CN103118691B - 预防和治疗免疫病变和炎性疾病的包括用nod2激动剂处理的干细胞或其培养物的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及预防或治疗免疫病变和炎性疾病的药物组合物，其包括通过用NOD2激动剂培养表达核苷酸‑结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞而产生的干细胞或其培养物。更具体地，本发明涉及抑制对象的免疫应答或炎症应答的方法，其包括向对象施用药物组合物、干细胞或其培养物的步骤，利用干细胞或其培养物制备免疫抑制药物或抗炎药物的方法，制备PGE2或TGF‑β1的方法，其包括在具有NOD2激动剂的培养基中培养NOD2‑表达干细胞的步骤，包括表达NOD2的干细胞和NOD2激动剂的移植物，制备该移植物的方法，包括表达NOD2的干细胞和NOD2激动剂的复合物，和通过用NOD2激动剂培养NOD2‑表达干细胞产生的培养物。

Description

预防和治疗免疫病变和炎性疾病的包括用NOD2激动剂处理的干细胞 或其培养物的药物组合物
技术领域
本发明涉及预防或治疗免疫病变和炎性疾病的药物组合物，其包括通过用NOD2激动剂培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞产生的干细胞或其培养物。更具体地，本发明涉及抑制对象的免疫应答或炎症应答的方法，其包括向对象施用药物组合物、干细胞或其培养物的步骤；利用干细胞或其培养物制备免疫抑制药物或抗炎药物的方法；制备PGE2或TGF-β1的方法，包括在具有NOD2激动剂的培养基中培养NOD2-表达干细胞的步骤；包括表达NOD2的干细胞和NOD2激动剂的移植物(graft)；制备移植物的方法；包括表达NOD2的干细胞和NOD2激动剂的复合物(composite)；和通过用NOD2激动剂培养NOD2-表达干细胞产生的培养物。
背景技术
属于核苷酸-结合寡聚结构域(NOD)蛋白质家族的蛋白质由三个主结构域构成：在N-末端上的参与蛋白质-蛋白质相互作用的半胱天冬酶募集结构域(CARD)或热蛋白结构域、中心NOD结构域和C-末端上的LRR结构域。NOD蛋白质的类型可分为在N-末端上具有一个CARD结构域的NOD1组，和在N-末端上具有两个CARD结构域的NOD2组。这两组一起被称为NOD样受体(NLR)，并且它们与Toll样受体(TLR)一起显著有助于体内免疫应答的发展。已知NOD通过识别来自大多数细菌的细胞壁的PGN部分，在先天的免疫应答中起到极其重要的作用。NOD1在胃和结肠的上皮细胞和胰、肺、肾和脾的巨噬细胞和树突细胞中表达。已知NOD1识别二氨基庚二酸(DAP)-型PGN干肽(stempeptide)、二肽或三肽，其存在于革兰氏阴性菌和一些革兰氏阳性菌中，但在真核细胞中不存在(Hisamatsu T等,J.Biol.Chem.,278:32962,2003)。
NOD2主要在髓样细胞，特别是巨噬细胞、中性白细胞和树突细胞中，以及小肠中的帕内特细胞中表达，并且与NOD1相比，其分布更加受限。此外，NOD2的表达被炎性细胞因子即TNF-α和IFN-γ诱导。因此，NOD2几乎不在正常肠细胞中表达，而是仅当肠细胞被感染时表达。在由NOD2识别的激动剂中最广泛已知的激动剂(配体)为胞壁酰二肽(MDP)，其为对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两者共有的肽聚糖(PGN)基序(Girardin SE,等,J.Biol.Chem.,278:8869,2003)。
2003年，Girardin，S.E.等报道了NOD2-敲除小鼠可正常生长，但变得对通过口服而不是静脉内施用单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的感染高度敏感。该结果提示NOD2不涉及生长机制，而是用作检测MDP存在的模式识别蛋白。然而，在肠中李斯特(Listeria)菌株的存在下，NOD2诱导抗菌活性的先天免疫应答，其起到体内防御蛋白的作用(Girardin SE,等,J.Biol.Chem.,278:8869,2003)。MDP已被用作刺激免疫应答的佐剂，即抗原佐剂，和用作能够辅助免疫原的佐剂(韩国专利申请公开号1019960033469、1020070031848和1020100045473)。
同时，前列腺素E2(在下文中，被称为PGE2)是由前列腺素E2：(5Z,11(α),13E,15S)-11,15-二羟基-9-氧-前列-5,13-二烯-1酸代表的化合物，并且是在生理和病理条件下最广泛产生的前列腺素(Ushikubi F等,J.Pharmacol.Sci.83:279,2000)。
PGE2传统上用于使子宫颈准备生产并且已经实际上用于刺激分娩的药物组合物中。它以阴道栓剂的形式制造，具有以下商标名称：Cervidil(由Forest Laboratories，Inc.)、Prostin E2(由Pfizer Inc.)、Propess(由Ferring Pharmaceuticals)和Glandin(由NabiqasimPharmaceuticals Pakistan)。最近，PGE2已经被提示为新免疫抑制调节剂的强有力的候选者，因为它起到抑制由巨噬细胞产生的细胞因子诸如白细胞介素-1β和TNFα的释放并且同时抑制辅助T1细胞分化(Harris SG等,Trends Immunol.,23:144,2002)。此外，体外研究已经报道PGE2抑制细胞因子诸如白细胞介素-2和IFN-γ的产生，以便抑制人和鼠科动物T细胞分化(Goodwin JS等,J.clin.Immunol.,3:295,1983)。这些研究提示PGE2为有希望的免疫调节药物，并且因此已经非常需要开发其成本有效且简单的生产方法。
同样地，已知转化生长因子β1(TGF-β1)为免疫抑制药和抗炎药物。TGF-β1，像PGE2一样，已经被提示作为有希望的免疫调节药物，并且因此已经非常需要开发其成本有效且简单的生产方法。
同时，免疫抑制药物的类型可分为特异性和非特异性免疫抑制剂。理论上，特异性免疫抑制剂是较好的，但主要使用非特异免疫抑制剂。环孢霉素(Neoral，Cipol A)、咪唑硫嘌呤(硫唑嘌呤)和泼尼松龙(类固醇)是在临床实践中最经常使用的免疫抑制药物。已经发现与单独药物的使用相比，这三种药物的组合显示较少的副作用和较高的免疫抑制作用。最近，很多免疫抑制药物诸如FK506、RATG、OKT3、Cellcept等已经被开发并用于临床实践。
在从抗原刺激至抗体产生的过程中，这些免疫抑制药物通过阻碍巨噬细胞对抗原的吞噬加工、淋巴细胞的抗原识别、细胞分裂、T和B细胞的分裂或抗体产生引起免疫抑制。多数药物具有抗肿瘤活性，因为它们通过诱导DNA损伤、抑制DNA合成等阻碍细胞分裂。
然而，药物的代表性副作用为高血压和中毒性肾损害(肾功能降低)。由于这些副作用的高发生率，患者的状况不得不被充分监测，以检测副作用的发生。副作用诸如震颤、抽搐、肝炎、胆汁郁积、血尿酸过多、肌无力、多毛症和龈肥大很少出现。被称为咪唑硫嘌呤的一种经常使用的抑制剂抑制引起低白细胞计数、贫血症和低血小板计数的骨髓功能。另外，咪唑硫嘌呤可引起并发症诸如胰腺炎、肝炎和胆汁郁积，以及偶尔地脱发和发热。被称为泼尼松龙的类固醇药物是市场中使用的第一个免疫抑制剂，并具有多种抑制活性。例如，它可增加个体的食欲、肩膀和背部附近的肌肉量，并可引起暂时的精神愉快。然而，该类固醇药物应该被谨慎使用，因为它促进动脉粥样硬化的进展，并引起高血压、胃溃疡、糖尿病、生长阻滞、骨质疏松症、白内障或青光眼。
同种异体移植诸如器官移植和造血干细胞移植是21世纪中引人注目的医学成就，并且已经被应用于绝症诸如心力衰竭——包括扩张型心肌病、慢性肾衰竭和难治的血液病的根治疗法。然而，仍然具有克服同种异体移植后产生的致命并发症，诸如移植物移入失败或移植物抗宿主病(GVHD)的限制。在使这些免疫应答最小化的努力中，已经使用用于控制T细胞免疫应答的疗法，该免疫应答由在移植后识别同种异体抗原的T细胞的细胞免疫引起(Ikehara S,Exp.Hematol.,31:1142,2003；First MR,Transplantation,77:88,2004)，即，通过利用免疫抑制药物，环孢霉素或FK506抑制T细胞的白细胞介素(IL)-2产生控制免疫应答的疗法。然而，仍然非常需要开发没有副作用的便宜免疫抑制药物。
同时，间质干细胞的免疫调节机制还没有被完全鉴定，同时，对于间质干细胞，仅少数研究被报道。第一发现是间质干细胞似乎抑制抗原呈递细胞(APC)。免疫应答的变化与在某些条件下的培养过程期间添加的单核细胞数成比例，这提示单核细胞参与免疫抑制。第二发现是间质干细胞似乎通过调节T细胞增殖诱导免疫抑制性质。T细胞与间质干细胞的共培养下调细胞周期蛋白D2的表达并随后将T细胞停止在细胞周期的G0/G1期中，以预防它们增殖。也报道了，甚至在间质干细胞被移出后，增殖能力也持续降低(Glennie S等,Blood,105:2821,2005)。
公开内容
技术问题
在利用干细胞开发调节免疫或炎症应答的更有效的方法的努力中，本申请人首先发现NOD2受体在干细胞中表达，和干细胞经NOD2受体调节免疫应答。随后，他们发现当干细胞用NOD2激动剂即MDP处理时，PGE2和TGF-β1被过度表达，这导致更有效地抑制免疫应答，由此证明其对本发明完成的结肠炎和特应性皮炎模型的治疗效果。
技术方案
本发明的目的是提供预防或治疗免疫病变或炎性疾病的药物组合物，其包括通过用NOD2激动剂培养表达NOD2的干细胞而产生的干细胞或其培养物，其作为常规免疫抑制药物和抗炎药物的替代是便宜的并且不具有副作用。
本发明的另一个目的是提供治疗免疫病变或炎性疾病的方法，其包括向患有免疫病变或炎性疾病的对象施用组合物的步骤。
本发明的再一个目的是提供抑制对象的免疫应答或炎症应答的方法，其包括向对象施用干细胞或其培养物的步骤。
本发明的再一个目的是提供制备免疫抑制药物或抗炎药物的方法。
本发明的再一个目的是提供制备在多种应用中使用的前列腺素E2和TGF-β1的方法。
本发明的再一个目的是提供包括表达NOD2的干细胞和NOD2激动剂的移植物，或通过将干细胞从移植物中移出而制备的移植物，和移植物的制备方法。
本发明的再一个目的是提供包括表达NOD2的干细胞和NOD2激动剂的复合物。
本发明的再一个目的是提供通过添加NOD2激动剂至表达NOD2的干细胞而产生的培养物。
有利效果
本发明提供了可用于预防或治疗免疫病变和炎性疾病的药物组合物。此外，本发明提供了制备PGE2和TGF-β1的方法，其能以有成本有效的方式以高产率产生PGE2和TGF-β1，而不进行化学处理。本发明的药物组合物是便宜的不具有副作用的细胞治疗剂，其可被用作先前已知的具有副作用的免疫抑制药物和抗炎药物的替代。因此，它可用于预防或治疗免疫病变——诸如包括克罗恩病(Crohn’s disease)、类风湿性关节炎和特应性皮炎在内的自体免疫疾病——和炎性疾病。
附图说明
图1a显示了说明在hUCB-MSC中TLR和NLR表达的mRNART-PCR结果，和图1b至1e显示了在用每个激动剂处理后IL-8表达和MSC增殖的水平；
图2为显示在用每个激动剂处理后hUCB-MSC对MNC增殖的影响的图；
图3为显示用每个激动剂处理后hUCB-MSC培养物对MNC增殖(3a和3b)和脾细胞增殖(3c)的影响的图；
图4显示了用MDP单独处理的间质干细胞(hUCB-MSC#618)培养物的抑制效果的比较(A)和siRNA处理的结果(B)；
图5显示了用MDP单独处理的间质干细胞(hUCB-MSC#620)的抑制效果的比较(A)和siRNA处理的结果(B)；
图6a显示了在用相应的激动剂处理每种受体后PGE2分泌的量，图6b显示了在用相应的激动剂处理每种受体后COX-2表达的水平，图6c显示了COX-2表达水平的变化，其通过利用MDP处理siNOD2和siRip2而增加，图6d显示了PGE2分泌量的变化，其通过利用MDP处理siNOD2、siRip2和消炎痛(indo)而增加，图6e显示了对MNC增殖的抑制效果的变化，其通过利用MDP处理消炎痛(indo)而增加，和图6f显示了PGE2分泌量的减少，其通过利用MDP处理siNOD2和消炎痛(indo)而增强；
图7a显示了在用相应的激动剂处理每种受体后的NO产生量，图7b显示了在用相应的激动剂处理每种受体后PGE2分泌的量，图7c显示了在用相应的激动剂处理每种受体后TGF-β1分泌的量，图7d显示了在用相应的激动剂处理每种受体后COX-2表达水平的变化，图7e显示了PGE2存在情况下，对MNC增殖的抑制效果，图7f显示了PGE2的存在情况下，对脾细胞增殖的抑制效果，图7g显示了对MNC增殖的抑制效果，其通过利用MDP处理消炎痛(indo)而增强，和图7h显示了对MNC增殖的抑制效果，其通过利用MDP处理TGF-β1中和抗体(a-TGF-β1)而提高；
图8说明了通过各自的siRNA在hUCB-MSC中对NOD2和Rip2基因和蛋白质表达的显著抑制；
图9a显示了通过利用MDP处理siNOD2和siRip2而增加的COX-2表达，图9b显示了通过利用MDP处理siNOD2、siRip2和消炎痛(indo)而增加的PGE2分泌，图9c显示了通过利用MDP处理siNOD2和siRip2而增加的TGF-β1分泌，和图9d为显示通过利用MDP处理siNOD2和siRip2对MNC增殖的抑制效果的变化的图；
图10a显示了通过利用MDP处理siNOD2、siRip2、消炎痛(indo)和TFG-β1中和抗体(a-TFG-β1)而增强的IL-10分泌，和图10b显示了Treg群体的变化，其通过利用MDP处理siNOD2、siRip2、消炎痛(indo)和TFG-β1中和抗体(a-TFG-β1)而增强；
图11显示了mRNA RT-PCR结果，其说明脐带血源间质干细胞(UCB-MSC)、脂肪组织源干细胞(AD-MSC)和羊膜上皮干细胞(AEC)中的NOD2、RIP2和RPL13A表达；
图12a为显示结肠炎模型的实验组和对照组中体重减少的图，图12b为显示存活率的图，图12c为显示疾病活性指数(disease activityindex)的变化的图，图12d显示了结肠长度的图像，图12e为显示结肠长度的图，图12f为显示炎性细胞的炎症、水肿和浸润的组织病理学图像，和图12g为显示病理学分数的图；
图13a为显示在DSS-诱导的结肠炎小鼠模型的结肠中通过MDP造成的IL-6、IFN-γ和IL-10分泌变化的图，图13b为荧光显微图像，其显示在MDP和siNOD2处理后结肠炎小鼠模型的对照组和实验组的结肠中的Fox3p+定位，图13c为蛋白质印迹的结果，其显示在MDP和siNOD2处理后对照组和实验组中Fox3p蛋白质表达水平，图13d显示了蛋白质印迹分析的定量，图13e为说明MPO活性和用于分析小鼠结肠中炎性细胞浸润的CD4+、CD11b+细胞浸润的图；
图14为显示在将MDP-处理的hUCB-MSC静脉内或皮下注射入特应性皮炎-诱导的小鼠后肉眼检查的结果的图；
图15为显示血清型免疫球蛋白E水平的图，其为特应性皮炎的指数；
图16为显示血清型免疫球蛋白G1水平的图，其为特应性皮炎的指数；
图17为在小鼠皮肤组织的组织处理后H&E染色的图像；和
图18为显示在小鼠皮肤组织的组织处理和甲苯胺蓝染色后，为特应性皮炎的主要症状之一的肥大细胞脱粒的图像。
具体实施方式
在实现以上目的的一个方面中，本发明提供了预防或治疗免疫病变或炎性疾病的药物组合物，其包括通过用NOD2激动剂培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞而产生的干细胞或其培养物。
在本发明中，发现利用核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)激动剂处理干细胞促进了间质干细胞中PGE2和TGF-β1的分泌，其又调节了免疫应答和炎症应答。换言之，本发明证实了干细胞的免疫和炎症调节活性与NOD2的功能相关，和当用NOD2激动剂处理时，免疫抑制和抗炎效果增强，和因此NOD2激动剂-处理的干细胞和其培养物可被用作免疫和炎症调节的细胞治疗剂。因此，本发明提供了预防或治疗免疫病变或炎性疾病的药物组合物，其包括通过用NOD2激动剂培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞而产生的干细胞或其培养物。如本文所用，术语“NOD2”和“NOD2受体”可交换使用。
如本文所用的，术语“激动剂”通常指起到正向刺激受体作用的化学品，并且也被称为效应物。换言之，激动剂具有正功能，而拮抗剂起到阻碍配体的作用或具有负功能。在本发明中，激动剂可与“配体”交换使用，所述配体指通常结合至受体的化学品。对于本发明的目的，激动剂可为NOD2激动剂。
如本文所用的，术语“NOD2激动剂”指结合至NOD2受体以激活NOD2的物质，并且NOD2激动剂的例子之一为胞壁酰二肽(MDP)，但不限于此。
如本文所用的，术语“MDP”为胞壁酰二肽，并且在本发明中，它可被用作激活NOD2途径以促进间质干细胞中PGE2分泌的激动剂。
如本文所用的，短语“用添加激动剂培养的”或“用添加激动剂产生的”例如可指在添加激动剂的培养基中培养间质干细胞。优选地，以上的培养可指用添加浓度为1至100μg/ml的激动剂培养0.1至200小时，和更优选地1至72小时。另外，它可指在添加激动剂的培养基中培养细胞，和进一步在替换的培养基中培养。
如本文所用的，术语“干细胞”指具有分化成不同组织即“未分化细胞”能力的细胞。术语“间质干细胞”指源自不同成体细胞诸如骨髓、脐带血、胎盘(或胎盘组织)和脂肪(脂肪组织)的多能干细胞。例如，源于骨髓的间质干细胞具备分化成脂肪组织、骨/软骨组织和肌肉组织的多能性，并且因此很多研究已经集中于研究间质干细胞用于开发细胞疗法。
在本发明中，干细胞可为人成体干细胞、人多能干细胞、诱导的多能干细胞、动物胚胎干细胞或动物成体干细胞。同时，成体干细胞可为间质干细胞、人组织源间质基质细胞、人组织源间质干细胞、多能干细胞或羊膜上皮细胞，并且间质干细胞可为源自选自脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜和胎盘的来源的间质干细胞，和优选地源自人的间质干细胞，和最优选地源自人脐带血的间质干细胞(hUCB-MSC)。从每个来源获得干细胞可按照本领域已知的方法进行，并且不限于本发明的实施例中描述的方法。
优选地，使用通过利用浓度为1至100μg/ml的MDP处理人-源间质干细胞0.1-200小时而制备的间质干细胞。如果细胞用MDP培养0.1小时或更短，则NOD2途径不能被充分激活。如果细胞用MDP培养200小时或更长，则没有财务效益。因此，更优选地，间质干细胞用MDP处理0.1～200小时，还要更优选地1～72小时，和最优选地24小时。
对于培养间质干细胞，可使用本领域已知的任何常规培养基，已知其适于干细胞培养。例如，可使用Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)或角质形成细胞(Keratinocyte)无血清培养基(角质形成细胞-SFM)。最优选地，可使用D-media(D-培养基(Gibco))。
培养间质干细胞的培养基可充剂添加补。通常地，培养基可包含等渗溶液中的中性缓冲液(例如，磷酸盐和/或高浓度碳酸氢盐)和蛋白质营养物(例如，血清诸如FBS、血清替换物、白蛋白或必需和非必需氨基酸诸如谷氨酰胺)。此外，它可包含脂类(脂肪酸、胆固醇、血清的HDL或LDL提取物)和多数该类型的原种培养基中发现的其他成分(例如，胰岛素或运铁蛋白、核苷或核苷酸、丙酮酸盐、糖源诸如葡萄糖、以任何电离形式或盐存在的硒、糖皮质激素诸如氢化可的松和/或还原剂诸如β-巯基乙醇)。
同样，鉴于保护细胞防止相互粘附或粘附至血管壁，或防止形成大簇，在培养基中包括抗凝块剂可以是有利的，例如，由Invitrogen销售的那些(Cat#0010057AE)。
在本发明的一个实施方式中，发现利用添加NOD2激动剂之一——胞壁酰二肽(MDP)——培养的干细胞培养物抑制了单核细胞(MNC)的增殖。
在血流中流通的单核细胞迁移至组织，在那里它们成熟为巨噬细胞。单核细胞、巨噬细胞和树突细胞在身体防御系统中是最重要的，并在适应性免疫应答的开始中具有中心作用，所述适应性免疫应答具有呈递抗原和调节T-淋巴细胞功能的能力。在另一方面，单核细胞和巨噬细胞在免疫系统中起到主要的防御屏障的作用。同样地，单核细胞在适应性免疫应答的识别和激活步骤中起到佐细胞的作用。它们起到用于T-淋巴细胞的抗原识别的抗原呈递细胞(APC)的作用，并产生起到针对T细胞激活的二级信号的作用的膜蛋白和分泌蛋白。一些单核吞噬细胞可分化成树突细胞，其在刺激对抗蛋白质抗原的T淋巴细胞应答中起到重要作用。当细胞和器官移植排斥发生时，体内移植的细胞/器官被识别为外源物，并且因此，单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的数量都增加。因此，对本领域技术人员显而易见的是通过利用添加胞壁酰二肽(MDP)而产生的干细胞的培养物，抑制单核细胞增殖，这导致体内免疫应答的抑制。
如本文所用的，术语“单核细胞”指源于骨髓和周围血细胞的单核吞噬白细胞。
此外，在本发明的另一个实施方式中，发现用添加胞壁酰二肽(MDP)培养的干细胞促进PGE2和TGF-β1的分泌，这导致由PGE2和TGF-β1诱导的MNC抑制。已经报道了PGE2起到抑制炎性细胞因子诸如白细胞介素-1β和细胞因子TNFα的分泌的作用。TGF-β1被认为是抗炎细胞因子。
仍然在本发明的另一个实施方式中，提示MDP-处理的干细胞以高产率产生抗炎细胞因子IL-10，并且此外，形成调节的T细胞群体。
因此，本发明的干细胞和其培养物可用于预防或治疗免疫病变和炎性疾病。在这点上，免疫病变或炎性疾病可为自体免疫疾病、移植排斥、移植物抗宿主病、关节炎、细菌感染、脓毒症、炎症等。自体免疫疾病可为克罗恩病、红斑、特应性皮炎、类风湿性关节炎、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、恶性贫血、阿狄森病(addison’sdisease)、1型糖尿病、狼疮、慢性疲乏综合征、纤维肌痛、甲状腺功能减退症和甲状腺功能亢进症、硬皮病、白塞病(Behcet’s disease)、炎性肠病、多发性硬化症、重症肌无力、美尼尔氏综合征(Meniere’ssyndrome)、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、白癜风、子宫内膜异位症、牛皮癣、白癜风、系统性硬皮病、哮喘、溃疡性结肠炎等。
如本文所用的，术语“炎性疾病”共同表示由炎症引起的损伤，和可为但不限于优选地水肿、皮炎、过敏症、特应性皮炎、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、狼疮、纤维肌痛、牛皮癣关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、肩膀的关节周炎、腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征或多发性硬化症。
如本文所用的，术语“免疫病变”指与具体的免疫应答的发展相关的病变，并且可为但不限于优选地自体免疫疾病、移植排斥、移植物抗宿主病。自体免疫疾病可为克罗恩病、红斑、特应性皮炎、类风湿性关节炎、桥本甲状腺炎、恶性贫血、阿狄森病、1型糖尿病、狼疮、慢性疲乏综合征、纤维肌痛、甲状腺功能减退症和甲状腺功能亢进症、硬皮病、白塞病、炎性肠病、多发性硬化症、重症肌无力、美尼尔氏综合征、格林巴利综合征、干燥综合征、白癜风、子宫内膜异位症、牛皮癣、白癜风、系统性硬皮病、哮喘、溃疡性结肠炎等等。
在本发明的实施方式中，确定了本发明的干细胞或其培养物能治疗结肠炎动物模型和特应性皮炎模型中的炎性疾病诸如结肠炎和免疫疾病诸如特应性皮炎，这提示其对免疫病变和炎性疾病的治疗效果。
如本文所用的，术语“预防”指其中通过施用该组合物阻止或延迟免疫病变或炎性疾病的所有行动。如本文所用的，术语“治疗”指其中通过施用该组合物免疫病变或炎性疾病的症状被缓解或转为更好状况的所有行动。
此外，本发明的组合物可包括每1ml1.0×105至1.0×109，优选地1.0×106至1.0×108，更优选地1.0×107个细胞。
本发明的组合物可未冰冻进行使用，或冰冻用于以后的使用。如果细胞群体被冰冻，则标准的冷冻保存剂(例如，DMSO、甘油、细胞冻存培养基(Cascade Biologics))被添加至富集的细胞群体，然后将其冰冻。
此外，组合物可通过配制适于通过制药领域的常规方法施用给患者的单位剂量进行施用，该制剂包含对单次剂量或分次剂量(divideddose)的有效量。为了该目的，用于肠胃外给药的制剂优选地包括注射制剂，诸如注射安瓿、输液制剂诸如输液袋和喷雾制剂诸如气溶胶。注射安瓿可就在施用制剂之前与注射溶液诸如盐水溶液、葡萄糖、甘露醇和林格溶液混合。此外，输液袋可具有聚氯乙烯或聚乙烯的结构，例如，Baxter、Becton Dickinson、Medcep、National Hospital Products或Terumo的产品。
除了活性成分之外，药物制剂还可进一步包括一种或多种药学上可接受的非活性载体，例如，用于注射制剂的防腐剂、镇痛控制剂、增溶剂或稳定剂，和用于局部制剂的碱、赋形剂、润滑剂或防腐剂。
本发明的制备的组合物或药物制剂可根据本领域中任何常规方法与用于移植和其它目的的其他干细胞一起施用，或以与其混合物的形式施用。对需要治疗的患者的损伤的直接移植物移入或移植，或直接移植或注射入腹膜腔是优选的，但不限于此。此外，利用导管的非外科给药和在切开后外科给药诸如注射或移植都是可能的，但利用导管的非外科给药是更优选的。另外，组合物也可肠胃外施用，例如，静脉内注射，其是除了对损伤直接给药以外，对于造血系统干细胞移植的常规方法之一。
干细胞可以以单次剂量或分次剂量每天1.0×104至1.0×1010个细胞/kg(体重)的量施用，优选地1.0×105至1.0×109个细胞/kg(体重)。然而，应当理解实际施用的活性成分的量应该根据包括以下的各种相关因素确定：待治疗的疾病、待治疗的状况、患者症状的严重度、给药的选择路径和个体患者的体重、年龄和性别；并且因此，以上剂量不应以任何方式限制本发明的范围。
在另一方面，本发明提供治疗免疫病变或炎性疾病的方法，包括向患有免疫病变或炎性疾病的对象施用该组合物的步骤。
仍然在另一方面，通过施用根据本发明的NOD2激动剂-处理的干细胞和其培养物，可抑制免疫应答或可调节炎症，并且因此，本发明提供了抑制对象的免疫应答或炎症应答的方法，其包括向对象施用通过添加NOD2激动剂至表达NOD2的干细胞产生的干细胞或其培养物的步骤。
如本文所用，术语“对象”指哺乳动物，其包括牛、狗、猪、鸡、绵羊、马和人，但不限于此。在这点上，抑制免疫应答或炎症应答的方法可限于不包括人的动物。优选地，施用添加NOD2激动剂培养的干细胞或其培养物可通过腹内或静脉内注射、直接注射入损伤或注射入滑液腔进行。
免疫应答或炎症应答的抑制用于预防或治疗免疫病变或炎性疾病。
仍然在另一方面，本发明提供了制备免疫抑制药物或抗炎药物的方法，其包括通过添加NOD2激动剂至表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞培养干细胞的步骤。
如本文所用的，术语“免疫抑制药物”，如上所述，指包括通过用NOD2激动剂培养表达NOD2的干细胞而产生的干细胞或其培养物的药物，其能够通过抑制免疫应答而治疗免疫病变。
如本文所用的，术语‘抗炎药物’，如上所述，指包括通过用NOD2激动剂培养表达NOD2的干细胞而产生的干细胞或其培养物的药物，其能够通过抑制炎症而治疗炎性疾病。
仍然在另一方面，本发明提供了制备PGE2或TGF-β1的方法，其包括在用NOD2激动剂处理的培养基中培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞的步骤，其中前列腺素E2(PGE2)或转化生长因子β1(TGF-β1)在培养期间由干细胞分泌。
在本发明的实施方式中，发现与未用MDP处理的间质干细胞和用其他受体激动剂(DAP、LPS、Pam3CSK4等)处理的间质干细胞相比，MDP-处理的间质干细胞显著促进已知可适用于多个领域的PGE2和TGF-β1的分泌。
在本发明中，对于PGE2和TGF-β1的回收，收集干细胞的培养基，并且通过离心和过滤去除细胞和碎片，由此仅留下上清液。
仍然在另一方面，本发明提供了包括表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞和NOD2激动剂的移植物。
如本文所用的，术语“移植物”指可被移植入人或哺乳动物的材料，其从外侧保护受损组织或支持移植的细胞或分泌的治疗性物质保持在同一位置上。移植物被用作组织工程的支撑物，并包括用于本领域的可生物降解的合成聚合物和天然材料，但不限于此。因为本发明的移植物包括表达NOD2的干细胞和NOD2激动剂，所以它具有不引起移植排斥或炎症应答的优点。因此，不需要抑制由不同移植物的移植引起的移植排斥或炎症应答所需要的任何额外的免疫抑制剂或抗炎药物，移植的移植物可稳定地移植到机体上，而不引起植入物排斥或炎症应答。
仍然在另一方面，本发明提供了通过在具有NOD2激动剂的移植物中培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞，并随后从其中移出干细胞而制备的移植物。
仍然在另一方面，本发明提供了制备移植物的方法，包括在具有NOD2激动剂的移植物中培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞的步骤。
优选地，该方法可进一步包括在培养步骤后移出干细胞的步骤。
仍然在另一方面，本发明提供了包括表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞和NOD2激动剂的复合物。
优选地，NOD激动剂可结合至复合物中干细胞的NOD2。更优选地，NOD2可通过将NOD2激动剂结合至复合物中干细胞的NOD2而激活。最终，复合物可用于细胞疗法。
仍然在另一方面，本发明提供了通过用NOD2激动剂培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞而产生的培养物。
该培养物可包括诸如PGE2和/或TGF-β1的组分，其显示了对免疫病变或炎性疾病的预防效果或治疗效果。
最佳实施方式
在下文中，通过提供如下的实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅表示说明所要求保护的发明，但决不限制所要求保护的发明。
在以下实施例中，源自脐带血的间质干细胞的使用仅是示例性的，但根据先前的描述，对本领域技术人员显而易见的是具有其他NOD2受体的间质干细胞和干细胞可用NOD2激动剂处理，用于诱导PGE2产生水平的显著增加，以便获得免疫抑制或抗炎效果。
此外，在本实施例中，MDP被用作NOD2激动剂。然而，如以下实施例所示的，其中NOD2受体被抑制的干细胞不具有免疫调节活性，并且因此根据先前的描述，对本领域技术人员将显而易见的是即使当使用其他NOD2激动剂时，也可实现本发明的免疫抑制或抗炎效果。
实施例1：分离和培养人脐带血源间质干细胞(在下文中，称为 hUCB-MSC)和人脐带血源单核细胞(在下文中，称为hUCB-MNC)
在分娩后立即从脐静脉获得脐带血(UCB)样本，由Boramae医院和首尔国立大学伦理审查委员会(Seoul National University InstitutionalReview Board)许可母亲的书面知情同意书(IRB NO.0603/001-002-07C1)。UCB样本与Hetasep溶液(StemCell Technologies，温哥华，加拿大)以5:1的比率混合，并随后在室温下温育以去除红细胞。通过添加Ficoll溶液至样本并将混合物在2500rpm下离心20分钟，将它与上清液分离而仔细地收集单核细胞。随后，沉淀的细胞用PBS清洗两次。
hUCB-源单核细胞(hUCB-MNC)在补充有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基(Gibco，Grand Island，NY，USA)中培养。
hUCB-源间质干细胞(hUCB-MSC)在D-media(Formula NO.78-5470EF，Gibco BRL)中以2×105～2×106个细胞/cm2的密度进行培养，所述培养基包含EGM-2SingleQuot和10%FBS(Gibco BRL)。在3天的培养后，去除未贴壁细胞。观察到贴壁细胞形成集落并快速生长，显示了纺锤形形态。从UCB样本的每一个分离的间质干细胞分别被标明为#618和#620。
实施例2：在hUCB-MSC中表达的受体的鉴定
2-1：hUCB-MSC中功能性TLR2、TLR4、NOD1和NOD2的表达的鉴定
进行RT-PCR以确定功能性Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)、核苷酸-结合寡聚结构域蛋白1(NOD1)和核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)是否在hUCB-MSC中表达。
具体而言，总RNA通过利用Easy-spin总RNA提取试剂盒(IntronBiotechnology，Seongnam，韩国)从hUCB-MSC中提取。通过利用Superscript III逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和寡(oligo)(dT)引物(Invitrogen)，由1μg总RNA制备cDNA。使用的引物组如下(F：正向，R：反向)。
TLR2F(SEQ ID NO.1)：5’-GATGCCTACTGGGTGGAGAA-3’
TLR2R(SEQ ID NO.2)：5’-CGCAGCTCTCAGATTTACCC-3’
TLR4F(SEQ ID NO.3)：5’-ACAGAAGCTGGTGGCTGTG-3’
TLR4R(SEQ ID NO.4)：5’-TCTTTAAATGCACCTGGTTGG-3’
NOD1F(SEQ ID NO.5)：5’-CCACTTCACAGCTGGAGACA-3’
NOD1R(SEQ ID NO.6)：5’-TGAGTGGAAGCAGCATTTTG-3’
NOD2F(SEQ ID NO.7)：5’-GAATGTTGGGCACCTCAAGT-3’
NOD2R(SEQ ID NO.8)：5’-CAAGGAGCTTAGCCATGGAG-3’
Rip2F(SEQ ID NO.9)：5’-CCATTGAGATTTCGCATCCT-3’
Rip2R(SEQ ID NO.10)：5’-ATGCGCCACTTTGATAAACC-3’
RPL13A F(SEQ ID NO.11)：5’-CATCGTGGCTAAACAGGTAC-3’
RPL13A R(SEQ ID NO.12)：5’-GCACGACCTTGAGGGCAGCC-3’
PCR条件被设定为具有：在95℃下持续3min的最初变性；94℃下30sec，60℃下30sec和72℃下1min，30个周期；在72℃下10min的最终延伸。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上分离，可视化，并且利用凝胶成像系统拍照凝胶的图像。
如图1a所示，在包含人单核细胞性白血病细胞系即THP-1细胞的阳性对照组中，所有的感兴趣受体在THP-1细胞和hUCB-MSC两者中表达。与在THP-1细胞中相比，TLR4在hUCB-MSC中以更高水平表达，而TLR2、NOD1和NOD2的基因表达水平在THP-1细胞中更大。同时，也在hUCB-MSC中观察到Rip2表达。
2-2：分析响应由感兴趣受体的激动剂产生的刺激的细胞因子产生
在实施例2-1中证实在hUCB-MSC中感兴趣受体表达之后，受体的功能性通过监测激动剂刺激后的IL-8产生进行研究。对于该实验，在96-孔平板中补充有2%FBS的KSFM培养基中，以2x104个细胞/孔的密度培养hUCB-MSC。在24小时的培养后，细胞用相应于每种受体中的以下激动剂进行处理，即，Pam3CSK4(TLR2激动剂，Pam3)、LPS(TLR4激动剂)、Tri-DAP(NOD1激动剂，T-DAP)和MDP(NOD2激动剂)。随后样本温育额外的24小时。每种培养物的上清液被收集、离心和通过0.2μm滤器过滤。随后，IL-8和PGE2的浓度利用ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)进行测量。超纯LPS(大肠杆菌O111:B4)、Pam3CSK4和Tri-DAP从Invivogen(San Diego,CA,USA)购买。MDP[Ac-(6-O-硬脂酰)-胞壁酰-Ala-D-Glu-NH2；胞壁酰二肽]从Bachem(Bubendorf，瑞士)购买。重组人干扰素-γ从Peprotech(Rockyhill，NJ，USA)购买。
如图1b和1c所示，通过Pam3CSK4(三-酰化肽；TLR2激动剂)、LPS(脂多糖，TLR4激动剂)、Tri-DAP(三-二氨基庚二酸，NOD1激动剂)和MDP(NOD2激动剂)的刺激导致在hUCB-MSC中以剂量依赖性方式增加的IL-8产生。这些结果提示在hUCB-MSC中NOD1、NOD2、TLR2和TLR4被表达并活跃响应激动剂的刺激。
2-3：分析激动剂引起的TLR和NLR刺激对hUCB-MSC增殖的影响(1)
基于先前的发现，即某种类型的MSC受到TLR刺激影响(Pavsner-Ficher等，Toll-like receptors and their ligands controlmesenchymal stem cell functions,Blood,109:1422,2007)，激动剂对hUCB-MSC增殖的影响通过用每种激动剂处理细胞并培养它们4天进行研究。
更具体地，在96-孔平板中的补充有2%FBS的MSC培养基中，以2x103个细胞/孔的密度培养细胞。在24小时的培养后，细胞用Pam3CSK4(TLR2激动剂)、LPS(TLR4激动剂)、Tri-DAP(NOD1激动剂)和MDP(NOD2激动剂)进行处理，每种的浓度为10μg/ml，并随后培养另外4天。通过利用细胞计数试剂盒-8(Dojindo MolecularTechnologies，Rockville，MD，USA)监测细胞增殖。实验组的每种类型的结果的差异由标准偏差(±SD)代表。所有的统计学分析利用MSExcel程序进行，并且p<0.05的测试值被认为是统计学上显著的(在下文中，相同)。
如图1d和1e所示的，没有发现激动剂对hUCB-MSC的增殖有影响。
2-4：分析激动剂引起的TLR和NLR刺激对hUCB-MSC对人MNC增殖的抑制活性的影响(2)
在本实验中，发明人研究了TLR和NLR激动剂是否增强hUCB-MSC对人MNC增殖的抑制活性。
基于鉴定在通过MSC抑制淋巴细胞增殖中MSC和淋巴细胞之间的直接相互作用的重要性的研究，本发明人研究在两个细胞组彼此接触的条件下，MDP是否对hUCB-MSC对MNC增殖的抑制能力具有影响。
如图2所示，hUCB-MSC(#618)在直接的细胞与细胞相互作用下强烈抑制了人MNC的增殖。然而，TLR(Pam3CSK4和LPS)激动剂和NLR激动剂(Tri-DAP和MDP)在相同条件下不影响hUCB-MSC对MNC增殖的抑制活性(图2)。
实施例3：通过NOD2-Rip2依赖性途径，MDP引起的增强的 hUCB-MSC免疫抑制活性的鉴定(1)
3-1：确定由MDP-处理的hUCB-MSC产生的分泌因子对MNC增殖的影响
也已知可溶性因子介导通过MSC的免疫抑制。因此本发明人检验了由UCB-MSC产生的分泌因子是否对人MNC增殖有影响。制备培养基(CM)，并且hUCB-MSC与激动剂共培养24小时。在清洗后，将细胞在新鲜培养基中培养额外的4天。随后，制备包含培养基(CM)的对照组和用激动剂(#618)处理的hUCB-MS的样本，并且MNC在包含hUCB-MSC的CM中培养3天。
实验结果说明MNC增殖在包含hUCB-MSC培养基(UCM)的对照组中被轻微抑制(图3a)。令人惊讶地，当MNC在利用MDP预处理的UCM(MDP-UCM)中培养时，MNC增殖以更高的水平被抑制，但当使用其他激动剂处理UCM(Pam3CSK4、LPS、Tri-DAP)时，不存在该效果(图3a)。当使用由其他hUCB-MSC(#620)样本制备的UCM时，观察到类似的结果(图3b)。此外，当它们在UCM存在下培养时，异种小鼠脾细胞的增殖也被抑制，并且该抑制效果通过MDP刺激增强(图3c)。这些结果提示来自MDP-处理的hUCB-MSC的分泌因子在MNC的免疫抑制中起到重要作用。
3-2：鉴定通过MDP处理增强的hUCB-MSC的免疫抑制活性
为了确定MDP是否增强hUCB-MSC的免疫抑制活性，进行以下实验。制备包含hUCB-MSC的培养基(CM)的对照组，并且激动剂-处理的hUCB-MSC在培养的第5天收集。随后，MNC在hUCB-MSC的CM中再共培养3天，并且在培养后，监测MNC增殖的水平。
如图4A所示的，与未处理的UCB-MSC上清液(UCB-MSC#618)相比，在用激动剂MDP(UCB-MSC#618+MDP)处理的间质干细胞的上清液中MNC增殖受到显著抑制。
另一方面，MNC抑制率在用其他激动剂(LPS等)处理的间质干细胞的上清液(UCB-MSC#618+Pam3；UCB-MSC#618+LPS；UCB-MSC#618+T-DAP)和未处理的UCB-MSC上清液(UCB-MSC#618)之间是类似的。即，与未处理的阴性对照组相比，当用其他激动剂处理时，MNC组的增殖仅受到轻微抑制。
这些结果提示由MDP-处理的间质干细胞分泌的可溶性因子显著抑制MNC增殖。
3-3：通过利用NOD2和Rip2的siRNA研究MNC抑制中NOD2、Rip2和MDP之间的相关性
另外，为了研究在MNC抑制中NOD2、Rip2和MDP之间的相关性，利用NOD2和Rip2的siRNA和对照组(siCTL)进行以下实验。当细胞密度达到60%时，siRNA被转染入细胞。为受体-相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶2(RIPK2或受体相互作用激酶蛋白质2(Rip2)，其是NOD1和NOD2的衔接子和被称为RICK或CARDIAK类型的激酶(Bertin等,1999;Inohara等,1999；Ogura等,2001b))的siRNA的siRIPK2(M-003602-02)，为NOD2的siRNA的siNOD2(J-011388-07)，和非靶向对照(siControl#1，D-001810-01)从Dharmacon(Chicago，IL，USA)购买。DharmaFECT1(Dharmacon)被用作转染试剂，和siRNA在100nmol/L的浓度下被转染。在大约48小时后，该培养基用新鲜培养基所替代，并且细胞用10μg/mL的MDP(NOD2激动剂)处理24小时，除了阴性对照(仅MNC的培养基)和阳性对照(添加有UCB-MSC上清液(UMS)而没有激动剂的培养基)。
即，单独培养MNC的培养基(i)，和添加有UCB-MSC上清液(UMS)而没有激动剂的培养基(ii)制备作为对照组，并且制备利用MDP的和UMS处理的培养基(iii)，利用MDP、UMS和对照siRNA(siCTL)处理的培养基(iv)，利用MDP、UMS和siNOD2处理的培养基(v)，和利用MDP、UMS和siRip2处理的培养基(vi)。此后，MNC增殖通过在450nm波长下的光学密度测量。
如图4B所示的，MNC增殖抑制率在培养基(iv)和培养基(iii)中类似，而在培养基(v)和(vi)中的MNC增殖抑制率类似于培养基(ii)中的MNC增殖抑制率。换言之，NOD2和Rip2的siRNA能抵消MDP在增强MNC增殖抑制方面的作用，但对照siRNA不显示以上作用。这些结果指示NOD2和Rip2正调节MDP-诱导的免疫应答。因此，提示NOD2和Rip2对MDP-调节的-UCB-MNC抑制是必需的。
实施例4：通过NOD2-Rip2依赖性途径，MDP引起的增强的 hUCB-MSC免疫抑制活性的鉴定(2)
为了证实实施例3中的实验结果，从实施例1获得的间质干细胞系#620用于按照实施例3-2和3-3中描述的相同的方法进行该实验。
如图5A所示的，与用其他受体激动剂培养或不用任何激动剂培养的UCB-MSC上清液(UCB-MSC#620)相比，在激动剂MDP-处理的间质干细胞上清液(UCB-MSC#618+MDP)中，MNC增殖被显著抑制，这是与实施例3-1中观察到的相似的结果。如图5B所示的，MDP在增强MNC抑制中的效果由NOD2和Rip2的siRNA抵消，但没有由对照siRNA抵消，这也类似于实施例3-3的结果。这些结果指示MDP经NOD2-Rip2-依赖性途径增强间质干细胞对MNC增殖的抑制活性。
以上结果，连同实施例3的结果一起，提示本发明的MDP-处理的干细胞和其培养物证明了强免疫抑制效果，并因此可被用作免疫调节组合物，用于治疗自体免疫疾病诸如类风湿性关节炎和克罗恩病，或免疫病变诸如特应性皮炎。
实施例5：分析MDP-诱导的PGE 2 产生和通过UMS(UCB-MSC上清 液；UMS)的MNC抑制之间的相关性
5-1：通过MDP刺激，来自MSC的PGE2分泌增加
在96-孔平板中的补充有2%FBS的MSC培养基中培养hUCB-MSC(2×104个细胞/孔)。在24hr的培养后，细胞用1μg/mLPam3CSK4(TLR2激动剂)、1μg/mL LPS(TLR4激动剂)、10μg/mLTri-DAP(NOD1激动剂)或10μg/mL MDP(NOD2激动剂)处理，并再培养24小时，随后收集每个样本的培养上清液。在离心后，通过0.2μm滤器过滤培养上清液。随后，利用ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)按照制造商的方案，测量PGE2浓度。
如图6a所示的，与用其他受体的激动剂处理的那些相比，利用NOD2激动剂MDP处理hUCB-MSC显著增强PGE2分泌。
5-2：分析COX-2表达和MDP处理之间的相关性
用1μg/mL Pam3CSK4(TLR2激动剂)、1μg/mL LPS(TLR4激动剂)、10μg/mL Tri-DAP(NOD1激动剂)或10μg/mL MDP(NOD2激动剂)处理细胞，并培养24小时。随后，利用包含2mM二硫苏糖醇和蛋白酶混合物的1%Nonidet-P40缓冲液(Roche，US)裂解收集的细胞。细胞溶胞产物通过12%SDS-PAGE溶解，并转移至硝化纤维素膜。随后，利用初级抗体(COX-2、GAPDH(Santa Cruz biotechnology,Santa Cruz,CA,USA))进行免疫染色。此后，用二级抗体进行免疫染色利，并且利用增强的化学发光(ECL)试剂(Intron Biotechnology)检测蛋白质。
如图6b所示的，与用其他受体的激动剂处理的那些相比，用NOD2激动剂MDP处理的hUCB-MSC显示了增强的COX-2表达。
5-3：分析COX-2表达和通过MDP处理刺激的NOD2和Rip2的活性之间的相关性
为了研究COX-2表达和NOD2和Rip2的功能之间的相关性，细胞首先用MDP处理，并进一步用siNOD2和siRip2处理。随后检查COX-2表达水平。利用实施例5-2中描述的方法测量蛋白质表达水平，并且siRNA处理的方法与实施例3-3中描述的相同。
如图6c所示的，通过抑制NOD2和Rip2，降低COX-2表达水平。该结果提示COX-2表达依赖于NOD2和Rip2的活性。
5-4：NOD2、Rip2和COX-2对PGE2表达的影响的研究
为了确定MDP治疗效果的持续时间(sustainment time)，在利用MDP处理hUCB-MSC1天后监测产生的PEG2的量。在该实验中，MDP在1天的培养后通过去除培养基而去除，并且用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞5次。随后，测量产生的PEG2的量。同时，利用MDP通过实施例5-1中描述的相同的方法处理细胞，并测量PGE2浓度。同样地，为了确定NOD2、Rip2和COX-2对PGE2表达的影响，用实施例3-3的对照组中的每一个即siRNA(siCTL)、siNOD2、siRip2和被称为消炎痛(Sigma(St.Louis,MO,USA))的COX-2抑制剂处理细胞。
如图6d所示的，甚至当在1天的处理后去除MDP时，在MDP-刺激的hUCB-MSC中的PGE2产生水平大于培养第5天的对照组中的PGE2产生水平。另外，通过利用NOD2和Rip2siRNA的转染或通过添加消炎痛抑制COX-2来抑制MDP-增强的PGE2产生。这些结果指示NOD2、Rip2和COX-2在hUCB-MSC中MDP-诱导的PGE2产生中起到重要作用。
5-5：在通过hUCB-MSC的MNC抑制中PGE2作用的研究
为了研究通过hUCB-MSC的MNC抑制中PGE2的作用，当用MSC上清液、MDP-处理的MSC上清液以及MDP和消炎痛(COX-2抑制剂)-处理的MSC上清液处理时，检查MNC增殖。该实验通过实施例3中描述的相同方法进行。
如图6e所示的，利用MDP-处理的MSC培养基进行细胞处理显著抑制了MNC增殖，但与消炎痛(Indo)的共处理显示了类似于阴性对照组的MNC增殖率。这些结果指示PGE2在通过hUCB-MSC的MNC抑制中起到重要作用，其与实施例5-4的结果一致。
这些结果提示本发明的MDP-处理的干细胞和其培养物产生PGE2，其可被用作免疫调节组合物。如上所述的，因为已知PGE2抑制细胞因子诸如白细胞介素-1β和TNFα的分泌，所以本发明的MDP-处理的干细胞和其培养物也可被用作抗炎组合物。
5-6：NOD2和COX-2对MDP-诱导的抗炎细胞因子白细胞介素-10(IL-10)的产生的影响的研究
为了确定IL-10的产生水平，在24-孔平板中的补充有2%FBS的MSC培养基中培养hUCB-MSC(1x105个细胞/孔)。大约24小时后，用siNOD2或消炎痛(Indo)处理细胞，并进一步培养24小时。随后，细胞被清洗5次，并添加新鲜RPMI。在5天的培养后，获得UCB-MSC上清液(UMS)。MNC(1×106/孔)与UMS和ConA(Sigma(St.,Louis Mo,USA))一起培养。在3天的培养后，细胞上清液被收集、离心和通过0.2μm滤器过滤。随后，利用ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)测量IL-10浓度。
如图6f所示的，通过MDP处理抗炎细胞因子IL-10的产生显著增加。然而，通过抑制NOD2或消炎痛处理抑制IL-10产生。这些结果提示MDP处理通过作用于NOD2-Rip2途径增加抗炎细胞因子IL-10的产生，其是与产生PGE2涉及的途径相同的途径。
换言之，本发明的MDP-处理的干细胞以高产率产生抗炎细胞因子IL-10，并且因此MDP-处理的干细胞或其培养物可被用作抗炎组合物，特别是用于关节炎等的治疗。
实施例6：分析MNC抑制和hUCB-MSC中PGE 2 和TGF-β的MDP- 诱导的产生之间的相关性
6-1：MDP对MSC中PGE2和TGF-β1的产生和COX-2表达的影响的研究
可溶性因子诸如肝细胞生长因子、TGF-β、吲哚胺2,3双加氧酶-1(IDO-1)、一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)是通过MSC调节免疫抑制的强有力的候选者。为了确定TLR和NLR激动剂是否诱导hUCB-MSC中包括NO、PGE2和TGF-β1在内的可溶性因子的产生，用Pam3CSK4、LPS、Tri-DAP和MDP培养细胞24小时，并收集培养上清液。通过实施例5-1和5-2中描述的方法监测可溶性因子的分泌。
所述结果说明了利用TLR和NOD激动剂的单次处理不诱导hUCB-MSC中NO的产生，尽管LPS诱导巨噬细胞中NO的产生(图7a)。有趣地是，PGE2和TGF-β1的产生仅通过在hUCB-MSC中添加MDP而增强，但不通过添加其他激动剂增强(图7b和7c)。此外，COX-2即PGE2-产生酶的表达，在MDP处理24小时后，在hUCB-MSC中增加(图7d)。
6-2：PGE2和TGF-β对MNC增殖的影响的研究
为了研究PGE2对单核细胞(MNC)增殖的影响，hMNC和小鼠脾细胞用不同浓度的PGE2培养。通过实施例5-5中描述的相同的方法进行该实验。
结果显示当用浓度为10ng/mL或更高的PGE2培养时，hMNC和小鼠脾细胞的增殖被显著抑制(图7e和7f)。
接下来，本发明人检查了通过MDP-预处理UCM的hMNC抑制是否归因于PGE2和TGF-β1。通过实施例5-5中描述的相同的方法进行该实验。
结果显示MDP-UCM对hMNC增殖的抑制效果通过COX抑制剂消炎痛抵消(图7g)。此外，当与TGF-β1中和抗体一起共处理时，MDP-UCM不抑制hMNC增殖(图7h)。这些结果提示MDP诱导hUCB-MSC中PGE2和TGF-β1的产生，其介导hUCB-MSC的免疫抑制活性。
实施例7：分析hUCB-MSC中MDP-诱导的COX-2表达及PGE 2 和 TGF-β1产生与NOD2和Rip2的活性之间的相关性
NOD2和Rip2是MDP-诱导的免疫应答中的重要因子。因此，本发明人检查了NOD2和Rip2在hUCB-MSC中MDP-诱导的COX-2表达及PGE2和TGF-β1的产生中是否是必需的。通过实施例5-4中描述的相同的方法进行该实验。
结果说明了在hUCB-MSC中NOD2和Rip2两者的基因和蛋白质表达被siRNA显著抑制(图8)。通过siRNA下调NOD2和Rip2进一步抑制hUCB-MSC中MDP-诱导的COX-2表达(图9a)。与对照siRNA相比，NOD2和Rip2的siRNA处理降低了MDP-UCM中的PGE2和TGF-β1产生(图9b和9c)。此外，MLR实验显示了NOD2和Rip2的下调恢复了MDP-UCM对hMNC增殖的增加的抑制效果(图9d)。这些结果提示MDP经NOD2-Rip2途径诱导hUCB-MSC中PGE2和TGF-β1的产生增加，这指示UCM-MSC的免疫抑制能力增强。
实施例8：分析MDP-UCM对hMNC中的IL-10产生和调节T细胞群 体的影响
8-1：MDP-UCM对hMNC中IL-10产生的影响的研究
已知在骨髓基质细胞中产生的PGE2通过宿主巨噬细胞在IL-10产生中起到重要作用(Nemeth,K.,A.等,Bone marrow stromal cellsattenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of hostmacrophages to increase their interleukin-10production.Nat Med15:42-49,2009)。MDP诱导hUCB-MSC中的PGE2产生，并且因此本发明人检查hMNC中的IL-10产生是否在MDP-UCM存在下增加。通过实施例5-6中描述的相同的方法进行该实验。
结果说明单独UCB-MSC不产生IL-10，不管MDP刺激与否(数据未显示)。尽管单独hMNC不产生IL-10，但IL-10产生在UCM存在下被上调(图10a)。此外，与在未处理的UCM存在下相比，通过hMNC的IL-10产生在MDP-UCM存在下增加更多(图10a)。然而，通过MDP-UCM的hMNC中增加的IL-10产生通过利用消炎痛或TGF-β1中和抗体单次处理逆转，并且以上效果通过用消炎痛和TGF-β1中和抗体的组合处理细胞而加速(图10a)。当NOD2活性在hUCB-MSC中由siRNA抑制时，与未处理的UCM相比，甚至在MDP-UCM存在下hMNC中的IL-10产生也不增加(图10a)。
8-2：MDP-UCM对hMNC中T细胞群体的影响的研究
接下来，本发明人研究了UCM对hMNC分化成调节T细胞(Treg)的影响。为了该目的，hMNC用UCM培养5天，并且hMNC中CD4、CD25和Foxp3的共表达通过流式细胞术确定。
结果说明hMNC中的Treg群体在UCM存在下增加50%或更多，并且与用未处理的UCM培养的那些相比，Treg群体在利用MDP-UCM培养的hMNC中增加更多(图10b)。类似地，通过MDP-UCM引起的Treg群体的增加通过利用消炎痛和TGF-β1中和抗体处理或通过利用siRNA的NOD2抑制逆转(图10b)。这些结果指示UCM中MDP-诱导的PGE2和TGF-β1的产生在通过hMNC的IL-10产生和hMNC分化成为Treg中是重要的。
实施例9：其他类型的干细胞中NOD2表达的确定
对于其他类型的干细胞，为了确定免疫应答和炎症应答是否可通过NOD2受体和激动剂之间的相互作用调节，通过添加核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)激动剂，利用人单核细胞性白血病细胞系检查脂肪组织源干细胞(AD-MSC)和羊膜上皮干细胞(AEC)中的NOD2表达，即THP-1作为阳性对照组。RT-PCR在实施例2中描述的相同的条件下进行。人羊膜上皮干细胞在分娩后获得，具有由Guro医院(首尔国立大学IRB)批准的患者的书面知情同意书(IRB NO.0611/001-002)，并且羊膜上皮干细胞从获得的羊膜组织中分离。获得脂肪组织源干细胞，具有由Boramae医院批准的患者的书面知情同意书(SNU IRB#0600/001-001)，并且分离和培养脂肪组织源干细胞。
如图11所示，与在阳性对照即THP-1细胞中相比，NOD2表达在脂肪组织源干细胞和羊膜上皮干细胞中更高。换言之，NOD2受体表达在其他类型的干细胞以及间质干细胞中观察到，这提示其他类型的干细胞也可用于经NOD2受体-激动剂相互作用调节免疫应答和炎症应答。
实施例10：利用结肠炎动物模型研究NOD2-表达干细胞的治疗效果
10-1：利用结肠炎动物模型研究NOD2-表达干细胞的治疗效果
本发明人检查hUCB-MSC治疗对治疗结肠炎小鼠是否有效和MDP刺激是否促进hUCB-MSC对DSS-诱导的结肠炎的保护效果。对于施用hUCB-MSC，细胞在存在或不存在MDP下培养24小时，并随后用PBS清洗以去除MDP。具体而言，为了研究结肠炎动物模型中MDP-处理的干细胞的治疗效果，结肠炎在小鼠(Central Lab.Animal Inc.,C57BL/6N)中通过用3%DSS(葡聚糖硫酸钠)的处理进行诱导。在2天的治疗后，MDP-处理的hUCB-MSC、未处理的hUCB-MSC和通过利用siRNA处理的NOD2-抑制的hUCB-MSC被腹膜内注射。在该时刻，3%DSS在饮用水中施用7天。
结果说明了与PBS-或成纤维细胞-处理的小鼠相比，未处理的hUCB-MSC的腹膜内注射缓解了DSS-诱导的结肠炎小鼠的体重减轻并同时提高了存活率(图12a和12b)。此外，MDP-刺激的hUCB-MSC(MDP-MSC)注射导致体重恢复至没有患结肠炎的对照组的90%，和没有小鼠死于结肠炎(图12a和12Bb)。疾病活性指数通过注射hUCB-MSC轻微降低，但显著不同于PBS-或成纤维细胞-处理的组的疾病活性指数。另一方面，MDP-MSC的注射显著降低疾病活性指数(图12c)。当NOD2由siRNA下调时，MDP-MSC不缓解体重减轻或增加存活率和疾病活性指数。
小鼠在第14天处死以测量它们的结肠长度，并进行组织病理学分析。肉眼检查的结果显示由于炎症减少的结肠长度通过用hUCB-MSC治疗轻微缓解，其通过添加MDP增强(图12d和12e)。组织病理学研究的结果显示在DSS-处理的小鼠中观察到固有层和粘膜下层的结肠粘膜腐蚀、严重水肿损伤和炎性细胞浸润(图12f)。在hUCB-MSC-处理的小鼠中观察到限于结肠的一部分的粘膜下层的粘膜腐蚀和水肿(图12f)。然而，通过利用MDP-MSC治疗，结肠中的病理损害被完全治疗并且病理学分数显著降低(图12f和12g)。如所预期的，siNOD2-处理的hUCB-MSC的注射既没有缓解DSS-诱导的结肠炎中病理严重程度，也没有降低病理学分数(图12f和12g)。这些结果提示MDP增强了hUCB-MSC对结肠炎的保护效果，这指示了NOD2的关键作用。
10-2：在结肠炎动物模型中研究MDP对炎性细胞因子产生和T细胞群体的影响
此外，本发明人在结肠炎小鼠中研究了MDP对hUCB-MSC-诱导的炎性细胞因子产生的调节的影响。
结果显示在DSS-处理的小鼠结肠中，hUCB-MSC降低IL-6和IFN-γ产生，并增加IL-10产生(图13a)。此外，MDP-MSC在DSS-处理的小鼠结肠中几乎完全阻碍IL-6和IFN-γ产生，并促进IL-10产生，但该效果由NOD2下调抵消(图13a)。
为了确定hUCB-MSC是否对小鼠结肠中的Treg群体有影响，在荧光显微镜下监测Foxp3+细胞浸润入结肠。
结果说明了与在PBS-处理的结肠炎小鼠中相比，在结肠中的Fox3p+细胞的定位在hUCB-MSC-处理的结肠炎小鼠中更高(图13b)。另外，通过利用MDP-MSC处理进一步增加结肠中Fox3p+细胞的定位，其由hUCB-MSC中的NOD2抑制抵消(图13b)。结肠中的Foxp3表达通过蛋白质印迹定量。与在PBS-处理的结肠炎小鼠中相比，Foxp3蛋白质表达在hUCB-MSC-处理的小鼠中更高(图13c和13d)。类似地，结肠中的Foxp3水平通过利用MDP-MSC处理进一步增加，其也由NOD2下调抵消(图13c和13d)。
10-3：分析结肠炎动物模型中的炎性细胞浸润
最后，本发明人检查了炎性细胞浸润入小鼠结肠。监测髓过氧化物酶(MPO)的活性，以确定嗜中性浸润。
结果说明hUCB-MSC抑制MPO活性和CD4+和CD11b+细胞浸润入DSS-处理的小鼠结肠(图13e)。类似地，MDP-MSC以更大程度抑制MPO活性和CD4+和CD11b+细胞浸润，其由通过siRNA的NOD2抑制抵消(图13e)。
这些结果支持hUCB-MSC诱导抗炎，同时抑制促炎症应答，其可以通过MDP处理以NOD2-依赖性方式增强。
此外，这些结果提示本发明的MDP-处理的干细胞或其培养物可实际用于治疗具有结肠炎的动物模型中的炎症。
实施例11：MDP-处理的hUCB-MSC对特应性皮炎-诱导的动物模型 的治疗效果的研究
11-1：诱导特应性皮炎和利用hUCB-MSC注射治疗
在进行本实验前的一天，8周龄雌性NC/Nga小鼠的背部的毛被剃毛，并且背部皮肤上剩余的毛通过施加去毛膏完全去除。随后，第二天，150μl的4%十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液被施加至被剃毛的背部皮肤以从皮肤上去除脂肪。皮肤完全干燥大约3至4小时，并且随后均匀施加100mg的粉尘螨(Df)提取物至背部和耳朵。一周两次进行Df提取物的施加，持续3周，总共6次(对于每次Df提取物的施加，SDS水溶液的施加是必要的)，以诱导特应性皮炎。随后，实施例1中制备的2×106个hUCB-MSC悬浮在200μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并静脉内或皮下注入NC/Nga小鼠，在Df施加期间一周一次，持续3周，和在诱导特应性皮炎后持续1周，即总共4次，持续4周。通过在补充有10μl/mL的MDP的培养基中培养hUCB-MSC24小时并且随后在注射前用PBS清洗细胞5次，制备MDP-处理的hUCB-MSC。
11-2：通过肉眼检查损伤研究MDP-处理的hUCB-MSC的治疗效果
为了研究MDP-处理的hUCB-MSC对特应性皮炎的治疗效果，在第4次注射hUCB-MSC的24小时后进行尸体解剖，并且损伤的严重度通过肉眼检查进行评估。肉眼检查根据干燥、表皮脱落、红斑和水肿进行，给出0至3的分数，并且总分数用于评估。
如图14所示，静脉内注射hUCB-MSC进入特应性皮炎-诱导组诱导损伤的轻微缓解，但与未处理的特应性皮炎-诱导组不具有很大的差异。与之相反，损伤的显著缓解在静脉内或皮下注射MDP-处理的hUCB-MSC的组中观察到。
这些结果提示本发明的MDP-处理的干细胞或其培养物可用于治疗自体免疫疾病诸如特应性皮炎。
11-3：通过分析血清IgE研究MDP-处理的hUCB-MSC的治疗效果
为了研究MDP-处理的hUCB-MSC对特应性皮炎的治疗效果，在第4次注射hUCB-MSC的24小时后进行尸体解剖，并且利用商业OptEIA小鼠组(BD Bioscience，Mississauga，加拿大)测量从尸体解剖中收集的血清中的IgE水平。
如图15所示的，在静脉内注射hUCB-MSC或MDP-处理的hUCB-MSC的组中，观察到IgE的显著抑制，同时在静脉内注射MDP-处理的hUCB-MSC的组中观察到更高的抑制率。然而，皮下注射MDP-处理的hUCB-MSC不诱导与特应性皮炎-诱导组的大的差异。
11-4：通过分析血清IgG1研究MDP-处理的hUCB-MSC的治疗效果
为了研究MDP-处理的hUCB-MSC对特应性皮炎的治疗效果，在第4次注射hUCB-MSC的24小时后进行尸体解剖，并且利用ELISA试剂盒(Bethyl Laboratories Inc.,Montgomery,TX,USA)，在从尸体解剖中收集的血清中进行测量IgG1水平，其为特应性皮炎的Th2免疫应答的代表性指数。
如图16所示，在所有hUCB-MSC-处理的组中，观察到IgG1的显著抑制。
11-5：通过组织病理学检查皮肤组织研究MDP-处理的hUCB-MSC的治疗效果
为了研究MDP-处理的hUCB-MSC对特应性皮炎的治疗效果，在第4次注射hUCB-MSC的24小时后进行尸体解剖，并且收集皮肤组织并用10%中性福尔马林溶液固定。随后，加工组织切片、石蜡包埋并切成3至4μm切片。随后，为了病理性研究，进行苏木精-伊红(H&E)染色。
如图17所示的，在特应性皮炎-诱导组中，观察到表皮增生和炎性细胞的过度浸润。在静脉内注射hUCB-MSC和静脉内或皮下注射MDP-处理的hUCB-MSC中观察到表皮厚度和炎性细胞浸润的减少。损伤缓解的最大速率按照皮下注射MDP-处理的hUCB-MSC、静脉内注射MDP-处理的hUCB-MSC和静脉内注射hUCB-MSC的顺序观察到。
11-6：通过组织病理学检查皮肤组织研究MDP-处理的hUCB-MSC的治疗效果
为了研究MDP-处理的hUCB-MSC对特应性皮炎治疗效果，在第4次注射hUCB-MSC的24小时后进行尸体解剖，收集皮肤组织并用10%中性福尔马林溶液固定。随后，加工组织切片、石蜡包埋和切成3–4μm切片。随后，进行甲苯胺蓝染色以检验肥大细胞脱粒，其为特应性皮炎的主要症状之一。
如图18所示的，在特应性皮炎-诱导组中观察到大量脱粒的肥大细胞，并且在所有其他组中观察到肥大细胞脱粒的减少。
这些结果提示本发明的MDP-处理的干细胞或其培养物可实际用于治疗动物模型中的免疫病变诸如特应性皮炎。
除非另有规定，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域中技术人员通常理解的相同含义。本文使用的命名也是广泛已知的和本领域通常使用的。

Claims (13)

1.预防或治疗免疫病变或炎性疾病的药物组合物，其包括通过用浓度为1至10μg/ml的NOD2激动剂培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞24至72小时而产生的分离的干细胞或其培养物，
其中所述NOD2激动剂为胞壁酰二肽(MDP)，并且
其中所述免疫病变或炎性疾病为特应性皮炎或炎性肠病。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述干细胞为人成体干细胞、人多能干细胞、诱导的多能干细胞、动物胚胎干细胞或动物成体干细胞。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述成体干细胞为人组织源间质基质细胞、多能干细胞或羊膜上皮细胞。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述成体干细胞为选自以下的间质干细胞：脐带源间质干细胞、脐带血源间质干细胞、骨髓源间质干细胞、脂肪组织源间质干细胞、肌肉源间质干细胞、神经源间质干细胞、皮肤源间质干细胞、羊膜源间质干细胞和胎盘源间质干细胞。
5.制备免疫抑制药物或抗炎药物的方法，其包括利用浓度为1至10μg/ml的NOD2激动剂培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞24至72小时的步骤，
其中所述NOD2激动剂为胞壁酰二肽(MDP)。
6.制备PGE2或TGF-β1的方法，其包括利用浓度为1至10μg/ml的NOD2激动剂培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞24至72小时的步骤，其中前列腺素E2(PGE2)或转化生长因子β1(TGF-β1)在所述培养期间由所述干细胞分泌，
其中所述NOD2激动剂为胞壁酰二肽(MDP)。
7.一种移植物，其通过在具有浓度为1至10μg/ml的NOD2激动剂的所述移植物中培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞24至72小时，并随后从其中移出干细胞而制备，
其中所述NOD2激动剂为胞壁酰二肽(MDP)。
8.制备移植物的方法，包括在具有浓度为1至10μg/ml的NOD2激动剂的所述移植物中培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞24至72小时的步骤，
其中所述NOD2激动剂为胞壁酰二肽(MDP)。
9.根据权利要求8所述的方法，进一步包括在所述培养步骤后移出干细胞的步骤。
10.复合物，其通过用浓度为1至10μg/ml的NOD2激动剂培养表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞24至72小时而制备，
其中所述NOD2激动剂为胞壁酰二肽(MDP)。
11.根据权利要求10所述的复合物，其中所述NOD2激动剂被结合至所述干细胞的NOD2。
12.根据权利要求10所述的复合物，其中NOD2由将所述NOD2激动剂结合至所述干细胞的NOD2激活。
13.一种培养物，其通过添加浓度为1至10μg/ml的NOD2激动剂至表达核苷酸-结合寡聚结构域蛋白2(NOD2)的干细胞24至72小时而产生，
其中所述NOD2激动剂为胞壁酰二肽(MDP)。
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