WO2013125899A1 - 줄기세포를 유효 성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

줄기세포를 유효 성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2013125899A1
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composition
disease
cells
mesenchymal stem
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PCT/KR2013/001435
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강경선
이성훈
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주식회사 강스템홀딩스
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to a composition for immunological disease or treatment containing stem cells or cultures thereof and a method for preparing the composition.
  • the immune system is building a defense system composed of various cells to protect the human body from internal and external pathogens, which is achieved through the specific function of each cell and signal transmission between each cell.
  • the body's immune system can be broadly divided into immune tolerance, which suppresses and regulates immunity, and immune response, which promotes immunity.
  • the two immune functions are balanced to achieve immunological homeostasis. You lose. However, for some reason, their balance is broken, resulting in immune and inflammatory diseases if the immune response is more advanced than immune tolerance.
  • Immunosuppressants for the prevention or treatment of immune diseases or inflammatory diseases include specific inhibitors and nonspecific inhibitors that inhibit only the response, and theoretically, the action of the specific inhibitor should be excellent, but nonspecific inhibitors are mainly used.
  • the most commonly used immunosuppressive agents are cyclosporine (Cyclosporine, Neoral, Cipol A), Azachioprine (Imuran), and prednisolone (a type of steroid). The three were found to have fewer side effects and the highest immunosuppressive effects when used together when used separately. Recently, various immunosuppressive agents such as FK506, RATG, OKT3, and Cellcept have been developed and used.
  • immunosuppressive agents inhibit immunity by inhibiting several processes such as phagocytosis of macrophages, antigen recognition by lymphocytes, cell division, T-cell and B-cell division, and antibody production. causess inhibition. Most of them have antitumor activity because they inhibit cell division through mediation of DNA disorders and inhibition of DNA synthesis.
  • azachioprine may inhibit bone marrow function, such as decreased white blood cell counts, anemia, and platelet reduction, and may have complications such as hair loss and fever with pancreatitis, hepatitis, and biliary retention.
  • Prednisolone one of the steroid agents, has been used first among immunosuppressants and has the broadest inhibitory effect. Increases appetite, increases muscles in the shoulders and back and temporarily gives happiness, but these steroids not only promote arteriosclerosis, but also cause high blood pressure, gastric ulcers, diabetes, growth inhibition, osteoporosis, cataracts, and glaucoma. It is a drug to do.
  • Atopic dermatitis is a recurrent, chronic allergic eczema with symptoms such as severe itching and dry skin. Atopy shows high IgE expression in blood and is characterized by an increase in eosinophils. Recently, it is estimated that atopic dermatitis occurs in about 10 to 20% of the population, but there is no clear cure, and most cases are diagnosed at a young age under 5 years. Diagnosis is made between 24 months. In the national epidemiological survey conducted by the Korean Academy of Pediatric Allergy Respiratory Diseases, the prevalence of atopic dermatitis has been gradually increasing in recent decades, and social interest is increasing. Since 50 to 75% of children with atopic dermatitis show an allergic disease progression to asthma and rhinitis, early diagnosis and management of atopic dermatitis, the starting point of allergic progression, are very important for the prevention of adult allergic progression.
  • Atopic dermatitis is caused by immunological and physiological factors such as activation of T lymphocytes, abnormalities in the cytokine system, decreased cellular mediated immunity, increased IgE, and many other factors such as skin biochemical defects.
  • a moisturizing of dried skin is required, and treatment with a drug such as steroid is typically required. If the symptoms are mild as a treatment for atopic dermatitis, moisturizers, local steroids, antihistamines, antibiotics, and local immune response modifiers are used.
  • atopic dermatitis In the case of severe atopic dermatitis, systemic steroids or immunosuppressive agents are used, and if they are used for a long time, there are side effects, and if the drug is stopped, the possibility of recurrence of the lesion is high, so safe and effective treatment is required even in the long term.
  • Patients with atopic dermatitis are more likely to have extreme epidemics that do not want to get along with others, and maladaptation in social and school life, causing serious mental, physical and social disorders such as depression, alienation, anxiety, and sleep disorders, and developing asthma and allergic rhinitis.
  • Atopic dermatitis is a major disease that causes not only skin but also immune diseases. However, atopic dermatitis is currently used to relieve symptoms. Therefore, the development of more radical and innovative therapeutics is urgently needed.
  • the present inventors have shown negative immunological characteristics with respect to hematopoietic stem cell markers or immunorejection-related markers to isolate stem cells expressing ZNF281 which have a low risk of rejection at the time of transplantation, thereby showing an effect in the treatment of atopic dermatitis. It was also confirmed that the stem cells obtained by culturing the stem cells with the addition of NOD2 agonists exhibited a superior therapeutic effect of atopic dermatitis, thereby identifying and identifying that the stem cells of the present invention are also stem cells expressing NOD2. The invention has been completed.
  • One object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating atopic dermatitis containing stem cells or cultures thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a composition for preventing or treating an immunological disease or an inflammatory disease containing a step of isolating stem cells or a culture thereof.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of immune diseases or inflammatory diseases containing stem cells or cultures thereof.
  • stem cell refers to a cell having excellent proliferative capacity and capable of differentiating into various tissues of the body.
  • culture refers to a medium containing growth factors, cytokines, chemokines, etc. secreted from cells excluding cells from the cell culture solution.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the development of atopic dermatitis by administration of the composition
  • treatment refers to any action that improves or benefits the symptoms of atopic dermatitis by administration of the composition. it means.
  • Stem cells according to the present invention is characterized by expressing the stem cell ZNF281.
  • ZNF281 is a protein encoded by the ZNF281 gene in humans, also referred to as zinc finger protein 281. It is a protein involved in electronic regulation that inhibits the transcription of many genes, including gastrin and ornithin decarboxylase. It binds to the G-rich box of the enhancer region of the gene and belongs to the krueppel C2H2-type zinc finger protein family.
  • Stem cells expressing ZNF281, an active ingredient of the composition of the present invention do not express histocompatibility antigen HLA-DR (class II), which is the most important cause of rejection in tissue or organ transplantation. It has a prophylactic or therapeutic effect.
  • the stem cells of the present invention is characterized by expressing NOD2.
  • NOD2 is largely divided into a CARD (caspase-recruitment domain) or pyrin domain which exists at the N-terminus and is involved in protein-protein interaction, and is divided into a NOD domain and a C-terminal LRR domain in the middle.
  • One of the NOD family proteins consisting of domains is a protein having two CARD domains at the N-terminus.
  • NOD1 protein having one CARD domain at the N-terminus which is called NLR (NOD like receptor), which is involved in in vivo immune response together with toll like receptor (TLR).
  • NLR NOD like receptor
  • stem cells of the present invention has at least one of the following characteristics:
  • (c) shows a cumulative population doubling level (CPDL) of 30 to 45.
  • (e) can differentiate into cells of mesoderm, endoderm and ectoderm.
  • TIMP-2 TGF- ⁇ , RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN- ⁇ , IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, Secrete at least one cytokine or chemokine selected from the group consisting of IL-13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm sTNFRI, PFGF-bb.
  • Stem cells of the present invention express Oct-4, Sox-2, Rex-1, c-myc, ZNF281 means that the undifferentiated state is maintained.
  • the stem cells of the present invention shows a cumulative population doubling level (CPDL) of 30 to 45, it can be seen that the proliferation is excellent.
  • CPDL cumulative population doubling level
  • the stem cells of the present invention exhibit negative immunological properties against CD14, CD31, CD34, CD45 and HLA-DR known as hematopoietic stem cell markers or immunorejection related markers.
  • the stem cells of the present invention can be used as cells useful for allogenic transplantation because they lack hematopoietic and immunorejection-related markers to minimize angiogenesis and rejection during transplantation.
  • Stem cells according to the present invention is characterized in that the adult human stem cells, human pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells), animal embryonic stem cells or animal adult stem cells.
  • the stem cells may be adult stem cells.
  • the term "adult stem cells" of the present invention may be mesenchymal stem cells, mesenchymal stromal cells derived from human tissues, mesenchymal stem cells derived from human tissues such as fat, bone marrow, multipotent stem cells, or amniotic epithelial cells.
  • adult stem cells are generally attracting attention because they allow them to avoid an unlimited number of sources and ethical issues that researchers face.
  • stem cells isolated from umbilical cord blood have greater advantages than other adult stem cells because, unlike bone marrow or adipose tissue, donors are not at risk of further harm.
  • the stem cells of the present invention are umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived mesenchymal stem cells, nerve-derived mesenchymal stem cells It may be a mesenchymal stem cell selected from the group consisting of skin-derived mesenchymal stem cells, amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells and placental-derived mesenchymal stem cells.
  • the term "umbilical cord blood” of the present invention refers to blood collected from a umbilical vein connecting the placenta and fetus of a mammal.
  • the umbilical cord blood can be readily collected from the umbilical vein of the donor at birth. More specifically, in the case of normal vaginal delivery, it can be collected from the umbilical vein that has been extracted out of the state in which the placenta remains in the uterus after childbirth. Alternatively, in the case of cesarean section, the placenta is also extracted from the umbilical vein after the baby is delivered out of the uterus.
  • stem cells expressing ZNF281 an active ingredient of the composition of the present invention, do not express histocompatibility antigen HLA-DR (class II), which is the most important cause of rejection in tissue or organ transplantation, there is a problem during transplantation. It is possible to minimize or minimize the immune response, such as the rejection reaction, it is possible to use not only self-derived but also allogeneic. Preferably, it may be isolated from umbilical cord blood of a mammal, including a human. Most preferably, the cord blood derived stem cells disclosed in Korean Patent Application No. 10-2009-0023821.
  • the immune disease or inflammatory disease is characterized in that the autoimmune disease, transplant rejection, arthritis, graft versus host disease, bacterial infection, sepsis or inflammation.
  • the autoimmune diseases include Crohn's disease, erythema, atopy, rheumatoid arthritis, Hashimoto's thyroiditis, pernicious anemia, Edison's disease, type 1 diabetes, lupus, chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, hypothyroidism and hypertension, scleroderma, Behcet's disease, inflammatory disease Bowel disease, multiple sclerosis, myasthenia gravis, Meniere's syndrome, Sjogren's syndrome, vitiligo, endometriosis, psoriasis, vitiligo, systemic scleroderma, asthma and ulcerative colitis do.
  • atopic dermatitis is a representative skin disease in a person with atopic allergy. Commonly referred to as chronic fever, dry skin and itching are the main symptoms. It is characterized by immunological characteristics and may be accompanied by other allergic diseases such as hives, metal allergies, asthma or allergic rhinitis, and tend to have a family history. The onset of symptoms usually occurs between 2 and 6 months of age, especially under 1 year of age, with 85% occurring within 5 years of age. It is commonly known as a disease when young, but 50% of patients disappear within two stones, but 25% of them appear in adolescence, and the remaining 25% do not go away as adults. Unbearable itching can distract you, interfere with learning, and can result in lowered grades. Other children can be hurt or bullied by teasing or bullying.
  • composition of the present invention may comprise 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 9 , preferably 1.0 ⁇ 10 6 to 1.0 ⁇ 10 8 , more preferably 1.0 ⁇ 10 7 cells per ml. .
  • compositions of the present invention can be used unfrozen or frozen for future use. If cryopreserved, standard cryopreservatives (e.g. DMSO, glycerol, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, albumin, dextran, sucrose, ethylene glycol, id erythritol, D-ribitol, D-mannitol, D- Sorbitol, i-inositol, D-lactose, choline chloride, Epilife ® Cascade Biologics) can be added to the cell population before freezing.
  • standard cryopreservatives e.g. DMSO, glycerol, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, albumin, dextran, sucrose, ethylene glycol, id erythritol, D-ribitol, D-mannitol, D- Sorbitol, i-inositol, D-lacto
  • compositions suitable for this purpose include parenteral injectables such as injectable ampoules, injectables such as infusion bags, sprays such as aerosol preparations and the like.
  • parenteral injectables such as injectable ampoules
  • injectables such as infusion bags
  • sprays such as aerosol preparations and the like.
  • the injection ampoule may be prepared by mixing with an injection solution immediately before use, and as the injection solution, physiological saline, glucose, mannitol, and Ringer's solution may be used.
  • the infusion bag can also be made of polyvinyl chloride or polyethylene and is manufactured by Baxter, Becton Dickinson, Medcep, National Hospital Products or Terumo. An injection bag can be illustrated.
  • the pharmaceutical preparation may further include one or more pharmaceutically acceptable conventional inert carriers and diluents in addition to the active ingredient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier and diluent may be biologically and physiologically friendly to stem cells and recipients to be transplanted thereof.
  • Diluents include, but are not limited to, saline, aqueous buffers, solvents and / or dispersion media.
  • a preservative, a painless agent, a solubilizer or a stabilizer may be further included, and in the case of a topical administration agent, a base, an excipient, a lubricant, or a preservative may be further included.
  • composition or pharmaceutical formulation of the present invention may be administered in the form of a mixture with or in combination with other stem cells used for transplantation and other uses, using administration methods commonly used in the art.
  • administration methods commonly used in the art.
  • the administration can be both non-surgical administration using a catheter and surgical administration methods such as injection or transplantation after dissection of the disease site, but non-surgical administration using a catheter is more preferable.
  • parenteral administration for example, in addition to direct lesions, transplantation by intravascular injection, which is a general method of hematopoietic stem cell transplantation, is also possible according to a conventional method.
  • the daily dose of the stem cells may be administered 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 10 cells / kg body weight, preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 9 cells / kg body weight divided into one or several times .
  • the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of several relevant factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the patient's weight, age and gender, and therefore, the dosage may be It is not intended to limit the scope of the present invention in terms of aspects.
  • the present invention provides a method for preparing the composition, comprising the steps of: separating stem cells; And it provides a method for producing a composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising the step of culturing the stem cells.
  • Separating the stem cells of the present invention can be carried out by any known separation method. For example, density gradient fractionation, immunoselection, and differential adhesion separation may be used.
  • stem cells expressing ZNF281 were isolated from umbilical cord blood and cultured.
  • the method for separating and culturing stem cells from the umbilical cord blood can be used in any of the existing methods including the method of Korean Patent Application No. 10-2009-0023821.
  • the step of culturing the stem cells may be further cultured by adding a NOD2 agonist.
  • agonist in the present invention generally refers to a chemical that serves to positively stimulate a receptor (receptor), also called agonists. That is, in contrast to antagonists, antagonists, agonists play a positive role, instead of interfering or playing the opposite role of common ligands.
  • ligand which generally refers to a chemical that binds to a receptor, may be used in parallel.
  • NOD2 agonist means a substance capable of binding to NOD2 receptor and activating NOD2 without limitation, and may be, for example, MDP (muramyl dipeptide).
  • the "addition and culture" of the agonist may be, for example, to culture by adding the agonist to the culture of the stem cells of the present invention.
  • the culture may be performed by adding agonists at a concentration of 1 to 100 ⁇ g / ml for 0.1 to 200 hours, more preferably 1 to 72 hours.
  • it may be to culture by replacing the medium.
  • the human-derived stem cells are treated with MDP at a concentration of 1 to 100 ⁇ g / ml for 0.1 to 200 hours.
  • MDP concentration of 1 to 100 ⁇ g / ml for 0.1 to 200 hours.
  • the NOD2 pathway may not be activated sufficiently, and treating MDP for more than 200 hours has no economic benefit, more preferably 0.1 to 200 hours, even more preferably.
  • a conventional medium known in the art to be suitable for stem cell culture can be used.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • McCoys 5A medium Eagle's basal medium
  • CMRL Medium Glasgow Minimum Essentials
  • Ham's F-12 Medium Iscove's modified Dulbecco's Medium
  • Liebovitz 'L-15 Medium RPMI 1640 Medium
  • Keratinocyte-SFM Keratinocyte serum free medium
  • the stem cell medium may be supplemented with an additive.
  • an additive e.g., neutral buffers (e.g., phosphates and / or high concentrations of bicarbonate) and protein nutrients (e.g., fetal bovine serum, horse or human serum, serum substitutes or albumin, such as serum, or essential amino acids and glutamine, etc.) in isotonic solutions.
  • neutral buffers e.g., phosphates and / or high concentrations of bicarbonate
  • protein nutrients e.g., fetal bovine serum, horse or human serum, serum substitutes or albumin, such as serum, or essential amino acids and glutamine, etc.
  • Essential amino acids e.g., fetal bovine serum, horse or human serum, serum substitutes or albumin, such as serum, or essential amino acids and glutamine, etc.
  • lipids fatty acids, cholesterol, HDL or LDL extracts of serum
  • other components found in most preservative media of this kind (such as insulin or transferrin, nucleosides or nucleotides, pyruvate salts, any ionized form or salt)
  • Sugar sources such as glucose, selenium, glucocorticoids such as hydrocortisone and / or reducing agents such as ⁇ -mercaptoethanol.
  • Antibiotics and antifungal agents may be added to prevent microbial contamination.
  • the present invention provides a method for treating atopic dermatitis, comprising the step of administering to an individual suffering from an immune disease or inflammatory disease containing the stem cells as an active ingredient.
  • the term "individual” means a mammal including a cow, a dog, a pig, a chicken, a sheep, a horse, and a human, but is not limited thereto.
  • Stem cells expressing ZNF281 isolated from human adult stem cells of the present invention was found to be effective in the prevention or treatment of atopic dermatitis similar to the case of oral administration of prednisolone currently used, and MDP, an agonist of NOD2, was identified. It was confirmed that the stem cells expressing ZNF281 of the present invention also expressed NOD2 in view of showing a superior therapeutic effect when treated and cultured stem cells.
  • stem cells expressing ZNF281 of the present invention or cultures thereof, and cultured with the addition of NOD2 agonists can be effectively used for the prevention or treatment of atopic dermatitis.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an experiment schedule of an animal experiment model. The time when the atopy-induced ointment was treated on one straight line and the time when the stem cells of the present invention were treated were shown simultaneously.
  • Figure 2 is a diagram showing a site in which the stem cell injection of the present invention. Intrasubcutaneous injection was applied to the dorsal and dorsal part of atopic dermatitis.
  • Figure 3 is a diagram showing the observation of gross lesions after stem cell administration in atopic dermatitis mouse model.
  • A is a diagram showing the gross lesions scored for each experimental group evaluated at the time of necropsy (Day 30), B is a diagram showing the observation of the gross lesions over time.
  • Figure 4 shows the histological changes after stem cell administration in atopic dermatitis mouse model.
  • A is a diagram showing the frequency of inflammatory cells by H & E staining
  • B is a diagram showing the thickness of the epithelial layer.
  • FIG. 5 is a diagram showing degranulation of mast cells after stem cell administration in atopic dermatitis mouse model.
  • A is a result of staining with toluidine blue and confirmed by confocal microscopy
  • B is a diagram showing the numerical value of degranulation of mast cells.
  • Figure 6 is a diagram showing the degranulation of mast cells in the skin tissue of atopic dermatitis induced mice injected with stem cells.
  • the skin tissues of each group were ground to extract proteins and compared with the amount of tryptase found during degranulation of mast cells.
  • Figure 7 is a diagram showing the concentration of immunoglobulin E (IgE) in serum after stem cell administration in atopic dermatitis mouse model.
  • IgE immunoglobulin E
  • Figure 8 is a diagram showing the distribution in the skin tissue of stem cells injected in vivo in atopic dermatitis induced mice.
  • mice were purchased from a central laboratory animal and only healthy animals were used for the experiment by observing general symptoms while acclimating to the laboratory for about one week. Thirty-nine males of eight weeks of age were randomly divided.
  • the polycarbonate MI cage polycarbonate MI cage, 26 ⁇ 42 ⁇ 18 cm, manufactured by Myeongjin Machinery
  • Breeding boxes were tagged with the experiment number, animal number and drug dose.
  • the feed was freely fed high pressure steam sterilized experimental animal solid feed (Purina Co., Ltd.), and the negative water was freely fed high pressure steam sterilized tap water.
  • mice atopic dermatitis-expressing mice
  • 7-week-old mice were used for the experiment at 8 weeks of age after undergoing a week-long purifying period.
  • the hair was removed to the upper part of the back of the NC / Nga mouse and the upper part of the auricle on the first induction day, and then the hair was completely removed using a hair removal cream.
  • 100 mg of atopic dermal ointment was uniformly applied to the dorsal and auricle parts using a flat bar.
  • Atopy-induced ointment used in this experiment was an ointment containing extract of American house dust mite (Dermatophagoides farina; Df), and when applied to atopic dermatitis-expressing mice (NC / Nga mice), human-like atopic lesions were detected.
  • Df American house dust mite
  • NC / Nga mice atopic dermatitis-expressing mice
  • human-like atopic lesions were detected.
  • Cord blood used to isolate hUCB-USC was provided by Boramae Hospital donated cord blood bank (Allcord). Specifically, the method of separating hUCB-USC from cord blood is as follows. First, red blood cells were removed using HetaSep TM (Stem Cell Technologies INC, Vancouver, BC), and then mononuclear cells were separated using a Ficoll gradient. The isolated mononuclear cells were cultured in a specific culture medium described in Korean Patent Application No. 10-2009-0023821 to isolate and proliferate stem cells expressing ZNF281 through continuous passage.
  • HUCB-USC expressing ZNF281 isolated and propagated in Example 3 was injected by intrasubcutaneous injection into the dorsal and auricle portions of the atopic dermatitis disease area.
  • the experimental group was configured as shown in Table 1 below.
  • HUCBUSC was also injected into the NC / Nga mice once a week for an odd-numbered Df and injected four times a day (FIG. 1).
  • MDP is a substance represented by the following Chemical Formula 1, and is a peptidoglycan, which is a component of Gram-negative and Gram-positive bacteria, which increases the expression level of USC's NOD-2 receptor and ultimately immunomodulation of USC. It is an additive to maximize the ability.
  • the negative control group (-) consisted of mice that did not induce atopic dermatitis (NC / Nga mice), and the atopic dermatitis-induced control group (Df) induced atopic dermatitis and treated nothing with atopic dermatitis (Df). Mice were composed.
  • the fibroblast control group (Fb) is a group consisting of mice that induce atopic dermatitis using atopic dermatitis and administered the same amount of fibroblasts at the same site as the cell administration site to the hUCB-USC-administered group expressing ZNF281.
  • Pretreatment hUCB-USC group induced atopic dermatitis using atopy-induced ointment and administered hUCB-USC expressing ZNF281 cultured by adding MDP to the culture medium 24 hours before cell recovery at the hUCB-USC administration site.
  • prednisolone-administered group is a group consisting of mice that induce atopic dermatitis by using atopic dermatitis and orally administer prednisolone, an immunosuppressant, once every three weeks.
  • hUCB-USC expressing ZNF281 were visually checked first to determine the relief effect. Severity of disease from 0 to 3 points (0, none; 1, mild; 2) depending on the severity of the scores of dryness, excoriation, erythema, and edema. , moderate; 3, severe). On the 4th, 11th, 18th, 24th and 30th day from the start of the experiment, the mean change of each experimental group was compared and analyzed.
  • FIG. 3 Atopic dermatitis gross lesion evaluation of each experimental group evaluated at autopsy (Day30) was significantly increased in the atopic dermatitis-induced control group compared to the negative control group, and this increase was significantly decreased in the hUCB-USC treated group expressing ZNF281. This is comparable to the experimental group administered oral administration of commercially available immunosuppressive prednisolone, and the MDP group cultured with MDP, which is a NOD2 agonist for one day, showed better effect than that.
  • the experimental group had no effect on atopic dermatitis relief (FIG. 3A). This showed a similar pattern not only at necropsy but throughout the experimental period (FIG. 3B).
  • hUCB-USC expressing ZNF281 of the present invention not only shows a therapeutic effect against atopic dermatitis, but also shows a superior therapeutic effect in the MDP group, so that hUCB-USC expressing ZNF281 of the present invention is NOD2. It was confirmed that the expression also.
  • FIG. 4 This is to confirm the difference between the control group and the ZUCF-USC-administered group expressing ZNF281 at the site of atopic dermatitis.
  • the expression of inflammatory cells in the group receiving ZNF281-expressing stem cells was compared. It was confirmed that the frequency was low (FIG. 4A), and the epithelial layer thickness was also decreased in the hUCB-USC-administered group expressing ZNF281 to the level similar to that of the PDS-administered immunosuppressive group compared to the atopic dermatitis-induced control group (FIG. 4B).
  • Atopic dermatitis is known to be caused by IgE, one of immunoglobulins, inducing degranulation of mast cells. Therefore, the degree of degranulation of mast cells at the site of onset of atopic dermatitis of the control group and the ZUCF-USC-administered group expressing ZNF281 was compared. To this end, paraffin was embedded in the skin tissue and confirmed by confocal microscopy through toluidine blue staining.
  • the serum IgE concentration increased due to atopic dermatitis induction was significantly decreased compared to the atopic dermatitis induced control group by hUCB-USC expressing ZNF281, which is similar to the prednisolone administration group (PDS), an immunosuppressive agent. Level.
  • the MDP pretreated hUCB-USC-administered group which is a NOD2 agonist, decreased to a lower level than the hUCB-USC-administered group or prednisolone-administered group.
  • CFDA-SE Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit, Invitrogen
  • hUCB-USC expressing ZNF281 administered to mice and necropsied.
  • the skin tissue was observed. Skin tissues were treated with 4% paraformaldehyde, and then frozen sections were prepared and treated.
  • In vivo distribution of hUCB-USC expressing transplanted ZNF281 by confirming the green wavelength of CFDA-SE using confocal microscope system. The location was followed up.
  • hUCB-USC expressing the transplanted ZNF281 was observed subcutaneously in atopic dermatitis lesions.
  • hUCB-USC expressing ZNF281 injected into the animal model was found to be directly involved in the atopic dermatitis reduction by distribution in the disease area.
  • Stem cells of the present invention and a method for producing the same have a negative immunological characteristic against hematopoietic stem cell markers or immunorejection-related markers, thereby reducing the risk of rejection during transplantation, stems obtained by culturing with the method of the present invention.
  • Cells have an improved effect on the prevention or treatment of immune or inflammatory diseases

Abstract

본 발명은 줄기세포 또는 이의 배양물을 함유하는 면역질환 또는 염증질환의예방 또는 치료용 조성물 및 상기 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 줄기세포 또는 이의 배양물, NOD2 아고니스트를 첨가하여 배양한 줄기세포는 아토피 피부염을 포함하는 면역 질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

줄기세포를 유효 성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 줄기세포 또는 이의 배양물을 함유하는 면역질환 또는 치료용 조성물 및 상기 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
면역시스템은 내부 및 외부의 병원성 물질로부터 인체를 보호하기 위해 다양한 세포로 구성된 방어 체계를 구축하고 있으며 이는 각각의 세포가 가진 특이적 기능 및 각 세포간의 신호 전달을 통해 이루어진다. 인체의 면역계는 면역을 억제하고 조절하는 면역 관용(tolerance)와 면역을 촉진하는 면역반응(immunity)로 크게 나눠 볼 수 있는데 이 두 가지 면역 작용이 서로 균형을 이뤄 면역학적 항상성(immunological homeostasis)이 이루어지게 된다. 그러나, 어떤 이유에서 이의 균형이 깨져 면역반응이 면역 관용보다 항진되어 있을 경우 면역 질환 및 염증 질환이 초래되게 된다.
면역 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료를 위한 면역억제제는 그 반응만을 억제하는 특이적 억제제와 비특이적 억제제가 있으며, 이론적으로 특이적 억제제의 작용이 뛰어나야 하나, 비특이적 억제제가 주로 사용된다. 임상적으로 가장 흔히 사용되는 면역억제제로는 싸이클로스포린(Cyclosporine, Neoral, Cipol A), 아자치오프린(Imuran), 프레드니솔론(일종의 스테로이드)이 있다. 위의 세가지는 함께 병용했을때가 따로 복용했을때보다 부작용이 적고 면역억제 효과도 가장 높은 것으로 판명되었다. 최근에는 FK506, RATG, OKT3, Cellcept등 여러가지 면역 억제제가 개발되어 사용되고 있다.
이들 면역억제제는 항원자극에서 항체생성에 이르는 과정 중 대식세포에 의한 항원의 탐식, 림프구 등에 의한 항원 인식, 세포분역, T-세포와 B-세포의 분열, 항체 생성 등 몇 가지 과정을 저해시킴으로써 면역억제를 야기한다. 대부분 항종양 활성을 갖고 있는데, 그 이유는 DNA 장애, DNA 합성 저해 등을 매개로 하여 세포분열을 저지하기 때문이다.
그러나, 이에 따른 대표적인 부작용으로 고혈압과 신독성(콩팥 기능이 저하됨)이 있으며 이 부작용의 발생률이 높기 때문에 사용할 때 충분히 경과를 관찰해야 하는 등의 문제가 있어 왔다. 그 외 부작용으로 드물게 떨림, 발작, 간염, 담액저류, 혈중 뇨산 증가, 근육기력 저하, 조모증(hypertrichosis), 치은비대(gingival hypertrophy)등이 있다. 흔히 쓰이는 억제제 중 아자치오프린은 백혈구 수치의 감소, 빈혈, 혈소판 감소 등 골수 기능을 억제하기도 하며 췌장염, 간염, 담즙저류와 함께 드물게 탈모, 발열등을 보이는 합병증이 있을 수 있다. 스테로이드 제제의 하나인 프레드니솔론은 면역억제제 중 가장 먼저 사용되기 시작하였으며 가장 광범위한 억제 작용을 보인다. 식욕을 증진시켜주며 어깨와 등의 근육을 증가시키고 일시적으로는 행복감을 주기도 하나 이러한 스테로이드 제제는 동맥경화증을 촉진시킬뿐만 아니라 고혈압, 위궤양, 당뇨, 성장 저해, 골다공증, 백내장, 녹내장 등을 일으키므로 주의해야 할 약물이다.
아토피 피부염(atopic dermatitis)은 심한 가려움증과 피부건조증 등의 증상을 동반하는 재발성, 만성의 알레르기성 습진을 말한다. 아토피는 혈액 내에서 높은 IgE 발현량을 나타내며 호산구의 증가와 같은 특징을 가진다. 최근 아토피 피부염은 전체 인구의 약 10 내지 20%에서 발병하고 있는 것으로 추산되고 있으나, 완치시킬 수 있는 뚜렷한 치료법이 없는 실정이고 특히 5세 이하의 어린 나이에 대부분 진단되며 이 중 50%는 6개월에서 24개월 사이에 진단된다. 대한 소아알레르기 호흡기학회에서 시행한 전국 역학 조사에서 최근 10년간 아토피 피부염의 유병률이 점차 증가하고 있어, 이에 대한 사회적 관심이 높아지고 있다. 아토피 피부염 환아의 50 내지 75%에서 천식, 비염으로 진행하는 알레르기성 질환의 경과를 보이기 때문에 알레르기로 진행의 시작점인 아토피 피부염을 조기에 진단하고 관리하는 것이 성인 알레르기 진행의 예방에 매우 중요하다.
아토피 피부염은 T 림파구의 활성화, 사이토카인 체계의 이상, 세포 매개성 면역의 감소, IgE의 증가와 같은 면역학적 이상과 생리학적 요인 그리고 피부의 생화학적 결함과 같은 많은 요소로 인해 야기된다. 이러한 아토피 피부염을 치료하기 위해서는 건조된 피부의 보습을 비롯하여 대표적으로 스테로이드와 같은 약물을 이용한 치료가 필요하다. 아토피 피부염의 치료제로서 증상이 경한 경우에는 보습제 국소 스테로이드제, 항히스타민제, 항생제 및 국소 면역반응 조절제 등을 사용한다. 중증의 아토피 피부염인 경우에는 전신 스테로이드제나 면역억제제를 사용하게 되는데, 장기간 사용할 경우 부작용이 있으며, 약 복용을 중단하면 병변의 재발 가능성이 높으므로 장기적으로 사용하여도 안전하고 효과적인 치료법이 요구된다. 아토피 피부염 환자는 타인과 어울리기 싫어하는 대인기피증과 사회와 학교생활에서의 부적응증을 갖기 쉬우며, 우울증, 소외감, 불안증, 수면장애 등 심각한 정신적, 육체적, 사회적 장애를 유발하고 천식 및 알레르기성 비염으로 발전하는 등 아토피는 피부뿐만 아니라 체내 면역질환까지 일으키는 큰 질환이지만 현재 사용되고 있는 아토피 피부염 치료제는 증상을 완화시키는 치료제이다. 따라서, 보다 근본적이며 획기적인 치료제의 개발이 절실한 상황이다.
이에 본 발명자들은 조혈모 줄기세포 마커 또는 면역거부반응 관련 마커에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타내어 이식시 거부반응의 위험이 적은 ZNF281을 발현하는 줄기세포를 분리하여 아토피 피부염의 치료에 효과를 나타냄을 확인하였으며, 또한 상기 줄기세포를 NOD2 아고니스트를 첨가하여 배양하여 얻은 줄기세포가 보다 뛰어난 아토피 피부염의 치료효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명의 줄기세포는 또한 NOD2를 발현하는 줄기세포임을 동정하고 이에 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 줄기세포 또는 이의 배양물을 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 줄기세포를 분리하는 단계 또는 이의 배양물을 함유하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 줄기세포 또는 이의 배양물을 함유하는 면역 질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "줄기세포"는 뛰어난 증식력을 가지며, 신체 여러 조직으로 분화가 가능한 세포를 의미한다.
본 발명의 용어 "배양물"은 세포배양액으로부터 세포를 제외한 세포에서 분비된 성장인자, 사이토카인, 케모카인 등을 포함한 배지를 의미한다
본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 아토피 피부염의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여로 아토피 피부염의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 의한 줄기세포는 줄기세포 ZNF281을 발현하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 용어 "ZNF281"은 인간에서 ZNF281 유전자에 의하여 코딩되는 단백질로서, zinc finger protein 281이라고도 한다. 이는 전자조절에 관여하는 단백질로 가스트린(gastrin) 및 오르니틴 디카르복실라제(ornithin decarboxylase)를 포함한 많은 유전자의 전사를 억제한다. 상기 유전자의 인핸서 영역의 G-rich 박스에 결합하며 크루펠 C2H2-형(krueppel C2H2-type) zinc finger protein 패밀리에 속한다.
본 발명의 조성물의 유효성분인 ZNF281을 발현하는 줄기세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 가장 중요한 원인인 조직적합항원 HLA-DR(class II)이 발현되지 않는 세포이므로 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 효과를 나타낸다.
바람직하게 상기 본 발명의 줄기세포는 NOD2를 발현하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 용어 "NOD2"는 N-말단에 존재하면서 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 CARD(caspase-recruitment domain) 혹은 pyrin 도메인과 중간에 NOD 도메인 그리고 C-말단의 LRR 도메인으로 구분되는 크게 3개의 도메인으로 구성되는 NOD 패밀리 단백질 중 하나로 N-말단에 두 개의 CARD 도메인을 갖는 단백질이다. 이외에 N-말단에 하나의 CARD 도메인을 갖는 NOD1 단백질이 있으며, 이를 합쳐 NLR(NOD like receptor)이라고 하며, 이는 TLR(toll like receptor)과 함께 생체 내 면역반응에 관여한다. 골수유래 대식세포, 호중구, 수지상 세포 및 소장의 파네드 세포에 분포하는 단백질로 그 분포가 NOD1보다는 한정된 곳에서 발현되는 특징이 있다. 상기 NOD2가 인식하는 아고니스트(agonist; a.k.a. 리간드) 중 가장 널리 알려진 것은 그람 음성균과 그람 양성균의 PGN 성분에 공통적으로 존재하는 MDP(muramyl dipeptide)이다.
또한 본 발명의 줄기세포는 하기 특성 중 적어도 하나의 특성을 가지고 있다:
(a) 전사조절인자인 c-myc에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타낸다.
(b) 세포외기질이 바닥에 코팅되어 부착 후 5 내지 30일 사이에 선 형태 또는 구 형태의 세포 집락을 이루면서 증식한다.
(c) 30 내지 45의 CPDL(cumulative population doubling level)을 보인다.
(d) CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나
타낸다.
(e) 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포로 분화 가능하다.
(f) TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm sTNFRI, PFGF-bb로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인을 분비한다.
본 발명의 줄기세포가 Oct-4, Sox-2, Rex-1, c-myc, ZNF281을 발현한다는 것은 미분화 상태가 유지되고 있음을 의미한다.
또한, 본 발명의 줄기세포는 30 내지 45의 CPDL(cumulative population doubling level)을 보여, 증식력이 우수함을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 줄기세포는 조혈모 줄기세포 마커 또는 면역거부반응 관련 마커로 알려진 CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타낸다. 이와 같이 본 발명의 줄기세포는 조혈 및 면역거부반응 관련 마커가 결여되어 이식시 혈관형성과 거부반응을 최소화할 수 있어 동종간 이식(allogenic transplantation)에 유용한 세포로 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 줄기 세포는 인간의 성체 줄기세포, 인간의 만능줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells), 동물의 배아줄기세포 또는 동물의 성체줄기세포인 것을 특징으로 한다.
바람직하게 상기 줄기세포는 성체줄기세포일 수 있다. 본 발명의 용어 "성체줄기세포"는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 지방, 골수 등의 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막 상피세포일 수 있다. 성체줄기세포는 일반적으로 배아줄기세포에 비해 무제한적인 소스와 연구자들이 직면할 수 있는 윤리적 문제를 피할 수 있기 때문에 주목받고 있다. 더욱이, 제대혈로부터 분리한 줄기세포는 골수나 지방조직과 달리 기증자가 추가적인 해를 입을 염려가 없기 때문에 다른 성체줄기세포들 보다 더 큰 장점을 가지고 있다.
보다 바람직하게 본 발명의 줄기세포는 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 태반 유래 중간엽 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 용어 "제대혈"은 포유류의 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액을 말한다. 상기 제대혈은 출산시 공여자의 제대정맥으로부터 용이하게 채취할 수 있다. 보다 구체적으로, 정상 질식분만(vaginal delivery)의 경우에는 출산 후 자궁내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채취할 수 있다. 또는 제왕절개의 경우에는 아기 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취한다.
본 발명의 조성물의 유효성분인 ZNF281을 발현하는 줄기세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 가장 중요한 원인인 조직적합항원 HLA-DR(class II)이 발현되지 않는 세포이므로, 이식수술시 문제가 되는 거부반응 등의 면역반응을 유발하지 않거나 최소화할 수 있어, 자가 유래는 물론 동종 유래 또한 사용할 수 있다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물의 제대혈로부터 분리된 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 대한민국 특허출원 10-2009-0023821호에 개시된 제대혈 유래 줄기세포일 수 있다.
본발명에 있어서, 상기면역질환 또는 염증질환은 자가면역질환, 이식거부, 관절염, 이식편대숙주병, 세균감염, 패혈증 또는 염증인 것을 특징으로 한다. 상기 자가면역질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨병, 제1형 당뇨, 루푸스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증, 전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 면역질환 또는 염증질환 중 "아토피 피부염(atopic dermatitis)"은 아토피 알레르기를 가진 사람에서 나타나는 대표적인 피부질환이다. 흔히, 태열이라고 불리는 만성 피부질환으로서 피부건조증 및 가려움증이 주 증상이다. 면역학적 특성을 보여 다른 알레르기 질환인 두드러기, 금속 알레르기, 천식이나 알레르기성 비염 등을 동반하는 경우가 있으며, 가족력을 띠는 경향이 있다. 증상이 나타나는 시기는 대체로 생후 2 내지 6 개월이며, 특히 1세 미만에서 가장 많이 나타나고 85%가 만 다섯 살 안에 나타난다. 보통 어릴 때 잠시 앓는 병이라고 알려져 있으나 환자의 50%는 두 돌 이내에 없어지나 25%는 청소년기까지 나타나며, 나머지 25%는 성인이 되어서도 없어지지 않고 계속된다. 참을 수 없는 가려움증으로 인하여 주의가 산만해지고 학습에 지장을 주어 성적저하 등이 생길 수 있고, 다른 아이들의 놀림이나 따돌림으로 인하여 피해의식 또는 정서적 상처를 받을 수 있다.
본 발명의 조성물은 1 ml 당 1.0×105개 내지 1.0×109개, 바람직하게는 1.0×106개 내지 1.0×108개, 보다 바람직하게는 1.0×107개의 세포를 포함 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 동결되지 않은 채 사용되거나, 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제(예를 들어 DMSO, 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i-d 에리스리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-솔비톨, i-이노시톨, D-락토스, 콜린 클로라이드, 에피라이프(Epilife®) 세포동결배지(Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1 회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합하여 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터(Baxter), 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠(National Hospital Products) 또는 테루모(Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 줄기세포 및 이를 이식받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제로는 이에 한정되지 않으나, 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있다. 이 외에도, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.
상기 줄기세포의 1일 투여량은 1.0×104 내지 1.0×1010 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×105 내지 1.0×109 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 상기 조성물을 제조하는 방법으로서, 줄기세포를 분리하는 단계; 및 상기 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 줄기세포를 분리하는 단계는 종래 알려진 어떠한 분리방법에 의해서도 수행될 수 있다. 예를 들어, 밀도차를 이용한 분리법(density gradient fractionation), 면역선택(immunoselection) 및 감별 부착 분리법(differential adhesion separation) 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 제대혈로부터 ZNF281을 발현하는 줄기 세포를 분리하여 배양하였다. 상기 제대혈로부터 줄기세포를 분리 배양하는 방법은 대한민국 특허출원 10-2009-0023821호의 방법을 비롯하여 기존에 사용되어 온 방법은 모두 사용할 수 있다.
상기 줄기세포를 배양하는 단계는 추가적으로 NOD2 아고니스트를 첨가하여 배양할 수 있다.
본 발명의 용어 "아고니스트(agonist)"는 일반적으로 수용체(receptor)를 긍정적으로 자극하는 역할을 하는 화학물질을 뜻하는 것으로, 효능제라고도 불린다. 즉, 안타고니스트(antagonist), 길항제와는 반대로, 일반적인 리간드를 방해하거나 반대의 역할을 수행하는 대신, 아고니스트는 긍정적인 역할을 수행한다. 본 발명에서는 일반적으로 수용체와 결합하는 화학물질을 뜻하는 용어인 "리간드(ligand)"와 병행하여 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "NOD2 아고니스트"는 NOD2 수용체에 결합하여 NOD2를 활성화시킬 수 있는 물질은 제한 없이 의미하나, 그 예로, MDP(muramyl dipeptide)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 아고니스트를 "첨가하여 배양"은 예를 들어, 본 발명의 줄기세포의 배양액에 아고니스트를 첨가하여 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 100μg/ml 농도로 0.1 내지 200 시간 동안, 더욱 바람직하게는 1 내지 72 시간 동안 아고니스트를 첨가하여 배양하는 것일 수 있다. 또한, 아고니스트를 첨가하여 배양한 후, 배지를 교체하여 배양하는 것일 수 있다.
바람직하게 인간 유래 줄기세포에 MDP를 1 내지 100 μg/ml 농도로 0.1 내지 200 시간 동안 처리하는 것이다. 0.1 시간 보다 짧은 시간 동안 MDP를 처리하는 경우, NOD2 경로가 충분히 활성화되지 못할 수 있으며, 200시간 이상 MDP를 처리하는 것은 경제적으로 큰 이익이 없으므로, 더 바람직하게는 0.1 내지 200 시간, 더 더욱 바람직하게는 1 내지 72 시간, 가장 바람직하게는 24시간 동안 MDP를 첨가하여 배양할 수 있다.
상기 줄기세포의 배양에 사용되는 배지로서는 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 예를 들면, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), McCoys 5A 배지, Eagle's basal 배지, CMRL 배지, Glasgow 최소 필수 배지, Ham's F-12 배지, Iscove's modified Dulbecco's 배지, Liebovitz' L-15 배지, RPMI 1640 배지 또는 Keratinocyte-SFM(Keratinocyte serum free medium)을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 Dmedia(Gibco)를 사용할 수 있다.
상기 줄기세포 배지는 첨가제로 보충될 수 있다. 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대, 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면, 소태아혈청, 말 또는 사람혈청, 혈청대체물 또는 알부민 등의 혈청, 또는 글루타민 등의 필수 아미노산 및 비필수 아미노산)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-머캅토에탄올)을 함유할 수 있다. 미생물의 오염을 막기 위한 항생제 및 항진균제 등을 첨가할 수도 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 면역질환 또는 염증질환 발병 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 아토피 피부염의 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "개체"란 소, 개, 돼지, 닭, 양, 말, 인간을 포함한 포유 동물을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 인간 성체줄기세포로부터 분리된 ZNF281을 발현하는 줄기세포는 현재 사용되고 있는 프레드니솔론을 경구투여시킨 경우와 유사하게 아토피 피부염의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였고, NOD2의 아고니스트인 MDP를 처리하여 배양한 줄기세포를 처리하였을 때 보다 뛰어난 치료효과를 보이는 것으로 미루어 본 발명의 ZNF281을 발현하는 줄기세포는 또한 NOD2를 발현하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 ZNF281을 발현하는 줄기세포 또는 이의 배양물, NOD2 아고니스트를 첨가하여 배양한 줄기세포는 아토피 피부염의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 동물실험모델의 실험 일정을 나타낸 도이다. 하나의 직선상에 아토피 유발 연고를 처리한 시기와 본 발명의 줄기세포를 처리한 시기를 동시에 나타내었다.
도 2는 본 발명의 줄기세포를 주입한 부위를 나타낸 도이다. 아토피 피부염 발병부위인 등쪽, 귓바퀴 부분에 피하주사방식(intrasubcutaneous injection)으로 주입하였다.
도 3은 아토피 피부염 생쥐모델에서 줄기세포 투여 후 육안병변 관찰결과를 나타낸 도이다. A는 부검시(Day 30) 평가된 각 실험군에 대한 육안병변을 점수화하여 나타낸 도이고, B는 시간에 따른 육안 병변 관찰결과를 나타낸 도이다.
도 4는 아토피 피부염 생쥐모델에서 줄기세포 투여 후 조직학적 변화를 나타낸 도이다. A는 H&E 염색으로 염증세포의 빈도를 나타낸 도이고, B는 상피층의 두께를 나타낸 도이다.
도 5는 아토피 피부염 생쥐모델에서 줄기세포 투여 후 비만세포의 탈과립화를 나타낸 도이다. A는 톨루이딘 블루로 염색하여 공초점 현미경으로 확인한 결과이고, B는 비만세포의 탈과립화를 수치화하여 나타낸 도이다.
도 6은 줄기세포를 주입한 아토피 피부염 유발 마우스의 피부조직 내 비만세포의 탈과립화를 나타낸 도이다. 각 군의 피부조직을 분쇄하여 단백질을 추출하고 비만세포의 탈과립화시 발견되는 트립타아제의 양을 비교하였다.
도 7은 아토피 피부염 생쥐모델에서 줄기세포 투여 후 혈청 내 면역글로불린 E(IgE)의 농도를 나타낸 도이다.
도 8은 아토피 피부염 유발 마우스에서 생체 내 주입된 줄기세포의 피부조직 내 분포를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험동물
제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 아토피 피부염에 대한 유효성 평가를 위하여 NC/Nga 아토피 피부염 발현 생쥐를 이용하여 실험을 진행하였다. 7주령의 수컷 BALB/cAnNCrjBgi-nu 마우스를 중앙실험동물로부터 구입하였고, 약 1주일간 실험실에 순화시키면서 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 실험에 사용하였다. 8주령의 수컷 39마리를 무작위법으로 군을 분리하였다. 본 실험은 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수 10 내지 12회/hr, 조명시간 12시간(07:00-19:0), 조도 150 내지 200 룩스로 설정된 서울대학교 수의과대학 실험실 내 헤파필터가 장착된 MI 선반에서 실시하였다. 순화 및 실험기간 중에는 중합탄산 MI 상자(polycarbonate MI cage, 26×42×18 cm, 명진기계 제작)에서 7 마리/상자의 밀도로 사육하였다. 사육상자에는 실험번호, 동물번호 및 약물 투여량을 기입한 태그를 부착하였다. 순화기간 동안 사료는 고압 증기 멸균된 실험동물용 고형사료((주) 퓨리나)를 자유 섭취시켰으며, 음수는 고압 증기 멸균된 상수도를 자유 섭취시켰다.
실시예 2: 아토피 피부염 질환 동물모델 확립
실험에 사용한 동물은 아토피 피부염 발현 생쥐(NC/Nga 마우스)로서 7주령의 마우스를 구입하고 일주일 간의 순화기간을 거친 후 8주령에서 실험에 사용하였다. 아토피 피부염을 유발시키기 위해 첫 번째 유발일에 NC/Nga 마우스의 등쪽, 귓바퀴 윗부분까지 최대한 제모기로 제모한 후 제모크림을 이용하여 털을 완전히 제거하였다. 제모크림 제거 후 평편한 막대를 이용하여 아토피 유발연고 100 mg을 등쪽, 귓바퀴 부분에 균일하게 도포하였다. 두 번째 유발일부터는 NC/Nga 마우스의 등쪽, 귓바퀴 윗부분까지 새로 자란 털을 최대한 제모기로 제거한 후, 피부의 지방성분을 제거하고 큐티클막을 파괴시키기 위해 도포부위에 4% SDS(sodium dodecyl sulfate) 수용액(150 μl)을 분무하고 헤어드라이기의 시원한 바람으로 건조시킨 후 약 2 내지 3시간 동안 완전히 건조시키고 평편한 막대를 이용하여 아토피 유발연고 100 mg을 등쪽, 귓바퀴 부분에 균일하게 도포하였다. 아토피 유발연고를 주 2회씩 3주간총 6회 도포하여 아토피 피부염 질환 마우스 모델을 확립하였다. 본 실험에 사용된 아토피 유발연고는 미국 집먼지 진드기(American house dust mite; Dermatophagoides farina; Df) 추출물이 함유된 연고제제로 아토피 피부염 발현 생쥐(NC/Nga 마우스)에 도포하였을 경우, 인간과 유사한 아토피 병변을 나타내는 것으로 보고되었다(Suto, H. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 1999, 120 Suppl. 1: 70-75; Vestergaard, C. et al., Mol. Med. Today, 2000, 6(5): 209-210; Matsuda, H. et al., Int. Immunol., 2997, 9(3): 461-466).
실시예 3: hUCB-USC(human umbilical cord blood-universal stem cell)의 분리, 배양 및 증식
hUCB-USC를 분리하기 위하여 사용한 제대혈은 보라매병원 공여 제대혈 은행(Allcord)으로부터 제공받았다. 구체적으로 제대혈에서 hUCB-USC를 분리하는 방법은 다음과 같다. 우선, HetaSepTM(Stem Cell Technologies INC, Vancouver, BC)을 이용하여 적혈구를 제거한 후, 피콜 구배(Ficoll gradient)를 이용하여 단핵세포층(mononuclear cells)을 분리하였다. 분리한 단핵세포는 대한민국 특허출원 10-2009-0023821호에 기재된 특정 배양배지에 배양하면서 지속적인 계대배양을 통하여 ZNF281을 발현하는 줄기세포를 분리, 증식시켰다.
실시예 4: hUCB-USC의 이식
상기 실시예 3에서 분리하여 증식시킨 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC를 아토피 피부염 병부위인 등쪽, 귓바퀴 부분에 피하주사방식(intrasubcutaneous injection)으로 주입하였다. 실험군은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 구성하였다. 또한 hUCBUSC를 NC/Nga 마우스에 주 1회씩 홀수 번째 Df 도포한 다음 날 총 4회 주사하였다(도 1). 실험군 중 MDP 전처치 hUCB-USC 투여군은 세포 투여 1일 전 본 발명의 hUCB-USC의 배양액에 10 μg/ml의 MDP(muramyl dipeptide)를 첨가하여 24시간 배양한 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC를 처리한 군으로써 상기 MDP는 하기 화학식 1로 표시되는 물질로서, 통상적으로 그람음성과 그람양성 박테리아의 구성성분인 펩티도글리칸으로 USC의 NOD-2 수용체의 발현양을 증가시키고 궁극적으로 USC의 면역조절능력을 극대화시키기 위한 첨가제이다.
표 1
Figure PCTKR2013001435-appb-T000001
화학식 1
Figure PCTKR2013001435-appb-C000001
음성대조군(-)은 아토피 피부염을 유발하지 않은 생쥐(NC/Nga 마우스)들로 구성하였고, 아토피 피부염 유발 대조군(Df)은 아토피 유발연고(Df)를 이용하여 아토피 피부염을 유발시키고 아무것도 처치하지 않은 생쥐들로 구성하였다. 또한 섬유아세포 대조군(Fb)은 아토피 유발연고를 이용하여 아토피 피부염을 유발시키고 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC 투여군에 세포투여 위치와 동일한 부위에 동량의 섬유아세포를 투여한 생쥐들로 구성한 군이고, MDP 전처치 hUCB-USC 투여군(MDP)은 아토피 유발연고를 이용하여 아토피 피부염을 유발시키고 hUCB-USC 투여 위치에 세포 회수 24시간 전에 배양액에 MDP를 첨가하여 배양한 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC를 투여한 생쥐들로 구성한 군이며, 마지막으로 프레드니솔론 투여군(PDS)은 아토피 유발연고를 이용하여 아토피 피부염을 유발시키고 3주간 하루에 한번씩 면역 억제제인 프레드니솔론(prednisolone)을 경구투여한 생쥐들로 구성한 군이다.
실시예 5: 육안병변 평가
아토피 피부염 유발 마우스 모델에 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC를 주입 후 우선 육안으로 병변을 확인하여 구제 효과를 판정하였다. 질병의 정도를 각질생성(dryness), 찰과(excoriation), 홍반(erythema), 부종(edema)의 점수를 증상에 정도에 따라 각각 0점에서 3점까지(0, none; 1, mild; 2, moderate; 3, severe) 부여한 후 그 수치를 합산하여 평가하였다. 실험시작으로부터 Day 4, 11, 18, 24, 30일에 각 실험군의 평균값으로 실험군 간의 유의적 변화를 비교분석하였다.
상기 실험 결과를 도 3에 나타내었다. 부검시(Day30) 평가된 각 실험군의 아토피 피부염 육안병변 평가는 음성 대조군에 비해 아토피 피부염 유발 대조군에서 현저히 증가하였고, 이러한 증가는 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC 처리군에서 유의하게 감소하였다. 이는 상용화되고 있는 면역억제제인 프레드니솔론을 경구투여한 실험군과 비교할 만한 정도이며 하룻동안 NOD2 아고니스트인 MDP를 첨가하여 배양한 MDP군에서는 이보다 더 뛰어난 효과를 나타냄을 확인하였다.이에 반해 섬유아세포를 투여한 실험군은 아토피 피부염 완화에 아무런 영향을 주지 못하였다(도 3A). 이는 부검시뿐 아니라 실험기간 전반에 걸쳐 유사한 패턴을 나타내었다(도 3B). 이러한 실험 결과는 본 발명의 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC 자체로서 아토피 피부염에 대한 치료 효과를 나타낼 뿐 아니라, MDP군에서 보다 뛰어난 치료효과를 나타내는 것으로 미루어 본 발명의 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC는 NOD2도 발현하는 것을 확인하였다.
실시예 6: 조직검사
실험시작 30일 후(Day30) 실험동물을 안락사시키고, 부검시 아토피 피부염 병변 조직 부위를 확보하고 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 조직을 고정시킨 후 파라핀으로 포매하여 H&E(hematoxylin & eosin) 및 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색시키고 공초점현미경 시스템을 이용하여 분석하였다.
상기 실험 결과를 도 4에 나타내었다. 이는 대조군과 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC 투여군이 아토피 피부염 발병 부위에서 어떠한 차이를 나타내는지를 확인하기 위한 것으로, 일반적인 H&E 염색을 비교하였을 때, ZNF281을 발현하는 줄기세포를 투여한 그룹에서 염증세포의 발현 빈도가 낮았으며(도 4A), 상피층 두께 또한 아토피 피부염 유발 대조군에 비해 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC 투여군에서 면역억제제인 PDS 투여군과 유사한 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4B).
실시예 7: 비만세포 탈과립화 검사
아토피 피부염은 면역글로불린 중 하나인 IgE가 비만세포의 탈과립화를 유도하여 유발되는 것으로 알려져 있다. 따라서 대조군과 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC투여군의 아토피 피부염 발병 부위에서 비만세포의 탈과립화 정도를 비교하여 확인하였다. 이를 위하여, 피부조직을 파라핀 포매한 후 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색법을 통하여 공초점 현미경으로 확인하였다.
그 결과, 아토피 피부염 유발 대조군에 비해 ZNF281을 발현하는 hUBC-USC 투여군에서 비만세포 탈과립화가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 5). 또한, 각 실험군의 피부조직을 분쇄하여 단백질을 추출해 낸 후, 비만세포의 탈과립화 현상에서 발견되는 트립타아제의 발현량을 비교 분석한 결과 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC 투여군에서 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).
실시예 8: 혈청 내 IgE 농도 평가
실험시작 30일 후(Day30) 실험동물을 안락사시키고, 부검시 채혈한 혈청에 대해 Opt EIA Mouse Set(BD Bioscience, Mississauga, Canada)를 이용하여 피부염의 Th2 면역반응의 대표적인 지표인 혈청 내 면역글로불린 E(IgE) 수치를 비교하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염 유발로 증가된 혈청 내 IgE 농도는 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC 투여로 아토피 피부염 유발대조군에 비해 유의적으로 감소하였으며, 이는 면역억제제인 프레드니솔론 투여군(PDS)과 비슷한 수준이었다. 한편, NOD2 아고니스트인 MDP 전처치 hUCB-USC 투여군에서는 hUCB-USC 투여군이나 프레드니솔론 투여군보다도 더 낮은 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 세포 추적 시험
세포 투여시 동물 체내에서 이식된 세포의 분포여부를 확인하기 위하여 미리 CFDA-SE(Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit, Invitrogen)를 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC에 표지한 후 마우스에 투여하고 부검을 실시하여 피부조직을 관찰하였다. 피부조직은 채취 후 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 냉동절편을 제조하여 처리하였으며, 공초점현미경 시스템을 이용하여 CFDA-SE의 녹색파장을 확인함으로써 이식된 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC의 생체 내 분포 위치를 추적 분석하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 이식된 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC는 아토피 피부염 병변 피하에서 관찰되는 것을 확인하였다. 즉, 동물모델에 주입한 ZNF281을 발현하는 hUCB-USC는 질병부위에 분포하여 아토피 피부염 완화에 직접 관여하는 것으로 확인되었다.
<데이터의 통계처리>
실험에서 나온 데이터의 통계학적 분석을 위하여 일방(one-way) ANOVA를 실시하여 p=0.05 수준에서 실험군 간의 유의성을 검정하고 유의성이 인정되면, Dunnett의 t-테스트를 시행하여 대조군과 실험군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다(p＜0.05).
본 발명의 줄기세포와 그 제조방법은 조혈모 줄기세포 마커 또는 면역거부반응 관련 마커에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타내어 이식시 거부 반응의 위험이 적으며, 본 발명의 제조방법으로 배양해 얻은 줄기세포는 면역 질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료에 향상된 효과를 나타낸다

Claims (12)

  1. 줄기세포를 유효 성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 ZNF281을 발현하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 NOD2를 발현하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 하기 특성 중 적어도 하나의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물:
    (a) 전사조절인자인 c-myc에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
    (b) 세포외기질이 바닥에 코팅되어 부착 후 5 내지 30일 사이에 선 형태 또는 구 형태의 세포 집락을 이루면서 증식함;
    (c) 30 내지 45의 CPDL(cumulative population doubling level)을 보임;
    (d) CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타냄;
    (e) 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포로 분화 가능함; 또는
    (f) TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm sTNFRI, PFGF-bb로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인을 분비함.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 인간의 성체줄기세포, 인간의 만능줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells), 동물의 배아줄기세포 또는 동물의 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포인 것인 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 태반 유래 중간엽 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 중간엽 줄기세포인 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 면역질환 또는 염증질환은 자가면역질환, 이식거부, 관절염, 이식편대숙주병, 세균감염, 패혈증 또는 염증인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 의한 줄기세포를 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 줄기세포를 배양하는 단계;를 포함하는, 제1항에 의한 조성물의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 줄기세포를 배양하는 단계는 추가적으로 NOD2 아고니스트를 첨가하여 배양하는 것인 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 NOD2의 아고니스트의 농도는 배지에 대하여 1 내지 100㎍/ml이며, 첨가하여 배양하는 시간은 0.1 내지 200시간인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018038575A1 (ko) * 2016-08-26 2018-03-01 연세대학교 산학협력단 중간엽 줄기세포 유래 분비 단백체를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 치료 방법
EP4058043A4 (en) * 2019-11-12 2023-09-06 Orchard Therapeutics (Europe) Limited COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING OR PREVENTING CROHN’S DISEASE

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090246181A1 (en) * 2008-03-28 2009-10-01 Masahiko Kuroda Therapeutic composition for atopic dermatitis
US20100183571A1 (en) * 2005-10-13 2010-07-22 Anthrogenesis Corporation Treatment of multiple sclerosis using placental stem cells
KR20100104385A (ko) * 2009-03-17 2010-09-29 차의과학대학교 산학협력단 중간엽 줄기세포를 포함하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물
US20100247577A1 (en) * 2007-10-17 2010-09-30 Txcell Tr1 cells, mesenchymal stem cells and uses thereof
KR20100125961A (ko) * 2009-05-22 2010-12-01 서울대학교산학협력단 제대혈 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제용 조성물
KR20120018724A (ko) * 2010-08-23 2012-03-05 주식회사 강스템홀딩스 Ｎｏｄ２의 아고니스트를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100183571A1 (en) * 2005-10-13 2010-07-22 Anthrogenesis Corporation Treatment of multiple sclerosis using placental stem cells
US20100247577A1 (en) * 2007-10-17 2010-09-30 Txcell Tr1 cells, mesenchymal stem cells and uses thereof
US20090246181A1 (en) * 2008-03-28 2009-10-01 Masahiko Kuroda Therapeutic composition for atopic dermatitis
KR20100104385A (ko) * 2009-03-17 2010-09-29 차의과학대학교 산학협력단 중간엽 줄기세포를 포함하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20100125961A (ko) * 2009-05-22 2010-12-01 서울대학교산학협력단 제대혈 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제용 조성물
KR20120018724A (ko) * 2010-08-23 2012-03-05 주식회사 강스템홀딩스 Ｎｏｄ２의 아고니스트를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018038575A1 (ko) * 2016-08-26 2018-03-01 연세대학교 산학협력단 중간엽 줄기세포 유래 분비 단백체를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 치료 방법
EP4058043A4 (en) * 2019-11-12 2023-09-06 Orchard Therapeutics (Europe) Limited COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING OR PREVENTING CROHN’S DISEASE

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