KR101436728B1

KR101436728B1 - 골수유래억제세포 및 레바미피드를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101436728B1
Application number: KR1020130028982A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 박민정; 이성희
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-20
Filing date: 2013-03-19
Publication date: 2014-09-02
Also published as: KR20130106786A

Abstract

본 발명은 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC)와 레바미피드를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 골수유래억제세포 및 레바미피드(rebamipide)를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 면역억제제 및 인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 골수유래억제세포와 레바미피드를 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드 병용투여에 의한 면역질환의 치료는 면역조절 T 세포(Treg)의 활성을 촉진시키고 자가면역항체의 수준을 감소시켜 과도한 면역반응을 조절하는 기작을 통해 이루어지므로, 염증반응 및 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는 효과가 있다.

Description

골수유래억제세포 및 레바미피드를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating immune disease comprising Myeloid derived suppressor cells and rebamipide}

본 발명은 면역반응의 이상으로 유발되는 면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용되는 골수유래억제세포와 레바미피드의 약학적 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 골수유래억제세포 및 레바미피드를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 면역과민반응으로 인한 질환이 증가하고 있지만, 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이다. 현재 과도한 면역반응에 의한 질환의 치료방법으로는 면역억제제를 단독 또는 병용 투여함으로써 상기 질환에 의해 야기되는 각종 증상을 완화 내지 감소시키는 것이다. 면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 장기이식분야 뿐만 아니라 루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환과, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료시에 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다(Wollenberg 2008).

현재 사용되고 있는 면역억제제로는 사이클로스포린 A와 FK506 등이 있는데, 이들은 복잡한 화학구조를 가진 천연물 유래의 화합물로서 원료 수급의 측면에서 고비용으로 인해 비경제적이고 장기투여로 인해 각종 부작용이 야기될 수 있다는 위험성을 내포하고 있다. 따라서 낮은 독성, 면역관용 유도와 함께 경제적인 생산이 가능한 새로운 면역억제제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한편, 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.

따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하는 실험들이 많이 보고되고 있다.

또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다.

또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.

따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제 및 치료방법의 개발이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC)와 레바미피드(rebamipide)를 동시에 병용 처리할 경우, 골수유래억제세포 및 레바미피드를 단독 처리하는 경우에 비해 면역질환의 증상을 월등히 개선시켜 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 골수유래억제세포와 레바미피드를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC)와 레바미피드를 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC) 및 레바미피드(rebamipide)를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골수유래억제세포(MDSC) 및 레바미피드(rebamipide)는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키고, 혈액 내 총 IgG, IgG1 및 IgG2a의 농도를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골수유래억제세포(MDSC) 및 레바미피드(rebamipide)는 염증성 사이토카인인 IL-17의 발현을 감소 또는 억제시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 골수유래억제세포(MDSC)를 5x10⁵~2x10⁶의 세포수로 포함하고, 레바미피드를 5-10mg/kg의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈 및 궤양성 대장염 중에서 선택된 것일 수 있다. 을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC)는 골수세포에 15~30ng/ml의 GM-CSF 또는 M-CSF을 처리하고, 2~4일 동안 배양하여 분화시킨 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC)와 레바미피드를 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명에 따른 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드 병용투여에 의한 면역질환의 치료는 면역조절 T 세포(Treg)의 활성을 촉진시키고 자가면역항체의 수준을 감소시켜 과도한 면역반응을 조절하는 기작을 통해 이루어지므로, 염증반응 및 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서, 자가면역질환이 유발된 동물모델에 골수유래억제세포를 단독 처리한 경우, 레바미피드를 단독 처리한 경우 및 골수유래억제세포와 레바미피드를 병용 처리한 경우 각각에 대한 관절염지수의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서, 자가면역질환이 유발된 동물모델에 골수유래억제세포를 단독 처리한 경우, 레바미피드를 단독 처리한 경우 및 골수유래억제세포와 레바미피드를 병용 처리한 경우 각각에 대한 혈액 내 총 IgG, IgG1, IgG2a 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서, 자가면역질환이 유발된 동물모델에 골수유래억제세포를 단독 처리한 경우, 레바미피드를 단독 처리한 경우 및 골수유래억제세포와 레바미피드를 병용 처리한 경우 각각에 대한 면역질환의 개선 정도를 보기 위하여 조직학적 검사를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서, 자가면역질환이 유발된 동물모델에 골수유래억제세포를 단독 처리한 경우, 레바미피드를 단독 처리한 경우 및 골수유래억제세포와 레바미피드를 병용 처리한 경우 각각에 대한 Th17 및 Treg에 미치는 영향을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드를 병용 처리하는 경우, 면역질환을 매우 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다는 사실을 확인하였고, 따라서 본 발명은 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC) 및 레바미피드(rebamipide)를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 면역질환의 치료제로서 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cell)에 관심을 가지며 연구를 진행하였는데, 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cell; MDSC)에 대해서는 아직 많은 연구가 진행되고 있지 않으며, 단지 암 관련해서 이들 세포의 역할이 규명된 바 있는데, 보고된 바에 의하면 골수에서 유래한 억제세포(MDSC)가 암세포나 바이러스에 감염된 세포를 죽이는 면역기능에 중요한 세포독성 T 림프구(CD8 killer T 세포)의 기능을 억제하며, T 세포를 조절하는 기전으로서 산화질소 합성효소와 아르기나제라는 효소가 필수아미노산인 아르기닌의 대사를 조절함으로써 이뤄진다는 내용이 알려져 있다.

즉, 골수유래억제세포는 면역반응이 억제되어야 하는 시기에 활성화된 T세포를 효과적으로 억제하는 역할을 함으로써 면역조절 기능을 하고 있다.

이에 본 발명자들은 이러한 면역조절 기능을 갖는 골수유래억제세포를 이용하여 보다 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있는 새로운 방법을 모색하던 중, 레바미피드를 골수유래억제세포와 병용 처리하는 경우, 면역질환의 증상을 매우 효과적으로 개선 및 치료할 수 있다는 사실을 확인하였다.

한편, 레바미피드(rebamipide)는 종래에 위궤양, 급성위염 또는 만성 위염의 급성 악화로 인한 위 점막 손상의 치료에 탁월한 효과를 가지는 의약제로 알려져 있으며, 소화성궤양 치료제로도 널리 사용되고 있고, 그의 화학명은 2-(4-클로로벤조일아미노)-3-[2(1H)-퀴놀리논-4-일]프로피온산이다.

이 약제는 PGE2 생합성을 촉진시켜 점액을 증가시킴으로써 위점막을 보호하고, 세포증식을 촉진시키며, 특히 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균에 감염된 환자에 있어서 위 점막 세포에 대한 균의 점착 및 침윤을 억제시킴으로써 위 염증을 억제하는 특징을 갖는 것으로 알려진 바 있다.

이에 본 발명자들은 면역질환의 개선 및 치료를 위한 치료제로서 골수유래억제세포를 이용한 세포치료제의 치료효과를 레바미피드 화합물에 의해 상승효과를 볼 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 면역질환, 특히 자가면역질환인 류마티스 관절염이 유발된 마우스 동물모델을 대상으로, 골수세포를 분화하여 수득한 골수유래억제세포를 레바미피드 화합물과 병용처리 한 후, 골수유래억제세포 및 레바미피드 화합물을 단독으로 처리한 군과 관절염 지수 측정을 통해 질환증상의 개선정도를 분석하였다.

그 결과, 골수유래억제세포 및 레바미피드 화합물을 단독처리한 군에 비해 이들을 병용처리한 군의 경우 관절염 지수가 현저하게 감소되는 것으로 나타났고, 특히 병용처리한 군의 경우 다른 대조군들에 비해 처치 후 5일 이내에 관절염 지수가 현격하게 감소되는 것으로 나타났다(도 1 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 골수유래억제세포 및 레바미피드 화합물을 병용 처리하는 것이 매우 단 시간 내에 효과적인 치료 효과를 얻을 수 있는 획기적인 방법 임을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은, 상기 일실시예에서 사용된 실험군 및 대조군 마우스들을 대상으로 혈액 내 IgG의 수준 정도를 측정하는 실험을 수행하였는데, 이는 본 발명에 따른 면역질환 치료 방법, 즉 골수유래억제세포와 레바미피드 화합물의 병용처리가 조절 T 세포(Treg)의 활성을 촉진시켜 자가면역항체를 억제시키는 기작을 통해 이루어지는 것인지 확인하기 위함이다.

이러한 본 발명의 일실시예에 따른 실험 결과, 골수유래억제세포와 레바미피드 화합물을 단독처리한 군에 비해 이들을 병용 처리한 군의 경우 혈장 내 총 IgG의 농도가 가장 많이 감소하는 것으로 나타났고, 자가면역항체인 IgG1 및 IgG2a의 농도도 감소한 것으로 나타났다(도 2 참조).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 골수유래억제세포와 레바미피드를 병용 처리하는 경우, 면역 조절능을 갖는 Treg 세포의 활성에 의해 자가면역항체 수준을 감소시킴으로써 자가면역반응을 억제하여 면역질환을 예방 및 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서 상기 “활성”이란 생체 내에서 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg), 즉, 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.

그러므로 본 발명은 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC) 및 레바미피드(rebamipide)를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 조성물의 유효성분 중 하나인 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC)는 포유류의 골수세포로부터 분화시킨 것을 사용할 수 있는데, 골수세포의 수득은 당업계에 공지된 방법을 통해 수득할 수 있고, 골수유래억제세포로 분화시키는 방법은 상기 골수세포에 GM-CSF 또는 M-CSF을 처리하고 2~4일동안 배양하는 과정을 통해 분화시킬 수 있으며, 이때 상기 골수세포 1x10⁶의 세포수를 기준으로 GM-CSF 또는 M-CSF은 20~30ng/ml의 농도로 처리할 수 있으며, 20ng/ml의 농도로 처리할 수 있다.

또한, 상기 포유류로부터 골수세포를 수득하고 골수유래억제세포로 분화시키기 위한 포유류 유래 골수세포는 정상의 포유류 골수세포 및 면역질환에 걸린 포유류의 골수세포 모두를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 조성물의 유효성분 중의 하나인 레바미피드는 구체적으로 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 1]

또한, 본 발명에 따른 상기 레바미피드 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

상기 본 발명에 따른 레바미피드 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것 모두를 사용할 수 있으며, 상기 골수유래억제세포와 병용 처리하기에 적합한 레바미피드의 처리 농도는 6mg/kg일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물이 치료할 수 있는 대상 질환은 면역질환일 수 있으며, 본 발명에서 상기 “면역질환”은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.

그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 “자가면역질환“이라고 한다.

또한, “염증성 질환”이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.

구체적으로 본 발명에서 적용할 수 있는 상기 면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 “치료”란 용어는“치료하는”이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 “치료”또는 “치료요법”은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역질환을 경감시킴.

(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드를 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 골수유래억제세포(MDSC)는 5x10⁵~2x10⁶의 세포수로 포함될 수 있으며, 본 발명에 레바미피드 화합물은 5~10mg/day/kg, 바람직하게는 6mg/day/체중kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공할 수 있다.

나아가 본 발명은 인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC)와 레바미피드를 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법을 제공할 수 있다.

앞에서도 기술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 면역질환의 치료방법은 골수유래억제세포와 레바미피드를 병용 투여하는 방법을 통해 수행할 수 있는데, 이때 상기 투여는 골수유래억제세포와 레바미피드가 함께 포함된 단일 조성물(single composition) 또는 이들이 각 개별적으로 함유된 개별적인 조성물(separate composition)을 사용하여 수행할 수 있다.

그리고 상기 조성물이 개별적인 조성물(separate composition)의 형태인 경우, 상기 조성물은 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다.

또한, 적절한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 투과점막, 또는 장 투여 격막내, 직접 심실내, 복강내, 또는 안내 주사뿐만 아니라, 근육내, 피하, 정맥, 골수 주사를 포함한 비경구 전달을 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

면역질환 모델 마우스 입수

본 발명자들은 하기 실시예에서 수행할 동물 마우스로서 2000년에 Y.Iwakura팀이 개발한 IL-1 수용체 유전자 결손 마우스(IL-1Ra knockout mouse)를 사용하였는데, 이 마우스는 인터루킨 1 수용체억제인자(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)가 IL-1 수용체에 직접 작용하여, IL-1 알파, IL-1 베타 수용체에 작용하지 못하도록 하여 자연적으로 만성적인 자가면역질환, 류마티스 관절염 질환이 유발된 마우스 모델로서 이를 사용하였다.

< 실시예 2>

골수 유래 억제세포( MDSC ) 분화유도

정상 B/c마우스로부터 골수를 분리한 후, GM-CSF(20ng/ml) 및 M-CSF (20ng/ml)를 처리하고 3일 동안 배양하였다. 배양 후 anti-mouse CD11b PerCP 및 Gr-1 APC 형광이 라벨된 항체를 각각 넣고 반응시킨 다음, CD11b+Gr-1+인 세포만을 분리하였다.

< 실시예 3>

골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드의 병용처리에 따른 관절염 개선정도 분석

본 발명자들은 면역질환의 효과적인 치료 방법으로서, 골수유래억제세포와 레바미피드의 병용처리에 따른 면역질환의 개선 정도를 분석하기 위해, 상기 실시예 2에서 분화시킨 골수유래억제세포(MDSC) 1x10⁶를 레바미피드 6mg/kg와 함께 상기 실시예 1의 관절염 마우스 동물모델에 투여하여 in vivo 내에서의 관절염 개선 정도를 분석하였다. 이때 대조군으로는 상기 질환 마우스 모델에 골수유래억제세포만을 처리한 군, 레바미피드만을 처리한 군 및 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 군은 시간에 따라 관절염 지수가 점점 증가하는 것으로 나타났고, 레바미피드만을 단독 처리한 군의 경우 일시적으로 관절염 증상이 감소된 것으로 나타났으나 다시 증상이 악화되어 치료 효과가 미비한 것으로 나타났다.

반면, 골수유래억제세포(MDSC)를 단독처리한 군은 아무것도 처리하지 않았거나, 레바미피드만을 처리한 군에 비해 월등히 관절염 증상을 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다. 그러나, 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드를 함께 처리한 군은 골수유래억제세포를 단독 처리한 군에 비해 관절염 개선 정도가 더 우수한 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드를 병용 처리하는 경우, 종래 치료 방법에 비해 보다 월등하고 현저하게 면역질환을 치료 및 질환의 발달을 억제할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

IgG 레벨 측정

본 발명자들은 상기 실시예 3에서 실험한 마우스 동물모델들을 대상으로 혈액을 채취한 후, 혈액 내 총 IgG, IgG1 및 IgG2a의 레벨을 측정하였다(Bethyl Lab Co., Montgomery, TX). 먼저 anti-IgG, IgG1,IgG2a 항체를 상온에서 2시간 동안 96-well microtitier plate에 도포한 다음 희석해 둔 혈청 샘플을 well당 50㎕씩 넣고 실온에서 1시간 반응 시켰다. 반응이 끝나면 0.05% Tween 20(Amresco)이 포함된 TBS(pH 8.0)용액으로 3번씩 세척 후, anti-IgG, IgG1,IgG2a HRP 항체를 1시간동안 반응시키고, 위의 용액으로 세척한 후 TMB +H₂O₂ system(KPL, Gaithersburg, MD)으로 발색하였다. 이는 450nm에서 흡광도로 읽었으며, 항체 측정 결과는 흡광도 자체로 표시하였다.

측정 결과, 관절염이 유발된 마우스 군에 비해 골수유래억제세포 및 레바미피를 단독으로 처리한 군들 모두가 총 IgG, IgG1, IgG2a 레벨이 감소하는 것으로 나타났으나, 이들 단독 처리군에 비해 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드(rebamipide, Rb)를 병용처리한 군의 경우, 총 IgG, IgG1, IgG2a 레벨이 더 감소하는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 종합해 볼 때, 면역질환의 치료를 위한 보다 효과적인 방법으로서 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드(rebamipide, Rb)를 병용으로 처리하는 방법을 새롭게 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

조직학적 검사

본 발명자들은 골수유래억제세포와 레바미피드의 병용처리에 따른 면역질환의 개선 정도를 분석하기 위해 조직학적 검사를 실시하였다.

먼저 상기 실시예 2에서 분화시킨 골수유래억제세포(MDSC) 1x10⁶를 레바미피드 6mg/kg와 함께 상기 실시예 1의 관절염 마우스 동물모델에 투여한 뒤 35일 후에 실험동물을 치사시킨 후, 마우스의 뒷발을 10% 포르말린으로 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀으로 블록을 만들었다. 관절 절편(7um)을 준비하고 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)으로 관절 절편을 염색하였다. 또한, 연골파괴 정도를 확인하기 위하여 톨루이딘 블루(Toluidin blue)와 사프라닌 O (Safranin O) 염색 및 TRAP 염색을 하였다.

관절염모델마우스에서 골수유래억제세포(MDSC)와 레바미피드를 병용 투여한 마우스에서의 관절 내 연골 및 염증도를 관찰한 결과, 대조군에 비해 연골과 골파괴 정도가 의미있게 감소되었음을 알 수 있었다(도 3 참조).

< 실시예 6>

관절염 동물모델에서 골수유래억제세포와 레바미피드 병용처리에 의한 Treg 세포 증가 및 Th17 세포 억제 효과

나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 골수유래억제세포와 레바미피드 병용 처리가 Th17 및 Treg에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여 마우스의 비장세포 1× 10⁶의 세포에 anti-CD4 PerCP Ab를 가지고 surface 항체 염색 후 세포 내 사이토카인 IL-17, IFN-r과 Foxp3 Ab로 염색하여 세포내 Th17세포와 Treg세포의 population을 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 대조군인 관절염 실험동물에 비해 골수유래억제세포 또는 레바미피드를 처리한 마우스의 비장에서 면역조절 세포인 Foxp3+Treg의 세포가 증가되어 있으며, 병인세포인 Th1 및 Th17 세포는 감소되어 있음을 알 수 있었고, 이러한 효과는 골수유래억제세포와 레바미피드를 병용 투여한 마우스 군에서 골수유래억제세포 또는 레바미피드를 단독 처리한 군에 비해 월등히 높음을 알 수 있었다(도 4 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

CD11b+Gr-1+ 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC) 및 레바미피드(rebamipide)를 유효성분으로 포함하는, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 및 피부 경화증으로 이루어지는 군에서 선택된 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 CD11b+Gr-1+ 골수유래억제세포(MDSC) 및 레바미피드(rebamipide)는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키고, 혈액 내 총 IgG, IgG1 및 IgG2a의 농도를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 및 피부 경화증으로 이루어지는 군에서 선택된 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 CD11b+Gr-1+ 골수유래억제세포(MDSC) 및 레바미피드(rebamipide)는 염증성 사이토카인인 IL-17의 발현을 감소 또는 억제시키는 것을 특징으로 하는, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 및 피부 경화증으로 이루어지는 군에서 선택된 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 CD11b+Gr-1+ 골수유래억제세포(MDSC)를 5x10⁵~2x10⁶의 세포수로 포함하고, 레바미피드를 5-10mg/kg의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 및 피부 경화증으로 이루어지는 군에서 선택된 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 CD11b+Gr-1+ 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC)는 골수세포에 15~30ng/ml의 GM-CSF(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) 또는 M-CSF(Macrophage Colony Stimulating Factor)을 처리하고, 2~4일 동안 배양하여 분화시킨 것을 특징으로 하는, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 및 피부 경화증으로 이루어지는 군에서 선택된 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 CD11b+Gr-1+ 골수유래억제세포(Myeloid derived suppressor cells: MDSC)와 레바미피드를 병용 투여하는 단계를 포함하는, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 및 피부 경화증으로 이루어지는 군에서 선택된 자가면역질환의 치료방법.
제1항의 조성물을 포함하는 면역억제제.