JP2013536222A - Ｎｏｄ２アゴニストで処理した幹細胞またはその培養物を含む免疫疾患および炎症性疾患の予防および治療用の薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、NOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養生成物を含む、免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療用の薬学的組成物に関し、より詳細には、前記薬学的組成物は、前記幹細胞またはその培養物を被験体に投与する段階を含む被験体の免疫反応や炎症反応を抑制する方法、前記幹細胞またはその培養物を用いて、免疫抑制剤または抗炎症剤の製造方法、NOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養する段階を含む、PGE₂またはTGF-β1の製造方法、NOD2を発現する幹細胞およびNOD2のアゴニストを含む移植体、前記移植体の製造方法、NOD2を発現する幹細胞およびNOD2のアゴニストを含む複合体、ならびにNOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して得られた培養物に関するものである。

Description

本発明は、NOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養物を含む免疫疾患および炎症性疾患の予防または治療用の薬学的組成物に関するもので、より詳細には、前記の薬学的組成物、前記幹細胞またはその培養物を被験体に投与する段階を含む、被験体の免疫反応または炎症反応を抑制する方法、前記幹細胞またはその培養物を用いて、免疫抑制剤または抗炎症剤の製造方法、NOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養する段階を含むPGE₂またはTGF-β1の製造方法、NOD2を発現する幹細胞およびNOD2のアゴニストを含む移植体、前記移植体の製造方法、NOD2を発現する幹細胞およびNOD2のアゴニストを含む複合体、ならびにNOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して得られた培養物に関する。

NOD（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein/ヌクレオチド結合オリゴマー化領域タンパク質）ファミリータンパク質は大きく3つのドメインで構成されるが、N末端に存在し、タンパク質-タンパク質相互作用に関するCARD（caspase-recruitment domain/カスパーゼ動員ドメイン）あるいはパイリンドメイン(pyrin domain)および中間のNODドメイン、そしてC-末端のLRRドメインに分けることができる。NODはN-末端にCARDドメインが一個存在するNOD1およびCARDドメインが二個存在するNOD2タンパク質に分けることができる。これらの2個のタンパク質を合わせてNLR（NOD Like Receptor）といい、TLR（Toll Like Receptor）と共に生体内で免疫反応に大きく寄与する。NODはほとんどの細菌細胞壁の表面に存在するPGNの一部の断片の構造を認識し先天免疫反応の重要な役割を果たすことで知られている。NOD1は胃、大腸の上皮細胞、膵臓、肺、腎臓、脾臓のマクロファージ、樹状細胞等で発現され、真核細胞では発現されず、グラム陰性菌および何種類かのグラム陽性菌が保有しているDAP（ジアミノピメリン酸)−タイプのPGNの胚性幹ペプチドであるジペプチドまたはトリペプチドを認識することで知られている（Hisamatsu T et al., J. Biol. Chem., 278:32962, 2003（非特許文献1））。

NOD2は、骨髄細胞、特にマクロファージ、好中球、樹状細胞および小腸のパネード細胞に分布するタンパク質で、その分布がNOD1よりも限定された所で発現される特徴を有している。また、NOD2は特異的に炎症性サイトカインのTNF-αおよびIFN-γによって発現が誘導される性質を持ち、平常時の消化管細胞ではほとんど発現されず、感染時にのみ発現される特性を有する。NOD2が認識するアゴニスト（リガンド）の中で最も広く知られているのは、グラム陰性菌とグラム陽性菌のPGN成分に共通して存在するMDP（ムラミルジペプチド）である（Girardin SE, et al., J. Biol.Chem., 278:8869, 2003（非特許文献2））。

2003年、Girardin SEの研究結果によると、NOD2 ノックアウトマウスは正常に成長するが、感染誘発モデルでリステリア・モノサイトゲネス菌（Listeria monocytogenes）の静脈注射による感染より経口投与による感染誘導時の感受性のほうが非常に高く表れたことが確認された。これによりNOD2は成長過程に関与せず、全身的にはMDP物質の投与を感知するパターン認識タンパク質が腸内リステリア菌株については、抗菌作用の先天性免疫反応を誘導する生体防御タンパク質であることが分かる（非特許文献2）。MDPは免疫反応の刺激のための補強剤、抗原性補助剤および免疫原を補助することができるアジュバント等に利用されてきた（韓国特許出願公開第1019960033469号（特許文献1）、同第1020070031848号（特許文献2）及び同第1020100045473号（特許文献3））。

一方、プロスタグランジンE₂（以下PGE₂）は、プロスタグランジンE₂（5Z,11（α）,13E,15S）-11,15-ジヒドロキシ-9-オキソ-プロスター5,13-ジエン-1-オイック酸）で表される化合物であり、生理学的、および病理学的環境の中で最も広く生産されているプロスタグランジンである（Ushikubi F et al., J. Pharmacol.Sci.83:279, 2000（非特許文献3））。

PGE₂の従来の用途は、出産にあたり子宮頸部を出産準備状態にさせるためのものであり、実際に薬学的に出産誘導に利用されてきており、次の商標名に名づけられる座薬の形で販売中だ。：Cervidil（フォレスト株式会社）、Prostin E2（ファイザー株式会社）、Propess（フェリング・ファーマ株式会社）およびGlandin（Nabiqasim製薬、パキスタン）。

また、PGE₂は最近新たに免疫抑制、調節剤としての用途が脚光を浴びているが、これはマクロファージによって産生されるインターロイキン-1βおよびTNFαのようなサイトカインの分泌を抑制する役割をし、ヘルパーＴ１細胞の分化を抑制することが報告されているためである（Harris SG et al., Trends Immunol., 23:144, 2002（非特許文献4））。また、生体外で、PGE₂がインターロイキン-2およびIFN-ガンマのようなサイトカインの産生を抑制して、ヒトとマウスのT細胞の分化を抑制することも報告されている（Goodwin JS et al., J. clin. Immuno., 3:295, 1983（非特許文献5））。また、上に述べた実験結果で報告されているように、PGE2は免疫調節剤としての利用可能性に富み、且つ経済的で簡単な生産方法が求められてきた。

TGF-β1（トランスフォーミング増殖因子β1）は、免疫抑制および抗炎症剤として知られており、PGE₂と同様に、免疫調節剤として利用される可能性に豊み、経済的で簡単な生産方法が求められてきた。

一方、免疫抑制剤には、その反応だけを抑制する特異的抑制剤と非特異的抑制剤があり、理論的には特異的抑制剤の作用が優れていなければならないが、非特異的阻害剤が主に使用される。臨床的に最もよく使用される免疫抑制剤としては、シクロスポリン（商品名：シクロスポリン、ネオーラル、シポル A）、アザチオプリン（商品名：イムラン）およびプレドニゾロン（一種のステロイド）がある。前記の三種類は併用して服用した時に個別の服用時より副作用が少なく、免疫抑制効果も最も高いことが判明した。最近ではFK 506、RATG、OKT3、Cellcept等、何種類かの免疫抑制剤が開発され使用に至っている。

これらの免疫抑制剤は、抗原刺激から抗体生成に至る過程でマクロファージによる抗原の貪食、リンパ球等による抗原認識、細胞分裂、T細胞とB細胞の分裂または抗体の生成等、何種類かの過程を阻害することによって、免疫抑制を惹起する。前記抑制剤の大部分は抗腫瘍活性を有するが、その理由は、DNA障害、DNA合成阻止等を媒介にして細胞分裂を阻止するためである。

しかし、これに伴う代表的な副作用として、高血圧と腎毒性（腎機能の低下）があり、これらの副作用の発生率が高いため、使用時には十分に経過を観察しなければならない等の問題があった。その他の副作用として稀に震え、発作、肝炎、胆汁うっ滞、血中尿酸の増加、筋力の低下、多毛症、歯肉肥大（gingival hypertrophy）等がある。よく使われる抑制剤のうち、アザチオプリンは骨髄機能を抑制し、白血球数値の減少、貧血、血小板の減少を招く。さらにアザチオプリンは、膵炎、肝炎、胆汁うっ滞と共に稀に脱毛、発熱等が見られる合併症を引き起こすことがある。ステロイド製剤の一つであるプレドニゾロンは免疫抑制剤の中で一番最初に使用されたもので、広範な抑制作用を示す。食欲を増進させ、肩と背中の筋肉を増加させ、一時的には幸福感をもたらしてくれるが、このようなステロイド製剤は動脈硬化症を促進させるだけでなく、高血圧、胃潰瘍、糖尿病、成長阻害、骨粗鬆症、白内障、緑内障等を引き起こすため、注意が必要な薬物である。

臓器移植と造血幹細胞移植等の同種間移植は、21世紀に至り成し遂げられた画期的な医療の成果として、拡張性心筋症のような心不全、慢性腎不全および難治性血液疾患等の末期疾患における根本的な治療方法として用いられている。しかし、同種移植後に発生する致命的な合併症である移植臓器の拒絶反応または移植片対宿主病（GVHD）のような免疫学的反応を克服しなければならないという問題点がある。このような免疫学的反応を最小限にするために、移植後の同種抗原を認知したT細胞による細胞性免疫によって引き起こされる、T細胞の免疫反応を調節するための処理（Ikehara S, Exp.Hematol., 31:1142, 2003（非特許文献6）; First MR, Transplantation, 77:88, 2004（非特許文献7））、即ち、免疫抑制剤であるシクロスポリンすなわちFK506を用いてT細胞のインターロイキン（IL）-2の生成を抑制することによって免疫反応を調節する療法が用いられる。しかし、副作用が無くより経済的な免疫抑制剤の開発が必要とされている。

一方、間葉系幹細胞の免疫調節能力に対する正確な作用メカニズムは未だ詳細に知られていないが、最近間葉系幹細胞と関連して、以下のようないくつかの報告のみが提示されている。まず、間葉系幹細胞は、APC（抗原提示細胞）を抑制する効果があると思われる。特定の条件の下で培養過程中に添加された単核細胞の数に比例して免疫反応の程度が変化することから、最終的に単核細胞が免疫抑制効果に関与するものと推定することができる。第二に、間葉系幹細胞は、T細胞の増殖速度を調節することにより、免疫抑制効果を示すものと見られる。T細胞を間葉系幹細胞と一緒に培養する場合には、サイクリンD2が抑制されるに従い、T細胞が細胞周期中のG0/G1期に留まってそれ以上は増加しない。また、間葉系幹細胞を除去したとしても増殖能力は持続的に低下することが報告されている（Glennie S et al., Blood, 105:2821, 2005（非特許文献8））。

韓国特許出願公開第1019960033469号 韓国特許出願公開第1020070031848号 韓国特許出願公開第1020100045473号

Hisamatsu T et al., J. Biol. Chem., 278:32962, 2003 Girardin SE, et al., J. Biol.Chem., 278:8869, 2003 Ushikubi F et al., J. Pharmacol.Sci.83:279, 2000 Harris SG et al., Trends Immunol., 23:144, 2002 Goodwin JS et al., J. clin. Immuno., 3:295, 1983 Ikehara S, Exp.Hematol., 31:1142, 2003 First MR, Transplantation, 77:88, 2004 Glennie S et al., Blood, 105:2821, 2005

本発明者らは、幹細胞を用いて、より効果的に免疫または炎症を調節する方法を開発しようと鋭意努力を続けた結果、NOD2受容体が幹細胞で発現され、NOD2受容体を介して幹細胞が免疫調節することを確認した後、NOD2のアゴニストであるMDPで幹細胞を処理することにより、PGE2およびTGF-β1が有意に大量に生産され、免疫反応がより一層効果的に抑制され、それにより、大腸炎モデルおよびアトピー性皮膚炎モデルに対する治療効果が実証されることにより、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、従来の免疫抑制剤および炎症抑制剤を代替することができる、副作用がなく且つ経済的であるNOD2を発現する幹細胞に、NOD2のアゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養物を含む、免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供することにある。

本発明の別の目的は、前記組成物を免疫疾患または炎症性疾患にかかった被験体に投与する段階を含む、免疫疾患または炎症性疾患の治療方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、前記幹細胞またはその培養物を被験体に投与する段階を含む、被験体の免疫反応または炎症反応を抑制する方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、免疫抑制剤または抗炎症剤の製造方法を提供するもことである。

本発明のさらに別の目的は、様々な用途で使用されているプロスタグランジンE2およびTGF-β1の製造方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、前記のNOD2を発現する幹細胞およびNOD2のアゴニストを含む移植体または前期移植体から幹細胞を除去した移植体および前記移植体の製造方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、上記のNOD2を発現する幹細胞およびNOD2のアゴニストを含む複合体を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、NOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養して得られる培養物を提供することである。

本発明は、免疫疾患および炎症性疾患の予防または治療に使用することができる医薬品組成物を提供するのに効果的である。また、複数の有用な用途で知られているPGE2およびTGF-β1を、構成的な面において簡易で経済的でありながら、化学工程がなく、且つ向上した収率で生産することができるPGE2およびTGF-β1の製造方法を提供するのに効果的である。本発明に係る薬学的組成物は、副作用が知られている既存の免疫抑制剤および抗炎症剤に代わるものとして、副作用がなく経済的に使用することができる細胞治療剤としてクローン病、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎等の自己免疫疾患等の免疫疾患および炎症性疾患の予防または治療に使用することができるので有用である。

hUCB-MSCでTLRおよびNLRが発現されることを表すmRNA RT-PCRの結果写真である。 各アゴニストで処理した後、IL-8の発現量およびMSCの増殖程度を測定したグラフである。 各アゴニストで処理した後、IL-8の発現量およびMSCの増殖程度を測定したグラフである。 各アゴニストで処理した後、IL-8の発現量およびMSCの増殖程度を測定したグラフである。 各アゴニストで処理した後、IL-8の発現量およびMSCの増殖程度を測定したグラフである。 各アゴニストで処理した後、MNCの増殖に対するhUCB-MSCの効果を表すグラフである。 各アゴニストで処理した後、hUCB-MSC培養物のMNC増殖に対する効果を表すグラフである。 各アゴニストで処理した後、hUCB-MSC培養物のMNC増殖に対する効果を表すグラフである。 各アゴニストで処理した後、脾細胞増殖に対する効果を表すグラフである。 MDPのみで処理した間葉系幹細胞（hUCB-MSC＃618）の培養物の抑制効果の比較（A）およびsiRNA処理実験の結果（B）を表すグラフである。 MDPのみで処理した間葉系幹細胞（hUCB-MSC＃620）の培養物の抑制効果の比較（A）およびsiRNA処理実験の結果（B）を表すグラフである。 アゴニストによる各受容体の処理後のPGE₂の分泌量を表すグラフである。 アゴニストによる各受容体の処理後のCOX-2の発現量を表すグラフである。 siNOD2およびsiRip2処理に伴ってMDPにより改善されたCOX-2発現量の変化を表すグラフである。 siNOD2、siRip2およびインドメタシン（indo）処理に伴って、MDPにより改善されたPGE₂の分泌量の変化を表すグラフである。 インドメタシン（indo）処理に伴って、MDPにより改善されたMNC増殖抑制効果の変化を表すグラフである。 siNOD2およびインドメタシン（indo）処理に伴ってMDPにより改善されたIL-10分泌量の減少効果を表すグラフである。 アゴニストによる各受容体の処理後のNOの生成量を表すグラフである。 アゴニストによる各受容体の処理後のPGE₂の分泌量を表すグラフである。 アゴニストによる各受容体の処理後のTGF-β1の分泌量を表すグラフである。 アゴニストによる各受容体の処理後のCOX-2発現量の変化を表すグラフである。 PGE₂の存在下でのMNC増殖抑制効果を表すグラフである。 PGE₂の存在下での脾細胞増殖抑制効果を表すグラフである。 インドメタシン（indo）処理に伴って、MDPにより改善されたMNC増殖抑制効果の変化を表すグラフである。 TGF-β1の中和抗体（a-TGF-β1）の処理に伴ってMDPにより改善されたMNC増殖抑制効果の変化を表すグラフである。 hUCB-MSCでNOD2およびRip2の両遺伝子の各siRNAによる該遺伝子およびタンパク質の発現が顕著に抑制されることを表した図である。 siNOD2とsiRip2処理に伴って、MDPにより改善されたCOX-2の発現量の変化を表すグラフである。 siNOD2、siRip2およびインドメタシン（indo）処理に伴って、MDPにより改善されたPGE₂の分泌量の変化を表すグラフである。 siNOD2およびsiRip2処理に伴って、MDPにより改善されたTGF-β1の分泌量の変化を表すグラフである。 siNOD2およびsiRip2処理に伴うMDPのMNC増殖抑制効果の変化を表すグラフである。 siNOD2、siRip2、インドメタシン（indo）およびTFG-β1中和抗体（a-TFG-β1）の処理に伴って、MDPにより改善されたIL-10の分泌量の変化を表すグラフである。 siNOD2、siRip2、インドメタシン（indo）およびTFG-β1中和抗体（a-TFG-β1）の処理に伴って、MDPにより改善された調節性Ｔ細胞(Treg)群の変化を表すグラフである。 臍帯血由来の間葉系幹細胞（UCB-MSC）、脂肪由来幹細胞（AD-MSC）および羊膜上皮幹細胞（AEC）においてNOD2、RIP2およびRPL13Aが発現されることを表すmRNA RT-PCRの結果の写真である。 各実験群と対照群による大腸炎モデルにおける体重減少の変化を表したグラフである。 生存率を表したグラフである。 疾病活性指数の変化を表したグラフである。 大腸の長さを表した図である。 大腸の長さを表したグラフである。 炎症の程度と浮腫、炎症細胞の浸潤の程度を表す病理組織写真である。 病理学的スコアを表したグラフである。 DSS処理により誘導された大腸炎マウスモデルの大腸におけるMDPによるIL-6、IFN-γおよびIL-10の分泌量の増減の有無を表したグラフである。 大腸炎のマウスモデルの対照群および実験群において、MDPおよびsiNOD2処理によるFox3p +細胞の大腸での局在化を蛍光顕微鏡で観察した写真である。 対照群および実験群において、MDPおよびsiNOD2処理に伴うFox3pのタンパク質の発現をウエスタンブロットで表した図である。 ウェスタンブロットの結果を数値化したグラフである。 MPO活性、および、マウス大腸の炎症細胞の浸潤を分析するためのCD4 +、CD11b +細胞の浸潤を表すグラフである。 アトピー性皮膚炎を誘発したマウスにMDPで処理したhUCB-MSCを静脈内または皮下注射を介して注入した後、その肉眼病変を評価したグラフである。 アトピー性皮膚炎の指標である血清中の免疫グロブリンEの数値を表したグラフである。 アトピー性皮膚炎の指標である血清中の免疫グロブリンG1の数値を示したグラフである。 マウスの皮膚組織を組織処理した後、H＆E染色をした図である。 マウスの皮膚組織を組織処理し、トルイジンブルー染色をした後の、アトピー性皮膚炎の主な症状の一つである肥満細胞の脱顆粒の程度を評価した図である。

前記の目的を達成するための一つの様態として、本発明は、NOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養物を含む免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

本発明では、NOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）のアゴニストで幹細胞を処理した場合、その間葉系幹細胞におけるPGE₂およびTGF-β1の分泌が促進され、これが次に免疫および炎症を調節することを確認した。即ち、本発明は、幹細胞の免疫および炎症調節機能がNOD2と関連があることを確認し、また、NOD2アゴニストによって処理された幹細胞の改善された免疫抑制および炎症抑制効果を確認し、NOD2アゴニストで処理された幹細胞およびその培養物が免疫調節および炎症調節のための細胞治療剤として利用できることを確認した。また、NOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養物を含む、免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療用の薬学的組成物として使用できることを提示する。本発明で使用される用語、「NOD2」及び「NOD2受容体」は、互換的に使用することができる。

本発明で使用される用語、「アゴニスト」は一般的に、受容体を正に刺激する役割を果たす化学物質を意味するもので、作用剤とも呼ばれる。即ち、アンタゴニストがリガンドを妨害したり負の機能を有する一方、アゴニストは正の機能を有する。本発明では、アゴニストは、一般的に受容体と結合する化学物質を意味する用語である「リガンド」と互換的に使用することができる。本発明の目的上、アゴニストはNOD2アゴニストであってもよい。

本発明で使用される用語、「NOD2アゴニスト」は、NOD2受容体に結合してNOD2を活性化させ得る物質を制限なく意味しているが、その例として、MDP（ムラミルジペプチド）であってもよい。

本発明で使用される用語、「MDP」はムラミルジペプチドで、本発明ではNOD2の経路を活性化させ間葉系幹細胞におけるPGE₂分泌を促進させるアゴニストとして使用することができる。

本発明において、アゴニストを「添加して培養」という表現は、例えば、間葉系幹細胞の培地にアゴニストを添加して培養することであってもよい。好ましくは、1〜100μg/mlの濃度で0.1〜200時間、さらに好ましくは1〜72時間の間アゴニストを添加して培養することであってもよい。また、アゴニストを添加して培養した後、培地を交換して培養することであってもよい。

本発明で使用される用語、「幹細胞」は、様々な組織に分化できる能力を有する細胞、即ち「未分化細胞」であり、「間葉系幹細胞」は、骨髄、臍帯血、胎盤（または胎盤組織細胞）、脂肪（または脂肪組織細胞）などの様々な成体細胞に由来する多能性の性質を有する幹細胞を意味する。例えば、骨髄に由来する間葉系幹細胞は、脂肪組織、骨/軟骨組織、筋肉組織に分化できる多能性によって、細胞治療剤としての開発のために、様々な研究が進められている。

本発明において、前記幹細胞は、ヒト成体幹細胞、ヒトの多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、動物の胚性幹細胞または動物の成体幹細胞であってもよい。一方、成体幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞、ヒト組織由来間葉系幹細胞、多能性幹細胞または羊膜上皮細胞であってもよく、間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤からなる群から選ばれる供給源由来の間葉系幹細胞であってもよく、特に、ヒト由来のものが好ましい。最も好ましくは、ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（hUCB-MSC）であってもよい。各供給源由来の幹細胞を得る方法は、当技術分野で公知の方法によることができ、本発明の実施例の方法に限定されない。

好ましくは、ヒト由来間葉系幹細胞を1〜100μg/mlの濃度のMDPで0.1〜200時間の間処理した間葉系幹細胞を用いることである。0.1時間より少ない時間の間MDPを添加する場合、NOD2の経路が十分に活性化されないことがあり、200時間以上MDPを添加することは経済的に多くの利益を得ることができないので、より好ましくは0.1〜200時間、さらにより好ましくは1〜72時間、最も好ましくは24時間の間MDPで処理した間葉系幹細胞を用いることができる。

前記間葉系幹細胞の培養に使用される培地としては、当技術分野で幹細胞培養に適合すると公知されている通常の培地を使用することができるが、例えばDMEM（ダルベッコ修飾イーグル培地）、またはケラチノサイト-SFM（ケラチノサイト血清フリー細胞）を使用することができ、最も好ましくは、D-media（Gibco）を使用することができる。

前記間葉系幹細胞の培地に添加剤を補充することができる。一般的に、等張液中の中性緩衝剤（例えばリン酸塩および/または高濃度の重炭酸塩）およびタンパク質の栄養分（例えば血清、例えばFBS、血清代替物、アルブミン、または必須アミノ酸および非必須アミノ酸、例えばグルタミン）を含有することができる。さらに、脂質（脂肪酸、コレステロール、血清のHDLまたはLDLエキス）およびこの種類のほとんどの保存液培地で見られるその他の成分（例えば、インスリンまたはトランスフェリン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、ピルビン酸塩、グルコースなどの糖源、任意のイオン化形態または塩であるセレニウム、ヒドロコルチゾンなどのグルココルチコイド、および/またはβ-メルカプトエタノールなどの還元剤）を含有することができる。

また、培地は、細胞が相互に付着したり、容器の壁に付着したり、または大きなクラスタを形成するのを防止する目的で、抗凝集剤、例えばInvitrogenが販売しているもの（Cat＃0010057AE）を含むことが有益であるといえる。

本発明の一実施態様では、NOD2アゴニストの一つであるMDP（ムラミルジペプチド）を添加して培養した幹細胞の培養物が単核細胞（MNC）の増殖を抑制することが確認された。

単核細胞は血流を循環しているうちに組織に移動し、移動した場所でマクロファージに成熟していく。単核細胞、マクロファージ、および樹状細胞は、体の免疫防御システムの中で最も重要なもので、これらの抗原提示能力とT-リンパ球の機能を調節する能力を通じて後天性免疫反応を誘導する上で中枢的な役割を果たす。一方、単核細胞およびマクロファージは、免疫過程における1次防衛線の一つである。また、単核細胞は、後天性免疫反応の認識段階および活性化段階で補助細胞としての機能を果たす。これらの主な機能は、抗原をT-リンパ球によって認識可能な形で提示し（抗原提示細胞; APC）、Ｔ細胞活性化のための２次の合図役として作用する膜タンパク質と分泌型タンパク質を生産することである。一部の単核食細胞は樹状細胞に分化されることもあり、樹状細胞は、タンパク質抗原に対するTリンパ球の反応を誘導するのに重要な役割を果たす。細胞および臓器の移植拒絶反応が起こる場合、体内に移植された細胞/臓器が外部の異物として認識され、したがって単核細胞、マクロファージ、および樹状細胞が増加する。したがって、MDP（ムラミルジペプチド）を添加して培養した幹細胞の培養物によって単核細胞の増殖が抑制される場合、体内の免疫反応の抑制をもたらすことは、当業者にとっては自明な事項であるといえよう。

本発明で使用される用語、「単核細胞」は骨髄や末梢血細胞に由来する単核の食作用白血球を意味する。

さらに、本発明の別の実施態様では、MDP（ムラミルジペプチド）を添加して培養した幹細胞がPGE₂およびTGF-β1の分泌を促進し、MNC抑制がPGE2およびTGF-β1によるものであることが確認された。このようなPGE₂はインターロイキン-1βなどの炎症性サイトカインおよびTNFαなどのサイトカインの分泌を抑制する役割をするものと報告されている。また、TGF-β1は、抗炎症性サイトカインとみなされる。

また、本発明の別の実施態様において、MDP処理した幹細胞は、抗炎症性サイトカインのIL-10を高収率で生産すること、さらに、調節性T細胞群を形成することが示唆されている。

したがって、本発明に係る幹細胞およびその培養物は、免疫疾患および炎症性疾患の予防および治療に有用である。ここで、前記の免疫疾患または炎症性疾患は、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、関節炎、細菌感染、敗血症または炎症等であり、前記の自己免疫疾患は、クローン病、紅斑病、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アディソン病、1型糖尿病、ループス、慢性疲労症候群、線維筋痛、甲状腺機能低下症および亢進症、硬皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Meniere's syndrome）、ギラン - バレー症候群（Guilian-Barre syndrome）、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、白斑症、全身性硬皮症、喘息、または潰瘍性大腸炎等が挙げられる。

本発明で使用される用語、「炎症性疾患」は、炎症に起因する病変を総称し、これらに限定されないが、好ましくは浮腫、皮膚炎、アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、結膜炎、歯肉炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症（fibromyalgia）、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、筋炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群（sjogren's syndrome）、または多発性硬化症であり得る。

本発明で使用される用語、「免疫疾患」とは、特定の免疫反応の発生に関連する疾患を意味し、これらに限定されないが、好ましくは、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病であり得、自己免疫疾患は、クローン病、紅斑病、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アディソン病、1型糖尿病、ループス、慢性疲労症候群、線維筋痛症、甲状腺機能低下症および亢進症、硬皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Meniere's syndrome）、ギラン - バレー症候群（Guilian-Barre syndrome）、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、白斑症、全身性硬皮症、喘息、または潰瘍性大腸炎位であり得る。

本発明の実施態様によれば、大腸炎の動物モデルおよびアトピー性皮膚炎モデルにおいて、本発明による幹細胞またはその培養物が炎症性疾患である大腸炎を治療し、免疫疾患アトピーを治療することが確認され、免疫疾患および炎症性疾患の治療効果があることが確認された。

本発明で使用される用語、「予防」は、前記組成物の投与により免疫疾患または炎症性疾患の発症を抑制するかまたは遅延させる全ての行為を意味し、「治療」は、前記組成物の投与により免疫疾患または炎症性疾患の症状が好転または改善するすべての行為を意味する。

また、本発明の組成物は、1mlあたり1.0×10⁵個〜1.0×10⁹個、好ましくは1.0×10⁶個から1.0×10⁸個、より好ましくは1.0×10⁷個の細胞を含むことができる。

本発明の組成物は凍結されていない状態で使用してもよく、また後の使用のため凍結させてもよい。凍結の必要がある場合は、標準の冷凍保存剤（例えばDMSO、グリセロール、Epilife（登録商標）、細胞凍結培地（Cascade Biologics））を凍結前の細胞集団に添加することができる。

また、前記組成物は、薬学的分野における通常の方法に従って、患者への身体内投与に適した単位投与剤形に製剤化することにより投与してもよく、前記製剤には、単回または複数回用量の有効量を含める。これらの目的に適合した剤形としては、非経口投与製剤として注射用アンプルのような注射剤、注入バックのような注入剤、およびエアロゾル製剤のようなスプレー剤等が好ましい。前記の注射用アンプルは使用直前に注射液と混合調製が可能で、注射液としては生理食塩水、ブドウ糖、マンニトール、リンゲル液等が使用できる。また、注入バッグはポリ塩化ビニルまたはポリエチレン製のものを使用することができ、バクスター（Baxter）、ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、メドウセプツ（Medcep）、ナショナル・ホスピタル・プロダクツ（National Hospital Products）またはテルモ（Terumo）社の注入バックを例示することができる。

前記薬学的製剤は、前記有効成分の他に一つ以上の薬学的に許容可能な通常の不活性担体、例えば注射剤の場合には、保存剤、無痛化剤、可溶化剤または安定化剤などを、そして局所投与用製剤の場合には、基剤（base）、賦形剤、潤滑剤または保存剤等をさらに含んでもよい。

前述のように製造された本発明の組成物または薬学的製剤は、当技術分野において一般的に使用される投与方法を用いて、移植またはその他の用途に使用される他の幹細胞と併せて投与することができ、またそれらの幹細胞との混合物の形で投与されてもよい。好ましくは、治療が必要な患者の疾患部位に直接生着または移植したり、腹腔内に直接移植または注入できるが、前述の方法に限定されない。また、前記の投与は、カテーテルを用いた非外科的投与および疾患部位切開後の注入または移植等の外科的投与方法も全て可能だが、カテーテルを用いた非外科的投与方法がより好ましい。また、通常の方法によって非経口的に、例えば病変に直接投与する方法の他に、造血系幹細胞移植の一般的な方法である血管内注入による移植も可能である。

前記幹細胞は、単回用量または複数回用量で1日あたり細胞1.0×10⁴〜1.0×10¹⁰個/kg体重、好ましくは細胞1.0×10⁵〜1.0×10⁹個/kg体重の量で投与できる。しかし、有効成分の実際の投与量は、治療しようとする疾患の種類、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢、性別等の様々な関連要素を考慮して決定されると理解されるべきである。したがって、前記の投与量は、どのような面から見ても、本発明の範囲を限定するものではない。

別の様態として、本発明は、前記組成物を免疫疾患または炎症性疾患にかかった被験者に投与する段階を含む、免疫疾患または炎症性疾患の治療方法を提供する。

さらに別の様態として、本発明に係るNOD2アゴニストで処理された幹細胞およびその培養物を投与することにより、免疫反応を抑制するか炎症を調節することができ、本発明は、NOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養物を被験体に投与する段階を含む被験体の免疫反応または炎症反応の抑制方法を提供する。

本発明で使用される用語、「被験体」とは、ウシ、イヌ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ、ヒトを含む哺乳動物を意味するが、これに限定されない。この時、前記の免疫反応または炎症の抑制方法は、ヒトを除く動物に限定されてもよい。また、好ましくは、NOD2のアゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養物の投与は腹腔または血管内投与、病変への直接投与または関節腔(Synovial cavity）内投与等が挙げられる。

上記免疫反応または炎症反応の抑制は、免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療を目的とする。

さらに別の様態として、本発明は、NOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養する段階を含む、免疫抑制剤または抗炎症剤の製造方法を提供する。

本発明で使用される用語、「免疫抑制剤」とは、前記で説明したように、NOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養することによって得られた幹細胞またはその培養物を含む製剤であって、免疫反応を抑制して免疫疾患を治療することができる製剤を意味する。

本発明で使用される用語、「抗炎症剤」とは、前記で説明したように、NOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養することによって得られた幹細胞またはその培養物を含む製剤であって、炎症を抑制することによって炎症性疾患を治療することができる製剤を意味する。

さらに別の様態として、本発明は、NOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞をNOD2のアゴニストを添加した培地で培養する段階を含み、培養時に前記幹細胞からPGE₂（プロスタグランジンE2）またはTGF-β1（Transforming growth factor beta 1）が分泌されることを特徴とするPGE2またはTGF-β1の製造方法を提供する。

本発明の実施態様によれば、MDPで処理していない間葉系幹細胞と他の受容体の種々のアゴニスト（DAP、LPS、Pam3CSK4など）で処理した間葉系幹細胞に比べて、MDPで処理した間葉系幹細胞は、様々な有用な用途で使用されることが公知されているPGE2およびTGF-β1の分泌を著しく促進することが確認された。

本発明において、PGE₂およびTGF-β1の回収は、前記幹細胞を培養した培地を回収し、遠心分離または濾過して細胞および浮遊物を除去し、残った上清を回収して得ることができる。

さらに別の様態として、本発明は、NOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞およびNOD2のアゴニストを含む移植体を提供する。

本発明で使用される用語、「移植体」とは、損傷した部位を外部から隔離したり、移植された細胞や分泌した治療物質が留まるようにする支持体として、ヒトまたは哺乳動物に移植できる物質を意味する。このような移植体は、組織工学用支持体として生分解性を有する合成高分子と天然材料等、当技術分野に多様に使用される物質を制限なく含む。本発明の移植体はNOD2を発現する幹細胞およびNOD2のアゴニストを含むため、移植体による免疫拒否反応または炎症反応を起こさないという利点がある。したがって、様々な移植体を体内に移植した場合に発生し得る免疫拒否反応または炎症反応を抑制するための追加の免疫拒否反応抑制剤または抗炎症剤を全く用いることなく、移植された移植体は、生体内に免疫拒絶反応または炎症反応を引き起こさず、安定的に生着することができる。

さらに別の様態として、本発明は、移植体内でNOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養した後、幹細胞を除去した、移植体を提供する。

さらに別の様態として、本発明は、移植体内でNOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養する段階を含む移植体の製造方法を提供する。

好ましくは、前記方法は、培養段階の後に幹細胞を除去する段階をさらに含むことができる。

さらに別の様態として、NOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞およびNOD2のアゴニストを含む、複合体を提供する。

好ましくは、前記複合体中の幹細胞のNOD2にNODアゴニストが結合されていてよい。より好ましくは、複合体中の幹細胞のNOD2にNOD2のアゴニストが結合されることによりNOD2が活性化されていてもよい。前記複合体は、細胞治療剤として使用することができる。

さらに別の様態として、本発明は、NOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加することによって得られた培養物を提供する。

上記培養物には免疫疾患または炎症性疾患を予防または治療できる効果を発揮することを可能にするPGE2および/またはTGF-β1の成分が存在し得る。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものでないことは当技術分野で通常の知識を有する者にとって自明のことである。

特に、下記の実施例では、臍帯血由来の間葉系幹細胞を用いた方法についてのみ例示されているが、他のNOD2受容体を有する間葉系幹細胞と幹細胞についてもNOD2アゴニストで処理することにより、PGE₂の産生量を大幅に増加させて免疫抑制または炎症抑制の効果が得られることは、本明細書に開示された内容から明らかであり当技術分野で通常の知識を有する者にとって自明のことであろう。

また、下記の実施例では、NOD2アゴニストとしてMDPが使用されたが、下記の実施例に示されるように、NOD2受容体を抑制した幹細胞は、免疫調節効果がないことが確認されており、他のNOD2アゴニストを使用しても、本発明の免疫抑制または炎症抑制効果を得ることができることは、本明細書に開示された内容から、当技術分野において通常の知識を有する者にとって自明であろう。

実施例1：ヒト臍帯血由来の間葉系幹細胞（以下、hUCB-MSC）とヒト臍帯血由来単核細胞（以下、hUCB-MNCとする）の分離および培養
臍帯血（UCB）のサンプルは産婦の許可を得て韓国のポラメ病院とソウル大学校IRB（IRB No. 0603/001-002-07C1）で、出産直後の臍帯の静脈から得た。UCBのサンプルをHetasep溶液（StemCell Technologies社、バンクーバー、カナダ）と5:1の割合で混ぜた後、室温で培養して赤血球を除去した。単核細胞は、Ficoll溶液を添加し、2500rpmで20分間遠心分離して上澄液を収集して得た。ペレット化した細胞はPBSで二回洗浄した。

hUCB由来の単核細胞（hUCB-MNC）は、10％FBS（ウシ胎仔血清）が添加されているRPMI-1640（Gibco、Grand Island、NY、USA）培地で培養した。

hUCB由来の間葉系幹細胞（hUCB-MSC）は、EGM-2 SingleQuotと10％FBS（Gibco BRL）を含むD-media（Formular No.78-5407EF、Gibco BRL）において、細胞2×10⁵〜2×10⁶個/cm²の濃度で培養し、3日後に、付着していない細胞を除去した。底に付着している細胞は、コロニー(細胞群体)を形成し短期間で成長し、紡錘形を示すことが確認され、各UCBサンプルから分離された間葉系幹細胞を、それぞれ＃618および＃620と命名した。

実施例2：hUCB-MSCが発現する受容体の確認
2-1：TLR2、TLR4、NOD1およびNOD2のhUCB-MSCにおける機能的発現の確認
TLR2（Toll様受容体2）、TLR4（Toll様受容体4）、NOD1（Nucleotide-binding Oligomerization Domain proteins 1）とNOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain proteins 2）がhUCB-MSCで機能的に発現されるか否かをRT-PCRを介して調べた。

具体的には、hUCB-MSCの全てのRNAは、Easy-spin全RNA抽出キット（Intron Biotechnology、Seongnam、Korea）を使用して抽出した。cDNAは1μgの全RNAからSuperscript IIIリバーストランスクリプターゼ（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）とオリゴ（dT）プライマー（Invitrogen）を用いて作製した。プライマーセットは、以下の通りである（F：フォワード、R：リバース）。
TLR2 F（配列番号1）：5'-GATGCCTACTGGGTGGAGAA-3'
TLR2 R（配列番号2）：5'-CGCAGCTCTCAGATTTACCC-3'
TLR4 F（配列番号3）：5'-ACAGAAGCTGGTGGCTGTG-3'
TLR4 R（配列番号4）：5'-TCTTTAAATGCACCTGGTTGG-3'
NOD1 F（配列番号5）：5'-CCACTTCACAGCTGGAGACA-3'
NOD1 R（配列番号6）：5'-TGAGTGGAAGCAGCATTTTG-3'
NOD2 F（配列番号7）：5'-GAATGTTGGGCACCTCAAGT-3'
NOD2 R（配列番号8）：5'-CAAGGAGCTTAGCCATGGAG-3'
Rip2 F（配列番号9）：5'-CCATTGAGATTTCGCATCCT-3'
Rip2 R（配列番号10）：5'-ATGCGCCACTTTGATAAACC-3'
RPL13A F（配列番号11）：5'-CATCGTGGCTAAACAGGTAC-3'
RPL13A R（配列番号12）：5'-GCACGACCTTGAGGGCAGCC-3'

PCR条件は、95℃で3分間解離させた後、30サイクルを行い、10分間の間72℃で最終的に延長した。１サイクルは、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で1分の構成とした。PCR産物は、1.5％アガロースゲルから分離し、ゲルドキュメンテーションシステムで可視化させ、写真撮影した。

図1aに示すように、単球性白血病細胞株すなわちTHP-1細胞を陽性対照群として使用した時、すべての受容体がTHP-1細胞およびhUCB-MSCにおいて発現していた。TLR4はTHP-1細胞よりhUCB-MSCにおいてより高レベルで発現していた。一方、TLR2、NOD1、NOD2の発現レベルはTHP-1細胞で高かった。一方、Rip2もhUCB-MSCで発現することが観察された。

2-2：発現が確認された受容体のアゴニストによる刺激によるサイトカイン生産の分析
上記実施例2-2で発現が確認された受容体の機能を調べるために、アゴニストの刺激に対応したIL-8の生産を調査した。hUCB-MSCを96ウェルプレート中、細胞2×10⁴個/ウェルで、2％のFBSを補充したKSFM培地で培養した。24時間後、各々の受容体のアゴニストであるPam₃CSK4（TLR2アゴニスト、Pam₃）、LPS（TLR4アゴニスト）、Tri-DAP（NOD1アゴニスト、T-DAP）、およびMDP（NOD2アゴニスト）で処理して24時間さらに培養した。上清を集め、遠心分離した後、0.2μmフィルターで濾過した。その後、IL-8とPGE₂の濃度をELISAキット（R＆D Systems、Minneapolis、MN、USA）を用いて測定した。Ultrapure LPS（E. coli O111：B4）、Pam₃CSK4、およびTri-DAPはInvivogen（San Diego、CA、USA）から購入した。MDP [Ac-（6-O-ステアロイル）-ムラミル-Ala-D-Glu-NH2; ムラミルジペプチド]は、Bachem社（Bubendorf、Switzerland）から購入した。組換えヒトインターフェロン-γは、Peprotech（Rockyhill、NJ、USA）から購入した。

その結果、図1bと1cに示されるように、Pam₃CSK4（トリアシル化ペプチド; TLR2アゴニスト）、LPS（リポ多糖、TLR4アゴニスト）、Tri-DAP（トリ-ジアミノピメリン酸、NOD1アゴニスト）、およびMDP（NOD2アゴニスト）で、各々刺激を与えた時、hUCB-MSCにおいて、IL-8が投与量依存的に増加した。即ち、hUCB-MSCにおいてこれらの特定のアゴニストに対応してNOD1、NOD2、TLR2、TLR4が発現されて機能していることが確認された。

2-3：アゴニストによるTLRおよびNLRに対する刺激がhUCB-MSCの増殖に与える影響に関する分析（1）
本実施例では、特定の種類のMSCはTLRの刺激に影響を受けるという研究結果（Pavsner-Ficher et al., Toll-like receptors and their ligands control mesenchymal stem cell functions、Blood、109:1422、2007）に基づき、hUCB-MSCの場合を検証するために、各アゴニストで処理して4日間培養した後分析した。

より詳しくは、96ウェルプレート中、細胞を2×10³個/ウェルで2％のFBSを補充したMSC培地で培養した。培養24時間後、細胞を各10μg/ mlの濃度のPam₃CSK4（TLR2アゴニスト）、LPS（TLR4アゴニスト）、Tri-DAP（NOD1アゴニスト）、およびMDP（NOD2アゴニスト）で処理してさらに4日間培養した。増殖はCell Counting Kit-8（Dojindo Molecular Technologies、Rockville、MD、US）を使用して測定した。各実験群の結果における差異は±SDで示した。すべての統計の解析は、MS Excelプログラムを使用しており、P <0.05は、統計的有意と解釈し、以下同様である。

その結果、図1dと1eに示されるように、どのようなアゴニストもhUCB-MSCの増殖に影響を及ぼさないことを確認することができた。

2-4：アゴニストによるTLRとNLRに対する刺激がhUCB-MSCの増殖に与える影響に関する分析（2）
本発明者らはTLRおよびNLRアゴニストが、ヒトMNCの増殖に対するhUCB-MSCの抑制能力を強化するか否かについて調査した。

MSCとリンパ球の間における直接相互作用がMSCによるリンパ球増殖の抑制に重要であるという研究に基づいて、本発明者らは直接接触条件でMNC増殖に対するhUCB-MSCの抑制能力にMDPが影響を与えるか否かを調査した。

その結果、図2に示すように、hUCB-MSC（＃618）は、細胞対細胞接触条件においてヒトMNCを急激に抑制した。しかし、TLR（Pam3CSK4とLPS）およびNLRアゴニスト（Tri-DAPとMDP）は、前記のような条件でMNC増殖に対するhUCB-MSCの抑制効果に影響を与えなかった（図2）。

実施例3：NOD2-Rip2依存的経路を通じたMDPによるhUCB-MSCの免疫抑制増進効果の確認（1）
3-1：MDP処理時にhUCB-MSCで製造される分泌因子がMNC増殖に与える効果の確認
また、水溶性因子がMSCによる免疫抑制を媒介することが知られているため、本発明者らはUCB-MSCによって製造される分泌因子がヒトMNCの増殖に影響を与えるか否かを調査した。培養培地（CM）を用意し、hUCB-MSCを24時間以上アゴニストと共培養し、洗浄した後、新たな培地に交換した。4日間さらに培養した後、対照群であるCMおよびアゴニスト処理されたhUCB-MSC（＃618）を用意して、3日間hUCB-MSCのCMの存在下でMNCを培養した。

その結果、MNCの増殖は対照群であるhUCB-MSCの培地（UCM）で弱く抑制された（図3a）。驚くべきことに、MNCの増殖は、MDPで前処理したUCM（MDP-UCM）の存在下でより一層抑制された。しかし、他のアゴニスト（Pam₃CSK₄、LPS、Tri-DAP）の場合はそのようではなかった（図3a）。他のhUCB-MSC（＃620）から製造されたUCMを使用した実験でも類似した結果を示した（図3b）。さらに、UCMの存在下で異種マウス脾細胞の増殖が抑制され、この細胞増殖の抑制はMDPの刺激によって増大した（図3c）。これらの結果は、hUCB-MSCからMDPによって誘導された分泌因子が、免疫抑制において重要な役割を果たすことを裏付けるものである。

3-2：MDP処理時におけるhUCB-MSCの免疫抑制増進効果の確認
MDPがhUCB-MSCの免疫抑制効果を強化させるか否かを確認するため、次の実験を行った。対照群であるhUCB-MSCの培地（CM）を調製し、アゴニスト処理されたhUCB-MSCを培養5日目に回収した。その後、MNCをさらに3日間hUCB-MSCのCMで共培養することによってMNCの増殖を観察した。

その結果、図4Aに示されるように、アゴニストであるMDPで処理した間葉系幹細胞の上澄液（UCB-MSC＃618 + MDP）の場合、アゴニストを添加せずに培養したUCB-MSC上澄液（UCB- MSC＃618）に比べて著しくMNC増殖が抑制された。

これに反して、他のアゴニスト（LPS等）で処理した間葉系幹細胞上澄液（UCB-MSC＃618 + Pam₃; UCB-MSC＃618 + LPS; UCB-MSC＃618 + T-DAP）の場合は、アゴニストを添加せずに培養したUCB-MSC上澄液（UCB-MSC＃618）と同様のMNC抑制率であった。即ち、何も添加していない陰性対照群と比較してMNC増殖が若干抑制されるだけだった。

これらの結果は、MDPを添加した結果、間葉系幹細胞から分泌される水溶性因子によって著しくMNC増殖が抑制されたことを示す。

3-3：siRNAを用いた、MNC抑制におけるNOD2、Rip2とMDPの関係の検証
さらにNOD2およびRip2のsiRNAと対照群（siCTL）を利用して、MNC抑制におけるNOD2、Rip2およびMDPの相互関係を検証するための実験を行なった。細胞が60％の濃度となったとき、siRNAを導入し、RIPK2（receptor-interacting serine-threonine kinase 2またはRip2（Receptor interacting kinase protein 2）; NOD1およびNOD2のアダプタで、RICKまたはCARDIAKとも呼ばれるキナーゼの一種（Bertin et al、1999; Inohara et al、1999; Ogura et al、2001b））のsiRNAである、siRIPK2（M-003602-02）、NOD2のsiRNAであるsiNOD2（J-011388-07）および非標的対照（siControl＃1、D-001810-01）は、Dharmacon（Chicago、IL、USA）社から購入した。DharmaFECT1（Dharmacon）を導入薬剤として使用し、siRNAは、100 nmol /Lの濃度で導入した。導入の48時間後に培地を交換し、陰性対照群（MNC単独で培養した培地）および陽性対照（アゴニストを添加せずに培養したUCB-MSC上澄液（UMS）で処理した培地）を除き、細胞を10μg/mL MDP（NOD2アゴニスト）で各々24時間ずつ処理した。

即ち、対照群として、MNC単独で培養した培地（i）、アゴニストを添加せずに培養したUCB-MSCの上澄液（UMS）で処理した培地（ii）を用意し、MDPとUMSで処理した培地（iii）、MDP、UMSと対照siRNA（siCTL）で処理した培地（iv）、MDP、UMSとsiNOD2で処理した培地（v）およびMDP、UMSとsiRip2で処理した培地（vi）を用意した。その後MNCの増殖を光学密度450nmで検証した。

その結果、図4Bに示されるように、培地（iv）は、培地（iii）と同じ程度の増殖抑制を示しているのに対し、培地（v）、（vi）は、培地（ii）と同じ程度に抑制されることが確認された。即ち、NOD2とRip2のsiRNAは、MDPによって強化されたMNCの抑制をそれ以前の程度まで戻したが、対照群siRNAは、そのような結果を示さなかった。この結果から、NOD2およびRip2はMDP誘導免疫反応を正に調整しているとが分かる。したがって、NOD2およびRip2がMDP調節性のUCB-MNC抑制に必要であると見なされる。

実施例4：MDPのNOD2-Rip2依存的経路を通じたhUCB-MSCの免疫抑制増進効果とその確認（2）
実験結果の検証のために、実施例1で得られた間葉系幹細胞株＃620について、実施例3-2および3-3と同じ方法で実験を行った。

その結果、図5Aに示されるように、実施例3-1と同じようにアゴニストとしてMDPで処理した間葉系幹細胞上澄液（UCB-MSC＃618 + MDP）の場合は、他の受容体をアゴニストで処理したか、またはアゴニストを添加せずに培養したUCB-MSC上澄液（UCB-MSC＃620）と比べて著しくMNCの増殖を抑制することが示され、また、図5Bに示されるように、実施例3-3と同様にNOD2とRip2のsiRNAは、MDPによって強化されたMNCの抑制をMDPで強化される以前に戻したが、対照群siRNAは、そのような結果を示さないことが確認された。これらの結果は、MDPがNOD2-Rip2依存的経路を通じた、間葉系幹細胞によるMNC増殖抑制を強化することを意味するであろう。

これらの実験結果は、前記の実施例3の結果と共に、本発明に係るMDPで処理した幹細胞およびその培養物が優れた免疫抑制効果を示すため、関節リウマチおよびクローン病などの自己免疫疾患やアトピー性皮膚炎などの免疫疾患の治療のための免疫調節組成物として非常に有用に使用されることを示す。

実施例5：MDPによって生産されたPGE2のUMS（UCB-MSC上澄液;UMS）によるMNCの抑制との関連性についての分析
5-1：MDPのMSCに対するPGE2分泌量増加効果を確認
hUCB-MSC（2×10⁴個/ウェル）を96ウェルプレートの2％FBSを補充したMSC培地で培養した後、24時間後に1μg/mL Pam3CSK4（TLR2アゴニスト）、1μg/mL LPS（TLR4アゴニスト）、10μg/mL Tri-DAP（NOD1アゴニスト）または10μg/mL MDP（NOD2アゴニスト）を各々添加して24時間培養した後、培養上澄液を得た。培養上澄液は、遠心分離した後、0.2μmフィルターで濾過し、その後PGE₂の濃度をELISAキット（R＆Dシステム、Minneapolis、MN、USA）を用いて製造業者のプロトコルに従って測定した。

その結果、図6aに示されるように、hUCB-MSCを他の受容体のアゴニストで処理した場合と比較し、NOD2のアゴニストであるMDPで処理した場合、PGE₂の産生を有意に増加させ得ることが確認できた。

5-2：COX-2の発現とMDP処理との関係についての確認
各種細胞に1μg/mL Pam3CSK4（TLR2アゴニスト）、1μg/mL LPS（TLR4アゴニスト）、10μg/mL Tri-DAP（NOD1アゴニスト）または10μg/mL MDP（NOD2アゴニスト）を各々添加して24時間培養した。その後、回収した細胞を2mMのジチオスレイトールとプロテアーゼ・カクテル（Roche社、US）を添加した１％のNonidet-P40バッファを使用して溶解させた。細胞溶解産物は、12％のSDS-PAGEで分離させ、ニトロセルロース膜に移し、1次抗体（COX-2、GAPDH（Santa Cruz biotechnology、Santa Cruz、CA、USA））で免疫染色した。その後2次抗体で免疫染色した後、タンパク質をECL（enhanced chemiluminescence）試薬（Intron Biotechnology）を用いて検出した。

その結果、図6bに示されるように、hUCB-MSCを他の受容体のアゴニストで処理した場合に比べ、NOD2のアゴニストであるMDPで処理した場合、COX-2の発現を強化することが確認できた。

5-3：COX-2の発現とNOD2、Rip2およびMDP処理との関係
COX-2の発現とNOD2、Rip2との関係を調べるために、MDPで処理した後siNOD2、siRip2で処理した細胞のCOX-2の発現量を調べた。タンパク質の発現量の測定は、実施例5-2と同様であり、siRNA処理方法は、実施例3-3に記載された方法と同様に行った。

その結果、図6cに示されるように、COX-2の発現は、NOD2とRip2の抑制により減少したことが確認された。この結果によって、COX-2の発現がNOD2とRip2に依存することを示していると判断することができる。

5-4：NOD2、Rip2およびCOX-2のPGE2発現に対する影響の確認
MDP処理の効果の持続時間を決定するために、hUCB-MSCをMDPで処理し、1日後にMDPを除去した後、PGE₂産生量を調べた。MDPは処理1日後に培地を除去した後、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて5回洗浄することにより、除去した。一方、実施例5-1のようにMDPで処理してPGE2の濃度を測定した。この時、NOD2、Rip2とCOX-2のPGE₂発現に対する影響を調べるために、実施例3-3の各対照群すなわちsiRNA（siCTL）、siNOD2、siRip2およびCOX-2の抑制剤であるインドメタシン（Sigma社（St. Louis、MO、USA）)で細胞を処理した。

その結果、図6dに示されるように、MDPが1日後に除去されたにもかかわらず、MDPで刺激したhUCB-MSCは培養5日後の時点で対照群よりもPGE2を多く生産することが示された。また、NOD2とRip2のsiRNAが導入された場合およびインドメタシンでCOX-2を抑制した場合、MDPによって強化されたPGE₂の生産量は再び抑制されることが分かった。これは、NOD2、Rip2とCOX-2がhUCB-MSCにおけるMDP誘導性PGE₂生産に重要であることを示唆している。

5-5：hUCB-MSCによるMNC抑制におけるPGE2の役割の確認
hUCB-MSCによるMNC抑制におけるPGE₂の役割を調べるために、MSC上澄液、MDPで処理して培養したMSC上澄液、およびMDPとインドメタシン（COX-2阻害剤）で処理して培養したMSC上澄液でMNC細胞を処理したときの、MNCの増殖を調べた。この実験は、前記実施例3と同一の方法により行った。

その結果、図6eに示されるように、MDPで処理したMSC培養液の場合MNCの増殖を顕著に抑制するが、インドメタシン（Indo）と同時に処理した場合には、陰性対照群と類似したMNCの増殖を示した。これらの実験結果は、実施例5-4と共にhUCB-MSCによるMNC抑制がPGE₂によるものであることを意味する。

このような実験結果は、本発明によるMDP処理した幹細胞およびその培養物がPGE₂を生産することにより、免疫抑制用組成物として極めて有用であることを意味する。一方、これまで調べてきたように、PGE₂は炎症性サイトカインであるインターロイキン-1βおよびTNFαのようなサイトカインの分泌を抑制する役割を果たすものであると報告されていることからも、本発明によるMDP処理した幹細胞およびその培養物は抗炎症組成物として有用である。

5-6：NOD2およびCOX-2のMDPにより誘導される抗炎症性サイトカインであるIL-10（インターロイキン-10）の産生量の影響についての確認
IL-10の濃度を測定するためにhUCB-MSC（1×10⁵個/ウェル）を24ウェルプレート中で2％のFBSを補充したMSC培地に播種（seeding）した後、24時間後、siNOD2またはインドメタシン（Indo）で処理し、24時間さらに追加で培養した。5回洗浄した後、新しいRPMIを新たに加え、5日後にUCB-MSC上澄液（UMS）を得た。MNCは1×10⁶個/ウェルでUMSおよびConA（シグマ社（St. Louis Mo、USA））と共に培養した。3日後に細胞上澄液を収集して遠心分離し、0.2μmフィルターで濾過し、 IL-10の濃度をELISAキット（R＆D Systems、Minneapolis、MN、USA）を用いて測定した。

その結果、図6fに示されるように、MDP処理によって抗炎症性サイトカインのIL-10の生産量が大幅に増加するが、NOD2抑制やインドメタシン処理によって、IL-10の産生が抑制されることを確認することができた。これらの実験結果は、MDPの処理に応じて、抗炎症性サイトカインであるIL-10もPGE₂と同様にNOD2-Rip2経路に依存して、その生産量が顕著に増加することを示唆している。

即ち、本発明によるMDP処理した幹細胞は、抗炎症性サイトカインであるIL-10を高収率で生産するため、本発明によるMDP処理した幹細胞またはその培養物は、抗炎症組成物、特に関節炎などの治療のための抗炎症組成物として有用である。

実施例6：MDPに反応して、hUCB-MSCによって生成されたPGE ₂ およびTGF-β1のMNC抑制との関連性について
6-1：MSCにおけるPGE2およびTGF-β1の分泌量増加効果の確認およびCOX-2発現に対するMDPの確認
肝細胞成長因子であるTGF-β、IDO-1（インドールアミン2,3ジオシキゼナーゼ-1）、NO（一酸化窒素）、およびPGE2（プロスタグランジンE2）のような水溶性因子は、MSCによる免疫抑制を調節する候補因子である。hUCB-MSCでTLRおよびNLRアゴニストがNO、PGE₂とTGF-β1を含む分泌因子を誘導するか否かを確認するために、それぞれの細胞をPam₃CSK₄、LPS、Tri-DAP、およびMDPと共に24時間培養し、培養上澄液を収集して得た。前記実施例5-1と5-2と類似した方法により分泌因子の分泌を確認した。

その結果、マクロファージにおいてLPSがNOの生成を誘導したが、hUCB-MSCにおいてTLRとNODアゴニストによる単独処理はNOを生成しなかった（図7a）。興味深いことに、PGE₂とTGF-β1の生成は、他のアゴニストではなく、MDPに反応してhUCB-MSCにおいて促進された（図7bと7c）。さらに、MDPの曝露は刺激後24時間目にhUCB-MSCにおいてPGE₂の生成の主要酵素であるCOX-2の発現を増加させた（図7d）。

6-2：PGE ₂ とTGF-β1のMNC増殖に対する効果の確認
単核球の増殖でPGE₂の効果を確認するために、hMNCとマウス脾臓単核細胞を、様々な濃度のPGE₂の存在下で培養した。実験は、実施例5-5と同じ方法で行った。

その結果、hMNCとマウス脾臓単核細胞の増殖は、10 ng/mL以上の濃度のPGE₂の存在下で著しく抑制された（図7eおよび7f）。

次に、本発明者らはMDPで前処理したUCMによってhMNCが抑制されるのはPGE₂およびTGF-β1によるものかどうかを調査した。実験は、実施例5-5と同じ方法で行った。

その結果、hMNC増殖に対するMDP-UCMの抑制能力は、一般的なCOX阻害剤であるインドメタシンによって完全に除去された（図7g）。さらに、TGF-β1中和抗体と同時処理した場合は、MDP-UCMはhMNCの増殖を抑制できなかった（図7h）。このような結果は、hUCB-MSCにおいてMDPがPGE₂とTGF-β1の生成を誘導し、これがhUCB-MSCの免疫抑制能力を媒介することを示唆している。

実施例7：hUCB-MSCにおいて、MDPによるCOX-2発現、PGE2およびTGF-β1の生成とNOD2およびRip2の関係についての分析
NOD2とRip2はMDP誘導免疫反応に対して重要である。したがって、本発明者らはMDPに反応したhUCB-MSCにおけるCOX-2の発現とPGE2およびTGF-β1の生成にNOD2およびRip2が必要であるかを調査した。実験は、実施例5-4と同じ方法で行った。

その結果、hUCB-MSCにおいてNOD2およびRip2両方の遺伝子およびタンパク質がsiRNAによって著しく抑制された（図8）。siRNAによるNOD2およびRip2の下方調節はhUCB-MSCにおいてMDP誘導性COX-2の発現を抑制した（図9a）。NOD2およびRip2に対するsiRNA処理は、対照群siRNAと比較してMDP-UCMでPGE₂およびTGF-β1の生成を減少させた（図9bおよび9c）。さらに、MLR実験ではNOD2およびRip2の下方調節がhMNC増殖においてMDPによって増大したUCMの抑制効果を元の状態にもどした（図9d）。このような結果は、MDPがNOD2-Rip2経路を通じてhUCB-MSCにおいてPGE2およびTGF-β1生成の増加を導き、これはUCM-MSCの免疫抑制能力を強化することを示唆する。

実施例8：MDPで前処理されたUCMのhMNCにおける、IL-10の生成および調節性T細胞群に対するの効果の確認
8-1：MDPで前処理されたUCMのhMNCにおける、IL-10生成の効果分析
骨髄間質細胞で生成されたPGE₂は、宿主マクロファージによって生成されるIL-10にとって重要であると公知されている（Nemeth, K., A. et al., Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E（2）-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat Med 15:42-49, 2009）。MDPがhUCB-MSCからPGE2生成を誘導するため、本発明者らはhMNCによるIL-10の生成がMDP-UCMの存在下で増加するかについて調査した。実験は、実施例5-6と同じ方法で行った。

その結果、MDP刺激に関係なく、UCB-MSC単独ではIL-10を生成していなかった（データの提示は無し）。hMNC単独ではIL-10を生成しなかったが、UCMの存在下でIL-10の生成は、上方調節された（図10a）。さらに、hMNCによるIL-10の生成は非処理のUCMに比べMDP-UCMの存在下で、より多く増加した（図10a）。しかし、インドメタシンまたはTGF-β1中和抗体単独処理はMDP-UCMによって促進されたhMNCのIL-10生成を元に戻し、このレベルはインドメタシンおよびTGF-β1中和抗体の組み合わせ処理によって、より減少した（図10a）。hUCB-MSCにおいてsiRNAによってNOD2が抑制される時、非処理のUCMに比べてMDP-UCMの存在下でhMNCによるIL-10生成は増加しなかった（図10a）。

8-2：MDPで前処理されたUCMのhMNCにおいて、T細胞群に対する効果についての分析
次に、本発明者らはhMNCが調節性T細胞（Treg）に分化されるにあたって、UCMの効果を調査した。具体的には、UCMでhMNCを5日間培養した後、hMNC内のCD4、CD25、Foxp3を同時に発現する細胞の比率をフローサイトメトリーで測定した。

その結果、hMNCにおいて調節性T細胞(Treg)群はUCMの存在下で50％以上増加し、これは非処理のUCMよりMDP-UCMにおいて培養されたhMNCにおいてより増加したことを示す（図10b）。同様に、インドメタシンおよびTGF-β1中和抗体の処理、またはsiRNAによるNOD2の抑制はMDP-UCMによって増加されたTreg群を元の状態に戻した（図10b）。これらの結果は、UCMにおいてMDP誘導性のPGE₂およびTGF-β1がhMNCによるIL-10の生成およびhMNCのTregへの分化に重要な役割を果たすことを示唆する。

実施例9：他の幹細胞におけるNOD2の発現の確認
他の幹細胞の場合にもNOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）のアゴニストを添加して培養した場合、NOD2受容体 - アゴニストの反応によって免疫調節および炎症の調節が可能であるかを確認するために、ヒト単球性白血病細胞株THP -1細胞を陽性対照群として、脂肪由来幹細胞（AD-MSC）および羊膜上皮幹細胞（AEC）がNOD2を発現するか調べるために、前記実施例2と同じ方法でRT-PCRを行った。ヒト羊膜上皮幹細胞は、韓国ソウルの九老病院から患者の同意を得て出産後に採取した後、（ソウル大学校機関倫理委員会の承認取得（IRB No. 0611/001-002））、得られた羊膜から羊膜上皮細胞を分離した。脂肪由来幹細胞の場合は、韓国ソウルのポラメ病院の患者の同意を得て採取し（SNU IRB＃0600/001-001）、これから脂肪由来幹細胞を分離培養した。

その結果、図11に示されるように、脂肪由来幹細胞および羊膜上皮幹細胞で陽性対照群であるTHP-1細胞よりNOD2が多く発現していることが観察された。即ち、間葉系幹細胞以外にも、他の幹細胞もまたNOD2受容体を発現することが確認されており、他の幹細胞の場合もNOD2受容体 - アゴニストの反応によって免疫調節および炎症調節が可能であることが認められる。

実施例10：大腸炎動物モデルにおける治療効果の検証
10-1：大腸炎の動物モデルで治療効果の分析
本発明者らはhUCB-MSC処理が大腸炎マウスを治療してMDP刺激がDSSで誘発された大腸炎に対するhUCB-MSCの保護効果を増進させるかについて調査した。hUCB-MSC投与のために、細胞を24時間MDPの存在下または不在下で培養した後、PBSで洗浄してMDPを除去した。具体的には大腸炎にかかった動物モデルにMDPで処理した幹細胞の効果を検証するために、マウス（（株）中央実験動物、C57BL/6Nマウス）を3％のDSS（デキストラン硫酸ナトリウム）で処理して大腸炎を誘発させた後、2日後にMDPで処理したhUCB-MSC、処理していないhUCB-MSCおよびsiRNAで処理してNOD2を抑制したhUCB-MSCを腹腔内に処置した。この時、3％のDSSは、7日間飲用水で投与した。

その結果、MDP刺激がないhUCB-MSCの腹腔内投与は、PBS処理または線維芽細胞処理マウスと比較してDSSで誘発された大腸炎マウスの体重減少および致死率を改善した（図12aと12b）。さらに、MDPで刺激されたhUCB-MSC（MDP-MSC）は、大腸炎を有さない対照群マウスの90％まで体重減少を回復させ、大腸炎誘導致死から完全に治療された（図12aおよび12Bb）。疾病活性指数（Disease activity index）は、hUCB-MSCによって若干減少したが、PBSまたは線維芽細胞投与群とは著しく異なっている。しかしMDP-MSCは、疾病活性指数を著しく改善させた（図12c）。NOD2がsiRNAによって下方調節された時、MDP-MSCは、体重減少、生存率および疾病活性指数を改善させることができなかった。

14日目にマウスを屠殺し、大腸の長さと組織病理学を分析した。肉眼検査の結果、炎症による大腸の短縮はhUCB-MSC処理によってわずかに緩和されたが、これはMDPの添加によって増強されたことが示された（図12dと12e）。病理組織学的分析の結果、DSS処理マウスにおいて、腸の全体の粘膜の破壊、重篤な浮腫病変、および固有層と粘膜下層で炎症細胞の散在した浸潤が観察された（図12f）。hUCB-MSC処理マウスでは、大腸の一部に限定された粘膜下層の粘膜びらんおよび浮腫が認められた（図12f）。しかし、MDP-MSCは、大腸の病理学的損傷を完全に治療し、病理学的スコアを著しく減少させた（図12fおよび12g）。期待通り、DSSで誘発された大腸炎でsiNOD2処理hUCB-MSCの投与は、病理学的重篤度を防ぐことも、または病理学的スコアを減少させることもできなかった（図12fと12g）。このような結果は、MDPが大腸炎に対してhUCB-MSCの保護効果を増進させることを示し、これはNPD2が必要であることを示唆する。

10-2：大腸炎の動物モデルにおける炎症性サイトカインおよびT細胞のクラスター分析(群の分析)
また、本発明者らは大腸炎マウスでhUCB-MSCで誘発された炎症性サイトカイン生成の調節におけるMDPの効果を調査した。

その結果、DSS処理されたマウスの大腸でhUCB-MSCは、IL-6およびIFN-γの生成を減少させ、IL-10生成を増加させた（図13a）。さらに、DSS処理されたマウスの大腸でMDP-MSCは、IL-6およびIFN-γの生成をほぼ遮断し、IL-10の生成を増進させたが、これは、NOD2の下方調節によって除去された（図13a）。

hUCB-MSCがマウスの大腸でTreg群に影響を与えるかを確認するために、Foxp3+細胞の大腸浸潤を蛍光顕微鏡で観察した。

その結果、hUCB-MSCは、PBS処理された大腸炎マウスと比較して、大腸でFox3p +細胞の局在化が増加した（図13b）。また、Foxp3 +細胞の大腸での局在化はMDP-MSCによってより増加したが、これはhUCB-MSCにおいてNOD2抑制によって元の状態に戻った（図13b）。このような現象は、ウエスタンブロッティング分析で大腸からのFoxp3発現を定量化して確認された。Foxp3タンパク質の発現は、PBS処理大腸炎マウスと比較してhUCB-MSC投与されたマウスでより高い結果が示された（図13cと13d）。同様に、大腸におけるFoxp3のレベルはMDP-MSCによってより一層増加しており、またこれはNOD2下方調節によって元の状態に戻された（図13cと13d）。

10-3：大腸炎の動物モデルにおける炎症細胞浸潤の分析
最後に、本発明者らは、マウスの大腸での炎症細胞の浸潤を調査した。好中球浸潤のために、MPO（ミエロペルオキシダーゼ）活性を用いて分析した。

その結果、DSS処理されたマウスの大腸でhUCB-MSCは、MPO活性およびCD4 +およびCD11b +細胞の浸潤をさらに減少させた（図13e）。前記の結果と同様に、MDP-MSCは、MPO活性ならびにCD4 +およびCD11b +細胞の大腸での浸潤を減少させたが、これはNOD2のsiRNAによって元の状態に戻された（図13e）。

前記のような結果は、hUCB-MSCが抗炎症反応を誘導し、前炎症反応を抑制し、これはNOD2依存的様式でMDPによって促進されることを裏付けるものである。

また、このような結果は、本発明によるMDPで処理した幹細胞またはその培養物は、大腸炎など、実際の動物モデルにおいて炎症を治療できることを示唆する結果といえる。

実施例11：アトピー性皮膚炎を誘発した動物モデルに対するMDP処理したhUCB-MSCの治療効果の確認
11-1：アトピー性皮膚炎の誘発およびhUCB-MSCの注入
試験開始1日前に出生8週齢の雌NC / Ngaマウスの背中部位を除毛した後、脱毛クリームを使用して背中部位の皮膚の毛を完全に除去した。試験開始日に4％のSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液150μlを脱毛した背中の部位に塗布して皮膚の脂肪成分を除去して、約3〜4時間後、完全に乾燥した後、Df（Dermatophagoides farina）エキス100 mgを背中の部位および耳介部に均一に塗布した。Dfエキスの塗布は週2回を3週間、合計で6回実施（Dfエキス塗布時毎にSDS水溶液の塗布必須）して、アトピー性皮膚炎を誘発した。前記実施例1で用意した2×10⁶個のhUCB-MSCを200μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浮遊させてNC / Ngaマウスに週1回ずつDf塗布と同一期間の3週間と、アトピー性皮膚炎誘発後1週間、即ち合計4週間に4回、静脈または皮下に注射した。MDPで処理したhUCB-MSCの注入は24時間10μl/mLMDPを培地に添加してhUCB-MSCを培養した後、PBSで5回水洗した後、注射した。

11-2：MDP処理したhUCB-MSCの治療効果を肉眼病変レベルで検証
MDPで処理したhUCB-MSCのアトピー性皮膚炎に対する治療効果を確認するために、hUCB-MSCの4週目の注射投与の24時間後に剖検し、肉眼病変を評価した。肉眼病変は角質生成（乾燥）、擦過（表皮剥離）、紅斑、浮腫のスコアを症状に応じて、0点から3点まで付与した後、その数値を合算して評価した。

その結果、図14に示されるように、アトピー性皮膚炎誘発群に比べて誘発に併せてhUCB-MSCを静脈内注射した群では、若干の病変の緩和傾向のみが確認され、大きな差は観察されなかったが、MDP処理したhUCB-MSCを注射した群の場合は、静脈注射と皮下注射を施行した群の両方に有意な病変の緩和が観察された。

このような結果は、本発明のMDP処理した幹細胞またはその培養物が、アトピー性皮膚炎等の自己免疫疾患の治療が可能であることを示唆する結果といえる。

11-3：MDPで処理したhUCB-MSCの治療効果を血清中の免疫グロブリンE（IgE）の分析を通じて検証
MDPで処理したhUCB-MSCのアトピー性皮膚炎に対する治療効果を確認するために、hUCB-MSCの4週目の注射投与の24時間後に剖検し、剖検時に採血した血清について市販のOpt EIA mouse set（BD Bioscience、Mississauga、Canada）を利用して免疫グロブリンE（IgE）濃度を測定した。

その結果、図15に示されるように、hUCB-MSCを静脈内注射した群とMDPで処理したhUCB-MSCを静脈内注射した群では有意なIgE抑制効果が確認されており、抑制率においては、MDPで処理したhUCB-MSCを静脈注射した群がより高い抑制率を示した。しかし、MDPで処理したhUCB-MSCを皮下注射した群は、誘発群との大きな差は見られなかった。

11-4：MDPで処理したhUCB-MSCの治療効果を血清中の免疫グロブリンG1（IgG1）の分析を通じて検証
MDPで処理したhUCB-MSCのアトピー性皮膚炎に対する治療効果を確認するために、hUCB-MSCの4週目の注射投与の24時間後に剖検し、剖検時に採血した血清について、アトピー性皮膚炎のTh2の免疫反応の代表指標である血清中の免疫グロブリンG1（IgG1）の数値をELISAキット（Bethyl Laboratories Inc.、Montgomery、TX、USA）を利用して比較した。

その結果、図16に示すように、すべてのhUCB-MSC投与群において有意なIgG1の抑制効果が観察された。

11-5：MDPで処理したhUCB-MSCの治療効果を皮膚組織に対する病理組織学的検査を通じて検証
MDPで処理したhUCB-MSCのアトピー性皮膚炎に対する治療効果を確認するために、hUCB-MSCの4週目の注射投与の24時間後に剖検し、皮膚組織を摘出して10％の中性ホルマリン溶液で固定して、十分な固定を経た後、組織の処理過程を経て、パラフィン包埋し、3〜4μmに薄く切断して、H＆E（ヘマトキシリン・エオジン）で染色して病理学的分析を実施した。

その結果、図17に示されるように、誘発群の場合には、表皮の異常増殖と肌内に炎症細胞の過剰な浸潤が観察された。これらの病変の症状についてhUCB-MSCを静脈内注射した群、MDPで処理したhUCB-MSCを静脈内注射または皮下注射した群いずれも表皮の厚さと炎症細胞の浸潤程度が減少する傾向が観察され、MDPで処理したhUCB-MSCを皮下注射した群、静脈注射した群、hUCB-MSCを静脈内注射した群の順に病変の抑制が確認された。

11-6：MDPで処理したhUCB-MSCの治療効果を皮膚組織に対する病理組織学的検査を通じて検証
MDPで処理したhUCB-MSCのアトピー性皮膚炎に対する治療効果を確認するために、hUCB-MSCの4週目の注射投与の24時間後に剖検し、皮膚組織を摘出して10％の中性ホルマリン溶液で固定し、十分な固定を経た後、組織の処理過程を経て、パラフィン包埋し、3〜4μmに薄く切断してトルイジンブルーで染色し、アトピー性皮膚炎の主な病変のひとつである肥満細胞の脱顆粒の程度を分析した。

その結果、図18に示されるように誘発群の場合、脱顆粒された肥満細胞が多数観察され、すべての群で肥満細胞の脱顆粒が減少する傾向が観察された。

前記のような結果は、本発明によるMDPで処理した幹細胞またはその培養物が、アトピー性皮膚炎等、実際の動物モデルにおける免疫疾患を治療可能であることを示唆する結果である。

別途に定義されない限り、本明細書で使用されているすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野で公知であり、一般的に使用されているものである。

本発明は、免疫疾患および炎症性疾患の予防または治療に使用することができる医薬品組成物を提供するのに効果的である。また、複数の有用な用途で知られているPGE2およびTGF-β1を、構成的な面において簡易で経済的でありながら、化学工程がなく、且つ向上した収率で生産することができるPGE2およびTGF-β1の製造方法を提供するのに効果的である。本発明に係る薬学的組成物は、副作用が知られている既存の免疫抑制剤および抗炎症剤に代わるものとして、副作用がなく経済的に使用することができる細胞治療剤としてクローン病、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎等の自己免疫疾患等の免疫疾患および炎症性疾患の予防または治療に使用することができるので有用である。
[本発明1001]
NOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞にNOD2アゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養物を含む、免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
[本発明1002]
前記NOD2アゴニストがMDP（ムラミルジペプチド）である、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1003]
前記幹細胞が、ヒト成体幹細胞、ヒト多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）、動物の胚性幹細胞または動物の成体幹細胞である、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1004]
前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞、ヒト組織由来間葉系幹細胞、多能性幹細胞または羊膜上皮細胞である、本発明1003の薬学的組成物。
[本発明1005]
前記成体幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、筋肉由来間葉系幹細胞、神経由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞および胎盤由来間葉系幹細胞からなる群から選択される間葉系幹細胞である、本発明1004の薬学的組成物。
[本発明1006]
NOD2を発現する単離された間葉系幹細胞を含む、免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
[本発明1007]
前記免疫疾患または炎症性疾患が、自己免疫疾患、移植拒絶反応、関節炎、移植片対宿主病、細菌感染、敗血症または炎症である、本発明1001または1006の薬学的組成物。
[本発明1008]
前記自己免疫疾患が、クローン病、紅斑病、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アディソン病、1型糖尿病、ループス、慢性疲労症候群、線維筋痛、甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、強皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Meniere's syndrome）、ギラン - バレー症候群（Guilian-Barre syndrome）、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、白斑、全身性強皮症、喘息および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、本発明1007の薬学的組成物。
[本発明1009]
ヒトを除く対象の免疫反応または炎症反応を抑制するための方法であって、NOD2を発現する幹細胞にNOD2アゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養物を対象に投与する段階を含む、方法。
[本発明1010]
免疫反応または炎症反応を抑制することにより対象の免疫疾患または炎症性疾患を予防または治療するために行われる、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記NOD2アゴニストがMDP(ムラミルジペプチド)である、本発明1009の方法。
[本発明1012]
培地中の前記NOD2アゴニストの濃度が1〜100μg/mlであり、NOD2アゴニストを添加して培養する時間が0.1〜200時間である、本発明1009の方法。
[本発明1013]
ヒトを除く対象の免疫反応または炎症反応を抑制するための方法であって、NOD2を発現する単離された間葉系幹細胞またはその培養物を対象に投与する段階を含む、方法。
[本発明1014]
前記投与段階が、腹腔内もしくは静脈内注射、病変への直接注入または関節腔（Synovial cavity）への注入により行われる、本発明1009または1013の方法。
[本発明1015]
NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞にNOD2アゴニストを添加して培養する段階を含む、免疫抑制剤または抗炎症剤を調製するための方法。
[本発明1016]
前記NOD2アゴニストがMDP(ムラミルジペプチド)である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
NOD2を発現する単離された間葉系幹細胞を培養する段階を含む、免疫抑制剤または抗炎症剤を調製するための方法。
[本発明1018]
NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞をNOD2アゴニストと共に培養する段階を含み、培養中に該幹細胞からPGE ₂ （プロスタグランジンE ₂ ）またはTGF-β1（Transforming growth factor beta 1）が分泌される、PGE ₂ またはTGF-β1を調製するための方法。
[本発明1019]
前記NOD2アゴニストがMDP(ムラミルジペプチド)である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
NOD2を発現する単離された間葉系幹細胞を培養する段階を含み、培養中に該幹細胞からPGE ₂ (プロスタグランジンE ₂ )またはTGF-β1(Transforming growth factor beta 1)が分泌される、PGE ₂ またはTGF-β1を調製するための方法。
[本発明1021]
NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞およびNOD2アゴニストを含む、移植体。
[本発明1022]
前記NOD2アゴニストがMDP(ムラミルジペプチド)である、本発明1021の移植体。
[本発明1023]
NOD2を発現する単離された間葉系幹細胞を含む、移植体。
[本発明1024]
移植体内でNOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞をNOD2アゴニストと共に培養し、その後そこから幹細胞を除去することにより調製される、前記移植体。
[本発明1025]
前記NOD2アゴニストがMDP(ムラミルジペプチド)である、本発明1024の移植体。
[本発明1026]
移植体内でNOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞をNOD2アゴニストと共に培養する段階を含む、移植体を調製するための方法。
[本発明1027]
培養段階の後に幹細胞を除去する段階をさらに含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記NOD2アゴニストがMDP(ムラミルジペプチド)である、本発明1026の方法。
[本発明1029]
NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞およびNOD2アゴニストを含む、複合体。
[本発明1030]
前記幹細胞のNOD2にNOD2アゴニストが結合されている、本発明1029の複合体。
[本発明1031]
前記幹細胞のNOD2にNOD2アゴニストが結合されていることによりNOD2が活性化されている、本発明1029の複合体。
[本発明1032]
NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞にNOD2アゴニストを添加することにより作製された、培養物。

Claims (32)

1. NOD2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2）を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養物を含む、免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
2. 前記NOD2のアゴニストが、MDP（ムラミルジペプチド）であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
3. 前記幹細胞が、ヒト成体幹細胞、ヒト多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）、動物の胚性幹細胞または動物の成体幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
4. 前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞、ヒト組織由来間葉系幹細胞、多能性幹細胞または羊膜上皮細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
5. 前記成体幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、筋肉由来間葉系幹細胞、神経由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞および胎盤由来間葉系幹細胞から構成された群から選択される間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項４に記載の薬学的組成物。
6. NOD2を発現する分離された間葉系幹細胞を含む、免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
7. 前記免疫疾患または炎症性疾患が、自己免疫疾患、移植拒絶反応、関節炎、移植片対宿主病、細菌感染、敗血症または炎症であることを特徴とする、請求項１または６に記載の薬学的組成物。
8. 前記自己免疫疾患が、クローン病、紅斑病、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アディソン病、1型糖尿病、ループス、慢性疲労症候群、線維筋痛、甲状腺機能低下症および亢進症、硬皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Meniere's syndrome）、ギラン - バレー症候群（Guilian-Barre syndrome）、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、白斑症、全身性硬皮症、喘息および潰瘍性大腸炎からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
9. NOD2を発現する幹細胞にNOD2アゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養物を被験体に投与する段階を含む、被験体の免疫反応または炎症反応を抑制する方法。
10. 免疫反応または炎症反応を抑制して、被験体の免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療を行うことである、請求項９に記載の方法。
11. 前記NOD2のアゴニストが、MDP(ムラミルジペプチド)であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
12. 前記NOD2のアゴニストの濃度が、培地に対して1〜100μg/mlであり、添加して培養する時間が0.1〜200時間であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
13. NOD2を発現する分離された間葉系幹細胞またはその培養物を被検体に投与する段階を含む、被検体の免疫反応または炎症反応を抑制する方法。
14. 前記投与段階が、腹腔もしくは血管内投与、病変への直接投与または関節腔（Synovial cavity）内投与であることを特徴とする、請求項９または１３に記載の方法。
15. NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養する段階を含む、免疫抑制剤または抗炎症剤の製造方法。
16. 前記NOD2のアゴニストが、MDP(ムラミルジペプチド)であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. NOD2を発現する分離された間葉系幹細胞を培養する段階を含む、免疫抑制剤または抗炎症剤の製造方法。
18. NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞をNOD2のアゴニストを添加した培地で培養する段階を含み、培養時、前記幹細胞からPGE₂（プロスタグランジンE₂）またはTGF-β1（Transforming growth factor beta 1）が分泌されることが特徴である、PGE₂またはTGF-β1の製造方法。
19. 前記NOD2のアゴニストが、MDP(ムラミルジペプチド)であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
20. NOD2を発現する分離された間葉系幹細胞を培養する段階を含み、培養時、前記幹細胞からPGE₂(プロスタグランジンE₂)またはTGF-β1(トランスフォーミング増殖因子β1)が分泌されることが特徴であるPGE₂またはTGF-β1の製造方法。
21. NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞およびNOD2のアゴニストを含む、移植体。
22. 前記NOD2のアゴニストが、MDP(ムラミルジペプチド)であることを特徴とする、請求項２１に記載の移植体。
23. NOD2を発現する分離された幹細胞を含む、移植体。
24. 移植体内でNOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養し、その後幹細胞を除去した、前記移植体。
25. 前記NOD2のアゴニストが、MDP(ムラミルジペプチド)であることを特徴とする、請求項２４に記載の移植体。
26. 移植体内でNOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養する段階を含む移植体の製造方法 。
27. 培養段階の後に、幹細胞を除去する段階をさらに含むことが特徴である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記NOD2のアゴニストが、MDP(ムラミルジペプチド)であることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
29. NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞またはNOD2のアゴニストを含む、複合体。
30. 前記幹細胞のNOD2にNOD2のアゴニストが結合されていることが特徴である、請求項２９に記載の複合体。
31. 前記幹細胞のNOD2にNOD2のアゴニストが結合されNOD2が活性化されていることが特徴である、請求項２９に記載の複合体。
32. NOD2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain protein 2)を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して得た、培養物。

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