WO2015142061A1 - 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 신경세포에서 염증에 의한 세포의 사멸을 억제하고, 뇌 염증성 질환 동물모델에서 생존률을 증가시키며, 부종 등 염증 반응으로 인한 뇌 손상 및 염증성 사이토카인 수치를 현저하게 감소시키는 등 우수한 치료 효과를 가지고 있어, 뇌 염증성 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 조성물

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 줄기세포는 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있으며, 세포학적 유래에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 분류할 수 있다. 배아 줄기세포는 착상 전 수정란이나 발생중인 태아 생식기 조직 등에서 유래하는 반면, 성체 줄기세포는 성체 내에서 존재하는 각 기관, 예를 들면 골수, 뇌, 간, 췌장 등에서 유래한다.

만능 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로, 난자와 정자의 수정 이후 8 세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4~5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하고, 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.

다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며, 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다. 성체 줄기세포는 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 채취, 줄기세포로 발전시킨 것으로 특정 조직으로만 분화되는 특징이 있다. 그러나 최근에는 성체 줄기세포를 이용하여 간세포 등 각종 조직으로 분화시키는 실험이 성공을 거두고 있어 주목된다.

줄기세포는 자기 재생(self-renewing), 분화, 영구성(immortal) 등의 특징이 있으며, 다양한 조직으로부터 얻을 수 있는 성체 줄기세포는 일반적으로 배아 줄기세포에 비해 무제한적인 소스와 연구자들이 직면할 수 있는 윤리적 문제를 피할 수 있기 때문에 널리 연구에 이용되고 있다.

최근에는 줄기세포를 뇌경색, 외상성 신경손상, 근골격계 질환 등 다양한 질환에 적용하여 전임상, 임상 연구가 시도되고 있다. 그러나 현재 기술적인 수준은 단순한 줄기세포의 추출 및 배양/증식과 이를 주입하는 정도에 그치고 있으며, 최근까지의 임상 연구 결과 이러한 줄기세포 치료는 아직 뚜렷한 효과를 보이지 못하고 있는 것으로 알려졌다. 이에 치료 효과를 증진하기 위하여 다양한 유전자 조작 줄기세포를 이용한 연구가 진행되고 있으나, 유전자 조작을 이용한 세포 치료는 윤리적인 문제 때문에 인체에서 적용하기 어려운 한계점이 있다.

그 외에도 줄기세포를 이용한 치료 방법을 임상에 적용하는데 몇 가지 문제점이 있다. 예를 들어, 줄기세포가 조직에 생착한 다음 종괴 형성의 위험성이 있으며, 줄기세포 자체의 큰 크기로 인해 동맥폐색을 유발하여 뇌경색을 초래할 가능성이 있고, 급성기와 같이 뇌-혈관장벽이 열린 상태에서는 뇌 내로 이동이 용이하나 만성기에서는 큰 크기로 인해 이동에 제한이 있다.

한편, 엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100 nm인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것이 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려졌다. 특히, 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵 성분을 함유하고 있어 세포 간 커뮤니케이션 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 줄기세포에 비해 동물 혈청을 상대적으로 적게 함유하고 있어 동물 혈청 감염에 의한 증상(zoonosis)의 위험성 역시 배재할 수 있다. 이러한 엑소좀의 특성을 고려할 때 엑소좀을 이용한 세포치료법은 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 패러다임이 될 것으로 기대된다.

한편, 뇌 염증성 질환이란 특정 원인에 의해 뇌에 발생하는 염증성 질환을 의미하는 것으로, 뇌염, 뇌수막염, 수막뇌염 등을 모두 포함하는 개념이다. 뇌염이란 뇌 실질의 염증성 질환을 총칭하는 말로서 뇌를 싸고 있는 뇌수막에 생기는 염증(뇌수막염)과는 구별되는 질환이다. 뇌수막염과 뇌염이 함께 있는 경우는 이를 수막뇌염이라고 한다. 뇌염은 원인에 따라 감염성, 혈관염성, 종양성, 화학성, 특발성 등으로 크게 분류할 수 있으며, 각각 세부 항목에 따라 구체적인 병인에 대한 뇌염으로 다시 분류를 할 수 있다. 또한 질환의 시간적 경과에 따라 급성, 아급성, 만성 뇌염으로 분류하기도 한다. 현재까지 뇌 염증성 질환의 치료를 위한 방안으로 항생제를 이용하고 있으나, 항생제 치료에 의해 원인균이 치료된다 하더라도 심각한 뇌 손상, 뇌 수두증, 난청, 간질 등의 부작용을 일으키고 있어, 이에 대한 새로운 치료법의 개발이 요구되고 있다. 그러나, 현재까지 줄기세포 유래 엑소좀을 이용한 뇌 염증성 질환의 치료에 대해서는 체계적인 연구가 미비한 실정이다.

이에 본 발명자들은 새로운 뇌 염증성 질환의 치료제를 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, 줄기세포 유래 엑소좀이 신경세포에서 염증에 의한 세포의 사멸을 억제하고, 뇌 염증성 질환 동물모델에서 우수한 치료 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 신경세포에서 염증에 의한 세포의 사멸을 억제하고, 뇌 염증성 질환 동물모델에서 생존률을 증가시키며, 부종 등 염증 반응으로 인한 뇌 손상 및 염증성 사이토카인 수치를 현저하게 감소시키는 등 우수한 치료 효과를 가지고 있어, 뇌 염증성 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 트롬빈 처리에 의해 줄기세포에서 엑소좀이 분비되는 과정을 TEM 이미지 분석을 통해 확인한 도이다 (좌: 트롬빈 처리 전, 우: 트롬빈 처리 후).

도 2는 본 발명에서 분리한 줄기세포 유래 엑소좀에서 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9가 정상적으로 발현되는지를 확인한 도이다.

도 3은 신경세포에 LPS를 처리하였을 때, LPS의 처리 농도에 따른 신경 세포의 생존능을 나타낸 도이다.

도 4는 신경세포에 LPS를 처리한 후, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀을 처리하였을 때, 신경 세포의 생존능을 나타낸 도이다.

도 5는 뇌 염증성 질환 동물모델을 이용한 실험 기간 동안 생존률을 나타낸 도이다.

도 6은 뇌 염증성 질환 동물모델을 이용한 실험 종료 후, 뇌 무게를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 7은 뇌 염증성 질환 유도 1일 및 6일 후, 뇌의 MRI 촬영 결과 및 뇌 손상 부위/전체 뇌 부위의 변화를 나타낸 도이다.

도 8은 뇌 염증성 질환 동물모델에서 줄기세포 유래 엑소좀 투여 여부에 따른 뇌 조직 내 염증성 사이토카인의 발현 정도를 나타낸 도이다.

도 9는 뇌 염증성 질환 동물모델에서 줄기세포 유래 엑소좀 투여 여부에 따른 뇌 조직 내 단백질의 발현 정도를 나타낸 도이다.

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 줄기세포란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다.

본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 엑소좀(exosome)은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미한다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다.

본 발명에서 뇌 염증성 질환은 뇌에 발생하는 모든 염증성 질환을 총칭하는 것으로, 뇌염, 뇌수막염, 수막뇌염을 포함하며, 바람직하게는 뇌수막염이고, 더욱 바람직하게는 세균 감염성 뇌수막염이다.

상기 뇌수막염은 원인에 따라 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다.

상기 바이러스성 뇌수막염에는 단순 포진 바이러스, 아르보바이러스, 수두대상포진 바이러스, 엡스테인바 바이러스, 거대세포 바이러스, 일본 뇌염 바이러스 등에 의한 뇌수막염이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

상기 비바이러스성 뇌수막염에는 세균(예를 들어, 헤모필루스 인플루엔자, 네이세리아 뇌염균, 페렴구균. 연쇄상구균, 포도상구균, 대장균, 연쇄상구균 등), 기생충(예를 들어, 낭미충, 톡소플라스마), 곰팡이균, 원충류(예를 들어, 아메바 등) 등에 의한 뇌수막염이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에서는 줄기세포 유래 엑소좀이 신경세포에서 염증에 의한 세포의 사멸을 억제하고, 뇌 염증성 질환 동물모델에서 생존률을 증가시키며, 부종 등 염증 반응으로 인한 뇌 손상 및 염증성 사이토카인 수치를 현저하게 감소시키는 등 뇌 염증성 질환에 대한 우수한 치료 효과가 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌 염증성 질환의 치료를 위한 의약품으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 줄기세포 유래 엑소좀과 함께 뇌 염증성 질환의 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 줄기세포 유래 엑소좀과 함께 엑소좀 내부 물질을 더 함유할 수 있다.

상기 엑소좀 내부 물질은 엑소좀이 유래한 조직 또는 세포에서 유래한 단백질, 지질, mRNA, microRNA 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 개체의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 투여는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 내, 혈관 내(정맥, 동맥 등), 근육 내, 피하, 자궁 내 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 개체의 뇌실 내에 직접 생착 또는 이식하는 것이나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 조성물은 뇌 염증성 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 줄기세포 유래 엑소좀의 분리

줄기세포 유래 엑소좀을 분리하기 위하여, 초원심분리기(Ultracentrifuge)를 이용하였다. 보다 구체적으로, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 배양배지에 1×10⁵세포/ml의 농도가 되게 희석한 후, 60 mm 배양접시에 3 ml씩 분주하고 1주일간 배양하였다. 배양접시에 줄기세포가 가득 증식된 것을 확인한 후, 50 U/ml 농도의 트롬빈(thrombin)이 희석되어있는 배양배지로 교체하고, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 2 ml 원심 분리 튜브에 나누어 담고, 4℃, 10000 g에서 30분간 원심분리한 후, 상층액을 새 튜브에 옮겨 세포 부스러기(debris)를 제거하였다. 상기 상층액을 다시 4℃, 100,000 g에서 2시간 동안 초원심분리하였으며, 상층액을 제거하고 최종적으로 엑소좀을 분리하였다(최종 농도 15 mg/ml).

줄기세포 유래 엑소좀의 분비 과정을 TEM 이미지를 통해 확인하였으며, 상기 과정을 통해 분리한 엑소좀에서 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9(System Bioscience, Mountain View, CA, USA)의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 그 결과를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 트롬빈 처리로 인해 중간엽 줄기세포에서 엑소좀이 분비됨을 확인하였다.

또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 분리된 줄기세포 유래 엑소좀은 정상적으로 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9를 발현하고 있음을 확인하였다.

실시예 2. in vitro 에서 줄기세포 유래 엑소좀의 신경세포 보호 효과 검증

상기 실시예 1에서 수득한 줄기세포 유래 엑소좀의 신경 세포 보호 효과를 검증하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 임신 주령 18.5일이 된 백서에서 태아를 꺼내 대뇌 피질을 분리한 후, 1차 교세포 및 신경 세포와 함께 7일간 배양하였다. 상기 세포에 LPS(lipopolysaccharides)를 농도별로 처리한 후 세포 사멸 정도를 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, LPS가 10 ㎍/ml의 농도일 때, 약 40%의 신경세포가 사멸함을 확인하였으며, 이 후 상기 농도 조건으로 처리한 신경세포를 뇌 염증 세포 모델로 이용하였다.

다음으로 상기와 같이 LPS를 10 ㎍/ml의 농도로 처리한 신경세포에 상기 실시예 1에서 수득한 줄기세포 유래 엑소좀을 15 ㎍씩 처리한 후, cell count kit(Dojindo, Kumamoto, Japan)를 이용하여 세포 생존능을 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 세포 사멸이 유도된 신경세포에 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀을 처리할 경우, 신경세포의 사멸 정도가 현저하게 억제되됨을 확인하였으며, 이를 통해 줄기세포 유래 엑소좀의 신경세포 보호 효과를 확인하였다.

실시예 3. in vivo 에서 줄기세포 유래 엑소좀의 뇌 염증성 질환의 치료 효과 검증

3-1. 세균감염성 뇌수막염 동물 모델의 디자인

세균감염성 뇌수막염 동물 모델을 만들기 위해, 생후 10일 된 신생 백서를 흡입 마취한 후, 스테레오텍식 프레임(stereotaxic frame)을 이용하여 오른쪽 뇌실에 1×10³ CFU(colony forming unit)의 E. coli(Escherichia coli) (10 ul)를 31 gauze 주사기로 60초에 걸쳐서 천천히 투여하고, 항생제(Ampicilline, 200 mg/kg)를 12시간 간격으로 2일간 투여하였다. 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 뇌수막염 치료 효과를 확인하기 위해, 모델링(세균감염성 뇌수막염 유발) 1일 후인, 생후 11일(P11) 째에 상기 실시예 1에서 수득한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 (20 ㎍)을 10 ul PBS에 희석한 후, 일산화질소(NO) 흡입 마취 하에 스테레오텍식 프레임을 이용하여, 실험군(MEN+MSC exosome) 백서의 오른쪽 뇌실 내로 천천히 투여하였다. 뇌수막염 대조군(MEN)의 경우 생리식염수를 백서의 오른쪽 뇌실 내에 투여하였으며, 비교군(MEN+fibroblast)에는 섬유아세포 유래 엑소좀을 동일한 용량으로 백서의 오른쪽 뇌실 내에 투여하였다.

3-2. 생존률 및 뇌 조직 분석

실험 기간동안 생존률을 분석하였으며, 실험 종료 후 뇌의 무게를 측정하고, MRI 촬영을 통해 뇌 조직의 손상된 부위를 분석하였다.

보다 구체적으로, 세균감염성 뇌수막염 유발 6일 후, 각 백서의 사지를 고정하고 흉곽을 절개하여 심장과 폐 조직을 드러나게 한 후, 23 게이지 바늘을 좌심실 내에 고정하고 우심방을 천자하여 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 관류시켰다. 이후 두개골을 절개하고, 조심스럽게 뇌 조직을 채취하여 그 무게를 측정하였다. 또한, 뇌수막염 유발 1일 후 및 6일 후의 백서의 뇌를 7-teslar 자기공명영상(MRI)을 이용하여 촬영하고, 뇌수막염으로 인한 손상의 정도를 DWI(Diffusion Weighted Image) 영역으로 확인하였다. 뇌 MRI 이미지는 Image J 프로그램을 이용하여 뇌실 확장과 DWI의 뇌 실질 경색 부위를 측정하여 뇌 손상으로 정의하고 "전체 손상된 뇌의 부피/전체 뇌의 부피"를 구하였다. 이상의 실험 결과를 도 5 내지 도 7에 각각 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 뇌수막염 대조군(MEN) 및 비교군(MEN+fibroblast)에 비해 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 실험군(MEN+MSC exosome)의 생존률이 높게 나타남을 확인하였다.

또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 정상군(NC)에 비해 뇌수막염 대조군(MEN)의 뇌 무게가 유의하게 감소하는데 반해, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 실험군(MEN+MSC exosome)의 뇌 무게는 정상군과 큰 차이가 없는 것을 확인하였다.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 뇌수막염 대조군(MEN, Saline)은 심각한 뇌실질의 부종(edema)과 뇌실확장 소견이 보였으며 뇌 손상이 관찰되었으나, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 실험군(MEN+MSC exosome)은 뇌수막염 대조군(MEN) 및 비교군(MEN+fibroblast)에 비해 실험 기간 동안 뇌 손상의 정도가 현저하게 개선됨을 확인하였다.

3-3. 뇌 조직 내 단백질 발현 분석

상기 실시예 3-2에서 분리된 뇌 조직으로부터 단백질을 분리한 후, 종래 공지된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 통해 염증성 사이토카인(IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α)의 발현 정도를 측정하였으며, 웨스턴 블랏을 통해 Caspase-3 및 GFAP의 발현 정도를 분석하였다. 이상의 실험 결과를 도 8 및 도 9에 각각 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 뇌의 염증성 사이토카인의 수치가 정상군(NC)에 비하여 뇌수막염 대조군(MEN)에서 급격하게 증가되었다. 반면, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 실험군(MEN+MSC exosome)은 상기와 같은 뇌의 염증성 사이토카인의 수치가 뇌수막염 대조군에 비하여 유의하게 호전되었으며, 이는 비교군(MEN+fibroblast)에 비해서도 현저하게 우수한 결과였다.

또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 반응성 아교화의 정도와 세포의 사멸 정도를 판단할 수 있는 Caspase-3 및 GFAP의 발현이 정상군(NC)에 비하여 뇌수막염 대조군(MEN)에서 급격하게 증가되어 뇌 손상이 일어났음을 확인하였다. 반면, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 실험군(MEN+MSC exosome)은 상기와 같은 단백질 발현이 뇌수막염 대조군에 비하여 유의하게 감소하였으며, 이는 비교군(MEN+fibroblast)에 비해서도 현저하게 우수한 결과였다.

이상의 실험 결과를 통하여, 줄기세포 유래 엑소좀이 신경세포에서 염증에 의한 세포의 사멸을 억제하고, 뇌 염증성 질환의 동물모델에서 생존률을 증가시키며, 부종 등 염증 반응으로 인한 뇌 손상 및 염증성 사이토카인 수치를 현저하게 감소시키는 등 뇌 염증성 질환에 대한 우수한 치료 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

Claims (9)

1. 줄기세포 유래 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 조직 유래인 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 뇌 염증성 질환은 뇌염, 뇌수막염 및 수막뇌염으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 뇌수막염은 세균, 기생충, 곰팡이균, 원충류 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 의해 유발된 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 뇌수막염은 세균 감염성 뇌수막염인 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀 외에 엑소좀 내부 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 경구, 직장 내, 혈관 내, 근육 내, 피하, 자궁 내, 뇌혈관 내 또는 뇌실 내로 투여되는 것을 특징으로 하는, 뇌 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.

Images