KR101292451B1

KR101292451B1 - 염증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101292451B1
Application number: KR1020100079192A
Authority: KR
Inventors: 손영숙; 홍현숙; 김도연; 이은경
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2009-08-17
Filing date: 2010-08-17
Publication date: 2013-07-31
Also published as: US20120214729A1; KR20110018273A; US8575089B2; WO2011021833A2; WO2011021833A3

Abstract

본 발명은 서브스턴스-P(Substance P, SP)를 포함하는 염증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의한 서브스턴스-P를 포함하는 조성물은 염증 관련 백혈구, 호중구 및 조혈줄기세포를 혈액 내에 감소시키고, 항염증 관련 사이토카인, 조절 T 림파구, 항염증성 대식세포 등 증가시키는 효과가 있어 염증반응을 조기에 종료시켜 비외상성, 외상성, 감염성 허혈성 손상으로부터 염증을 예방 및 치료하는 탁월한 효과를 제공한다.

Description

염증 예방 또는 치료용 조성물{A composition for preventing or treating inflammation}

본 발명은 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 염증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

다양한 조직 손상 및 세포 괴사(necrosis) (외상손상, 방사선 손상, 항암제 세포손상, 허혈성 손상, 비외상성 자가면역질환, 이식거부반응에 의한 조직손상 등), 이물질 반응, 감염의 경우 모두 염증반응을 유발시킨다. 심각한 정도에 따라 국소적일 수도 있고, 전신에 염증반응이 유발되는 패혈증으로 발전하기도 한다. 많은 염증성 질환, 예들 들어, 패혈증(sepsis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 호흡기질환, RSV 질환(respiratory syncitial virus), 방사선 손상, 위궤양, 위장염, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 아토피성피부염, 심혈관질환, 자가면역질환, 이식거부 반응 등에서 염증은 질병의 주요 원인으로 작용하며 현재 많은 연구자들이 염증 과정을 억제시키기 위해 노력 중이다. 지속적인 염증은 치유가 아니라 조직의 손상을 가속화 시키므로 적당한 염증 반응 억제는 환자의 생존 및 치유를 위해 무엇보다 중요하다고 할 수 있다.

염증세포는 다른 혈액세포들과 같이 골수 내 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSC)로부터 여러 단계의 분화 과정을 거쳐 생성되고, 일단 분화된 세포는 다시 미분화 상태로 복귀할 수 없는 일방적인 반응이다. 따라서 혈액세포의 경우는 림파구를 제외하고는 그 수명이 수일에서 수주로 제한된다. 그러므로 조혈계 세포의 생산은 조혈모세포로부터의 일생을 통한 지속적인 세포분열과 분화에 의하여 이루어진다. 조직에 손상이 생겨 염증세포의 증가가 필요한 환경이 오면 골수에서 빠른 분열능을 가진 HSC 전구세포들의 양이 늘고, 그에 따라 혈중에서도 조혈모세포의 양 또한 증가한다. 이렇게 혈중에서 증가한 HSC는 조혈원기세포(Commitment hematopoietic progenitor cell)의 형태로 분화를 시작한다. 그러므로 혈중 HSC양의 변화는 전체적인 염증반응 및 면역반응에 중요한 역할을 미칠 수 있다.

염증반응의 특징은 혈액내 염증성 혈구세포(백혈구, 호중구, 대식세포 등)와 그 전구세포 및 HSC 들이 많이 분포하게 되고, 염증성 사이토카인(TNF-alpha, IL2, IL4, IL6 등)의 증가와 항염증성 사이토카인(IL10 등) 감소가 특징적이다(Eva Mezey et al, Nature Medicine 2009 vol15, 42-49). 또한 손상조직에 많은 염증세포가 쌓이게 된다.

일반적으로 염증반응은 선천적 면역반응의 생체 방어적 반응 중의 하나이지만, 염증세포 특히 호중구 세포들이 분비하는 활성산소와 단백질 분해효소 등은 주변조직의 심각한 손상을 초래하게 된다. 그러므로 염증반응이 길어지면 만성 혹은 난치성 궤양 등으로 발전하게 되고, 치유 후에도 섬유상 조직(fibrosis)으로 변화되어 조직의 경화(scirosis)를 초래하여 조직의 기능을 현저히 감소시킨다.

염증을 처치하기 위하여 현재는 부신피질호르몬과 소염진통제와 같은 정도의 치료약이 사용되고 있지만, 염증반응에 대한 분자수준의 이해가 증가되면서 새로운 염증치료제의 개발이 이어질 것으로 기대된다.

최근, 자가 면역 반응의 억제에 관련된 조절 T 림파구 (regulatory T cell)와 항염증성 대식세포 (M2 type macrophage) 등 에서 주로 분비되는 것으로 알려진 항염증 사이토카인인 IL-10이 염증 반응 감소 및 자가 면역성 반응 감소에 관여하여, 염증 반응으로 인한 조직 손상을 최소화 하고, 손상 조직의 치유를 촉진시킬 것으로 기대되고 있다. 이러한 최근 연구 결과들을 토대로, 생체 내 항염증 반응을 촉진 및 조절하여 염증 제어 및 자가 면역 질환을 제어하려는 시도가 있으나, 이를 조절하는 기능을 가진 신 물질이 아직 발견되지 못하였다.

서브스턴스-P(이하, '서브스턴스 P' 또는 SP)는 오랫동안 중추신경계에서 통증을 전달하는 신경전달물질로 알려져 있었고, 11개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로서, 사람, 쥐, 토끼에서 동일한 아미노선 서열을 가지고 있어 종간 구별이 없는 일종의 신경호르몬이다. 서브스턴스-P는 신경 세포뿐만 아니라 비신경계 조직 등 다양한 조직에서의 발현 및 작용을 통해 서브스턴스-P가 기존에 알려진 기능인 통증전달 외에, 신경-면역계 상호 조절, 골수 섬유증, 암세포 증식 등 에서 중요한 역할을 할 것으로 기대하고 있다. 또한 서브스턴스-P의 이전의 연구보고들은 서브스턴스-P가 비만세포(mast cell)에서 히스타민 방출(histamine release)을 촉진하고 (Castellani ML et al, Clin Invest. Med 2008 Vol31, E362-72), 과민성 통증(allodynia)을 유발하고(McLeod AL et al, Neuroscience, 1999, Vol89, 891-9), 말초 신경염에 관계할 것(Black PH, Brain Behav. Immun. 2002 Vol 16, 622-53)으로 제시하고 있다. 이러한 보고에 근거하여 서브스턴스-P는 염증유발 신경호르몬(proinflammatory neuropeptide)로 예상되었고, G-CSF와 비슷하거나 더 많은 염증반응을 유도하리라 예측되었다.

그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 G-CSF와 서브스턴스-P의 기능을 비교하던 중 서브스턴스-P가 오히려 다양한 조직 손상에 염증 억제 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명자들은 서브스턴스-P를 유효성분으로 함유하는 염증의 예방 또는 치료용 조성물 등을 제공하고자 한다.

본 발명은 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 혈액 내 염증세포(예컨대, 백혈구, 호중구, 대식세포 등), 조혈줄기세포, 단핵세포, 염증성 사이토카인(예컨대, TNF-alpha, IL2, IL4, IL6 등)의 감소에 의한 것, 또는 혈액 내 항염증성 사이토카인(예컨대, IL10 등), 항염증성 세포(예컨대, 항염증 조절 T 세포, 항염증 대식세포 (M2) 등) 증가에 의한 것인 다양한 염증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 패혈증(sepsis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 호흡기질환, RSV(respiratory syncitial virus) 질환, 방사선 유발 염증, 방사선 손상, 위궤양, 위장염, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 아토피성피부염, 심혈관질환, 자가면역질환, 및 이식거부반응으로 구성된 군으로부터 선택된 염증성 질환 또는 장애(inflammatory diseases or disorders)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 자가면역질환은 류머티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병, 아토피 피부염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선, 천포창, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 일부의 후천성 재생불량성 빈혈, 일차성 간경변(원발성 담즙성 간경변), 베체씨병 (Behcet's disease), 크론씨병, 실리코시스(규소 폐증), 아스베스토시스(석면 폐증), IgA 신장질환, 연쇄상구균감염후 사구체신염(PSGN), 쇼그렌 증후군(Sjㅦgren Syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 피부근염(dermatomyositis), 다발성 근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 그레이브씨 갑상선 항진증(Grave's disease), 결절성 다발성 동맥염(Polyarteritis nodosa), 강직성 척추염 (Ankylosing spondylitis), 섬유조직염 (Fibromyalgia syndrome), 및 측두동맥염(Temporal arteritis)을 포함한다. 이하, 본원에서 자가면역질환은 이와 같은 의미이다.

본 발명은 또한 패혈증(sepsis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 호흡기 감염, RSV(respiratory syncitial virus) 감염, 위염, 장염, 위장염, 및 아토피성피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 염증성 질환 또는 장애의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 호흡기질환, 방사선 손상, 위궤양, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 심혈관질환, 자가면역질환, 및 이식거부반응으로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상을 매개하거나, 1이상에 의해 매개되는 염증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

서브스턴스-P를 유효 성분으로 포함하는 본 발명에 의한 조성물은, 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

서브스턴스-P를 유효 성분으로 포함하는 본 발명에 의한 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

서브스턴스-P를 유효 성분으로 포함하는 조성물의 약제학적 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 연고제, 크림제, 겔제, 점적제, 에어로졸, 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕괴제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토나이트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명은 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 조성물의 염증의 예방 및 치료용도, 혈액 내 염증세포(백혈구, 호중구, 대식세포 등), 조혈줄기세포, 단핵세포, 염증성 사이토카인(예컨대, TNF-alpha, IL2, IL4, IL6 등)의 감소에 의한 염증의 예방 또는 치료용도 및 항염증성 사이토카인(예컨대, IL10 등), 항염증 조절 T 세포, 항염증 대식세포 (M2)의 증가에 의한 염증 예방 및 치료 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 패혈증(sepsis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 호흡기질환, RSV(respiratory syncitial virus) 질환, 방사선 유발 염증, 방사선 손상, 위궤양, 위장염, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 아토피성피부염, 심혈관질환, 자가면역질환, 및 이식거부반응으로 구성된 군으로부터 선택된 염증성 질환 또는 장애의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명은 또한 패혈증(sepsis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 호흡기 감염, RSV(respiratory syncitial virus) 감염, 위염, 장염, 위장염, 및 아토피성피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 염증성 질환 또는 장애의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 호흡기질환, 방사선 손상, 위궤양, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 심혈관질환, 자가면역질환, 및 이식거부반응으로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상에 의해 매개되는 염증의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하는 것을 포함하는 염증, 바람직하게는 패혈증(sepsis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 호흡기질환, RSV(respiratory syncitial virus) 질환, 방사선 유발 염증, 방사선 손상, 위궤양, 위장염, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 아토피성피부염, 심혈관질환, 자가면역질환, 이식거부반응으로 구성된 군으로부터 선택된 염증성 질환 또는 장애의 예방 및 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하는 것을 포함하는 염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하는 것을 포함하는 패혈증(sepsis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 호흡기 감염, RSV (respiratory syncitial virus) 감염, 위염, 장염, 위장염, 및 아토피성피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 염증성 질환 또는 장애의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하는 것을 포함하는 호흡기질환, 방사선 손상, 위궤양, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 심혈관질환, 자가면역질환, 및 이식거부반응으로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상을 매개하거나, 1 이상에 의해 매개되는 염증, 또는 염증성 질환 또는 장애의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 "치료학적으로 유효한 양"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 염증, 바람직하게는 패혈증(sepsis), 관절염 (arthritis), 천식(asthma), 호흡기질환, RSV(respiratory syncitial virus) 질환, 방사선 유발 염증, 방사선 손상, 위궤양, 위장염, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 아토피성피부염, 심혈관질환, 및 자가면역반응으로 구성된 군으로부터 선택된 염증성 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법; 패혈증(sepsis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 호흡기 감염, RSV(respiratory syncitial virus) 감염, 위염, 장염, 위장염, 및 아토피성피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 것 염증성 질환 또는 장애의 예방 또는 치료하는 방법; 또는 호흡기질환, 방사선 손상, 위궤양, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 심혈관질환, 자가면역질환, 및 이식거부반응으로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상을 매개하거나, 1 이상에 의해 매개되는 염증성 질환 또는 장애의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 성인의 경우, 서브스턴스-P를 1일 1회 투여시, 0.001 - 0.5 mg/일, 바람직하게는 0.0001 - 0.005 mg/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 조성물은 경구, 설하, 직장, 피부, 피하, 근육, 복강, 정맥, 동맥, 뇌척수강내, 골수내 등으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 정맥으로 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 치료가 필요한 대상체에 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내 염증을 예방하거나, 감소시키거나, 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 치료가 필요한 대상체에 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하여 혈액 내 조혈줄기세포 감소시키는 것을 포함하는, 대상체 내 염증을 예방하거나, 감소시키거나, 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 치료가 필요한 대상체에 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하여 혈액 내 단핵세포 감소시키는 것을 포함하는, 대상체 내 염증을 예방하거나, 감소시키거나, 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 치료가 필요한 대상체에 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하여 혈액 내 염증세포, 바람직하게는 백혈구, 호중구, 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 감소시키거나, 혈액내 항염증 세포, 바람직하게는 항염증 조절 T 세포 또는 항염증 대식세포 (M2형)로부터 선택되는 1 이상을 증가시키는 것을 포함하는, 대상체 내 염증을 예방하거나, 감소시키거나, 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 치료가 필요한 대상체에 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하여 혈액 내 염증성 사이토카인(예컨대, TNF-alpha, IL2, IL4, IL6)을 감소시키거나 항염증성 사이토카인(예컨대, IL10)을 증가시키는 것을 포함하는, 대상체 내 염증을 예방하거나, 감소시키거나, 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 패혈증(sepsis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 호흡기질환, RSV(respiratory syncitial virus) 질환, 방사선 유발 염증, 방사선 손상, 위궤양, 위장염, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 아토피성피부염, 심혈관질환, 자가면역질환, 이식거부반응으로 구성된 군으로부터 선택된 염증성 질환 또는 장애, 또는 이의 위험을 가지는 대상체에 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내 염증을 예방하거나, 감소시키거나, 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 대상체에 치료학적으로 유효한 양의 서브스턴스-P를 투여하는 것을 포함하고, 염증은 호흡기질환, 방사선 손상, 위궤양, 당뇨성 궤양, 욕창, 신경척추 손상(spinal injury), 치매(dementia), 각막손상, 피부 외상, 심혈관질환, 자가면역질환, 및 이식거부반응으로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상을 매개하거나, 1 이상에 의해 매개되는 것인, 대상체 내 염증을 예방하거나, 감소시키거나, 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 서브스턴스-P를 포함하는 조성물은 염증 예방 및 치료를 목적으로 혈액 내 염증세포, 조혈줄기세포, 단핵세포 및 염증성 사이토카인의 감소 및 항염증성 사이토카인, 항염증 조절 T 세포, 항염증 대식세포(M2)를 증가시키는 효과를 나타낸다.

도 1은 말초혈액에서 분리한 단핵구 세포에 서브스턴스-P 처리시 IL-6과 IL-10의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 2는 말초혈액으로부터 분리한 CD4+ T 세포에 서브스턴스-P 처리시 IL-6과 IL-10의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 3은 말초혈액으로부터 분리한 CD11b+ 대식세포에 서브스턴스-P 처리시 IL-6과 IL-10의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 4는 염증에 의해 증가된 혈중 단핵 세포가 서브스턴스-P의 투여에 의해 조기 감소되는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 염증 반응에 의한 혈액내로 이동하는 조혈모세포가 서브스턴스-P의 투여에 의해 조기에 종료되는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 염증에 의해 증가된 혈중 백혈구 수가 서브스턴스-P의 투여에 의해 감소되는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 방사선 조사시 증가된 염증성 세포수가 서브스턴스-P의 투여에 의해 감소되는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 방사선 조사시 증가된 염증성 사이토카인이 서브스턴스-P의 투여에 의해 감소되는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 방사선 조사시 감소된 항염증성 사이토카인이 서브스턴스-P의 투여에 의해증가되는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 서브스턴스-P의 투여에 의해 장간막 림프절(MLN)의 항염증 조절 T 세포와 항염증 대식세포 (M2)가 증가되는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 서브스턴스-P의 투여에 의해 소장의 항염증 조절 T 세포와 항염증 대식세포 (M2)가 증가되는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 스트렙토조토신 투여로 자가 면역성 당뇨 유발시, 서브스턴스-P의 동시 투여로 췌장 beta 세포의 자가면역성 손상를 억제하는 효과를 나타낸 도이다.
도 13은 스트렙토조토신 투여로 자가 면역성 당뇨 유발시, 서브스턴스-P의 동시 투여에 의한 혈당 유지 효과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 스트렙토조토신 투여로 자가 면역성 당뇨 유발시, 서브스턴스-P의 동시 투여에 의한 체중 유지 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

실시예 1. in - vitro 에서 SP 의 항염증 효과 확인

실시예 1-(1). 말초혈액에 SP 첨가 시 항염증 효과 확인

C57bl/6 마우스(8주령, 성별; male, n=5, 평균체중;20g)의 말초혈액을 채취하여 혈액을 PBS로 2배 희석한 후 튜브에 들어있는 Ficoll 위에 조심스럽게 얹은 후 원심분리를 2200rpm에서 20분간 실시하였다. 원심분리를 하면 아래로부터 적혈구층, ficoll층, 단핵세포층(mononuclear cell layer), 혈장층 순으로 얻어지는데, 적혈구층, ficoll층을 제외한 단핵세포층과 혈장층을 분리하여 PBS 로 1회 세척한 후 세포 수를 확인하여 1x10⁵/0.2ml 농도로 T-cell 활성화 배지(lymphocyte activation media; RPMI, 10% FBS, 100μM 2-mercaptoetanol, 20㎍/㎖ ConA) 에 37도 배양기에서 배양하며 4.5시간 10시간 24시간에 배양 상등액을 취하였다. SP 처리 그룹은 T-cell 활성화 배지에 생리식염수에 용해시킨 SP를 10 nmole/kg 농도로 포함시켜 처리하였다. 배양 배지에서 혈액세포를 4.5시간, 10시간, 24시간 배양 후 배양 상등액의 IL-6과 IL-10의 발현 수준을 ELISA (R&D System)방법으로 확인하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다. -70도씨에 보관 중인 배양 상등액 시료와 냉장 보관중인 시약, 대조군, 표준 단백질을 실온에 꺼내놓았다. 50ul 희석액을 각각의 웰에 넣고 표준, 대조군, 시료을 50ul씩 넣고 플레이트를 가볍게 탭핑해주어 잘 섞이도록 한 후 2시간 실온 방치하였다. 실온 방치 후 용액을 걷어내고 제공된 세척 버퍼를 이용하여 5회 세척한 후 100ul 컨쥬게이트 (IL-10 conjugate, IL-6 conjugate)를 각각의 웰에 넣고 실온에서 2시간 방치하였다. 실온 방치 후 이전과 같은 방법으로 세척하고 100ul 기질 용액을 넣고 빛을 차단한 채 30분간 실온에서 방치하였다. 30분 후 100ul 정지 코돈을 처리하여 반응을 중지시키고 450nm에서 광학적 밀도를 측정하고 표준 시료에 의한 단백질 환산식에 의해 사이토카인 양을 환산하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, SP 처리에 의하여 항염증 사이토카인 IL 10 은 증가하였으나 염증 유발 사이토카인인 IL 6 는 큰 변화가 없는 것을 확인하였다.

실시예 1-(2). SP 첨가 시 CD4 + T 세포 및 CD11b + 대식세포의 항염증 효과 확인

실시예 1-(1)과 같은 방법으로 말초혈액을 채취하여 ficoll 방법으로 RBC와 ficoll 층을 제거하고 MACS (Miltenyi Biotec, Germany) 세포 분리 방법으로 분리하였다.

분리방법은 다음과 같다. CD4-FITC (130-091-608, Miltenyi Biotec, Germany)항체를 10분 처리하고 anti-FITC Microbeads (120-000-293, Miltenyi Biotec, Germany)를 15분간 처리한 후 MACS column 에 로딩하여 CD4+ T 세포를 분리한 후 1x10⁴/0.2ml 농도로 실시예 1-(1)에서와 같이 T-cell 활성화 배지에 30도 배양기에서 배양하며 4.5시간 10시간 24시간에 배양 상등액을 취하였다. 또한 CD11b-FITC (130-081-201, Miltenyi Biotec, Germany) 항체를 10분 처리하고 anti-FITC Microbeads 를 15분간 처리한 후 MACS 컬럼에 로딩하여 CD11b+ 대식세포를 분리한 후 2x10³/0.2ml 농도로 대식세포 활성화 배지(macrophage activation media; a-MEM, 10% FBS, 100μM 2-mercaptoetanol, 20㎍/㎖ ConA) 에 37도 배양기에서 배양하며 4.5시간 10시간 24시간에 배양 상등액을 취하였다. SP 처리와 IL-10, IL-6 발현을 확인은 상기 실시예 1-(1)의 방법과 동일하게 수행하였다.

그 결과를 도 2 및 3에 나타내었다.

도 2 및 3에 나타난 바와 같이, SP 처리에 의하여 CD4+ T 세포 및 CD11b+ 대식세포에서 항염증 사이토카인인 IL-10 발현이 증가하였으나, 염증유발 사이토카인인 IL-6 는 차이가 없는 것을 확인하였다.

실시예 2. 각막 상피 화상 모델에서 SP 의 투여에 의한 항염증 효과 확인

토끼(New Zealand white rabbit, Male, 2.5kg, n=4)를 케타라 (50mg/ml 유한양행)와 럼푼 (23.32mg (Xylazine hydrochloride) /ml,바이엘코리아 주식회사)을 2:1로 섞은 다음 총 900 마이크로리터 (케타라 600 마이크로리터: 럼푼 300 마이크로리터)를 근육에 주사하였다. 근육 주사 후 동일한 마취제 300 마이크로리터(케타라 200 마이크로리터: 럼푼 100 마이크로리터)를 토끼 귀의 정맥에 주사하였다.

토끼 각막의 윤부(limbus) 부분에 1N NaOH 에 충분히 적신 6mm paper disc를 10초간 접촉시켰다. 알칼리 화상 후 각막 상피는 paper disc 크기만큼 제거되었다.

알칼리 화상 직후, 토끼 눈을 생리식염수로 빠르게 세척하였다. 동시에 생리식염수에 용해시킨 SP를 5nmole/kg로 정맥 주사하고 24시간 후 한 번 더 주사하여 투여하였다(화상 후 즉시 및 24시간 후). 대조군은 동량의 PBS를 주사하였다(주사 Volume: 1ml).

알칼리 화상 후 1, 3, 5, 7일째에 말초혈액을 귀 정맥에서 10ml씩 채혈하고, 분리된 혈액 중 2ml은 백혈구 수치 측정을 위해 이용하고 나머지 8ml 혈액은 세포 분리에 이용하였다.

실시예 2-1. SP 의 투여에 의한 혈액 내 단핵세포 수 조기 감소 효과의 확인

위에서 얻은 혈액을 PBS로 2배 희석한 후 튜브에 들어있는 Ficoll 위에 조심스럽게 얹었다. 그 후 원심분리를 2200rpm에서 25분간 실시하였다. 원심분리를 하면 아래로부터 적혈구층, ficoll층, 단핵세포층(mononuclear cell layer), plasma 층 순으로 얻어지는 데, 상기 혈장층을 제거한 후 단핵세포만을 분리하여 새로운 튜브에 담았다. 그 후 PBS를 30ml 넣고 원심분리 한 후(washing step), 세포 수를 카운트하여 ml 당 세포수를 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 세포수는 염증세포를 포함하는 혈액세포의 수로서 전체적인 염증 수치와 비례한다. 도 4에서와 같이, 전체 세포수가 화상 후 초기에는 비슷하게 유지되다가 서브스턴스-P를 주사하지 않은 그룹은 계속 증가하는 반면 서브스턴스-P를 주사한 그룹은 7일째에 감소함을 알 수 있다. 따라서, 서브스턴스-P는 염증세포수의 감소를 통해 염증 치료에 기여함을 알 수 있다.

실시예 2-2. SP 의 투여에 의한 혈액 내 조혈줄기세포 조기 감소 효과의 확인

전체 세포 중 1x10⁴ 개의 세포는 HSC-CFU assay에 이용하였다. 이때 사용하는 배지는 semi-solid 한 HSC-CFU media (Miltenyi; Hematopoietic stem cell-colony forming unit)로 35mm dish에 2ml씩 담았다. 이 배지에서 상기 세포들을 2주 동안 배양 후(5% CO₂, 37도) 현미경 (Leica)을 보며 형성된 콜로니 수를 카운트하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.

두 군의 HSC 수를 비교한 결과, 서브스턴스-P를 주사한 그룹은 초기에 증가 후 3일 이후 바로 감소하는 반면, 주사하지 않은 그룹은 서서히 증가하다가 5일에 peak를 이루고 그 이후에 이르러서야 서서히 감소하기 시작함이 확인된다. 따라서, 서브스턴스-P 투여를 통해, 조혈줄기세포가 혈액으로의 이동하는 시기를 조기에 종료시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 서브스턴스-P가 염증 반응 기간을 단축시킴을 의미하는 결과이다

실시예 2-3. SP 의 투여에 의한 혈액 내 백혈구 감소 효과의 확인

전체 10ml 중 2ml는 혈구 카운팅에 이용하였으며, 백혈구 수치는 Neodin (혈구분석 업체)에서 분석하였다. 상세하게는, 혈액 2ml을 EDTA가 포함된 바이얼에 넣고 잘 섞은 뒤 자동분석기기(SYSMEX Corporation[Japan]사의 SYSMEX XE-2100 혈구자동분석기)에서 전체 백혈구 수치를 분석하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6은 Day0 수치를 기준으로 증가%를 나타낸 것이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 각 군에서의 백혈구 수치는 화상 후 3일까지는 비슷하게 유지되다가 서브스턴스-P를 주사한 그룹은 3일 이후 급속히 감소하지만 주사하지 않은 그룹은 계속 증가하였다. 따라서, 서브스턴스-P의 투여에 의한 혈액 내 백혈구 수치의 감소 효과를 확인할 수 있었다. 이는 서브스턴스-P가 염증반응을 신속히 종료시킴을 의미한다.

실시예 3. 방사선 조사 모델에서 SP 투여에 의한 항염증 효과 확인

방사선 조사한 위장관계의 경우 세포괴사로 인한 심한 염증반응이 유발되고 이는 위염을 포함한 위장관계의 염증을 초래함이 이미 잘 알려져 있어, 방사선 치료의 대표적 피해로 지적되고 있다.

C57bl/6 마우스(8주령, 성별; male, n=4, 평균체중;20g)에 생리식염수에 용해시킨 SP를 5nmole/kg 농도로 방사선 조사 1일 전 및 방사선 조사 직후 꼬리 정맥에 주사하였다. 방사선 조사는 감마레이 방사선 조사장치(¹³⁷Cs, Atomic Energy of Canada, Mississauga, Canada) 에서 8Gy의 방사선을 조사하였다. 방사선 조사 4.5시간 및 1일에 마우스를 희생하여, 혈액을 채취한 후 일부는 CBC(Complete Blood Count) 분석의뢰 하였고, 나머지는 혈청을 분리하여 사이토카인을 분석하였다.

실시예 3-1. 방사선 조사 후 발생하는 혈액 내 염증 세포증가에 대한 SP 의 억제효과 확인

8Gy 방사선 조사 후 4.5시간과 1일에 마우스 혈액을 200ul씩 취하여 EDTA 가 소량 포함된 바이얼에 담아, CBC 분석을 하였다. 그 결과 방사선 조사 후 4.5시간에 혈액 내 염증 세포 증가가 관찰되었고, SP 를 투여한 그룹에서는 염증 세포수가 확연히 감소하는 것을 관찰하였다. 도 7 에서 보는 바와 같이 A)백혈구, B)단핵구, C)호중구는 SP 를 투여하지 않은 그룹에 비해 두 배 이상 감소하였고, D)호산구 또한 30-40% 감소하였다. SP 는 방사선 조사 후 발생하는 염증세포의 증가를 억제하는 효과를 갖는 것으로 확인되었다.

실시예 3-2. 방사선 조사 후 혈액 내 염증성 사이토카인 증가에 대한 SP 의 억제효과 확인

염증 사이토카인으로 잘 알려진 IL-6 및 TNFa를 ELISA (R&D System) 분석하였다. 구체적으로는 다음과 같다.

-70도씨에 보관 중인 혈청 시료와 냉장 보관중인 시약, 대조군, 표준 단백질을 실온에 꺼내놓았다. 50ul 희석액을 각각의 웰에 넣고 표준, 대조군, 시료을 50ul씩 넣고 plate 를 가볍게 탭핑해주어 잘 섞이도록 한 후 2시간 실온 방치하였다. 실온 방치 후 용액을 걷어내고 제공된 세척 버퍼를 이용하여 5회 세척한 후 100ul 컨쥬게이트 (IL-6 conjugate, TNF-a conjugate)를 각각의 well 에 넣고 실온에서 2시간 방치하였다. 실온 방치 후 이전과 같은 방법으로 세척하고 100ul 기질 용액을 넣고 빛을 차단한 채 30분간 실온에서 방치하였다. 30분 후 100ul 정지 코돈을 처리하여 반응을 중지시키고 450nm에서 광학적 밀도를 측정하고 표준 시료에 의한 단백질 환산식에 의해 사이토카인 양을 환산하여 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8A에서 보는 바와 같이 방사선 조사 후 4.5시간에 염증성 사이토카인인 IL-6가 증가하는데 SP 투여 그룹은 그렇지 않은 그룹에 비해 30% 정도 IL-6 증가가 억제되는 것이 확인되었다. TNFa (도 8B) 역시 방사선 조사 1일 후 SP 투여그룹에서 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 3-3: 방사선 조사 후 SP 투여로 혈액 내 항염증성 사이토카인 증가에 대한 효과 확인

항염증성 사이토카인으로 잘 알려진 IL-10을 실시예 2-2와 같은 방법으로 ELISA (R&D System) 분석하였다. 도 9에서 보는 바와 같이 IL-10은 방사선 조사 후 4.5시간에 감소하였으나, SP 를 주사한 그룹은 2배 이상 증가를 보였고, 1일 후에도 SP 투여 그룹에서 IL-10의 양이 증가하는 경향을 확인하였다.

실시예 3-4: 방사선 조사 후 SP 투여에 의한 장간막 림프절 ( MLN ; mesentric lymph node )의 조절 T 세포 ( regulatory T cell )과 항염증 대식세포 ( M2 ) 증가 확인

상기 실시 예 3과 같은 방법으로 위와 같은 방사선 조사를 실시한 후 4.5 시간에 쥐를 희생하여 장간막 림프절 (MLN)을 취하여 단일 세포를 분리하여 3.7% 포르말린에 1시간 고정한 후 FACS (BD FACSCalibur™ : 343098, BD Biosciences, Canada) 분석을 통하여 항염증 관련 T 세포와 대식세포 분석을 실시하였다.

구체적으로, 8Gy 방사선 조사 후 4.5시간에 쥐를 희생하여 개복한 후 장간막 림프절과 소장을 채취하여 각각의 조직을 잘게 자르고 수술용 가위를 사용하여 잘게 다진 후 collagenase type Ⅰ(worthington, USA)와 DNase Ⅰ(sigma, USA)을 37도에서 20분 처리하고 세척과정을 거친 후 단일 세포를 분리하여 3.7% 포르말린에 1시간 실온 고정한다. 포르말린에 고정된 장간막 림프절 단일 세포는 CD4 (130-091-608, Miltenyi Biotec, Germany), FoxP3 (130-093-013, Miltenyi Biotec, Germany) 항체를 이중 염색한 후 FACS 분석을 통하여 조절 T cell (regulatory T cell)분석을 실시하였다. 또한 CD11b (130-081-201, Miltenyi Biotec, Germany), CD206 (ab64693, abcam, UK) 항체를 이중 염색한 후 FACS 분석을 통하여 항염증 대식세포인 M2 분석을 실시하였다. 포르말린에 고정된 소장 단일 세포는 전체 세포 중 T 세포나 대식세포가 차지하는 비율이 1% 미만이기 때문에 앞서 실시 예 1-(2)에서 개제한 MACS 분리 방법으로 CD3(130-092-962, Miltenyi Biotec, Germany)+ 세포와 CD11b+ 세포를 분리한 후 FACS 분석을 실시하였다. CD3로 분리한 세포에 CD4, FoxP3 항체를 이중 염색하여 조절 T cell (regulatory T cell)분석을 실시하고, CD11b로 분리한 세포에 CD11b, CD206 항체를 이중 염색하여 항염증 대식세포인 M2 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 10 및 11에 나타내었다.

도 10 및 11에 나타난 바와 같이, SP를 주사한 그룹에서 장간막 림프절과 소장의 조절 T 세포(regulatory T cell: CD4+, FoxP3+)과 항염증 대식세포인 M2(CD11b+, CD206+)가 증가한 것을 확인하였다.

실시예 4: SP 의 항염증 작용에 의한 자가면역질환의 예방 내지 치료 효과 확인

다양한 염증성 질환과 더불어 당뇨와 같은 자가 면역 질환 또한 과도한 면역반응에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 제 1형 당뇨인 스트렙토조토신(Streptozotocin, 이하, STZ라고도 함)에 의한 당뇨 유발 시 췌장 또는 췌장 관련 림프 조직의 자가 면역 질환으로 알려져 있다. 스트렙토조토신에 의해 당뇨를 유발되며 SP를 처리했을 때 제 1형 당뇨로의 진행이 억제 되었으며 당뇨 유발 후에 SP 를 처리했을 때에도 당뇨 병변이 약해지는 것을 확인하였다.

구체적으로, ICR 마우스 (8주령, 성별; male, n=10, 평균체중;30g)는 생리식염수에 용해시킨 SP를 5nmole/kg 농도로 꼬리 정맥에 주사한 후 STZ (Sigma, USA)를 복강 주사하였다. 스트렙토조토신은 2일 연속 복강 주사하고, SP는 5일간 같은 농도로 정맥 주사하였다. 대조군은 스트렙토조토신 만 주사한 그룹이며, 1주일 경과 후 혈당을 체크하여 당뇨유발을 확인한 후 STZ 주사 7일째부터 SP를 5일간 정맥 주사하였다.

10주간 혈당과 체중을 조사하였다. 2-3일에 한번 씩 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액 한 방울을 취하여 혈당 측정기(Roche, Switzerland)를 사용하여 혈당을 측정하고 동시에 체중을 측정하였다. 그 결과를 도 13, 14에 나타내었다. SP를 STZ와 동시에 투여한 그룹(위의 박스 2번)의 혈당과 체중이 정상 상태로 유지되는 반면 STZ 만을 투여한 그룹(위의 박스 1번)에서는 투약 20일 이후 10마리 모두가 최고 혈당치인 600이상을 나타냈다. 당뇨 유발 후 SP 투여 그룹(위의 박스 3번)은 SP를 투여하던 시기에 단기적으로 혈당이 감소하는 효과를 확인하였다.

11주째 마우스를 희생하여 췌장을 분리하여 인슐린 IHC 염색 (4590, Cell Signaling, USA)을 실시하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타난 바와 같이 결과 SP를 주사한 그룹에서의 인슐린 분비가 높게 나타난 반면 STZ 만 주사한 그룹은 인슐린 분비가 현저히 낮아져 있었다. 이는 인슐린을 분비하는 베타 세포의 사멸이 SP에 의해 억제되었음을 의미하며 췌장의 자가면역질환의 예방 및 억제 효과를 확인한 것이다. 즉, SP가 제 1형 당뇨로의 진행을 억제하며 당뇨 유발 후에 SP 를 처리했을 때에도 당뇨 병변이 약해지는 것을 확인하였다. 이러한 SP의 항염증 효과는 여러 염증성 질환 뿐만 아니라 당뇨와 같은 자가 면역 질환에도 효과가 있는 것으로 보인다.

Claims

서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부염, 심근경색, 일차성 간경변, 크론씨병 및 사구체신염으로 구성된 군으로부터 선택되는 염증성 질환 또는 장애의 예방 또는 치료용 조성물.
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제1항에 있어서, 경구, 설하, 직장, 피부, 피하, 근육, 복강, 정맥, 동맥, 뇌척수강내, 또는 골수내 투여를 위한 조성물.
제5항에 있어서, 정맥 투여를 위한 조성물.