, 프랑스 등록특허 제2322860호 등에 기재된 제조방법을 참고할 수 있다.

발명의 배경이 되는 기술에 기재한 바와 같이, 최근 보조 T 림프구(Th)에 속하며 Th1 또는 Th2 와는 독립적인 세포인 Th17의 존재가 보고되었으며, Th1 세포보다 IL-23 에 의해 유도되는 Th17 세포가 자가면역질환을 일으키는데 더 중요하다는 것이 밝혀졌다. Th17 세포는 자가면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키며, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 자가면역질환의 치료제를 개발할 수 있다.

본 발명자들은 메포민이 Th17 세포의 분화를 억제함으로써, Th17 세포와 관련된 자가면역질환의 치료제로 사용될 수 있음을 처음으로 규명하였다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 메포민이 쥐의 비장에서 분리된 CD4+ T 세포로부터 Th17 세포로의 분화를 억제하며, 농도 의존적으로 Th17 세포 분화 억제 효과가 증가함을 확인하였고 (도 1), 나아가 이러한 Th17 분화 억제가 STAT3 등의 신호 전달 물질의 조절을 통해 이루어지는 것임을 확인할 수 있었다 (도 2). 또한, Th17 에 의해 유도되는 대표적인 질환인 류마티스 관절염 동물 모델을 대상으로 액와 림프절 및 비장을 추출하여 Th17 분화 정도를 측정한 결과, 생리 식염수를 처리한 질병 모델에서 높은 Th17 분화율이 나타남에 반하여 메포민을 처리한 질병 모델에서는 Th17 분화가 현저히 억제되었음을 알 수 있었고(도 3 및 도 4), 메포민을 처리한 질병 모델에서 류마티스 관절염이 눈에 띄게 호전됨을 확인할 수 있었다(도 5). 따라서, 메포민이 Th17 세포 분화를 억제함으로써 Th17 에 의해 발생하는 자가면역질환에 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 자가면역질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "치료 또는 예방" 이란 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용함으로써 자가면역질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 바람직하게 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물은 Th17 세포의 분화를 억제함으로써 Th17 세포에 의한 자가면역질환의 발생 또는 가속화된 진행으로부터 조직을 보호할 수 있다.

본 발명에서 자가면역질환은 Th17 에 의해 유도되는 모든 자가면역질환에 사용될 수 있으며, 바람직한 예시로 건선, 류마티스성 관절염, 전신성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 자가면역 심근염, 아토피성 피부염, 접촉 과민증, 천식, 염증성 장질환 및 치주 질환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하여 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

또한 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용 약, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 자가면역질환 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 치료방법은 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 바람직하게 상기 약학적 조성물의 투여량은 kg당 약 10 mg 내지 약 200 mg의 범위에서 사용될 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 메포민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학적 조성물은 Th17 세포의 분화를 억제함으로써 Th17 세포에 의한 자가면역질환의 발생 또는 가속화된 진행으로부터 조직을 보호함으로써 자가면역질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1의 (A)는 쥐의 비장에서 분리한 CD4+ T 세포에 메포민을 처리하지 않거나 (Control) 메포민을 농도별로(0.5mM, 0mM, 5mM 및 10mM) 처리한 경우 Th17 세포로의 분화 정도를 확인한 FACS 분석 결과를 나타낸다. (B)는 상기 FACS 데이터를 독립적으로 세 번 반복하여 얻은 결과를 토대로 하여 Th17 세포군의 비율을 산출한 그래프를 나타낸다.
도 2의 (A)는 쥐의 비장에서 분리한 CD4+ T 세포에 메포민을 농도별로(0.5mM, 0mM, 5mM 및 10mM) 처리한 경우 Th17 분화에 관련된 신호 전달 물질들의 인산화 여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다. (B)는 최종 신호 전달 물질인 STAT3의 인산화 비율을 산출한 그래프를 나타낸다.
도 3은 Th17 관련 질병 동물 모델의 액와 림프절에서 Th17 의 분화 정도를 나타낸 그림이다. 도 1(A)에서 NORMAL 은 질병을 유도하지 않은 정상군, CAIA 는 질병 유도군에 생리 식염수를 처리한 경우, Met-LD 는 질병 유도군에 저농도(100 mg/kg)로 메포민을 처리한 경우, Met-HD 는 질병 유도군에 고농도(150 mg/kg)로 메포민을 처리한 경우로, 각 동물에서 액와 림프절을 추출하여 분리한 세포들에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다. 도 1(B)는 상기 FACS 데이터를 토대로 하여 Th17 세포군의 비율을 산출한 그래프를 나타낸다.
도 4는 Th17 관련 질병 동물 모델의 비장에서 Th17 의 분화 정도를 나타낸 그림이다. 도 2(A)에서 NORMAL 은 질병을 유도하지 않은 정상군, CAIA 는 질병 유도군에 생리 식염수를 처리한 경우, Met-LD 는 질병 유도군에 저농도(100 mg/kg)로 메포민을 처리한 경우, Met-HD 는 질병 유도군에 고농도(150 mg/kg)로 메포민을 처리한 경우로, 각 동물에서 비장을 추출하여 분리한 세포들에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다. 도 2(B)는 상기 FACS 데이터를 토대로 하여 Th17 세포군의 비율을 산출한 그래프를 나타낸다.
도 5의 (A)는 Th17 관련 류마티스 관절염 동물 모델에 대한 메포민의 치료 효과를 나타낸 그림으로, Control 은 질병을 유도하지 않은 정상군, CAIA 는 질병 모델, Low dose Metformin은 질병 모델에 메포민을 100 mg/kg 복강 내 투여한 경우, High dose Metformin은 질병 모델에 메포민을 150 mg/kg 복강 내 투여한 경우 발의 붓기 점수를 나타낸 것이다. (B)는 상기 각 마우스군에서의 조직 염색 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인 비트로(in vitro)에서 메포민의 Th17 세포 분화 억제 효과 확인

24 웰 플레이트에 항-CD3 항체(BD pharmingen 553058)를 2㎍/㎖ 을 첨가하고, 4℃ 에서 하룻밤 동안 배양하여 플레이트를 코팅시켜 두었다. 7주령의 DBA1/J 쥐에서 비장(spleen)을 추출하고, MACS CD4+ T 세포 분리 키트(MACS 130-090-860)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하고, 전날 준비해 두었던 상기 24 웰 플레이트에서 항-CD3 항체를 모두 걷어내고, 한 웰 당 5 X 10⁵의 세포를 넣었다. 여기에 항-CD28 항체(5㎍/㎖, BD pharmigen 553295), 항-IFNγ 항체(10㎍/㎖, R&D system MAB485), 항-IL-4 항체(10㎍/㎖, R&D system MAB404), IL-6(50ng/㎖, R&D system 406-ML) 및 TGF-β(1ng/㎖, R&D system 240-B) 을 첨가하였다. 이와 동시에 준비한 메포민(한독약품)을 각각 0.5mM, 0mM, 5mM 및 10mM 의 농도로 함께 처리하여 24시간 배양하였다. 이로부터 5일 후, 이오노마이신(500ng/㎖, sigma-aldrich I0638), PMA(5ng/㎖, sigma P8139), golgi plug(1ug/㎖, BD bioscience 555029)을 첨가하고, 4 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 분화된 세포를 항-마우스 CD4 항원제시세포(eBioscience 17-0041)와 PE-결합된 항-마우스/인간 RoRγ(t) (eBioscience 12-6988-80)로 1시간 동안 처리한 뒤에 BD FACSCalibur™ 유세포 분석기(BD science)를 통해 Th17 로의 분화 정도를 확인하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1(A)에서 CD4에 양성이며 RoRγ(t) 를 발현하고 있는 세포군이 Th17 이다. 이 FACS 데이터를 독립적으로 세 번 반복하여 얻은 결과를 토대로 하여 Th17 세포군의 비율을 산출한 그래프를 도 1(B)에 나타내었다. 이를 살펴보면, 메포민을 처리하지 않은 대조군에 비하여 메포민을 처리한 경우 Th17 세포로의 분화 저해되었으며, 메포민의 농도가 증가에 따라 Th17 세포로의 분화 억제 효과가 더욱 명확하게 나타남을 알 수 있다.

실시예 2. 메포민이 Th17 분화에 관련된 신호 전달에 미치는 영향 확인

24 웰 플레이트에 항-CD3 항체(BD pharmingen 553058)를 2㎍/㎖ 을 첨가하고, 4℃ 에서 하룻밤 동안 배양하여 플레이트를 코팅시켜 두었다. 6주령 DBA1/J 쥐로부터 1 X 10⁶ 비장세포(splenocytes)를 분리하고, 전날 준비해 두었던 상기 24 웰 플레이트에서 항-CD3 항체를 모두 걷어내고 웰에 세포를 넣었다. 여기에 메포민(한독약품)을 각각 0.5mM, 0mM, 5mM 및 10mM 의 농도로 함께 처리하여 24시간 배양하였다. 다음날 세포를 거둬들여, lysis buffer (PBS, 1% NP-40, PMSF, leupeptin, phosphatase inhibitor cocktail set)로 4℃에서 25분 동안 lysis한 뒤에 12000 rpm, 4℃ 조건으로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 모아서 농도를 측정하기 위해 Bradford assay (BioRAD)를 수행한 뒤에 동량의 농도를 준비하여 5xSDS sample buffer와 함께 5분간 끓였다. 이렇게 준비한 샘플을 SDS-PAGE에 로딩하여, 전기영동한 뒤에 나이트로셀룰로스 멤브레인에 트랜스퍼하여 블랏팅을 준비하였다. 5% skim milk or 5% PBA를 사용하여 멤브레인을 블락킹한 뒤에 각 1차 항체를 사용하여 원하는 분자를 검출하였다.

본 실험에서는 1차 항체로 항-AMPKα (2532, Cell signaling), 항-phospho-AMPKα (Thr172) (40H9) Rabbit mAb(2535, cell signaling) 를 5% PBA에, 또한 항-stat3(79D7) Rabbit mAb (4904, cell signaling)를 5% skim milk에 사용하였다. 더불어 항-phospho-stat3 (Ser727) (9134, cell signaling), 항-mTOR(7C10) Rabbit mAb (2983, cell signaling) 를 5% skim milk에, 항-phospho-mTOR (Ser2448)(D9C2) XP Rabbit mAb (5536, cell signaling) 는 5% PBA에서, 마지막으로 β-actin (4970s,cell signaling)은 5%skim milk에 희석하여 사용하였다. 1차 항체는 하룻밤 동안 4℃에서 배양한 뒤에 PBST를 이용하여 세척하였다. 발관을 위한 2차 항체로 퍼옥시다아제가 결합된 이차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP, sc-2004, santa cruz Biotech)를 사용하여 발광시킨 뒤 western blotting substrate(WESTERSAVE^TM, Ab FRONTIER)를 사용하여 형광을 띠게 하여 그 사진을 chemiluminescence analyzer system(Fusion SL-4 3500,Viber lourmat)을 사용하여 찍어 분석하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2(A)는 메포민의 농도별 처리에 따라 각 신호 전달 물질의 인산화 여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이며, 도 2(B)는 특히 최종 신호 전달 물질인 STAT3의 인산화 정도를 확인한 결과이다. 이를 살펴보면, 처리한 메포민의 농도가 증가할수록 Th17 세포 분화에 관련이 있다고 알려진 각 분자들의 인산화가 다르게 진행되는 것을 확인할 수 있으며, 특히 최종 산물인 STAT3의 인산화가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 메포민이 STAT3의 인산화를 저해함으로 Th17의 분화를 억제하는 것으로 볼 수 있다.

실시예 3. 액와 림프절 내 Th17 세포 분화 억제 효과

24 웰 플레이트에 항-CD3 항체(BD pharmingen 553058)를 2㎍/㎖ 을 첨가하고, 4℃ 에서 하룻밤 동안 배양하였다. 7주령의 DBA1/J 쥐에 제2형 콜라겐을 주입하여 류마티스 관절염을 유도한 CAIA 질병 모델에 메포민(한독약품)을 농도별(HD군 150 mg/kg, LD 군 100 mg/kg)로 처리한 쥐에서 액외 림프절(axillary lymph node)을 추출하고, 여기서 각 세포들을 분리하여 FACS 분석을 진행하였다. 구체적으로, 이오노마이신 (500ng/㎖, sigma-aldrich I0638), PMA(5ng/㎖, sigma P8139), golgi plug(1ug/㎖, BD bioscience 555029)를 첨가하고, 4 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 분화된 세포를 항-마우스 CD4 항원제시세포(eBioscience 17-0041)와 PE-결합된 항-마우스/인간 RoRγ(t) (eBioscience 12-6988-80)로 1시간 동안 처리한 뒤에 BD FACSCalibur™ 유세포 분석기(BD science)를 통해 Th17 로의 분화 정도를 확인하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3(A)에서 CD4에 양성이며 RoRγ(t) 를 발현하고 있는 세포군이 Th17 이다. 이 FACS 데이터를 독립적으로 세 번 반복하여 얻은 결과를 토대로 하여 Th17 세포군의 비율을 산출한 그래프를 도 3(B)에 나타내었다. 이를 살펴보면, 질병을 유도하지 않은 정상군(NORMAL)에 비해 질병 유도군 (CAIA)이 높은 Th17 분화율을 보이는 것을 알 수 있다. 그러나 질병을 유도한 후 메포민을 처리한 군에서는 낮은 농도(low dose, LD) 및 높은 농도(high dose, HD) 모두에서 Th17 분화을 억제함을 알 수 있다.

실시예 4. 비장 내 Th17 세포 분화 억제 효과

24 웰 플레이트에 항-CD3 항체(BD pharmingen 553058)를 2㎍/㎖ 을 첨가하고, 4℃ 에서 하룻밤 동안 배양하였다. 7주령의 DBA1/J 쥐에 제2형 콜라겐을 주입하여 류마티스 관절염을 유도한 CAIA 질병 모델에 메포민(한독약품)을 농도별(HD군 150 mg/kg, LD 군 100 mg/kg)로 처리한 쥐에서 비장(spleen)을 추출하고, 이를 MACS CD4+ T 세포 분리 키트(MACS 130-090-860)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 전날 준비해 두었던 24 웰 플레이트에서 항-CD3 항체를 모두 걷어내고, 한 웰 당 5 X 10⁵의 세포를 넣었다. 여기에 항-CD28 항체(5㎍/㎖, BD pharmigen 553295), 항-IFNγ 항체(10㎍/㎖, R&D system MAB485), 항-IL-4 항체 (10㎍/㎖, R&D system MAB404), IL-6(50ng/㎖, R&D system 406-ML) 및 TGF-β(1ng/㎖, R&D system 240-B) 을 첨가하였다. 이로부터 5일 후, 이오노마이신 (500ng/㎖, sigma-aldrich I0638), PMA(5ng/㎖, sigma P8139), golgi plug(1ug/㎖, BD bioscience 555029)을 첨가하고, 4 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 항-마우스 CD4 항원제시세포(eBioscience 17-0041)와 PE-결합된 항-마우스/인간 RoRγ(t) (eBioscience 12-6988-80) 와 FITC-결합된 항-마우스 IL-17A(eBioscience, 11-7177-81)로 분화된 세포를 1시간 동안 처리한 뒤에 BD FACSCalibur™ 유세포 분석기 (BD science)를 통해 Th17 분화 정도를 확인하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4(A)에서 CD4에 양성이며 RoRγ(t) 를 발현하고 있는 세포군이 Th17 이다. 이 FACS 데이터를 독립적으로 세 번 반복하여 얻은 결과를 토대로 Th17 세포군의 비율을 산출한 그래프를 도 4(B)에 나타내었다. 이를 살펴보면, 질병을 유도하지 않은 정상군(NORMAL)에 비해 질병 유도군 (CAIA)이 높은 Th17 분화율을 보이는 것을 알 수 있다. 그러나 질병을 유도한 후 메포민을 처리한 군에서는 낮은 농도(low dose, LD) 및 높은 농도(high dose, HD) 모두에서 Th17 분화을 억제함을 알 수 있었다.

실시예 5. 류마티스 관절염 동물 모델에서의 치료 효과

5-1. 마우스 발의 부종 정도 확인

7주령의 DBA1/J 쥐에게 Mouse monoclonal anti-type II collagen 5 clone antibody cocktail kit(chondrex 53010)을 매뉴얼대로 사용하여, 류마티스 관절염 동물 모델인 CAIA 모델을 구축하였다. 6mg의 5-clone cocktail 을 복강 내 투여하고, 이로부터 3일 후에 25-50㎍의 LPS를 복강 내 투여하여 질병 모델을 구축하였다. 실험군으로 100 mg/kg 및 150 mg/kg 농도의 메포민을 복강 내 투여하였으며, 대조군(control)의 경우는 음성 대조군으로 생리식염수를 투여하였다.

각 동물에 대하여 발의 붓기 정도를 측정하여 도 5(A)에 나타내었다. 발의 붓기 정도는 각 다리 별로 5점을 만점으로 총합 20점에 도달하면 질병이 매우 심각함을 의미한다. 정상군(Control)에 비해 질병군(CAIA)의 경우 류마티스 관절염이 유도되어 발의 붓기가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 100mg/kg 및 150mg/kg 메포민 처리군이 질병군(CAIA)에 비해 붓기 점수가 낮음을 알 수 있으며, 메포민 처리군이 농도 의존적으로 류마티스 관절염의 호전 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.

5-2. 조직 염색

실시예 5-1에서 사용된 각군의 마우스 hind paw를 block화하여 section하여 조직 염색을 실시하였다. H&E 염색의 경우 Xylene Ⅰ과 xylene Ⅱ 에서 15분 탈파라핀(deparaffin)과정을 거쳐 100% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올 (hydration 함수) 순으로 각각 5분씩 통과시켰다. 그리고 수돗물에서 5분간 세척하였다. Harris hematoxylin (Sigma-Aldrich HHS32)으로 10분간 염색한 후 수돗물로 충분히 세척한 뒤 1%HCl에 2-3회 Dipping하고, 0.2% ammonia water에서 2-3회 Dipping 하였다. 또한 Eosin(Sigma-Aldrich HT110132)으로 1분 30초간 염색 후 세척하였다. 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 100% 에탄올 (dehydration 탈수) 순으로 통과시킨 후 Xylene에 담가 봉입(mounting)하였다. Safranin O 염색의 경우는 동일 과정을 수행하고 염색약만 다른 것을 이용하였다. 이 때에는 Weigert’s iron hematoxylin(Sigma-Aldrich HT1079-1SET)와 Fast green(FCF, Sigma-Aldrich F7252-5G)로 5분간 염색하였다. 1% 아세트산에 2-3회 Dipping하고 Safranin o(Sigma-Aldrich S2255-25G) 5분간 염색한 후 수돗물에서 세척하였다. 그 후 동일한 봉입과정을 수행하였다.

그 결과를 도 5(B)에 나타내었다. 이를 살펴보면, 질병군(CAIA)의 조직에서는 뼈파괴가 일어나고 조직이 침윤하여 관절이 붓는 현상을 관찰할 수 있으며, 메포민 처리군의 조직에서 정상군처럼 호전되어 정상적인 뼈와 조직의 형태를 이루고 있음을 확인할 수 있다.

Claims

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하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 시험관내(in vitro)에서 미분화 T 세포로부터 Th17 세포로의 분화 억제용 조성물:
[화학식 1]
미분화 T 세포에 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관내(in vitro)에서 미분화 T 세포로부터 Th17 세포로의 분화를 억제하는 방법:
[화학식 1]