KR20180086440A - 신경 세포 세포외 소포체 - Google Patents

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KR20180086440A
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스티븐 엘. 스타이스
로빈 린 웹
트레이시 에이. 스타이스
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유니버시티 오브 조지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드
아루나 바이오메디칼 인코포레이티드
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Abstract

본 명세서에는 신경 세포외 소포(EV) 및 척수 상해, 뇌졸중, 및 외상성 뇌 손상 및 신경퇴행성 질환의 치료에서 이들 EV를 사용하는 방법이 개시되어 있다.

Description

신경 세포 세포외 소포체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 전문이 참고로 본 명세서에 포함된, 2015년 11월 18일자로 출원된 미국 가출원 제62/256,823호의 이익을 청구한다.
선천적인 장애, 암, 퇴행성 질환, 및 척수 상해를 비롯한, 신경계에 대한 질환 및 상해는, 전연령의 수백만의 사람에게 영향을 준다. 선천적인 장애는 뇌 또는 척수가 발달 중에 올바르게 형성되지 않은 경우 일어난다. 신경계의 암은 비정상적인 세포의 비제어된 확산으로부터 유발된다. 퇴행성 질환은 신경계가 신경 세포의 기능을 손실시킬 때 일어난다. 손상은 잃어버린 세포를 신경 줄기세포라고 불리는, 신경 세포로 성숙될 수 있는 세포로부터 유래된 새로운 것으로 대체함으로써 반전될 수 있다는 증거가 있다. 그러나, 이식된 줄기세포는 이식 부위로부터 이동하고, 테라토마 형성으로 이어지는 일부 세포 형질전환을 겪을 수 있고, 자주 겪는다. 또한, 이의 크기로 인해서, 줄기세포는 CNS로 자주 직접 주입되는데, 이것은 합병증을 유도할 수 있다. 침입성 CNS 수술은 환자를 출혈 및 부종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 전달 동안 그리고 전달 후에 일어나는 합병증으로 인한 위험에 놓이게 한다. 전신으로 투여된 줄기세포는 작은 모세혈관에 머무르게 되고, 이것은 자주 폐에서 바람직하지 않은 효과를 유도할 수 있고, 심지어는 질환 또는 상해에 도달하지 않을 수 있다. 줄기세포 요법은 또한 유도성이고 부정적인 면역 반응을 촉발시킬 수 있다.
본 명세서에는 신경 세포외 소포(neural extracellular vesicle)(EV) 및 척수 상해, 뇌졸중, 및 외상성 뇌 손상 및 신경퇴행성 질환의 치료에서 이들 EV를 사용하는 방법이 개시되어 있다.
개시된 EV는 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포(예를 들어, 인간 배아 줄기세포(ESC) 또는 유도 만능 줄기세포(iPSC))로부터 생산된 신경 전구세포(NP) 세포를 NP 세포가 EV를 생산하기에 충분한 조건 하에서 그러한 시간 동안 세포 배양 배지 중에서 배양하고, 상기 EV를 배양 배지로부터 단리함으로써 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, NP 세포는 SOX 1+, SOX 2+, OCT4- 및 NESTIN+이다.
개시된 EV는 일부 실시형태에서 만능 줄기세포(PSC)(예를 들어, ESC 또는 iPSC)로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래된 뉴런 세포(neuronal cell)를 세포 배양 배지 중에서 EV를 생산하기에 충분한 조건 하에서 그러한 시간 동안 세포 배양 배지 중에서 배양하고, 상기 EV를 배양 배지로부터 단리함으로써 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, PSC-유래 신경 세포는 신경아교 세포, 예컨대 성상세포 또는 희소돌기교세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, PSC-유래 신경 세포는 뉴런을 포함한다. 일부 실시형태에서, PSC-유래 신경 세포는 hES 세포로부터 유래된 NP 세포로부터 분화된다. 일부 실시형태에서, PSC-유래 신경 세포는 PSC로부터 직접 분화된다.
또한 임의의 기원의 성상세포를 성상세포가 EV를 생산하기에 충분한 조건 하에서 그러한 시간 동안 세포 배양 배지 중에서 배양하고, 상기 EV를 배양 배지로부터 단리함으로써 수득된 EV가 개시되어 있다.
개시된 EV는 대안적으로 일부 실시형태에서, PSC로부터 생산된 중간엽 줄기세포(MSC)를 MSC 세포가 EV를 생산하기에 충분한 조건 하에서 그러한 시간 동안 세포 배양 배지 중에서 배양하고, 상기 EV를 배양 배지로부터 단리함으로써 수득될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, hNP 세포로부터 생산된 EV(본 명세서에서 NPEX라고도 지칭됨)는 줄기-세포-유래 성상세포(본 명세서에서 APEX라고도 지칭됨) 또는 중간엽 줄기세포(본 명세서에서 MSCEX라고도 지칭됨)로부터의 EV에서 식별되지 않는 1653개의 단백질을 가졌다(표 9 참고). 따라서, 일부 실시형태에서, EV는 표 9에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600개 또는 그 초과의 단백질 바이오마커를 포함한다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, APEX로부터 생산된 EV는 NPEX 또는 MSCEX에서 식별되지 않는 596개의 단백질(표 8 참고)을 가졌다. 따라서, 일부 실시형태에서, EV는 표 8에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500개 또는 그 초과의 단백질 바이오마커를 포함한다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, MSCEX로부터 생산된 EV는 APEX 또는 MSCEX에서 식별되지 않는 536개의 단백질(표 7 참고)을 가졌다. 따라서, 일부 실시형태에서, EV는 표 7에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400개 또는 그 초과의 단백질 바이오마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 개시된 EV는 세포의 실질적으로 균질한 집단으로부터 생산된다. 일부 실시형태에서, 개시된 EV는 비-형질전환 세포로부터 생산된다.
또한 개시된 EV를 함유하는 조성물이 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 생체 적합성 스캐폴드, 예컨대 하이드로젤 내의 개시된 EV를 포함한다. 적합한 하이드로젤은 체온에서 고화 또는 경화되는 온도 의존적인 하이드로젤, 예를 들어, 플루로닉스(PLURONICS)(상표명); 이온에 의해서 가교 결합된 하이드로젤, 예를 들어, 소듐 알기네이트; 가시광 또는 자외광에 대한 노출에 의해서 경화되는 하이드로젤, 예를 들어, 아크릴레이트 단부기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 폴리락트산 공중합체; 및 pH 변화 시에 경화 또는 고화되는 하이드로젤, 예를 들어 테트로닉스(TETRONICS)(상표명)를 포함한다. 하이드로젤은 예를 들어, 하기 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 다당류, 단백질, 폴리포스파젠, 폴리(옥시에틸렌)-폴리(옥시프로필렌) 블록 중합체, 에틸렌 다이아민의 폴리(옥시에틸렌)-폴리(옥시프로필렌) 블록 중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트), 및 설폰화된 중합체.
일부 실시형태에서, 개시된 EV를 포함하는 조성물은 1종 이상의 향신경성 작용제(neurotrophic agent)를 추가로 포함한다. 조성물은 백혈병 저해 인자(LIF), 뇌-유래 향신경성 인자(BDNF), 섬모 향신경성 인자(CTNF), 표피 성장 인자 수용체(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), FGF-6, 신경아교-유래 향신경성 인자(GDNF), 섬모 향신경성 인자(CTNF), 과립구 집락-자극 인자(GCSF), 간세포 성장 인자(HGF), IFN-γ, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP-2), IGFBP-6, IL-1ra, IL-6, IL-8, 단핵구 주화성 단백질(MCP-1), 단핵 식세포 집락-자극 인자(M-CSF), 향신경성 인자(NT3), 금속단백분해효소의 조직 저해제(TIMP-1), TIMP-2, 종양 괴사 인자(TNF-β), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF-D, 우로카이나제 플라스미노겐 활성화인자 수용체(uPAR), 골 형성 단백질 4(BMP4), IL1-a, IL-3, 렙틴, 줄기세포 인자(SCF), 스트로마 세포-유래 인자-1(SDF-1), 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGFBB), 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ-1) 및 TGFβ-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 개시된 EV를 포함하는 조성물은 프로테아제 저해제, RNAse 저해제 또는 이들의 조합물을 추가로 포함한다.
또한 대상체에게 유효량의 본 명세서에 개시된 신경 EV를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 척수 상해, 뇌졸중, 외상성 뇌 상해 또는 신경퇴행성 질환을 갖는 대상체의 치료 방법이 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 파킨슨병-관련 장애, 헌팅톤병, 프라이온병, 운동 뉴런 질환(MND), 척수소뇌성 실조증(SCA) 또는 척수성 근위축(SMA)이다.
몇몇 연령 관련 질환의 맥락에서 이로울 수 있는 개시된 EV의 내용물에서 표현되는 몇몇 단백질 패밀리가 존재한다. 이들은 촉매작용적 활성 효소, 예컨대 메탈로프로테아제, 몇몇 칼슘-매개 신호전달 단백질, 및 다른 이온 채널을 포함한다. 유비퀴틴 리가제 및 프로테아좀 소단위뿐만 아니라 몇몇 DNA 및 RNA 중합효소 소단위가 존재한다. 따라서, 대상체에게 유효량의 본 명세서에 개시된 신경 EV를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 단백질 항상성 장애 또는 단백질병증(proteinopathy)을 갖는 대상체의 치료 방법이 또한 개시되어 있다.
뇌졸중 또는 외상성 뇌 상해를 앓고 있거나 또는 신경퇴행성 질환을 갖는, 척수 상해를 갖는 환자 또는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 신경 EV를 함유하는 조성물의 용도가 또한 개시되어 있다.
본 발명의 1종 이상의 실시형태의 상세 사항은 첨부된 도면 및 하기 설명에 언급되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면 및 청구범위로부터 자명할 것이다.
도 1은 세포외 소포(EV)(예를 들어, 엑소좀)가 수득될 수 있는 세포의 잠재적인 공급원을 도시한 도면.
도 2는 EV를 함유하는 다소포체(MVB)가 신경 전구세포(NP)에서 일반적임을 나타내는 초미세구조 분석. 전통적으로 "필라멘트, 과립, 불규칙적인 조밀한 덩어리, 및 막 성분으로서 기술된 더 작은 구체 및 타원형 소포 및 다른 봉입체(inclusion)를 함유하는 소포"라 기술된 것이 NP의 경계막 근처에서 보인다. 또한 보고된 바와 같이, 소포는 3개 이상의 소포의 클러스터로 빈번하게 발견되었다(패널 A, B). 패널 B로부터의 삽도는 패널 C에 나타나 있고, 이러한 MVB는 사실상 더 큰 다소포체 내부로 돌출된 소포를 갖는데, 이는 원형질 막으로부터의 단백질 재순환에서 이들 소포에 대한 역할을 뒷받침한다. 이들 소포는 원형질 막과 결합하여, EV를 세포외 공간으로 방출하는 것으로 보인다(패널 D, E). 이전 보고는 소포가 합쳐질 수 있고, 이것은 NP에서 일반적인 것일 가능성이 있고, MVB의 클러스터를 갖는 대부분의 세포에서 인지될 수 있다는 것을 나타낸다(패널 A, F, G). 패널 H는 NP로부터의 정제된 EV의 투과 전자 현미경(TEM) 영상이다.
도 3A 내지 도 3D는 EV가 나노입자 추적 분석에 의해서 정제 및 검출될 수 있음을 나타낸 도면. 도 3A는 SDS-PAGE에 의해서 분리된 엑소좀으로부터의 단백질 및 쿠마시 염색으로 염색된 겔을 나타낸다. EV로부터의 단백질 프로파일은 중첩되었지만, 세포 펠릿으로부터 구별되었고, 이는 카코(cargo)가 EV에 구체적으로 수송된다는 것을 뒷받침한다. 도 3B는 BCA 검정에 의해서 비교할 때 단백질 함량은 세포가 스트레스 조건, 예컨대 영양 박탈에 노출될 때 단백질 양의 프로파일이 변화된다는 것을 나타낸다. 도 3C 및 도 3D는 신경 전구세포 세포(도 3C) 및 성상세포(도 3D)로부터의 정제된 EV의 나노사이트(NanoSight) 분석을 나타낸다. 이들 EV는 중첩되지만 상이한 크기의 프로파일을 나타내고, 세포의 두 유형 모두는 55㎚의 소포를 나타내고, 25 내지 250㎚ 범위인 피크를 생성한다.
도 4는 분화된 신경 세포가 신경 전구세포 세포로부터 DiI-표지된 EV를 내면화한다는 것을 나타낸다. 10uM의 DiI를 세포 상청액에 30분 동안 첨가한 후 최종 EV 스핀 및 PBS 세척함으로서, EV를 표지하는 것이 가능하였다. 분화된 세포의 배양 배지에 첨가하는 경우, EV의 흡수는 5분 이내인 것이 명백하였다.
도 5A 및 도 5B는 신경 전구세포로부터의 EV가 분화된 신경 세포를 기아 스트레스로부터 더 양호하게 보호하는 것을 나타낸 도면. 도 5A는 신경 전구세포 세포(NP), 성상세포, 또는 인간 제대 MSC로부터의 초미세여과에 의해서 수거된 EV를 나타낸다. 단백질 함량은 BCA에 의해서 측정되었고, EV를 연속 희석하고, 동일 부피의 인산염 완충 혈청(PBS) 중에서 신경망 세포(6 내지 8주 분화)를 함유하는 웰로 옮겼다. 세포를 고정시키고 세포를 기아 스트레스에 10일 동안 적용하고, β-III 튜불린(Tuj)에 대해서 염색하였다. 웰당 중심 20개 필드를 셀로믹스 어레이스캔(Cellomics Arrayscan)을 사용하여 영상화하였다(도시된 4명의 기술 담당자로부터의 대표적인 이미지). 도 5B는 NP 및 성상세포 EV가 세포를 기아 스트레스로부터 보호하였고, 단층 및 연장의 온전성을 상당히 유지하였음을 나타낸다. 더 많은 세포 및 잔해가 MSC 처리된 웰 중에 존재하였지만, 세포는 이의 신경 모폴로지를 상당히 잃어버렸다. 약간의 세포가 PBS 만을 수용한 웰 중에서 여전히 검출 가능하였다. NP 및 성상세포 EV 샘플은 더 높은 단백질 농도를 가졌고, 따라서 50㎍ 단백질/웰로 처리하였다. 단백질은 MSC 샘플로 제한되었고, 따라서 6.25가 가능한 최대 농도였지만, 여전히 농도 의존적인 방식으로 세포를 사멸시키는 것으로 보였고, 따라서 더 높은 용량(50, 25 또는 12.5㎍/웰)은 상이한 결과를 생성할 가능성이 없다.
도 6A 내지 도 6C는 인듐-111 표지된 EV가 주입 1시간 이내에 뇌졸중 조직 부근에서 발견될 수 있음을 나타낸 도면. 도 6A 내지 도 6C는 유리 인듐(도 6A)과 비교한 인듐-111 표지된 EV(도 6B, 6C)의 생물분포를 나타내는데, 이것은 EV가 뇌졸중 직후(도 6B 원, 좌측 패널) 또는 뇌졸중 발생 24시간 후(도 6C, 원, 좌측 패널)에 주입된 경우 뇌졸중의 부근의 뇌에서 주입 1시간 이내에 존재하는 것을 나타낸다. 초기 주입 시기에 관계없이, EV는 주입 24시간 후에 그 면적으로부터 상당히 깨끗해졌지만(도 6B, 6C; 원, 우측 패널), 더 적은 양의 방사능이 여전히 검출 가능하였고, 아마도 이는 EV가 주변 조직에 의해서 대사되었음을 나타낸다.
도 7은 새끼 돼지 뇌에서 DiR 표지된 EV의 생물분포를 나타낸 도면. DiR 표지된 EV(대략 2.7 x 1010개 소포/㎏)는 정위 주입에 의해서 뇌 실질 내로(상부 패널), 그리고 지주막하 공간 내의 CSF 내로(하부 패널)의 직접 전달을 통해서 등 및 배 둘 모두로부터 검출 가능하였다. 형광은 두 예 모두에서 뇌의 등 및 배 양상에서 검출 가능하였지만, IP 주입된 경우에는 등 영역에서 보다 두드러졌고(상부 패널), CSF 주입 후에는 뇌의 배 영역에서 보다 두드러졌다(하부 패널).
도 8A 내지 도 8E는 신경 세포로부터 유래된 EV를 사용한 처리가 마우스 색전성 뇌졸중 모델에서 경색 크기 및 기능성 결과를 향상시키는 것을 나타낸 도면. 색전성 뇌졸중의 유도 이후에 마우스에 주입하기 위해서 APEX, MSCEX, PBS 및 NPEX 분취물을 블라인딩된 조사자에게 제공하였다(뇌졸중 2, 14 및 28시간 후에 대략 2.7 x 1011개의 소포/㎏의 3회 반복 용량). 뇌졸중 96시간 후 수거된 뇌의 TTC 염색은 NPEX 또는 APEX 처리 이후에 실질적으로 감소된 경색 크기를 나타낸 반면, MSCEX는 어떤 효과도 갖지 않았다(도 8A, 8C). NPEX 및 APEX는 또한 연구 기간에 걸쳐서 사망률을 대조군의 40%를 초과하게 감소시켰고, MSCEX 처리된 마우스는 연구 기간에 걸쳐서 합병증이 발생한 반면, APEX 및 NPEX 처리된 동물의 대략 25 내지 30%가 사망하였다(도 8B). 접착 테이프 시험에 의해서 검출된 향상된 감각 능력(도 8E), 및 신경학적 결핍 점수에 의해서 요약된 바와 같은 더 낮은 신경학적 결핍(도 8D)을 비롯한 표현형 이점이 또한 APEX 처리된 동물 및 NPEX 처리된 동물에서 주목되었다.
도 9A 내지 도 9C는 신경 세포로부터 유래된 EV가 뇌졸중 이후에 면역 반응을 조절한다는 것을 나타낸 도면. 뇌졸중 96시간 후 혈액 샘플 유세포 분석법은, APEX 및 NPEX가 MSCEX 및 대조군(비히클) 처리된 군에 비해서 조절 T-세포를 증가시키고(도 9A), 염증성 T-헬퍼 세포를 감소시키고(도 9B), 순환계에서 항-염증성 M2 대식세포를 증가시키는 것을 나타낸다(도 9C).
도 10A 내지 도 10C는 NPEX 처리가 MRI에 의해서 측정되는 경우 뇌졸중 후 28 ± 4시간 이내에 감소된 경색 체적을 유발하는 것을 나타낸 도면. 뇌졸중에 적용된 동물은 뇌졸중 후 2, 14 및 24시간에서 NPEX(대략 2.7 x 1010개 소포/㎏) 또는 PBS(비히클)를 제공받았다. 마취 동안, 동물을 또한 MRI 분석에 적용하였다. NPEX 처리된 동물은 PBS가 제공된 것과 비교할 때 실질적으로 감소된 경색 체적을 가졌다(도 A 내지 도 C). 동측면과 대측면 간의 크기 차이를 평가한 경우, NPEX 군에서 반구들 간에 적은 차이가 존재하였는데, 이는 대조군과 비교할 때 더 적은 부종 및 종창을 나타낸다.
도 11은 NPEX 처리가 뇌졸중 12주 후에 분자 결핍을 향상시킨다는 것을 나타낸 도면. T2 및 T2 플레어(flair) 영상 둘 모두는 뇌졸중 후 12주에 NPEX 처리된 돼지에서 더 낮은 측정 가능한 손상을 나타낸다. 조직의 부재(사멸)는 12주 시점에서 상당히 감소되었고, 숙주 조직과 부합되지 않는 밀도 면적은 처리된 동물에서 훨씬 덜 명백하였다.
도 12는 NPEX, APEX 및 MSCEX EV에 대해서 독특하고, 이에 의해서 공유된 단백질의 수를 나타낸 벤 다이어그램.
정의
본 발명에 따라서 종래의 세포 배양 방법, 화학 합성 방법 및 관련 기술 분야 내의 다른 생물 기술 및 약제학적 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 널리 공지되어 있고, 달리는 문헌에 충분히 설명되어 있다.
다양한 값이 제공되어 있는 경우, 맥락이 명백하게 달리 구술되지 않는 한 하한의 단위의 10분의 1(예컨대 탄소 원자의 수를 함유하는 기의 경우에서 그 범위 내에 포함된 각각의 탄소 원자 수가 제공됨), 그 범위의 상한과 하한 사이 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 그 사이의 값이 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 그 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 본 발명에 포함되고, 명시된 범위에서 임의로 구체적으로 제한된 한계에 적용된다. 언급된 범위가 그 한계치 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이러한 포함된 한계치 둘 모두 중 어느 하나를 제외한 범위가 본 발명에 또한 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 또한 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료를 이제 기술한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이 단수 형태는 그 문맥이 명백하게 달리 구술하지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것을 주목해야 한다.
추가로, 하기 용어가 하기에 언급된 정의를 가질 것이다. 구체적인 용어가 본 명세서에 정의되지 않은 경우에, 그 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의한 문맥 내에서 이의 전형적인 사용의 의미를 가질 것이라는 것이 이해되어야 한다.
용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적인 임의의 개체를 지칭한다. 대상체는 척추동물, 예를 들어, 포유동물일 수 있다. 따라서, 대상체는 인간 또는 수의학적 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 임상의, 예를 들어, 의사의 치료 하의 대상체를 지칭한다.
용어 "치료 유효"는 사용되는 조성물의 양이 질환 또는 장애의 1종 이상의 원인 또는 증상을 개선시키기에 충분한 양을 가짐을 지칭한다. 이러한 개선은 본질적으로 제거가 아니라, 감소 또는 변경 만을 요구한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 사리에 맞는 유익/유해비와 부합되는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여형을 지칭한다.
용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료" 등은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 본 발명에 따른 세포 조성물을 사용하여 향상될 수 있는 질환 상태, 병태 또는 결핍에 대한 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자에게 이익을 제공하는 임의의 작용을 지칭한다. 병태를 치료하는 것은 질환 상태 또는 병태의 효과의 발병을 예방 또는 지연시키는 것을 비롯하여, 적어도 하나의 증상의 경감 또는 억제, 질환 상태 또는 병태의 효과의 진행의 지연을 통해서 병태를 향상시키는 것을 포함한다. 본 출원에서, 치료는 이러한 상해의 효과를 반전 및/또는 저해시키는 것을 비롯한, 척추 손상 또는 뇌졸중의 효과를 감소시키는 것, 질환이 향상되고/되거나 진행 또는 악화되지 않도록 신경퇴행성 질환을 반전, 향상, 저해 및/또는 안정화시키는 것을 포함할 수 있다. 용어 "예방적"은 특정 결과, 자주 질환 상태 및/또는 병태의 진행 및/또는 악화가 일어날 "가능성을 감소시키는" 방법을 기술하는 데 사용된다.
DNA 리가제, DNA 중합효소, 제한 엔도뉴클레아제 등을 비롯한 효소 반응을 위한, 세포의 성장, 세포의 분리, 및 관련된 경우, 클로닝, DNA 단리, 증폭 및 정제에 대한 표준 기술 및 다양한 분리 기술은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 공지되고 널리 사용되는 것이다. 다수의 표준 기술이 문헌[Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth. Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; and Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles 및 Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York]에 기술되어 있다. 사용되는 경우 약어 및 명명법은 전문 잡지, 예컨대 본 명세서에 언급된 것에서 일반적으로 사용되고 관련 기술 분야에서 표준인 것으로 여겨진다.
"인간 배아 줄기세포" (hESC) 및 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 하위세트인, 용어 "인간 만능 줄기세포"는 수정 후 임의의 시기의 배아-전, 배아, 태아 조직 또는 성인 줄기세포(인간 유도 만능 줄기세포의 경우)로부터 유래되고, 특히 뉴런 줄기 및 전구세포, 신경 능선 세포, 중간엽 줄기세포(MSC) 및 관련된 증식성 및 비-증식성 신경 세포를 비롯한, 몇몇 상이한 세포 유형의 자손을 생산하는 적절한 조건 하에서 존재할 수 있는 특징을 갖는다. 이 용어는 다양한 부류의 줄기세포의 확립된 주 및 기술된 방식으로 만능인 1차 조직으로부터 수득된 세포 둘 모두를 포함한다.
용어 "배아 줄기세포"는 배반포기(blastocyst stage) 배아로부터 단리된, 바람직하게는 인간을 비롯한 영장류의 만능 세포를 지칭한다.
용어 "신경 전구세포 세포"는 뉴런 및 신경아교 세포 유형으로 분화되는 능력을 갖는 시기의 제한된 수를 분할할 수 있는 세포를 지칭한다.
용어 "세포외 소포" 및 "EV"는 본 명세서에서 지질 이중층 또는 마이셀에 의해서 함유된 세포로부터의 유체, 거대-분자, 용질, 및 대사체로 이루어진 약 10㎚ 내지 10㎛ 크기의 소포를 지칭한다. 일부 경우에, EV는 세포-유래 EV이다. 용어 "EV"는 또한 세포-유래 EV, 예컨대 신경 EV에서 발견되는 생물활성 분자를 함유하도록 조작된 지질 소포를 포함한다. 이들 용어는 엑소좀 및 에토좀 둘 모두를 포함한다. 엑소좀은 다소포체(MVB)의 엑소시토시스(exocytosis) 상에 배출된다. 에토좀은 원형질 막에서 조립되어, 그것으로부터 방출된 소포이다. 일부 경우에, EV는 약 20㎚ 내지 10㎛, 20㎚ 내지 1㎛, 20㎚ 내지 500㎚, 30㎚ 내지 100㎚, 30㎚ 내지 160㎚, 또는 80 내지 160㎚ 크기이다. 일부 실시형태에서, EV는 약 20 내지 150㎚ 크기인 엑소좀이다.
용어 "자가 EV"는 EV가 투여되는 대상체 또는 환자로부터의 세포로부터 수득된 EV의 집단을 기술하는 데 사용된다.
용어 "신경 EV"는 만능 줄기세포로부터 시험관내에서 유래된 신경 전구세포 세포 또는 상기 신경 전구세포 또는 만능 줄기세포로부터 시험관내에서 유래된 만능 줄기세포 또는 신경 세포로부터 생산된 세포-유래 EV를 지칭하는 데 사용된다. 이 용어는 또한 실질적으로 동일한 생물활성을 갖기 위해서 세포-유래 신경 EV에서 발견되는 생물활성 분자의 충분한 수를 함유하도록 조작된 소포를 지칭한다.
조성물
본 명세서에는 신경 EV(예를 들어, 엑소좀) 및 척수 상해, 뇌졸중, 및 외상성 뇌 상해 및 신경퇴행성 질환의 치료에서 이들 EV를 사용하는 방법이 개시되어 있다.
개시된 EV는 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포(예를 들어, 인간 배아 줄기세포(ESC) 또는 유도 만능 줄기세포(iPSCs))로부터 시험관내에서 생산된 신경 전구세포 (NP) 세포 또는 중간엽 줄기세포(MSC)를 NP 세포 또는 MSC가 EV를 생산하기에 충분한 조건 하에서 그러한 시간 동안 세포 배양 배지 중에서 배양함으로써 수득될 수 있다.
인간 배아 줄기세포(ESC)로부터 인간 신경 전구세포(hNP) 세포를 생산하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제7,531,354호에 기술되어 있고, 이것은 이들 세포의 교시에 대해서 이의 전문이 참고로 포함된다. 인간 신경전구세포 세포(hNP)는 Nestin, Musashi-1, Soxl, Sox2 및 Sox3을 비롯한, 극초기 다능성 신경 줄기세포와 연관된 마커를 발현하는 것으로 공지되어 있다. 피더 세포 무함유 신경 전구세포 세포가 EV를 생산하는 데 사용될 수 있지만, 본 명세서에 달리 기술된 신경전구세포 세포가 또한 사용될 수 있다는 것이 주목된다. 바람직한 신경전구세포 세포는 미국 특허 제7,531,354호에 제공된 방법에 따라서 접착성 피더 세포뿐만 아니라 배상체(embryoid body)로부터 생산된다.
개시된 EV는 일부 실시형태에서 만능 줄기세포로부터 직접 또는 간접적으로 유래된 분화된 신경 세포, 예컨대 성상세포를 세포 배양 배지 중에서 EV를 생산하기에 충분한 조건 하에서 그러한 시간 동안 세포 배양 배지 중에서 배양하고, 상기 EV를 배양 배지로부터 단리함으로써 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분화된 신경 세포는 hN2(상표명) 뉴런 세포(아룬에이 바이오메디컬(ArunA Biomedical)), 뉴로넷(NeuroNet)(상표명) 뉴런, 또는 아스트로프로(AstroPro)(상표명) 성상세포(아룬에이 바이오메디컬 인크)이다.
EV-생산 NP 세포, 신경 세포, 또는 MSC를 생산하는 데 사용되는 만능 줄기세포는 인간 배아 줄기세포(hESC) 및 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 포함한다.
만능 줄기세포는 단계-특이적 배아 항원(SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81이라 지정된 항체를 사용하여 검출 가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다(Thomson et al., Science 282:1145, 1998). 만능 줄기세포의 시험관내 분화는 SSEA-4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 손실 및 SSEA-1의 증가된 발현을 유발한다. 미분화된 만능 줄기세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타제 활성을 갖는데, 이것은 세포를 4% 파라폼알데하이드로 고정시키고, 이어서 제조사(벡터 레보러토리스(Vector Laboratories), 미국 캘리포니아주 버린게임 소재)에 의해서 기술된 바와 같이 기질로서 벡터 레드(Vector Red)로 현상시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해서 검출되는 바와 같이 Oct-4 및 TERT를 발현한다.
사용될 수 있는 만능 줄기세포의 유형은 전형적으로 필수적으로 임신 대략 10 내지 12주 전이 아닌, 임신 동안 이의의 시기에 취해진 배아-전 조직(예컨대, 예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 태아 조직을 비롯한, 임신 후에 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예는 인간 배아 줄기세포 또는 인간 배아 생식 세포의 확립된 윤리적 주, 예컨대, 예를 들어 인간 배아 줄기세포주 WA01, WA07 및 WA099(위셀(WiCell))이다. 이러한 세포의 초기 확립 또는 안정화 동안 본 개시내용의 조성물의 사용이 또한 고려되고, 이 경우 기원 세포는 기원 조직으로부터 직접 채취된 1차 만능 세포일 것이다. 피더 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기세포 집단으로부터 채취된 세포가 또한 적합하다. 돌연변이체 인간 배아 줄기세포주, 예컨대, 예를 들어, BG01v(브레사젠(BresaGen), 미국 조지아주 아텐스 소재), 뿐만 아니라 정상 인간 배아 줄기세포주, 예컨대 WA01, WA07, WA09(위셀) 및 BG01, BG02(브레사젠, 미국 조지아주 아텐스 소재)가 또한 적합하다.
인간 배아 줄기세포(hESC)는 예를 들어, 톰슨(Thomson) 등에 의해서 기술된 바와 같은 관련 기술 분야에 기술된 방법(미국 특허 제5,843,780호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995)에 의해서 제조될 수 있다. 대안적으로, 이것은 상업적으로 입수 가능할 수 있다.
외배반 줄기세포(EpiSc) 및 유도 만능 줄기세포(iPSC)는 초기 이식-후 단계 배아로부터 단리된다. 이것은 Oct4를 발현하고, 만능성이다. iPSC는 4종의 유전자(c-myc, Klf4, Sox2, Oct4)의 레트로바이러스 형질도입에 의해서 만능 상태로 되돌아가는 성인 체세포를 탈분화시킴으로써 제조된다.
미국 특허 제20140356382호에 기술된 바와 같이, "세포로부터 생산된 [엑]소좀은 임의의 적합한 방법에 의해서 배양 배지 및/또는 세포 조직으로부터 수집될 수 있다. 전형적으로 EV의 제제는 원심분리, 여과 또는 이들 방법의 조합에 의해서 세포 배양물 또는 조직 상청액으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, EV는 분별 원심분리에 의해서 제조될 수 있는데, 즉 펠릿이 더 큰 입자일 때까지 저속(2,0000g 미만) 원심분리하고 그 다음 펠릿이 EV일 때까지 고속(100,000g 초과) 원심분리하고, 적절한 필터(예를 들어, 0.22㎛ 필터)로 크기 여과하고, 구배 초원심분리(예를 들어, 수크로스 구배)하거나 또는 이들 방법의 조합에 의해서 제조될 수 있다. EV, 즉, 지질 이중층이 제거되고 없어진 EV의 내용물 및 수득된 내용물은 또한 인공 EV를 조작하는 데 사용될 수 있다는 것이 주목된다.
추가로, 미국 특허 출원 제20140356382호에 기술된 바와 같이, 외인성 단백질 및/또는 펩타이드 및 다른 카고가 전기천공 또는 형질주입 시약의 사용을 비롯한 다수의 상이한 기술에 의해서 EV 내에 도입될 수 있다. 전기천공 조건은 생물치료 카고의 전하 및 크기에 따라서 달라질 수 있다. 전형적인 전압은 20V/㎝ 내지 1,000V/㎝, 예컨대 20V/㎝ 내지 100V/㎝ 범위이고, 커패시턴스는 전형적으로 25μF 내지 250μF, 예컨대 25μF 내지 125μF이다. 150mV 내지 250mV 범위의 전압, 특히 200mV의 전압이 EV에 항체를 적재시키기에 바람직하다. 대안적으로, EV는 펩타이드 형질주입 시약을 사용하여 외인성 단백질 및/또는 펩타이드가 적재될 수 있다. EV의 작은 크기에도 불구하고, 종래의 형질주입 작용제가 EV를 단백질 및/또는 펩타이드로 형질주입시키기 위해서 사용될 수 있다. EV는 또한 숙주 세포를 치료 단백질 또는 관심 펩타이드를 발현하는 핵산 작제물로 형질전환 또는 형질주입시킴으로써 적재될 수 있어서, EV가 세포로부터 생산될 때 치료 단백질 또는 펩타이드가 EV 내에 자리를 잡도록 한다.
예시적인 실시형태에서에서, 본 명세서에 개시된 EV-생산 NP 세포 및/또는 신경 세포는 세포 및 EV를 생산하는 이의 능력에 따라서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 동안 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 동안 배양된다. EV-생산 세포는 적합한 배지 중에서 배양되고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 쉽게 결정되는 조건 하에서 성장될 수 있다. 세포 배양 조건은 세포 유형에 따라서 달라질 수 있고, 이하에 제공된 예가 적합한 배지 및 조건을 예시한다. 예를 들어, 우태아 혈청(예를 들어, 10%에서)을 함유하고, 임의로 글루타민 또는 글루타민-함유 혼합물 및 항체가 보충된CMRL 1066 배지(인비트로젠(Invitrogen))가 사용될 수 있다. 세포는 일부 실시형태에서 표면(피더 세포) 상에서 성장될 수 있고, 예를 들어, 세포는 표면 상에서 단층으로서(피더 세포 무함유) 성장될 수 있고, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100% 컨플루언트까지 성장될 수 있다.
세포 성장 배지는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 적어도 최소 필수 배지 및 1종 이상의 임의적인 성분, 예컨대 성장 인자, 아스코르브산, 글루코스, 비-필수 아미노산, 염(미량 원소 포함), 글루타민, 인슐린(여기에 제시되어 있거나 제외되지 않음), 액틴 A, 트랜스페린, 베타 머캅토에탄올, 및 관련 기술 분야에 널리 공지되고 본 명세서에 달리 기술된 다른 작용제를 포함한다. 바람직한 배지는 신경 세포를 지지하는 저 단백질, 무혈청계 성장 배지이다. 사용되는 성장 인자는 단독의 또는 바람직하게는 백혈병 저해제 인자(LIF)와 조합된 섬유모세포 성장 인자 2(FGF2)일 수 있다. 성장 배지 중에서 성장될 NP 또는 신경 세포에 따라서, LIF의 봉입체가 바람직하지만, 필수적이지는 않을 수 있다. 추가적인 배지는 혈청, 예를 들어, 약 0.1% 내지 20%(바람직하게는, 약 2 내지 10%)의 우태아 혈청, 또는 정의된 배지의 경우에는, 우태아 혈청 및 KSR이 존재하지 않고, 임의로 소 혈청 알부민(약 1 내지 5%, 바람직하게는 약 2%)을 함유할 수 있는 기저 세포 배지를 포함한다. 바람직한 배지는 정의되어 있고, 무-혈청 및 저 단백질이다. 성장 배지에 대한 성분은 성장될 신경 세포의 유형에 좌우되며, 이들 모두는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 특히 바람직한 배지는 아룬에이로부터의 배지 및 보충물이다. AB2(상표명) 신경 세포 배양 배지 키트는 AB2(상표명) 기저 신경 배지 및 ANS(상표명) 신경 배지 보충물을 함유한다. 배지 및 보충물은 모든 신경 세포 배양물 요구를 충족시키는 다용도성(versatility)을 위해서 특이적으로 조작된다. AB2(상표명) 기저 신경 배지 및 ANS(상표명) 신경 배지 보충물은 hNP1(상표명) 주의 분화를 다양한 신경 표현형으로 안내하기 위해서 전문화된 배지를 위한 베이스로서 사용될 수 있다. 다수의 배지 및 보충물 각각은 세포 성장, 멸균, pH, 삼투성, 및 엔도톡신에 대해서 시험함으로써 사용을 위해서 미리 적합하게 된다.
아룬에이로부터의 제형은 신경 배양물이 피더 세포에 대한 필요성 없이 다수의 계대에 걸쳐서 안정한 핵형을 유지하는 것을 허용하여, 이들을 초기 단계 약물 발견을 비롯한 매우 다양한 연구 응용을 위한 우수한 선택으로 만든다.
배지에 임의로 첨가될 수 있는 다른 작용제는 배지 중에서 성장하는 세포 유형에 따라서, 다수의 다른 성분 중에서 예를 들어, 니코틴아마이드, TGF-β 1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 액티빈 A, 노달, 본 모포겐 단백질(Bone Morphogen Protein)(BMP 2 내지 7) 혈청 알부민, 섬유모세포 성장 인자(FGF) 패밀리의 구성원, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II, LR-IGF), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩타이드-I 및 II(GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디, 엑센딘-4, 파라티로이드 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 표피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이터, 예컨대, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민, 포스콜린, Na-부티레이트, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노달, 발포르산, 트라이코스타틴 A, 소듐 부티레이트, 간세포 성장 인자(HGF), 스핑고신-1, VEGF, MG132(EMD, 미국 캘리포니아주 소재), N2 및 B27 보충물(깁코, ca), 스테로이드 알칼로이드, 예컨대, 예를 들어, 사이클로파민(EMD, 미국 캘리포니아주 소재), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 디코프 단백질 패밀리, 소 뇌하수체 추출물, 섬 신생(islet neogenesis)-연관 단백질(INGAP), 인디안 헤지호그, 소닉 헤지호그, 프로테아좀 저해제, 노치 경로 저해제, 소닉 헤지호그 저해제, 헤레굴린 또는 이들의 조합물 중 임의의 1종 이상을 포함한다. 포함되는 경우, 이들 성분 각각은 유효량으로 포함된다.
추가 예의 방식으로, 적합한 배지는 하기 성분, 예컨대, 예를 들어, 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM), 깁코 #11965-092; 넉아웃 둘베코 변형된 이글 배지(KO DMEM), 깁코 # 10829-018; 햄스 F12/50% DMEM 기저 배지; 200mM L-글루타민, 깁코 #15039-027; 비-필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-머캅토에탄올, 시그마(시그마) #M7522; 인간 재조합 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 깁코 #13256-029로부터 제조될 수 있다.
세포 배지는 상업적으로 입수 가능하고, 정의된 무-제노 성분을 비롯한 상업적으로 입수 가능한 성분, 예컨대 인비트로젠 코프.(깁코), 셀 어플리케이션즈, 인크.(Cell Applications, Inc.), 바이올로지컬 인더스트리즈(Biological Industries), 베트 하에메크(Beth HaEmek), 이스라엘(Israel) 및 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 입수 가능한 것으로 보충될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 표적 세포 중 임의의 1종 이상을 생산하기 위해서 세포 배지를 쉽게 변형시킬 수 있을 것이다.
개시된 EV-생산 세포는 다양한 방식으로 세포를 지지하는 피더 세포의 층 상에서 배양될 수 있다. 피더 세포의 층 상에서 세포를 배양하기 위한 접근법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 세포는 배상체로서 또는 현탁물 중에서가 아니라, 접착성 단층으로서, 세포 지지체 또는 매트릭스 상에서 성장될 수 있다. 특정 실시형태에서, EV를 생산하는 데 사용되는 세포에 따라서 세포 지지체의 사용이 바람직할 수 있다. 사용되는 경우, 세포 지지체는 바람직하게는 적어도 하나의 기질 단백질을 포함한다. 기질 단백질은 예를 들어, 세포외 매트릭스에서 발견되는 단백질인 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 라미닌, 테나신, 트롬보스폰딘, 및 이들의 혼합물을 포함하는데, 이것은 성장 촉진을 나타내고, 표피 성장 인자(EGF)와 상동성인 도메인을 함유하고, 성장 촉진 활성을 나타낸다. 사용될 수 있는 다른 기질 단백질은 예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, 비브로넥틴, 폴리라이신, 폴리오니틴 및 이들의 혼합물을 포함한다. 또한, 이들 배아 줄기세포 분화 단백질 중 1종 이상을 유효 농도로 함유하는 젤 및 다른 물질, 예컨대 메틸셀룰로스가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 분화 단백질 또는 이들 분화 단백질을 포함하는 재료는 특히 예를 들어, 라미닌, BD 세포-타크(상표명) 세포 및 조직 접착제, BD(상표명) 피브로젠 인간 재조합 콜라겐 I, BD(상표명) 피브로젠 인간 재조합 콜라겐 III, BD 마트리겔(Matrigel)(상표명) 기저막 매트릭스, BD 마트리겔(상표명) 기저막 매트릭스 고농도(HC), BD(상표명) 퓨라매트릭스(PuraMatrix)(상표명) 펩타이드 하이드로젤, 콜라겐 I, 콜라겐 I 고농도(HC), 콜라겐 II(보빈), 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 및 콜라겐 VI을 포함한다.
대안적으로, 이들 세포는 피더 세포를 본질적으로 함유하지 않지만, 그럼에도 불구하고 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템 중에서 배양되어 EV를 생산할 수 있다. 피더-무함유 배양물 중에서의 세포의 성장은 또 다른 세포 유형과 함께 미리 배양함으로써 컨디셔닝된 배지를 사용하여 지지될 수 있다. 대안적으로, 분화 없는 피더-무함유 배양물 중에서의 EV-생산 세포의 성장은 화학적으로 정의된 배지를 사용하여 지지될 수 있다. 이러한 접근법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 세포는 피더 세포 무함유 배지 중에서 성장된다.
EV는 다양한 시간 간격에서(예를 들어, EV의 생산율에 따라서, 약 2, 4, 6, 8 또는 3, 6, 9, 12일 또는 더 긴 간격에서)에서 수거될 수 있다. EV의 예시적인 수율은 본 명세서에서 달리 기술된 바와 같이 약 24시간 내지 7일의 증식성 신경 세포 및 및 비-증식성 신경 세포의 배양 시간 기간 동안 적어도 약 1ng EV/1백만개 세포, 적어도 약 10ng EV/1백만개 세포, 적어도 약 50ng EV/1백만개 세포, 적어도 약 100ng EV/1백만개 세포, 적어도 약 500ng EV/1백만개 세포, 적어도 약 750ng EV/1백만개 세포, 적어도 약 800ng EV/1백만개 세포, 적어도 약 900ng EV/1백만개 세포, 적어도 약 1.0㎍ EV/1백만개 세포, 적어도 약 1.5㎍ EV/1백만개 세포, 적어도 약 2.0㎍ EV/1백만개 세포, 적어도 약 2.5㎍ EV/1백만개 세포, 적어도 예를 들어 약 3.0㎍ EV/1백만개 세포, 적어도 약 5.0㎍ EV/1백만개 세포, 적어도 약 10.0㎍ EV/1백만개 세포 범위일 수 있다.
특정 실시형태에서에서, EV는 초원심분리 또는 분별 원심분리 또는 이들의 임의의 조합에 의해서 수거 및 수집되고, 펠릿화된 EV는 수집되고, 임의로 수집된 펠릿화된 EV는 적합한 배지로 세척된다. 예를 들어, EV의 제제는 원심분리, 여과 또는 이들 방법의 조합에 의해서 세포 배양물 또는 조직 상청액으로부터 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, EV는 분별 원심분리에 의해서 제조될 수 있는데, 즉 펠릿이 더 큰 입자일때까지 저속(2,0000g 미만) 원심분리하고, 그 다음 펠릿이 EV일 때까지 고속(100,000g 초과) 원심분리하고, 적절한 필터(예를 들어, 0.22㎛ 필터)로 크기 여과하고, 구배 초원심분리(예를 들어, 수크로스 구배)하거나 또는 이들 방법의 조합에 의해서 제조될 수 있다. EV는 분별 원심분리, 미세 및 초미세-여과, 중합체 침전, 미소유체 분리, 면역포획 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해서 정제될 수 있다. EV를 단리 및 정제하기 위한 이들 및/또는 관련된 방법은 문헌[Thery, et al., Current Protocols in Cell Biology, (2006) 3.221-3.22.29, copyright 2006 by John Wiley & Sons, Inc.; Sokolova, et al., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2011, 87, 146-150; Wiklander, et al., Journal of Extracellular Vesicles, 2015, 4, 26316, pp. 1-13; 및 Boeing, et al., Journal of Extracellular Vesicles, 2014, 3, 23430, pp. 1-11]에 기술되어 있다. 다른 단리 방법, 예컨대 전기장 무선주파수 및 음향처리(acoustics)가 개발될 수 있다.
약제학적 조성물
치료적 유효량의 1종 이상의 개시된 EV 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약제학적 조성물이 개시된다. 개시된 EV를 함유하는 제형은 바람직하게는 정확한 투여량의 단순한 투여에 적합한 단위 투여형의 액체, 고체, 반-고체 또는 동결 건조된 분말 형태, 예컨대, 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀션, 지속-방출형 제형, 정제, 캡슐, 분말, 좌제, 크림, 연고, 로션, 에어로졸, 패치 등의 형태를 가질 수 있다.
약제학적 조성물은 전형적으로 종래의 약제학적 담체 및/또는 부형제를 포함하고, 추가로 다른 의학적 작용제, 담체, 애주번트, 첨가제 등을 추가로 포함할 수 있다. EV 대 1종 이상의 부형제의 중량 백분율은 약 20:1 내지 약 1:60, 또는 약 15:1 내지 약 1:45, 또는 약 10:1 내지 약 1:40, 또는 약 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 1:1 내지 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 또는 1:35이고, 바람직하게는 약 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1 또는 5:1 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 개시된 조성물은 약 1㎍ 내지 약 1 g 또는 그 초과의 총 EV, 약 500㎍ 약 500㎎, 약 1㎎ 내지 약 500㎎, 약 5 내지 약 500㎎, 약 10 내지 약 500㎎, 약 25 내지 약 500㎎, 약 50㎎ 내지 약 350㎎, 약 75㎎ 내지 약 450㎎, 약 50㎎ 내지 약 450㎎의 총 EV 또는 약 75㎎ 내지 약 325㎎ 또는 약 100㎎ 내지 약 650㎎의 총 EV를 포함하고, 임의로 1종 이상의 적합한 약제학적 담체, 첨가제 및/또는 부형제를 함유할 수 있다.
비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 근육내, 척추강내, 뇌척수액내 또는 비강내)를 위한 주사 가능한 조성물은 전형적으로 적합한 i.v. 용액, 예컨대 멸균 생리염 용액 중에 EV 및 임의로 추가적인 성분을 함유할 것이다. 조성물은 또한 수성 에멀션 중의 현탁액으로서 제형화될 수 있다.
액체 조성물은 담체, 예컨대, 예를 들어, 수성 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올 중에 EV를 포함하는 약제학적 조성물, 및 임의적인 약제학적 애주번트를 용해 또는 분산시켜 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 경구 액체 제제로 사용하기 위해서, 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션 또는 시럽으로서 제조될 수 있고, 물 또는 생리 식염수 중에서의 수화에 적합한 액체 형태 또는 건조 형태 중 어느 하나로 공급된다. 비강내, 기관내 또는 폐내 투여의 경우에, 조성물은 액체 조성물로서 제공될 수 있고, 이것은 코, 기관 및/또는 폐에 분사될 수 있다.
경구 투여를 위해서, 이러한 부형제는 약제 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다. 바람직한 경우, 조성물은 또한 미량의 비-독성 보조 물질, 예컨대 습윤제, 유화제 또는 완충제를 함유할 수 있다.
조성물이 경구 투여를 위한 고체 제제의 형태로 사용되는 경우, 이 제제는 정제, 과립, 분말, 캡슐 등일 수 있다. 정제 제형에서, 조성물은 전형적으로 첨가제, 예를 들어, 부형제, 예컨대 당류 또는 셀룰로스 제제, 결합제, 예컨대 전분 페이스트 또는 메틸 셀룰로스, 충전제, 붕괴제, 및 의학 제제의 제조에서 전형적으로 사용되는 다른 첨가제와 제형화된다.
이러한 투여형의 제조 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명하고, 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (17th Ed., Mack Pub. Co. 1985] 참고). 투여될 조성물은 다량의 선택된 화합물을 본 발명에 따른 환자 또는 대상체를 비롯한, 생물계에서 치료 용도를 위해서 약제학적 유효량으로 함유할 것이다.
정맥내 제형은 본 명세서에 기술된 EV, 등장성 매질 및 EV의 응집을 예방하는 1종 이상의 물질을 포함할 수 있다. 예시적인 정맥내/척추강내/ 뇌척수액내 제형은 0.18% 염수 중의 염수 용액(예를 들어, 생리 식염수(NS); 약 0.91% w/v의 NaCl, 약 300mOsm/L) 및/또는 덱스트로스 4%, 및 임의로 1%, 2% 또는 3%의 인간 혈청 알부민을 함유할 수 있다. 또한, EV는 본 발명에 따른 조성물에서 사용되는 내용물을 수득하기 위해서 파괴될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 제형은 척수 상해, 뇌졸중, 외상성 뇌 상해 및/또는 신경퇴행성 질환을 치료하는 데 사용하기 위해서 약 100ng, 200ng, 300ng, 400ng, 500ng, 600ng, 700ng, 800ng, 900ng, 1.0㎍, 1.5㎍, 2.0㎍, 2.5㎍, 3.0㎍, 5.0㎍, 10.0, 15.0㎍, 20.0㎍, 100㎍, 또는 그 초과의 EV/㎖ 정맥내/척추강내/뇌척수액내 매질을 비롯한, 약 50ng EV/㎖ 정맥내/척추강내/뇌척수액내 매질을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 정맥내 제형은 약 0.1㎍ EV/㎖ 매질, 약 0.2㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 0.3㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 0.4㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 0.5㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 0.6㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 0.7㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 0.8㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 0.9㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 1.0㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 1.5㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 2.0㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 2.5㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 예컨대 적어도 예를 들어, 약 3.0㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 예컨대, 예를 들어, 적어도 약 5.0㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 약 10.0㎍ EV/㎖ 정맥내 매질, 15.0㎍ EV/㎖ 정맥내 매질 또는 약 20.0㎍ 또는 그 초과의 EV/㎖ 정맥내 매질을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 25㎎의 EV, 적어도 50㎎의 EV, 적어도 60㎎의 EV, 적어도 75㎎의 EV, 적어도 100㎎의 EV, 적어도 150㎎의 EV, 적어도 200㎎의 EV, 적어도 250㎎의 EV, 적어도 300㎎의 EV, 약 350㎎의 EV, 약 400㎎의 EV, 약 500㎎의 EV, 약 750㎎의 EV, 약 1g(1,000㎎) 또는 그 초과의 EV를 단독으로 또는 치료적 유효량의 적어도 1종의 추가 생물활성제와 조합하여 포함하는 투여형으로 존재하고, 작용제는 척수 상해, 뇌졸중, 외상성 뇌 상해 및/또는 신경퇴행성 질환을 치료하기에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 10㎎ 내지 약 750㎎, 약 25㎎ 내지 약 650㎎, 또는 약 30㎎ 내지 약 500㎎, 또는 약 35㎎ 내지 약 450㎎, 가장 자주는 약 50 내지 약 500㎎의 EV를 포함한다.
일부 실시형태에서, 정맥내 제형은 본 명세서에 기술된 EV, 등장성 매질 및 EV의 응집을 예방하는 1종 이상의 물질을 포함할 수 있다. 따라서 정맥내 제형은 0.18% 염수 중의 염수 용액(예를 들어, 생리 식염수(NS); 약 0.91% w/v의 NaCl, 약 300mOsm/L) 및/또는 덱스트로스 4%, 및 임의로 1%, 2% 또는 3%의 인간 혈청 알부민을 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 개시된 EV를 포함하는 조성물은 1종 이상의 향신경성 작용제를 추가로 포함한다. 조성물은 백혈병 저해 인자(LIF), 뇌-유래 향신경성 인자(BDNF), 표피 성장 인자 수용체(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), FGF-6, 신경아교-유래 향신경성 인자(GDNF), 과립구 집락-자극 인자(GCSF), 간세포 성장 인자(HGF), IFN-γ, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP-2), IGFBP-6, IL-1ra, IL-6, IL-8, 단핵구 주화성 단백질 (MCP-1), 단핵 식세포 집락-자극 인자(M-CSF), 향신경성 인자(NT3), 금속단백분해효소의 조직 저해제(TIMP-1), TIMP-2, 종양 괴사 인자(TNF-β), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF-D, 우로카이나제 플라스미노겐 활성화인자 수용체(uPAR), 골 형성 단백질 4(BMP4), IL1-a, IL-3, 렙틴, 줄기세포 인자(SCF), 스트로마 세포-유래 인자-1 (SDF-1), 혈소판 유래 성장 인자-BB (PDGFBB), 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ-1) 및 TGFβ-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 개시된 EV는 생체 적합성 스캐폴드, 예컨대 하이드로젤 내에 또는 그 상에 함유된다. 적합한 하이드로젤은 체온에서 고화 또는 경화되는 온도 의존적인 하이드로젤, 예를 들어, 플루로닉스(상표명); 이온에 의해서 가교 결합된 하이드로젤, 예를 들어, 소듐 알기네이트; 가시광 또는 자외광에 대한 노출에 의해서 경화되는 하이드로젤, 예를 들어, 아크릴레이트 단부기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 폴리락트산 공중합체; 및 pH 변화 시에 경화 또는 고화되는 하이드로젤, 예를 들어 테트로닉스(상표명)를 포함한다. 이러한 상이한 하이드로젤을 형성하는 데 사용될 수 있는 물질의 예는 다당류, 예컨대 알기네이트, 폴리포스파젠, 및 이온 가교-결합된 폴리아크릴레이트, 또는 블록 공중합체, 예컨대 온도 변화에 의해서 고화된 폴리(옥시에틸렌)-폴리(옥시프로필렌) 블록 중합체인 플루로닉스(상표명)(폴록사머스(POLOXAMERS)(상표명)이라고도 공지됨), 또는 pH 변화에 의해서 고화된 에틸렌 다이아민의 폴리(옥시에틸렌)-폴리(옥시프로필렌) 블록 중합체인 테트로닉스(상표명)(폴록사민스(POLOXAMINES)(상표명)라고도 공지됨)를 포함한다.
적합한 하이드로젤은 또한 방광, 장, 혈액 및 뇌를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 조직으로부터 유래된 하이드로젤로부터 유래된 미정의된 세포외 매트릭스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 개시된 EV는 콜라겐, 피브린, 실크, 아가로스, 알기네이트, 히알루로난, 키토산, 생분해성 폴리에스터, 예컨대 폴리락트산-co-글리콜산, 폴리라식산(polylacic acid), 또는 폴리글리콜산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에터설폰, 펩타이드-기재 생물물질, 글리코스 아미노 글리칸, 피브로넥틴, 라미닌 또는 이들의 조합물을 포함하는 생체 적합성 스캐폴드 중에 또는 그 상에 함유된다.
일부 경우에, 하이드로젤은 알긴산의 음이온성 염, 해조류로부터 단리된 탄수화물 중합체를 이온, 예컨대 칼슘 양이온으로 가교-결합시킴으로써 제조된다. 하이드로젤의 농도는 칼슘 이온 또는 알기네이트의 농도를 증가시킴으로써 증가된다. 예를 들어, 미국 특허 제4,352,883호에는 물 중에서 실온에서 알기네이트를 2가 양이온으로 이온 가교-결합시켜 하이드로젤 매트릭스를 형성하는 것이 기술되어 있다.
EV는 알기네이트 용액과 혼합되고, 그 용액은 미리 이식된 지지체 구조물로 전달되고, 이어서 칼슘 이온의 생체내 생리 농도의 존재로 인해서 단시간에 고화된다. 대안적으로, 이 용액은 이식 이전에 지지체 구조물로 전달되고, 칼슘 이온을 함유하는 외부 용액 중에서 고화된다.
일반적으로, 이들 중합체는 수성 용액, 예를 들어, 물 또는 하전된 측기를 갖는 수성 알코올 용액 또는 이들의 1가 이온성 염 중에서 적어도 부분적으로 가용성이다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측기를 갖는 중합체의 다수의 예, 예를 들어, 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 및 폴리(메타크릴산)이 존재한다. 산성 기의 예는 카복실산기, 설폰산기, 및 할로겐화(바람직하게는 플루오린화) 알코올기를 포함한다. 음이온과 반응할 수 있는 염기성 측기를 갖는 중합체의 예는 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐 피리딘) 및 폴리(비닐 이미다졸)이다.
폴리포스파젠은 단일 결합 및 이중 결합을 교호시킴으로서 분리된 질소 및 인 원자로 이루어진 골격을 갖는 중합체이다. 각각의 인 원자는 2개의 측쇄에 공유 결합되어 있다. 사용될 수 있는 폴리포스파젠은 산성이고 2가 또는 3가 양이온으로 염 브릿지를 형성할 수 있는 측쇄를 대부분 갖는다. 산성 측쇄의 예는 카복실산기 및 설폰산기이다.
생침식성(bioerodible) 폴리포스파젠은 적어도 2개의 상이한 유형의 측쇄, 다가 양이온으로 염 브릿지를 형성할 수 있는 산성 기, 및 생체내 조건 하에서 가수분해될 수 있는 측기, 예를 들어 이미다졸기, 아미노산 에스터, 글리세롤 및 글루코실을 갖는다. 생침식성 또는 생분해성 중합체, 즉, 목적하는 응용(통상적으로 생채내 요법)에서 허용 가능한 기간 내에 용해 또는 분해되는 중합체는 약 25℃ 내지 38℃의 온도를 갖는 pH 6 내지 8의 생리 용액에 노출될 때 약 5년 미만, 가장 바람직하게는 약 1년 미만 내에 분해될 것이다. 가수분해 측쇄의 예는 비치환된 및 치환된 이미다졸 및 아미노산 에스터이고, 여기서 측쇄는 아미노 링키지를 통해서 인 원자에 결합된다.
다양한 유형의 폴리포스파젠의 합성 및 분석 방법은 미국 특허 제 4,440,921호, 제4,495,174호 및 제4,880,622호에 기술되어 있다. 상기에 기술된 다른 중합체의 합성 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz, editor (John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1990)] 참고). 다수의 중합체, 예컨대 폴리(아크릴산), 알기네이트, 및 플루로닉스(상표명)은 상업적으로 입수 가능하다.
수용성 중합체는 중합체가 반대 전하의 다가 이온, 중합체가 산성 측기를 갖는 경우에는 다가 양이온, 또는 중합체가 염기성 측기를 갖는 경우에는 다가 음이온을 함유하는 수성 용액과 반응시킴으로써 가교-결합된다. 중합체를 산성 측기와 가교-결합시켜서 하이드로젤을 형성하기 위한 양이온은 2가 및 3가 양이온, 예컨대 구리, 칼슘, 알루미늄, 마그네슘, 및 스트론튬을 포함한다. 이들 양이온의 염의 수성 용액을 중합체에 첨가하여 부드럽고, 고도로 팽윤성인 하이드로젤을 형성한다.
중합체를 가교-결합시켜 하이드로젤을 형성하기 위한 음이온은 2가 및 3가 음이온, 예컨대 저분자량 다이카복실레이트 이온, 테레프탈레이트 이온, 설페이트 이온, 및 카보네이트 이온을 포함한다. 이들 음이온의 염의 수성 용액을 중합체에 첨가하여 양이온과 관련하여 기술된 바와 같이 부드럽고, 고도로 팽윤성인 하이드로젤을 형성한다.
항체가 하이드로젤 중에서 통과하는 것을 예방하지만 영양분의 도입을 허용하려는 목적을 위해서, 하이드로젤 중의 유용한 중합체 크기는 10,000D 내지 18,500D 범위이다.
온도-의존적인, 또는 감온성, 하이드로젤은 소위 "역 젤라틴" 특성을 갖고, 즉 이것은 실온 이하에서 액체이고, 더 높은 온도, 예를 들어 체온으로 가온될 때 젤이다. 따라서, 이들 하이드로젤은 실온 이하에서 액체로서 용이하게 적용될 수 있고, 체온으로 가온될 때 반-고체 젤을 자동적으로 형성한다. 그 결과, 이러한 겔은 지지체 구조물이 먼저 환자에게 이식되고, 이어서 하이드로젤-EV 조성물로 충전되는 경우 특히 유용하다. 이러한 온도-의존적인 하이드로젤의 예는 플루로닉스(상표명)(바스프-와이언도트(BASF-Wyandotte)), 예컨대 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 F-108, F-68, 및 F-127, 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드), 및 N-아이소프로필아크릴아마이드 공중합체이다.
이들 공중합체는 이의 물성, 예컨대 다공성, 분해율, 전이 온도 및 강직성도에 영향을 주는 표준 기술에 의해서 조정될 수 있다. 예를 들어, 염의 존재 및 부재 하에서의 저분자량 당류의 첨가는 전형적인 감온성 중합체의 더 낮은 임계 용해 온도(LCST)에 영향을 미친다. 또한, 이들 젤이 4℃에서 분산액 기준으로 5 내지 25%(W/V) 범위의 농도로 제조되는 경우, 점도 및 젤-졸 전이 온도가 영향을 받고, 젤-졸 전이 온도는 농도에 역으로 관련된다.
미국 특허 제4,188,373호에는 열 겔화 수성 시스템을 제공하기 위한 수성 조성물의 플루로닉(상표명) 폴리올이 기술되어 있다. 미국 특허 제4,474,751호, 제'752호, 제'753호 및 제4,478,822호에는 열경화성 폴리옥시알킬렌 젤을 사용하는 약물 전달 시스템이 기술되어 있는데; 이들 시스템에서는, 젤 전이 온도 및/또는 젤의 강직성이 pH 및/또는 이온 강도의 조정에 의해서, 뿐만 아니라 중합체의 농도에 의해서 변형될 수 있다.
pH-의존적인 하이드로젤은 특정 pH 값에서, 그 미만에서 또는 그 초과에서 액체이고, 특정 pH, 예를 들어, 인간 신체 내의 세포외 유체의 정상 pH 범위인 7.35 내지 7.45에 노출되는 경우 젤이다. 따라서, 이들 하이드로젤은 액체로서 이식된 지지체 구조물에 용이하게 전달되고, 신체 pH에 노출될 때 반-고체 젤을 자동적으로 형성할 수 있다. 이러한 pH-의존적인 하이드로젤의 예는 테트로닉스(상표명)(바스프-와이언도트) 에틸렌 다이아민의 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 중합체, 폴리(다이에틸 아미노에틸 메타크릴레이트-g-에틸렌 글리콜), 및 폴리(2-하이드록시메틸 메타크릴레이트)이다. 이들 공중합체는 이의 물성에 영향을 주는 표준 기술에 의해서 조정될 수 있다.
가시광 또는 자외광에 의해서 고화되는 하이드로젤은 미국 특허 제5,410,016호에 기술된 바와 같은 수용성 영역, 생분해성 영역 및 적어도 2개의 중합성 영역을 포함하는 마크로머로 제조될 수 있다. 예를 들어, 하이드로젤은 코어, 코어의 각각의 단부 상의 연장부 및 각각의 연장부 상의 단부 캡을 포함하는 생분해성, 중합성 마크로머에서 시작될 수 있다. 코어는 친수성 중합체이고, 연장부는 생분해성 중합체이고, 단부 캡은 가시광 또는 자외광, 예를 들어 장파장 자외광에 노출될 때 마크로머를 가교-결합시킬 수 있다.
이러한 광 고화되는 하이드로젤의 예는 폴리에틸렌 옥사이드 블록 공중합체, 아크릴레이트 단부기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 폴리락트산 공중합체, 및 양 단부에서 아크릴레이트에 의해서 캡핑된 10K 폴리에틸렌 글리콜-글리콜리드 공중합체를 포함한다. 플루로닉(상표명) 하이드로젤에서와 같이, 이들 하이드로젤을 포함하는 공중합체는 이들의 물성, 예컨대 분해율, 결정화도 차이 및 강직성도에 의해서 조정될 수 있다.
치료 방법
또한 대상체에게 유효량의 본 명세서에 개시된 신경 EV의 집단을 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 척수 상해, 뇌졸중, 외상성 뇌 상해 또는 신경퇴행성 질환을 갖는 대상체의 치료 방법이 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 파킨슨병-관련 장애, 헌팅톤병, 프라이온병, 운동 뉴런 질환(MND), 척수소뇌성 실조증(SCA) 또는 척수성 근위축(SMA)이다.
용어 "척수 상해"는 척수의 정상적인 운동, 자율신경 또는 감각 기능을 일시적 또는 영구적으로 변화시키는 척수 상해를 기술하는 데 사용된다. 손상은 자주 신체적 외상, 예컨대 스포츠 상해, 미끄러짐 및 낙상 사고 또는 자동차 사고로부터 유발되지만, 질환, 예컨대 이분척추, 프리드리히 운동실조증(Friedrich's ataxis) 및/또는 횡단척수염으로부터 유발될 수도 있다. 기능 손실을 유발하는 척수에 대한 상해는 척수가 완전히 절단된 결과일 필요는 없다. 척수 및 이의 신경근이 손상되는 장소에 따라서, 증상 및 손상 정도는 실금에서 마비까지 매우 달라질 수 있다. 척수 상해는 불완전한 상해에서 기능의 전체 손실을 유발하는 완전한 상해까지 다양한 수준으로 설명된다. 척수 상해는 대마비 또는 사지마비를 유발할 수 있다.
척수 상해의 전통적인 치료는 척추를 안정화시키고, 척수 상해와 연관된 염증을 제어하여 추가 손상을 예방하는 것으로 출발한다. 다른 중재는 위치 및 상해 정도에 따라서 상당히 달라질 수 있다. 많은 경우에, 종래의 요법을 사용하면, 척수 상해는 특히 상해가 일상 생활의 활동을 방해하는 경우에는, 상당히 장기간의 물리 치료 및 재활치료를 필요로 한다.
척수 상해는 이의 원인을 기초로 3종류로 분류될 수 있다: 기계력, 독성, 및 혈류의 부족으로부터의 허혈. 척수 상해는 또한 1차 상해 및 2차 상해로 나뉠 수 있다. 1차 상해는 본래 상해(신체 외상, 독소에 대한 노출 또는 허혈) 시에 즉시 일어나는 세포사에 의해서 유발되고, 2차 상해는 본래 발작에 의해서 유발된 결과적인 캐스케이드에 의해서 유발되고, 추가 조직 손상을 유발한다. 이들 2차 상해 경로는 염증, 종창, 신경전달물질 결핍/불균형, 허혈의 결과 및 세포 자살을 포함한다. 본 발명은 특히 완전 상해, 불완전 상해, 허혈, 방사선 이상이 없는 척수 상해, 중심 척수 증후군, 척수 전삭 증후군, 브라운-세카르 증후군(Brown-Sequard syndrome), 후 척수 증후군, 척수로 및 척수 원추를 비롯한 척수 상해의 모든 형태를 치료하는 데 사용될 수 있다.
용어 "뇌졸중"은 뇌혈관 사고(CVA), 뇌혈관 발작(CVI), 또는 뇌 공격을 기술하는 데 사용되며, 뇌로의 불량한 혈류가 세포사를 유발하는 경우 일어난다. 2가지 주요 유형의 뇌졸중이 존재한다: 혈류의 부족으로 인한 허혈성, 및 출혈로 인한 출혈성. 이들 유형의 뇌졸중 둘 모두는 뇌의 부분이 적절하게 기능하지 않는다. 뇌졸중의 징후 및 증상은 특히 신체의 한 부분 상에서의 운동 및 감각 무능력, 이해 및 대화 문제점, 스피닝 감각 또는 한쪽 시력의 손실을 포함할 수 있다. 징후 및 증상은 자주 뇌졸중이 발생한 직후에 보인다. 증상이 1 또는 2시간 미만으로 지속되는 경우, 일시적인 허혈성 공격으로서 공지되어 있다. 출혈성 뇌졸중은 또한 극심한 두통과 연관될 수 있다. 뇌졸중의 증상은 영구적일 수 있다. 뇌졸중의 장기간 합병증은 폐렴 또는 방광의 손실을 포함할 수 있다. 뇌졸중에 대한 주요 위험 인자는 고혈압이다. 다른 위험 인자는 특히 흡연, 비만, 고 혈중 콜레스테롤, 당뇨병, 이전의 일과성 허혈성 발작(TIA), 및 심방 세동을 포함한다. 허혈성 뇌졸중은 전형적으로 혈관의 폐색에 의해서 유발된다. 출혈성 뇌졸중은 뇌 또는 뇌 주변의 공간으로의 직접적인 출혈에 의해서 유발된다. 출혈은 뇌 동맥류로 인해서 일어날 수 있다. 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중 둘 모두가 본 발명에 따라서 치료된다.
용어 "외상성 뇌 손상"(TBI)은 관련 기술 내에서 뇌의 움직임에 의해서 유발되는 뇌에 대한 상해 또는 이물질에 의해서 유발되는 뇌에 대한 상해를 기술하는 데 사용된다. TBI의 원인은 낙상, 차량 충돌 또는 물체에 의한 또는 물체와의 부딪침을 포함할 수 있다. TBI는 관통하는 물체 - 두개골로 들어간 이물질에 의해서 유발된 뇌에 대한 상해에 의해서도 유발될 수 있다. 원인은 화기 상해 또는 뾰족한 물체와의 부딪침을 포함할 수 있다. TBI는 뇌진탕, 무의식 기간(코마) 또는 기억상실을 유발할 수 있다. TBI는 인지 기능(예를 들어, 주의력 및 기억력), 운동 기능(예를 들어, 말단 약화, 조정력 및 균형 손상), 감각(예를 들어, 청각, 시각, 지각 및 촉각 및 감정 손상(예를 들어, 우울증, 불안, 공격성, 충동 제어, 성격 변화) 중 하나 이상을 손상시킬 수 있다.
용어 "신경퇴행성 질환"은 본 명세서 전체에서 중추 신경계에 대한 손상에 의해서 유발된 질환을 기술하는 데 사용되며, 이 손상은 본 발명에 따른 신경 세포를 환자의 뇌 및/또는 척수의 손상된 영역에 이식함으로써 감소 및/또는 개선될 수 있다. 본 발명에 따른 신경 세포 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 예시적인 신경퇴행성 질환은 예를 들어, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭경화증(루게릭병), 알츠하이머병, 리소좀 축적 질환(예를 들어, 문헌[Folkerth,　J. Neuropath. Exp. Neuro., 　58, 9, Sep., 1999]에 기술된 바와 같은 "백질 질환" 또는 신경아교/탈수초 질환), 테이삭스병(베타 헥소사미미다제 결핍), 다른 유전 질환, 다발성 경화증, 뇌 손상 또는 허혈, 사고, 환경적 발작 등에 의해서 유발된 외상, 척수 상해, 운동실조 및 알코올 중독을 포함한다. 또한, 본 발명은 환자의 뇌 내의 부위에 대한 혈류 부족 또는 허혈에 의해서 유발되거나 또는 뇌 및/또는 척수에 대한 신체 상해로부터 일어난 환자에서 뇌졸중 또는 심장 발작의 중추 신경계에 대한 효과를 감소 및/또는 제거하는 데 사용될 수 있다. 용어 신경퇴행성 질환은 또한 특히 예를 들어, 자폐증 및 관련된 신경학적 질환, 예컨대 조현병을 비롯한 예를 들어, 신경발달 장애를 포함한다.
약제학적 조성물을 비롯한 본 명세서에 개시된 조성물은 국소 치료가 바람직한지 전신 치료가 바람직한지에 따라서 그리고 치료될 영역에 따라서 다수의 방식으로 투여될 수 있다.
대상체의 치료 방법은 본 명세서에 기술된 유효량의 EV 및 임의로 적어도 1종의 추가적인 생물활성(예를 들어, 신경퇴행성 질환, 뇌졸중 및/또는 척수 상해의 치료에 유용한 작용제) 작용제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 100㎎/㎏ 환자/일 또는 일부 실시형태에서, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200㎎/㎏ 초과의 개시된 EV가 이들 조성물이 제공되는 환자에 투여될 수 있도록 제형화될 수 있다.
대상체에게 투여되는 EV의 용량은 10㎍ 미만, 25㎍ 미만, 50㎍ 미만, 75㎍ 미만, 0.10㎎ 미만, 0.25㎎ 미만, 0.5㎎ 미만, 1㎎ 미만, 2.5㎎ 미만, 5㎎ 미만, 10㎎ 미만, 15㎎ 미만, 20㎎ 미만, 50㎎ 미만, 75㎎ 미만, 100㎎ 미만, 500㎎ 미만, 750㎎ 미만, 1g 미만 또는 1g 초과일 수 있다. 투여는 다수의 투여 경로에 의해서 수행될 수 있지만, 정맥내, 척추강내, 비강내 및/또는 뇌척수액내가 투여 경로로서 자주 사용된다.
일부 실시형태에서, 개시된 EV는 뇌졸중 또는 외상 후 24시간 이내에 투여된다. 그러나, 일부 실시형태에서, EV는 뇌졸중 또는 외상 후 적어도 1, 2, 3, 또는 4주 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 개시된 EV는 1, 2, 3, 또는 그 초과의 일수 간격의 다회 용량으로 투여된다. 일부 경우, 예컨대 신경퇴행성 질환의 경우에, EV는 질환 기간에 걸쳐서 연속적으로(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4주마다 1회) 투여된다.
EV에는 신경퇴행성 과정에 관여되는 펩타이드 또는 펩타이드 번역 산물을 표적으로 하는 소분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 펩타이드, 단백질 또는 항체가 적재될 수 있다.
특정 실시형태에서, 개시된 EV에는 추가적인 생물활성제가 적재되거나, 개시된 EV는 추가적인 생물활성제, 특히 신경퇴행성 질환의 치료에 유용한 작용제와 함께 공동-투여된다.
용어 "공동투여된", "공동투여" 또는 "병용 요법"은 유효량의 적어도 2종의 활성 화합물/조성물이 신경 손상 및/또는 신경퇴행성 질환을 치료하는 데 사용되는 요법을 기술하는 데 사용된다. 용어 공동-투여는 바람직하게는 EV 및 적어도 1종의 활성 화합물을 동시에 대상체에게 투여하는 것을 포함하지만, 화합물/조성물이 환자에게 동시에 투여될 필요는 없고, 단지 유효량의 개별 화합물/조성물이 동시에 환자 중에 존재한다. 따라서, 용어 공동-투여는 EV 및 생물활성제(들)가 대략 동시에(동일시기에(contemporaneously)), 또는 본 명세서에 달리 기술된 바와 같이 최대 1일 또는 실질적으로는 그 초과를 비롯하여 약 1 내지 수분 내지 약 8시간, 약 30분 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 4시간, 또는 다른 화합물/조성물보다 훨씬 더 빨리 투여되는 투여를 포함한다.
EV와 함께 적재 또는 공동투여될 수 있는 작용제는 예를 들어, 알츠하이머병을 위한 아리셉트, 나멘다, 도네페질, 엑셀론, 라자다인, 글란타민, 리바스티그민, 메만틴, 에르골로이드, 남자릭 및 이들의 혼합물, 파킨슨병을 위한 비페리덴, 아포모르핀, 트라이헥시페니딜, 카비도파/레보도파, 라사글린, 벨라도나, 레보도파, 벤즈트로핀, 엔타카폰, 셀레질린, 리바스티그민, 프라미펙솔, 로티고틴, 브로모크립틴, 퍼골리드, 로핀롤, 카비도파/엔타카폰/레보도파, 아만타딘, 톨코폰, 트라이헥시페니딜 및 이들의 혼합물, 헌팅톤병의 치료를 위한 테트라베나진, 할로페리돌, 클로프로마진, 올란자핀, 플루옥세틴, 서트랄린, 노트립틸린, 벤조다이아즈핀, 파록세틴, 벤라팍신, 베타-차단제, 리튬, 발프로에이트, 카바마제핀, 보툴리넘 독소 및 이들의 혼합물, 운동 뉴런 질환의 치료를 위한 항콜린성 약물, 항경련제, 항우울제, 벤조다이아제핀, 충혈완화제, 근육 이완제, 진통제, 흥분제 및 이들의 혼합물, 척수소뇌성 실조증의 치료를 위한 선택적 세로토닌 재흡수 저해제(SSRI's), 선택적 노르에피네프린-세로토닌 재흡수 저해제(SNRI's), 아세타졸라마이드, 바클로펜, 클로나제팜, 플루나리진, 가바펜틴, 메클리진, 메만틴, 온단세트론, 스코폴아민, 모다피닐, 아르모다피닐, 아만타딘, 아토목세틴, 부프로프리온, 카니틴, 크레아틴, 모다피닐, 아모다피닐, 피루다이스티그민, 셀레길린, 벤라팍신, 데스벤라팍신, 부스피론, 릴루졸, 베렌클린, 메만틴, 바클로펜, 티자니딘, 심발타, 리리카, 아세타졸라마이드, 카바마제핀, 클로나제팜, 이소니아지드, 드록시도파, 에페드린, 플루드로코티손, 미도드린, 레보도파, 프라미펙솔, 플루옥세틴, n-아세틸시스테인, 바클로펜, 단트롤렌, 나트륨, 다이아제팜, 로피니롤, 티자니딘, 트라이헥실페니딜, 클로나제핀, 플루나라진, 레베티라세탐, 프리미돈, 토피라메이트, 발프로산, 페니토인, 4-아미노피리딘 및 이들의 혼합물 및 척수성 근위축의 치료를 위한 릴루졸을 포함할 수 있다. 뇌졸중의 치료를 위한 작용제는 특히 살리실레이트, 예컨대 아스피린, 혈정 용해제(알테플라제) 및 혈소판 응집 저해제(클로피도그렐)를 포함한다.
보다 일반적으로, 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAIDS) 및 다른 항-염증성 작용제는 본 명세서에 기술된 바와 같은 신경퇴행성 질환의 치료에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 EV의 활성은 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해서 평가될 수 있다. 이러한 치료에 사용하기 위해서 요구되는 EV의 양은 EV가 제조된 특정 세포뿐만 아니라, 투여 경로, 치료될 병태의 본성 및 환자의 연령 및 병태에 따라서 달라질 수 있고, 궁극적으로는 참여 의사 또는 임상의의 재량일 수 있다. 그러나, 일반적으로, 용량은 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏ 체중/1일 범위일 수 있다.
질환-관련 단백질 및 이의 생물학적 활성 단편의 활성 및 발현을 조절함으로써 일어나는 척수 상해, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및/또는 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 본 방법에서 유용한 EV를 식별하는 것은 임의의 다양한 스크리닝 기술로 EV 활성을 스크리닝함으로써 행해질 수 있다. 스크리닝은 전체 EV 또는 이의 내용물에 대해서 수행될 수 있다. 이러한 스크리닝 시험에 사용되는 단편은 용액 중에서 자유롭거나, 고체 지지체에 부착되거나, 세포 표면 상에 담지되거나 세포내에 위치될 수 있다. 질환-관련 단백질, EV 및/또는 EV의 1종 이상의 성분 간의 결합 복합체의 생물학적 활성 또는 형성의 차단 및 감소는 관련 기술 분야에서 입수 가능한 방법에 의해서 측정될 수 있다.
본 발명의 다수의 실시형태가 기술되어 있다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 행해질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시형태는 하기 청구범위의 범주에 포함된다.
실시예
연구를 수행하여 EV가 신경 줄기세포에 주변분비(paracrine) 이익을 제공하고, 최적의 시험관내 신경 배양 조건 및 신경 줄기세포 치료의 치료 결과 둘 모두에서 역할을 하는지의 여부를 결정하였다. 본 연구의 목적은 신경 계통의 인간 줄기세포, 구체적으로 신경 전구세포 세포 및/또는 분화된 유사분열후 뉴런 세포로부터 EV를 단리하는 것이 가능한지의 여부를 결정하는 것이었다. EV를 인간 만능 줄기세포주로부터 유래된 신경 전구세포 세포(SOX 1+ 및 2+, OCT4-; hNP1(상표명) 아룬에이 바이오메디컬) 또는 분화된 뉴런 세포(β-III 튜불린(Tuj1) +, MAP2+, Oct4-); hN2(상표명) 아룬에이 바이오메디컬)로부터 분리하였다.
실시예 1:
인간 만능 줄기세포[문헌[Chambers, et al., Methods Mol Biol, 2016. 1307: p. 329-43] 참고]주를 피더 무함유 조건 또는 넉-아웃 혈청 대체(KSR) 배지로 구성된 배지(DMEM=F12, 2mM L-글루타민, 0.1mM MEM 비필수 아미노산, 50U/㎖ 페니실린, 50㎎/㎖ 스트렙토마이신, 및 20% KSR(모두 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코 제품) 및 4ng/㎖ 염기성 섬유모세포 성장 인자 bFGF; 알앤디 시스템스(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하여 혈청 부재 배지, 예컨대 MTeSR 또는 E8(이것은 판매처, 예컨대 스템 셀 테크놀로지(Stem Cell Technology)로부터 상업적으로 입수 가능함) 중에서 배양하였다. 세포를 미토마이신-C(시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 유사분열 불활성화된 뮤린(murine) 배아 섬유모세포(MEF) 상에서 또는 피더 없이 배양하고, 수동으로 또는 효소적으로 해리시키고, 2 내지 5일마다 새로운 피더층으로 계대시켰다. 컨디셔닝된 배지 중에서의 hPSC의 피더-무함유 배양의 경우, MEF 상에서 성장된 세포를 PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 무함유)로 1회 세척하고, 이어서 MEF 층이 접시에 생성되기 시작할 때까지 0.25% 트립신(깁코)과 함께 인큐베이션시켰다. 교반 후 부유하는 MEF 층을 폐기하여, 수집된 접착성 줄기세포를 방출시키고, 원심분리하고, MEF-컨디셔닝된 배지(CM) 중에서 재현탁시켰다. 20% KSR 배지를 MEF 상에 24시간 동안 놓고, 이어서 수집된 배지에 추가적인 4ng/㎖의 bFGF를 보충함으로써 CM을 제조하였다 세포를 라미닌 기질(1㎎/㎠; 시그마)로 코팅된 조직 배양 접시 상에 플레이팅하고, 약 90%의 컨플루언스까지 성장시켰다. 세포를 적어도 3회 계대시켜 MEF 오염을 최소화하였다[문헌[Boyd, et al., Tissue Eng Part A, 2009. 15(8): p. 1897-907, Mumaw, et al., Microsc Microanal, 2010. 16(1): p. 80-90 and Young, et al., Neuroscience, 2011. 192: p. 793-805] 참고]. 배양 방법에 관계없이, 모든 배지를 수집하고, EV를 배지로부터 수집하고, 환자를 치료하는 데 사용한다.
새로운 피더 세포 상에서의 수동 계대 후, hESC를 ES 배지 중에서 7일 동안(1기) 증식시켰다. 이어서 세포 분화를 DN2, MEDII 또는 ES 배지와 함께 또 다른 7일 동안(2기) 유도하였다. DN2 배지는 N2(깁코), L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 및 4ng/㎖ bFGF가 보충된 DMEM/F12-기반 배지이다. 본 연구를 위한 MEDII 배지는 컨디셔닝된 배지로 (달리 언급되지 않은 한) 50% 보충된 DN2 배지이다. 여기서 적용된 분화 단계를 이해하고 따르기 위해서, 표현형 마커 발현을 다양한 시간 간격에서 관찰하였다. 1, 2 및 3기에서, 집단을 수거하고, 마커 Musashi-1, Nestin 및 Oct-4를 관찰하였다. 면역세포화학 분석을 또한 접착성 세포 집단 상에서 수행하였다. 두 기 모두에서 세포를 Nestin 및 Oct-4로 이중-염색하고, 모폴로지와 연관된 면역세포화학 관찰을 위해서 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 이어서 표현형 차이를 나타낸 군을 유세포 분석법을 사용하여 이들 동일한 마커에 대한 정량 분석에 적용하였다. 달리 기재되지 않는 한 모든 실험을 3회 반복하였다. 새로운 피더 세포 상에서의 수동 계대 후, hESC를 ES 배지 중에서 7일 동안(1기) 증식시켰다. 이어서 세포 분화를 DN2, MEDII 또는 ES 배지와 함께 또 다른 7일 동안(2기) 유도하였다. DN2 배지는 N2(깁코), L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 및 4ng/㎖ bFGF가 보충된 DMEM/F12-기반 배지이다. 본 연구를 위한 MEDII 배지는 컨디셔닝된 배지(상기에 기술됨)로 (달리 언급되지 않은 한) 50% 보충된 DN2 배지이다. 1, 2 및 3기 집단을 수거하고, 마커 Musashi-1, Nestin 및 Oct-4를 관찰하였다. 면역세포화학 분석을 또한 접착성 세포 집단 상에서 수행하였다. 두 기 모두에서 세포를 Nestin 및 Oct-4로 이중-염색하고, 모폴로지와 연관된 면역세포화학 관찰을 위해서 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 이어서 표현형 차이를 나타낸 군을 유세포 분석법을 사용하여 이들 동일한 마커에 대한 정량 분석에 적용하였다. 달리 기재되지 않는 한 모든 실험을 3회 반복하였다.
새로운 피더 세포 상에서의 수동 계대 후, hESC를 ES 배지 중에서 7일 동안(1기) 증식시켰다. 이어서 세포 분화를 DN2, MEDII 또는 ES 배지와 함께 또 다른 7일 동안(2기) 유도하였다. DN2 배지는 N2(깁코), L-글루민, 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 및 4ng/㎖ bFGF가 보충된 DMEM/F12-기반 배지이다. 본 연구를 위한 MEDII 배지는 컨디셔닝된 배지(상기에 기술됨)로 (달리 언급되지 않은 한) 50% 보충된 DN2 배지이다. 1, 2 및 3기에서, 집단을 수거하고, 마커 Musashi-1, Nestin 및 Oct-4를 관찰하였다. 면역세포화학 분석을 또한 접착성 세포 집단 상에서 수행하였다. 두 기 모두에서 세포를 Nestin 및 Oct-4로 이중-염색하고, 모폴로지와 연관된 면역세포화학 관찰을 위해서 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 이어서 표현형 차이를 나타낸 군을 유세포 분석법을 사용하여 이들 동일한 마커에 대한 정량 분석에 적용하였다. 달리 기재되지 않는 한 모든 실험을 3회 반복하였다.
hPSC를 hPSC 배지(상기에 기술된 것 중 임의의 것) 중에서 대략 5 내지 10일(1기) 동안 단층으로서 또는 배상체로서 증식시켰다. 이어서 배지, 전형적으로 N2(깁코), L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 및 통상적으로 4ng/㎖ bFGF가 보충된 DMEM/F12-기반 배지로 세포 분화를 유도하였다. Nestin 및 Oct-4를 관찰하였고, 신경 로제트가 관찰되었다. 신경 로제트를 단리하고(수동 또는 효소적으로), 면역세포화학 분석을 또한 접착성 로제트 집단 상에서 수행하였다. 두 기 모두에서 세포를 Nestin+ 및 Oct-4로 이중-염색하고, 모폴로지와 연관된 면역세포화학 관찰을 위해서 형광 현미경 하에서 관찰하였다[Shin, et al., Stem Cells, 2006. 24(1): p. 125-38]. 오염 세포 대부분으로부터 단리되는 경우 로제트는 인간 신경 전구세포 세포인 것으로 간주된다. 간략하면, hNP 세포를 폴리-오르니틴(20㎎/㎖) /라미닌(시그마-알드리치, 인크.)(5㎎/㎖) 코팅된 플레이트 또는 다른 ECM, 예컨대 마트리겔 상에서 성장시키고, 2mM L-글루타민 및 20ng/㎖ b-FGF를 함유한 배지 중에서 유지 및 확장시켰다. hNP 세포를 대략 48시간 마다 계대시키고, 수동 해리에 따라서 1:2로 분할시켰다[상기 문헌[Mumaw, et al.], [Young, et al.] 및 [Dhara, et al., Methods Mol Biol, 2011. 767: p. 343-54] 참고].
대안적으로, 신경 유도는 액티빈/노달 경로, 및/또는 BMP 신호전달의 저해제를 사용하여 SMAD 신호전달을 저해함으로써 자극될 수 있다(저해제의 예는 Noggin, SB431542[Chambers, et al. Nat Biotechnol, 2009. 27(3): p. 275-80], 화합물 C[Zhou, et al., Stem Cells, 2010. 28(10): p. 1741-508], 또는 단독 또는 조합된 다른 전략일 수 있음). 세포는 소닉 헤지호그의 존재 또는 부재 하에서 마트리겔 또는 다른 세포외 매트릭스 상에서, AB2, 뉴로바살(Neurobasal), 또는 상기에 열거된 다른 배지 중에서 배양될 수 있다[상기 문헌[Chambers, et al.], 및 상기 문헌[Zhou, et al.]].
hNP 세포를 bFGF 및 LIF 없이 상기에 기술된 유지 배지 하에서 폴리-오르니틴 및 라미닌 코팅된 플레이트 또는 다른 ECM, 예컨대 마트리겔 상에서 뉴런으로 분화시켰다. 대안적으로 LIF 또는 EGF를 hNP 세포에 첨가하고, 이들 두 조건 하에서 1 내지 7주 동안 분화시켰다[상기 문헌[Mumaw, et al.], 및 상기 문헌[Dodia, et al., PLoS One, 2011. 6(8): p. e232669]].
(bFGF 또는 bFGF와 LIF 또는 EGF 없이 유지 배지 중에서 2개의 조건 하에서) 뉴런 분화, 예컨대 폴리-오르니틴 및 라미닌 코팅된 플레이트 상에서 뉴런으로 분화된 hNP 세포 1 내지 4주 후, 신경을 hNSC 유지 배지로부터의 세포로부터 1% FCS(깁코)가 보충된 염기성 배지(DMEM 햄스 F12 배지, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신)로 스위칭시킴으로써 성상세포 분화를 유도하였다(상기 문헌[Mumaw, et al.] 및 상기 문헌[Young, et al.] 참고). 마지막으로, 유지 배지를 10%의 FCS를 함유하는 염기성 배지에 의해서 대체함으로써 다중선형 분화를 달성하였다. 45 내지 50일 후 배양물은 신경아교 마커 S100β 및 비멘틴에 대해서 거의 100% 양성이었다[Palm, et al., Sci Rep, 2015. 5: p. 1632110].
대안적으로, hNP 세포를 기술된 바와 같은(상기 문헌[Shin et al.]) 증식 배지(예컨대 AB2(상표명), ANS(상표명) 뉴로바살(상표명), 1Х B27, 1Х 글루타맥스(Glutamax)(상표명), P/S, FGF2(10ng/㎖) 중에서 접착성 단층 배양물로서 성장시키고, FGF의 제거에 의해서 분화시켰다. hNP 세포의 성상세포 분화를 위해서, 뉴런 분화 배지에 재조합 단백질, 예컨대 BMP2 및 화학물질 예컨대 아자사이티딘, 트라이코스타틴 A 또는 유사한 분자의 조합물을 1 내지 5일 동안 보충하였는데, 그 사이에서 완전 배지를 변화시키고, 그 다음 별개로 또는 조합으로 그 분자가 보충된 분화 배지로 변화시켰다. 세포를 분석 전에 5, 15 또는 30일 처리에서 또는 분화 d6 또는 d10에서 저온보존을 위해서 수거하였다. 저온보존을 위해서, 세포를 아큐타제(Accutase)(상표명)로 해리시키고, 10% DMSO를 함유하는 분화 배지 중에서 동결시켰다[Majumder, et al., Stem Cell Res, 2013. 11(1): p. 574-86].
상기에 기술된 바와 같이 피더 없이 배양된 hPSC가 대략 90%의 컨플루언스에 도달한 경우, 100㎜ 접시를 PBS++(Ca2+ 및 Mg2+ 함유함)로 세척하고, 10㎖의 새로운 내피 성장 배지 2 미세혈관(EGM2-MV)(론자(Lonza); 5% FBS, 사유 내피 기저 배지 2(EBM2) 기저 배지 및 bFGF, VEGF, EGF 및 R3-IGF-125의 농축물)로 교체하였다. 배지를 20 내지 30일의 기간에 걸쳐서 2 내지 3일 마다 변화시켰다. hESC로부터 상피막으로의 전이가 완결된 후, 세포를 T75 플라스크로 트립신 통과시키고, 컨플루언스까지 성장시켰다. 초기 세포 배양물을 확장시키기 위해서, 세포를 계대시키고, 플라스크당 대략 4 x 104개 세포/㎠의 표적 밀도로 시딩하였다. 실험을 위한 후속 배양을 위해서, 세포를 106 세포=T75 플라스크(대략 1.3 x 105개 세포/㎠)로 계대배양시키고, 5 내지 7일에 걸쳐서 컨플루언스까지 성장시켰다[상기 문헌[Boyd, et al.]].
실시예 2:
방법
세포 배지를 컨플루언트 배양물로부터 배지 변화 24시간 후 수집하였고, -20℃에서 동결시켰다. 배지를 4℃에서 밤새 해동시키고, EV 정제 전에 0.22㎛ 스터플립 유닛(Steriflip unit)을 통해서 여과하였다.
초원심분리에 의한 세포외 소포 정제.
세포 배양 배지로부터의 세포외 소포의 단리를 문헌[Thery, C., et al., Isolation and Characterization of EVs from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids, in Current Protocols in Cell Biology. 2001, John Wiley & Sons, Inc]에 의해서 공개된 프로토콜에 따라서 수행하였다. 간략하면, 여과된 배지를 300 x g에서 10분 동안 순차적으로 원심분리하고, 상청액을 2,000 x g에서 10분 동안의 원심분리를 위해서 새로운 튜브로 옮겼다. 이어서, 수집된 상청액을 10,000 x g에서 30분 동안 원심분리하고, 생성된 상청액을 새로운 튜브에 수집하였다. EV를 표지하기 위해서, DiI를 10㎛의 최종 농도로 정제된 상청액에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 상청액을 11.5㎖ 소발 울트라크림프(Sorvall Ultracrimp) 튜브에 분포시키고, 밀봉하고, 그 후 100,000 x g에서 70분 동안 4℃에서의 원심분리를 위해서 소발 T880 고정각 회전자로 옮겼다. 상청액을 주의하면서 제거하고, 펠릿화된 물질을 PBS 중에 재현탁하고, 또 다른 울트라크림프 튜브로 옮기고, 다시 100,000 x g에서 70분 동안 4℃에서 원심분리하였다. PBS를 제거하고, 각각의 튜브로부터의 펠릿화된 물질을 100㎕ PBS 중에 재현탁하였다. 동일한 세포 유형으로부터의 모든 정제된 EV를 풀링시키고, 분말화하고, -20℃에서 저장을 위해서 DNase/RNase 무함유 튜브(20 내지 50㎕ 분취물)에 분취하였다.
초미세여과에 의한 세포외 소포 정제
세포외 소포의 초미세여과를 심장근육세포 유래된 세포외 소포의 정제를 위해서 개발된 절차에 따라서 수행하였다. 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-15 100kDa 분자량 컷오프 필터를 10㎖ PBS로 습윤시키고, 스윙잉 부켓 로터(swinging bucket rotor)에서 4,000 x g로 10분 동안 원심분리하였다. PBS를 폐기하고, 세포 배양 배지를 필터에 대략 15㎖/튜브로 첨가하고, 4,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 줄기세포 유래된 세포외 소포를 여과할 때 또 다른 15㎖ 배양 배지를 필터에 첨가하였는데, 그 이유는 더 적은 배지가 제1 런 쓰루(run through)로부터 필터에 보유되어서, 총 대략 30㎖의 배지가 H9 유래된 NP, 성상세포, 및 MSC주에 대해서 여과된 반면, 단지 15㎖의 배지가 SH SY5Y 세포에 대해서 여과되었기 때문이며; 필터 내의 배지를 4,000 x g에서 5분 증분으로 원심분리하여 대략 1㎖의 잔여물을 얻었다. 이어서 이것을 DiI 표지화(10㎛에서 30분 동안)를 위해서 1.5㎖ 튜브로 옮기거나 또는 비표지된 정제를 위해서 PBS로 15㎖로 희석시키고, 2회 세척한 후, 1 내지 1.5㎖의 최종 부피가 수득될 때까지 5분 원심분리 증분을 반복하였다. 이어서 정제된 세포외 소포 제제를 동일한 세포 유형으로부터 풀링시키고, 대략 100㎕ 분취물(DNase/RNase 무함유 튜브)로 분산시키고, -20℃에서 저장하였다.
DiI-표지화 소포
표지된 소포를 초미세여과에 의해서 생성하였다. 초미세여과가 완결된 후, 필터 잔여물을 원심분리 튜브로 옮기고, 10㎛ DiI를 상청액에 30분 동안 첨가하였다. 이 시간 동안 PBS를 여과 유닛에 첨가하여 필터가 마르는 것을 예방하였다. 표지제와의 인큐베이션 후, 상청액을 다시 여과 장치로 옮기고, PBS(대략 45㎖)로 3회 세척하여 유리 표지(free label)를 제거하였다. 최종 세척 후 잔여물을 대략 1㎖로 농축시키고, 이것을 분취시키고, -20℃에서 저장하였다.
전자 현미경
소포 제제를 4% 파라폼알데하이드(PFA)와 1:1로 혼합하고(최종 2% PFA를 산출함), 15분 동안 인큐베이션시켰다. 고정된 소포 현탁액 5㎕ 액적을 폼바(Formvar)-코팅된 격자로 20분 동안 옮기고, 이어서 PBS 방울로 옮김으로써 세척하였다. 격자를 1% 글루타알데하이드 방울 상에 5분 동안 옮기고, 이어서 몇방울의 물 위로 이동시켜 잔류하는 글루타알데하이드를 제거한 후 우라닐-옥실레이트로 옮겼다. 격자를 80kV에서 전자 현미경에 의해서 영상화하였다.
결과
초기 보고는 신경 전구세포 세포가 다른 세포 유형보다 더 적은 EV를 분비한 것을 나타낸 반면, 세포의 초미세구조 분석은 식작용 기원의 현저한 소포(도 2A 내지 도 2C)를 드러내었고, 다수가 세포의 외부 경계막과 인접하거나 그것과 연관되었다(도 2D, 도 2E). 다소포체(MVB) 내의 카고는 크기가 다양하고(도 2B, 도 2C), 소포 내에서의 돌출이 가끔 가시화된다(화살표). 더 작은 소포는 더 큰 MVB로 합쳐지는 것 같은데, 그 이유는 그것이 세포의 주변부로 이동하기 때문이다(도 2F, 2G). 신경 전구세포 세포의 배지로부터 소포를 정제 및 가시화하는 것이 가능하였다(도 2H). 이러한 데이터는, 신경 전구세포 세포가 세포외 소포를 세포 매질로 방출하여, 이들 소포가 공개된 EV 정제 프로토콜을 사용하여 정제될 수 있음을 시사한다. 모든 스케일 막대는 500㎚이다.
신경 전구세포 세포가 전자 현미경에 의해서 정제 및 가시화될 수 있는 EV를 생산하는 능력을 갖는 것을 확인한 후, 다수의 세포 유형으로부터 정제된 소포를 특징규명하는 공정을 쿠마시 염색(도 3A), 및 총 단백질 함량의 BCA 분석(도 3B)에 의한 단백질 프로파일링으로 시작하였다. 단백질 프로파일을 신경 전구세포 세포, 분화된 신경 세포 및 성상세포(모두 동일한 ES 세포주로부터 유래됨), 및 양성 대조군으로서 사용된 인간 신경모세포종 세포주인 SH SY5Y 세포와 비교하였다. 초기 실험은, 단백질 프로파일이 중첩되지만, 세포가 동일한 유전적 기원을 가짐에도 불구하고, 신경 전구세포 및 분화된 신경세포에서 상이한 단백질이 존재함을 나타낸다. 유사하게, 동일한 유전적 기원으로부터의 신경 전구세포, 및 성상세포 세포로부터의 소포의 크기 프로파일의 비교는, 2개의 세포 유형으로부터의 소포의 크기가 중첩되지만(높은 백분율의 55㎚ 소포를 포함함), 두 세포 유형 사이에서 다른 상이한 하위집단이 존재함을 나타내는데, 성상세포는 25㎚ 집단, 및 약간 더 큰 135㎚ 집단을 포함하는 독특한 소포 크기를 나타낸다(도 3C, 도 3D). 종합해보면, 이들 데이터는 카고가 MVB 내로 특이적으로 표적화되어, 이들 카고는 분화 과정이 변화되는데, 이는 발달 과정 전체에서 세포 의사소통에 대한 세포에서의 EV에 대한 역할을 뒷받침한다.
EV를 표지화하고, 이것의 또 다른 세포에 의한 흡수를 가시화하는 것이 가능한지를 결정하기 위해서, 분화된 신경 세포(섬유모세포 성장 인자(FGF)가 없는 분화 배지 중에서 6 내지 8주)를 30초부터 30분까지 범위의 시점에서 성상세포 유래된 소포로 처리하고, 그 후 세포를 고정시키고, β-III 튜불린에 대해서 염색하였다. 극초기 시점에서, 몇몇 소포가 세포에서 발견되었다(도 4A 내지 도 4C). 배양물 중에서 5분까지, 두드러진 적색 형광을 갖는 신경 세포를 발견할 수 있었는데, 이는 이들 세포에서 소포 흡수를 나타낸다(도 4D 내지 도 4F).
이들 소포가 수용 세포에서 효과를 발휘할 수 있는지를 결정하기 위해서, 분화된 신경 세포를 신경 전구세포, 성상세포 또는 MSC(모두 동일한 ES 세포주로부터 유래됨), 또는 SH SY5Y 세포로부터 유래된 소포의 연속 희석된 농축물로 처리하였다. 이어서 이들 세포를 영양 박탈에 10일에 걸쳐서 적용하고, 신경돌기 결과물에 대해서 분석하였다. 예견된 바와 같이, PBS 만이 제공된 웰에서, 단층이 파괴되고, 몇몇 세포가 남아있었다(도 5D). 그러나, 신경 전구세포 또는 성상세포로부터의 EV의 최고 농도가 제공된 세포는 이러한 영양 박탈에서 살아남을 수 있었고, 무손상 신경돌기를 갖는 세포의 단층이 여전이 거의 무손상 상태였다(도 5A, B). MSC 유래된 EV로 처리된 웰은 미처리 웰보다 더 많은 세포를 함유하였지만, 단층은 더 이상 무손상 상태가 아니었고, 신경돌기는 상당히 손실되었다(도 5C). 이들 데이터는, 소포 처리가 영양 박탈로부터 수용 세포를 보호하였다는 것을 나타내고, 중요하게는, 소포가 동질 또는 자가 기원으로부터 유래함에도 불구하고, 세포가 상이한 세포 유형으로부터 기원한 소포에 상이하게 반응하는 것을 나타낸다.
종합해보면, 이들 데이터는 그 결과 기원의 모 공급원이 소포에 영향을 갖는다는 생각을 뒷받침한다. 이는 세포외 소포를 재생 의학을 위해서 잠재적으로 개발될 수 있는 치료 기원으로서 고려하는데 큰 영향을 갖고, CNS 상해 및/또는 질환의 치료를 위한 신경 기원으로부터 유래된 소포에 대한 필요성을 강조한다. 중요하게는, 이들 데이터는 또한 뉴런 유래된 소포, 뿐만 아니라 신경아교 소포도 시험관내에서 이익을 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 3:
생물분포 방법: 단일-광자 방출 분광학에 의한 설치류 생물분포. PBS 중의 1.5 내지 2mCi의 인듐-111-옥신을 EV(약 2.7 x 1011개 소포/㎏)를 함유하는 200㎕ 용량에 첨가하고, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 아미콘 100kDa 초미세여과 장치를 통한 3회의 반복된 PBS 세척에 의해서 유리 인듐을 제거하였다. 수집된 EV를 용량당 200μCi의 방사능으로 희석시키고, 뇌졸중 후 1시간 또는 24시간에 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 주사하였다. 대조군 동물에게 유리 인듐-111-옥신을 주사하였다. 전신 및 두부 단일 광자 방출 분광학(SPECT) 영상을 주사 1 및 24시간 후에 메디소 나노스캔 마이크로SPECT/CT(Mediso's nanoScan microSPECT/CT) 시스템에 의해서 획득하고, 투사 영상을 최대 강도에 따라서 재구성하여 뇌에서 그리고 신체 전체에서 방사능을 결정하였다.
새끼 돼지 생물분포: EV를 이미 기술된 바와 같이 센트리콘(Centricon) 유닛을 사용한 초미세여과에 의해서 농축하고, 이어서 30분 동안 암실에서 DiR표지화(5㎛)를 위해서 50㎖ 팔콘 튜브로 옮겼다. 표지된 EV를 100,000 x g에서 4시간 동안 초원심분리에 의해서 수집하였다. 펠릿화된 EV를 PBS로 세척하고, 초원심분리에 의해서 다시 수집하였다. EV를 PBS 중에 재현탁하고, 나노사이트NS 300 나노입자 추적 분석을 기반으로 개별 새끼 돼지를 위해서 (200ul PBS 중의) 2.7 x 1010개 소포/㎏ 체중 용량으로 희석하였다. 새끼 돼지를 정맥내 주입(꼬리 정맥), 비강내 전달, 지주막하 낭종 내로의 뇌척수 EV 주사, 또는 뇌 실질 내로의 직접 주사를 위해서 아이소플루란으로 마취시켰다. 실질내 주사를 위해서 EV를 분당 5㎕의 유량으로 전달하였다. EV 전달의 완결 30분 후에 아이소플루란 그 다음 CO2 질식에 의해서 동물을 안락사시켰다. 뇌, 심장, 간, 신장, 폐 및 비장을 제거하고, 루미나(Lumina) IVIS(모델)를 사용하여 영상화하여 DiR 형광을 검출하였다.
마우스: 유리 인듐-111 또는 인듐-111 표지된 EV를 마우스 꼬리 정맥에 뇌졸중 후 즉시(도 6B), 또는 24시간에(도 6C) 주사한 후에 EV 생물분포를 평가하였다. SPECT 스캔을 주사 1시간 후에 수행하였고(도 6A, 6B, 6C, 좌측 패널), 다시 주사 24시간 후에 수행하였다(도 6A, 6B, 6C, 우측 패널). 최대 강도에 의해서 재구성된 영상은 인듐-111 표지된 EV가 초기 시점 및 24시간 후 둘 모두에서 폐, 간, 비장 및 신장에서 신체 여과 기관 전체에 분포되는 반면(도 6B, 6C; 전신 스캔), 유리 인듐-111은 초기에 폐에 대부분 국지화되고, 그 다음 24시간 후에 간, 비장 및 신장에서 소모되는 것을 나타내는데(도 6A; 전신 스캔), 이는 아마도 신장계를 통한 클리어런스를 나타낸다. 독특하게, 표지된 EV는 뇌졸중 직후 또는 24시간 후에 주사되는 경우 주입 1시간 이내에 뇌졸중의 부근의 뇌에 존재하였는데(도 6B, 6C; 원), 이는 혈액 뇌 장벽의 파괴, 손상된 조직으로의 귀소 또는 이들 둘의 일부 조합으로 인한 순환계로부터의 접근을 나타낸다. 유리 인듐은 접근된 시점에서 뇌졸중이 있는 조직에 국지화되지 않았다(도 6A, 원).
독특성: 이것은 EV의 IV 주입이 뇌졸중 이후에 경색이 있는 뇌 내부에 그리고 그 주변에 실제로 분포된다는 것을 보여준 첫 번째 것이다. 대부분의 EV는 다른 기관, 예컨대 심장, 간, 폐 및 신장에서 분포되었고, 본 발명자들은 EV가 처음으로 뇌졸중 후 면역 반응에 전신 효과를 갖는 것을 시사하는 데이터(다른 부분에서의 데이터)를 갖는다. 따라서, 주변 EV의 전신 효과는 뇌졸중 후 분자 및 표현형 이익에 긍정적인 효과를 가질 가능성이 있다. 따라서 EV는 손상 부위에서 직접적인 효과를 가질 수 있고, 국소 면역 세포를 통해서 또는 뉴런에 대한 직접적인 효과뿐만 아니라 면역계에 대한 전신 효과를 통해서 효과를 가질 수 있다. 이는 대동물 뇌에서 생물분포를 보여준 첫 번째 데이터이다.
새끼 돼지: 뇌졸중 이후에 뇌로의 EV 전달을 최적화하기 위해서, 형광 표지된 물질(DiR, 5㎛)의 생물분포를 상해를 입지 않은 새끼 돼지에서 평가하였다. 표지된 EV를 실질 내에(도 7, 상부 패널), 또는 두개골의 기저부에서 지주막하 낭종의 CSF 내에(도 7, 하부 패널) 직접 주사한 후 뇌에서 검출하였다. 이는 대동물 연구에서 EV 생물분포의 첫 번째 예시이다.
실시예 4:
방법
마우스 모델
중년 C57/B6 수컷 마우스(9 내지 11개월의 교배 은퇴)를 뇌졸중 수술 전에 3일 동안 접착 테이프 시험(ATT)에 대해서 예비 연습시켰다(3회/일). 마우스를 식별을 위해서 표지하고, 번호 매기고, 색전성 뇌졸중의 유도 후에 상이한 처리군에 대해서 4의 블록 크기(동일한 케이지로부터의 4마리 동물)로 뇌졸중 후에 요법을 위해서 무작위화하였다. 뇌졸중 수술 및 뇌혈류(CBF)를 수행한 외과의, 및 신경행동 및 신경학적 결핍 점수 매김을 수행한 관찰자를 군의 식별에 대해서 블라인딩시켰다. 제공된 모든 4개의 치료제를 해동시키고, 각각 용량 1, 2 및 3으로 뇌졸중 후 2, 14 및 38시간에 정맥내로 주사하였다. 상대적인 뇌혈류(CBF)를 뇌졸중 후 6시간 및 48시간에 측정하였다. 신경학적 결핍 점수(NDS)를 뇌졸중 후 48시간에 평가하고, 체성감각 기능을 반영하는 ATT를 안락사 직전에 뇌졸중 후 96시간에 수행하였다. 사망률을 매일 모니터링하고, 4일까지 안락사 전에 기록하였다.
색전성 뇌졸중
마우스를 뇌졸중 수술 20분 전에 부프레노르핀(0.05㎎/㎏ SC)으로 진정시키고, 3.5% 아이소플루란으로 마취시켰다. 마취의 수술 플레인(surgical plain)을 수술 동안 1.5 내지 2.0%로 유지시켰다. 열-조절 수술 패드에 의해서 체온을 37℃로 유지시켰다. 목의 배면 상에서의 중간선 절개에 의해서, 우측 총경동맥(CCA), 외경동맥(ECA) 및 내경동맥(ICA)을 평가하였다. 임시 비외상성 클립을 CCA 상에 위치시켜 카테터 삽입 동안 혈액의 손실을 예방하였다. 단일 피브린 풍부 혈전을 함유한 변형된 PE-10 카테터(9±0.5㎜ 길이)를 ECA에 도입하고, ICA로 전진시켰다. 혈전을 100㎕의 PBS와 함께 조심히 주사하고, 혈관폐색(embolization) 직후에 카테터를 제거하고, 동맥 상처를 고정시켜 혈액 손실을 예방하였다. 온-사이트 포터블 싱글 포인트 코티컬 레이저 도플러 플로우메트리(on-site portable single point cortical laser Doppler flowmetry)(페리메드 인크.)(PeriMed Inc.))를 사용하여 뇌졸중의 유도를 확인하였다. 마지막으로, 임시 클립을 제거하고, CCA에서의 혈류를 회복시켰다. 수술 부위를 #6 멸균 모노필라멘트 나일론 봉합을 사용하여 폐쇄시키고, 부프레노르핀(0.05㎎/㎏ SC)을 다시 주사하였다. 마우스를 깨끗한 회복 케이지로 옮기고, 동물 온도를 유지시켰다. 의식이 있는 마우스를 음식 및 물에 자유롭게 접근할 수 있는 깨끗한 표준 케이지로 옮겼다. 탈수의 임의의 징후의 경우에 필요에 따라서 NAPA 젤 및 젖산 링거 용액을 제공하였고; 달리는 37℃에서 미리 가온된 1㎖의 표준 멸균 염수를 12시간 마다 SC 주사하였다.
레이저 스페클 대비 영상화(laser Speckle Contrast Imaging);
간략하면, 뇌졸중 6시간 후, 체온을 37 ±0.5℃에서 유지시키면서 마우스를 아이소플루란을 사용하여 마취시켰다. 두개골을 면도하고, 중간선 피부 절개를 수행하여 중간 뇌 영역을 노출시켰다. 조명을 위한 70mW 빌트-인 레이저 다이오드 및 두개골 10㎝ 위에 설치된 1388 x 1038 픽셀 CCD 카메라(속도 19Hz, 및 노출 시간 6mSec, 1.3 x 1.3㎝)와 함께 페리캠(PeriCam) 고해상도 레이저 스페클 대비 영상화기(LSCI; PSI 시스템, 페리메드(Perimed))를 사용하여 관류 영상을 획득하였다. 획득된 비디오 및 영상을 CBF에서 동적 변화에 대해서 분석하였다. 허혈성 영역의 전체 관류를 상해를 입지 않은 대측 반구로부터의 동일한 크기의 관심 영역과 비교하여 상대적인 CBF를 비교할 것이다. 피부 상처를 조직 글루를 사용하여 폐쇄시켰다. 뇌졸중 후 48시간에서, 피부 상처를 다시 개복하고, 깨끗하게 하고, 중간 대뇌 동맥 영역을 노출시켜 상기에 기술된 바와 같이 LSCI 절차를 반복하였다.
신경학적 결핍 점수(NDS):
마우스에서 신경학적 결핍을 하기 기준에 따라서 더 불량한 결과를 나타내는 최고 수치 및 더 양호한 신경학적 결과를 나타내는 더 낮은 수치를 갖는 5-지점 스케일로 뇌졸중 후 48시간에서 치료군에 대해서 블라인딩된 관찰차에 의해서 평가하였다: 0, 결핍 없음(정상 마우스); 1, 대측성 면 상에서의 앞다리 구부리기 결핍; 2, 꼬리에 의해서 유지될 때 측방 동측부로의 측부 누름 및 몸통 돌기에 대한 감소된 내성과 함께 구부리기 결핍; 3, 케이지 내부에서 움직이는 동안 영향을 받는 측면으로의 매우 우세한 선회 및 영향을 받는 측면에 대해서 체중을 견디는 능력 감소를 비롯한, 점수 2에서와 같은 모든 결핍; 4, 상기와 같은 모든 결핍이 있지만, 자발적으로 움직이려는 의지가 거의 없고, 가만히 있는 것을 더 선호함; 5, 말기인 것으로 고려되어 동물 보호 요건에 따라서 안락사시킴.
체성감각 시험을 위한 ATT:
접착 테이프 시험(ATT)을 체성감각 운동 기능의 시험으로서 사용하였고, 안락사 직전 뇌졸중 후 96시간에서 수행하였다. 간략하면, 미경험 마우스를 투명한 아크릴 상자(15㎝ x 25㎝)에 넣음으로써 미경험 마우스를 수술 전에 3일 동안 시험 절차에 적응시켰다. 2조각의 접착 테이프(0.3㎝ x 0.4㎝)를 각각의 앞다리 상의 원위-방사상 영역에 부착하여 그것이 무모 부분(3개의 패드, 무지구 및 소지구)을 피복하도록 한 후 그것을 양쪽 촉각 자극으로서 사용하였다. 180초 내에서, 테이프 제거 시간을 감각운동 기능으로서 기록하였다. 마우스가 180초 이내에 테이프를 제거하는 데 실패하면, 180초의 점수를 주었다. 따라서, 더 짧은 시간의 점수가 더 양호한 결과를 나타내는 반면 더 긴 시간은 더 높은 결핍을 갖는 결과를 나타낸다.
안락사 및 2,3,5-트라이페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) -염색:
TTC-염색은 뇌졸중 후 대사적으로 활성인(살아있거나 또는 반음영) 조직과 불활성인(죽거나 또는 중심) 조직 사이에서 달라진다. TTC는 무색 용액이며, 이것은 살아있는 조직으로부터의 다양한 탈수효소, 주로 미토콘드리아 탈수효소의 효소 작용에 의해서 적색 1,3,5-트라이페닐폼아잔(TPF)으로 환원되는 반면, 중심(죽은 조직)은 백색으로 유지된다. 따라서, 더 큰 백색 면적은 더 큰 손상 및 경색 체적을 나타낸다. 뇌졸중 후 96시간에서 그리고 ATT를 수행한 후, 마우스를 아이소플루란(5%)으로 깊이 마취시켰다. 혈액을 직접 심장 천자를 통해서 수집하여 이후에 혈청을 단리 및 수득하였다. 뇌를 25㎖의 차가운 0.01M 인산염-완충 염수(PBS)로 매우 신속하게 관류시키고, 새로 수거하고, 즉시 금속 마우스 뇌 매트릭스로 옮겼다. 경색이 있는 면적을 확인하고, 5-블레이드를 교대 갭에 위치시켜 2-㎜ 관상면(coronal) 조각(뇌당 4개의 박편)을 수득하였다. 박편을 미리 가온된 (37℃) PBS(시그마) 중의 5% TTC 3㎖를 함유하는 35-㎜ 접시에 20 내지 30분 동안 37℃에서 개별적으로 위치시키고, 그 후 차가운 PBS로 2x 세척하고, 10% 포르말린으로 고정시켰다. 영상화를 위해서, 고정된 박편을 접시로부터 취하고, 고해상도 캐논 스캐너 상에서 순서대로 놓았다. 영상을 찍고, 분석을 위해서 저장하였다. 수정된 경색 체적을 회색 스케일 영상 및 시온 이미지 소프트웨어(Scion Image software)를 사용하여 추정하고, 상해가 없는 부분의 % 부피로서 제공하였다.
혈액 유세포 분석법(Th17, Treg, M2)
안락사 이전에 혈액을 수집하고, 정제된 세포를 형광 활성화 세포 분류에 적용하여 T-헬퍼(CD4+/FOX3P+) 집단, 조절 T-세포(CD4+/IL17+), 및 M2 대식세포(IL10+/CD206+) 집단을 비롯한 전신에 존재하는 면역 세포의 집단을 식별하였다.
결과
EV를 표준 방법(박편 제조 참고)을 사용하여 동질 유래된 성상세포 전구세포(APEX), MSC(MSCEX), 및 신경 전구세포(NPEX) 세포로부터 분리하고, 나노입자 추적 분석(나노사이트-NS300)에 의해서 평가하고, 색전성 뇌졸중 이후에 꼬리 정맥 주사 직전에 실온에서 해동될 때까지 -20℃에서 개별 용량 분취물로 저장하였다. 3개의 EV 유형 및 PBS를 색전성 뇌졸중 이후에 뇌졸중 후 2, 14 및 28시간에서 대략 2.7 x 1011개 소포/㎏(또는 비히클)의 3회 용량으로 블라인딩된 관찰자에 의해서 투여하였다. 평가된 모든 파라미터에서 APEX 및 NPEX 둘 모두는 비히클 처리된 대조군뿐만 아니라 MSCEX 처리군보다 우수했다. 안락사 직후에, 2,3,5-트라이페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)를 사용하여 대사적으로 활성인(살아있음, 적색) 조직 및 불활성인(죽음, 무색) 조직을 구분하였다. 중요하게는, TTC는 APEX 또는 NPEX(상표명) 처리(도 8A) 이후에 감소된 상해 및 경색 체적을 나타낸 반면, MSCEX 처리는 대조군과 대등하였다. 뇌졸중 이후 96시간 이내에, APEX 및 NPEX 처리는 사망률을 각각 20 및 17% 감소시켰다(도 8B). 뇌졸중 후 48시간에 평가된 신경학적 결핍(결핍 없음[0]으로부터 중증도가 증가하면서 말기 결핍[5]까지의 5-지점 스케일)은 APEX 또는 NPEX가 제공된 마우스에 대해서 상당히 더 양호한 행동 결과를 나타내었다(도 8D). 각각의 앞다리의 원위-방사상 영역에 부착된 양쪽 촉각 자극으로서 사용된 접착 테이프를 제거하는 능력이 마찬가지로 개선된 감각운동 기능을 나타내었다(도 8E). 종합해보면, 이들 데이터는 현재 비히클 대조군과 비교할 때 NPEX 치료된 혈전색전성 뇌졸중 설치류 모델에서 개선된 생존, 분자 및 기능적 결과를 나타낸다.
안락사 직전 96시간 시점에서 혈액 세포의 유세포 분석은, 신경 세포 유형 유래된 EV, APEX 및 NPEX 처리가 전신에서 보호성 조절 T 세포의 존재의 증가를 유발한 반면(도 9A), MSCEX는 대조군과 구별할 수 없었다는 것을 나타낸다. 염증-전 T-헬퍼 세포는 APEX 군 및 NPEX 군에서 감소된 반면(도 9B), 항-염증성 M2 대식세포는 이들 군에서 증가되었다(도 9C). 종합해보면, 이들 데이터는 신경 세포 유형 유래 EV는 뇌졸중 후에 면역 반응을 조절함으로써 이의 효과의 일부 또는 전부를 발휘한다는 것을 나타낸다.
동일한 ES 세포로부터 동질(유전적으로 동일한) 유래된 신경 전구세포, 성상세포 전구세포, 및 MSC 세포를 생산하는데 사용되는 생산 및 품질 제어 방법은 공여자 물질의 기원으로 인해서 유전 변이의 교란 변수 없이 이들 3가지 세포 유형으로부터 EV를 비교하는 독특한 기회를 제공한다. 줄기세포 유래 EV 문헌의 대다수가 MSC 유래 EV에 집중되어 있다. 본 명세서에서, 처음으로 신경 세포 유래 EV(APEX 및 NPEX)가 평가되었고, MSC-유래 EV와 직접 비교되었다. MSCEX에 비해서 분자 이익(경색 체적)에서의 실질적인 개선이 존재하고, 또한 신경 유래 EV(APEX 및 NPEX)의 증가된 생존 및 개선된 기능적 결과가 존재한다. 이들 개선은 사망에 이르기 더 쉬운 더 늙은 동물에서 즉각적이었다. 따라서, 어떤 다른 그룹도 임의의 EV(MSC 또는 신경) 요법이 인간 뇌졸중 병태(색전성 뇌졸중) 및 동반이환(co-morbidly) 인자, 예컨대 연령(중년 마우스)의 인자를 모사하는 마우스 모델에서 이러한 강력하고 즉각적인 개선을 갖는 것을 밝히지 못했다. 이러한 초기의 강한 효과는 본 명세서에 개시된 바와 같은 신경 EV로만 수득될 수 있는 것 같다.
이러한 연구는, 부분적으로 작용 기전이 IL17 사이토카인을 억제하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 염증성 M1 반응을 억제하는 반면, 아마도 IL10 및 다른 사이토카인을 통해서 M2 반응을 개선시키는 면역 조절을 통해서 이루어질 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 5:
돼지 모델, 중간 대뇌 동맥(MCA) 폐색에 의한 허혈성 손상 유도.
랜드레이스종 거세돼지(Landrace barrow)(5 내지 6개월, 150 내지 170lbs)를 유일한 완전히 개발된 돼지 뇌졸중 모델[1]을 사용하여 이미 기술된 바와 같이 상해에 적용하였다. 간략하면, 관골궁(zygomatic arch)의 일부를 절제하고, 하부 근육을 후방으로 들어올려 두정골을 드러내었다. 뼈 표면에 창을 생성하여 경막을 노출시켰다. 근위 MCA를 영구적으로 폐색시켜, 전두엽의 가장 먼 꼬리 부분뿐만 아니라 측두엽, 정수리 및 후두엽의 상당 부분을 차지하는 경색을 유발시켰다.
자기 공명 분광학
자기 공명 영상화(MRI)를 MCAO 수술 후 24시간 및 90일에 GE 16-채널 고정-부위 트윈 구배 시그나(Twin gradient Signa) HDx 3.0 텔사(Tesla) MRI 시스템 상에서 수행하였다. 마취 하에서, 환자를 등받이에 두고 신경두개의 MRI를 다채널 상 배열 척추 코일을 사용하여 수행하였다. 표준 다면 MR 뇌 영상화 시리즈를 획득하였다. 이들은 T2-가중(T2w), T2-가중 유체 감쇠 역전 회복(플레어), 및 T1-가중(T1w) 플레어, 뿐만 아니라 확산-가중 영상화(DWI) 시리즈를 포함하였다. DWI는 b = 0 및 b = 1000으로 획득되었다. 뇌 경색의 존재 및 대뇌반구 부피의 변화에 대해서 DWI, 겉보기 확산 계수(ADC) 맵 및 T1w-플레어 영상을 오시릭스(Osirix)(등록상표) 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 허혈성 면적의 부피는 DWI 시퀀스로부터 생성된 ADC 맵으로부터 수동으로 유래되었다. 허혈성 면적을 정상 ADC 값을 제공하는 대측 대뇌 반구로부터의 ADC 수치와 함께, ADC 수치 감소의 두 수준에 의해서 정의하였다. 정상의 80% 및 40% ADC 값을 갖는 것으로 정의된 허혈성 면적을 순차적인 ADC 영상 상에서 수동으로 추적하였다. 각각의 면적을 조각 두께와 곱하여 허혈성 조직의 부피를 생성하였다. 이 방법이 선택되었는데, 그 이유는 그것이 조직학적으로 정의된 면적과 강한 상관관계가 있는 것으로 입증되었기 때문이었다. 대뇌 반구 부피를 유사한 과정을 통해서 결정하였고, 이에 의해서 대뇌 반구 부피를 T1w 플레어 영상 상에서 정량화하였다(열구(sulci) 및 측방 심실 공간 제외). T2w 플레어 영상을 CSF로 채워진 영역과 과집중의 실질 면적을 구별하기 위한 참조군으로 사용하였다(Platt, S.R., et al., Experimental & Translational Stroke Medicine, 2014. 6:5).
EV 투여량 및 투여
생물학적 안전 케비넷에서 유지시키면서, 50 내지 60㎖ PBS 중에 약 2.7 x 1010개 소포/㎏을 함유하는 NPEX EV를 4℃에서 해동시키고, 무균 기술을 사용하여 60cc 주사기로 옮겼다. 귀 정맥 카테터를 통한 정맥내 주입 직전에 샘플을 최소 25회 뒤집었다. MCAO 후 2, 14 및 24시간에서 3회 용량(50 내지 60㎖)의 NPEX 또는 PBS(비히클)를 돼지에게 제공하였다.
동물 평가 및 회복
수술 후, 동물을 깨끗한 회복 우리로 이동시키고, 관제거(extubation)시까지 연속적으로 모니터링하였다. 직장 온도, 심박수 및 호흡수(TPR)를 돼지가 깨어나고, 활력 징후가 정상 한계치 내에서 안정할 때까지 15분 마다 기록하였다. 그 후, 활력 징후가 정상(예를 들어, 열)으로부터 차이가 없는 한 TPR 측정을 먼저 1 내지 2시간 간격으로 줄이고, 이어서 돼지가 회복됨에 따라서 다음 48시간에 걸쳐서 더 긴 간격으로 줄였다. 처음 36시간 동안, 관찰 없이 돼지를 4시간을 초과하게, 일반적으로는 2시간 이하 동안 방치하지 않았다. TPR에 더하여, 기록된 다른 관찰은 회복 초기부터 동물이 처음 스스로 일어날 때까지의 시간, 도움을 받아서 마시고 먹기까지의 시간, 및 도움 없이 마시고 먹기까지의 시간을 포함하였다. 사건, 예컨대 열(직장 온도 103℉ 초과), 선회 행동 및 발작을 또한 모니터링 및 기록하였다.
표 1에서 인지된 바와 같이, 일상적인 평가는 NPEX 처리로 뇌졸중 후 개선된 생존 및 즉각적인 회복에서의 기능적 결과를 나타낸다. 생존은 NPEX 처리군에서 상당히 더 양호하였는데, 7마리 중 7마리의 돼지가 뇌졸중 후 72시간을 초과하게 생존한 반면, 대조군에서는 8마리 중 5마리 만이 생존하였다. 동물이 도움 없이 일어날 수 있을 때까지의 시간은 NPEX 처리에서 약 2시간 감소되었다. 뇌졸중 후 72시간 내에 매우 일반적인 열은 NPEX 처리군에서 낮아졌는데, 여기서 8마리 중 6마리 동물이 적어도 1회 열이 난 대조군과 비교할 때 7마리 중 4마리의 동물이 1회 이상의 열 에피소드를 가졌다. 도움 없이 마시고 먹기까지의 시간, 선회 행동을 나타내는 동물의 수, 및 문헌화된 발작 활동을 갖는 동물의 수는 군들 사이에서 유사하였다.
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표 2에서 인지되는 바와 같이, 보행 분석은 대조군과 비교할 때 NPEX 처리군에서 개선된 운동 기능을 나타낸다. 뇌졸중 후 7일에서, NPEX 처리된 돼지는 이들의 보폭을 따라서 움직일 때 보다 더 빨리 그리고 보다 리듬(리듬감)있게 움직인다. 우반구에서의 뇌졸중으로 인해서, 좌측의 특이적인 결핍이 더 두드러졌다. 좌측의 특이적 측정은 더 큰 스텝 길이, 더 짧은 사이클 시간, 더 큰 보폭 길이 및 사이클 시간의 스윙 백분율을 나타낸다. 처리된 동물은 이들이 이의 보폭을 따라서 움직일 때 각각의 발에 더 큰 압력을 가했고, 도달에 의해서 입증된 앞다리를 지나치는 뒷다리의 더 두드러진 움직임을 보여주었고, 이는 대조군에 비해서 더 자연스러운 움직임을 나타낸다.
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결과
28 ± 4시간에서의 초기 MRI 분석은 대조군과 비교할 때 NPEX 처리된 돼지에서 더 작은 병변 부피를 나타내었다(도 10A 내지 도 10C). 동측 및 대측 반구의 부피 측정은 뇌졸중을 NPEX 처리한 후 부피가 덜 변화되는 것을 나타내는데(도 10D), 이는 뇌졸중 후 처음 24시간 내에 동측 반구에서 더 적은 종창을 나타내고, 돼지 모델에서 마찬가지로 면역 반응의 초기 조절 및 신경보호 효과를 나타내는 설치류 데이터와 일치한다. 생리학적 파라미터, 가장 주목하게는 생존율은 또한 뇌졸중 유도 후 72시간 내에서 증가되었다. 처리된 동물은 또한 대조군보다 약 2시간 빨리 도움 없이 일어날 수 있었다. 뇌졸중 후 7일에서의 보행 분석은 증가된 속도 및 리듬(리듬감), 움직임 전체에서 각각의 발에 가해지는 더 높은 압력, 뿐만 아니라 증가된 스텝 및 보폭 길이, 사이클당 스윙 스탠스(swing stance)(발이 땅에서 떨어짐) 시간의 증가된 백분율, 및 4발 움직임에서 예상되는 바와 같이 뒷다리가 앞다리를 지나 연장된 더 뚜렷한 도달에 의해서 검출된 바와 같은 개선된 움직임 기능을 나타내었다.
NPEX 처리는 또한 MRI T2 및 T2 플레어 영상에 의해서 검출된 바와 같이 뇌졸중 후 12주에 동물에서 분자 이익에 상당한 효과를 가졌다(도 11). 죽은/사멸 조직은 처리에 의해서 감소되었고, 주로 피질 조직을 포함하는 손상된 조직(녹색 흔적)은 상당히 감소된 반면, 대조군에 비해서 뇌실의 온전성은 상당히 보존되었다. NPEX가 제공된 동물은 대조군 처리가 제공된 것보다 12주 연구에 걸쳐서 더 큰 경색 크기(뇌졸중 후 24시간에서 3.8㎝3 초과)에서 살아남을 수 있었다. 이는 아마도 감소된 뇌졸중 중증도로 이어지고 뇌 조직의 온전성뿐만 아니라 행동 및 운동 기능을 비롯한 더 양호한 장기간 결과를 촉진시키는 NPEX의 항-염증성 특성때문이다.
이전에는 어떤 유형의 EV도 대동물에서 뇌졸중의 결과를 개선시키거나 어떤 신경 결핍의 문제에 대해서도 개선시키지 못했다. 소동물에서와 일관되게, 본 발명자들은 NPEX가 뇌에 즉시 영향을 주고, 따라서 NPEX가 돼지 및 마우스에서 빠르게 작용한다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 뇌졸중이 걸린 동물에 대한 EV의 이러한 효과 및 즉각적인 효과를 시사한 어떤 다른 연구도 알지 못한다. 즉시 NPEX는 생존 및 운동 기능(동물이 회복되는 속도, 일어나기까지의 시간, 균형을 잡기까지의 시간 등)을 개선시켰다. 대동물종에서의 분자 및 표현형 결과는 이미 기술된 설치류 데이터를 확대하여, EV가 더 오래 지속될 가능성이 있는 신경보호 효과를 발휘하는 것을 나타낸다. 이러한 효과는 아마도 부분적으로 뇌졸중 이후에 발생하는 면역 반응을 약화시킴으로써 1차 손상 캐스케이드를 조절하는 것으로 인한 것인데, 그 이유는 분자 및 표현형 차이가 뇌졸중 후 24시간만큼 빨리 검출 가능하고, 신경 회복성인 향상된 M2 반응에 나중에 효과를 미치기 때문이다. NPEX 처리된 동물의 개선된 보행과 함께 더 길게 지속되는 효과가 전체적으로 관찰된다.
요약하면, 이것은 작용 기전이 동물 전체에서 일관된다는 것을 시사하는 첫 번째 뇌졸중 연구이고, 인간과 유사한 구조를 갖는 더 복잡한 뇌에서의 연구를 포함한다. 본 발명자들의 시험관내 인간 세포 연구는, 손상된 신경세포에 대한 직접적인 신경보호 작용을 시사하고, 마우스 및 돼지 연구는 면역계를 통한 보호를 시사한다. 두 종 모두에서 신경-회복 기전에 더 오래 작용하는 효과가 관찰되었고, 이는 부분적으로 Treg 세포의 상향 조절로 인한 것일 수 있다(현재까지는 마우스만). 중요하게는, 마우스와 달리 돼지 뇌는 백질비, 대뇌 피질, 세포구조 및 크기를 비롯하여 인간 뇌와 다수의 상동성을 공유한다. 이들 유사성으로 인해서, 돼지는 설치류와 비교할 때 더 우수한 모델 시스템인 것으로 간주되고, 치료적으로 생산된 신경 전구세포 유래 EV를 사용한 허혈성 뇌졸중의 인간 치료에서 기대되는 이익을 더 잘 대표한다.
이는 신경 전구세포 배양물로부터 다량의 EV를 생산하는 능력으로 인해서 가능하며, 이는 MSC로부터 수득된 수율보다 대략 5배 더 크다. 배양물로부터 상업적인 규모로 EV를 지속적으로 생성하는 능력은, EV-생산 세포가 세포를 취급하고, 생성된 EV를 정제하는 엄격한 품질 제어 공정에 좌우된다는 것을 필요로 할 것이다.
실시예 6:
1차 여과(단계 1, 모든 정제 방법에 대해서 사용됨)
배지를 배양된 세포를 함유하는 플레이트 또는 플라스크로부터 수거한다. 1차 여과 전 또는 후에 수거된 배지를 -20℃에서 동결시키고, 4℃에서 해동시킨다. 여과를 멸균 층류 후드에서 완결하여 오염을 최소화한다. 수거된 배지를 0.22㎛ 필터(이엠디 밀리포어 스테리컵(EMD Millipore Stericup))를 통한 전량 여과(dead end filtration)를 통해서 여과하였다. 이러한 1차 여과는 수거된 배지로부터 임의의 세포 잔해 및/또는 죽은 세포를 제거한다. 이는 EV 및 미세소포를 추가 정제를 위한 여과액으로 통과시킨다.
센트리콘 초미세여과(centricon utrafiltration)
1차 여과를 거친 후, 배지는 1차 여과가 가능하다. 이러한 단계는 센트리콘 원심분리 유닛을 포함하는 시스템을 활용하는데, 이것은 스핀당 최대 70㎖의 배양 배지를 가공할 수 있다. 이러한 여과 공정은 100kDa 필터를 사용하여 풍부한 EV를 수집한다. 이러한 공정 동안, 배지는 4,000 x g에서의 원심분리를 통해서 필터 디스크로 밀려 나간다. 잔여물이 유닛당 대략 250㎕ 내지 5㎖에 도달하면, 이어서 출발 배지 부피의 대략 90%의 PBS+/+를 사용하여 완충제 교환을 수행한다. 잔여물이 필터 유닛당 250㎕ 내지 1㎖에 도달할 때까지 2,000 x g에서의 원심분리에 의해서 PBS+/+를 센트리콘 필터를 통해서 통과시킨다. 이 때, 잔여물을 EV 분석을 위해서 수집한다. 샘플을 즉각적인 나노입자 추적 분석을 위해서 취하고, 동일한 세포 유형으로부터의 모든 정제된 EV를 풀링시키고, 분말화하고, -20℃에서 저장을 위해서 DNase/RNase 무함유 튜브에 분취하였다.
아미콘 교반식-세포 초미세여과
더 큰 부피의 초미세여과를 위해서, 나란히 3개의 유닛이 연결된 아미콘 교반식-세포 초미세여과 유닛을 사용하였다. 각각의 기본 유닛은 400㎖ 배지를 보유하고, 이것을 저장소로 사용하여 추가로 확장시켜 처리량을 증가시켰다. 이러한 단계는 압력 용기 및 순서대로 작동하는 3개의 EMD 밀리포어 스터드 셀 유닛(EMD Millipore Stirred Cell Units)(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 미국 소재)을 포함하는 시스템을 사용한다. 이러한 단계는 마찬가지로 100kDa 필터 디스크(피셔 사이언티픽, 미국 소재)를 통해서 통과하는 배지를 갖는 전량 여과를 사용한다. 이러한 공정 동안, 배지는 압착된 질소 기체에 의해서 공급된 25psi의 양압을 사용하여 필터 디스크로 밀려 나간다. 잔여물이 50㎖/교반식 세포 유닛에 도달할 때, 시스템을 감압한다. 이어서 출발 배지 부피의 50%의 PBS+/+를 사용하여 완충제 교환을 수행한다. 잔여물이 필터 유닛당 50㎖에 도달할 때까지 PBS+/+를 교반식 세포 필터를 통해서 통과시킨다. 이 때, 잔여물을 EV 분석을 위해서 수집한다. 샘플을 즉각적인 나노입자 추적 분석을 위해서 취하고, 동일한 세포 유형으로부터의 모든 정제된 EV를 풀링시키고, 분말화하고, -20℃에서 저장을 위해서 DNase/RNase 무함유 튜브에 분취하였다.
섬유모세포 성장 인자 ELISA
hFGF2 함량을 결정하기 위해서, 저온보존된 샘플 NPEX(상표명), APEX, 및 MSCEX EV를 4℃에서 해동시키고, 동일 부피의 EV 용해 완충제를 용해시켜서 엑소좀 내용물을 방출시킨다. 용해물을 제조사 프로토콜에 따라서 상업적으로 입수 가능한 인간 FGF2 ELISA 검정 키트(써모 사이언티픽 - 카탈로그 번호 KHG0021)를 사용하여 인간 FGF2에 대해서 분석하였다. 키트에 제공된 FGF2 표준품을 사용하여 시험 샘플에서 표준 곡선 및 정량화된 FGF2를 생성하였다. FGF2를 490pG/㎖의 NPEX(상표명) 샘플에서 검출하였다. FGF2는 APEX(상표명) 또는 MSCEX(상표명) 샘플에서 검출될 수 없었다.
질량 분광학
신경 EV 대 MSC 유래 EV에 대해서 독특한 단백질을 비교하기 위해서, 정제된 EV 단백질을 바이오프록시미티, 엘엘씨(Bioproximity, LLC)에 의해서 질량 분광학에 적용하였다.
결과
초원심분리 및 초미세여과 방법을 이미 기술된 바와 같이 사용하였다. 큰 부피 정제는 아미콘 교반식-세포 시스템을 사용하여 일주일의 작업으로 24리터 초과의 세포 배양 배지를 정제하였다.
섬유모세포 성장 인자 ELISA 결과
단백질 인간 섬유모세포 성장 인자 2(hFGF2)를 hNP1(상표명) 배양 배지에 첨가하여 hNP1(상표명) 세포의 증식 상태를 유지시킨다. hFGF2 보충된 배지 중에서 배양된 hNP1(상표명) 세포(NPEX)에 의해서 생산된 EV는 엑소좀 단백질 내용물의 일부로서 이러한 hFGF2 단백질 중 임의의 것을 축적/함유할 수 있다. 살아있는 hNP1(상표명) 세포 배양물로부터 수집된 hNP1(상표명) 배양 배지로부터 수거된 NPEX EV를 hFGF2의 존재에 대해서 시험하였다. 이러한 정제 및 저온보존된 NPEX(상표명) EV는 해동 후 검출 가능한 수준의 hFGF2를 함유하였다. 다른 한편, h아스트로프로(상표명) 인간 성상세포(APEX)로부터의 EV, 및 중간엽 줄기세포(MSCEX)로부터의 EV(여기서 세포 배양 배지는 hFGF2가 보충되지 않았음)는 어떤 검출 가능한 hFGF2도 함유하지 않았다. 종합해보면, 이들 데이터는 배지에 보충된 단백질이 세포에 의해서 흡수되어, 형질주입 또는 다른 기술의 부재 하에서도 풍부한 EV 샘플 중에 존재하여 세포에서 단백질을 과발현시킨다는 것을 나타낸다.
질량 분광학
도 12는 NPEX, APEX 및 MSCEX 소포에 대해서 독특하고, 이에 의해서 공유된 단백질의 수를 나타낸 벤 다이어그램이다. 총 2727종의 단백질이 이들 소포 모두에 의해서 공유되었다(표 3). APEX 및 MSCEX는 NPEX 소포에 존재하지 않는 2786종의 단백질을 공유하였다(표 4). NPEX는 MSCEX와는 단지 467종의 단백질(표 5) 및 APEX 소포와는 단지 426종의 단백질(표 6)을 공유하였다. MSCEX는 APEX 또는 NPEX 소포에서 식별되지 않는 536종의 독특한 단백질을 가졌다(표 7). APEX는 NPEX 또는 MSCEX 소포에서 식별되지 않는 596종의 단백질을 가졌다(표 8). NPEX는 APEX 또는 MSCEX 소포에서 식별되지 않는 1653종의 단백질을 가졌다(표 9).
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따라서, 개시된 EV는 이들이 유래된 세포의 기원을 기반으로 독특하다. 더욱이, 이들 단백질을 EV를 식별하기 위한 특징으로서 사용될 수 있다.
논의
이것은 초원심분리에 의해서 논리적으로 정제될 수 없는 상당한 양의 배지를 1주일 이내에 24리터의 배지로부터 여과 및 EV 풍부화하는 것을 허용하는 아미콘 교반식-세포 초미세여과 유닛을 필요로 하는 규모를 인식하고, 강력한 인력 및 더 작은 센트리콘/아미콘 원심분리 필터 유닛을 사용하는 다수의 원심분리를 필요로 하는 최초의 문헌이다.
CNS 내에서 표적에 분포하는 NPEX EV의 능력(생물분포 박편에서 입증된 바와 같음)과 조합된, NPEX(상표명)에서 세포 배양 배지로부터의 hFGF2의 포함은, 이들 EV가 hFGF2를 혈액 뇌 장벽을 통해서 잠재적으로 전달하여 CNS 조직을 표적화할 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 결과는, 단백질(상기 실시예에서 hFGF2)을 비롯한 큰 분자를 전달하기 위한 잠재적인 방법이 관심 분자를 갖는 EV 공급 세포(상기 실시예에서 hNP1(상표명)) 배양 배지를 보충함으로써 세포외 소포(NPEX(상표명))를 사용하여 CNS를 비롯하여 생체 내에서 표적화한다는 것을 시사한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 개시된 발명이 속한 기술 분야의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 간행물 및 이들이 인용된 문헌은 구체적으로 참고로 포함된다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 일상적인 실험을 넘어서지 않는 것을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 구체적인 실시형태에 대한 다수의 등가물을 인식할 것이거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해서 포함되도록 의도된다.

Claims (20)

  1. 인간 만능 줄기세포로부터 유래된 신경 전구세포(NP) 세포를 세포 배양 배지 중에서 세포외 소포(extracellular vesicle: EV)를 생산하기에 충분한 조건 하 그리고 시간 동안 배양하는 단계 및 상기 EV를 상기 배양 배지로부터 단리하는 단계에 의해서 수득된 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 만능 줄기세포는 배아 줄기세포인, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인간 만능 줄기세포는 유도 만능 줄기세포인, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 신경 전구세포 세포는 SOX 1+, SOX 2+ 및 OCT4-인, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EV는 표 9의 1종 이상의 단백질 바이오마커를 포함하는, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  6. 인간 배아 줄기(hES)세포로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래된 신경 세포를 세포 배양 배지 중에서 EV를 생산하기에 충분한 조건 하 그리고 시간 동안 배양하는 단계 및 상기 EV를 상기 배양 배지로부터 단리하는 단계에 의해서 수득된 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 신경 세포는 상기 hES 세포로부터 유래된 신경 전구세포(NP) 세포로부터 분화된, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 신경 세포는 신경아교 세포(glial cell)인, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 신경아교 세포는 성상세포를 포함하는, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EV는 표 8의 1종 이상의 단백질 바이오마커를 포함하는, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  11. 인간 만능 줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(MSC)를 세포 배양 배지 중에서 EV를 생산하기에 충분한 조건 하에서 그러한 시간 동안 배양하는 단계 및 상기 EV를 상기 배양 배지로부터 단리하는 단계에 의해서 수득된 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인간 만능 줄기세포는 배아 줄기세포인, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 인간 만능 줄기세포는 유도 만능 줄기세포인, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EV는 표 7의 1종 이상의 단백질 바이오마커를 포함하는, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 향신경성 인자(neurotrophic factor)를 더 포함하는, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EV는 하이드로젤 스캐폴드 중에 현탁된, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 저해제, RNAse 저해제 또는 이들의 조합물을 더 포함하는, 세포외 소포(EV)를 포함하는 조성물.
  18. 척수 상해, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 또는 신경퇴행성 질환을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 파킨슨병-관련 장애, 헌팅톤병, 프라이온병, 운동 뉴런 질환(MND), 척수소뇌성 실조증(SCA) 또는 척수성 근위축(SMA)인, 치료 방법.
  20. 뇌졸중 또는 외상성 뇌 손상을 앓고 있거나 또는 신경퇴행성 질환을 갖는, 척수 상해를 갖는 환자 또는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
KR1020187017132A 2015-11-18 2016-11-16 신경 세포 세포외 소포체 KR20180086440A (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023055222A1 (ko) * 2021-10-01 2023-04-06 주식회사 입셀 유도만능줄기세포 배양 배지 유래 성분을 포함하는 조성물 내지 이의 용도

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3377078A4 (en) 2015-11-18 2019-09-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. EXTRACELLULAR NERVE CELL VESITEL
WO2017136430A1 (en) * 2016-02-01 2017-08-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Exosome-total-isoloation-chip (exotic) device for isolation of exosome-based biomarkers
WO2019133717A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Abbott Laboratories Novel biomarkers and methods for diagnosing and evaluating traumatic brain injury
CN110317788A (zh) * 2019-04-26 2019-10-11 广州瑞臻再生医学科技有限公司 一种npc培养基、外泌体的制备方法和应用
CN118147051A (zh) * 2019-06-10 2024-06-07 布瑞克斯奥根株式会社 用于促进干细胞来源外泌体产生和增加干性的包含白藜芦醇的组合物
MX2022003570A (es) * 2019-09-25 2022-07-11 Codiak Biosciences Inc Composiciones de vesícula extracelular.
KR20230004424A (ko) * 2019-11-04 2023-01-06 아루나 바이오, 인크. 세포외 소포체 및 항체 전달을 위한 그의 용도
CN114728024B (zh) * 2019-11-12 2024-05-14 布瑞克斯奥根株式会社 包含源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体的用于预防或治疗肾脏疾病的组合物
WO2021184020A1 (en) * 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Methods of treating neuroinflammation
WO2021198954A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-07 Universidade Do Minho Exosome-enriched extracellualr vesicles isolation, method and uses thereof
US12042545B2 (en) 2020-10-14 2024-07-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Encapsulated extracellular vesicles
CN113577108B (zh) * 2021-08-31 2023-07-07 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种多功能胶原支架、其制备方法与应用
CN113887569B (zh) * 2021-09-09 2022-10-25 同济大学 一种基于区域尺度的事故多发区域判别方法
WO2023056606A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Hangzhou Jijing Pharmaceutical Technology Limited Valproate (vpa) compounds for use in treating spinocerebellar ataxia type 1 (sca1)
CN115137694B (zh) * 2022-07-15 2024-08-23 上海市第一人民医院 一种用于脊髓损伤的水凝胶材料及其制备方法和应用
JP7371975B1 (ja) 2022-09-27 2023-10-31 セルソース株式会社 細胞外小胞の製造方法及び細胞外小胞含有組成物
CN118416015B (zh) * 2024-07-04 2024-09-06 西部生科生物医学科技(成都)有限公司 一种富含脂肪干细胞外泌体的组合物及其应用

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4188373A (en) 1976-02-26 1980-02-12 Cooper Laboratories, Inc. Clear, water-miscible, liquid pharmaceutical vehicles and compositions which gel at body temperature for drug delivery to mucous membranes
US4352883A (en) 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4440921A (en) 1982-06-21 1984-04-03 Research Corporation Coupling of polyorganophosphazenes to carboxylic acid
US4474751A (en) 1983-05-16 1984-10-02 Merck & Co., Inc. Ophthalmic drug delivery system utilizing thermosetting gels
US4474752A (en) 1983-05-16 1984-10-02 Merck & Co., Inc. Drug delivery system utilizing thermosetting gels
US4478822A (en) 1983-05-16 1984-10-23 Merck & Co., Inc. Drug delivery system utilizing thermosetting gels
US4474753A (en) 1983-05-16 1984-10-02 Merck & Co., Inc. Topical drug delivery system utilizing thermosetting gels
US4880622A (en) 1986-05-20 1989-11-14 Research Corporation Technologies, Inc. Water-soluble phosphazene polymers having pharmacological applications
US5410016A (en) 1990-10-15 1995-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
CA2583473A1 (en) * 2004-10-05 2007-04-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Neuronal progenitors from feeder-free human embryonic stem cell culture
US20080026457A1 (en) 2004-10-22 2008-01-31 Kevin Wells Ungulates with genetically modified immune systems
WO2006087233A2 (en) * 2005-02-21 2006-08-24 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft e.V. Release of extracellular membrane particles carrying the stem cell marker prominin-1 (cd133) from neural progenitors and other epithelial cells
CN102497887A (zh) 2009-04-17 2012-06-13 Isis创新公司 递送遗传物质的组合物
WO2012020308A2 (en) 2010-08-13 2012-02-16 The University Court Of The University Of Glasgow Cellular and molecular therapies
SG183579A1 (en) 2011-02-11 2012-09-27 Agency Science Tech & Res Methods of detecting therapeutic exosomes
GB201121070D0 (en) 2011-12-07 2012-01-18 Isis Innovation composition for delivery of biotherapeutics
EP3336190B1 (en) 2011-12-13 2021-02-24 Henry Ford Health System Methods, systems, and compositions for cell-derived/vesicle-based microrna delivery
BR112014024541A2 (pt) * 2012-04-03 2017-08-08 Reneuron Ltd micropartículas de células tronco
WO2014028763A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 The University Of Chicago Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders
US10308959B2 (en) 2013-01-18 2019-06-04 Henry Ford Health System Methods, systems, and compositions relating to MiRNA-146a
ES2662326T5 (es) 2013-04-12 2021-08-04 Evox Therapeutics Ltd Vesículas de suministro terapéutico
GB201317887D0 (en) 2013-10-09 2013-11-20 Reneuron Ltd Product
WO2015038065A1 (en) 2013-09-11 2015-03-19 Nanyang Technological University Plasma microvesicle biomarkers for ischemic stroke
WO2015038075A1 (en) 2013-09-16 2015-03-19 Agency For Science, Technology And Research Method
EP3057662A4 (en) 2013-10-17 2017-03-29 Children's Hospital Los Angeles Antibody dependent exosome therapy
FR3014198B1 (fr) 2013-12-03 2017-03-03 Biomerieux Sa Procede d'isolement d'exosomes
CN103740645A (zh) * 2013-12-06 2014-04-23 山西医科大学 神经干细胞来源Exosomes制备及在神经系统疾病中的应用
US9919011B2 (en) 2014-03-18 2018-03-20 Samsung Life Public Welfare Foundation Method for treating an inflammatory brain disease comprising administering a stem cell-derived exosome
US10513710B2 (en) 2014-04-18 2019-12-24 University Of Massachusetts Exosomal loading using hydrophobically modified oligonucleotides
US10240127B2 (en) 2014-07-03 2019-03-26 ReCyte Therapeutics, Inc. Exosomes from clonal progenitor cells
WO2016090183A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Capricor Therapeutics, Inc. Processes for producing stable exosome formulations
WO2016172598A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 The Broad Institute Inc. Exosomes and uses thereof
WO2017054085A1 (en) 2015-10-01 2017-04-06 University Of Ottawa Exosome packaging of nucleic acids
EP3377078A4 (en) 2015-11-18 2019-09-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. EXTRACELLULAR NERVE CELL VESITEL
WO2017188487A1 (ko) 2016-04-29 2017-11-02 삼성전자 주식회사 줄기세포 유래의 세포외 소포체 생산 방법
MX2019005140A (es) 2016-11-02 2020-01-20 J Prockop Darwin Exosomas y usos de los mismos en enfermedades del cerebro.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023055222A1 (ko) * 2021-10-01 2023-04-06 주식회사 입셀 유도만능줄기세포 배양 배지 유래 성분을 포함하는 조성물 내지 이의 용도

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AU2016357303A1 (en) 2018-05-10
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