KR20170091064A - Ｎｏｄ２의 아고니스트를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

Ｎｏｄ２의 아고니스트를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 및 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 약학조성물, 상기 상기 줄기세포 또는 그 배양물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 피험체의 면역반응 또는 염증반응을 억제하는 방법, 상기 줄기세포 또는 그 배양물을 이용하여 면역억제제 또는 항염증제의 제조 방법, NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 PGE2 또는 TGF-β1의 제조 방법, NOD2를 발현하는 줄기세포 및 NOD2의 아고니스트를 포함하는 이식체, 상기 이식체의 제조방법, NOD2를 발현하는 줄기세포 및 NOD2의 아고니스트를 포함하는 복합체 및 NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 얻은 배양물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 부작용이 알려진 기존의 면역억제제 및 염증억제제를 대체하는, 부작용이 없고 경제적으로 사용될 수 있는 세포치료제로서 클론스병, 류마티스 관절염, 아토피 등 자가면역질환과 같은 면역질환 및 감염 및 염증질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는바 유용하다.

Description

ＮＯＤ２의 아고니스트를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition comprising stem cells treated with NOD2 agonist or culture thereof for prevention and treatment of immune diseases and inflammatory diseases}
본 발명은 NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 및 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 약학조성물, 상기 상기 줄기세포 또는 그 배양물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 피험체의 면역반응 또는 염증반응을 억제하는 방법, 상기 줄기세포 또는 그 배양물을 이용하여 면역억제제 또는 항염증제의 제조 방법, NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 PGE2 또는 TGF-β1의 제조 방법, NOD2를 발현하는 줄기세포 및 NOD2의 아고니스트를 포함하는 이식체, 상기 이식체의 제조방법, NOD2를 발현하는 줄기세포 및 NOD2의 아고니스트를 포함하는 복합체 및 NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 얻은 배양물에 관한 것이다.
NOD(Nucleotide-binding Oligomerization Domain proteins) 패밀리 단백질은 크게 3개의 도메인으로 구성되는데, N-말단에 존재하면서 단백질-단백질 상호작용에 관하는 CARD(caspase-recruitment domain) 혹은 pyrin 도메인과 중간의 NOD 도메인, 그리고 C-말단의 LRR 도메인으로 구분할 수 있으며, N-말단에 CARD 도메인이 하나 있는 NOD1과 CARD 도메인이 두 개 존재하는 NOD2 단백질로 구분할 수 있다. 이를 합쳐 NLR(NOD Like Receptor)이라고 하며, TLR(Toll Like Receptor)와 함께 생체 내에서 면역 반응에 크게 기여한다. NOD는 대부분의 박테리아 세포벽 표면에 존재하는 PGN의 일부 단편 구조들을 인식하여 선천 반응의 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. NOD1은 위, 대장의 상피세포, 췌장, 폐, 콩팥, 비장의 대식세포, 수지상세포 등에서 발현되며 진핵세포에서는 발현되지 않고 그람 음성균과 몇몇 그람 양성균이 가지고 있는 DAP(diaminopimelic acid)-type의 PGN의 stem-peptide인 dipeptide나 tripeptide를 인식하는 것으로 알려져 있다(Hisamatsu T et al., J. Biol . Chem ., 278:32962, 2003).
NOD2는 골수유래 대식세포, 호중구, 수지상 세포 및 소장의 파네드 세포에 분포하는 단백질로 그 분포가 NOD1보다는 한정된 곳에서 발현되는 특징을 가지고 있다. 또한 특이하게 염증성 사이토카인인 TNF-알파 및 IFN-감마에 의하여 발현이 유도되는 성질이 있어 평상시의 소화관 세포에서는 거의 발현되지 않고 감염 시에만 발현되는 특성을 갖는다. NOD2가 인식하는 아고니스트(agonist; 리간드) 중 가장 널리 알려진 것은 그람 음성균과 그람 양성균의 PGN 성분에 공통적으로 존재하는 MDP(muramyl dipeptide)이다(Girardin SE, et al ., J. Biol . Chem ., 278:8869, 2003).
2003년 Girardin SE의 연구 결과에 따르면, NOD2 knockout 마우스는 정상적으로 성장하지만, 감염유발 모델에서 Listeria monocytogenes 균의 정맥주사에 의한 감염보다는 경구 투여에 의한 감염 유도시 감수성이 매우 높게 나타나는 것을 확인하였다. 이것으로 NOD2는 성장과정에는 관여하지않으며, 전신적으로는 MDP물질을 감지하는 pattern 인식 단백질이지만 장내 Listeria 균주에 대해서는 항균 작용의 선천성 면역 반응을 유도하는 생체 방어 단백질임을 알 수 있다(Girardin SE, et al ., J. Biol . Chem ., 278:8869, 2003). MDP는 면역 반응 자극을 위한 보강제, 항원성 보조제, 면역원을 보조할 수 있는 아쥬반트 등으로 이용 되어왔다(한국 특허출원 공개번호 제1019960033469호, 제1020070031848호 및 제1020100045473호).
한편, 프로스타글란딘 E2(이하 PGE2)는 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2: 5Z, 11(알파)13E, 15S)-11, 15-디하이드록시-9-옥소-프로스타-5, 13-디엔-1-오익산[(5Z, 11(alpha), 13E, 15S)-11, 15-Dihydroxy-9-oxo-prosta-5, 13-dien-1-oic acid])로 표시되는 화합물이며, 생리학적, 그리고 병리학적 환경에서 가장 널리 생산되는 프로스타글란딘이다(Ushikubi F et al., J. Pharmacol . Sci. 83:279, 2000).
PGE2종래의 용도는 출산 준비를 위해 자궁 경부를 준비시키는 데 있었으며 실제로 약학적으로 출산유도에 이용되어 온바, 다음 상표명으로 질 좌약의 형태로 판매 중이다: Cervidil(포레스트 주식 회사), Prostin E2 (화이자 주식 회사), Propess (Ferring 제약 회사), Glandin (Nabiqasim 제약, 파키스탄).
또한 최근 새롭게 면역억제, 조절제로서의 용도가 각광받고 있는데, 이는 대식세포에 의해 생산되는 인터류킨-1베타 및 TNF알파와 같은 사이토카인의 분비를 억제하는 역할을 하며, helper T1 cell의 분화를 억제하는 것이 보고되어 있기 때문이다(Harris SG et al., Trends Immunol., 23:144, 2002). 또한 in vitro에서, PGE2가 인터류킨-2 및 IFN-감마와 같은 사이토카인의 생산을 억제하여, 인간 및 쥐의 T 세포의 분화를 억제하는 것 또한 보고되었다(Goodwin JS et al., J. clin . Immunol., 3:295, 1983). 또한, 위 실험 결과가 보고되어 온바, 면역 조절제로 이용 가능성이 풍부하여, 경제적이고 간편한 생산 방법이 요구되어 왔다.
TGF-β1(Transforming growth factor beta 1)은 면역 억제 및 항염증제로 알려져 있으며, PGE2와 마찬가지로 면역 조절제로 이용 가능성이 풍부하여 경제적이고 간편한 생산 방법이 요구되어 왔다.
한편, 면역억제에는 그 반응만을 억제하는 특이적 억제제와 비특이적 억제제가 있으며, 이론적으로 특이적 억제제의 작용이 뛰어나야 하나, 비특이적 억제제가 주로 사용된다. 임상적으로 가장 흔히 사용되는 면역억제제로는 싸이클로스포린 (cyclosporine, Neoral, Cipol A), 아자치오프린(imuran), 프레드니솔론(일종의 스테로이드)이 있다. 위의 세 가지는 함께 병용했을 때가 따로 복용했을 때 보다 부작용이 적고 면역억제 효과도 가장 높은 것으로 판명되었다. 최근에는 FK 506, RATG, OKT3, Cellcept등 여러 가지 면역억제제가 개발되어 사용되고 있다.
이들 면역억제제는 항원자극에서 항체생성에 이르는 과정 중 대식세포에 의한 항원의 탐식, 림프구 등에 의한 항원 인식, 세포 분열, T세포와 B세포의 분열, 항체 생성 등 몇 가지 과정을 저해시킴으로써 면역 억제를 야기한다. 대부분 항종양 활성을 가지고 있는데, 그 이유는 DNA 장애, DNA 합성 저지 등을 매개로 하여 세포 분열을 저지하기 때문이다.
그러나 이에 따른 대표적인 부작용으로 고혈압과 신독성(콩팥기능이 저하됨)이 있으며 이 부작용의 발생률이 높기 때문에 사용할 때 충분히 경과를 관찰해야 하는 등의 문제가 있어 왔다. 그 외 부작용으로 드물게 떨림, 발작, 간염, 담액 저류, 혈중 뇨산증가, 근육기력 저하, 조모증 (hypertrichosis), 치은 비대(gingival hypertrophy)등이 있다. 흔히 쓰이는 억제제 중 아자치오프린은 백혈구수치의 감소, 빈혈, 혈소판 감소 등 골수 기능을 억제하기도 하며 췌장염, 간염, 담즙저류와 함께 드물게 탈모, 발열 등을 보이는 합병증이 있을 수 있다. 스테로이드 제제의 하나인 프레드니솔론은 면역 억제제 중 가장 먼저 사용되기 시작하였으며 가장 광범위한 억제 작용을 보인다. 식욕을 증진시켜주며 어깨와 등의 근육을 증가시키고 일시적으로는 행복감을 가져다 주기도 하나 이러한 스테로이드제제는 동맥 경화증을 촉진시킬 뿐 아니라 고혈압, 위궤양, 당뇨, 성장 저해, 골다공증, 백내장, 녹내장 등을 일으키므로 주의해야 할 약물이다.
장기이식과 조혈모세포이식 등과 같은 동종 이식은, 21세기에 이르러 이루어낸 획기적인 의료 성과로서, 확장성 심근병증과 같은 심부전, 만성 신부전 및 난치성 혈액질환 등의 말기 질환에서 근본적인 치료 방법으로 이용되고 있다. 그러나 동종 이식 후 발생되는 치명적인 합병증인 이식 장기의 거부 또는 이식편 대 숙주병(graft-versus-host-desease, GVHD)와 같은 면역학적 반응을 극복해야 하는 문제점이 있다. 현재 쓰이는 기술로는, 이러한 면역학적 반응을 최소화하기 위하여 이식 후 나타나는 면역반응은 동종항원을 인지한 T 세포에 의해서 세포성 면역으로 발생되어 T 세포의 면역반응을 조절하기 위한 치료법(Ikehara S, Exp . Hematol ., 31:1142, 2003; First MR, Transplantation , 77:88, 2004), 즉, 면역억제제인 싸이클로스포린, FK506을 이용하여 T 세포의 interleukin(IL)-2의 생성을 억제하여 면역반응을 조절하는 치료법을 이용하고 있으나, 부작용이 없으면서도 경제적으로 사용될 수 있는 면역억제제의 개발이 필요하여 왔다.
한편, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)의 면역조절능력에 대한 정확한 작용기전은 아직 상세히 알려지지 않았으며, 다만 최근 중간엽 줄기세포와 관련하여 다음과 같은 몇 가지 보고들만이 제시되었다. 첫째, 중간엽 줄기세포는 APC(antigen presenting cell)를 억제하는 효과가 있는 것으로 보인다. 특정 조건에서 배양과정 중 첨가된 단핵구 수에 비례하여 면역반응 정도가 변하는 것으로 보아 결국 단핵구가 면역억제효과에 관여하는 것으로 추정할 수 있다. 둘째, 중간엽 줄기세포가 T 세포의 증식속도를 조절함으로써, 면역억제 효과를 나타내는 것으로 보인다. T 세포를 중간엽 줄기세포와 함께 배양하는 경우, cyclin D2가 억제됨에 따라 T 세포가 세포주기 중 G0/G1 시기에 머물러 더 이상 증가하지 않는다. 또한 중간엽 줄기세포를 제거한다 하더라도 증식능력은 지속적으로 저하되는 것으로 보고되었다(Glennie S et al ., Blood, 105:2821, 2005).
이에, 본 발명자들은 줄기세포를 이용하여 더 효과적으로 면역 또는 염증을 조절하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, NOD2 수용체가 줄기세포에서 발현되며 NOD2 수용체를 통하여 줄기세포가 면역조절함을 확인한 다음, NOD2의 아고니스트인 MDP를 줄기세포에 처리함으로써 PGE2 및 TGF-β1이 유의적으로 과량생산되어 면역반응을 보다 더 효과적으로 억제하며, 대장염 모델 및 아토피 모델에서 치료 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 종래의 면역억제제 및 염증억제제를 대체할 수 있는 부작용이 없고 경제적인 NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는, 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 면역질환 또는 염증질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역질환 또는 염증질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 줄기세포 또는 그 배양물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 피험체의 면역반응 또는 염증반응을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역억제제 또는 항염증제의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다양한 용도로 사용되고 있는 프로스타글란딘 E2 및 TGF-β1의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 NOD2를 발현하는 줄기세포 및 NOD2의 아고니스트를 포함하는 이식체 또는 상기 이식체에서 줄기세포를 제거한 이식체 및 상기 이식체들의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 NOD2를 발현하는 줄기세포 및 NOD2의 아고니스트를 포함하는 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양하여 얻은 배양물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에서는, NOD2 (Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)의 아고니스트를 줄기세포에 처리한 경우, 그 중간엽 줄기세포에서 PGE2 및 TGF-β1의 분비가 촉진되고 차례로 면역 및 염증을 조절하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명은 줄기세포의 면역 및 염증조절기능이 NOD2와 관련 있음을 확인하였고, 또한 NOD2 아고니스트로 처리된 줄기세포의 향상된 면역억제 및 염증억제효과를 확인하여, NOD2 아고니스트가 처리된 줄기세포 및 그 배양물이 면역조절 및 염증조절을 위한 세포치료제로 이용될 수 있음을 확인하여, NOD2 (Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물로 이용될 수 있음을 제시한다. 본 발명에서 용어, "NOD2"와 "NOD2 수용체"는 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "아고니스트 (agonist)"는 일반적으로 수용체(receptor)를 긍정적으로 자극하는 역할을 하는 화학물질을 뜻하는 것으로, 효능제라고도 불린다. 즉, 안타고니스트(antagonist), 길항제와는 반대로, 일반적인 리간드를 방해하거나 반대의 역할을 수행하는 대신, 아고니스트는 긍정적인 역할을 수행한다. 본 발명에서는 일반적으로 수용체와 결합하는 화학물질을 뜻하는 용어인 "리간드(ligand)"와 병행하여 사용될 수 있으며, 본 발명의 목적상 NOD2 아고니스트 일 수 있다.
본 발명에서 용어, "NOD2 아고니스트"는 NOD2 수용체에 결합하여 NOD2를 활성화시킬 수 있는 물질은 제한 없이 의미하나, 그 예로, MDP(Muramyl Dipeptide)일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "MDP"는 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide)로, 본 발명에서는 NOD2 경로를 활성화 시켜 중간엽 줄기세포가 PGE2를 분비촉진하도록 하는 아고니스트로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 아고니스트를 "첨가하여 배양"은 예를 들어, 중간엽 줄기세포의 배지에 아고니스트를 첨가하여 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 100㎍/ml 농도로 0.1 내지 200 시간 동안, 더욱 바람직하게는 1 내지 72 시간 동안 아고니스트를 첨가하여 배양하는 것일 수 있다. 또한, 아고니스트를 첨가하여 배양한 후, 배지를 교체하여 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "줄기세포"는 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 '미분화세포'이고, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)"는 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래하는 다분화성의 성질을 갖는 줄기세포를 의미한다. 예를 들어, 골수(bone marrow)로부터 유래된 중간엽 줄기세포는 지방조직, 뼈/연골 조직, 근육조직으로 분화될 수 있는 다분화성에 의해 세포치료제로서의 개발을 위해 다양한 연구가 진행되고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 인간의 성체줄기세포, 인간의 만능줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells), 동물의 배아줄기세포 또는 동물의 성체줄기세포일 수 있다. 한편, 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 유래의 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)일 수 있으며, 특히, 인간 유래의 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cell;hUCB-MSC)일 수 있다. 각 유래에서 줄기세포를 얻는 방법은 종래 당업계에 공지된 방법에 의할 수 있으며, 본 발명의 실시예의 방법에 한정되지 않는다.
바람직하게는 인간 유래 중간엽 줄기세포에 MDP를 1 내지 100㎍/ml 농도로 0.1~200시간 동안 처리한 중간엽 줄기세포를 이용하는 것이다. 0.1시간 보다 적은 시간 동안 MDP를 첨가하는 경우, NOD2 경로가 충분히 활성화 되지 못할 수 있으며, 200시간 이상 MDP를 첨가하는 것은 경제적으로 큰 이익이 없으므로, 더 바람직하게는 0.1~200시간, 더 더욱 바람직하게는 1~72시간, 가장 바람직하게는 24시간 동안 MDP를 처리한 중간엽 줄기세포를 이용할 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포의 배양에 사용되는 배지로서는 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 예를 들면 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 또는 Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium)을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 D-media(Gibco)를 사용할 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포 배지는 첨가제로 보충될 수 있다. 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.
또한, 배지는 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent), 예컨대 Invitrogen이 판매하는 것들(Cat # 0010057AE)을 포함하는 것이 유익할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 NOD2 아고니스트 중 하나인 MDP(Muramyl Dipeptide)를 첨가하여 배양한 줄기세포의 배양물이 단핵세포 (MNC)의 증식을 억제하는 것을 확인하였다.
단핵 세포는 혈류를 순환하다가 조직으로 이동하게 되고, 그곳에서 대식세포로 성숙하게 된다. 단핵 세포, 대식세포 및 수지상 세포는 신체의 면역 방어 시스템에서 가장 중요한 것으로, 이들의 항원 제시 능력과 T-림프구의 기능을 조절하는 능력을 통하여 후천성 면역 반응을 유도하는 데 있어서 중추적인 역할을 한다. 한편, 단핵 세포 및 대식세포는 면역 과정에 있어서 1차 방어선 중 하나이다. 또한, 단핵 세포는 후천성 면역 반응의 인식 단계 및 활성화 단계에서 보조 세포로서의 기능을 한다. 이들의 주된 기능은 항원을 T- 림프구에 의해 인식될 수 있는 형태로 제시(Antigen Presenting Cell;APC)하고, T 세포 활성화를 위한 2차 시그널로서 작용하는 막 단백질 및 분비형 단백질을 생산하는 것이다. 일부 단핵 식세포는 수지상 세포로 분화될 수 있으며, 수지상 세포는 단백질 항원에 대한 T 림프구 반응을 유도하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 따라서, 세포 및 장기 이식 시 면역거부반응이 일어나는 경우, 체내에서 이식된 세포/장기를 외부 물질로 인식하여 단핵 세포, 대식세포 및 수지상 세포가 증가하게 된다. 따라서 MDP(Muramyl Dipeptide)를 첨가하여 배양한 줄기세포의 배양물에 의하여 단핵세포 증식이 억제될 경우, 체내 면역반응이 억제되는 것은 당업자에게 자명한 사항이라고 할 것이다.
본원에서 "단핵세포"는 골수 및 말초혈액 세포에서 유래되는 단핵 식작용 백혈구를 뜻한다.
아울러 본 발명의 다른 실시예에서는 MDP(Muramyl Dipeptide)를 첨가하여 배양한 줄기세포가 PGE2 및 TGF-β1 분비를 촉진하며, MNC 억제가 PGE2 및 TGF-β1에 의한 것임을 확인하였다. 이러한 PGE2는 염증 사이토카인인 인터류킨-1베타 및 TNF알파와 같은 사이토카인의 분비를 억제하는 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 또한 TGF-β1는 항염증 사이토카인으로 보고되고 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예는 MDP 처리한 줄기세포는 항염증 사이토카인인 IL-10을 높은 수율로 생산함을 제시하였다. 아울러, 조절 T 세포 군집을 형성함을 제시하고 있다.
따라서, 본 발명에 따른 줄기세포 및 그 배양물은 면역질환 및 염증질환의 예방 및 치료에 유용하다. 이때, 상기 면역질환 또는 염증질환은 자가면역질환, 이식거부, 이식편대숙주병, 관절염, 세균감염, 패혈증 또는 염증 등일 수 있으며, 상기 자가면역질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염 등일 수 있다.
본 발명에서 용어, "염증질환"은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 또는 다발성 경화증일 수 있다.
본 발명에서 용어, "면역질환"이란 특정 면역 반응이 일어날 경우 문제가 되는 질환을 의미로서, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 자가면역질환, 이식거부, 이식편대숙주병 일 수 있으며, 자가면역질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염 등일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면 대장염 동물 모델 및 아토피 모델에서 본 발명에 따른 줄기세포 또는 그 배양물이 염증질환인 대장염을 치료하며, 면역질환인 아토피를 치료하는 것을 확인하여 면역질환 및 염증질환에 치료 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 면역질환 또는 염증질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여로 면역질환 또는 염증질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명의 조성물은 1㎖ 당 1.0×105개 내지 1.0×109개, 바람직하게는 1.0×106개 내지 1.0×108개, 보다 바람직하게는 1.0×107개의 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 동결되지 않은채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife®) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson), 메드셉 (Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.
상기 줄기세포의 1일 투여량은 1.0×104 내지 1.0×1010 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×105 내지 1.0×109 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 NOD2 아고니스트가 처리된 줄기세포 및 그 배양물을 투여함으로써 면역반응을 억제하거나 염증을 조절할 수 있는바, 본 발명은 NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양한 줄기세포 또는 그 배양물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 피험체의 면역반응 또는 염증반응의 억제방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "피험체"란 소, 개, 돼지, 닭, 양, 말, 인간을 포함한 포유동물을 의미하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 면역반응 또는 염증의 억제방법은 인간을 제외한 동물로 한정되는 것일 수 있다. 아울러, 바람직하게는 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양한 줄기세포 또는 그 배양물의 투여는 복강 또는 혈관 내 투여, 병변으로의 직접 투여 또는 관절의 활강(Synovial cavity) 내 투여 등일 수 있다.
상기 면역반응 또는 염증 반응의 억제는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 면역억제제 또는 항염증제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "면역억제제"란 상기에서 설명한 바와 같이, NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양하여 수득한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 제제로 면역 반응을 억제하여 면역질환을 치료할 수 있는 제제를 의미한다.
본 발명에서 용어, "항염증제"란 상기에서 설명한 바와 같이, NOD2를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양하여 수득한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 제제로 염증을 억제하여 염증질환을 치료할 수 있는 제제를 의미한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)를 발현하는 줄기세포를 NOD2의 아고니스트를 첨가한 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 배양시 상기 줄기세포에서 PGE2(Prostaglandin E2) 또는 TGF-β1(Transforming growth factor beta 1)이 분비되는 것이 특징인 PGE2 또는 TGF-β1의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에 따르면 MDP를 처리하지 않은 중간엽 줄기세포 및 다른 수용체의 아고니스트들(DAP, LPS, Pam3CSK4 등)를 처리한 중간엽 줄기세포에 비하여, MDP를 처리한 중간엽 줄기세포는 여러 유용한 용도로 사용되는 것으로 알려진 PGE2 및 TGF-β1의 분비를 현저하게 촉진함을 확인하였다.
본 발명에 있어서, PGE2 및 TGF-β1의 회수는 상기 줄기세포를 배양한 배지를 수거하여 원심 분리 및 여과하여 세포 및 부유물을 제거하고 나머지 상층액을 회수하여 얻을 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)를 발현하는 줄기세포 및 NOD2의 아고니스트를 포함하는 이식체를 제공하는 것이다.
본 발명에서 용어, "이식체"란 손상된 부위를 외부로부터 격리하거나 이식된 세포나 분비된 치료 물질이 머물러 있도록 하는 지지체로서, 인체 또는 포유동물에 이식될 수 이는 물질을 의미한다. 이와 같은 이식체는 조직공학용 지지체로서 생분해성을 가지는 합성고분자와 천연재료 등 당업계에 다양하게 사용되는 물질을 제한없이 포함한다. 본 발명의 이식체는 NOD2를 발현하는 줄기세포 및 NOD2의 아고니스트를 포함하고 있기 때문에, 이식체로 인한 면역거부 반응 또는 염증반응을 야기하지 않는 장점이 있다. 따라서, 다양한 이식체를 체내에 이식하였을 경우 발생할 수 있는 면역거부 반응 또는 염증반응을 억제하기 위한 별도의 면역거부반응 억제제 또는 항염증제의 투여가 없어도 이식된 이식체가 생체 내에 면역거부 반응이나 염증 발생 없이 안정적으로 생착할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 이식체 상에서 NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양한 후 줄기세포를 제거한 이식체를 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 이식체 상에서 NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)를 발현하는 줄기세포에에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 이식체 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는 배양단계 이후에 줄기세포를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)를 발현하는 줄기세포 및 NOD2의 아고니스트를 포함하는 복합체를 제공한다.
바람직하게 상기 복합체는 줄기세포의 NOD2에 NOD 아고니스트가 결합되어 있는 것일 수 있다. 더 바람직하게는 상기 복합체는 줄기세포의 NOD2에 NOD2 아고니스트가 결합되어 NOD2가 활성화되어 있는 것일 수 있다. 상기 복합체는 세포 치료제로 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)를 발현하는 줄기세포에 NOD2의 아고니스트를 첨가하여 얻은 배양물을 제공한다.
상기 배양물에는 면역질환 또는 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 발휘할 수 있으며, PGE2 및/또는 TGF-β1과 같은 성분이 존재할 수 있다.
본 발명은 면역질환 및 염증질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 약학조성물을 제공하는 효과가 있다. 또한, 여러 유용한 용도가 알려진 PGE2 및 TGF-β1을 구성적으로 간이하고, 경제적이면서도 화학공정이 없이 향상된 수율로 생산할 수 있는 PGE2 및 TGF-β1의 제조 방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 부작용이 알려진 기존의 면역억제제 및 염증억제제를 대체하는, 부작용이 없고 경제적으로 사용될 수 있는 세포치료제로서 클론스병, 류마티스 관절염, 아토피 등 자가면역질환과 같은 면역질환 및 염증질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는바 유용하다.
도 1A는 hUCB-MSC에서 TLR과 NLR이 발현됨을 보이는 mRNA RT-PCR 결과 사진이며, 1B 내지 1E는 각 아고니스트를 처리한 후, IL-8의 발현양 및 MSC의 증식 정도를 측정한 그래프이다.
도 2는 각 아고니스트를 처리한 후, MNC의 증식에 대한 hUCB-MSC의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 각 아고니스트를 처리한 후, hUCB-MSC 배양물의 MNC 증식에 대한 효과(3A 및 3B), splenocyte 증식에 대한 효과(3C)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 MDP만 처리한 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC #618)의 배양물의 억제효과 비교(4A) 및 siRNA 처리 실험결과(4B)를 나타내는 그래프이다.
도 5는 MDP만 처리한 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC #620)의 배양물의 억제효과 비교(5A) 및 siRNA 처리 실험결과(5B)를 나타내는 그래프이다.
도 6A는 각 수용체에 대한 아고니스트들의 처리에 따른 PGE2 분비량을 나타내고, 6B는 각 수용체에 대한 아고니스트들의 처리에 따른 COX-2 발현양을 나타내고, 6C는 siNOD2 및 siRip2 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 COX-2 발현양의 변화를 나타내고, 6D는 siNOD2, siRip2 및 인도메타신(indo) 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 PGE2 분비량의 변화를 나타내고, 6E는 인도메타신(indo) 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 MNC 증식 억제 효과 변화를 나타내며, 6F는 siNOD2 및 인도메타신(indo) 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 IL-10 분비량의 감소효과를 나타내는 그래프이다.
도 7A는 각 수용체에 대한 아고니스트들의 처리에 따른 NO 생성량을 나타내고, 7B는 각 수용체에 대한 아고니스트들의 처리에 따른 PGE2 분비량을 나타내고, 7C는 각 수용체에 대한 아고니스트들의 처리에 따른 TGF-β1의 분비량을 나타내고, 7D는 각 수용체의 아고니스트들의 처리에 따른 COX-2 발현양의 변화를 나타내고, 7E는 PGE2 존재하에서 MNC의 증식 억제 효과를 나타내고, 7F는 PGE2 존재하에서 splenocyte의 증식 억제 효과를 나타내며, 7G는 인도메타신(indo) 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 MNC 증식 억제 효과 변화를 나타내며, 7H는 TGF-β1의 중화항체(a-TGF-β1) 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 MNC 증식 억제 효과 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 hUCB-MSC에서 NOD2 및 Rip2 양 유전자 각각의 siRNA에 의한 상기 유전자 및 단백질의 발현이 현저하게 억제되는 것을 나타낸 도이다.
도 9A는 siNOD2 및 siRip2 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 COX-2 발현양의 변화를 나타내고, 9B는 siNOD2, siRip2 및 인도메타신(indo) 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 PGE2 분비량의 변화를 나타내고, 9C는 siNOD2 및 siRip2 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 TGF-β1 분비량의 변화를 나타내고, 도 9D는 siNOD2 및 siRip2 처리에 따른 MDP의 MNC 증식 억제 효과에 대한 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10A는 siNOD2, siRip2, 인도메타신(indo) 및 TFG-β1 중화항체(a-TFG-β1) 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 IL-10 분비량의 변화를 나타내고, 10B는 siNOD2, siRip2, 인도메타신(indo) 및 TFG-β1 중화항체(a-TFG-β1) 처리에 따른 MDP에 의해 향상된 Treg 군집의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 제대혈 유래 중간엽줄기세포(UCB-MSC), 지방유래 줄기세포(AD-MSC) 및 양막상피줄기세포(AEC)에서 NOD2, RIP2 및 RPL13A이 발현됨을 보이는 mRNA RT-PCR 결과 사진이다.
도 12A는 각 실험군 및 대조군에 따른 Colitis 모델에서 체중 감소 변화를 나타낸 그래프이고, 12B는 생존율을 나타낸 그래프이며, 12C는 질병 활성 지수의 변화를 나타낸 그래프이며, 12D는 대장의 길이를 나타낸 도이며, 12E는 장의 길이를 나타낸 그래프이고, 12F는 염증 정도와 부종, 염증 세포의 침윤 정도를 나타낸 조직병리학 사진이고, 12G는 병리학적 점수를 나타낸 그래프이다.
도 13A는 DSS-처리로 유도된 대장염 마우스 모델의 대장에서 MDP에 의해 IL-6, IFN-γ 및 IL-10 분비량의 증감 여부를 나타낸 그래프이고, 13B는 대장염 마우스 모델의 대조군 및 실험군에서 MDP 및 siNOD2 처리군에 따른 Fox3p+ 세포의 대장에서 국지화 여부를 형광 현미경으로 관찰한 사진이고, 13C는 대조군 및 실험군에서 MDP 및 siNOD2 처리군에 따른 Fox3p의 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 나타낸 도이고, 13D는 웨스턴 블롯 결과를 수치화한 그래프이며, 13E는 마우스 대장에서 염증세포의 침윤 정도를 MPO 활성, CD4+, CD11b+세포의 침윤 정도를 분석한 그래프이다.
도 14는 아토피성 피부염을 유발한 생쥐에 MDP를 처리한 hUCB-MSC를 정맥 또는 피하주사를 통해 주입한 후, 그 육안병변을 평가한 그래프이다.
도 15는 아토피성 피부염의 지표인 혈청 내 면역글로불린 E 수치를 나타낸 그래프이다.
도 16은 아토피성 피부염의 지표인 혈청 내 면역글로불린 G1 수치를 나타낸 그래프이다.
도 17은 마우스의 피부조직을 조직 처리한 후 H&E 염색을 한 도이다.
도 18은 마우스의 피부조직을 조직 처리한 후 Toluidine blue 염색을 하여 아토피 피부염의 주요 병변 중 하나인 비만세포의 탈과립 정도를 평가한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 방법에 대하여만 예시되어 있으나, 다른 NOD2 수용체를 가지는 중간엽 줄기세포 및 줄기세포에 대해서도 NOD2 아고니스트를 처리함으로써 PGE2의 생산량을 현저히 증가시켜 면역억제 또는 염증억제 효과를 얻을 수 있음은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다고 할 것이다.
아울러, 하기 실시예에서는 NOD2 아고니스트로서 MDP가 사용되었으나, 하기 실시예에서 볼 수 있듯이, NOD2 수용체를 억제한 줄기세포는 면역조절 효과가 없음을 확인한바, 다른 NOD2 아고니스트를 사용하여서도 본 발명의 면역억제 또는 염증억제 효과를 얻을 수 있음은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다고 할 것이다.
실시예 1: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 ( human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells ; 이하, hUCB - MSC )와 인간 제대혈 유래 단핵구 세포 ( human Umbilical Cord Blood Mononuclear Cells ; 이하, hUCB - MNC )의 분리와 배양
UCB(Umbilical Cord Blood) 샘플들은 산모의 허락을 얻어 보라매 병원과 서울대학교 IRB(IRB No. 0603/001-002-07C1)에서 출산 직후 탯줄 정맥에서 얻었다. UCB 샘플들을 Hetasep 용액 (StemCell Technologies, 밴쿠버, 캐나다)과 5:1의 비율로 섞은 다음, 실온에서 배양하여 적혈구를 제거하였다. 단핵 세포는 피콜 용액을 첨가하여 2500 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 수집하여 획득하였다. 분리된 세포는 PBS로 두 번 세척하였다.
hUCB-MNCs(단핵 세포)는 10% FBS(fetal bovine serum)이 첨가되어 있는 RPMI-1640(Gibco,Grand Island, NY, USA) 배지에서 배양하였다.
hUCB-MSCs(중간엽 줄기세포)는 EGM-2 SingleQuot과 10% FBS(Gibco BRL)가 포함된 D-media(Formular No.78-5407EF, Gibco BRL)에서 2×105 ~ 2×106 cells/㎠ 의 농도로 배양하였다. 3일 후 붙어있지 않은 세포들을 제거하였다. 바닥에 붙어있는 세포들은 콜로니를 형성하고 빨리 자랐으며, spindle 모양을 나타내는 것을 확인하고, 각 UCB 샘플에서 분리된 중간엽 줄기세포들은 각각 #618과 #620으로 명명하였다.
실시예 2: hUCB - MSC 가 발현하는 수용체의 확인
2-1: TLR2 , TLR4 , NOD1 , NOD2 가 hUCB - MSC 에서 기능적으로 발현되는지 여부 확인
TLR2(Toll Like Receptor 2), TLR4(Toll Like Receptor 4), NOD1(Nucleotide-binding Oligomerization Domain proteins 1) 및 NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain proteins 2)가 hUCB-MSC에서 기능적으로 발현되는지 여부를 RT-PCR을 통하여 알아보았다.
구체적으로, hUCB-MSC의 모든 RNA는 Easy-spin total RNA extraction kit (Intron Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 추출하였다. cDNA는 1㎍의 RNA에서 Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 oligo (dT) primers (Invitrogen)를 이용하여 만들었다. 프라이머 세트는 아래와 같다. (F : Forward, R : Reverse)
TLR2 F (서열번호 1): 5'-GATGCCTACTGGGTGGAGAA-3'
TLR2 R (서열번호 2): 5'-CGCAGCTCTCAGATTTACCC-3'
TLR4 F (서열번호 3): 5'-ACAGAAGCTGGTGGCTGTG-3'
TLR4 R (서열번호 4): 5'-TCTTTAAATGCACCTGGTTGG-3'
NOD1 F (서열번호 5): 5'-CCACTTCACAGCTGGAGACA-3'
NOD1 R (서열번호 6): 5'-TGAGTGGAAGCAGCATTTTG-3'
NOD2 F (서열번호 7): 5'-GAATGTTGGGCACCTCAAGT-3'
NOD2 R (서열번호 8): 5'-CAAGGAGCTTAGCCATGGAG-3'
Rip2 F (서열번호 9): 5'-CCATTGAGATTTCGCATCCT-3'
Rip2 R (서열번호 10): 5'-ATGCGCCACTTTGATAAACC-3'
RPL13A F (서열번호 11): 5'-CATCGTGGCTAAACAGGTAC-3'
RPL13A R (서열번호 12): 5'-GCACGACCTTGAGGGCAGCC-3'
PCR 조건은 95℃에서 3분 동안 해리시킨 후, 30 사이클을 돌리고, 10분 동안 72℃에서 마지막으로 신장시켰다. 한 사이클은 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 구성하였다. PCR 결과물은 1.5% 아가로즈 젤에서 분리하였으며, 젤 도큐멘테이션 시스템에서 가시화시키고, 사진 촬영하였다.
그 결과 도 1A에 나타난 바와 같이, 인간 monocytic leukemia 세포주 THP-1 세포를 양성 대조군으로 사용하였을 때, 모든 수용체가 THP-1세포와 hUCB-MSC에서 나타난 것을 확인하였다. TLR4는 THP-1세포보다 hUCB-MSC에서 더욱 높게 나타났다. 반면에 TLR2, NOD1, NOD2는 THP-1세포에서 더욱 높게 나타났다. 한편, Rip2도 hUCB-MSC에서 발현하는 것이 관찰되었다.
2-2: 발현 확인된 수용체의 아고니스트 자극에 따른 사이토카인( Cytokine ) 생산 분석
상기 실시예 2-2에서 발현이 확인된 수용체의 기능성을 알아보기 위하여, 아고니스트의 자극에 대응한 IL-8의 생산을 점검하였다. hUCB-MSC 를 2 x 104 / well로 96 well, 2% FBS 을 보충한 KSFM 배지에 배양을 시작하였다. 24시간 후, 각각 수용체의 아고니스트인 Pam3CSK4 (TLR2 아고니스트, Pam3), LPS (TLR4 아고니스트), Tri-DAP (NOD1 아고니스트, T-DAP), 및 MDP (NOD2 아고니스트)로 처리하여 24시간을 더 배양하였다. 상층액을 모아 원심분리한 후, 0.2㎛ 필터로 걸렀다. 그 후, IL-8과 PGE2의 농도를 ELISA kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다. Ultrapure LPS (E. coli O111:B4), Pam3CSK4, 및 Tri-DAP은 Invivogen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. MDP [Ac-(6-O-stearoyl)-muramyl-Ala-D-Glu-NH2; muramyl dipeptide]는 Bachem 사(Bubendorf, Switzerland)에서 구입하였다. 재조합 인간 인터페론 감마(Recombinant human Interferon-γ)는 Peprotech (Rockyhill, NJ, USA)에서 구입하였다.
그 결과 도 1B 및 1C에 나타난 바와 같이, Pam3CSK4 (Tri-acylated peptide;TLR2 아고니스트), LPS (Lipopolysaccharide, TLR4 아고니스트), Tri-DAP (Tri-diaminopimelic Acid, NOD1 아고니스트), 및 MDP (NOD2 아고니스트)로 각각 자극하였을 때, hUCB-MSC에서 IL-8이 투여량 의존적으로(dose-dependent) 증가하였다. 즉, hUCB-MSC에서 이러한 특정 아고니스트에 대응하여 NOD1, NOD2, TLR2, TLR4가 발현되고 기능하고 있음을 확인하였다.
2-3: 아고니스트에 의한 TLRs 와 NLRs 에 대한 자극이 hUCB - MSC 의 증식에 영향을 주는지 여부 분석(1)
본 실시예에서는 특정 종류의 MSC는 TLR 자극에 영향을 받는다는 연구 결과(Pavsner-Ficher et al ., Toll-like receptors and their ligands control mesenchymal stem cell functions, Blood, 109:1422, 2007)를 토대로, hUCB-MSC의 경우를 검증하기 위하여 각 아고니스트를 처리하여 4일 동안 키운 다음 분석하였다.
보다 자세하게는, 세포를 2 x 103 / well로 96 well, 2% FBS 을 보충한 MSC 배지에 배양을 시작하였다. 24시간 후에, Pam3CSK4 (TLR2 아고니스트), LPS (TLR4 아고니스트), Tri-DAP (NOD1 아고니스트), 및 MDP (NOD2 아고니스트)를 각 10㎍/ml 농도로 처리하여 4일간 배양하였다. 증식은 Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, US)를 사용하여 측정하였다. 각 실험에 사용된 다른 그룹별 차이 값은 ±SD로 나타내었다. 모든 통계 분석은 MS Excel 프로그램을 사용하였으며, P<0.05는 통계적으로 의미가 있다고 해석하였으며, 이하 동일하다.
그 결과 도 1D 및 1E에 나타난 바와 같이, 어떠한 아고니스트도 hUCB-MSC의 증식에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.
2-4: 아고니스트에 의한 TLRs 와 NLRs 에 대한 자극이 hUCB - MSC 의 증식에 영향을 주는지 여부 분석(2)
본 발명자들은 TLR 및 NLR 아고니스트들이 인간 MNC의 증식에서 hUCB-MSC의 억제 능력을 강화하는 지를 조사하였다.
MSC 및 림프구 간의 직접 상호작용이 MSC에 의한 림프구(lymphocyte) 증식의 억제에 중요하다는 연구에 기초하여, 본 발명자들은 직접 접촉 조건에서 MNC 증식에 대한 hUCB-MSCs의 억제 능력에 MDP가 영향이 있는 지를 조사하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, hUCB-MSCs (#618)은 세포 대 세포 접촉 조건에서 인간 MNC를 급격히 억제하였다. 그러나, TLR (Pam3CSK4 및 LPS), 및 NLR 아고니스트 (Tri-DAP 및 MDP)는 상기와 같은 조건에서 MNC 증식에 대한 hUCB-MSCs의 억제 효과에는 영향이 없었다(도 2).
실시예 3: MDP 의 NOD2 - Rip2 의존 경로를 통한 hUCB - MSC 의 면역억제 증진효과 확인(1)
3-1: MDP 처리 시 hUCB - MSC 에서 제조되는 분비 인자의 MNC 증식에 대한 효과 확인
또한, 수용성 인자가 MSC에 의한 면역 억제를 매개한다고 알려져 있으므로, 본 발명자들은 UCB-MSCs에 의해 제조되는 분비 인자가 인간 MNC 증식에 영향이 있는지 여부를 조사하였다. 배양 배지(CM)를 준비하여, hUCB-MSCs를 24시간 동안 상기 아고니스트와 공동 배양하고, 세척 후, 새로운 배지로 교체하였다. 4일간 추가로 배양한 후, 대조군인 CM 및 아고니스트 처리된 hUCB-MSCs (#618)을 준비하여, 3일 간 hUCB-MSCs의 CM 존재 하에서 MNC를 배양하였다.
그 결과, MNCs의 증식은 대조군인 hUCB-MSCs(UCM)의 배지에서 약하게 억제되었다(도 3A). 놀랍게도, MNC의 증식은 MDP로 전 처리한 UCM(MDP-UCM)의 존재 하에서 더 억제되었다. 그러나 다른 아고니스트 (Pam3CSK4, LPS, Tri-DAP)의 경우에는 그렇지 않았다(도 3A). 이러한 결과는 다른 hUCB-MSCs(#620)로부터 제조된 UCM을 사용한 실험에서도 유사한 결과를 나타냈다 (도 3B). 게다가, UCM의 존재하에서 이종 마우스의 비장단핵세포(xenogenic mouse splenocytes)의 증식이 억제되었으며, 이는 MDP 자극에 의해 증대되었다(도 3C). 이러한 결과들은 hUCB-MSCs에서 MDP에 의해 유도된 분비 인자는 면역 억제에서 중요한 역할을 하는 것을 뒷받침하는 결과이다.
3-2: MDP 처리 시 hUCB - MSC 의 면역억제 증진 효과 확인
MDP가 hUCB-MSC의 면역억제효과를 강화시키는지 확인하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다. 대조군인 hUCB-MSC의 배지(culture media, CM)와 아고니스트 처리된 hUCB-MSC은 5일째 것으로 준비하고, MNC를 3일 더 hUCB-MSC의 CM에서 공동 배양하여 MNC의 증식을 관찰하였다.
그 결과 도 4A에 나타난 바와 같이, 아고니스트로서 MDP를 처리한 중간엽 줄기세포 상층액(UCB-MSC #618 + MDP)의 경우, 아고니스트를 첨가하지 않고 배양한 UCB-MSC 상층액 (UCB-MSC #618)에 비하여 현저하게 MNC 증식을 억제하였다.
이에 반하여, 다른 아고니스트(LPS 등)를 처리한 중간엽 줄기세포 상층액(UCB-MSC #618 + Pam3; UCB-MSC #618 + LPS; UCB-MSC #618 + T-DAP)의 경우는, 아고니스트를 첨가하지 않고 배양한 UCB-MSC 상층액 (UCB-MSC #618)과 비교할 때 MNC 억제율이 비슷하였다. 즉, 아무것도 첨가하지 않은 음성대조군과 비교하여 MNC 증식이 약간 억제될 뿐이었다.
이러한 결과는, MDP를 첨가한 결과 중간엽 줄기세포에서 분비되는 수용성 인자에 의하여 현저하게 MNC 증식이 억제됨을 제시한다.
3-3: siRNA 를 이용한, MNC 억제에 있어서 NOD2 , Rip2 및 MDP 관계 검증
추가적으로 NOD2와 Rip2의 siRNA와 대조군(siCTL)을 이용하여, MNC억제에 있어서 NOD2, Rip2 및 MDP의 상호 관계를 검증하기 위한 실험을 하였다. 세포가 60% 농도가 되었을 때, siRNA를 도입하였으며, RIPK2 (receptor-interacting serine-threonine kinase 2 또는 Rip2 (Receptor interacting kinase protein 2); NOD1 및 NOD2의 어댑터로, RICK 또는 CARDIAK라고도 지칭되는 kinase의 일종(Bertin et al, 1999; Inohara et al, 1999; Ogura et al, 2001b))의 siRNA인 siRIPK2(M-003602-02), NOD2의 siRNA인 siNOD2(J-011388-07) 및 non-targeting control (siControl #1, D-001810-01)은 Dharmacon (Chicago, IL, USA) 사에서 구입하였다. DharmaFECT1 (Dharmacon) 를 도입 agent로 사용하였고, siRNA는 100 nmol/L 농도로 도입하였다. 도입 후 48시간 뒤에 배지를 교환하고, 음성대조군 (MNC 단독으로 배양한 배지) 및 양성대조군 (아고니스트를 첨가하지 않고 배양한 UCB-MSC 상층액 (UMS)를 처리한 배지)을 제외하고는, 세포는 10㎍/mL MDP (NOD2 아고니스트)로 24시간 각각 처리하였다.
즉, 대조군으로서, MNC 단독으로 키우는 배지(i), 아고니스트를 첨가하지 않고 배양한 UCB-MSC 상층액 (UMS)를 처리한 배지(ii)를 준비하고, MDP와 UMS를 처리한 배지(iii), MDP, UMS와 대조군 siRNA (siCTL)를 처리한 배지(iv), MDP, UMS와 siNOD2를 처리한 배지(v) 및 MDP, UMS와 siRip2를 처리한 배지(vi)를 준비하였다. 그 후 MNC 증식을 광학 밀도 450nm에서 검증하였다.
그 결과, 도 4B에 나타난 바와 같이, (iv)배지는 (iii)배지와 같은 정도의 증식억제를 보임에 비해, (v), (vi)배지는 다시 (ii)배지 정도로 억제되는 것을 확인하였다. 즉, NOD2와 Rip2의 siRNA는 MDP에 의해 강화된 MNC의 억제를 되돌렸지만, 대조군 siRNA는 그러한 결과를 나타내지 않았다. 이 결과로부터 NOD2와 Rip2는 MDP 유도 면역 반응을 긍정적으로 조정하고 있음을 알 수 있다. 그러므로, NOD2와 Rip2가 MDP-조절-UCB-MNC의 억제에 필요하다고 볼 수 있다.
실시예 4: MDP 의 NOD2 - Rip2 의존 경로를 통한 hUCB - MSC 의 면역억제 증진효과 확인 (2)
실험결과의 검증을 위하여, 실시예 1에서 수득한 중간엽 줄기세포주 #620에 대하여 실시예 3-2과 3-3과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, 실시예 3-1과 유사하게 아고니스트로서 MDP를 처리한 중간엽 줄기세포 상층액(UCB-MSC #618 + MDP)의 경우, 다른 수용체에 대한 아고니스트를 처리하였거나 아고니스트를 첨가하지 않고 배양한 UCB-MSC 상층액 (UCB-MSC #620)에 비하여 현저하게 MNC 증식을 억제하는 것으로 나타났으며, 또한, 도 5B에 나타난 바와 같이, 실시예 3-3과 유사하게 NOD2와 Rip2의 siRNA는 MDP에 의해 강화된 MNC의 억제를 되돌렸지만, 대조군 siRNA는 그러한 결과를 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 MDP가 NOD2-Rip2 의존 경로를 통한, 중간엽 줄기세포에 의한 MNC 증식 억제를 강화시킨다는 것을 의미하는 것이다.
이러한 실험결과는 상기 실시예 3의 결과와 함께, 본 발명에 따른 MDP를 처리한 줄기세포 및 그 배양물이 우수한 면역억제 효과를 나타내므로, 류마티스 관절염, 클론스병과 같은 자가면역질환이나 아토피와 같은 면역질환의 치료를 위한 면역조절용 조성물로서 매우 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 5: MDP 에 의해 생산된 PGE 2 가 UMS ( UCB - MSC 상층액 ; UMS )에 의한 MNC 의 억제와 관련 있는지 여부 분석
5-1: MDP 의 MSC 에 대한 PGE 2 분비량 증가효과 확인
hUCB-MSC (2×104/well)을 96웰 플레이트의 2% FBS를 보충한 MSC 배지에 시당힌 다음, 24시간 후에 1㎍/mL Pam3CSK4 (TLR2 아고니스트), 1㎍/mL LPS (TLR4 아고니스트), 10㎍/mL Tri-DAP (NOD1 아고니스트) 또는 10㎍/mL MDP (NOD2 아고니스트)를 각각 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 배양 상층액을 수득하였다. 배양 상층액은 원심분리한 후, 0.2㎛ 필터로 여과한 후 PGE2의 농도를 ELISA 키트 (R&D 시스템, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이, hUCB-MSC에 다른 수용체의 아고니스트를 처리한 경우에 비하여, NOD2의 아고니스트인 MDP로 처리한 경우 PGE2 생산을 유의적으로 강화시킴을 확인할 수 있었다.
5-2: COX -2 발현과 MDP 처리와의 관계 확인
세포들을 1㎍/mL Pam3CSK4 (TLR2 아고니스트), 1㎍/mL LPS (TLR4 아고니스트), 10㎍/mL Tri-DAP (NOD1 아고니스트) 또는 10㎍/mL MDP (NOD2 아고니스트)를 각각 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 수득한 다음, 2mM dithiothreitol과 protease cocktail (Roche사, US) 이 첨가된 1% Nonidet-P40 버퍼를 사용하여 파쇄(lysate)하였다. 세포 파쇄물(lysate)은 12% SDS-PAGE로 resolve한 후, 니트로셀룰로즈막으로 옮겨 1차 항체 (COX-2, GAPDH (Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)) 로 면역 염색하였다. 그 후 2차 항체로 면역 염색한 후, 단백질을 ECL(enhanced chemiluminescence) reagent (Intron Biotechnology)를 이용하여 검출하였다.
그 결과 도 6B에 나타난 바와 같이, hUCB-MSC에 다른 수용체의 아고니스트를 처리한 경우에 비하여, NOD2의 아고니스트인 MDP로 처리한 경우 COX-2의 발현을 강화시킴을 확인할 수 있었다.
5-3: COX -2 발현과 NOD2 , Rip2 및 MDP 처리와의 관계
COX-2 발현과 NOD2, Rip2와의 관계를 알아보기 위하여, MDP를 처리한 후 siNOD2, siRip2를 처리한 세포의 COX-2 발현량을 알아보았다. 단백질 발현량의 측정은 실시예 5-2와 동일하고, siRNA 처리 방법은 실시예 3-3에 기재된 방법과 동일하게 시행하였다.
그 결과, 도 6C에 나타난 바와 같이, COX-2 발현은 NOD2와 Rip2의 억제에 의해 감소되었음을 확인하였다. 이 결과에 의하여, COX-2의 발현이 NOD2와 Rip2에 의존하고 있음을 나타낸다고 판단될 수 있다.
5-4: NOD2 , Rip2 및 COX -2의 PGE 2 발현에 대한 영향 확인
MDP 처리의 효과의 지속시간을 판단하기 위하여, hUCB-MSC에 MDP를 처리하고 1일 후 제거한 후, PGE2생산량을 알아보았다. MDP는 처리 1일 후 배지를 제거한 후, PBS(Phosphate Buffered Saline)을 이용하여 5회 세척함으로써 제거하였다. 한편, 실시예 5-1과 같이 MDP를 처리하고 PGE2의 농도를 측정하였다. 이때, NOD2, Rip2 및 COX-2의 PGE2 발현에 대한 영향을 살펴보기 위하여, 각각 실시예 3-3의 대조군 siRNA(siCTL), siNOD2, siRip2 및 COX-2의 억제제인 인도메타신 (Sigma사 (St. Louis, MO, USA)를 처리하였다.
그 결과, 도 6D에 나타난 바와 같이, MDP가 1일 후 제거되었음에도 불구하고, MDP-자극 hUCB-MSC은 배양 5일 후 시점에서 대조군보다 PGE2를 많이 생산하는 것으로 나타났으며, 또한, NOD2와 Rip2의 siRNA가 도입될 경우와 인도메타신으로 COX-2를 억제하였을 때, MDP에 의해 강화된 PGE2 생산량은 다시 억제되는 것으로 나타났다. 이는 NOD2, Rip2 및 COX-2가 hUCB-MSC에서 MDP-유도 PGE2 생산에 중요하다는 것을 시사한다.
5-5: hUCB - MSC 에 의한 MNC 억제에 있어서 PGE 2 의 역할 확인
hUCB-MSC에 의한 MNC 억제에 있어서 PGE2의 역할을 알아내기 위하여, MSC 상층액, MDP를 처리하여 배양한 MSC 상층액 및 MDP와 인도메타신(COX-2 억제제)를 처리하여 배양한 MSC 상층액을 MNC 세포에 처리하였을 때의 MNC 증식을 살펴보았다. 이에 사용된 실험 방법은 상기 실시예 3에서 사용한 것과 동일하였다.
그 결과, 도 6E에 나타난 바와 같이, MDP를 처리한 MSC 배양액의 경우 MNC의 증식을 현저히 억제하나, 인도메타신(Indo)을 함께 처리한 경우에는 음성대조군과 유사한 MNC 증식율을 보였다. 이러한 실험 결과는 실시예 5-4와 함께 hUCB-MSC에 의한 MNC 억제가 PGE2에 의한 것임을 의미한다.
이러한 실험결과는 본 발명에 따른 MDP 처리한 줄기세포 및 그 배양물이 PGE2를 생산함으로써 면역억제용 조성물로서 매우 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다. 한편, 앞서 살펴보았듯이, PGE2는 염증 사이토카인인 인터류킨-1베타 및 TNF알파와 같은 사이토카인의 분비를 억제하는 역할을 하는 것으로 보고되고 있는바, 본 발명에 따른 MDP 처리한 줄기세포 및 그 배양물은 역시 항염증 조성물로서 유용하다.
5-6: NOD2 및 COX -2의 MDP 에 의해 유도되는 항염증 사이토카인인 IL -10( 인터류킨 -10)의 발생량 영향 확인
IL-10의 농도를 측정하기 위하여 hUCB-MCS (1 x 105 / well)를 24 well plate의 2% FBS 을 보충한 MSC 배지에 시딩(seeding)한 다음, 24시간 후, siNOD2 또는 인도메타신(Indo)를 처리한 다음 24시간 더 추가로 배양하였다. 5번 세척한 다음, 새로운 RPMI를 새로이 가하고, 5일 후 UCB-MSC 상층액 (UMS)를 수득하였다. MNC는 1×106 /well에서 상기 UMS로 ConA (시그마사 (St. Louis Mo, USA))와 함께 배양한 다음, 3일 후 세포 상층액을 수집하여 원심분리한 다음 0.2㎛ 필터로 여과하고, IL-10의 농도를 ELISA kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 6F에 나타난 바와 같이, MDP 처리에 의하여 항염증 사이토카인인 IL-10의 생산량이 현저히 증가하나, NOD2 억제나 인도메타신 처리에 의해 IL-10의 생산이 억제됨을 확인할 수 있었다. 이러한 실험 결과는 MDP의 처리에 따라 항염증 사이토카인인 IL-10 역시 PGE2와 유사하게 NOD2-Rip2 경로에 의존하여 그 생산량이 현저히 증가 됨을 시사한다.
즉, 본 발명에 따른 MDP 처리한 줄기세포는 항염증 사이토카인인 IL-10을 높은 수율로 생산하므로, 본 발명에 따른 MDP 처리한 줄기세포 또는 그 배양물은 항염증 조성물, 특히 관절염 등의 치료를 위한 항염증 조성물로서 유용하다.
실시예 6: MDP 에 반응하여 hUCB - MSCs 에 의해 생성된 PGE 2 및 TGF -β1가 MNC 억제와 관련 있는지 여부
6-1: MDP 의 MSC 에 대한 PGE 2 및 TGF -β1 분비량 증가효과 확인 및 COX -2 발현 확인
간세포 성장 인자인 TGF-β, IDO-1(indoleamine 2,3 dioxygenase-1), NO(nitric oxide), 및 PGE2(prostaglandin E2)와 같은 수용성 인자는 MSC에 의한 면역억제를 조절하는 후보자이다. hUCB-MSCs에서 TLR 및 NLR 아고니스트가 NO, PGE2 및 TGF-β1를 포함하는 분비 인자를 유도하는지 확인하기 위하여, 세포들을 Pam3CSK4, LPS, Tri-DAP, 및 MDP로 24시간 동안 배양하고, 배양 상층액을 수집하여 수득하였다. 상기 실시예 5-1 및 5-2와 유사한 방법에 따라 분비 인자 분비를 확인하였다.
그 결과, 비록 대식세포에서 LPS가 NO 생성을 유도하지만, hUCB-MSCs에서 임의의 TLR 및 NOD 아고니스트 단독의 처리는 NO를 생성하지 않았다(도 7A). 흥미롭게도, PGE2 및 TGF-β1의 생성은 다른 아고니스트가 아닌 MDP에 반응하여 hUCB-MSCs에서 증진되었다(도 7B 및 7C). 더욱이, MDP 노출은 자극 후 24시간째에 hUCB-MSCs에서 PGE2 생성의 주요 효소인 COX-2의 발현을 증가시켰다(도 7D).
6-2: PGE 2 및 TGF -β1의 MNC 증식에 대한 효과 확인
단핵구 증식에서 PGE2의 효과를 확인하기 위하여, hMNC 및 마우스 비장단핵세포를 다양한 농도의 PGE2 존재 하에서 배양하였다. 실험방법은 실시예 5-5와 유사하다.
그 결과, hMNC 및 마우스 비장단핵세포의 증식은 10 ng/mL 농도 이상의 PGE2 존재 하에서 현저하게 억제되었다(도 7E 및 7F).
다음으로, 본 발명자들은 MDP로 전처리한 UCM에 의해 hMNC가 억제되는 것이 PGE2 및 TGF-β1에 의한 것인 지 여부를 조사하였다. 실험방법은 실시예 5-5와 유사하다.
그 결과, hMNC 증식에 대한 MDP-UCM의 억제 능력은 일반적인 COX 억제제인 인도메타신(indomethacin)에 의해 완전히 제거되었다(도 7G). 게다가 TGF-β1 중화 항체와 공동 처리하였을 때는 MDP-UCM은 hMNC의 증식을 억제하지 못하였다(도 7H). 이와 같은 결과는 hUCB-MSC에서 MDP가 PGE2 및 TGF-β1의 생성을 이끌고, 이는 hUCB-MSC의 면역억제 능력을 매개한다는 것을 시사한다.
실시예 7: hUCB - MSC 에서 MDP 에 의한 COX -2 발현 및 PGE 2 및 TGF -β1 생성과 NOD2 및 Rip2 의 관계 분석
NOD2 및 Rip2는 MDP-유도 면역 반응에 중요하다. 따라서, 본 발명자들은 MDP에 반응한 hUCB-MSC에 의하여 COX-2 발현 및 PGE2 및 TGF-β1의 생성에 NOD2 및 Rip2가 요구되는지 여부를 조사하였다. 실험방법은 실시예 5-4와 유사하다.
그 결과, hUCB-MSC에서 NOD2 및 Rip2의 양 유전자 및 단백질이 siRNA에 의해 현저하게 억제되었다(도 8). siRNA에 의한 NOD2 및 Rip2의 하향 조절은 hUCB-MSC에서 MDP-유도 COX-2 발현을 억제하였다(도 9A). NOD2 및 Rip2에 대한 siRNA 처리는 대조군 siRNA와 비교하여 MDP-UCM에서 PGE2 및 TGF-β1의 생성을 감소시켰다(도 9B 및 9C). 더욱이, MLR 실험은 NOD2 및 Rip2의 하향 조절이 hMNC 증식에서 MDP에 의해 증대된 UCM의 억제 효과를 되돌렸다(도 9D). 이와 같은 결과는 MDP가 NOD2-Rip2 경로를 통해 hUCB-MSC에서 PGE2 및 TGF-β1의 증가된 생성을 이끌며, 이는 UCM-MSC의 면역억제 능력을 강화함을 시사하는 것이다.
실시예 8: MDP 로 전 처리된 UCM 의 hMNC 에서 IL -10 생성 및 조절 T 세포 군집에 대한 효과 확인
8-1: MDP 로 전 처리된 UCM 의 hMNC 에서 IL -10 생성에 대한 효과 분석
골수 기질세포에서 생성되는 PGE2는 숙주 대식세포에 의해 생성되는 IL-10에 중요하다고 알려져 있다(Nemeth, K., A. et al., Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat Med 15:42-49, 2009). MDP가 hUCB-MSC에서 PGE2 생성을 이끄므로, 본 발명자들은 hMNC에 의한 IL-10 생성이 MDP-UCM의 존재하에서 증가되는지 여부를 조사하였다. 실험방법은 실시예 5-6과 유사하다.
그 결과, MDP 자극에 상관없이, UCB-MSC 단독은 IL-10을 생성하지 않았다(데이터는 제시하지 않음). 비록 hMNC 단독은 또한 IL-10을 생성하지 않았으나, UCM 존재 하에서 IL-10의 생성은 상향 조절되었다(도 10A). 더욱이, hMNC에 의한 IL-10 생성은 비처리된 UCM 보다 MDP-UCM 존재하에서 더 증가하였다(도 10A). 그러나, 인도메타신 또는 TGF-β1 중화 항체 단독 처리는 MDP-UCM에 의해 증진된 hMNC의 IL-10 생성을 되돌렸고, 이의 수준은 인도메타신 및 TGF-β1 중화항체의 조합 처리에 의해 더 감소하였다(도 10A). hUCB-MSC에서 siRNA에 의해 NOD2가 억제될 때, 비처리된 UCM에 비해 MDP-UCM의 존재 하에서 hMNC에 의해 IL-10 생성은 증가하지 않았다(도 10A).
8-2: MDP 로 전 처리된 UCM 의 hMNC 에서 T 세포 군집에 대한 효과 분석
다음으로, 본 발명자들은 hMNC가 조절 T 세포(regulatory T cells, Treg)로 분화되는 데 있어서, UCM의 효과를 조사하였다. 구체적으로, UCM으로 hMNC를 5일간 배양한 후 hMNC내의 CD4, CD25, Foxp3를 동시에 발현하는 세포 비율을 Flow cytometry로 측정하였다.
그 결과, hMNC에서 Treg 군집은 UCM 존재 하에서 50% 이상 증가하였고, 이는 비처리된 UCM 보다 MDP-UCM에서 배양된 hMNC에서 더 증가하였다(도 10B). 유사하게 인도메타신 및 TGF-β1 중화항체의 처리, 또는 siRNA에 의한 NOD2 억제는 MDP-UCM에 의해 증가된 Treg 군집을 되돌렸다(도 10B). 이러한 결과는 UCM에서 MDP-유도된 PGE2 및 TGF-β1가 hMNC에 의한 IL-10 생성 및 hMNC의 Treg로의 분화에 중요함을 시사하는 것이다.
실시예 9: 타 줄기세포에서의 NOD2 발현 확인
다른 줄기세포의 경우에도 NOD2 (Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)의 아고니스트를 첨가하여 배양하는 경우, NOD2 수용체-아고니스트 반응에 의하여 면역조절 및 염증조절이 가능한지 확인하기 위하여, 인간 monocytic leukemia 세포주 THP-1 세포를 양성 대조군으로 하여 지방유래 줄기세포 (AD-MSC) 및 양막 상피줄기세포(AEC)가 NOD2를 발현하는지 알아보기 위하여 상기 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. 인간양막상피줄기세포는 구로병원으로부터 환자의 동의를 얻어 애기가 태어난 후 채취한 후 (서울대학교 기관윤리위원회의 허가를 얻음 (IRB No. 0611/001-002)), 얻어진 양막으로부터 양막 상피세포를 분리하였다. 지방유래 줄기세포의 경우 보라매병원 환자의 동의를 얻어 채취하였으며 (SNU IRB #0600/001-001), 이로부터 지방유래 줄기세포를 분리 배양하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 지방유래 줄기세포 및 양막 상피줄기세포에서 양성대조군인 THP-1세포보다 NOD2의 발현이 강하게 발현되는 것을 관찰하였다. 즉, 중간엽줄기세포 이외에도 다른 줄기세포들 역시 NOD2 수용체를 발현하는 것을 확인한바, 다른 줄기세포들의 경우에도 NOD2 수용체-아고니스트 반응에 의하여 면역조절 및 염증조절이 가능함을 알 수 있다.
실시예 10: 대장염 ( Colitis ) 동물모델에서 치료효과 검증
10-1: 대장염 동물 모델에서 치료 효과 분석
본 발명자들은 hUCB-MSC 처리가 대장염 마우스를 치료하고 MDP 자극이 DSS- 유발된 대장염에 대한 hUCB-MSC의 보호 효과를 증진시키는지 여부를 조사하였다. hUCB-MSC 투여를 위해서, 세포는 24h 동안 MDP 존재 또는 부존재 조건에서 배양하고, PBS 세척으로 남아있는 MDP를 제거하였다. 구체적으로 대장염 동물 모델에서 MDP를 처리한 줄기세포의 효과를 검증하기 위해, 마우스((주)중앙실험동물, C57BL/6N 마우스)에 3% DSS(dextran sulfate sodium)를 처리하여 대장염을 유발시킨 후, 2일 뒤에 MDP를 처리한 hUCB-MSC, 처리하지 않은 hUCB-MSC와 siRNA로 처리하여 NOD2를 억제시킨 hUCB-MSC를 복강 내로 처치하였다. 이때, 3% DSS는 7일간 음수로 투여하였다.
그 결과, MDP 자극이 없는 hUCB-MSC의 복강내 투여는 PBS-처리 또는 섬유아세포-처리 마우스와 비교하여 DSS-유발된 대장염 마우스의 체중 감소 및 치사율을 개선하였다(도 12A 및 12B). 더욱이, MDP-자극된 hUCB-MSC(MDP-MSC)는 대장염이 없는 대조군 마우스의 90%까지 체중 감소를 회복시켰고, 대장염-유도 치사로부터 완전히 치료하였다(도 12A 및 12B). 질병 활성 지수(Disease activity index)는 hUCB-MSC에의해 약하게 감소하였으나, PBS 또는 섬유아세포 투여 군과는 현저하게 상이하였다. 그러나, MDP-MSC는 질병 활성 지수를 현저하게 개선시켰다(도 12C). NOD2가 siRNA에 의해 하향 조절되었을 때, MDP-MSC는 체중 감소, 생존율, 및 질병 활성 지수를 개선시키지 못하였다.
14일 째에, 생존한 마우스를 희생시키고 대장의 길이 및 조직병리학을 분석하였다. 육안 검사 결과, 염증에 의해 줄어든 대장 길이가 hUCB-MSC에 의해 약하게 되돌려졌으며, 이는 MDP에 의해 더 증진되었음을 확인하였다(도 12D 및 12E). 조직병리학 분석결과, DSS-처리 마우스에서 전체 장 점막의 파괴, 심각한 부종 병변, 및 고유판(lamina propria) 및 점막 밑층에서 염증 세포의 산재한 침윤이 관찰되었다(도 12F). hUCB-MSC-투여 마우스에서는 점막 밑층에서 점막 파괴 및 부종이 대장의 일 부분에 한정되어 있음을 관찰하였다(도 12F). 그러나, MDP-MSC는 대장의 병리학적 손상을 완전히 치료하였고 병리학적 점수를 현저하게 감소시켰다(도 12F 및 12G). 기대한 바대로, DSS-유발된 대장염에서 siNOD2-처리 hUCB-MSC의 투여는 병리학적 심각함을 방지하지도, 또는 병리학적 점수를 감소시키지도 못하였다(도 12F 및 12G). 이와 같은 결과는 MDP가 대장염에 대하여 hUCB-MSC의 보호 효과를 증진시키고, 이는 NPD2가 필요함을 시사하는 것이다.
10-2: 대장염 동물 모델에서 염증 사이토카인 및 T 세포 군집 분석
아울러, 본 발명자들은 대장염 마우스에서 hUCB-MSC-유발된 염증 사이토카인 생성의 조절에서 MDP의 효과를 조사하였다.
그 결과, DSS-처리된 마우스 대장에서 hUCB-MSC는 IL-6 및 IFN-γ 생성을 감소시키고, IL-10 생성을 증가시켰다(도 13A). 더욱이, DSS-처리된 마우스 대장에서 MDP-MSC는 IL-6 및 IFN-γ 생성을 거의 블로킹하였고, IL-10 생성을 증진시켰으며, 이는 NOD2의 하향 조절에 의해 제거되었다(도 13A).
hUCB-MSC가 마우스 대장에서 Treg 군집에 영향이 있는지 여부를 확인하기 위하여, Foxp3+ 세포의 대장 침윤을 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, hUCB-MSC는 PBS-처리된 대장염 마우스와 비교하여, 대장에서 Fox3p+ 세포의 국지화가 증가하였다(도 13B). 또한, Foxp3+ 세포의 대장 국지화는 MDP-MSC에 의해서 더 증가하였고, 이는 hUCB-MSC에서 NOD2 억제에 의해서 되돌려졌다(도 13B). 이런 현상은 웨스턴 블롯팅 분석으로 대장에서 Foxp3 발현을 정량하여 확인하였다. Foxp3 단백질 발현은 PBS-처리 대장염 마우스와 비교하여 hUCB-MSC-투여된 마우스에서 더 높게 나타났다(도 13C 및 13D). 유사하게, 대장에서 Foxp3 수준은 MDP-MSC에 의해서 더 증가하였고, 이는 또는 NOD2 하향조절에 의해서 되돌려졌다(도 13C 및 13D).
10-3: 대장염 동물 모델에서 염증세포의 침윤 분석
마지막으로, 본 발명자들은 마우스 대장에서 염증세포의 침윤을 조사하였다. 호중구 침윤(neutrophilic filtration)을 위하여, MPO(myeloperoxidase) 활성을 대안 방법으로 분석하였다.
그 결과, DSS-처리된 마우스 대장에서 hUCB-MSC는 MPO활성 및 CD4+ 및 CD11b+ 세포의 침윤을 감소시켰다(도 13E). 상기 결과와 마찬가지로, MDP-MSC는 MPO활성 및 CD4+ 및 CD11b+ 세포의 대장 침윤을 더 감소시켰고, 이는 NOD2에 대한 siRNA에 의해 되돌려졌다(도 13E).
상기와 같은 결과들은 hUCB-MSC가 항-염증 반응을 유도하고, 전-염증 반응(pro-inflammatory response)를 억제하고, 이는 NOD2-의존적 방법을 통해 MDP에 의해 증진된다는 것을 뒷받침하는 것이다.
또한, 이와 같은 결과는 본 발명에 따른 MDP를 처리한 줄기세포 또는 그의 배양물은 대장염 등 실제 동물 모델에서 염증을 치료할 수 있음을 시사하는 결과이다.
실시예 11: 아토피성 피부염을 유발한 동물 모델에서 MDP 를 처리한 hUCB - MSC 의 치료효과 확인
11-1: 아토피성 피부염의 유발 및 hUCB - MSC 의 주입
시험시작 1일 전 출생 8주령의 암컷 NC/Nga 생쥐의 등 부위를 제모한 후, 제모크림을 이용하여 털을 완벽하게 제거하였다. 시험시작일에 4% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 수용액 150 ㎕를 제모한 등 부위에 도포하여 피부의 지방성분을 제거하고, 약 3-4시간 뒤 완전히 건조된 후, Df(Dermatophagoides farina) 추출물 100 mg을 등 부위와 귓바퀴부위에 균일하게 도포하였다. Df 추출물 도포는 주 2회로 3주간 총 6회 실시 (Df 추출물 도포 시마다 SDS 수용액 도포 필수)하여 아토피 피부염을 유발하였다. 2 X 106개의 상기 실시예 1에서 준비한 hUCB-MSCs를 200 ㎕의 인산완충 생리식염수(PBS)에 부유시켜서 NC/Nga 생쥐에 주 1회씩 Df 도포와 동일한 기간인 3주와 아토피 유발 후 1주, 즉, 총 4주간 4회 정맥 또는 피하에 주사하였다. MDP를 처리한 hUCB-MSC의 주입은 24시간 동안 10㎕/mL MDP를 배지에 첨가하여 hUCB-MSC를 배양한 후 PBS로 5회 수세한 뒤 주사하였다.
11-2: MDP 를 처리한 hUCB - MSC 의 치료효과를 육안 병변 수준에서 검증
MDP를 처리한 hUCB-MSC의 아토피성 피부염에 대한 치료효과를 확인하기 위해 hUCB-MSC의 4주차 주사 24시간 후 부검하고 육안 병변을 평가하였다. 육안 병변은 각질생성(dryness), 찰과(excoriation), 홍반(erythema), 부종 (edema)의 점수를 증상에 따라 각각 0점에서 3점까지 부여한 후 그 수치를 합산하여 평가하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이 아토피성 피부염 유발군에 비해 유발과 함께 hUCB-MSC를 정맥 주사한 군은 약간의 병변 완화 경향성만 확인되었을 뿐 큰 차이는 관찰되지 않았으나 MDP를 처리한 hUCB-MSC를 주사한 군의 경우, 정맥주사와 피하주사를 시행한 군 모두 유의적인 병변완화가 관찰되었다.
이와 같은 결과는 본 발명MDP를 처리한 줄기세포 또는 그의 배양물은 아토피 등 자가면역 질환을 치료할 수 있음을 시사하는 결과이다.
11-3: MDP 를 처리한 hUCB - MSC 의 치료효과를 혈청 내 면역글로불린 E( IgE ) 분석을 통해 검증
MDP를 처리한 hUCB-MSC의 아토피성 피부염에 대한 치료효과를 확인하기 위해 hUCB-MSC의 4주차 주사 24시간 후 부검하고 부검 시 채혈한 혈청에 대해 commercial Opt EIA mouse set(BD Bioscience, Mississauga, Canada)을 이용하여 면역글로불린 E(IgE) 수치를 측정하였다.
그 결과 도 15에 나타난 바와 같이, hUCB-MSC를 정맥 주사한 군과 MDP를 처리한 hUCB-MSC를 정맥 주사한 군은 유의미한 IgE 억제효능이 확인되었으며, 억제율에 있어서는 MDP를 처리한 hUCB-MSC를 정맥 주사한 군이 더 큰 억제율을 나타내었다. 하지만 MDP를 처리한 hUCB-MSC를 피하 주사한 군은 유발군과 큰 차이를 보이지 않았다.
11-4: MDP 를 처리한 hUCB - MSC 의 치료효과를 혈청 내 면역글로불린 G1 ( IgG1 ) 분석을 통해 검증
MDP를 처리한 hUCB-MSC의 아토피성 피부염에 대한 치료효과를 확인하기 위해 hUCB-MSC의 4주차 주사 24시간 후 부검하고 부검 시 채혈한 혈청에 대해 아토피성 피부염의 Th2 면역반응의 대표지표인 혈청 내 면역글로불린 G1 (IgG1) 수치를 ELISA kit (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA)를 이용하여 비교해 보았다.
그 결과 도 16에 나타난 바와 같이, 모든 hUCB-MSC 투여군에서 유의미한 IgG1 억제효능이 관찰되었다.
11-5: MDP 를 처리한 hUCB - MSC 의 치료효과를 피부조직에 대한 병리조직학적 검사를 통해 검증
MDP를 처리한 hUCB-MSC의 아토피성 피부염에 대한 치료효과를 확인하기 위해 hUCB-MSC의 4주차 주사 24시간 후 부검하고 피부조직을 적출하여 10% 중성 포르말린(formalin) 용액에 고정하여, 충분한 고정을 거친 후 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고, 3-4 ㎛로 박절하여 H&E(hematoxylin-eosin)으로 염색하여 병리학적 분석을 실시하였다.
그 결과 도 17에 나타난 바와 같이, 유발군의 경우, 표피의 이상 증식과 피부 내로 염증세포의 과다한 침윤이 관찰되었다. 이러한 병변 증상에 대해 hUCB-MSC를 정맥 주사한 군, MDP를 처리한 hUCB-MSC를 정맥주사 또는 피하주사한 군 모두 표피의 두께와 염증세포의 침윤 정도가 감소하는 경향이 관찰되었으며, MDP를 처리한 hUCB-MSC를 피하 주사한 군, 정맥 주사한 군, hUCB-MSC를 정맥 주사한 군의 순으로 병변 억제가 확인되었다.
11-6: MDP 를 처리한 hUCB - MSC 의 치료효과를 피부조직에 대한 병리조직학적 검사를 통해 검증
MDP를 처리한 hUCB-MSC의 아토피성 피부염에 대한 치료효과를 확인하기 위해 hUCB-MSC의 4주차 주사 24시간 후 부검하고 피부조직을 적출하여 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여, 충분한 고정을 거친 후 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고, 3-4 ㎛로 박절하여 Toluidine blue로 염색하고, 아토피 피부염의 주요 병변 중 하나인 비만 세포 (mast cell)의 탈과립 정도를 분석해 보았다.
그 결과 도 18에 나타난 바와 같이 유발군의 경우, 탈과립된 비만 세포들이 다수 관찰되었으며, 모든 군에서 비만세포의 탈과립이 감소하는 경향이 관찰되었다.
상기와 같은 결과는 본 발명에 따른 MDP를 처리한 줄기세포 또는 그의 배양물은 아토피 등 실제 동물 모델에서 면역질환을 치료할 수 있음을 시사하는 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
<110> Kang Stem Biotech CO., LTD. <120> Pharmaceutical Composition Comprising Stem Cells Treated with NOD2 Agonist or Culture thereof for Prevention and Treatment of Immune Diseases and Inflammatory Diseases <130> PA110265-KR-D1-D1 <150> KR10-2010-0081640 <151> 2010-08-23 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR2 Forward primer <400> 1 gatgcctact gggtggagaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR2 Reverse primer <400> 2 cgcagctctc agatttaccc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR4 Forward primer <400> 3 acagaagctg gtggctgtg 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR4 Reverse primer <400> 4 tctttaaatg cacctggttg g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOD1 Forward primer <400> 5 ccacttcaca gctggagaca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOD1 Reverse primer <400> 6 tgagtggaag cagcattttg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOD2 Forward primer <400> 7 gaatgttggg cacctcaagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOD2 Reverse primer <400> 8 caaggagctt agccatggag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rip2 Forward primer <400> 9 ccattgagat ttcgcatcct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rip2 Reverse primer <400> 10 atgcgccact ttgataaacc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13A Forward primer <400> 11 catcgtggct aaacaggtac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13A Reverse primer <400> 12 gcacgacctt gagggcagcc 20

Claims (8)

  1. NOD2를 발현하는 분리된 중간엽 줄기세포를 포함하는, 면역질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역질환 또는 염증질환은 자가면역질환, 이식거부, 관절염, 이식편대숙주병, 세균감염, 패혈증 또는 염증인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 자가면역질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  4. NOD2를 발현하는 분리된 중간엽 줄기세포 또는 그 배양물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 피험체의 면역반응 또는 염증반응을 억제하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 투여단계는 복강 또는 혈관 내 투여, 병변으로의 직접 투여 또는 관절의 활강(Synovial cavity) 내 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. NOD2를 발현하는 분리된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 면역억제제 또는 항염증제의 제조 방법.
  7. NOD2를 발현하는 분리된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하며, 배양시 상기 중간엽 줄기세포에서 PGE2 또는 TGF-β1이 분비되는 것이 특징인 PGE2 또는 TGF-β1의 제조 방법.
  8. NOD2를 발현하는 분리된 중간엽 줄기세포를 포함하는 이식체.
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